ES2602446T3 - Procedimiento para la eliminación de biopelículas - Google Patents

Abstract

Método para la eliminación de biopelículas presentes sobre un sustrato, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) preparación de un componente detergente que comprende un agente secuestrante, así como un agente humectante y un agente dispersante, y de un componente enzimático que contiene al menos una proteasa, al menos una lacasa y al menos una polisacaridasa, b) disolver el componente detergente en una fase acuosa, c) disolver el componente enzimático en la solución formada en la etapa b), para formar una solución de una composición para la eliminación de las biopelículas presentes sobre un sustrato, en donde dicha solución formada tiene un pH comprendido entre 6,5 y 7,5, o b') disolver el componente enzimático en una fase acuosa, c') disolver el componente detergente en la solución formada en la etapa b'), para formar una solución para la eliminación de biopelículas, en donde dicha solución formada tiene un pH comprendido entre 6,5 y 7,5, d) aplicación de la solución de dicha composición, formada en la etapa c) o c'), sobre el sustrato durante un periodo predeterminado de tiempo, en particular comprendido entre 15 minutos y 4 horas, e) adición de una solución básica después de la citada aplicación d) de la solución de dicha composición sobre dicho sustrato, durante el citado periodo predeterminado de tiempo, con el fin de elevar el pH hasta aproximadamente 8 a 9.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la eliminacion de biopelfculas

La invencion hace referencia al campo de la eliminacion de biopeKculas. De manera mas particular, la invencion se refiere a un procedimiento para eliminar las biopelfculas.

La higiene adquiere una importancia creciente en la industria alimentaria, en los hospitales y, en particular, en el campo de la cirugfa, en las instalaciones de potabilizacion y desalinizacion de aguas, en el tratamiento de las aguas de proceso y, en especial, en las aguas utilizadas en torres de refrigeracion y en las necesidades de la vida diaria, por ejemplo, las lentes de contacto. A menudo, se observa que durante la circulacion de agua sobre un soporte, los microorganismos que circulan libremente en el agua pueden adherirse a la superficie. A continuacion, estos microorganismos pueden desarrollar una matriz extracelular adhesiva compuesta por sustancias polfmeras. El conjunto de microorganismos adheridos a una superficie e incluidos en una matriz de este tipo se denomina biopelfcula. Por lo general, estas biopelfculas estan compuestas de bacterias.

Desgraciadamente, se observa que esta matriz es muy resistente y puede representar una barrera para los agentes que podnan actuar contra los microorganismos. Los tratamientos clasicos basados en sosa y/o que comprenden diferentes biocidas no actuan de forma suficientemente eficaz puesto que no penetran en la totalidad del espesor de la biopelfcula, o resultan inhibidos por determinadas moleculas que componen dicha matriz. Por lo tanto, el tratamiento solo tiene una eficacia parcial sobre la superficie superior de la biopelfcula. Ademas, esto ultimo puede tambien captar otros microorganismos - especialmente, patogenos - adicionales a los inicialmente presentes.

Por el documento WO98/26807 se conoce un procedimiento de tratamiento enzimatico de una pelfcula biologica. En ese procedimiento, se pone en contacto la biopelfcula con una composicion de limpieza que comprende una o multiples hidrolasas para eliminar o liberar la capa de biopelfcula de la superficie. En una segunda etapa, la biopelfcula se pone en contacto con una composicion desinfectante y bactericida para degradar las celulas bacterianas presentes en la pelfcula. Sin embargo, el empleo simultaneo de estas dos composiciones determina un grado de inactivacion de ciertas enzimas en la mezcla final. Por lo tanto, se pueden mejorar la rapidez y eficacia de la limpieza con el uso de una composicion en la que no se produzca la inactivacion de enzimas.

Asimismo, por el documento US2003/0205247 se conoce la utilizacion de soluciones acuosas que contienen enzimas para la limpieza de depositos de almacenamiento o fermentacion, que contienen una o multiples enzimas seleccionadas de las siguientes: lacasas, peroxidasas, oxidorreductasas, transferasas, isomerasas, liasas o ligasas, y un agente espesante con un amplificador de espuma. El campo de accion de las soluciones anteriormente mencionadas es relativamente restringido, espedfico para las cervecenas, puesto que las enzimas seleccionadas e ilustradas son particularmente conocidas por ser activas sobre los polifenoles que constituyen principalmente los residuos de la fermentacion, taninos y analogos. El agente espesante es una sustancia que modifica la viscosidad y la tixotropfa de la solucion, que se utiliza con la finalidad de permitir una mejor adherencia de la solucion y/o espuma sobre las superficies de los depositos tratados. Estas soluciones no son apropiadas para la limpieza de instalaciones diferentes de recipientes y depositos (que comprenden, por ejemplo, numerosas tubenas) y no son adecuadas para la eliminacion de otros tipos de microorganismos y, por tanto, para una amplia variedad de biopelfculas.

El documento WO 92/13807 da a conocer el uso de una composicion que permite la eliminacion de la biomasa y de biopelfculas de sustratos en sistemas acuosos, es decir, en sistemas en los que se hace circular o se almacena agua. Este tipo de sistema adolece de la presencia de biomasa y de biopelfculas alcalinas o acidas debidas al tipo de organismo generalmente presente en esta clase de instalaciones.

Para resolver este problema, el documento WO 92/13807 preve la utilizacion de polisacaridos y/o de proteasas y de tensioactivos anionicos tales como SDS o DBS (dodecilsulfato sodico y acido dodecilbencenosulfonico, respectivamente) para la eliminacion de la biomasa y las biopelfculas.

El documento WO 2006031554 se refiere, igualmente, a un procedimiento para retirar, reducir o desestructurar las biopelfculas presentes sobre una superficie (sustrato), en donde este procedimiento se basa en la aplicacion, sobre el sustrato, de una alfa-amilasa derivada de una bacteria.

Desgraciadamente, este tipo de composicion y estos procedimientos segun el estado de la tecnica no son eficaces para una extensa gama de biopelfculas generadas por diversos microorganismos, y exhiben una eficacia limitada para la eliminacion de biopelfculas.

Tal como se puede comprobar por el texto anterior, estas composiciones y estos procedimientos siempre estan dirigidos a un tipo de biopelfcula o un microorganismo diana y/o a una aplicacion particular.

