ES2603530T3 - Aceite de semilla de algodón mejorado y usos - Google Patents

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Allan Graham Green
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Abstract

Semilla de algodon que tiene una composicion de acido graso en su aceite, en la que del 72 % al 88 % del contenido total de acidos grasos en el aceite de la semilla de algodon es acido oleico, del 4 al 10 % es acido palmitico y del 4 % al 15 % es acido linoleico, y en la que la semilla de algodon es transgenica para una construccion genetica que codifica una o mas moleculas de ARN que inhiben la expresion de tres genes que son ghFAD2-1, ghFatB-2 y ghCPA-FAS-2, en donde el gen ghFATB-2 es una molecula de acido nucleico que comprende nucleotidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la region codificante de la proteina de la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 5 y en donde el gen ghCPA-FAS-2 es una molecula de acido nucleico que comprende nucleotidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la region codificante de la proteina de la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 12.

Description

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aspectos, la enfermedad es obesidad, enfermedad cardíaca, alto contenido sérico de TAG, niveles altos de colesterol en suero, niveles altos de LDL en suero, niveles altos de HDL en suero, hipertensión, cáncer, diabetes, o cualquier combinación de los mismos. Se abarca cualquier sujeto que pueda beneficiarse de los presentes métodos
o composiciones. El término "sujeto" incluye, sin limitaciones, seres humanos y primates no humanos, animales de
5 ganado, animales de compañía, animales de laboratorio, animales silvestres en cautiverio, reptiles y anfibios, peces, aves y cualquier otro organismo. Se puede hacer referencia a un sujeto, independientemente de si es un organismo humano o no humano, como paciente, individuo, sujeto, animal, huésped o receptor. En un aspecto en concreto, el sujeto es un ser humano.
En un aspecto en concreto, la memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico quimérico que codifica un ácido nucleico silenciador de genes que reduce la expresión génica de ghFAD2-1, ghFatB-2 y ghCPA-FAS-2 de algodón, en el que el gen ghFATB2 es una molécula de ácido nucleico que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de codificación de proteínas de la secuencia de ADNc mostrada en SEQ ID NO: 5 y en el que el gen ghCPAFAS2 es una molécula de ácido nucleico que
15 comprende nucleótidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de codificación de proteínas de la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende: (i)) una secuencia contigua de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o una forma complementaria de la misma, o una secuencia que tiene un 90 % de identidad con la misma o una secuencia que hibrida con un complemento de la misma en condiciones de hibridación de alta rigurosidad o (ii) una variante de la molécula de ácido nucleico de (i) que carece de las secuencias que codifican para el polipéptido CPAFAS2 o sus formas complementarias. En una realización ilustrativa, la molécula de ácido nucleico silenciadora génica es un ARN en horquilla. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se proporciona dentro de una construcción genética.
25 En algunas realizaciones, la construcción génica comprende el ácido nucleico y comprende además la estructura expuesta en la figura 12 o las secuencias de los fragmentos A, E, F, G y H expuestas en la figura 13 o una variante funcional de la misma. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico se proporciona en una célula huésped. En otras realizaciones, se proporciona una planta o tejido o célula de la misma que comprende un ácido nucleico sujeto. En algunas realizaciones, se usan las moléculas de ácido nucleico para reducir la expresión de los genes FAD21 de algodón, FatB2 de algodón y/o CPAFAS2 de algodón en una planta de algodón. La memoria descriptiva proporciona, por tanto, una planta de algodón o semilla de la misma modificada que comprende un nivel reducido de uno o más genes endógenos seleccionados de FAD2 de algodón, FatB de algodón y CPAFAS de algodón, preferentemente dos o más de dichos genes o de los tres genes, en los que el aceite de semilla de algodón de la misma muestra niveles elevados de ácido oleico o niveles reducidos de ácido palmítico y ácido linoleico.
35 En una realización adicional, el aceite de semilla de algodón exhibe niveles reducidos de ácidos grasos de ciclopropeno y/o de ciclopropano o gosipol.
En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de FatB de algodón o un fragmento funcional o una variante del mismo, o una forma complementaria del mismo, estando dicha secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la región de codificación proteica de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o 7; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de
45 identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 u 8; (iii) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación de rigurosidad como mínimo moderada con al menos 30 nucleótidos contiguos derivados de la SEQ ID NO: 5 o 7; (iv) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a (i), (ii) o (iii); y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 548-843 de la SEQ ID NO: 5. En algún aspecto, el ácido nucleico, en particular el ARN, o una variante o fragmento funcional del mismo, se proporciona como una molécula sentido, antisentido, ribozima, de cosupresión o ARN bicatenario u otro agente silenciador de genes. Por lo tanto, la memoria descriptiva proporciona una molécula antisentido o de cosupresión que comprende un fragmento de uno cualquiera de (i) - (v) anteriores que se expresa y reduce la expresión de un gen FatB de algodón.
