ES2602108T3 - Método para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa - Google Patents

Método para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa Download PDF

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Abstract

Un método para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa en una muestra de glicoproteínas, incluyendo el método: (a) suministro de una muestra de glicoproteínas la cual comprende glicoformas que contienen glicanos de alta manosa, donde los glicanos de alta manosa están presentes con una abundancia de menos del 20% en relación con la masa total de glicanos de la muestra de glicoproteínas; (b) tratamiento de la muestra de glicoproteínas con Endoglicosidasa F3; y (c) cuantificación de las glicoformas que contienen alta manosa en la muestra tratada.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Un producto de glicoprotema tipico difiere significativamente en terminos de complejidad de un farmaco de molecula pequena tfpico. Las estructuras de azucar unidas al esqueleto del aminoacido de una glicoprotema pueden variar estructuralmente de muchas maneras, incluida la secuencia, la ramificacion, el contenido de azucar y la heterogeneidad. De esta forma, los productos de glicoprotemas pueden ser mezclas heterogeneas complejas de varias moleculas diversas estructuralmente que tienen en sf mismas estructuras de glicanos complejas. La glicosilacion no solo aumenta la complejidad estructural de la molecula, sino que tambien afecta o condiciona varios de los atributos biologicos y clmicos de una glicoprotema.
Pace et al. (Analytical Letters, 42, 1711-1724, 2009) describen la caracterizacion de glicanos menores unidos a N menores en anticuerpos utilizando la liberacion con Endo H y la espectrometna de masas MALDI.
COMPENDIO DE LA INVENCION
La invencion se basa, al menos en parte, en metodos y composiciones relacionados con el analisis y el control de estructuras de glicanos de alta manosa (estructuras Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y/o Man9) en glicoprotemas. La via de glicanos unidos a N que muestra la smtesis de alta manosa y estructuras de glicanos complejas se muestra en la Figura 1.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un metodo para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa en una muestra de glicoprotemas, comprendiendo el metodo: (a) suministro de una muestra de glicoprotemas la cual comprende glicoformas que contienen glicanos de alta manosa, donde los glicanos de alta manosa estan presentes con una abundancia de menos del 20% en relacion con la masa total de glicanos de la muestra de glicoprotemas; (b) tratamiento de la muestra de glicoprotemas con Endoglicosidasa F3; y (c) cuantificacion de las glicoformas que contienen alta manosa en la muestra tratada.
Metodos analiticos del producto
De forma mas general, la presente divulgacion se refiere, en algunos aspectos, a metodos para analizar estructuras de alta manosa en una preparacion de glicoprotemas, por ejemplo, metodos para identificar y/o cuantificar glicanos de alta manosa o glicoformas. Estos metodos pueden utilizarse para medir uno o mas de los siguientes aspectos: la presencia y/o la cantidad de alta manosa en una preparacion de glicanos o de glicoprotemas (por ejemplo, en relacion con la masa total de glicanos); las relaciones relativas de estructuras de alta manosa [por ejemplo, relaciones relativas de especies de alta manosa entre sf (por ejemplo, abundancias o relaciones relativas de Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y/o Man9 y sus isomeros), relaciones relativas de alta manosa con respecto a estructuras hubridas, relaciones relativas de alta manosa con respecto a estructuras complejas, relaciones relativas de alta manosa con respecto a estructuras fucosiladas]; la presencia o la abundancia de estructuras de alta manosa modificadas (por ejemplo, la presencia o la abundancia de estructuras de alta manosa fucosiladas).
En un aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo para analizar (identificar y/o cuantificar) glicoformas de alta manosa en una mezcla de glicoprotemas, por ejemplo, una preparacion de glicoprotemas. El metodo incluye: (a) suministro de una muestra que contiene glicoprotema, (b) realizacion opcional de un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con digestion enzimatica y/o analisis de espectrometna de masas (MS), (c) eliminacion de glicanos de abundancia mas alta de la muestra de glicoprotemas (por ejemplo, tratamiento de la muestra de glicoprotemas con una enzima que escinde glicanos fucosilados complejos de la glicoprotema, por ejemplo, tratamiento con endoglicosidasa F3), (d) reduccion y alquilacion opcionales de la muestra y/o realizacion de un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con espectrometna de masas. En un caso, una etapa siguiente (e) incluye la identificacion y/o la cuantificacion de glicoformas que contienen alta manosa en la muestra tratada (por ejemplo, mediante metodos electroforeticos, como electroforesis capilar (CE), LC-MS de fase inversa o LC-MS de fase inversa dirigida). En ciertos casos en las que se conocen las masas teoricas de las glicoformas que contienen alta manosa, puede establecerse un experimento de MS dirigido para monitorear unicamente conjuntos seleccionados de firmas m/z correspondientes a esas especies. En otro caso, la etapa (e) incluye, de manera alternativa, la identificacion y/o la cuantificacion de glicoformas de baja abundancia en la muestra tratada, incluidas, a modo no taxativo, glicoformas de alta manosa.
En un caso, el metodo es un metodo de alta resolucion, por ejemplo, el metodo identifica y/o cuantifica de manera separada glicoformas individuales (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 glicoformas individuales) en una mezcla de glicoprotemas.
En un caso, la mezcla de glicoprotemas es una preparacion de anticuerpos, por ejemplo, una preparacion de anticuerpos farmaceutica. En un caso la preparacion de anticuerpos se expreso a partir de un cultivo de celulas de mairnfero.
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En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo para analizar (identificar y/o cuantificar) estructuras de alta manosa y/o tnbridas en una preparacion de glicanos o de glicoprotemas. El metodo incluye (a) suministro de una mezcla de glicanos o de glicoprotemas, (b) tratamiento de la mezcla de glicanos o de glicoprotemas con una enzima que escinde los residuos de manosidasa terminales expuestos en el extremo no reductor de una glicoforma y (c) cuantificacion de los residuos de manosa terminales escindidos. En un caso, la etapa de cuantificacion incluye la realizacion de analisis de monosacaridos cuantitativo (por ejemplo, mediante HPLC o GC-MS). En un caso, las manosas terminales liberadas se cuantifican en relacion con la masa total de glicanos y, de este modo, se analizan las estructuras de alta manosa y/o tnbridas en una preparacion de glicanos o de glicoprotemas.
En un caso, la preparacion de glicoprotemas es una preparacion de anticuerpos, por ejemplo, una preparacion de anticuerpos farmaceutica. En un caso la preparacion de anticuerpos se expreso a partir de un cultivo de celulas de mairnfero.
En algunos casos, el metodo analftico descrito en la presente detecta estructuras de alta manosa presentes en baja abundancia en una preparacion de glicoprotemas, por ejemplo, el metodo detecta estructuras de alta manosa, por ejemplo, una o mas Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y/o Man9 presentes en una abundancia de menos del 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1% o menos del 0,05% en relacion con la masa total de glicanos.
En algunos casos, el metodo es un metodo de alto rendimiento, por ejemplo, todas las etapas del metodo pueden completarse en menos de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 horas por muestra; el metodo puede utilizarse para procesar al menos 5 muestras por dfa. En otro caso, pueden ejecutarse mas de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 muestras por dfa mediante el uso de un operador y un instrumento por metodo. En otro caso, el metodo requiere una preparacion minima de muestras (por ejemplo, la preparacion de muestras incluye solo un intercambio de solucion amortiguadora opcional, no requiere varias etapas de limpieza o purificacion y/o procedimientos de derivatizacion).
En un caso, el metodo es un metodo realizado en condiciones de GMP.
En un caso, la glicoprotema es una inmunoglobulina (IgG) (por ejemplo, un anticuerpo terapeutico como un IgG1, IgG2) o una fusion de Ig (por ejemplo, una fusion de receptor terapeutico Fc). Algunos ejemplos incluyen: bevacizumab, tositumomab, abciximab, alemtuzumab, acritumomab, cetuximab, adalimumab, ranibizumab, gemtuzumab, efalizumab, infliximab, abciximab, rituximab, basiliximab, eculizumab, palivizumab, omalizumab, daclizumab, ibritumomab tiuxetan, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, muromonab-CD3, natalizumab, panitumumab, ranibizumab, tositumomab, alefacept, etanercept y abatacept.
En otros casos, la glicoprotema es una hormona terapeutica (por ejemplo, FSH), un interferon, una eritropoyetina, un factor de estimulacion de la colonia o una enzima de reemplazo terapeutico (por ejemplo, glucocerebrosidasa, alfa- galactosidasa).