Existe, por lo tanto, la necesidad de una composicion y un procedimiento capaces de eliminar biopelfculas, que sean eficaces dentro de un intervalo razonable de tiempo, actuen sobre una amplia gama de biopelfculas producidas por una extensa variedad de microorganismos o grupos de microorganismos, que no sean perjudiciales para el soporte de la biopelfcula, y que actuen tanto para prevenir el desarrollo de biopelfculas como sobre biopelfculas formadas desde mucho tiempo antes y que han alcanzado un grado de cohesion y resistencia importante.

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Para solucionar este problema, la presente invencion ofrece un metodo para la eliminacion de biopelfculas presentes sobre un sustrato, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a) preparacion de un compuesto detergente que comprende un agente secuestrante, asf como un agente humectante y un agente dispersante, y de un compuesto enzimatico que contiene al menos una proteasa, al menos una lacasa y al menos una polisacaridasa,

b) disolver el compuesto detergente en una fase acuosa;

c) disolver el compuesto enzimatico en la solucion formada en la etapa b) para formar una solucion de una composicion para eliminar las biopelfculas presentes sobre un sustrato, en donde dicha solucion formada tiene un pH comprendido aproximadamente entre 6,5 y 7,5,

o b') disolver el compuesto enzimatico en una fase acuosa,

c') disolver el compuesto detergente en la solucion formada en la etapa b') para formar una solucion para eliminar biopelfculas, en donde la citada solucion formada presenta un pH comprendido aproximadamente entre 6,5 y 7,5.

d) aplicacion de la solucion de la citada composicion formada en la etapa c) o c') sobre el sustrato durante un periodo de tiempo predeterminado, en particular, comprendido entre 15 minutos y 4 horas,

e) adicion de una solucion basica, despues de dicha aplicacion d) de la solucion de la citada composicion sobre dicho sustrato durante el mencionado periodo de tiempo predeterminado, de manera que se produce una elevacion del pH hasta aproximadamente 8 a 9.

El procedimiento segun la invencion, basado en el uso de una composicion que comprende un compuesto detergente y un compuesto enzimatico que contiene al menos una proteasa, al menos una lacasa y al menos una polisacaridasa permite, sorprendentemente, mejorar de manera importante la rapidez y la eficacia de la eliminacion de una biopelfcula, con la capacidad de atacar distintos tipos de biopelfculas. Esta composicion permite eliminar la totalidad o la casi totalidad de la biopelfcula, y puede actuar sobre biopelfculas incluso maduras o que tengan un ciclo de desarrollo mas precoz y generadas por multiples especies o microorganismos diferentes.

En la actualidad, es necesario saber que ninguna composicion eficaz y ningun procedimiento permiten asegurar la eliminacion completa de las biopelfculas existentes en las instalaciones. Por ejemplo, en el campo de la industria alimentaria, la formacion de biopelfculas es inevitable (a causa de la riqueza del medio ambiente). Las biopelfculas presentan una actividad dclica de crecimiento que comprende una fase de crecimiento, durante la cual se produce la acumulacion de microorganismos, y una fase de desprendimiento, durante la que se desprenden trozos completos de la biopelfcula a causa de la erosion y bajo la accion de su propio peso. En realidad, cuando se detecta este fenomeno en un centro industrial, se debena detener la cadena de produccion y llevar a cabo diferentes ciclos de lavado alternativos con sosa y con numerosos detergentes y/o limpiadores qmmicos y/o enzimaticos, dado que no existen composiciones polivalentes. Esto significa muchas horas de trabajo y perdida de rendimiento de la instalacion.

En consecuencia, en la practica, la produccion no se interrumpe y cuando la biopelfcula esta en fase de ruptura, los lotes producidos estan contaminados y se eliminan hasta que el nivel de contaminacion por microorganismos de los alimentos producidos se encuentran nuevamente dentro de los lfmites aceptables segun las normas vigentes. Ademas, las industrias no tienen previsto disponer de un stock de solucion detergente o enzimatica determinada para cada microorganismo susceptible de contaminar su cadena de produccion.

De forma muy sorprendente, el procedimiento segun la presente invencion permite poner a disposicion una composicion detergente perfectamente polivalente, que permite eliminar un amplio espectro de biopelfculas en diferentes tipos de instalaciones y que no requieren precauciones particulares de uso en lo que respecta a instalaciones tanto de depositos como de tubenas. El detergente elimina una parte superficial de la biopelfcula y empapa y/o hincha las estructuras organicas de la biopelfcula gracias al caracter dispersante del agente dispersante presente en la composicion detergente. Esto favorece, por tanto, el acceso del componente enzimatico que fragiliza y degrada la matriz de la biopelfcula. Esta accion combinada de tres tipos de enzimas y del componente detergente favorece el acceso de la composicion a las capas mas profundas y permite un desprendimiento optimo de todo tipo de biopelfculas, preservando al mismo tiempo el sustrato.

Preferiblemente, dicho al menos un componente enzimatico comprende una proporcion de proteasa(s) comprendida entre 10 y 50%, una proporcion de lacasa(s) comprendida entre 5 y 35%, y una proporcion de polisacaridasa(s) comprendida entre 5 y 20% en peso con respecto al peso total del componente enzimatico, en donde se alcanza eventualmente el 100% del componente enzimatico con ayuda de un excipiente o disolvente convencional, por ejemplo, un alcohol.

Segun una realizacion preferida de la invencion, el componente enzimatico puede contener entre 1 y 10 proteasas, preferiblemente, entre 1 y 5 proteasas, mas preferiblemente, puede contener 2, 3, 4 o 5 proteasas.

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Ejemplos no limitantes de enzimas proteasas pertenecientes a la clase EC 3.4 y que se pueden utilizar en la invencion son las aminopeptidasas (EC 3.4.11), dipeptidasas (EC 3.4.13), dipeptidil-peptidasas y tripeptidil- peptidasas (EC 3.4.14), peptidil-dipeptidasas (EC 3.4.15), carboxipeptidasas tipo serina (Ec 3.4.16), metalocarboxipeptidasas (EC 3.4.17), carboxipeptidasas tipo cistema (EC 3.4.18), peptidasas omega (EC 3.4.19), serina endopeptidasas (EC 3.4.21), cistema endopeptidasas (EC 3.4.22), acido aspartico endopeptidasas (EC 3.4.23), metaloendopeptidasas (EC 3.4.24), treonina endopeptidasas (EC 3.4.25) y las endopeptidasas pertenecientes a la clase EC 3.4.99.

