ES2602808T3

ES2602808T3 - Composiciones y métodos para la elevada producción de etanol a partir de biomasa

Info

Publication number: ES2602808T3
Application number: ES12770605.9T
Authority: ES
Inventors: Holly J. Jessen; Jian Yi; Joshua LUNDORFF; Hans Liao; Ana NEGRETE-RAYMOND; Pirkko Suominen; Aristos Aristidou
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2032-04-11
Also published as: US20140038253A1; EP2697252A4; CA2832587A1; WO2012142094A2; US9862975B2; EP2697252B1; EP2697252A2; WO2012142094A3; US9181563B2; BR112013026193A2; US20160002676A1; DK2697252T3

Abstract

Una célula de levadura genéticamente modificada que expresa en exceso un polipéptido transportador de xilosa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4.

Description

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de xilosa.

Figura 24: Fermentación de xilosa a etanol por las cepas 4084 y 4085 en 50 % de medio CSH.

Figura 25: Fermentación de xilosa a etanol por las cepas 4083, 4085 y 4086 en 50 % de medio CSH.

Figura 26: La producción de etanol por las cepas 12053, 12124 y 12125 en 50 % de medio CSH con tanto 20 g/l de dextrosa y 80 g/l de xilosa como 70 g/l de dextrosa y 40 g/l de xilosa.

Figura 27: Fermentación de xilosa por las cepas 12053, 12124 y 12125 en 50 % de medio CSH con tanto 20 g/l de dextrosa y 80 g/l de xilosa como 70 g/l de dextrosa y 40 g/l de xilosa.

Figura 28: Consumo de arabinosa por las cepas 12038, yACN168, yACN170 y yACN172 en medio DM con 20 g/l de dextrosa, 35 g/l de xilosa y 35 g/l de arabinosa.

Figura 29: Consumo de arabinosa por las cepas 12038, yACN174, yACN176 y yACN178 en medio DM con 20 g/l de dextrosa, 35 g/l de xilosa y 35 g/l de arabinosa.

Figura 30: Consumo de xilosa por las cepas 3937, 12215, y 12216 en medio YP con 20 g/l de dextrosa, 80 g/l de xilosa y 10 g/l de arabinosa.

Figura 31: Producción de etanol por las cepas 3937, 12215, y 12216 en medio YP con 20 g/l de dextrosa, 80 g/l de xilosa y 10 g/l de arabinosa.

Figura 32: Consumo de arabinosa por las cepas 3937, 12215 y 12216 en medio YP con 50 g/l de arabinosa.

Figura 33: Fermentación de glucosa y xilosa a etanol por las cepas 3118, 3082 y 3862 en medio YP con 20 g/l de glucosa y 80 g/l de xilosa.

Figura 34: Fermentación de glucosa y xilosa a etanol por las cepas 3083 y 3352 en medio YP con 20 g/l de dextrosa y 80 g/l de xilosa.

Figura 35: Fermentación de glucosa y xilosa a etanol por las cepas 3356 y 12293 en medio YP con 20 g/l de dextrosa, 80 g/l de xilosa y 10 g/l de arabinosa.

Descripción detallada

La siguiente descripción de la invención se prevé simplemente para ilustrar diversas realizaciones de la invención. Como tales, las modificaciones específicas tratadas no deben interpretarse como limitaciones al alcance de la invención. Será evidente para un experto en la materia que pueden hacerse diversos equivalentes, cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención reivindicada, y se entiende que tales realizaciones equivalentes deben incluirse en la presente memoria.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan concentraciones de componentes, condiciones de fermentación, realización de la fermentación, etc., usados en la memoria descriptiva deben entenderse como que están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva son aproximaciones que pueden variar dependiendo al menos de la técnica analítica específica. Cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores resultantes necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas.

Abreviaturas:

ADH, alcohol deshidrogenasa; AI/araA, arabinosa isomerasa; ALD, aldehído deshidrogenasa; AR, aldosa reductasa; CYB2, L-(+)-lactato-citocromo c oxidoreductasa; CYC, iso-2-citocromo c; DHAP, dihidroxiacetona P; ENO1, enolasa 1; E4P, eritrosa 4-fosfato; F6P, fructosa 6-fosfato; GAL6, cisteína aminopeptidasa; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3; G3P, gliceraldehído 3-fosfato; G3PDH, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa; PDC1, piruvato descarboxilasa 1; PGK, fosfoglicerato cinasa; PPP, vía de pentosa fosfato; RE/araD, ribulosa 5-fosfato 4-epimerasa; RK/araB, ribulocinasa; RKI, ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa; RPE, ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; S7P, sedoheptulosa 7-fosfato; TAL, transaldolasa; TDH3, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; TEF1, factor-1 de elongación de la traducción; TEF2, factor-2 de elongación de la traducción; TKL, transcetolasa; TPI, triosafosfato isomerasa; URA3, orotidina 5'-fosfato descarboxilasa; XDH, xilitol deshidrogenasa; XI, xilosa isomerasa; XK, xilulocinasa; XR, xilosa reductasa.

En la presente memoria se proporcionan células de levadura genéticamente modificadas para la producción de etanol, métodos de preparación de estas células de levadura, y métodos de uso de estas células para producir etanol.

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La especie de levadura ideal para la producción de etanol a escala industrial a partir de biomasa debe presentar resistencia a ambientes de pH bajo, la capacidad de fermentar tanto azúcares de hexosa como de pentosa a etanol, y resistencia a compuestos inhibidores presentes en hidrolizado de materia de planta y que surgen de la fermentación, que incluyen acetato, HMF, furfural, fenólicos, aldehídos, cetonas, y el propio etanol.

Saccharomyces cerevisiae y la mayoría de las otras especies de levadura son capaces de fermentar azúcares de hexosa a etanol. Sin embargo, la mayoría de las especies de levadura son incapaces de fermentar azúcares de pentosa tales como arabinosa y xilosa. Aquellas especies de levadura que son capaces de metabolizar azúcares de pentosa lo hacen mediante una vía compleja. Las vías convencionales de la levadura para el metabolismo de la xilosa y la arabinosa (los dos azúcares de pentosa más comunes en biomasa celulósica) utilizan un producto intermedio de xilitol. La D-xilosa se reduce a xilitol por xilosa reductasa (XR). La arabinosa se convierte en xilitol mediante un proceso de tres etapas. La L-arabinosa se reduce a L-arabitol por aldosa reductasa (AR), el L-arabitol se convierte en L-xilulosa por L-arabitol 4-deshidrogenasa, y la L-xilulosa se convierte en xilitol por L-xilulosa reductasa. En ambas vías, el xilitol se oxida a D-xilulosa por xilitol deshidrogenasa (XDH), y la D-xilulosa se fosforila por xilulocinasa (XK) para producir D-xilulosa 5-P. La D-xilulosa 5-P resultante entra en la vía de pentosa fosfato (PPP), que genera fructosa 6-fosfato (F6P) y gliceraldehído 3-fosfato (G3P), ambos de los cuales entran en el ciclo glicolítico. Esta vía se ilustra en la Figura 1. El piruvato que surge de la glicólisis se convierte en acetaldehído y CO2 por piruvato descarboxilasa, y el acetaldehído se reduce a etanol por la alcohol deshidrogenasa (ADH).

Como las reductasas de la vía de utilización de arabinosa fúngica utilizan NADPH como reductor y las deshidrogenasas son específicas para NAD+, un desequilibrio del cofactor produce un crecimiento anaeróbico lento sobre la L-arabinosa y bajos niveles de producción de etanol aún cuando el proceso es redox neutro.

A diferencia de la levadura, las bacterias no utilizan un producto intermedio de xilitol cuando se metaboliza arabinosa. En bacterias, la L-arabinosa se convierte en L-ribulosa por L-arabinosa isomerasa (AI). La L-ribulosa se convierte en L-ribulosa 5-fosfato por L-ribulocinasa (RK), que entonces se convierte en D-xilulosa 5-fosfato por Lribulosa-fosfato 4-epimerasa (RE). Ninguna de estas etapas enzimáticas requiere un cofactor de NAD o NADH, que significa que la vía de arabinosa bacteriana no tiene problemas que compliquen el desequilibrio de factores. Se han hecho intentos previos para utilizar la vía de arabinosa bacteriana en levadura. Se incorporaron genes AI, RK y RE de fuentes bacterianas en S. cerevisiae, y la cepa de levadura genéticamente modificada resultante presentó la capacidad de fermentar arabinosa a etanol (Becker y Boles Appl. Environ Microbiol 69:4144 (2003)). Sin embargo, S. cerevisiae tiene tolerancia limitada al acetato libre y otros inhibidores comunes en los hidrolizados.