Los metodos de la presente divulgacion pueden utilizarse para evaluacion de estructuras de alta manosa en una o mas etapas del desarrollo en la produccion de una glicoprotema terapeutica u otra glicoprotema comercialmente relevante, por ejemplo, durante la seleccion de la celula huesped, la seleccion clonal, la optimizacion de medios, la determinacion de las condiciones del cultivo, las condiciones del proceso y/o los procedimientos de purificacion.
Los metodos descritos en la presente tambien pueden emplearse para monitorear el grado y/o el tipo de glicanos de alta manosa producidos en un cultivo celular, permitiendo de este modo el ajuste o la terminacion posible del cultivo a fin de, por ejemplo, lograr un patron u objetivo particular deseado de alta manosa o evitar el desarrollo de un patron u objetivo particular no deseado de alta manosa. En algunos casos, los metodos pueden usarse para comparar el grado y/o el tipo de glicosilacion de alta manosa que ocurre en diferentes cultivos celulares. En algunos casos, los metodos pueden usarse para monitorear el patron de glicosilacion de glicoprotemas producido durante el transcurso de su produccion por las celulas. Por ejemplo, la produccion de una glicoprotema (por ejemplo, produccion comercial) puede involucrar etapas para (1) cultivar celulas que producen la glicoprotema, (2) obtener muestras a intervalos regulares o irregulares durante el cultivo y (3) analizar el patron de glicosilacion de la o las glicoprotemas producidas en las muestras obtenidas. En algunos casos, dichos metodos pueden incluir una etapa de comparacion de los patrones de glicosilacion de las glicoprotemas producidas en las muestras obtenidas entre st En algunos casos, dichos metodos pueden incluir la comparacion de patrones de glicosilacion de las glicoprotemas producidas en las muestras obtenidas con el patron de glicosilacion de una muestra de referencia (como una muestra de control, o un GMP o un estandar o especificacion farmaceutica).
Los metodos descritos tambien pueden usarse para evaluar caractensticas de glicosilacion de alta manosa de celulas o lmeas celulares que se tienen en cuenta para la produccion de una glicoprotema particular deseada (por ejemplo, incluso antes de que se hayan disenado las celulas o las lmeas celulares para producir la glicoprotema o para producir la glicoprotema a un nivel pertinente desde un punto de vista comercial).
Los metodos de la presente divulgacion pueden aplicarse a glicanos o glicoprotemas obtenidos de una amplia variedad de fuentes, incluidas, a modo no taxativo, formulaciones terapeuticas y muestras biologicas. Una muestra biologica puede someterse a uno o mas analisis y/o etapas de purificacion antes o despues de haber sido analizada de acuerdo con la presente divulgacion. Los metodos de la presente divulgacion pueden utilizarse para analizar
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glicanos en cualquiera de una variedad de estados, incluidos, por ejemplo, glicanos libres, glicoconjugados (por ejemplo, glicopeptidos, glicoKpidos, proteoglicanos, etc.), glicanos asociados a celulas (por ejemplo, glicanos asociados al nucleo, al citoplasma o la membrana celular, etc.), glicanos asociados con componentes celulares, extracelulares, intracelulares y/o subcelulares (por ejemplo, protemas), glicanos en espacio extracelular (por ejemplo medio de cultivo celular), etc.
En algunos casos, se conoce un patron de glicosilacion de alta manosa deseado para una glicoprotema objetivo espedfica, y los metodos descritos en la presente permiten monitorear muestras de cultivos para evaluar el progreso de la produccion en una via que, segun se conoce, produce el patron deseado. Por ejemplo, cuando la glicoprotema objetivo es una glicoprotema terapeutica, que, a modo de ejemplo, ha sido sometida a revision reguladora en uno o mas pafses, a menudo se deseara monitorear los cultivos para evaluar la probabilidad de que generen un producto con un patron de glicosilacion lo mas cercano posible al patron de glicosilacion establecido del producto farmaceutico, independientemente de si se produce o no mediante la misma via exacta. En dichos casos, las muestras del cultivo de produccion se toman tfpicamente en distintos momentos y se comparan con un estandar establecido o con un cultivo de control a fin de evaluar la glicosilacion relativa. Entre otras cosas, la presente divulgacion puede facilitar analisis en tiempo real de glicosilacion de alta manosa en sistemas de produccion para protemas terapeuticas.
Los metodos descritos en la presente tambien pueden emplearse para evaluar, controlar y/o comparar la calidad de los productos terapeuticos, por ejemplo, evaluar la presencia, las cantidades, las relaciones y/o las especies de estructuras de alta manosa en un producto de glicoprotema terapeutica o comercialmente relevante de cualquier otra manera. Por ejemplo, los metodos pueden usarse en un ensayo de control de calidad, API o ensayo de liberacion de farmacos y pueden incluir, por ejemplo, una etapa de liberacion de un producto de glicoprotema para uso farmaceutico si el producto cumple con una especificacion de referencia o control para estructuras de alta manosa. El nivel de referencia puede ser una especificacion (por ejemplo, un estandar de GMP, una etiqueta de la FDA o prospecto del medico) o un criterio de calidad para la preparacion farmaceutica que contiene la composicion de glicoprotemas. En otros casos, la comparacion se realiza con un registro historico de un lote anterior o estandar y/o con una muestra de referencia de glicoprotema. Las caractensticas del analisis pueden registrarse, por ejemplo, en un registro de control de calidad (por ejemplo, un certificado de pruebas o un certificado de analisis).
En algunos casos, el nivel de referencia o el criterio de calidad corresponde a estructuras de alta manosa de no mas del 20%, 15%, 12%, 10% presentes en una composicion de glicoprotemas, por ejemplo, no mas del 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,2%, 0,1% o 0,05%. En un caso, la glicoprotema tiene estructuras de alta manosa (por ejemplo, tiene al menos alta manosa del 0,01%, 0,05% o 0,1%), pero no tiene mas del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,2%, 0,1% o 0,05%, por ejemplo, tiene alta manosa entre el 0,0520%, alta manosa entre el 0,05-15%, alta manosa entre el 0,05-10%, alta manosa entre el 1-10% y alta manosa entre el 1-5%. El nivel de las estructuras de alta manosa presentes en una composicion de glicoprotemas, generalmente, pueden medirse como el nivel de glicanos que contienen estructuras de alta manosa en relacion con la cantidad total de glicanos en una muestra, como una preparacion de glicoprotemas.
En algunos casos, se enriquecera un patron de glicosilacion de alta manosa deseado para una estructura en particular. Por ejemplo, en algunos casos, un patron de glicosilacion deseado tendra niveles inferiores (por ejemplo, menos de aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% o menos) de estructuras de alta manosa, o niveles superiores (por ejemplo mas de aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%) de estructuras de alta manosa, o niveles especificados de Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y/o Man9 (por ejemplo, enriquecimiento de Man5 y/o Man8 en relacion con otras especies de alta manosa o en relacion con la masa total de glicanos).
Metodos analiticos basados en celulas
Se ha encontrado que diferentes vfas celulares interactuan para determinar el patron de glicanos de alta manosa presentes en glicoprotemas producidas a partir de una celula en particular. Se ha encontrado que el patron de glicanos de alta manosa en una glicoprotema generada por una celula dependera del equilibrio y los patrones de componentes formativos frente a los consuntivos descritos en la presente (por ejemplo, la expresion de ciertos genes y la disponibilidad de ciertos metabolitos descritos en la presente) relacionados inesperadamente con la biosmtesis de estructuras de alta manosa. Los patrones de expresion o disponibilidad de dichos componentes en una celula o poblacion celular son indicativos o predictivos del patron de estructuras de alta manosa producidas por la celula o la poblacion celular, por ejemplo, son indicativos o predictivos del contenido de alta manosa de una glicoprotema terapeutica producida por dicha celula o poblacion celular.
Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo de evaluacion de la capacidad y/o el potencial de una celula para producir estructuras de alta manosa. El metodo incluye: suministro de una celula y evaluacion de dos o mas (por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 6 o mas, 7 o mas, 8 o mas, 9 o mas o 10 o mas) componentes de la maquinaria celular descritos en la presente, en donde el resultado de la evaluacion es indicativo del patron de glicanos de alta manosa presentes en una glicoprotema producida por la celula.
