ES2602633T3

ES2602633T3 - Anticuerpos anti-PSGL-1

Info

Publication number: ES2602633T3
Application number: ES11150345.4T
Authority: ES
Inventors: Rong-Hwa Lin; Chung Nan Chang; Pei-Jiun Chen; Chiu-Chen Huang
Original assignee: Abgenomics Cooperatief UA
Current assignee: Abgenomics Cooperatief UA
Priority date: 2004-05-10
Filing date: 2005-05-10
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2025-05-10
Also published as: NZ551626A; CA2907141C; NZ590690A; US8828397B2; TW201313740A; CN103980361A; EP2377889A2; UY28886A1; ES2448468T3; EP1765396A2; SG187443A1; IL178838A; US20090198044A1; JP2011200247A; TWI402274B; CA2812040C; PT1765396E; PH12015500247A1; EP2377889B1; UA100356C2

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a P-selectina glicoproteína ligando-1 humano sin interferir en la unión entre P-selectina glicoproteína ligando-1 y P-selectina, en donde el anticuerpo, tras la unión a P-selectina glicoproteína ligando-1 sobre una célula T activada induce la muerte de la célula T activada, en donde el anticuerpo comprende una primera cadena de inmunoglobulina, que es una cadena ligera, que contiene SEQ ID NOs: 1-3 y una segunda cadena, que es una cadena pesada, que contiene SEQ ID NOs: 4-6 para uso en el tratamiento de la enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD).

Description

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En una realización, uno de los dos anticuerpos mencionados inmediatamente arriba se forma mediante una cadena ligera y una cadena pesada que contienen, respectivamente, SEQ ID NOs: 1-3 y SEQ ID NOs: 4-6 (p. ej., SEQ ID NOs: 19 y 20, o SEQ ID NOs: 25 y 26).

Un método para inducir la muerte de una célula T activada se divulga en esta memoria. El método incluye poner en contacto uno de los tres anticuerpos arriba descritos con una célula T activada, en que la unión del anticuerpo a la célula T activada induce la muerte de la célula.

Un método para modular una respuesta inmune, mediada por células T, en un sujeto también se divulga en esta memoria. El método incluye (1) identificar un sujeto que tenga o que esté en riesgo de tener una afección relacionada con una respuesta inmune excesiva mediada por células T, y (2) administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno de los tres anticuerpos arriba descritos. Una “respuesta inmune excesiva mediada por células T” se refiere a una respuesta provocada por un nivel excesivo de células T activadas. Un nivel excesivo se refiere a (1) un nivel mayor que un nivel normal, y (2) un nivel mayor que el deseado en un individuo, incluso a pesar de que no sea mayor que un nivel normal. Ejemplos de la afección incluyen una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad alérgica, o un cáncer de células T, así como una situación en la que un sujeto ha recibido o se contempla que reciba un trasplante alogeneico o xenogeneico.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se recogen en la descripción que se acompaña a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Esta invención se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado de que células T activadas pueden ser inducidas a sufrir una apoptosis y pueden ser agotadas mediante la unión de anticuerpos o sus derivados a PSGL-1 sobre las células activadas. Los anticuerpos y derivados son útiles para tratar afecciones asociadas con una respuesta inmune excesiva o indeseada mediada por células T o una proliferación de células T.

Por consiguiente, la invención recoge polipéptidos que contienen CDRs de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina de anticuerpos anti-PSGL-1, así como ácidos nucleicos que los codifican. Tanto las cadenas de inmunoglobulina como los ácidos nucleicos se pueden utilizar para producir los anticuerpos y derivados arriba mencionados.

Una cadena de inmunoglobulina se puede obtener como un polipéptido sintético o polipéptido recombinante. Para preparar un polipéptido recombinante, un ácido nucleico que lo codifica puede ser enlazado a otro ácido nucleico que codifica un participante en la fusión, p. ej. glutatión-S-transferasa (GST – siglas en inglés), 6x etiqueta de epítopo His, proteína gen 3 de M13, o una región constante la cadena pesada de inmunoglobulina. El ácido nucleico de fusión resultante se puede introducir en una célula para la expresión de proteínas. La proteína de fusión puede aislarse a partir de la célula hospedante por métodos bien conocidos en la técnica. La proteína de fusión aislada puede ser tratada adicionalmente, p. ej., mediante digestión enzimática para separar el participante en la fusión y obtener el polipéptido recombinante de interés. Alternativamente, se puede obtener una cadena de inmunoglobulina a partir de una célula hospedante adecuada, activando la expresión endógena de un ácido nucleico que codifica la cadena.