55 En otro aspecto, se proporciona una sonda o cebador aislado que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos derivados de la SEQ ID NO: 5 o la SEC ID Nº 7 o una forma complementaria de las mismas.
En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de CPA–FAS de algodón o un fragmento funcional o una variante del mismo, o una forma complementaria del mismo, estando dicha secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la región de codificación proteica de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 10, 12 o 14; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, 13 o 15; ; (iii) una 65 secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación de rigurosidad como mínimo moderada con al menos 30 nucleótidos contiguos derivados de la SEQ ID NO: 10, 12 o 14; (iv) una secuencia de nucleótidos que es
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algodón, incluyendo los codificados por los genomas A y D del algodón tetraploide, así como las variantes no naturales que pueden producir los expertos en la técnica de la modificación genética. Un ejemplo de una variante de origen natural de ghFAD21 de algodón es la secuencia mostrada en el presente documento como SEQ ID NO: 24, que tiene aproximadamente un 96 % de identidad a lo largo de su longitud completa con la SEQ ID NO: 1. En una
5 realización preferente, un gen ghFAD21 se refiere a una molécula de ácido nucleico, que puede estar presente en el algodón o aislada del mismo o derivada del mismo, que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de codificación de proteínas de la secuencia de ADNc mostrada en laSEQ ID NO: 1.
Un "gen FatB–2 de algodón", "gen ghFatB–2 " o similar, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la acil-ADP tioesterasa en algodón, que se expresa en semillas de algodón en desarrollo. Un gen ghFatB–2 se puede distinguir fácilmente de los genes que codifican otras acil-ACP tioesterasa u otras proteínas por los expertos en la técnica, en particular de un gen ghFatB–1, por ejemplo la SEQ ID NO: 3, o de un gen ghFatB–3, por ejemplo la SEQ ID NO: 7. Los genes FatB–2 de algodón incluyen los alelos o
15 variantes de origen natural que existen en el algodón, incluyendo los codificados por los genomas A y D del algodón tetraploide, así como las variantes no naturales que pueden producir los expertos en la técnica de la modificación genética. En la presente invención, un gen ghFatB–2 se refiere a una molécula de ácido nucleico, que puede estar presente en el algodón o aislada del mismo o derivada del mismo, que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de codificación de proteínas de la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1. 5.
Un "gen CPA–FAS–2 de algodón", "gen ghFatB–2 " o similar, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la CPA ácido graso sintasa en algodón, que se expresa en semillas de algodón en desarrollo. Un gen ghCPA–FAS–2 se puede distinguir fácilmente de los genes que codifican otras CPA
25 ácido graso sintasas u otras proteínas por los expertos en la técnica, en particular de un gen ghCPA–FAS–1, por ejemplo la SEQ ID NO: 10, o de un gen ghCPA–FAS–3e, por ejemplo la SEQ ID NO: 14. Los genes CPA–FAS de algodón incluyen los alelos o variantes de origen natural que existen en el algodón, incluyendo los codificados por los genomas A y D del algodón tetraploide, así como las variantes no naturales que pueden producir los expertos en la técnica de la modificación genética. En la presente invención, un gen ghCPA–FAS–2 se refiere a una molécula de ácido nucleico, que puede estar presente en el algodón o aislada del mismo o derivada del mismo, que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la región de codificación de proteínas de la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1. 12.
Una forma genómica o clon de un gen que contiene la región transcrita puede estar interrumpida con secuencias no
35 codificantes denominadas “intrones” o “regiones intermedias” o “secuencias intermedias”. Un intrón, tal como se usa en el presente documento, es un segmento de un gen que se transcribe como parte de un transcrito de ARN primario pero que no está presente en la molécula de ARNm madura. Los intrones se eliminan o “cortan” del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones no están en el de ARN mensajero (ARNm). . Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. “Exones”, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a las regiones de ADN correspondientes a las secuencias de ARN que están presentes en el ARNm maduro o la molécula de ARN madura en los casos en los que la molécula de ARN no se traduce. Un ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u ordenar los aminoácidos en un polipéptido naciente. El término “gen” incluye una molécula sintética o de fusión que codifica la totalidad o parte de las proteínas de la invención descritas en el presente documento y una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de
45 las anteriores. Se puede introducir un gen en un vector apropiado para el mantenimiento extracromosómico en una célula o para su integración en el genoma del huésped.