En un caso, los componentes de la maquinaria celular se seleccionan de:
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Glicosiltransferasas/enzimas

• MGAT1 (GIcNAc T1);
• Alfa-manosidasa II, IIx;

• Alfa-manosidasa IB;

• Alfa-manosidasa IA;
• FucT1-9;
• Glucosidasa (por ejemplo, GCS1, GANAB).
• Niveles de precursores
• UDP-GlcNAc
• GDP-Man
• UDP/UTP
• GDP/GTP
• Uridina
• Guanosina
Biosmtesis o localizacion o trafico de precursores
• GNE (glucosamina (UDP-N-acetil)-2-epimerasa/N-acetilmanosamina)
• UDP fosfatasa del aparato de Golgi
• Transportador de UDP-GlcNAc
• UAP-1 (UDP-N-acetilhexosamina pirofosforilasa)
• PGM-3 - fosfoglucomutasa 3
• NAGK - N-acetil-D-glucosamina quinasa
• GNPNAT1 - glucosamina-fosfato N-acetiltransferasa 1
• UGP-2 - UDP-glucosa pirofosforilasa 2
• UGDH - UDP-glucosa 6-deshidrogenasa
• GAlK-1 - Galactoquinasa-1
• PGM-1 - Fosfoglucomutasa-1
• GCK - Glucoquinasa
Objetivos para alterar la localizacion o el trafico a traves del RE y el aparato de Golgi
• Chaperonas (BiP, SNARE, cpn, hsp)
• EDEM (protema similar a manosidasa de degradacion del RE)
• MANEA
• Receptor de manosa
• Arquitectura del aparato de Golgi, estructural
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• Contenido lip^dico del aparato de Golgi (esfingoKpidos, contenido de colesterol)
• Componentes de trafico (A1P1, VIP36)
En un caso se evalua la relacion de expresion de MGAT1 con respecto a alfa-manosidasa IB. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica que los niveles de Man5 en una glicoprotema producida por una celula seran elevados en relacion con el grupo total de glicanos.
En un caso se evalua la relacion de MGAT1 con respecto a alfa-manosidasa IA. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica que los niveles de Man5 en una glicoprotema producida por una celula seran elevados en relacion con el grupo total de glicanos.
En un caso se evalua la relacion de expresion de MGAT1 con respecto a MGAT2. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica que los niveles de Man5 en una glicoprotema producida por una celula seran elevados en relacion con el grupo total de glicanos.
En un caso se evalua la relacion de expresion de NAGK/GNE y/o NAGK con respecto a MGAT2. Una relacion baja de ambas, por ejemplo, cada una menos de 1, indica que los niveles de estructuras de alta manosa seran elevados en relacion con el grupo total de glicanos.
En un caso se evalua la relacion de expresion de MGAT1 con respecto a glucosidasa. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica que los niveles de ciertas estructuras de alta manosa (Man5, Man6, Man7, Man8, y/o Man9) seran elevados en relacion con el grupo total de glicanos.
En un caso se evalua la relacion de expresion de manosidasa IA y IB. Las diferencias en la relacion de expresion de estas puede afectar la composicion de las estructuras de alta manosa (por ejemplo, Man8 y Man9 en particular) presentes en una protema glicosilada.
En un caso se evalua la relacion de expresion de EDEM y manosidasa IA. Una relacion elevada, por ejemplo, de mas de 1, indicana un sesgo hacia alta manosa en una glicoprotema producida en una celula.
En un caso se evalua la relacion de expresion de manosidasa IIx y MGAT1. Una relacion elevada, por ejemplo, de mas de 1, indica un sesgo hacia manosa mas baja en una glicoprotema producida en una celula.
En un caso se evalua la relacion de expresion de manosidasa IA y una glucosidasa 1,3 (GANAB). Una relacion elevada, por ejemplo, de mas de 1, indicana un sesgo hacia alta manosa (por ejemplo, Man9) en una glicoprotema producida en una celula.
En un caso se evalua la relacion de una fucosiltransferasa con respecto a manosidasa 1b. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica un enriquecimiento en alta manosa, por ejemplo, Man5.
En un caso se evalua la relacion de expresion de manosidasa II con respecto a manosidasa IB. Una relacion baja, por ejemplo, de menos de 1, indica enriquecimiento en alta manosa, por ejemplo, Man5.
En un caso se evalua el nivel de expresion de VIP36. Los niveles de expresion de VIP36 influyen en el contenido de manosa de las glicoprotemas producidas en la celula. En un caso se evalua la relacion de expresion VIP36 y manosidasa IA. En un caso se evalua la relacion de expresion VIP36 y manosidasa IB.
En un caso se evalua el nivel de UGP-2. Los niveles de expresion de UGP-2 influyen en el contenido de manosa de las glicoprotemas expresadas en la celula. En un caso se evalua la relacion de expresion de UGP-2 con respecto a manosidasa IB. Una relacion elevada, por ejemplo, de mas de 1, indicana un nivel mas elevado de estructuras de alta manosa.
En algunos casos, el metodo tambien incluye la seleccion de una celula como celula huesped para expresion de una glicoprotema terapeutica (tal como una molecula de IgG) en funcion del resultado del metodo de evaluacion de la capacidad y/o el potencial de una celula para producir estructuras de alta manosa. Por ejemplo, en un caso la celula se selecciona como una celula huesped si el resultado del metodo de evaluacion de la capacidad y/o el potencial de la celula para producir estructuras de alta manosa indica que la celula puede producir o producira una glicoprotema con niveles bajos de estructuras de alta manosa (por ejemplo, estructuras de alta manosa <20%, <15%, <10%, <9%, <8%, <7%, <6%, <5%, <4%, <3%, <2%, <1%, <0,5% en relacion con la masa total de glicanos). En otro ejemplo, en un caso la celula se selecciona como una celula huesped si el resultado del metodo de evaluacion de la capacidad y/o el potencial de la celula para producir estructuras de alta manosa indica que la celula puede producir o producira una glicoprotema con niveles mas elevados de estructuras de alta manosa (estructuras de alta manosa de, por ejemplo, >10%, >15%, >20% en relacion con la masa total de glicanos). En otro ejemplo, en un caso la celula se selecciona como una celula huesped si el resultado del metodo de evaluacion de la capacidad y/o el potencial de la celula para producir estructuras de alta manosa indica que la celula puede producir o producira una glicoprotema que tenga una estructura de alta manosa predeterminada (por ejemplo, una relacion relativa predeterminada de una especie de alta manosa con respecto a otra, por ejemplo abundancias o relaciones relativas de Man4, Man5, Man6,
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Man7, Man8 y/o Man9 y sus isomeros; relaciones relativas predeterminadas de alta manosa con respecto a estructuras hforidas, relaciones relativas predeterminadas de alta manosa con respecto a estructuras complejas, relaciones relativas predeterminadas de alta manosa con respecto a estructuras fucosiladas, abundancia predeterminada de estructuras de alta manosa modificadas, por ejemplo, estructuras de alta manosa fucosiladas).
En un caso, el metodo tambien incluye una etapa para disenar geneticamente la celula seleccionada a fin de expresar una glicoprotema terapeutica, por ejemplo, una molecula terapeutica basada en IgG, por ejemplo, un anticuerpo terapeutico o una protema de fusion del receptor Fc, como bevacizumab, tositumomab, abciximab, alemtuzumab, acritumomab, cetuximab, adalimumab, ranibizumab, gemtuzumab, efalizumab, infliximab, abciximab, rituximab, basiliximab, eculizumab, palivizumab, omalizumab, daclizumab, ibritumomab tiuxetan, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, muromonab-CD3, natalizumab, panitumumab, ranibizumab, tositumomab, alefacept, etanercept, abatacept.
En algunos casos, el metodo tambien incluye la expresion y la cosecha de glicoprotemas a partir de la celula disenada geneticamente y la evaluacion de estructuras de alta manosa de la glicoprotema producida, por ejemplo, utilizando un metodo descrito en la presente.
Metodos para controlar estructuras de alta manosa
Se han desarrollado metodos para modular las estructuras de alta manosa. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo para modular la estructura de glicanos de una glicoprotema, por ejemplo, una glicoprotema terapeutica recombinante, por ejemplo, modulando la cantidad o el patron de estructuras de alta manosa presentes en una glicoprotema terapeutica recombinante o una glicoprotema comercialmente relevante de cualquier otra manera. El metodo incluye (a) suministro de una celula huesped disenada geneticamente para expresar una glicoprotema objeto y (b) cultivo de la celula en condiciones que permitan expresar la protema recombinante, en donde la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula uno o mas, por ejemplo, dos o mas (por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 6 o mas, 7 o mas, 8 o mas, 9 o mas o 10 o mas) componentes de la maquinaria celular descrita en la presente a fin de modular asf la estructura de glicanos de alta manosa de una glicoprotema. En algunos casos, el contenido de alta manosa se evalua durante el cultivo y/o al momento de cosechar las celulas o despues.