Preferiblemente, las proteasas pertenecen a la clase EC 3.4.21. Las proteasas estan disponibles en el comercio bajo diferentes formas que incluyen polvos, granulados, suspensiones y soluciones lfquidas.

Las lacasas que se utilizan en la invencion pertenecen a la clase EC 1.10.3.2. Las lacasas son enzimas que contienen cobre y tienen como funcion oxidar un sustrato en presencia de oxfgeno. Mas espedficamente, las lacasas son oxidorreductasas que actuan con el oxfgeno molecular como aceptor de electrones.

La al menos una polisacaridasa usada en la invencion es una enzima cuya mision es degradar los enlaces dentro de los polisacaridos. Preferiblemente, la al menos una polisacaridasa puede ser una alfa-amilasa, celulasa, hemicelulasa, glucosidasa, beta-glucanasa o pectinasa.

Mas preferiblemente, la al menos una polisacaridasa puede ser una alfa-amilasa perteneciente a la clase EC 3.2.1.1, que tiene como funcion degradar los enlaces (1-4)-alfa-glicosfdicos en los polisacaridos que contienen 3 o mas unidades alfa-(1-4)-D-glucosa.

Preferiblemente, el componente enzimatico puede comprender una proporcion de lacasa(s) de aproximadamente 30%, una proporcion de proteasa(s) de aproximadamente 30%, una proporcion de alfa-amilasa(s) de aproximadamente 10% en peso con respecto al peso total del componente enzimatico, en donde se alcanza eventualmente el 100% del componente enzimatico con ayuda de un excipiente o disolvente convencional.

Segun otra realizacion preferida, si el componente enzimatico comprende 2 proteasas, la proporcion de lacasa(s) puede ser aproximadamente de 30%, la proporcion total de proteasas, aproximadamente de 30%, la proporcion de alfa-amilasa(s) aproximadamente de 10% en peso con respecto al peso total del componente enzimatico, en donde se alcanza eventualmente el 100% del componente enzimatico con ayuda de un excipiente o disolvente convencional.

Por ejemplo, la relacion entre cada proteasa puede estar comprendida entre 1:2 y 2:1, preferiblemente, la relacion entre cada proteasa puede ser de 1:1. Las enzimas presentes en el componente enzimatico ejercen una accion complementaria sobre la biopelmula. Por ejemplo, la lacasa exhibe una gran eficacia sobre la suciedad que no atacan la alfa-amilasa o las proteasas.

Segun una realizacion preferida de la invencion, el componente enzimatico puede ser una solucion o estar en forma solida.

Preferiblemente, el componente enzimatico es una solucion cuyo pH puede estar comprendido entre aproximadamente 8 y 10. Preferiblemente, el componente enzimatico es una solucion acuosa cuyo pH puede estar comprendido entre aproximadamente 8,5 y 9,5; mas preferiblemente, el pH puede ser aproximadamente de 9,0, con la finalidad de preservar al maximo la integridad de las enzimas.

De manera alternativa, el componente enzimatico puede estar en forma solida tal como, por ejemplo, en forma de un liofilizado, polvos, granulados o bajo cualquier otra forma que permita la solubilizacion de dicho componente en un disolvente, dado que finalmente estara disuelto en dicho disolvente. El disolvente puede ser agua o una solucion acuosa, acida, basica, alcoholica, tamponada o neutra. En este caso, entonces, el componente enzimatico solubilizado se podra diluir posteriormente en una solucion acuosa que contiene eventualmente uno o multiples compuestos tales como, por ejemplo, detergentes para formar la solucion de limpieza.

En una realizacion conveniente segun la invencion, dicho al menos un componente detergente comprende una proporcion de agente secuestrante comprendida entre 1 y 10% en peso con respecto al peso total del componente detergente, lo cual constituye una relacion optima entre eficacia, estabilidad y coste.

El agente secuestrante es una sustancia qmmica que tiene la capacidad de formar complejos con los iones minerales, los cuales fija en una forma que impide su precipitacion por reacciones habituales. A modo de ejemplo, el agente secuestrante puede ser el acido etilendiaminotetraacetico, glucono-delta-lactona, gluconato sodico, gluconato de potasio, gluconato de calcio, acido dtrico, acido fosforico, acido tartarico, acetato sodico, sorbitol, o un compuesto que comprende un atomo de fosforo. Preferiblemente, el agente secuestrante puede ser un oxido de fosforo tal como un fosfonato, un fosfinato o un fosfato, o mezclas de los mismos, o una sal de los mismos, una amina o un oxido de amina que tiene en su estructura al menos un grupo funcional fosfina, oxido de fosfina, fosfinito, fosfonito, fosfito, fosfonato, fosfinato o fosfato, solos o en combinacion, o una sal de los mismos.

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Mas preferiblemente, el agente secuestrante puede ser un fosfonato o una sal del mismo, una amina o un oxido de amina que en su estructura comprende al menos un grupo funcional fosfina, oxido de fosfina, fosfinito, fosfonito, fosfito, fosfonato, fosfinato o fosfato, solos o en combinacion, o una sal de los mismos. Como ejemplo no limitante, el

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fosfonato puede tener la formula general R (R O)(R O)P=O, en donde R , R y R significan, independientemente, un grupo hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquil-amino sustituido o no sustituido, aminoalquilo sustituido o no sustituido, arilo o arilo sustituido. Como ejemplo no limitante, la amina o el oxido de amina pueden comprender uno, dos o tres sustituyente(s) de formula general CR4R5W, en donde R4 y R5 significan, independientemente el uno del otro, un grupo hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquil-amino sustituido o no sustituido, aminoalquilo sustituido o no sustituido, arilo o arilo sustituido, y W significa un grupo fosfonato, fosfinato o fosfato. El agente secuestrante puede estar en forma de una sal de sodio, calcio, litio, magnesio o potasio; preferiblemente, el agente secuestrante puede estar en forma de una sal de sodio, calcio o potasio.

En una variante conveniente segun la invencion, el componente detergente comprende una proporcion de agente dispersante comprendida entre 1 y 10% en peso con respecto al peso total del componente detergente.