Como se usa en el presente documento, un "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo en su localización nativa. Normalmente, un gen quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o de codificación de proteínas que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias de codificación de la misma fuente, pero dispuestas de un modo distinto a como se encuentran en la naturaleza. El término "endógeno" se utiliza en el presente documento para hacer referencia a una sustancia que está normalmente presente o se produce en una planta no modificada en la misma etapa de 55 desarrollo que la planta bajo investigación. Un “gen endógeno” se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Tal como se usa en el presente documento, "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha construido o modificada por tecnología de ADN recombinante. Los términos "polinucleótido extraño" o "polinucleótido exógeno" o "polinucleótido heterólogo" y similares se refieren a cualquier ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante manipulaciones experimentales. Estas incluyen secuencias de genes encontradas en esa célula siempre que el gen introducido contenga alguna modificación (por ejemplo, una mutación, la presencia de un gen marcador seleccionable, etc.) en relación con el gen de origen natural. Los genes extraños o exógenos pueden ser genes que se insertan en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva localización dentro del huésped nativo o genes quiméricos. Un “transgén” es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento 65 de transformación. La expresión "genéticamente modificado" incluye la introducción de genes en las células mediante transformación o transducción, mutación de genes en células y alteración o modulación de la regulación de
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se han sustituido con diferentes nucleótidos. A este respecto, se entiende bien en la técnica que se pueden realizar ciertas alteraciones, incluidas mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones, en un polinucleótido de referencia, con lo que el polinucleótido alterado retiene la función o la actividad biológica del polinucleótido de referencia. Por consiguiente, estos términos abarcan polinucleótidos que codifican polipéptidos que exhiben actividad enzimática u
5 otra actividad reguladora, o polinucleótidos capaces de servir como sondas selectivas u otros agentes de hibridación. En particular, esto incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido o secuencia de aminoácidos pero que varían en la secuencia de nucleótidos por la redundancia del código genético. Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" también incluyen variantes alélicas naturales.
Por "corresponde a" o "correspondiente a" se entiende un polinucleótido (a) que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria a la totalidad o la mayor parte de una secuencia polinucleotídica de referencia o (b) que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o una proteína. Esta frase también incluye dentro de su alcance un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o 15 proteína de referencia. Los términos utilizados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "identidad sustancial" e "idénticos" y se definen con respecto a un número mínimo de nucleótidos o restos de aminoácidos o en toda su longitud. Las expresiones "identidad de secuencia" e "identidad" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia en la medida en que las secuencias son idénticas base a nucleótido por nucleótido o en base a aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. Por tanto, un “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en
25 ambas secuencias, para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de las posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.
El % de identidad de un polinucleótido se puede determinar mediante un análisis GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos = 5 y una penalización por extensión de huecos = 0,3. A menos que se indique lo contrario, la secuencia problema tiene al menos 45 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia problema tiene una longitud de al menos 150 nucleótidos y al análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferentemente, la secuencia problema tiene al
35 menos 300 nucleótidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos, o al menos 400, al menos 500 o al menos 600 nucleótidos en cada caso. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST, como por ejemplo, divulgan Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997. Una discusión detallada del análisis de secuencias se puede encontrar en la Unidad 19,3 de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994–1998, Capítulo 15.
Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se indican como "esencialmente similares" cuando tales secuencias tienen una identidad de secuencia de al menos 90 %, especialmente al menos 95 %, más especialmente son idénticas. Está claro que cuando se describen las secuencias de ARN como esencialmente similares o que corresponden a o que tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, la timina (T) en la
45 secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN.
Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que cifras de % de identidad mayores que las proporcionadas anteriormente abarcarán realizaciones preferentes. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la luz de las cifras de porcentaje de identidad mínima, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia polinucleotídica que sea al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, más preferentemente al menos 90 %, más preferentemente al menos 91 %, más preferentemente al menos 92 %, más preferentemente al menos 93 %, más preferentemente al menos 94 %, más preferentemente al menos 95 %, más preferentemente al menos 96 %, más preferentemente al menos 97 %, más preferentemente al menos 98 %, más preferentemente al menos 99 %, más preferentemente al menos 99,1 %, más preferentemente al menos 99,2 %,
55 más preferentemente al menos 99,3 %, más preferentemente al menos 99,4 %, más preferentemente al menos 99,5 %, más preferentemente al menos 99,6 %, más preferentemente al menos 99,7 %, más preferentemente al menos 99,8 %, e incluso más preferentemente al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO citada relevante.