En un caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula una glicosiltransferasa descrita en la presente (por ejemplo, MGAT1). En un caso, la expresion de glicotransferasa se disminuye, pero no se suprime, por ejemplo, la expresion de glicotransferasa se desminuye en un 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en relacion con una madre. En algunos casos, esto se logra mediante el uso de: ARNip, ARN antisentido, desactivacion dirigida, mutacion dirigida, modulacion de concentracion de un cation divalente (por ejemplo, Mn++, Mg+, Co++ o Zn++), modulacion de amomaco, pH elevado (por ejemplo, mediante el uso de ulinastatina o cloroquina), inhibidores qmmicos (tales como: castanospermina, desoxinojirimicina, desoximanojirimicina, australina, 2,5-dihidroximetil-3,4 dihidroxipirrolidina, quifunensina, swainsonina, manostatina A, 1,4-didesoxi-1,4-imino-D-manitol), modulacion (por ejemplo, adicion) de acido oleico, modulacion (por ejemplo, adicion) de acido retinoico, modulacion de factores de transcripcion (por ejemplo, RFX1, Pax-4a, CHOP-10, COUP-TF1, MIF-1, Evi-1, MZF-1, STAT-6, Elk-1, MAZR).
En un caso, el metodo incluye la complementacion del medio de cultivo celular con un cation divalente, por ejemplo, manganeso (Mn++), por ejemplo, MnCh (por ejemplo, desde 25-250 uM MnCh, desde 25-150 uM MnCh, 25-100 uM MnCl2, 25-75 uM MnCh o 25-50 uM MnCh). En este caso, el metodo aumenta los niveles de alta manosa en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula, por ejemplo, aumenta el nivel de HM5. En un caso, el nivel aumenta en al menos el 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o mas en relacion con la glicoprotema producida por una misma celula huesped cultivada en el mismo medio no complementado con Mn++. En un caso, el metodo tambien aumenta el nivel de especies afucosiladas de la glicoprotema, por ejemplo, aumenta la relacion de especies afucosiladas en relacion con las especies fucosiladas en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula. Este caso tambien puede incluir una etapa de medicion del nivel de alta manosa en la glicoprotema, por ejemplo, el nivel total de especies de alta manosa o el nivel de una o mas HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o sus relaciones. Este caso tambien puede incluir una etapa de medicion del nivel de fucosilacion en la glicoprotema, por ejemplo, el nivel total de especies afucosiladas o la relacion de especies afucosiladas con respecto a las fucosiladas en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula.
En un caso, el metodo incluye la obtencion o la determinacion de la identidad o la cantidad de una glicoforma de alta manosa en una muestra de glicoprotemas, por ejemplo, mediante un metodo descrito en la presente, y la complementacion del medio de cultivo celular con un cation divalente, por ejemplo, manganeso (Mn++), por ejemplo, MnCl2 (por ejemplo, desde 25-250 uM MnCh, desde 25-150 uM MnCh, 25-100 uM MnCh, 25-75 uM MnCh o 25-50 uM MnCh), a fin de aumentar asf los niveles de alta manosa en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula, por ejemplo, aumenta el nivel de HM5. En un caso, el nivel aumenta al menos 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% o mas en relacion con la glicoprotema producida por una misma celula huesped cultivada en el mismo medio no complementado con Mn++. En un caso, el metodo incluye la complementacion del medio de cultivo celular con un cation divalente, por ejemplo, manganeso (Mn++), por ejemplo, MnCh (por ejemplo, desde 25-250 uM MnCh, desde 25-150 uM MnCl2, 25-100 uM MnCh, 25-75 uM MnCh o 25-50 uM MnCh), la obtencion y la determinacion de la identidad o la cantidad de una glicoforma de alta manosa, por ejemplo, mediante un metodo descrito en la presente,
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en una muestra de glicoprotemas, la comparacion de la identidad o la cantidad de glicoformas de alta manosa con la identidad o la cantidad de una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra de control, o un GMP o un estandar o especificacion farmaceutica) y la toma de una decision con respecto a la glicoprotema, por ejemplo una decision descrita en la presente.
En un caso, el metodo tambien aumenta el nivel de especies afucosiladas de la glicoprotema, por ejemplo, aumenta la relacion de especies afucosiladas en relacion con las especies fucosiladas en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula. Este caso tambien puede incluir una etapa de medicion del nivel de alta manosa en la glicoprotema, por ejemplo, el nivel total de especies de alta manosa o el nivel de una o mas HM4, HM5, HM6, HM7, HM8, HM9 o sus relaciones. Este caso tambien puede incluir una etapa de medicion del nivel de fucosilacion en la glicoprotema, por ejemplo, el nivel total de especies afucosiladas o la relacion de especies afucosiladas con respecto a las fucosiladas en una preparacion de la glicoprotema producida por la celula.
En un caso, el nivel de alta manosa se aumenta mediante la disminucion de la expresion de un gen divulgado en la presente, por ejemplo, MGAT1, en donde la expresion se disminuye mediante un metodo o un agente que resulta en una relacion no lineal entre la reduccion de la expresion del gen, por ejemplo, MGAT1, y el aumento en la alta manosa. En un caso, una representacion grafica de la reduccion en la expresion, por ejemplo, de MGAT1, y el aumento en alta manosa tiene basicamente tres fases: una fase en la que la reduccion de expresion tiene un efecto pequeno o no tiene ningun efecto en el nivel de alta manosa (no aumenta significativamente la alta manosa), una fase en la que la reduccion en el nivel de expresion es basicamente lineal con el aumento de alta manosa y una fase en la que la reduccion adicional en la expresion del gen causa un pequeno aumento o ningun aumento de alta manosa. En un caso, en un metodo para aumentar la alta manosa, el nivel de expresion del gen, por ejemplo, expresion de MGAT1, se encuentra en la fase lineal. En un caso, la reduccion se encuentra en la mitad de la fase lineal justo antes de la fase maxima y no lineal. En un caso, la reduccion se encuentra en el ultimo 25, 10, 5 o 1% de la fase lineal justo antes de la fase maxima y no lineal. En un caso, el nivel de reduccion no es mas que 1,5, 2,0 o 4,0 veces mayor que el nivel de reduccion de la expresion genica en el punto de inflexion entre la fase lineal y la fase en la que reducciones adicionales en la expresion genica para no proporcionar un aumento significativo adicional en alta manosa.
En un caso, la celula huesped esta sujeta a una cosecha de etapa retrasada o tardfa. En algunos casos, esto incluye el retraso de la cosecha hasta que la viabilidad de las celulas sea inferior al 40%, 30%, 20% o 10%. En otros casos, esto involucrara el retraso de la cosecha hasta que la cantidad de celulas sea superior a 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 10 x 106 o 15 x 106 celulas/ml. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir, de manera no taxativa, a la realizacion de la cosecha una vez que los niveles de los componentes de los medios hayan alcanzado un nivel objetivo inferior al 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% o 0% de los niveles iniciales. Los componentes de estos medios pueden incluir, a modo no taxativo, glucosa, galactosa, glutamina o niveles de aminoacidos. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir, de manera no taxativa, a la realizacion de la cosecha una vez que los niveles de un subproducto celular hayan alcanzado un nivel objetivo que suponga un aumento de mas de 2, 4, 6, 8, o 10 veces respecto a los niveles iniciales. Estos subproductos pueden incluir, a modo no taxativo, amomaco y lactato. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir al retraso del momento de una cosecha en comparacion con un protocolo de alimentacion existente. Esto puede involucrar, a modo no taxativo, retrasar el momento de la cosecha por 6, 12, 18, 24, 48, 72 o 96 horas con respecto al proceso existente. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir al retraso del momento de una cosecha hasta que se alcance un valor de consumo de gas. Esto puede incluir, a modo no taxativo, el retraso del momento de la cosecha hasta que el nivel de consumo de oxfgeno sea superior a 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 mmol/L. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir al retraso en la realizacion de la cosecha hasta que se alcance un multiplo de uno, dos, tres o cuatro de los parametros mencionados anteriormente. En otros casos, una cosecha retrasada puede referir al retraso de la cosecha hasta que se alcance una relacion de dos de los parametros mencionados anteriormente. Esto puede incluir, a modo no taxativo, una relacion de lactato/glucosa inferior a 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,1. De manera alternativa, esto puede incluir, a modo no taxativo, una relacion de oxfgeno/glucosa superior a 3, 4, 5, 6 o 7.