Se han hecho intentos previos para generar especies de levadura adicionales que son capaces de fermentar azúcares de pentosa y tolerantes a inhibidores del hidrolizado. Se generó una cepa de I. orientalis que contenía una inactivación de los supuestos genes de ADH ADHa y ADHb y también expresó en exceso un supuesto gen ADH1. La cepa de levadura resultante mostró una elevada capacidad para fermentar xilosa a etanol. Sin embargo, fue incapaz de fermentar arabinosa.

Como se ha descrito en la presente memoria, los genes AI (araA), RK (araB) y RE (araD) de la vía de arabinosa bacteriana de Bacteroides thetaiotaomicron, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Bacillus licheniformis se incorporaron en una cepa de Issatchenkia orientalis en diversas combinaciones (Ejemplo 1). Los genes bacterianos fueron normalmente, pero no siempre, de codón optimizado para I. orientalis. Cada una de las cepas resultantes presentó actividad de AI, RK y/o RE apropiada (Ejemplo 2). Se probaron varias cepas que contienen un conjunto completo de genes de la vía de arabinosa bacteriana (es decir, al menos una copia de cada uno de los genes AI, RK y RE) para su capacidad para fermentar arabinosa. Estas cepas presentaron tanto consumo de arabinosa como producción de etanol a partir de arabinosa (Ejemplo 3). Los resultados descritos en la presente memoria confirman que los genes de la vía de arabinosa bacteriana son activos cuando se expresan en I. orientalis.

Se incorporó un conjunto completo de genes de la vía de arabinosa de B. thetaiotaomicron en una cepa de I. orientalis que previamente había sido manipulada para fermentar xilosa a etanol con el fin de crear una cepa de vía doble capaz de fermentar tanto xilosa como arabinosa (Ejemplo 4). Las cepas de vía doble resultantes presentaron la capacidad de fermentar tanto arabinosa como xilosa a etanol, y ambas produjeron más etanol que las cepas de control que contienen solo xilosa o solo genes de la vía de arabinosa (Ejemplo 5). Sin embargo, la utilización de xilosa disminuyó en las cepas de la vía doble frente a la cepa de solo xilosa, incluso en medios que carecían de arabinosa. Además, el consumo de arabinosa no empezó hasta que tanto la dextrosa como la xilosa estuvieron prácticamente agotadas. Se generaron cepas de I. orientalis adicionales que contenían genes araB de B. thetaiotaomicron y L. citreum no de codón optimizado (Ejemplo 6). Estas cepas presentaron utilización de xilosa y producción de etanol mejoradas frente a una cepa que contiene el gen de B. thetaiotaomicron de codón optimizado.

Como se ha descrito en la presente memoria, se cribó el genoma de K. marxianus para identificar posibles transportadores de azúcar (Ejemplo 7). Se caracterizaron dos posibles genes transportadores de azúcar de K. marxianus, Kit105 y RAG4. Ambos genes se integraron en cepas de I. orientalis que habían sido previamente manipuladas para contener una vía de xilosa básica (XI, XK) con el fin de evaluar el efecto de la posible expresión del transportador en la utilización de xilosa (Ejemplo 8). Las cepas resultantes presentaron elevado co-consumo de glucosa y xilosa, así se integró una segunda copia de cada gen transportador en las células. Las células que contienen dos copias del gen KHT105 presentaron mayor utilización de xilosa y producción de etanol que la cepa

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parental o cepas que contienen dos copias del gen RAG4.

Los efectos de la expresión de KHT105 se probaron adicionalmente integrando dos copias del gen en una cepa de I. orientalis que contenía ingeniería de xilosa más avanzada, que incluye expresión en exceso de los genes de la vía de pentosa no oxidativa transaldolasa (TAL), ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa (RKI) y ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa (RPE) (Ejemplo 9). En fermentadores con medio de hidrolizado, la cepa que expresa KHT105 presentó un aumento del 80 % del consumo de xilosa y la producción de etanol frente a una cepa de control.

Para evaluar el efecto de la expresión de KHT105 sobre el consumo de arabinosa, se integró una única copia del gen en el locus S141G4546 de una cepa de I. orientalis que contenía los genes de la vía de arabinosa (Ejemplo 10). S141G4546 es un homólogo de la butanodiol deshidrogenasa y la xilitol deshidrogenasa. La cepa resultante presentó un ligero aumento en el consumo de arabinosa y la producción de etanol frente a una cepa principal.

Basándose en los datos que muestran que el transportador KHT105 aumentó tanto el consumo de xilosa como de arabinosa, se integraron dos copias del gen KHT105 en el locus S141G4546 de las cepas de vía doble de I. orientalis descritas anteriormente (Ejemplo 11). Las cepas que contienen el transportador KHT105 presentaron mayor producción de etanol y consumo de xilosa y de arabinosa que la cepa principal (Ejemplo 12). Los beneficios de la expresión de KHT105 fueron particularmente evidentes en medio que contenía niveles más altos de azúcar.

Para evaluar métodos adicionales para mejorar la producción de etanol en I. orientalis, se desarrolló una cepa de inactivación de aldehído deshidrogenasa (ALD). I. orientalis tiene tres homólogos principales a los genes ALD4, ALD5 y ALD6 de S. cerevisiae: S141G5680 (“ALD5680”), S141G9161 (“ALD9161”) y S141G6502 (“ALD6502”). Las inactivaciones se dirigieron a ALD5680, que presenta elevada expresión cuando las células se cultivan sobre xilosa. Ambas copias de ALD5680 se inactivaron en una cepa de I. orientalis que había sido previamente manipulada para fermentar xilosa a etanol (Ejemplo 13). La cepa inactivada en ALD5680 presentó consumo de xilosa y producción de etanol elevados y producción de acetato reducida bajo ciertas condiciones, pero los resultados fueron parcialmente dependientes de las condiciones de fermentación precisas usadas (Ejemplo 14).

Se integraron copias adicionales del gen KHT105 de K. marxianus en una cepa de I. orientalis que había sido previamente manipulada para contener dos copias de KHT105 en el locus S141G9091 (homólogo de ADH) (Ejemplo 15). Se integraron copias adicionales de KHT105 en los loci S141G4546 o ALD5680, y se evaluó el efecto del elevado número de copias de KHT105 y la inactivación de S141G4546/ALD5680 sobre el consumo de azúcar y la producción de etanol en el medio de hidrolizado. Entre ambas cepas inactivadas en S141G4546 y ALD5680, la presencia de una cuarta copia del gen KHT105 aumentó el consumo de xilosa y la producción de etanol frente a cepas que solo contenían tres copias del gen, presentando las cepas inactivadas en ALD resultados ligeramente mejores que las cepas inactivadas en S141G4546.

Se evaluaron a continuación los efectos de la expresión en exceso de KHT105 y/o la inactivación de ALD5680 en una cepa de I. orientalis resistente a etanol. La expresión en exceso de KHT105 produjo un aumento significativo en la producción de etanol y el consumo de xilosa en medio definido bajo en dextrosa, pero solo tuvo un ligero efecto en medio alto en dextrosa (Ejemplo 16).

Se integraron genes araD de Bifidobacterium animalis y Lactococcus lactis (Ejemplo 17) y genes araA de Lactobacillus sakei y B. thetaiotaomicron alternativos (Ejemplo 18) en cepas de I. orientalis de la vía doble que expresan en exceso KHT105 para evaluar su efecto sobre la fermentación de arabinosa. Estas cepas presentaron un elevado consumo de arabinosa frente a las cepas principales.

Como se ha descrito en la presente memoria, se identificaron secuencias novedosas de los genes TAL, RKI, TKL y RPE de I. orientalis. Se integraron copias exógenas de estos genes en I. orientalis para evaluar el efecto de su expresión en exceso sobre el consumo de xilosa y la producción de etanol (Ejemplos 19-21). Las cepas resultantes presentaron utilización de xilosa y producción de etanol elevadas frente a cepas principales.

En la presente memoria se proporcionan en ciertas realizaciones se aíslan polinucleótidos transportadores KHT105 y RAG4. En ciertas realizaciones, estos polinucleótidos aislados comprenden una región codificante que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOs:2 o 4, respectivamente. En ciertas de estas realizaciones, los polinucleótidos comprenden la región codificante de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:1 o 3. En otras realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos el 90 % de identidad de secuencia con la región codificante de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:1 o 3. En ciertas de estas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o al menos el 99,5 % de identidad de secuencia con la región codificante de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:1 o 3.