La composición de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina puede variar sin interrumpir la capacidad de formar un anticuerpo capaz de unirse a PSGL-1. Por ejemplo, una variante de este tipo puede contener una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que el residuo aminoácido es reemplazado por un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej. glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo aminoácido no esencial predicho en un polipéptido es preferiblemente reemplazado por otro residuo aminoácido de la misma familia de las cadenas laterales. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de un polipéptido de esta invención, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden rastrear en cuanto a la capacidad de formar un anticuerpo capaz de unirse a PSGL-1 para identificar variantes de esta invención según se describe más adelante en los ejemplos. Las cadenas y variantes de inmunoglobulina arriba descritas pueden utilizarse para producir un anticuerpo de esta invención o sus derivados. Un “anticuerpo” incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas tales como Fab, F(ab’)2, Fv, scFv (anticuerpo de cadena sencilla), y dAb (anticuerpo de dominio; Ward, et. al. (1989) Nature, 341,

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de fusión con la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana en E. coli. ADNc que codifica la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana fue amplificada mediante PCR con cebadores que tienen un sitio BglII y un sitio BamHI. El producto de la PCR se cortó mediante BglII y BamHI y se subclonó en un vector pET-32a (Novagen) que había sido digerido por las mismas enzimas. Después

5 se amplificaron mediante PCR ADNcs que codifican diversas regiones de hCD162 con cebadores que tienen un sitio NdeI en el extremo 5’ y un sitio BglII en el extremo 3’. Los productos de la PCR se cortaron mediante las correspondientes enzimas y se fusionaron en marco a la secuencia que codifica la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana en el vector pET-32a. Los cebadores utilizados en cada una de las construcciones se listan en la Tabla 2, y las secuencias de los cebadores se listan en la Tabla 3.

10 Tabla 2 Nombres de cebadores utilizados en cada uno de los experimentos

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Se utilizó 15A7 de ratón para producir anticuerpos humanizados injertando sus CDRs sobre un armazón humano. Para conservar la afinidad de unión y la especificidad, es esencial conservar la conformación de la región V cuando se injertan las CDRs en el armazón humano. Para seleccionar un donante de armazón apropiado, se compararon las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas ligera y pesada de 15A7 de ratón con las de 50 anticuerpos de ratón que habían sido humanizados.

Se encontró que un anticuerpo de ratón, mDREG-55, tenía una homología de la secuencia elevada con la región V de 15A7 de ratón, tanto en la cadena ligera como en la pesada. Se lista a continuación, una alineación de la secuencia de 15A7 de ratón frente a este anticuerpo mDREG-55 (las CDRs están destacadas):

Alineamiento de la cadena ligera

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Alineamiento de la cadena pesada:

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DREG-55 de ratón es un anticuerpo IgG1 monoclonal contra L-selectina. Las secuencias de las regiones VL y VH de 15A7 de ratón eran respectivamente un 64,3% (armazón solo: 73,8%) y 70% (armazón solo: 81,6%) homólogas con las de DREG55 de ratón. DREG-55 humanizado (HuDREG-55) había sido construido utilizando secuencias de armazón de regiones VL y VH de un Gal de anticuerpo humano. Por lo tanto, para humanizar 15A7 de ratón, las secuencias del armazón de las cadenas ligera y pesada de Gal humano se utilizaron para reemplazar los homólogos de 15A7 de ratón.