En un caso, la celula huesped esta sujeta a una estrategia de alimentacion retrasada. En algunos casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir, de manera no taxativa, a posponer la adicion de nutrientes alimentados (por ejemplo, componentes de fosfato, glucosa, galactosa, aminoacidos, vitaminas, etc.) en un lote alimentado sistema de cultivo por perfusion hasta que la viabilidad celular sea inferior al 90%, 80% o 70% o hasta que las celulas alcancen una densidad celular particular, tal como mas de 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 10 x 106 celulas/ml. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir, de manera no taxativa, a la adicion de nutrientes alimentados una vez que los niveles de los componentes de los medios hayan alcanzado un nivel objetivo inferior al 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de los niveles iniciales. Los componentes de estos medios pueden incluir, a modo no taxativo, glucosa, galactosa, glutamina o niveles de aminoacidos. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir, de manera no taxativa, a la adicion de nutrientes alimentados una vez que los niveles del subproducto celular hayan alcanzado un nivel objetivo que suponga un aumento de mas de 2, 4, 6, 8, o 10 veces respecto a los niveles iniciales. Estos subproductos pueden incluir, a modo no taxativo, amomaco y lactato. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir al retraso del inicio de una estrategia de alimentacion en comparacion con un protocolo de alimentacion existente. Esto puede involucrar, a modo no taxativo, retrasar el momento de comienzo inicial por 6, 12, 18, 24, 48, 72 o 96 horas con respecto al comienzo de la alimentacion en un proceso existente. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada
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puede referir al retraso del momento de las alimentaciones posteriores en comparacion con un protocolo de alimentacion existente. Esto puede involucrar, a modo no taxativo, retrasar cada momento de alimentacion posterior por 6, 12, 18, 24, 48, 72 o 96 horas con respecto al punto de alimentacion anterior. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir al retraso del momento de alimentacion hasta que se alcance un valor de consumo de gas. Esto puede incluir, a modo no taxativo, el retraso del momento de alimentacion hasta que el nivel de consumo de oxfgeno sea superior a 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 mmol/L. En otros casos, una estrategia de alimentacion retrasada puede referir al retraso de la alimentacion hasta que se alcance un multiplo de 2, 3 o 4 de los parametros mencionados anteriormente. En otros casos, una alimentacion retrasada puede referir al retraso de la alimentacion hasta que se alcance una relacion de dos del los parametros mencionados anteriormente. Esto puede incluir, a modo no taxativo, una relacion de lactato/glucosa inferior a 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,1. De manera alternativa, esto puede incluir, a modo no taxativo, una relacion de oxfgeno/glucosa superior a 3, 4, 5, 6 o 7.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula la arquitectura del aparato de Golgi, por ejemplo, manipulacion (por ejemplo, adicion al cultivo celular) de Brefeldina A, acido micofenolico, Destruxina B, Concanamicina B, Leucinostatina A y Efrepeptinas.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula el trafico del aparato de Golgi, por ejemplo, modulacion (por ejemplo, adicion al cultivo celular) de componentes que afectan la gemacion de un compartimento del aparato de Golgi con otro). Estos incluyen Brefeldina A, acido micofenolico, Destruxina B, Concanamicina B, Leucinostatina A y Efrepeptinas.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula los niveles de metabolitos o precursores, por ejemplo, modulacion (por ejemplo, adicion al cultivo celular) de galactosa 3'F UMP, UDP dialdehfdo, UDP, UTP, UDP acido N-acetilmuramico, 5'aminooxi-uridina, 5'-aminooxi-glicil-uridina, ManNAc. Dichos agentes pueden ser derivados de origen natural o no natural. Estos tambien pueden incluir manipulacion dirigida de niveles o actividades de enzimas involucradas en la biosmtesis de los metabolitos o los precursores. Estos pueden incluir, a modo no taxativo, los descritos anteriormente (por ejemplo GNE, UAP-1, PGM-3, NAGK, GNPNAT1, UGP-2, UGDH, GALK-1, PGM-1, GCK, UDP fosfatasa del aparato de Golgi, transportador de UDP-GlcNAc). Los mecanismos para manipular los niveles de enzimas incluyen mutagenesis dirigida, ARNip, ARN antisentido, desactivaciones dirigidas y analogos estructurales naturales y no naturales.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula el contenido lipfdico del aparato de Golgi, tal como la adicion de inhibidores o biosmtesis de esfingolfpidos (por ejemplo, fumonisina B1, fumonisina B2, L-cicloserina, DL-PDMP, DL-PPMP, DL-treo-dihidroesfingosina, miriocina, L-eritro MAPP, 3-O-metilesfingomielina, N-butildesoxinojirimicina u oleiletanolamida). En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula los niveles de colesterol, como la adicion de un inhibidor de biosmtesis de colesterol (tal como isopentenil pirofosfato, ezetimiba, simvastatina, inhibidores o HMG-COA-reductasa) o la adicion de un agente secuestrante de colesterol, como metil-p-ciclodextrina.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a la manipulacion de niveles de enzimas involucradas en la biosmtesis del lfpido. Estas enzimas pueden encontrarse segun se describe en Molecular Biology of the Cell, Alberts, Bray, Lewis, Raff, Robers, and Watson eds (1994). Los mecanismos para manipular los niveles de enzimas incluyen mutagenesis dirigida, ARNip, ARN antisentido, desactivaciones dirigidas y analogos estructurales y no naturales.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula la afinidad de union de las lectinas tipo L presentes en el RE o el aparato de Golgi (por ejemplo, VIPL VIP36) para intermediarios de alta manosa en la via de glicosilacion a traves de cambios en el pH intracompartimental (por ejemplo, mediante el uso de ulinastatina o cloroquina).
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a manipulacion que modula los componentes de “control de calidad” involucrados en glicosilacion y plegamiento de protemas, como EDEM, MANEAo GCS1.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a una manipulacion que modula la distribucion intracelular (por ejemplo, la localizacion de estas enzimas preferentemente al RE o al aparato de Golgi) de manosidasa 1a y 1b.
En otro caso, la celula huesped esta sujeta a manipulacion que modula el nivel de expresion de la protema que contiene la estructura de alta manosa (por ejemplo, un anticuerpo). Esto puede ser a traves de la adicion de agentes a la cromatina acetilada (por ejemplo, butirato). De manera adicional, puede ser a traves del aumento del numero de copias geneticas del gen que expresa la protema (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, a traves de amplificacion de dhfr, a traves de insercion dirigida, a traves de insercion viral o a traves de secuencias promotoras). En otros casos, esto puede ser a traves del aumento de la tasa de transcripcion o traduccion de la protema (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, a traves de secuencias potenciadoras, a traves de optimizacion con codones o secuencias promotoras).
En un caso, el metodo incluye una etapa de medicion del contenido o los patrones de alta manosa en uno o mas de los casos siguientes: antes y/o despues de la manipulacion, durante el cultivo de las celulas, despues de la cosecha de las celulas, despues de la purificacion de la glicoprotema.
En cierto caso, el metodo incluye una etapa para determinar un nivel deseado u objetivo de contenido de alta
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manosa antes de la manipulacion. El nivel objetivo o deseado puede ser, por ejemplo, >20%, >30%, >40%. El nivel objetivo o deseado puede ser, por ejemplo, <20%, <15%, <10%, <8%, <7%, <6%, <5%, <4%, <3%, <2%, <1%, <0,5%. El nivel objetivo o deseado puede ser, por ejemplo, niveles enriquecidos o aumentados de Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 o Man9. Esta determinacion puede incluir, a modo no taxativo, la medicion de niveles de alta manosa en un compuesto de referencia, o puede determinarse en funcion de una consideracion estructural o biologica deseada o mediante consulta de bibliograffa.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y a partir de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una representacion de la via para la biosmtesis de alta manosa y glicanos complejos. Los monosacaridos que componen el N-glicano se ilustran de la siguiente manera: fucosa (triangulo gris claro), GlcNAc (cuadrado negro), manosa (drculo gris oscuro) y galactosa (drculo gris claro). Las estructuras que representan las especies de alta manosa se indican como HM9, HM8, etc.