Preferentemente, un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido con actividad ghFAD2-1, ghFatB-2 o ghCPA-FAS-2 es mayor que 800, preferentemente mayor que 900, e incluso más preferentemente mayor que 1.000 nucleótidos de longitud.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas naturales, una o más mutaciones que son deleciones, inserciones o sustituciones de residuos nucleotídicos. Los mutantes pueden
65 ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, realizando mutagénesis dirigida a sitio sobre el ácido nucleico).
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La construcción de ácido nucleico de la invención puede introducirse en un vector, tal como un plásmido. Los vectores plasmídicos incluyen normalmente secuencias de ácido nucleico adicionales que proporcionan una selección, amplificación y transformación fáciles del casete de expresión en células procariotas y eucariotas, por ejemplo, vectores derivados de pUC, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados
5 de pSP, vectores derivados de pBS o vectores binarios que contienen una o más regiones de T-ADN. Entre las secuencias de ácido nucleico adicionales se incluyen orígenes de replicación para proporcionar una replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables, que codifican, preferentemente, resistencia a antibióticos o a herbicidas, sitios de clonación múltiple únicos que proporcionan sitios múltiples para insertar secuencias de ácido nucleico o genes codificados en la construcción de ácido nucleico, y secuencias que mejoran la transformación de células procariotas y eucariotas (especialmente de plantas).
Por “marcador génico” se quiere decir un gen que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y, por tanto, permite distinguir a dichas células transformadas de las células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere un rasgo para el que se puede “seleccionar” según la resistencia a un agente
15 selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, radiación, calor u otro tratamiento perjudicial para las células no transformadas). Un gen marcador detectable (o gen indicador) confiere un rasgo que se puede identificar mediante observación o análisis (es decir, mediante “detección selectiva” (por ejemplo, β–glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática no presente en las células no transformadas). El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no tienen que estar unidos. Un ejemplo de un gen marcador seleccionable es el gen terminador S1NptIIS3 mostrado esquemáticamente en la Figura 12, que comprende las SEQ ID NOs: 21–23.
Para facilitar la identificación de transformantes, la construcción de ácido nucleico comprende, deseablemente, un gen marcador seleccionable o detectable como, o además, el polinucleótido extraño o exógeno. La elección real de un marcador no es crucial, siempre que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células vegetales
25 de elección. El gen marcador y el polinucleótido extraño o exógeno de interés no tienen que estar unidos, ya que la cotransformación de genes no unidos como, por ejemplo, se describe en la patente de Estados Unidos n.º 4.399.216 también es un proceso eficiente en la transformación de plantas.
Entre los ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables se encuentran los marcadores que confieren resistencia a antibióticos, tales como resistencia a ampicilina, a eritromicina, a cloranfenicol o a tetraciclina, preferentemente resistencia a kanamicina. Entre los ejemplos de marcadores seleccionables para la selección de transformantes vegetales se incluyen, pero no se limitan a, un gen hyg que codifica la resistencia a la higromicina B; un gen de neomicina fosfotransferasa (nptII), que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina, G418; un gen de la glutatión-S-transferasa de hígado de rata , que confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como, por 35 ejemplo, se describe en el documento EP-A 256223; un gen de la glutamina sintetasa, que confiere, tras sobreexpresión, resistencia a inhibidores de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina como, por ejemplo, lo descrito en el documento WO87/05327, un gen de la acetiltransferasa de Streptomyces viridochromogenes, que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como, por ejemplo, se describe en el documento EP-A-275957, un gen que codifica una 5-enolshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), que confiere tolerancia a la Nfosfonometilglicina como, por ejemplo, describen Hinchee et al. Biotech. 6: 915, 1988, un bar, que confiere resistencia a bialafos, como, por ejemplo, se describe en el documento WO91/02071; un gen de la nitrilasa, tal como bxn de Klebsiella ozaenae, que confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker et al., Science, 242: 419, 1988); un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia al metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263: 12500, 1988); un gen de la acetolactato sintasa (ALS) mutante, que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otros
45 productos químicos inhibidores de la ALS (documento EP-A-154 204); un gen de la antranilato sintasa mutada que confiere resistencia a 5-metiltriptófano; o un gen de la dalapon-deshalogenasa, que confiere resistencia al herbicida.