En ciertas realizaciones, los polinucleótidos KHT105 y RAG4 aislados proporcionados en la presente memoria comprenden una región codificante que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOs:2 o 4, respectivamente. En ciertas de estas realizaciones, el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o al

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de xilosa comprenden la secuencia de nucleótidos de uno o más de los polinucleótidos KHT105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria. Similarmente, en ciertas realizaciones, los genes transportadores de xilosa codifican un transportador de xilosa que comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más de los polipéptidos KHT105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, las células de levadura genéticamente modificadas proporcionadas en la presente memoria comprenden una vía de fermentación de xilosa activa para convertir xilosa en xilulosa 5-fosfato. Una célula de levadura que tiene una “vía de fermentación de xilosa activa”, como se emplea en la presente memoria, produce enzimas activas necesarias para catalizar cada reacción en una vía de fermentación de xilosa, y por tanto es capaz de convertir xilosa en xilulosa 5-fosfato cuando se cultiva en condiciones de fermentación en presencia de xilosa. Una célula de levadura que tiene una vía de fermentación de xilosa activa comprende uno o más genes de la vía de fermentación de xilosa. Un “gen de la vía de fermentación de xilosa”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la región codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima involucrada en una vía de fermentación de xilosa activa. En ciertas realizaciones, una vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de xilitol y de xilulosa. En estas realizaciones, las células de levadura comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XR, XDH y XK. En otras realizaciones, una vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante un producto intermedio de xilulosa solo. En estas realizaciones, las células de levadura comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa xilosa isomerasa (XI) y XK.

En la presente memoria se proporcionan en ciertas realizaciones células de levadura genéticamente modificadas que tienen al menos una vía de fermentación de xilosa activa para convertir xilosa en xilulosa 5-fosfato, y que comprenden además uno o más genes transportadores de xilosa. En ciertas realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de xilitol y de xilulosa, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XR, XDH y XK. En otras realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante un producto intermedio de xilulosa solo, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XI y XK. En ciertas realizaciones, los genes transportadores de xilosa comprenden la secuencia de nucleótidos de uno o más de los polinucleótidos kit105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria. Similarmente, en ciertas realizaciones, los genes transportadores de xilosa codifican un transportador de xilosa que comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más de los polipéptidos KHT105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se proporcionan en ciertas realizaciones células de levadura genéticamente modificadas que tienen al menos una vía de fermentación de xilosa activa para convertir xilosa en xilulosa 5-fosfato, y que comprenden además una vía de fermentación de arabinosa activa para convertir arabinosa en xilulosa 5-fosfato. En ciertas realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de xilitol y de xilulosa, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XR, XDH y XK. En otras realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante un producto intermedio de xilulosa solo, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XI y XK. En ciertas realizaciones, la vía de fermentación de arabinosa activa convierte arabinosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de ribulosa y de ribulosa 5-fosfato, y en estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de arabinosa AI, RK y RE.

En la presente memoria se proporcionan en ciertas realizaciones células de levadura genéticamente modificadas que tienen al menos una vía de fermentación de xilosa activa para convertir xilosa en xilulosa 5-fosfato, y que comprenden además uno o más genes transportadores de xilosa y una vía de fermentación de arabinosa activa para convertir arabinosa en xilulosa 5-fosfato. En ciertas realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de xilitol y de xilulosa, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XR, XDH y XK. En otras realizaciones, la vía de fermentación de xilosa activa convierte xilosa en xilulosa 5-fosfato mediante un producto intermedio de xilulosa solo, y en ciertas de estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de xilosa XI y XK. En ciertas realizaciones, los genes transportadores de xilosa comprenden la secuencia de nucleótidos de uno o más de los polinucleótidos KHT105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria. Similarmente, en ciertas realizaciones, los genes transportadores de xilosa codifican un transportador de xilosa que comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más de los polipéptidos KHT105 y/o RAG4 descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la vía de fermentación de arabinosa activa convierte arabinosa en xilulosa 5-fosfato mediante productos intermedios de ribulosa y de ribulosa 5-fosfato, y en estas realizaciones las células comprenden al menos una copia de cada uno de los genes de la vía de fermentación de arabinosa AI, RK y RE.

En ciertas realizaciones, las células de levadura genéticamente modificadas proporcionadas en la presente memoria comprenden una vía de pentosa fosfato no oxidativa activa. Una célula de levadura que tiene una “vía de pentosa fosfato no oxidativa activa”, como se emplea en la presente memoria, produce enzimas activas necesarias para convertir xilulosa 5-fosfato más ribosa 5-fosfato en F6P y G3P. Una célula de levadura que tiene una vía de pentosa

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mantiene establemente en el citoplasma del huésped.

En ciertas realizaciones, las células de levadura proporcionadas en la presente memoria comprenden uno o más genes exógenos de la vía de fermentación de arabinosa, transportadores de xilosa, de la vía de fermentación de xilosa o de la vía de pentosa fosfato no oxidativa. En ciertas realizaciones, las células de levadura genéticamente modificadas descritas en la presente memoria comprenden un único gen exógeno. En otras realizaciones, las células de levadura comprenden múltiples genes exógenos. En estas realizaciones, las células de levadura pueden comprender múltiples copias de un único gen exógeno y/o copias de dos o más genes exógenos diferentes. Células de levadura que comprenden múltiples genes exógenos pueden comprender cualquier número de genes exógenos. Por ejemplo, estas células de levadura pueden comprender 1 a 20 genes exógenos, y en ciertas realizaciones preferidas pueden comprender 1 a 7 genes exógenos. Pueden integrarse múltiples copias de un gen exógeno en un único locus de forma que sean adyacentes entre sí. Alternativamente, pueden integrarse en varios loci dentro del genoma de la célula huésped. Una célula de levadura como se proporciona en la presente memoria puede comprender solo un tipo de gen exógeno o genes exógenos de solo una vía. Por ejemplo, los genes exógenos en una célula de levadura pueden limitarse a genes de la vía de fermentación de arabinosa o a genes transportadores de xilosa. Alternativamente, una célula de levadura puede comprender genes exógenos de dos o más vías o de una

o más vías en combinación con un gen exógeno transportador de xilosa. Por ejemplo, una célula de levadura puede comprender uno o más genes exógenos de la vía de fermentación de arabinosa y uno o más genes exógenos transportadores de xilosa.

En ciertas realizaciones, las células de levadura proporcionadas en la presente memoria comprenden uno o más genes endógenos de la vía de fermentación de arabinosa, transportadores de xilosa, de la vía de fermentación de xilosa y de la vía de pentosa fosfato no oxidativa. En ciertas de estas realizaciones, las células pueden manipularse para expresar en exceso uno o más de estos genes endógenos, que significa que las células modificadas expresan el gen endógeno a un nivel más alto que una célula nativa bajo al menos algunas condiciones. En ciertas de estas realizaciones, el gen endógeno que se expresa en exceso puede estar operativamente unido a uno o más elementos reguladores exógenos. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más promotores fuertes exógenos nativos o no nativos en una célula de forma que están operativamente unidos a uno o más genes endógenos.

Los genes de la vía de fermentación de arabinosa, transportadores de xilosa, de la vía de fermentación de xilosa y/o de la vía de pentosa fosfato no oxidativa en las células de levadura genéticamente modificadas proporcionadas en la presente memoria pueden estar operativamente unidos a uno o más elementos reguladores tales como un promotor

o terminador. Como se emplea en la presente memoria, el término “promotor” se refiere a una secuencia no traducida localizada aguas arriba (es decir, 5') con respecto al codón de iniciación de la traducción de un gen (generalmente dentro de aproximadamente 1 a 1000 pares de bases (pb), preferiblemente dentro de aproximadamente 1 a 500 pb) que controla el inicio de la transcripción del gen. El término “terminador”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia no traducida localizada aguas abajo (es decir, 3') con respecto al codón de terminación de la traducción de un gen (generalmente dentro de aproximadamente 1 a 1000 pb, preferiblemente dentro de aproximadamente 1 a 500 pb, y especialmente dentro de aproximadamente 1 a 100 pb) que controla el fin de la transcripción del gen. Un promotor o terminador está “operativamente unido” a un gen si su posición en el genoma con respecto a la del gen es tal que el promotor o terminador, según sea el caso, realiza su función de control transcripcional. Promotores y terminadores adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos WO99/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 y WO03/049525.