La Figura 2 es un grupo de perfiles de LC de glicanos cosechados a partir de una lmea celular de tipo salvaje (CHO) y una lmea celular mutante Lec1 (MGAT1 nulo).
La Figura 3 es un conjunto de representaciones graficas que reflejan los niveles de glicanos modelados para reflejar los niveles variables de MGAT1. Cada representacion grafica refiere al nivel del glicano indicado (% de inicio) basandose en el nivel de expresion de MGAT1 (% de inicio). Estas ilustran que una elevacion en las estructuras de alta manosa no requiere una supresion completa de la transferasa de MGAT1.
La Figura 4 es un grupo de representaciones graficas que muestran un analisis lineal de la expresion del gen UGP-2 en una poblacion celular segun se correlaciona con el contenido de Man5 en una glicoprotema producida por la celula. Cada punto en esta representacion grafica indica un clon espedfico de una de las cuatro lmeas celulares transformadas enumeradas.
La Figura 5 es una representacion grafica de los niveles crecientes de MnCl2 frente a los niveles (% de glicanos totales) de Man5. Los datos representan determinantes duplicados.
DESCRIPCION DETALLADA
Definiciones
El termino “alta manosa”, tal como se usa en la presente, se refiere a una o un multiplo de estructuras de N-glicanos, incluidas HM4, HM5, HM6, HM7, HM8 y HM9, que contienen 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de manosa, respectivamente. De manera alternativa, estas pueden denominarse Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y Man9. Estas estructuras se ilustran en la Figura 1, segun se indica.
Una “preparacion de celulas”, tal como se usa en la presente, se refiere a una preparacion de celulas in vitro. En el caso de celulas de organismos multicelulares (por ejemplo, vegetales y animales), una preparacion purificada de celulas es un subgrupo de celulas obtenido del organismo, no el organismo intacto completo. En el caso de microorganismos unicelulares (por ejemplo, celulas cultivadas y celulas microbianas), consiste en una preparacion de al menos un 10% y mas preferentemente el 50% de las celulas objeto.
El termino “disenada geneticamente”, tal como se usa en la presente en referencia a celulas, pretende comprender las celulas que expresan un producto genico en particular tras la introduccion de una molecula de ADN heterologo en la celula. El ADN heterologo puede ser una secuencia que codifica el producto genico y/o incluye elementos reguladores que controlan la expresion de una secuencia de codificacion (por ejemplo, de una secuencia endogena) para el producto genico. La molecula de ADN puede introducirse mediante reconocimiento genico o recombinacion homologa, esto es, introduccion de la molecula de ADN en un sitio genomico espedfico.
Se hace referencia al documento WO 2008/128227. Varios aspectos de la divulgacion se describen en mas detalle a continuacion.
Celulas huesped/celulas disenadas geneticamente
Una celula huesped utilizada para producir una glicoprotema descrita en la presente puede ser cualquier celula que contenga la maquinaria celular para producir estructuras de alta manosa. Por ejemplo, celulas de insectos, celulas vegetales, levadura o celulas de mairnferos (tales como celulas murinas, humanas o CHO). Las celulas CHO que son utiles como celulas huesped incluyen celulas de cualquier cadena de CHO, incluidas CHO K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO-S, CHO P12 o la lmea celular dhfr-CHO DUK-BII (Chassin et al., PNAS 77, 1980, 4216-4220). Las celulas murinas que son utiles como celulas huesped incluyen cadenas de NS0 u otros tipos de celulas de hibridoma o celulas de roedores similares de BHK. Las celulas humanas que son utiles como celulas huesped incluyen cadenas de PerC6, celulas de hibridoma o celulas retinianas, entre otras.
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Las celulas adecuadas de mai^eras incluyen cualquier celula animal o humana normal mortal o normal o inmortal anormal, incluidas: lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de celulas de rinon embrionarias humanas (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), celulas de rinon de hamster bebe (BHK, ATCC CCL 10); ovario de hamster chino (CHO), por ejemplo, DG44, DUKX-V11, GS-CHO (ATCC CCL 61, CRL 9096, CRL 1793 y CRL 9618); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243 251 (1980)), celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70), celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL 1587), celulas humanas de carcinoma cervical (HeLa, ATCC CCL 2), celulas de hngado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), celulas de pulmon humanas (W138, ATCC CCL 75), celulas de hngado humanas (Hep G2, HB 8065), celulas de melanoma de raton (NSO), tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51), celulas TRI (Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44 46 (1982)), celulas de rinon canino (MDCK) (ATCC CCL 34 y CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), celulas WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, Md.), celulas MCF-7, celulas MDA-MB-438, celulas U87, celulas A127, celulas HL60, celulas A549, celulas SP10, celulas DOX, celulas SHSY5Y, celulas Jurkat, celulas BCP-1, celulas GH3, celulas 9L, celulas MC3T3, celulas C3H-10T1/2, celulas NIH-3T3 y celulas C6/36. El uso de cultivo de celulas de tejido de mairnferos para expresar polipeptidos se discute en general en Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VcH Publishers, N.Y., N.Y., 1987).
Las celulas vegetales ejemplares incluyen, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, colza, mafz, trigo, arroz, tabaco, etc.) (Staub, et al. 2000 Nature Biotechnology l(3): 333-338 y McGarvey, P. B., et al. 1995 Bio-Technology 13(13): 14841487; Bardor, M., et al. 1999 Trends in Plant Science 4(9): 376-380). Celulas de insectos ejemplares (por ejemplo, Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc.). Las celulas bacterianas ejemplares incluyen Escherichia coli. Tambien pueden seleccionarse varias levaduras y hongos, tales como Pichiapastoris, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha y Saccharomyces cerevisiae.
Otras celulas huesped adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica.
Los metodos para generar o utilizar celulas huesped de la divulgacion y para generar glicoprotemas terapeuticas en dichas celulas huesped son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los metodos se proporcionan en Current Protocols in Cell Biology (2007. John Wiley and Sons, Inc., Print ISSN: 1934-2500); Current Protocols in Protein Science (2007, John Wiley and Sons, Inc., Print ISSN: 1934-3655); Wurm, Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells (2004) Nature Biotech. 22:1393-1398; Therapeutic Proteins: Methods and Protocols, Smales and James, eds. (2005, Humana Press, ISBN-10: 1588293904).
Metodos para detectar actividad o expresion de genes
Los metodos de deteccion basados en acido nucleico abarcan ensayos de hibridacion o amplificacion que incluyen, a modo no taxativo, analisis Southern o Northern, analisis de reaccion en cadena de polimerasa (por ejemplo, PCR cuantitativa), analisis SAGE, matrices de sonda o matrices de oligonucleotidos. Las sondas utiles en dichos metodos se seleccionan normalmente de secuencias de genes conocidas. En algunos casos, el material celular de una especie (por ejemplo, una especie de roedores, como el hamster chino) puede evaluarse utilizando sondas identificadas a partir de secuencias de genes ortologos (por ejemplo, secuencias derivadas de ratas o ratones) encontradas en la tecnica.
Las tecnicas basadas en anticuerpos para la deteccion de protemas incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimaticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA), analisis por Western blot y resonancia de plasmon superficial. Otros metodos pueden incluir la deteccion de peptidos o fragmentos de estos mediante el uso de metodos basados en electrometna de masas, incluidos, a modo no taxativo, LC-MS, MS/MS, MS/MS/MS, MALDI-MS, monitoreo de reaccion multiple (MRM).
En un caso, los metodos de deteccion descritos en la presente son parte de la determinacion de un perfil de expresion genica de la muestra, en donde el perfil incluye un valor que representa el nivel de una expresion genica, entre al menos otro valor para la expresion de al menos otro gen. El metodo tambien puede incluir la comparacion del valor o el perfil (por ejemplo, multiples valores) con un valor de referencia o un perfil de referencia. El perfil de expresion genica de la muestra puede obtenerse mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente (por ejemplo, suministrando un acido nucleico de la muestra y poniendo en contacto el acido nucleico con una matriz). El metodo puede utilizarse para evaluar o examinar celulas CHO.