Por lo tanto, el agente dispersante es una sustancia qmmica que tiene la capacidad de mejorar la separacion de las partfculas de una suspension con el fin de impedir la aglutinacion, agregacion y/o la decantacion. El agente dispersante puede ser un polfmero soluble o parcialmente soluble en agua tal como, por ejemplo, polietilenglicol, derivados de celulosa o un polfmero que comprende al menos un resto acido acnlico o ester acnlico. Preferiblemente, el agente dispersante es un polfmero que comprende al menos un resto acido acnlico o ester acnlico de la formula general -(CH2-CH-COOR)-, en donde R significa un grupo hidrogeno, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido. De manera particular, el agente dispersante es un polfmero que tiene un peso molecular medio Mw comprendido aproximadamente entre 500 y 10.000.

Mas preferiblemente, el agente dispersante es un polfmero del acido acnlico. En particular, el agente dispersante puede ser un homopolfmero del acido acnlico con un peso molecular medio comprendido aproximadamente entre 2.000 y 6.000.

En otra realizacion segun la invencion, el componente detergente comprende una proporcion de agente humectante comprendida entre 1 y 15% en peso con respecto al peso total del componente detergente.

El agente humectante es una sustancia qmmica anfffila o una composicion que comprende dicha sustancia qmmica anfffila, que modifica la tension superficial entre dos superficies. El agente humectante tiene la ventaja de favorecer la expansion de un ffquido sobre un solido. El agente humectante puede ser anionico, cationico, no ionico o anfotero. Preferiblemente, el agente humectante puede ser un humectante anionico o no ionico, es decir, que la parte hidrofila tiene una carga negativa o no contiene ninguna carga neta, o puede ser una composicion que comprende un humectante anionico. De manera mas particular, el agente humectante puede ser un ester de sacarosa o una composicion que comprende un sulfato sodico de alquilo y un alcohol.

De manera conveniente y preferible, en el componente detergente segun la invencion, dicho agente humectante no forma espuma con el calor y se selecciona, preferiblemente, del grupo de sulfato sodico de alquilo C6 a C10, alcohol eter sulfatos C6 a C10, sulfonatos de alquil-arilos C6 a C10.

El hecho de que el agente humectante sea un agente humectante que no genera espuma con el calor permite su utilizacion en instalaciones que comprenden multiples tubenas y tubos, evitando de este modo la formacion de espuma y sin alterar sino, por el contrario, mejorando el rendimiento como tensioactivo y/o emulsionante de la composicion segun la invencion. Se entiende que el aporte de una solucion detergente eficaz que no produce espuma limita las etapas de limpieza, lo cual es especialmente deseable sobre todo en instalaciones con multiples tubos o tubenas.

Al igual que el componente enzimatico, el componente detergente puede estar en forma solida para disolver en un disolvente y/o en una fase acuosa o en forma ffquida.

Cuando esta en forma solida, se puede disolver directamente en la solucion formada por el componente enzimatico que, eventualmente, ya esta diluido en la fase acuosa, o se disuelve en un disolvente previamente a su dilucion en la solucion formada por el componente enzimatico y la fase acuosa, o en la fase acuosa directamente, antes de la dilucion del componente enzimatico.

Cuando el componente detergente se encuentra en forma ffquida, se alcanza eventualmente un 100% del componente detergente, por lo general, con ayuda de agua y antes de aplicarlo sobre la biopeffcula, se diluira en la fase acuosa que, eventualmente, ya contiene el componente enzimatico.

Por el termino “disolver”, en el sentido de la presente invencion, se entiende una disolucion de un compuesto solido en una fase ffquida (disolvente), o una dilucion de un compuesto ffquido en otra fase ffquida en la que el compuesto ffquido es miscible.

De manera alternativa, segun la invencion, las etapas b) y c) o b') y c') se pueden llevar a cabo de forma simultanea para obtener una solucion de dicha composicion segun la invencion.

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Segun una realizacion preferida de la invencion, el pH de la solucion formada en la etapa b) esta comprendido aproximadamente entre 11,0 y 14,0, preferiblemente comprendido aproximadamente entre 12,0 y 14,0 y, de forma muy preferible, comprendido entre 12,8 y 13,8.

Segun la invencion, el pH de la solucion de dicha composicion formada en la etapa c) o c') esta comprendido entre 6,5 y 7,5 y se agrega una solucion basica a la citada aplicacion d) de la solucion de dicha composicion sobre dicho sustrato durante el periodo de tiempo predeterminado indicado, de manera que se produce una elevacion del pH hasta aproximadamente 8 a 9.

De este modo, cuando se aplica la composicion segun la invencion sobre el sustrato, el pH predominante esta comprendido entre 6,5 y 7,5, lo cual permite que las condiciones de actividad de la lacasa sean optimas. A continuacion, al efectuar el aumento del pH hasta aproximadamente 8 a 9, las otras enzimas alcanzan, por su parte, su eficacia optima, con el resultado de que la biopelfcula sera eliminada de forma especialmente conveniente, puesto que cada una de las enzimas presentes estara en condiciones optimas para llevar a cabo su accion, y la biopelfcula sera desprendida y eliminada por completo. Ademas, puesto que en las instalaciones donde se pueden formar biopelfculas se utilizan por lo general componentes basicos, no se agrega ningun componente exogeno que pudiera ser problematico para validar la etapa de limpieza. Por ejemplo, para higienizar una instalacion, es frecuente aplicar sosa y, por lo tanto, en el marco de la presente invencion se limita el aporte de sustancias de diferente naturaleza.

Preferiblemente, la temperatura de la solucion del componente detergente formada durante la etapa b) o c') puede estar comprendida aproximadamente entre 35°C y 50°C. Segun una realizacion preferida de la invencion, la composicion segun la invencion se aplica sobre un sustrato cubierto por una biopelfcula durante aproximadamente 30 a 50 minutos, lo que representa un periodo de aplicacion relativamente corto para una eficacia de este tipo.

El presente metodo permite eliminar eficazmente la totalidad o la casi totalidad de la biopelfcula, dejando sobre el sustrato solamente celulas aisladas, desprovistas de la proteccion de la matriz. La accion posterior de un biocida permite destruir la cepa microbiana. Por consiguiente, tras la aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion, una fase de desinfeccion posterior sera mucho mas eficaz que despues de la aplicacion de una fase de limpieza convencional, que no permite esta eliminacion total de la matriz.