Los elementos reguladores unidos a genes de la vía de fermentación de arabinosa, transportadores de xilosa, de la vía de fermentación de xilosa o de la vía de pentosa fosfato no oxidativa en las células de levadura proporcionadas en la presente memoria pueden ser endógenos o exógenos. Por ejemplo, puede insertarse un gen exógeno de la vía de fermentación de arabinosa o transportador de xilosa en una célula de levadura de forma que esté bajo el control transcripcional de un promotor y/o terminador endógeno. Alternativamente, el gen exógeno de la vía de fermentación de arabinosa o transportador de xilosa puede unirse a uno o más elementos reguladores exógenos. Por ejemplo, puede introducirse un gen exógeno en la célula como parte de una construcción de expresión de gen que comprende uno o más elementos reguladores exógenos. En ciertas realizaciones, los elementos reguladores exógenos, o al menos las porciones funcionales de elementos reguladores exógenos, pueden comprender secuencias nativas. En otras realizaciones, los elementos reguladores exógenos pueden comprender secuencias no nativas. En estas realizaciones, los elementos reguladores exógenos pueden comprender una secuencia con un grado de identidad de secuencia relativamente alto con un elemento regulador nativo. Por ejemplo, un gen exógeno puede unirse a un promotor o terminador exógeno que tiene al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o al menos el 90 % de identidad de secuencia con un promotor o terminador nativo. Los porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden calcularse por métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, usando el software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool del National Center for Biological Information (NCBI)) versión 2.2.1 con parámetros por defecto. Por ejemplo, una secuencia que tiene una puntuación de identidad de al menos el 90 % usando el algoritmo BLAST versión 2.2.1 con parámetros por defecto se considera que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia. El software BLAST está disponible de NCBI, Bethesda, Maryland. En aquellas realizaciones en donde múltiples genes exógenos se insertan en una célula huésped, cada gen exógeno puede estar bajo el control de un elemento regulador diferente, o dos o más genes exógenos pueden estar bajo el control de los mismos elementos reguladores. Por ejemplo, donde un primer gen exógeno está unido a un primer elemento regulador, un segundo gen

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la inserción de un gen exógeno.

Una construcción de integración o deleción puede comprender uno o más casetes de marcador de selección clonados en la construcción entre las dos secuencias del gen diana. El casete del marcador de selección contiene al menos un gen de marcador de selección que permite la selección de transformantes. Transformantes satisfactorios contendrán el gen de marcador de selección, que confiere a la célula satisfactoriamente transformada al menos una característica que proporciona una base para la selección. Genes de marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas (p. ej., resistencia a bleomicina o zeomicina (p. ej., gen ble de Streptoalloteichus hindustanus), aminoglucósidos tales como G418 o kanamicina (p. ej., gen de resistencia a kanamicina del transposón Tn903), o higromicina (p. ej., gen de resistencia a antibióticos de aminoglucósido de E. coli)), (b) deficiencias auxotróficas del complemento de la célula (p. ej., deficiencias en leucina

(p. ej., gen LEU2 de K. marxianus), uracilo (p. ej., gen URA3 de K. marxianus, S. cerevisiae o I. orientalis), o triptófano (p. ej., gen TRP de K. marxianus, S. cerevisiae o I. orientalis)), (c) permiten que la célula sintetice nutrientes críticos no disponibles de medios simples, o (d) confieren la capacidad de que la célula crezca sobre una fuente de carbono particular (p. ej., gen MEL5 de S. cerevisiae, que codifica la enzima alfa-galactosidasa (melibiosa) y confiere la capacidad de crecer sobre melibiosa como única fuente de carbono). Marcadores de selección preferidos incluyen el gen URA3, gen de resistencia a zeocina, gen de resistencia a G418, gen MEL5 y gen de resistencia a higromicina. Otro marcador de selección preferido es un casete del gen CYB2, a condición de que la célula huésped tanto carezca nativamente de un gen tal como su(s) gen(es) CYB2 nativo(s) se delecionen o alteren primero. Un gen de marcador de selección está operativamente unido a una o más secuencias de promotor y/o terminador que están operativas en la célula huésped. En ciertas realizaciones, estas secuencias de promotor y/o terminador son secuencias de promotor y/o terminador exógenas que están incluidas en el casete de marcador de selección. Promotores y terminadores adecuados son como se han descrito anteriormente.

En otras realizaciones, una construcción de integración o deleción puede no contener un casete de marcador de selección, pero puede, sin embargo, permitir la selección de transformantes basándose en la expresión en exceso de un gen exógeno (en el caso de construcciones de inserción) o deleción de un gen endógeno (en el caso de construcciones de deleción). Por ejemplo, donde una construcción de integración comprende uno o más genes exógenos de la vía de fermentación de arabinosa, pueden seleccionarse transformantes basándose en su capacidad para cultivar sobre arabinosa.

Se usa una construcción de integración o deleción para transformar la célula huésped. La transformación puede llevarse a cabo usando, por ejemplo, métodos de electroporación y/o transformación química (p. ej., cloruro de calcio, basada en acetato de litio, etc.). La selección o cribado basado en la presencia o ausencia del marcador de selección puede realizarse para identificar transformantes satisfactorios. En transformantes satisfactorios, un evento de recombinación homóloga en el locus del sitio diana produce la alteración o la deleción de la secuencia del sitio diana. Cuando la construcción se dirige a un gen nativo para la deleción o alteración, todo o una porción del gen nativo diana, su promotor, y/o su terminador, pueden ser delecionados durante este evento de recombinación. El casete de expresión, casete de marcador de selección, y cualquier otro material genético entre las secuencias diana en la construcción de integración, se inserta en el genoma del huésped en el locus correspondiente a las secuencias diana. Puede realizarse análisis por PCR o análisis de Southern para confirmar que ha tenido lugar la inserción/deleción deseada.

En algunas realizaciones, la transformación de las células puede realizarse usando ADN de dos o más construcciones, productos de PCR, o una combinación de los mismos, en vez de una única construcción o producto de PCR. En estas realizaciones, el extremo 3' de un fragmento de integración se solapa con el extremo 5' del otro fragmento de integración. En un ejemplo, una construcción contendrá la primera secuencia del locus de la secuencia diana y una parte no funcional del casete del gen marcador, mientras que la otra contendrá la segunda secuencia del locus de la secuencia diana y una segunda parte no funcional del casete del gen marcador. Las partes del casete del gen marcador están seleccionadas de forma que puedan combinarse para formar un casete completo. La célula se transforma con estos trozos simultáneamente, produciendo la formación de un marcador funcional completo o casete de gen estructural. Pueden seleccionarse transformantes satisfactorios basándose en las características conferidas por el marcador de selección. En otro ejemplo, el marcador de selección reside en un fragmento, pero las secuencias diana están en fragmentos separados, de manera que los fragmentos de integración tienen una alta probabilidad de integrarse en el sitio de interés. En otras realizaciones, puede usarse la transformación de tres ADN lineales para integrar el material genético exógeno. En estas realizaciones, un fragmento se solapa sobre el extremo 5' con un segundo fragmento y sobre el extremo 3' con un tercer fragmento.

Puede diseñarse una construcción de integración o de deleción de forma que el gen de marcador de selección y algunos o todos de sus elementos reguladores puedan llegar a delecionarse espontáneamente como resultado de un evento de recombinación homóloga posterior. Una forma conveniente de realizar esto es diseñar la construcción de forma que el gen de marcador de selección y/o elementos reguladores estén flanqueados por secuencias de repetición. Las secuencias de repetición son secuencias de ADN idénticas, nativas o no nativas para la célula huésped, y orientadas en la construcción en la misma dirección la una con respecto a la otra. Las secuencias de repetición tienen ventajosamente aproximadamente 25 a 1500 pb de longitud, y no tienen que codificar nada. La inclusión de las secuencias de repetición permite que se produzca un evento de recombinación homóloga, que produce la deleción del gen de marcador de selección y una de las secuencias de repetición. Como la

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menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:33, 35, o 37.