En otro aspecto, la divulgacion presenta un medio informatico que tiene una pluralidad de registros de datos codificados digitalmente. Cada registro de datos incluye un valor que representa el nivel de expresion de un gen en una muestra y un termino descriptivo de la muestra. El termino descriptivo de la muestra puede ser un identificador de la muestra, por ejemplo, el tipo de celula de la que derivo la muestra (por ejemplo una cadena de celulas CHO) o una condicion de cultivo celular en la que se cultivo la celula que es la fuente de la muestra. En un caso, el registro de datos tambien incluye valores que representan el nivel de expresion de genes diferente de Ggta1 (por ejemplo, otros genes asociados a smtesis de glicanos u otros genes en una matriz). El registro de datos puede estructurarse como una tabla, por ejemplo, una tabla que sea parte de una base de datos como una base de datos relacional (por ejemplo, una base de datos SQL de los entornos de bases de datos Oracle o Sybase).
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Metodos de modulacion de la expresion genica
En ciertos metodos de la divulgacion, la expresion genica se modula, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Dichos metodos pueden incluir la reduccion (disminucion) o la supresion (desactivacion) de la expresion de un gen objeto. Los metodos de generacion y uso de moleculas antisentido para modular las actividades biologicas se conocen en la tecnica, vease por ejemplo: Pan and Clawson, Antisense applications for biological control (2006) J. Cell Biochem. 98(1):14-35; Sioud and Iversen, Ribozymes, DNAzymes and small interfering RNAs as therapeutics (2005) Curr Drug Targets 6(6):647-53; Bhindi et al., Brothers in arms: DNA enzymes, short interfering RNA, and the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based gene-silencing strategies (2007) Am J Pathol. 171(4):1079-88. Los metodos para realizar desactivaciones de genes se conocen en la tecnica, por ejemplo, vease Kuhn and Wurst (Eds.) Gene Knockout Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Pres (27 de marzo de 2009).
En algunos casos puede seleccionarse una celula que ha sido disenada geneticamente para desactivacion permanente o regulada de un gen que codifica una protema involucrada en la smtesis de un glicano espedfico, tal como se describe en la presente. Por ejemplo, pueden desactivarse genes que codifican una enzima, tales como las enzimas descritas en la presente. La desactivacion permanente o regulada de la expresion genica puede lograrse apuntando hacia un gen locus con un constructo de ADN plasmido transfectado o un oligonucleotido sintetico. El constructo de plasmido u oligonucleotido puede designarse de distintas maneras. Estas incluyen los siguientes: 1) insercion de genes marcadores seleccionables u otras secuencias dentro de un exon del gen que se esta desactivando, 2) insercion de secuencias exogenas en regiones reguladoras de la secuencia no codificadora, 3) eliminacion o reemplazo de secuencias reguladoras y/o codificadoras y 4) alteracion de una secuencia de codificacion de protemas mediante mutagenesis espedfica del sitio.
En el caso de insercion de un gen marcador seleccionable en la secuencia codificadora, es posible crear una fusion en el marco de un exon endogeno del gen con el exon disenado para contener, por ejemplo, un gen marcador seleccionable. De esta manera, tras un reconocimiento correcto, el gen endogeno expresa un ARNm de fusion (secuencia de acido nucleico mas secuencia de marcador seleccionable). Asimismo, el ARNm de fusion no sena capaz de producir un producto de traduccion funcional.
En el caso de insercion de secuencias de ADN en regiones reguladoras, la transcripcion de un gen puede silenciarse mediante interrupcion de la region del promotor endogeno o cualquier otra region en la region 5' sin traducir (5' UTR) que se necesita para la transcripcion. Dichas regiones incluyen, por ejemplo, regiones de control trasnacional y donantes de empalmes de intrones. En segundo lugar, puede insertarse una nueva secuencia reguladora cadena arriba en el gen, que hana que el gen quedara sujeto al control de factores extracelulares. De esta manera, sena posible regular hacia abajo o extinguir la expresion genica segun se desee para la produccion de glicoproternas. Asimismo, una secuencia que incluye un marcador y un promotor seleccionables puede utilizarse para interrumpir la expresion de la secuencia endogena. Finalmente, todo el gen endogeno o una parte de dicho gen podna eliminarse mediante un diseno adecuado de sustratos de reconocimiento.
Otros metodos para afectar la expresion genica, por ejemplo, aumento o reduccion de la expresion genica, pueden involucrar adicion de agentes, por ejemplo, adicion de agentes especificados a los medios de cultivo tal como se describe en la presente.
Biologia de las estructuras de alta manosa
Se conoce que la presencia de glicanos que contienen manosa en protemas tiene un efecto en la interaccion de estas protemas con varios receptores y parejas de union, mediante la cual se influye en la funcion, la distribucion y la estabilidad de estas protemas que contienen manosa. Dichas parejas de union incluyen receptores Fc, FcRn, lectinas de union de manosa (MBL), C1q, receptor de manosa, DC y L-sign y receptores en celulas espedficas (vease, por ejemplo, Li et al., (2009) Curr Opin Biotechnol. 20, 678-684). De esta forma, los metodos descritos en la presente son utiles para evaluar o modular el direccionamiento de glicoproternas a tejidos espedficos (por ejemplo, medula osea, epitelios mamarios, epitelios intestinales), a tipos de celulas espedficos (por ejemplo, celulas dendnticas, macrofagos) o compartimentos espedficos (por ejemplo, lisosoma). Los metodos descritos en la presente tambien son utiles para evaluar o modular la actividad biologica a traves de uniones de receptores (por ejemplo, receptores Fc), eliminacion/semividas de suero (por ejemplo, mediante union al receptor de manosa, FcRn) y absorcion.
Los metodos descritos en la presente tambien son utiles para evaluar o modular otras actividades biologicas, incluidas: la deposicion y acumulacion de anticuerpos. La estructura de glicanos en la porcion Fc de un anticuerpo cambia la estructura tridimensional del anticuerpo. Se conoce que las alteraciones en la estructura de anticuerpos tienen el potencial de causar acumulacion o deposicion de anticuerpos. Los metodos utilizados en la presente senan utiles para generar anticuerpos con niveles dirigidos de alta manosa a fin de disminuir la deposicion de sueros, la formacion compleja y la acumulacion de anticuerpos. De manera similar, estos cambios estructurales pueden utilizarse para aumentar o disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo.
En algunos casos, las moleculas de anticuerpos tambien pueden contener glicosilacion en la porcion Fab de la molecula. En estos casos, ademas los aspectos biologicos descritos anteriormente, la presencia de una estructura
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de alta manosa tambien puede alterar la afinidad de los epttopos o la capacidad del anticuerpo para formar complejos reticulados en la superficie celular. Los metodos descritos en la presente senan utiles para generar anticuerpos con niveles alterados de estructuras de alta manosa a fin de “marcar” la afinidad deseada, asf como para lograr un nivel deseado de reticulacion de receptores para disminuir los efectos objetivo y aumentar la ventana terapeutica. Ademas, el diseno de polipeptidos y peptidos que contengan alta manosa puede inhibir la degradacion de protemas a traves de una v^a mediada por ubitiquina ligasa.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y a partir de las reivindicaciones.
La presente invencion tambien se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de manera taxativa.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: analisis de alto rendimiento de glicoformas de protemas de alta manosa
Uno de los mayores desaffos para caracterizar glicoformas de baja abundancia en una mezcla es la presencia de glicoformas de abundancia mas alta, asf como la amplia gama de glicoformas en la mezcla. El analisis de glicoformas de baja abundancia tipicamente involucra la liberacion de glicanos desde la protema, ya sea mediante tratamiento enzimatico (PNGAse-F o Endo-H) o qmmico (es decir, hidracinolisis). Los glicanos liberados se purifican y posteriormente se analizan sin derivatizacion adicional o despues del etiquetado con diferentes cromoforos/fluoroforos. No obstante, las etapas laboriosas de preparacion de la muestra involucradas en este proceso, asf como la gran cantidad de material que se necesita para estos analisis, dificulta la capacidad de usar estos tipos de metodo en un escenario de alto rendimiento.
El metodo descrito en la presente es util para analizar glicoformas que contienen alta manosa y, en particular, glicoformas de alta manosa presentes en baja abundancia (por ejemplo, <10%, <5%, <4%, <3%, <2%, <1%, <0,05%).