Las regiones variables ligera y pesada de 15A7 humanizadas fueron cada una de ellas ensambladas mediante 4 pares de oligonucleótidos sintéticos (~ 80 bases de longitud). Los oligonucleótidos de cada uno de los pares fueron solapados alrededor de 20 nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos se seleccionaron y sintetizaron para codificar las secuencias de proteínas de las regiones variables humanizadas que incluían péptidos señal. El ensamblaje y la amplificación de los genes se realizaron en cuatro etapas: (1) los cuatro pares de oligonucleótidos complementarios se re-asociaron y se extendieron con fragmento de Klenow en 4 reacciones separadas; (2) los 4 fragmentos de ADNds resultantes se mezclaron por pares, se desnaturalizaron, se re-asociaron y se extendieron en dos reacciones separadas; (3) los dos fragmentos de ADNds resultantes se mezclaron, desnaturalizaron, reasociaron y se extendieron para crear el ADNds de longitud completa final; y (4) el ADN resultante se amplificó mediante PCR con cebadores para introducir un sitio XbaI en ambos extremos. El fragmento de PCR se cortó luego mediante XbaI y se insertó en los vectores pVK y pVg4 digeridos con XbaI respectivos. Después, en las posiciones en donde se consideraban importantes las interacciones entre CDR y el armazón, los residuos de Gal se cambiaron de nuevo por los de 15A7 de ratón (es decir, I62V y D74H). En lo que sigue se listan alineamientos de 15A7 de ratón y 15A7 humanizado (Hu15A7) frente a mDREG-55, en que V62 y H74 están subrayados.

Alineamiento de la cadena ligera:

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Alineamiento de la cadena pesada:

recogieron después. 15A7 humanizado en los sobrenadantes se sometió a ensayo en cuanto a su capacidad de unirse a transfectantes de CHO de manera estable que expresan hCD162 y para inducir la apoptosis en células T activadas durante 7 días. Los resultados demuestran que conserva estas capacidades.

Preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados

Se generaron células que producían anticuerpos humanizados y quiméricos. Más específicamente, células Sp2/0 (Sp2/0-Ag14; ATCC CRL 1581) se transfectaron de manera estable con los plásmidos apropiados mediante electroporación utilizando un aparato Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) a 360 V y una capacitancia de 25 μF de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes de la transfección, los plásmidos se linearizaron mediante digestión con la enzima BamHI. Todas las transfecciones se realizaron utilizando 107 células en PBS y 20 μg de cada uno de los ADNs del plásmido. Las células procedentes de cada una de las transfecciones se extendieron en dos placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Al cabo de 48 horas, se aplicó un medio selectivo (suplemento de DMEM medio FBS al 10%/hipoxantina/timidina) y 1 μg/ml de ácido micofenólico. Células productoras de anticuerpos se rastrearon y aislaron examinando la presencia de anticuerpos en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA.

Las células aisladas se cultivaron en medio exento de suero, o con bajo contenido en Ig, y el sobrenadante cultivado se recogió. Los anticuerpos se purificaron mediante el paso sobre una columna de proteína estafilocócica A-Sepharose CL-4B. Después de lavar 5 veces cada vez con tampón de lavado 1 (Triton X-100 al 0,05%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 400 mM, CaCl2 1 mM y 1 mg/ml de OVA) y tampón de lavado II (Triton X-100 al 0,05%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 y NaCl 150 mM), los anticuerpos ligados se eluyeron con un tampón de elución que contenía 0,1 M de glicina-HCl, pH 2,7 y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 8,6.

Mediciones de afinidad

Las afinidades de unión de los anticuerpos 15A7 de ratón, quiméricos y humanizados arriba descritos se determinaron mediante unión competitiva.

15A7 de ratón se biotiniló mediante un sistema Sulfo-NHS-biotina EZ-Link (Pierce Biotechnology, Nº de cat. 21217). En síntesis, 0,5 mg (3,3 x 10-6 nmoles) de 15A7 de ratón se disolvieron en 187 μl de PBS y se mezclaron con 6,8 x 10-5 nmoles de Sulfo-NHS-biotina. La mezcla se incubó luego en hielo durante 2 horas antes de separar las biotinas libres dializando a 4ºC durante una noche frente a PBS. El 15A7 de ratón marcado con biotina, así obtenido, se almacenó a 4ºC hasta su uso.

Como fuente de antígeno CD162 humano se utilizaron transfectantes Sp2/0 que expresan establemente CD162

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Claims

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