Un “gen 5-fosfato cetol-isomerasa” o “gen RKI”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier gen que codifica un polipéptido con actividad de ribosa 5-fosfato cetol-isomerasa, que significa la capacidad para catalizar la conversión de ribulosa 5-fosfato en ribosa 5-fosfato. En ciertas realizaciones, un gen RKI puede derivarse de una fuente de levadura. Por ejemplo, el gen RKI puede derivarse de un gen RKI de I. orientalis que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:40, un gen RKI de S. cerevisiae que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:42, o un gen RKI de K. marxianus que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:44. En otras realizaciones, el gen puede codificar una secuencia de aminoácidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs:40, 42, o 44. En ciertas realizaciones, un gen RKI derivado de I. orientalis, S. cerevisiae o K. marxianus puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:39, 41 o 43 o una secuencia de nucleótidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:39, 41 o 43.

Un “gen transcetolasa” o “gen TKL”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier gen que codifica un polipéptido con actividad de transcetolasa, que significa la capacidad para catalizar la conversión de xilulosa 5fosfato y ribosa 5-fosfato en G3P y sedoheptulosa 7-fosfato (S7P) y la conversión de xilulosa 5-fosfato y eritrosa 4fosfato en F6P y G3P. En ciertas realizaciones, un gen TKL puede derivarse de una fuente de levadura. Por ejemplo, el gen TKL puede derivarse de un gen TKL de I. orientalis que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:46, un gen TKL de S. cerevisiae que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:48,

o un gen TKL de K. marxianus que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:50. En otras realizaciones, el gen puede codificar una secuencia de aminoácidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs:46, 48, o 50. En ciertas realizaciones, un gen TKL derivado de I. orientalis, S. cerevisiae o K. marxianus puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:45, 47 o 49 o una secuencia de nucleótidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:45, 47 o

49.

Un “gen transaldolasa” o “gen TAL”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier gen que codifica un polipéptido con transaldolasa actividad, que significa la capacidad para catalizar la conversión de G3P y S7P en eritrosa 4-fosfato (E4P) y F6P. En ciertas realizaciones, un gen TAL puede derivarse de una fuente de levadura. Por ejemplo, el gen TAL puede derivarse de un gen TAL de I. orientalis que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:52, un gen TAL de S. cerevisiae que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:54 o un gen TAL de K. marxianus que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:56. En otras realizaciones, el gen puede codificar una secuencia de aminoácidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %,

o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs:52, 54 o 56. En ciertas realizaciones, un gen TAL derivado de I. orientalis, S. cerevisiae o K. marxianus puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:51, 53, o 55 o una secuencia de nucleótidos con al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs:51, 53, o 55.

En ciertas realizaciones, las células de levadura genéticamente modificadas proporcionadas en la presente memoria comprenden además una deleción o alteración de uno o más genes nativos. “Deleción o alteración” con respecto a un gen nativo significa que tanto la región codificante entera del gen se elimina (deleción) como la región codificante del gen, su promotor, y/o su región terminadora se modifica (tal como por deleción, inserción o mutación) de forma que el gen ya no produce una enzima activa, produce una cantidad seriamente reducida (al menos el 75 % de reducción, preferiblemente al menos el 90 % de reducción) de una enzima activa, o produce una enzima con actividad seriamente reducida (al menos el 75 % reducida, preferiblemente al menos el 90 % reducida).

En ciertas realizaciones, la deleción o alteración de uno o más genes nativos produce una deleción o alteración de una o más vías metabólicas nativas. “Deleción o alteración” con respecto a una vía metabólica significa que la vía es tanto inoperativa como incluso presenta actividad que se reducen al menos el 75 %, al menos el 85 %, o al menos el 95 % con respecto a la vía nativa.

En ciertas realizaciones, la deleción o alteración del gen nativo puede llevarse a cabo por evolución forzada, mutagénesis, o métodos de ingeniería genética, seguido de selección o cribado apropiado para identificar los mutantes deseados. En ciertas realizaciones, la deleción o alteración de un gen de células huésped nativa puede acoplarse a la incorporación de uno o más genes exógenos en la célula huésped, es decir, los genes exógenos pueden incorporarse usando una construcción de integración de la expresión génica que también es una

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cepa 2902 se llamó la cepa yHJJ3 (2904) y el derivado ura-de la cepa 2903 se llamó la cepa yHJJ4 (2905).

La expresión del gen araB se confirmó usando qPCR. Se purificó ARN de la cepa principal y de la cepa 2902 usando un kit de ARN de ZymoResearch. Se usó un kit de RT-PCR Epicentre MasterAmp con cebadores de araB y de actina para la amplificación a partir de ARN. Los integrantes de araB mostraron Cts de aproximadamente 14 frente a aproximadamente 34 para la cepa 1822 y 18 para actina.

Ejemplo 1B: Integración de araD de B. thetaiotaomicron en un locus AR de I. orientalis:

El gen araD de B. thetaiotaomicron se optimizó en el codón para la expresión en I. orientalis (SEQ ID NO:15) y se clonó en PCR2.1-TOPO como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1A, excepto que se usó el sistema de PCR ClonTech Genome Advantage2 en vez de ADN polimerasa rTth. Debido a que los seis clones secuenciados tuvieron al menos un error de nucleótido, el extremo de 5' libre de error (fragmento Xbal/Pstl) de un clon se unió con el extremo 3' libre de error (fragmento Pstl/Pacl) de un segundo clon mediante digestión y ligación. El gen resultante se digirió con Xbal y Pacl y se ligó en pHJJ3 similarmente cortado, creando el vector pHJJ5. pHJJ5 contuvo el promotor ENO1, gen araD y terminador PDC. Se unió un fragmento Notl que contenía el promotor ENO1, gen araD, terminador PDC y locus URA3 de pHJJ5 en el vector pHJJ4 para generar los vectores pHJJ9 (orientación 1) y pHJJ10 (orientación 2). pHJJ4 contuvo regiones en la dirección 5' y en la dirección 3' del locus S141G725 de I. orientalis (AR, “AXR1”).

Se linealizó pHJJ9 por digestión secuencial con Sacl y Apal, liberando un fragmento que contenía el promotor ENO1, gen araD, terminador PDC, casete URA3 y secuencias que se dirigen a AXR1. Los fragmentos de integración se transformaron en la cepa 2904 de I. orientalis como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1A. Se purificaron las colonias transformadas en medio ScD-ura, y se realizó PCR para confirmar la integración en el locus AXR1. La cepa 2904 transformada con pHJJ9 linealizado produjo las cepas yHJJ7 (2908) y yHJJ8 (2909), teniendo cada una una copia de araB y una copia de araD de B. thetaiotaomicron.

La cepa 2908 se cultivó durante la noche en medio YPD y se sembró en medio ScD-FOA para seleccionar cepas en las que el marcador URA3 había salido del bucle. Las colonias resultantes se purificaron en medio YPD y se probaron en medio ScD-ura para confirmar la auxotrofía del uracilo. Las colonias también se confirmaron por PCR de colonias. Los derivados ura-de la cepa 2908 fueron las cepas yHJJ13 (3009) y yHJJ14 (3010).

Se linealizó pHJJ10 por digestión secuencial con Sacl y Apal, liberando un fragmento que contenía el promotor ENO1, gen araD, terminador PDC, casete URA3, y secuencias que se dirigen a AXR1. Los fragmentos de integración se transformaron en la cepa 3009 de I. orientalis. Se purificaron colonias transformadas en medio ScDura, y se realizó PCR para confirmar la integración en el locus AXR1. La cepa 3009 transformada con pHJJ10 linealizado produjo la cepa yHJJ15 (3011), que tenía una copia de araB y dos copias de araD de B. thetaiotaomicron.

La expresión de araD se confirmó usando qPCR. Se purificó ARN de las cepas 2908 (araB/araD) y 2904 (araB) usando una extracción con fenol ácido. Se eliminó el ADN genómico usando un kit de ARN libre de ADN de ZymoResearch, y se preparó ADNc a partir de 4 µg de ARN usando transcriptasa inversa de Promega. Se aisló ADN genómico de la cepa 2908 para su uso como un patrón usando un kit de ADN genómico YeaStar de ZymoResearch. Se realizó qPCR usando mezcla maestra de PCR SYBR Green de Applied Biosystems y cebadores de araD y actina. Los integrantes de araD mostraron aproximadamente seis veces más expresión de araD que la expresión de actina, frente a ninguna expresión en la cepa de control de araB.

El marcador URA3 de yHJ15 (3011) salió del bucle cultivando las células durante la noche en medio YPD y sembrando en placas de ScD-FOA. Las colonias se cribaron por PCR de colonias para identificar colonias que perdieron el marcador de selección, pero retuvieron el resto de la inserción de araD, y una colonia tal se llamó yJY21. Después se confirmó que la copia de araB de B. thetaiotaomicron se perdió durante el evento de salida del bucle, de manera que la cepa yJY21 solo tuvo las dos copias de araD.