Al comenzar con una muestra que contiene glicoprotemas, tal como una muestra de anticuerpos (por ejemplo, de cualquier medio, o una preparacion de proteinas), realizar de manera opcional un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con digestion enzimatica de la etapa 2 y/o analisis de espectrometna de masas de la etapa 3. Esta etapa es opcional en funcion de la formulacion de la muestra o el metodo cromatografico de la etapa 3. Tratar la muestra de glicoprotemas con una enzima que escinda glicanos fucosilados complejos de la glicoprotema en la muestra (por ejemplo, endoglicosidasa F3 (
http://glycotools.qa- bio.com/s.nl/it.A/id.96/.f)). Esta etapa revela inesperadamente glicoformas de baja abundancia, tales como especies de alta manosa, en la muestra restante. En la proxima etapa, de manera opcional, reducir y alquilar la muestra y/o realizar un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con MS. En la proxima etapa, analizar la muestra tratada enzimaticamente mediante un analisis de LC-MS de fase inversa o LC-MS de fase inversa dirigida para identificar glicoformas que contienen alta manosa. Tambien pueden emplearse otros tipos de productos qrnmicos en columna. Al conocer las masas teoricas de las glicoformas que contienen alta manosa, puede establecerse un experimento de MS dirigido para monitorear unicamente conjuntos seleccionados de firmas m/z correspondientes a esas especies. Este analisis puede repetirse con varias muestras en un escenario de analisis comparativo.
El metodo descrito anteriormente proporciona un equilibrio excelente entre rendimiento, resolucion y sensibilidad, lo que lo hace particularmente adecuado para el analisis de glicoformas de baja abundancia que contienen alta manosa en un escenario de alto rendimiento.
Ejemplo 2: efecto de niveles de MGAT1 en estructuras de Man5
Se transformaron lmeas celulares de tipo salvaje CHO (WT) y Lec1 (MGAT1 nulo) de manera estable para expresar una protema de fusion modelo de IgG. El producto recombinante se cosecho a partir de las celulas y los N-glicanos se analizaron mediante LC/MS de amida. Los datos de LC de celulas CHO WT (superior) y con deficiencia de MGAT1 (inferior) con glicanos representativos identificados con porcentaje relativo se muestran en la Figura 2. Tal como puede verse en la Figura 2, la glicoprotema producida a partir de las celulas mutantes Lec1 carece de estructuras de Man5.
No obstante, se ha descubierto que no es necesaria la inhibicion completa de MGAT1 para producir este efecto. La Figura 3 es un conjunto de representaciones graficas que reflejan los niveles de glicanos modelados para reflejar los niveles variables de MGAT1. Cada representacion grafica refiere al nivel del glicano indicado (% de inicio) basandose en el nivel de expresion de MGAT1 (% de inicio). Estas ilustran que una elevacion en las estructuras de alta manosa no requiere supresion o agotamiento completo de la transferasa de MGAT1.
Ejemplo 3: identificacion de correlaciones no lineales relacionadas con contenido de alta manosa
Este ejemplo ilustra la identificacion de correlaciones inesperadas y no lineales entre reguladores de glicosilacion y
contenido de alta manosa.
Se generaron clones transformados establemente que expresaban la protema de fusion modelo de IgG a partir de cada una de las lmea celulares CHOK1, CHOS, DG44 y Dhfr-. El producto de IgG se aislo de cada clon y los glicanos se caracterizaron por 2D LC/MS. El nivel de Man5 se determino como un porcentaje del total de glicanos. 5 De manera simultanea, se extrajo ARNm de cada clon y se caracterizaron los niveles de distintas enzimas involucradas en aspectos dispares de smtesis de glucidos. Dichas enzimas incluyen glicosiltransferasas, transportadores, enzimas metabolicas y otras involucradas en la biosmtesis de glicanos. Estos datos estuvieron sujetos a analisis lineal para identificar relaciones entre etapas biosinteticas particulares y el contenido de Man5. La Figura 4A muestra el nivel de expresion genica de UGP-2 dado que muestra inesperadamente una correlacion lineal 10 con el contenido de Man5 en una glicoprotema producida por la celula. Sin restringirse a la teona, la Figura 4B ilustra como este gen puede, retrospectivamente, estar correlacionado con metabolitos involucrados en la biosmtesis de Man5.
Ejemplo 4: niveles de Man5 afectados por altas concentraciones de cationes divalentes
Este ejemplo ilustra el efecto inhibitorio de niveles elevados de cationes divalentes en la actividad de glicoenzimas.
15 Se cultivaron celulas CHO que expresaban una protema de fusion modelo de IgG en presencia de niveles crecientes de MnCl2. El producto se cosecho a partir de estas celulas despues de 5 dfas, se purifico y estuvo sujeto a analisis de N-glicanos mediante HPLC de fase normal. Se cuantificaron los niveles (% de glicanos totales) de Man5, segun se muestran en la Figura 5. Como puede verse, debido a que los niveles de Mn en los medios son elevados, existe un aumento concomitante en el contenido de alta manosa. Sin restringirse a la teona, este puede estar impulsado 20 principalmente por la actividad del cofactor Mn en las transferasas.
Extensiones y alternativas
En caso de que una o mas de las bibliograffas o materiales similares citados difieran de esta solicitud o la contradigan, incluidos, a modo no taxativo, los terminos definidos, los terminos de uso, las tecnicas descritas o similares, prevalecera esta solicitud. Los tttulos de secciones utilizados en la presente se incluyen unicamente con 25 fines de organizacion y no deben interpretarse como una limitacion al objeto descrito de ninguna manera. Si bien los metodos se han descrito junto con diferentes realizaciones y ejemplos, no se pretende que dichos metodos se limiten a dichas realizaciones o dichos ejemplos. Por el contrario, los metodos abarcan diferentes alternativas, modificaciones y equivalentes dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, tal como lo apreciaran los expertos en la tecnica.
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Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa en una muestra de glicoprotemas, incluyendo el metodo: (a) suministro de una muestra de glicoprotemas la cual comprende glicoformas que contienen glicanos de alta manosa, donde los glicanos de alta manosa estan presentes con una abundancia de menos del 20% en relacion con la masa total de glicanos de la muestra de glicoprotemas;
    (b) tratamiento de la muestra de glicoprotemas con Endoglicosidasa F3; y
    (c) cuantificacion de las glicoformas que contienen alta manosa en la muestra tratada.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la etapa (c) abarca la realizacion de electroforesis capilar (CE), LC-MS de fase inversa o LC-MS de fase inversa dirigida en la muestra tratada.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 que adicionalmente comprende la determinacion de uno o mas de los siguientes:
    (i) la cantidad de glicoformas de alta manosa en la muestra de glicoprotemas en relacion con el total de glicoformas;
    (ii) una o mas relaciones relativas de dos especies de alta manosa seleccionadas de Man4, Man5, Man6, Man7, Man8 y Man9 en la muestra de glicoprotemas;
    (iii) la relacion relativa de alta manosa con respecto a estructuras tnbridas en la muestra de glicoprotemas;
    (iv) la relacion relativa de alta manosa con respecto a estructuras complejas en la muestra de glicoprotemas;
    (v) la relacion relativa de alta manosa con respecto a estructuras fucosiladas en la muestra de glicoprotemas;
    (vi) la presencia o la abundancia de estructuras de alta manosa modificadas (por ejemplo, la presencia o la abundancia de estructuras de alta manosa fucosiladas) en la muestra de glicoprotemas.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde el metodo comprende la determinacion de la presencia o abundancia de estructuras de alta manosa modificadas en la muestra de glicoprotemas y en donde las estructuras de alta manosa modificadas son estructuras de alta manosa fucosiladas.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el metodo identifica y/o cuantifica de manera separada al menos dos glicoformas individuales en la muestra de glicoprotemas.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la glicoprotema es una preparacion de anticuerpos o una preparacion de fusion de un receptor Fc.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el metodo se realiza en condiciones de GMP.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, que incluye ademas la comparacion de la identidad o la cantidad cuantificada de glicoformas de alta manosa con un nivel de referencia o criterio de calidad.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde el nivel de referencia es el de una muestra de control, un estandar de GMP o un estandar farmaceutico.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende entre las etapas (a) y (b) una etapa de realizacion en la muestra de glicoprotemas de un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con la digestion enzimatica y/o analisis de espectrometna de masas (MS).
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas entre las etapas (b) y (c), una etapa de reduccion y alquilacion de la muestra tratada y/o realizacion en la muestra tratada de un intercambio de solucion amortiguadora por una solucion amortiguadora compatible con la espectrometna de masas.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la muestra de glicoprotemas comprende una glicoprotema terapeutica.
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