De esta forma, segun una realizacion preferida de la invencion, el metodo comprende, ademas, una etapa ulterior de aplicacion de un biocida. Los biocidas pueden ser, por ejemplo y de manera no limitante, de tipo oxidante tal como el acido peracetico, peroxido de hidrogeno, monopersulfato de potasio e hipoclorito sodico. Segun la invencion, la aplicacion de un biocida debe ser posterior a la aplicacion de la composicion segun la invencion para evitar la inactivacion de las enzimas presentes en dicha composicion por parte de los biocidas.

En las reivindicaciones adjuntas se mencionan otras realizaciones segun la invencion.

A partir de la descripcion que se ofrece a continuacion, que carece de caracter limitante y que hace referencia a los dibujos adjuntos y a los ejemplos, se podran deducir caractensticas, detalles y ventajas adicionales de la invencion.

Figura 1 representa un grafico que muestra la cantidad de celulas de una cepa de Pseudomonas fluorescens presente sobre un sustrato, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento.

Figura 2 representa un grafico que muestra la cantidad de celulas de una cepa de Bacillus mycoides presente sobre un sustrato, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento.

Figura 3 representa un grafico que muestra la cantidad de celulas de una cepa de Bacillus cereus presente sobre un sustrato, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento.

Figura 4 muestra imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento sobre dicho sustrato, que esta recubierto por una biopelfcula de la cepa Pseudomonas fluorescens.

Figura 5 muestra imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento sobre dicho sustrato, que esta recubierto por una biopelfcula de la cepa Bacillus mycoides.

Figura 6 muestra imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, tras la aplicacion de diferentes soluciones de tratamiento sobre dicho sustrato, que esta recubierto por una biopelfcula de la cepa Bacillus cereus.

Figura 7 ilustra los resultados de la coloracion de biopelfculas antes de la limpieza con soluciones limpiadoras (A) y despues de la limpieza con dichas soluciones (B).

Figura 8 es un grafico que presenta la eficacia de cuatro enzimas frente a biopelfculas procedentes de la cepa Chryseobacterium meningosepticum.

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Figura 9 es un grafico que presenta la eficacia de cuatro enzimas frente a biopelfculas procedentes de la cepa Bacillus cereus.

Figura 10 es un grafico que presenta la eficacia de cuatro enzimas frente a biopelfculas procedentes de la cepa Pseudomonas fluorescens.

En las figuras, los elementos identicos o analogos tienen las mismas referencias.

Observese que las figuras y ejemplos que se muestran a continuacion no ilustran el procedimiento segun la invencion, sino que hacen referencia al efecto de las soluciones aplicadas para la eliminacion de biopelfculas presentes sobre un sustrato.

Ejemplo 1

Descripcion de la seleccion de condiciones experimentales: los ensayos se llevan a cabo en el marco de un procedimiento de limpieza in situ (NEP, por sus siglas en frances) en una planta piloto industrial. Las biopelfculas se desarrollan sobre una cara plana de un cilindro de acero inoxidable con el centro perforado. Este cilindro, una vez introducido en una canalizacion de diametro interior igual al diametro exterior del cilindro, provoca un estrechamiento brusco del diametro de este, forzando al lfquido a pasar a traves de la perforacion central. Esta restriccion implica alteraciones del flujo, produciendo de este modo zonas muertas en la superficie del cilindro. Estas zonas muertas son favorables para la formacion de una biopelfcula y muy desfavorables para su desprendimiento mecanico causado por el flujo. Por lo tanto, representan tfpicamente las zonas diffciles para eliminar una biopelfcula.

Se utilizan tres cepas diferentes: Pseudomonas fluorescens (suministrada por la Universidad de Cornell, Departamento de Ciencias de la Alimentacion, ftaca, Nueva York, 14853, EE.UU. [Kathryn J. Boor,
kib4@cornell.edu1). Bacillus mycoides (suministrada por el laboratorio AFSSA en Maison-Alfort, Francia [Brigitte Carpentier,
b.carpentier@lerpac.afssa.fr1), y Bacillus cereus (suministrada por INRA, UR638, Processus aux Interfaces et Hygiene des Materiaux, Villeneuve d'Ascq, Francia [Christine Faille,
Christine.faille@lille.inra.fr1).

Se prepara un medio de cultivo de la forma siguiente: extractos de carne en polvo (Biokar) se disuelven en agua destilada al 0,1% y se esterilizan. Sobre la superficie del cilindro se depositan 20 mL de inoculo al 5x107 UFC/mL en una solucion de caldo de tripticasa soya (TSB, Biokar). Los cilindros se incuban en una camara de humedad a 30°C durante 2 horas para permitir la adhesion de las celulas. A continuacion, se retira la solucion de TSB y se sustituye por 20 mL del medio de cultivo de carne y se incuban los cilindros durante 24 horas a 30°C. Entonces, se sustituye el medio de cultivo por un medio fresco a base de carne y los cilindros se incuban nuevamente durante 24 horas.

El procedimiento de limpieza consiste en introducir los cilindros contaminados con la biopelfcula en las canalizaciones derechas de una planta industrial piloto que se limpia por circulacion (procedimiento de limpieza in situ - NEP). Las soluciones de tratamiento se hacen circular durante 30 minutos a 45°C con un caudal de 300 L/h. Para dos de las cepas, los ensayos se llevaron a cabo tambien con un caudal de 600 L/h. Cada ensayo se repite tres veces y se calcula el valor medio.

El desarrollo y la eliminacion de las biopelfculas se siguen por observacion a microscopia y por la cuantificacion de las celulas viables presentes en los cilindros por recuento en medio de Tripticasa Soya Agar tras el desprendimiento de las celulas.

Descripcion del protocolo de preparacion de la composicion

El componente detergente se prepara mezclando en un volumen determinado de agua un fosfonato, un poliacrilato y un humectante anionico. Las correspondientes proporciones en el componente detergente son 3%, 4% y 3%. El pH de la solucion se ajusta a 13,3 por dilucion. Se prepara una solucion del componente enzimatico. Esta comprende una proporcion de 30% de proteasas (EC 3.4.21), 30% de lacasa (EC 1.10.3.2) y 10% de alfa-amilasa (EC 3.2.11) y un excipiente convencional.

El pH de la solucion del componente enzimatico se lleva a 9 por adicion progresiva de una solucion de hidroxido de potasio. La solucion de la composicion segun la invencion se prepara agregando el componente detergente y el componente enzimatico en agua. La solucion de dicha composicion segun la invencion comprende 1% de componente detergente y 0,05% del componente enzimatico. El pH de la solucion de dicha composicion segun la invencion fue aproximadamente de 10.