Ejemplo 1C: Integración de araA de B. thetaiotaomicron en un locus XDH de I. orientalis:

El gen araA B. thetaiotaomicron se optimizó en el codón para la expresión en I. orientalis como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1A (SEQ ID NO:5) y se sintetizó. Se usó mutagénesis dirigida al sitio para corregir los errores de nucleótidos en el gen ensamblado. Un clon que lleva el vector con la secuencia de genes deseada se llamó pJY13.

Se realizó una ligación de tres trozos usando un fragmento Xbal/Pacl que contenía el gen araA de B. thetaiotaomicron, un fragmento Xhol/Pacl de un vector de clonación que contenía secuencias que se dirigían a XYL2 (XDH), un terminador PDC y un casete de selección URA3, y un fragmento Xhol/Xbal que contenía el promotor TDH3 de I. orientalis. El plásmido pJY15 resultante contuvo el promotor TDH3, el gen araA de B. thetaiotaomicron, terminador PDC y el casete de marcador URA3 flanqueado por secuencias que se dirigen a XYL2.

El plásmido pJY15 se digirió con Apal y Kpnl para liberar el fragmento de integración, y se transformó ADN linealizado en la cepa 2904 del Ejemplo 1A (contiene el gen araB de B. thetaiotaomicron en el locus XYL1). Se

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integración en el locus deseado, y una de tales cepas se llamó yHJJ9 (3005).

Ejemplo 1E: Integración de araD de L. plantarum en el locus AR de la cepa de I. orientalis que contiene araB de B. thetaiotaomicron:

El gen araD de L. plantarum se optimizó en el codón para la expresión en I. orientalis usando una tabla de uso de codones de I. orientalis para la traducción inversa y se sintetizó de manera que contuvo un sitio de restricción Xbal en el extremo 5' y un sitio de restricción Pacl en el extremo 3' (SEQ ID NO:78). El producto de PCR de araD de L. plantarum se purificó en gel y se digirió con Xbal y Pacl. Los fragmentos resultantes se unieron en pHJJ18 (Ejemplo 1A) de los que habían sido digeridos el gen araB de B. thetaiotaomicron con Xbal y Pacl. Las colonias que tenían el inserto de araD de L. plantarum deseado se confirmaron por PCR, y se aisló ADN de plásmido (pHJJ13). El fragmento que contenía el promotor ENO1, araD de L. plantarum, terminador PDC y el casete de marcador URA3 se digirió a partir de pHJJ13 con Notl y se ligó en pHJJ4 digerido con Notl (las secuencias que se dirigen a AXR1 se separaron por un sitio Notl) para obtener vectores pHJJ15 (orientación 1) y pHJJ20 (orientación 2).

El plásmido pHJJ15 se digirió con Apal y Sacl para liberar el fragmento de integración, y el ADN linealizado se transformó en la cepa 2904 (Ejemplo 1 A). Se cribaron por PCR colonias ura+ para identificar colonias con integración en el locus AXR1, y una de tales cepas se llamó yHJJ11 (3007).

Ejemplo 1F: Integración de araA de L. plantarum en el locus XDH de la cepa de I. orientalis que contiene araB de B. thetaiotaomicron:

El gen araA de L. plantarum se optimizó en el codón para la expresión en I. orientalis usando una tabla de uso de codones de I. orientalis para la traducción inversa y se sintetizó de manera que contuvo un sitio de restricción Xbal en el extremo 5' y un sitio de restricción Pacl en el extremo 3' (SEQ ID NO:80). El ADN se clonó en TOPO y el plásmido con la secuencia deseada se llamó pJY14.

Se realizó una ligación de tres trozos usando un fragmento Xbal/Pacl de pJY14 que contenía el gen araA de L. plantarum, un fragmento Xhol/Pacl que contenía secuencias que se dirigían a XYL2 (XDH), un terminador PDC de I. orientalis y un casete de selección URA3, y un fragmento Xhol/Xbal que contenía el promotor TDH3 de I. orientalis. El plásmido pJY17 resultante contuvo el promotor TDH3, gen araA de L. plantarum, terminador PDC y el casete de marcador URA3 flanqueado por secuencias que se dirigen a XYL2.

El plásmido pJY17 se digirió con Apal y Kpnl para liberar el fragmento de integración, y el ADN linealizado se transformó en la cepa 2904 (Ejemplo 1A). Se cribaron por PCR colonias ura+ para identificar colonias con integración en el locus XYL2, y una de tales cepas se llamó yJY17.

Ejemplo 1G: Integración de araA de B. licheniformis en el locus XDH de la cepa de I. orientalis que contiene araB de

B. thetaiotaomicron:

El gen araA de B. licheniformis de 1,5 Kb se optimizó en el codón para la expresión en I. orientalis usando una tabla de uso de codones de I. orientalis para la traducción inversa y se construyó de manera que contuvo un sitio de restricción Xbal en el extremo 5' y un sitio de restricción Pacl en el extremo 3' (SEQ ID NO:82). El producto de PCR se clonó en un vector TOPO, y se usó mutagénesis dirigida para corregir tres errores de nucleótidos. El plásmido resultante pJY23 contuvo el gen araA de B. licheniformis de codón optimizado correcto.

Se realizó una ligación de tres trozos usando un fragmento Xbal/Pacl de pJY23 que contenía el gen araA de B. licheniformis, un fragmento Xhol/Pacl de un vector de clonación que contenía secuencias que se dirigían a XYL2 (XDH), un terminador PDC y un casete de selección URA3, y un fragmento Xhol/Xbal que contenía el promotor TDH3 de I. orientalis. El plásmido resultante pJY24 contuvo el promotor TDH3, gen araA de B. licheniformis, terminador PDC y el casete de marcador URA3 flanqueado por secuencias que se dirigen a XYL2.

El plásmido pJY24 se digirió con Apal y Kpnl para liberar el fragmento de integración, y el ADN linealizado se transformó en la cepa 2904 (Ejemplo 1A). Se cribaron por PCR colonias ura+ para identificar colonias con integración en el locus XYL2, y una de tales cepas se llamó yJY18.

Las cepas de I. orientalis genéticamente modificadas generadas en los Ejemplos 1A a 1G se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1:

Nombre de la cepa: araA araB araD

2762 (cepa principal): Fuente - - --

N.º de copias: 0 0 0

Promotor: - - --

Localización: - - -

Nombre de la cepa: araA araB araD

yHJJ2/2902 (ura+),yHJJ3/2904 (ura-): Fuente -- B. thetaiotaomicron --

N.º de copias: - 1 --

Promotor: -- ENO1 --

Localización: - locus XYL1 -

yHJJ1/2903 (ura+),yHJJ4/2905 (ura-): Fuente -- B. thetaiotaomicron --

N.º de copias: 0 1 0

Promotor: -- ENO1 --

Localización: - locus XYL1 -

yHJJ7/2908 (ura+),yHJJ8/2909 (ura+), yHJJ13/3009 (ura-), yHJJ14/3010 (ura-): Fuente -- B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 0 1 1

Promotor: -- ENO1 ENO1

Localización: - locus XYL1 locus AXR1

yHJJ9/3005: Fuente -- B. thetaiotaomicron E. coli

N.º de copias: 0 1 1

Promotor: -- ENO1 ENO1

Localización: - locus XYL1 locus AXR1

yHJJ11/3007: Fuente -- B. thetaiotaomicron L. plantarum

N.º de copias: 0 1 1

Promotor: -- ENO1 ENO1

Localización: - locus XYL1 locus AXR1

yHJJ15/3011: Fuente -- B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 0 1 2

Promotor: -- ENO1 ENO1

Localización: - locus XYL1 locus AXR1

yJY16: Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron --

N.º de copias: 1 1 0

Promotor: TDH3 ENO1 --

Localización: locus XYL2 locus XYL1 -

yJY17: Fuente L. plantarum B. thetaiotaomicron --

N.º de copias: 1 1 0

Promotor: TDH3 ENO1 --

Localización: locus XYL2 locus XYL1 -

yJY18: Fuente B. licheniformis B. thetaiotaomicron --

N.º de copias: 1 1 0

Promotor: TDH3 ENO1 --

Localización: locus XYL2 locus XYL1 -

yJY21: Fuente - -- B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 0 0 2

Promotor: - -- ENO1

Localización: - - locus AXR1

yJY22 (ura+), yJY23(ura-): Fuente B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 1 0 2