Descripcion de los ensayos y de sus resultados.

Ensayo con la cepa de Pseudomonas fluorescens

El grafico que se representa en la Figura 1 muestra la cantidad de biopelfcula presente en la pared del cilindro tras la aplicacion de soluciones de tratamiento, bajo las condiciones descritas anteriormente. Las superficies del sustrato estuvieron recubiertas por una biopelfcula formada por la cepa Pseudomonas fluorescens. La cantidad inicial de biopelfcula presente, antes del tratamiento, se designa A1 en la Figura 1.

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A continuacion, se compararon tres soluciones: una solucion que comprende solamente agua (B1), una solucion de sosa al 0,5% (C1) y una solucion de la composicion segun la invencion (D1). Las soluciones se aplicaron con un caudal de 300 L/h y a una temperature de 45°C. La solucion (B1), que comprende agua, permite comprobar el desprendimiento mecanico de la biopelfcula por el flujo.

De esta forma, se observa que la biopelreula es resistente al desprendimiento mecanico, dado que las cantidades de biopelreula son identicas (curvas A1 y B1). La aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion permite una reduccion importante de la biopelfcula (curva D1, 103 UFC) en relacion con una solucion de sosa (curva C1, 105 UFC). La composicion segun la invencion es, por lo tanto, mas eficaz que el tratamiento de referencia (solucion de sosa) sobre una biopelfcula resistente al desprendimiento mecanico.

La Figura 4 muestra multiples imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, despues de la aplicacion de las diferentes soluciones de tratamiento a 300 L/h. La imagen (B4) muestra la superficie del sustrato tratada con la solucion de agua, la imagen (C4) muestra la superficie del sustrato tratada con la solucion de sosa al 0,5% y la imagen (D4) muestra la superficie del sustrato tratada con la solucion de la composicion segun la invencion.

Estos datos muestran de forma clara que la composicion segun la invencion ha eliminado la totalidad de la matriz de las biopelreulas (coloracion difusa) y no quedan mas que celulas aisladas o pequenos grupos de celulas distribuidos en una sola capa sobre las superficies, sin proteccion de una matriz. La solucion de sosa, por sf misma, no permitio eliminar por completo la matriz (coloracion difusa) que protege parcialmente las celulas residuales. Por consiguiente, una fase posterior de desinfeccion sera mucho mas eficaz despues de la aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion.

Ensayo con la cepa de Bacillus mycoides

El grafico que se representa en la Figura 2 muestra la cantidad de biopelfcula presente en la pared del cilindro tras la aplicacion de soluciones de tratamiento, bajo las condiciones descritas anteriormente. Las superficies del sustrato estuvieron recubiertas por una biopelfcula formada por la cepa Bacillus mycoides. La cantidad inicial de biopelfcula presente, antes del tratamiento, se representa en la curva (A2).

A continuacion, se compararon cinco soluciones: una solucion que comprende solamente agua (B2), una solucion de sosa al 0,5% (C2), una solucion de la composicion segun la invencion (D2 y F2), y una solucion de sosa al 2% (E2). Las soluciones A2 a D2 se aplicaron en un caudal de 300 L/h, en tanto que las soluciones E2 y F2 se aplicaron en un caudal de 600 L/h.

La biopelfcula de Bacillus mycoides es relativamente sensible al desprendimiento mecanico y su cantidad se reduce en 90% por aplicacion de la solucion (B2). La aplicacion de la solucion de la composicion segun la invencion (D2 y F2) mostro rendimientos equivalentes a los de la solucion de sosa (C2 y E2), a caudales tanto de 300 L/h como de 600 L/h.

La Figura 5 muestra multiples imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, despues de la aplicacion de las diferentes soluciones de tratamiento a 300 L/h. La imagen (B5) muestra la superficie del sustrato tratada con una solucion de agua, la imagen (C5) muestra la superficie del sustrato tratada con una solucion de sosa al 0,5% y la imagen (D5) muestra la superficie del sustrato tratada con la solucion de la composicion segun la invencion.

Estos datos demuestran claramente que la composicion segun la invencion ha eliminado la casi totalidad de la matriz de las biopelfculas, dejando solamente celulas aisladas y pequenos grupos de celulas distribuidos en una sola capa, sin la proteccion de la matriz. La solucion de sosa no permitio una eliminacion mas eficaz de la biopelfcula. Por lo tanto, la accion posterior de una solucion desinfectante sera mas eficaz si se ha utilizado previamente una solucion de la composicion segun la invencion.

Ensayo con la cepa de Bacillus cereus

El grafico que se representa en la Figura 3 muestra la cantidad de biopelfcula presente en la pared del cilindro tras la aplicacion de soluciones de tratamiento, bajo las condiciones descritas anteriormente. Las superficies del sustrato estuvieron recubiertas por una biopelfcula formada por la cepa Bacillus cereus. La cantidad inicial de biopelfcula presente, antes del tratamiento, se representa en la curva (A3).

Se compararon cinco soluciones: una solucion que comprende solamente agua (B3), una solucion de sosa al 0,5% (C3), una solucion de la composicion segun la invencion (D3 y F3), y una solucion de sosa al 2% (E3). Las soluciones B3, C3 y D3 se aplicaron en un caudal de 300 L/h, en tanto que las soluciones E3 y F3 se aplicaron en un caudal de 600 L/h. Un caudal mas elevado influye sobre el desprendimiento mecanico.

La biopelfcula de Bacillus cereus es totalmente resistente al desprendimiento mecanico (curvas A3 y B3). La composicion segun la invencion muestra una mayor eficacia al caudal de 300 L/h en relacion con una solucion de

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sosa al 0,5% (C3) e, incluso, con un caudal de 600 L/h, con respecto a una solucion de sosa mas concentrada (curva E3).

La Figura 6 muestra multiples imagenes de la superficie de un sustrato, captadas con un microscopio de epifluorescencia, despues de la aplicacion de las diferentes soluciones de tratamiento. La imagen (B6) muestra la superficie del sustrato tratada con una solucion de agua, la imagen (C6) muestra la superficie del sustrato tratada con una solucion de sosa al 0,5% y la imagen (D6) muestra la superficie del sustrato tratada con la solucion de la composicion segun la invencion.

Estas imagenes demuestran una vez mas que la composicion segun la invencion elimina la casi totalidad de la matriz de las biopelfculas, dejando unicamente celulas aisladas o pequenos grupos de celulas distribuidos en una sola capa, sin la proteccion de una matriz.

La solucion de sosa no permite una eliminacion eficaz de la biopelfcula. La fase de desinfeccion del sustrato siguiente a la fase de eliminacion de la biopelfcula sera, por consiguiente, mas eficaz despues de la aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion durante esta fase de eliminacion.

Los diversos ensayos efectuados en este ejemplo demuestran la eficacia de la composicion segun la invencion para eliminar una biopelfcula de un sustrato. La composicion segun la invencion demuestra ser mas eficaz que una solucion de sosa empleada actualmente segun la tecnica anterior. La composicion segun la invencion se muestra tambien muy eficaz para numerosos tipos de biopelfculas producidas por bacterias diferentes. La composicion segun la invencion ofrece, por lo tanto, una solucion eficaz a los problemas mencionados en la tecnica y que son conocidos por el experto en la materia.

Ejemplo 2

Del mismo modo, se han llevado a cabo ensayos en dos lmeas de produccion industrial (industria de produccion de mantequilla y de margarina). Los testigos de acero inoxidable (8 x 1 cm) se depositan durante 15 dfas en los circuitos de produccion que presentan contaminaciones esporadicas. A continuacion, estos testigos se someten a ciclos de produccion y limpieza convencionales en esas instalaciones.

La presencia de una biopelfcula en la instalacion se determino por el desarrollo de una biopelfcula sobre los testigos. En la instalacion, se aplico un procedimiento de limpieza in situ espedfico, haciendo intervenir la composicion segun la invencion, en presencia de testigos contaminados; la eficacia se demostro por la eliminacion de las biopelfculas formadas en los testigos.

La presencia e importancia de las biopelfculas sobre los testigos se determinaron en laboratorio, por medio de la coloracion de los testigos y comparacion de la coloracion obtenida con una escala visual (metodo HYDROBIO®, BKG), asf como por observacion a microscopia optica (40x y 100x).

Se analizaron dos protocolos de limpieza: el primer protocolo sirvio de referencia y corresponde a la aplicacion de soluciones conocidas en la tecnica; el segundo protocolo incluye una etapa adicional de aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion.

En particular, el protocolo I comprende las etapas siguientes: limpieza con agua, limpieza alcalina, enjuague, higienizacion (o desinfeccion) y enjuague final. El protocolo I se aplico cada 32 horas durante una semana. La limpieza con agua se realizo durante 15 minutos a una temperatura comprendida entre 60 y 65°C. La limpieza alcalina permite limpiar las canalizaciones de la materia organica presente tras un ciclo de produccion. Esta etapa se llevo a cabo con una solucion de sosa al 3,5%, que se aplico durante 2*15 minutos a una temperatura comprendida entre 70 y 75°C.

La etapa de higienizacion permite la eliminacion de germenes que estan eventualmente todavfa presentes, pero sin la proteccion de la matriz de la biopelfcula. Esta etapa comprendio la aplicacion de una solucion de Deptil OX al 1,5% (HYPRED) durante 2*15 minutos a una temperatura comprendida entre 20 y 25°C. La solucion de Deptil OX contiene una mezcla de acido peracetico y de peroxido de hidrogeno. Las etapas de enjuague se llevaron a cabo durante 15 minutos a una temperatura comprendida entre 20 y 25°C.

El protocolo II difirio del protocolo I por que comprendio una etapa de limpieza espedfica, previa a la etapa de higienizacion (o desinfeccion). Ademas, el protocolo II se aplico solamente una vez.

La etapa de limpieza espedfica consistio en la aplicacion de una solucion de la composicion segun la invencion. Esta mezcla se aplico durante 30 minutos a una temperatura comprendida entre 40 y 45°C. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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Tabla 1

Cantidad de biopelmula tras el protocolo I (g/m2) Cantidad de biopelmula tras el protocolo II (g/m2)

Lmea de produccion 1

25 <5

Lmea de produccion 2

25 a 35 <5

El protocolo I no permitio limitar ni impedir el crecimiento de una biopelfcula, a pesar de la etapa de higienizacion (desinfeccion). Por consiguiente, la biopelfcula que se formo sobre los testigos de acero inoxidable en el centro de la instalacion es muy resistente. La aplicacion del protocolo II, que incluyo una etapa de limpieza espedfica con una solucion de la composicion segun la invencion, permitio una eliminacion mucho mas eficaz de esta biopelfcula (por debajo del lfmite de deteccion). De este modo, se demuestra una eficacia superior de la limpieza espedfica que, por lo tanto, constituye una solucion innovadora a los problemas de la tecnica anterior.

Ejemplo 3

Se llevaron a cabo ensayos que permitieron comparar los valores optimos de pH.

Se desarrollaron biopelfculas sobre testigos de acero inoxidable previamente lavados y esterilizados. Se preparo un inoculo bacteriano (Pseudomonas aeruginosa) por cultivo durante 16 horas en un medio TSB al 10% (caldo de triptona soya). Este precultivo se diluyo para obtener una densidad optica (DO) de 0,05 a 600 nm y se depositaron 500 |jl de esta solucion sobre cada testigo. Los testigos se incubaron durante 48 horas en placas de Petri mantenidas humedas y colocadas en una estufa a 30°C. Despues de 2 horas, se sustituyo la solucion bacteriana con 500 jl de medio fresco, TSB al 10%. Despues de 24 horas, se renovo este medio de cultivo.

A continuacion, los testigos se limpiaron y se insertaron en soportes metalicos, separados por tuercas. Entonces, se introdujeron en soluciones de limpieza. Los testigos se mantuvieron sumergidos en las citadas soluciones de limpieza durante un tiempo total de 30 minutos.

Las soluciones de limpieza son las siguientes:

1. Composicion segun la invencion a pH 4,5, inmersion durante 30 minutos

2. Composicion segun la invencion a pH 7, inmersion durante 30 minutos

3. Composicion segun la invencion a pH 9,7, inmersion durante 30 minutos

Seguidamente, los testigos se introdujeron en tubos de ensayo que conteman 10 ml de una solucion de TSB + Tween 80 al 0,5% para el recuento de bacterias. Los tubos de ensayo se incubaron durante 5 minutos sobre la mesa, antes de ser tratados por sonicacion durante 2 minutos treinta segundos y sometidos a tratamiento de vortice durante 30 segundos. Se repitieron las etapas de incubacion, sonicacion y vortice.