Nombre de la cepa: araA araB araD

Promotor: TDH3 -- ENO1

Localización: locus XYL2 - locus AXR1

yJY24 (ura+), yJY29(ura-): Fuente B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 0 2

Promotor: TDH3 -- ENO1

Localización: locus XYL2 - locus AXR1

yHJJ40/3406 (ura+),yHJJ44 (ura-): Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 1 2

Promotor: TDH3 TEF1 ENO1

Localización: locus XYL2 locus XYL1 locus AXR1

yHJJ47/3408: Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 2 2

Promotor: TDH3 TEF1 ENO1

Localización: locus XYL2 locus XYL1 locus AXR1

yJY30/3409 (ura+),yJY31 (ura-): Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 1 2

Promotor: TDH3 ENO1 ENO1

Localización: locus XYL2 locus XYL1 locus AXR1

yJY33/3410: Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 2 2

Promotor: TDH3 ENO1 ENO1

Localización: locus XYL2 locus XYL1 locus AXR1

Ejemplo 2: Análisis de la actividad de RK, RE y Al en cepas de I. orientalis que contienen genes araA, araB y/o araD bacterianos:

Se probaron las cepas generadas en el Ejemplo 1 para actividad de RK, RE y Al.

5 Ejemplo 2A: Análisis de actividad de RK:

RK cataliza la conversión dependiente de ATP de L-ribulosa en L-ribulosa 5-fosfato, produciendo ADP. La actividad de RK va seguida de la regeneración de ATP con PEP catalizado por piruvato cinasa. Esta reacción produce piruvato, que se reduce a lactato con NADH y lactato deshidrogenasa.

Los ensayos contuvieron Tris HCl 30 mM, pH 7,5, MgCl2 3,3 mM, EDTA 0,3 mM, PEP 1,7 mM, ATP 0,7 mM, >4 U/ml

10 de cada piruvato cinasa y lactato deshidrogenasa (premezclados PK+LDH de Sigma), ribulosa 2 mM, NADH 0,5 mM y extracto de células. En ensayos iniciales, se usó D-ribulosa como sustrato. En ensayos posteriores, se usó Lribulosa (ZuChem). Debido al nivel de expresión generalmente alto de esta enzima, los extractos se diluyeron 10 veces en NaTES 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, MnCl2 0,1 mM, 0,01 % (v/v) de Tween 20. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente, y el cambio en la absorbancia a 340 nm se monitorizó durante 10 minutos a intervalos

15 de 15 segundos. Los ensayos se llevaron a cabo en pocillos de microtítulo con un volumen de ensayo final de 200 µl. La reacción se inició mediante la adición de NADH solo o con L-ribulosa. La ΔA340 medida se convirtió en mM usando una longitud de trayectoria eficaz de 0,576 cm (determinada midiendo la absorbancia de una solución de NADH bajo estas condiciones frente a la medida en una cubeta de 1 cm, y aplicando la ley de Beer).

En ensayos con D-ribulosa como sustrato, se midió una actividad específica neta de 1,0 unidad/mg de proteína en

20 extractos en bruto de la cepa 2902 (1 copia de araB de B. thetaiotaomicron). En ensayos con L-ribulosa como sustrato, la actividad específica de RK en extractos de la cepa 3409 (1 copia de araB de B. thetaiotaomicron, 2 copias de cada uno de los genes araA y araD de B. thetaiotaomicron) fue 1,4 unidades/mg de proteína.

Debido a que el ensayo de RK mide la producción de ADP que puede surgir de cualquier actividad de cinasa, tiene una alta actividad de fondo en ausencia de L-ribulosa (aproximadamente 1/3 como mucho en presencia de L25 ribulosa). Esta actividad de fondo está presente en la cepa principal, y no aumenta cuando se añade L-ribulosa a

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Nombre de la cepa: araA araB araD

(ura-): N.º de copias 2 1 2

Promotor: TDH3 ENO1 ENO1

Localización: 9091 1202 9091

yARA30 (ura+), yARA34 (ura-): Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 1 2

Promotor: TDH3 TEF1 ENO1

Localización: 9091 1202 9091

3936/yARA36: Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 2 2

Promotor: TDH3 ENO1 ENO1

Localización: 9091 1202 9091

3937/yARA38(ura+), yLUN011 (ura-): Fuente B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron

N.º de copias: 2 2 2

Promotor: TDH3 TEF1 ENO1

Localización: 9091 1202 9091

Ejemplo 5: Caracterización de cepas de I. orientalis que utilizan xilosa manipuladas para contener genes de la vía de arabinosa de B. thetaiotaomicron:

Se caracterizaron cepas de la vía doble 3936 de /. orientalis (Ejemplo 4D; dos copias cada una de TDH3:araA, ENO1:araB y ENO1:araD) y 3937 (Ejemplo 4D; dos copias cada una de TDH3:araA, TEF1:araB y ENO1:araD) usando un experimento en matraz oscilante. Las cepas de control para estos experimentos fueron la cepa de la vía de arabinosa 3408 (Ejemplo 1C) y la cepa de la vía de xilosa yHJJ169 (3922). La cepa 3922 contiene los mismos antecedentes genéticos que la cepa 3489 (cepa que utiliza xilosa de las que se derivaron las cepas 3936 y 3937), junto con deleciones en los sitios 9091 y 1202 que sirvieron de sitios de integración para genes de la vía de arabinosa en las cepas de la vía doble. Así, la única diferencia genética entre la cepa 3922 y las cepas de la vía doble 3936/3937 es la presencia de los genes de la vía de arabinosa en la última.

Todas las cepas se cultivaron aeróbicamente durante la noche en YP con 20 g/l de arabinosa, y se calculó la cantidad de cultivo necesaria para inocular a una DO600=0,8. El volumen calculado de cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante cuatro minutos y el sedimento de células se resuspendió en 500 µl de YP + 20 g/l de arabinosa. Éste se usó para inocular matraces con agitación fermentativos a DO600=0,8. Debido al crecimiento residual en YP, este protocolo fue suficiente para recoger biomasa suficiente para inocular la cepa 3922.

Las cepas 3936 y 3937 se comportan similarmente a o ligeramente mejor que la cepa 3408 con respecto al consumo de arabinosa y la producción de etanol (Figura 3), consumiendo cada cepa aproximadamente 12-14 g de arabinosa en 145 horas y produciendo aproximadamente 3-4 g/l de etanol. Como era de esperar, la cepa 3922 no consumió arabinosa ni produjo etanol. Estos resultados confirmaron que las vías de arabinosa exógenas en las cepas 3936 y 3937 fueron completas y confirieron a estas cepas la capacidad de fermentar arabinosa a etanol.

Las cuatro cepas se caracterizaron a continuación en medio YP que contenía tanto 20 g/l de dextrosa, 80 g/l de xilosa y 10 g/l de arabinosa como 10 g/l de dextrosa, 40 g/l de xilosa y 10 g/l de arabinosa. Las cepas 3936 y 3937 presentaron la capacidad de fermentar xilosa a etanol y actuaron similarmente a la cepa de control 3922 en el medio de azúcar más bajo (Figura 4). En el medio de azúcar más alto, sin embargo, la utilización de xilosa fue reducida en las cepas de la vía doble en comparación con la cepa 3922 de la vía de xilosa (Figura 5). Esta disminución en la utilización de xilosa se observó incluso en medio que carecía de arabinosa, que indica que una de las enzimas de la vía de arabinosa es responsable de la reducida utilización de xilosa.

El consumo de arabinosa en las cepas de la vía doble pareció empezar solo después de que se agotaran la dextrosa y la xilosa. En el medio de xilosa más bajo, las cepas de la vía doble usaron aproximadamente 5 g/l de arabinosa, pero este nivel de consumo requirió aproximadamente 160 horas, ya que la arabinosa solo se consumió después de que se agotara la xilosa (Figura 6). En el medio de xilosa más alto, no se consumieron los últimos 5 g de xilosa, y así no se utilizó arabinosa.

Ejemplo 6: Utilización del gen araB de L. citreum y de B. thetaiotaomicron de codón no optimizado:

La evaluación de las cepas que tienen vías de arabinosa parciales mostró que el efecto inhibidor de la vía en la utilización de xilosa se produjo principalmente a partir de la acción del gen araB. Se identificaron araB alternativos

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xilosa, mientras que la cepa 2973 solo consumió xilosa después de agotarse la glucosa (Figuras 7-9).