A continuacion, se recuperaron los testigos y el medio que comprendio la solucion TSB + tween al 0,5% se sometio a diluciones en serie usando agua peptonada (agua peptonada libre de indol: preparar 10 mL de una disolucion a 15 g/L. Seguidamente, diluir 1 mL de esta solucion en 1 litro de agua esteril) y, a continuacion, se extendieron sobre una placa de Petri, incubando a 30°C durante una noche antes del recuento.

Asimismo, la biopelfcula se sometio a coloracion de la forma siguiente: los testigos se escurrieron y sumergieron en la solucion de coloracion selectiva para las protemas de la matriz de la biopelfcula durante 10 minutos. Seguidamente, los testigos se sumergieron en las diferentes soluciones de limpieza 1 a 3, anteriormente mencionadas, durante 10 minutos en 2 ocasiones (las soluciones de limpieza se sustituyeron entre las dos etapas de limpieza), antes de secar al aire libre.

Resultados:

A pH acido (4,5): sobre la superficie de la placa de Petri se desarrollo una capa de bacterias, lo que indica la presencia de una gran cantidad de biopelfcula residual en los testigos.

A pH neutro (7): sobre la superficie de la placa de Petri se desarrollo una capa de bacterias.

A pH alcalino (9,7): ausencia de bacterias en las placas de Petri.

La Figura 7 muestra los resultados de las coloraciones de las biopelfculas. La Figura 7A ilustra los testigos antes de la limpieza con las soluciones limpiadoras 1 a 3, en tanto que la figura B ilustra los testigos de acero despues de la limpieza con las soluciones 1 a 3 de izquierda a derecha. Tal como se puede observar, una limpieza a pH alcalino con la composicion segun la invencion es claramente mas eficaz que a pH acido o a pH neutro; la biopelfcula formada sobre el testigo se desprende por completo a pH alcalino, en tanto que persiste con otros valores de pH.

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Ejemplo comparativo

Se llevo a cabo un ensayo dirigido a determinar la eficacia de cuatro enzimas con respecto a tres cepas bacterianas.

Los resultados de este ensayo se presentan en las Figuras 8 a 10. Las biopelfculas se desarrollaron sobre testigos (12) de acero en conformidad con el Ejemplo 3.

Por lo tanto, se utilizaron cuatro testigos para cada cepa bacteriana (Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus y Chryseobacterium meningosepticum). A continuacion, se enjuagaron los testigos con agua antes de incubarlos por separado durante 30 minutos con una solucion de limpieza que contema, respectivamente, una primera proteasa, una segunda proteasa, una lacasa y una polisacaridasa.

La Tabla 2 muestra el resultado de los recuentos bacterianos, mientras que las Figuras 8 a 10 presentan en la ordenada el logaritmo de los resultados de los recuentos bacterianos y en la abscisa, el tipo de enzima empleado.

Tabla 2.

Chryseobacterium meningosepticum Bacillus cereus Pseudomonas fluorescens

Nivel inicial de contaminacion

2 x 108 7 x 10° 2 x 108

Primera proteasa

4 x 105 7 x 102 1x10

Segunda proteasa

2 x 10° 9x10 3,8 x 104

Lacasa

8x10 13x10 1,6 x 102

Amilasa

1 x 105 9,6 x 104 3,9 x 10°

Tal como se puede observar, ciertas cepas bacterianas son mas sensibles a la accion de la polisacaridasa y la lacasa, como ocurre con Chryseobacterium meningosepticum (Gram-). Bacillus cereus (Gram+) es en sf mismo mas sensible a la combinacion de las dos proteasas, en tanto que Pseudomonas fluorescens (Gram-) es mas sensible a la combinacion de la primera proteasa y lacasa.

Debe entenderse que la presente invencion no esta limitada en ningun caso a las realizaciones descritas anteriormente y que es posible realizar modificaciones sin desviarse del ambito de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, en relacion con los campos de aplicacion de las composiciones segun la invencion, estas han demostrado ser especialmente utiles para un uso en remojo, por ejemplo, en el terreno hospitalario (limpieza de material de laboratorio, de material quirurgico), o por circulacion a traves de tubenas tal como, por ejemplo, en la industria agroalimentaria, en las instalaciones de acondicionamiento de aire, en instalaciones de desalinizacion y potabilizacion de aguas, para los cascos de barcos y todo tipo de material sumergido, en circuitos de maquinas lavadoras, lavavajillas, etc. o tambien por remojo y por circulacion en tubenas.

RESUMEN

“PROCEDIMIENTO DE ELIMINACION DE BIOPELfCULAS” Procedimiento para la eliminacion de biopeKculas presentes en un sustrato.

Claims (2)

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   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para la eliminacion de biopelfculas presentes sobre un sustrato, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

   a) preparacion de un componente detergente que comprende un agente secuestrante, asf como un agente humectante y un agente dispersante, y de un componente enzimatico que contiene al menos una proteasa, al menos una lacasa y al menos una polisacaridasa,

   b) disolver el componente detergente en una fase acuosa,

   c) disolver el componente enzimatico en la solucion formada en la etapa b), para formar una solucion de una composicion para la eliminacion de las biopelfculas presentes sobre un sustrato, en donde dicha solucion formada tiene un pH comprendido entre 6,5 y 7,5, o

   b') disolver el componente enzimatico en una fase acuosa,

   c') disolver el componente detergente en la solucion formada en la etapa b'), para formar una solucion para la eliminacion de biopelfculas, en donde dicha solucion formada tiene un pH comprendido entre 6,5 y 7,5,

   d) aplicacion de la solucion de dicha composicion, formada en la etapa c) o c'), sobre el sustrato durante un periodo predeterminado de tiempo, en particular comprendido entre 15 minutos y 4 horas,

   e) adicion de una solucion basica despues de la citada aplicacion d) de la solucion de dicha composicion sobre dicho sustrato, durante el citado periodo predeterminado de tiempo, con el fin de elevar el pH hasta aproximadamente 8 a 9.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que comprende, adicionalmente, una etapa posterior de aplicacion de un biocida sobre el sustrato.