Basándose en estos resultados, se integró una segunda copia de cada gen transportador en el genoma. El marcador URA3 en las células yJY19 y yJY20 salió del bucle sembrando estas cepas en placas de ScD-FOA. Se cribaron por PCR de colonias las colonias para identificar colonias que retuvieron la integración, pero perdieron el gen URA3. Una de las cepas positivas que surge de yJY19 se llamó yJY25, y una de las cepas positivas que surge de yJY20 se llamó yJY26.

Se integró una segunda copia del casete de expresión de KHT105 de pJY27, como se ha descrito anteriormente, en la cepa yJY25. Se cribaron por PCR de colonias colonias ura+ para identificar células con la integridad deseada en el sitio AXR1, y un clon tal se llamó la cepa yJY27 (3097). El marcador URA3 en la cepa 3097 salió del bucle sembrando en placas de ScD-FOA después de crecimiento durante la noche. Las colonias se cribaron por PCR de colonias para confirmar la retención de la integración de KHT105, y una de las cepas ura-resultantes se llamó yJY32. yJY32 se transformó con ADN linealizado que llevaba el locus URA3 no mutante, y se cribaron por PCR de colonias colonias ura+ para identificar colonias con la integración correcta. Una de estas cepas que tiene URA3 en su locus original se llamó yJY34 (3081). Así, hubo tres cepas separadas que contenían dos copias del gen KHT105: 3097 (ura+), yJY32 (ura-) y 3081 (ura+).

Se integró una segunda copia del casete de expresión RAG4 de pJY28, como se ha descrito anteriormente, en la cepa yJY26. Se cribaron por PCR de colonias colonias ura+ para identificar células con la inserción deseada en el sitio AXR1, y un clon tal se llamó la cepa yJY28.

Las cepas 3097 (dos copias de KHT105) yJY28 (dos copias de RAG4) y 2973 (principal) se cultivaron durante la noche en YPD a 37 ºC y 250 rpm. Los cultivos durante la noche se recogieron y se resuspendieron a una DO600 objetivo de 3,0 en medio YP + 40 g/l de glucosa + 40 g/l de xilosa (pH 4,8, 37 ºC, 100 rpm).

La cepa 3097 presentó mayor co-consumo de glucosa/xilosa que la cepa de control 2973 cuando la concentración de glucosa fue inferior a 20 g/l (Figura 10). Toda la glucosa fue consumida en aproximadamente cinco horas por la cepa 2973, frente a aproximadamente ocho horas para las cepas 3097 y yJY28. La xilosa se utilizó a una tasa más rápida por las cepas 3097 y yJY28 frente a la principal después de que se consumiera toda la glucosa (Figura 11). La combinación de mayor co-consumo y velocidades de utilización de xilosa más rápidas condujeron a mayor producción de etanol en la cepa 3097 (Figura 12). La cepa 3097 produjo 29 g/l de etanol en 25 horas quedando 7 g/l de xilosa. La cepa de control 2973 produjo 24 g/l de etanol en 25 horas quedando 13 g/l de xilosa. La cepa yJY28 produjo 22 g/l de etanol quedando 16 g/l de xilosa. Estos resultados mostraron que la incorporación del gen transportador KHT105 aumentó la productividad de etanol a partir de una mezcla de sustrato de glucosa/ xilosa.

Cepas de /. orientalis que contienen genes transportadores de K. marxianus se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3:

Nombre de la cepa: Cepaprincipal Gen transportador N.º de copias Localización de la inserción

2973 (ura+), 3099/yJLJ70 (ura) (cepa principal fermentadorade xilosa): - - 0 -

yACN55 (ura-) (cepa principal fermentadora de xilosa con genes TAL, RKI, y RPE): - - 0 --

3408/yHJJ47 (ura+), yJY39 (ura-) (cepa principal con la vía de arabinosa completa deB. thetaiotaomicron, deleción de XYL1, XYL2 y AXR1): - - 0 --

3937/yARA38 (ura+), yLUN011 (ura-) (cepa principal con la vía de arabinosa completa deB. thetaiotaomicron, deleción de 9091 y 1202): - - 0 -

12053/yGP44 (ura+), yLUN027(ura-) (cepa principal tolerante a etanol): - - 0 -

yJY19 (ura+), yJY25 (ura-): 3099 KHT105 de K. marxianus 1 AXR1 (1)

yJY20 (ura+), yJY26 (ura-): 3099 RAG4 de K. marxianus 1 AXR1 (1)

3097/yJY27 (ura+), yJY32 (ura), 3081/yJY34 (URA3reintegrado en el locusoriginal): yJY25 KHT105 de K. marxianus 2 AXR1 (2)

yJY28: yJY26 RAG4 de K. marxianus 2 AXR1 (2)

yACN59 (ura+), yACN60 (ura+), yACN67 (ura-), yACN68 (ura-): yACN55 KHT105 de K. marxianus 1 9091 (1)

3415/yACN71 (ura+), yACN72 (ura+), yACN74 (ura-), yACN75 (ura-), 4141: yACN67 KHT105 de K. marxianus 2 9091 (2)

3849 (ura+), yHJJ172 (ura-) (2X ADH1): 3415 KHT105 de K. marxianus 2 9091 (2)

4014 (ura+), yHJJ182 (ura-), 4084: yHJJ172 KHT105 de K. marxianus 3 9091 (2), S141G4546 (1)

4083 (ura+), yLUN005 (ura-): yHJJ172 KHT105 de K. marxianus 3 9091 (2), ALD5680 (1)

4085: yHJJ182 KHT105 de K. marxianus 4 9091 (2), S141G4546 (2)

4086/yLUN007 (ura+), 4117(ura-): yLUN005 KHT105 de K. marxianus 4 9091 (2), ALD5680 (2)

12037/yLUN013: 4117 KHT105 de K. marxianus 6 9091 (2), ALD5680 (2), S141G4546 (2)

3812/yARA19: yJY39 KHT105 de K. marxianus 1 S141G4546 (1)

yLUN031 (ura+), yLUN033(ura-): yLUN027 KHT105 de K. marxianus 1 ALD5680 (1)

12125/yLUN036: yLUN033 KHT105 de K. marxianus 2 ALD5680 (2)

yLUN015 (ura+), yLUN016(ura-): yLUN011 KHT105 de K. marxianus 1 S141G4546 (1)

12038/yLUN018: yLUN016 KHT105 de K. marxianus 2 S141G4546 (2)

Ejemplo 9: Integración del gen transportador KHT105 de K. marxianus en una cepa de la vía de xilosa de I. orientalis más avanzada:

Se analizó una cepa de I. orientalis modificada que contenía el transportador KHT105 de K. marxianus en

5 combinación con la vía de utilización de xilosa XI/XK, expresión en exceso de los genes de pentosa fosfato no oxidativa, e inactivación del gen 9091 para su capacidad para fermentar xilosa y glucosa a etanol con respecto a una cepa comparable sin el transportador.

Se insertó un fragmento Notl que lleva el casete URA3 en el sitio Notl de pHJJ22 (Ejemplo 4A) para crear los plásmidos de deleción de 9091 pHJJ27 (orientación 1) y pHJJ28 (orientación 2).

10 Se clonó un fragmento Notl del vector pJY27 (Ejemplo 8) que lleva el promotor PDC de I. orientalis, gen transportador KHT105 de K. marxianus, terminador PDC de I. orientalis y casete de selección URA3 en pHJJ22 (Ejemplo 4A) para crear los vectores de expresión KHT105 pHJJ23 (orientación 1) y pHJJ24 (orientación 2).

Se digirió pHJJ23 con Apal y Kpnl para liberar el fragmento de integración, y se transformó ADN linealizado en células yACN55. yACN55 es una cepa ura-que contiene cuatro copias de un gen XI exógeno de B.

15 thetaiotaomicron, dos copias de un gen XK exógeno de la secuencia nativa y dos copias de cada uno de los genes exógenos de la vía de pentosa fosfato de la secuencia nativa (TAL, RKI, RPE), además de copias endógenas de genes XK, TAL, TKL, RPE y RKI. La principal de ura+ de yACN55 es la cepa 3356/yACN53.

Se seleccionaron transformantes y se purificaron sobre placas de ScD-ura. Se cribaron por PCR de colonias colonias ura+ para la integración correcta en el locus 9091. Dos cepas aisladas se llamaron yACN59 y yACN60. La

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Claims

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