Entre los marcadores detectables preferentes se incluyen, pero no se limitan a, un gen uidA que codifica una enzima β-glucuronidasa (GUS) para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos, un gen de la β-galactosidasa que codifica una enzima para la cual se conocen sustratos cromogénicos, un gen de la aecuorina (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259–68, 1985), que puede emplearse en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de la proteína fluorescente verde (Niedz et al., Plant Cell Reports, 14: 403, 1995.) o derivados de los mismos; un gen de luciferasa (luc) (Ow et al., Science, 234: 856, 1986), que permite la detección de bioluminiscencia, y otros conocidos en la técnica. Por "molécula indicadora”, tal como se utiliza en la presente
55 memoria descriptiva, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que facilita la determinación de la actividad del promotor por referencia al producto proteico.
Métodos de modificación de la expresión génica
El nivel de una proteína, por ejemplo una enzima implicada en la biosíntesis de aceite en las semillas en desarrollo de una planta, puede modularse aumentando el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína en una célula vegetal o disminuyendo el nivel de expresión de un gen que codifica la proteína en la planta, lo que da lugar a una composición de aceite modificado en la semilla madura. El nivel de expresión de un gen puede 65 modularse alterando el número de copias por célula, por ejemplo introduciendo una construcción genética sintética que comprende la secuencia de codificación y un elemento de control transcripcional que está operativamente
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representados por el Coker315 no transformado, contenían ácidos grasos totales de ciclopropano a un nivel de 11,5 % de ácidos grasos totales (promedio de 23 semillas tomadas al azar). En la semilla LY-2, como resultado del aumento sustancial del ácido oleico que es el sustrato para la enzima CPA-FAS, cada uno de los tres ácidos grasos de ciclopropano DHS, STC y MVL, así como el porcentaje total de ácidos grasos de ciclopropano se incrementaron
5 sustancialmente en comparación con el control no transformado. Esto contrastaba claramente con la línea MonoCott, DCS9-34, que mostró una reducción sustancial en los tres ácidos grasos de ciclopropano con el nivel total de ácidos grasos cíclicos, promediando sólo el 3,8 % en 26 semillas seleccionadas al azar. Esto representó una reducción de los ácidos grasos totales de ciclopropano más del 60 % en comparación con el tipo silvestre y más del 80 % en comparación con la semilla transgénica LY-2.
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TABLA 1
Composición de ácidos grasos del aceite de semilla en la semilla de algodón de la línea DCS9–34 trasgénica, en tres generaciones. Las semillas con más de 20 % de contenido de ácido palmítico eran segregantes nulos y eran esencialmente al nivel de tipo silvestre.
Generación
n.º de semilla % de palmítico (16:0) % de esteárico (18:0) % de oleico (18:1) % de linoleico (18:2) Total % CPFA
T2
1 24,1 1,8 13,3 58,5 ND
2
22,0 1,8 13,4 60,4 ND
3
11,8 1,6 63,7 21,6 ND
4
9,3 1,6 73,4 14,6 ND
5
9,8 1,7 70,6 16,7 ND
6
22,5 1,8 17,0 56,6 ND
7
11,3 1,6 64,8 20,9 ND
8
9,5 1,8 70,0 17,6 ND
9
8,5 1,6 75,4 13,3 ND
10
10,9 1,6 72,3 14,1 ND
T3
1 8,6 2,2 76,6 12,0 ND
2
9,5 2,2 73,4 14,5 ND
3
8,9 2,6 73,6 14,5 ND
4
7,4 2,4 80,0 9,8 ND
5
22,8 2,4 15,0 58,8 ND
6
7,6 2,3 81,0 8,7 ND
7
9,3 2,4 73,4 14,4 ND
8
8,0 2,5 76,7 12,3 ND
9
8,9 2,6 78,7 9,2 ND
10
9,0 2,6 74,3 13,7 ND
11
7,9 2,9 78,6 10,2 ND
12
23,2 2,8 15,6 57,4 ND
13
9,0 2,6 74,2 13,7 ND
14
7,8 2,2 79,5 10,1 ND
15
23,2 2,7 14,9 58,4 ND
T4
1 8,3 2,3 74,2 12,6 0,2
2
8,2 2,5 75,6 11,2 0,4
3
8,1 2,5 74,9 11,9 0,2
4
8,7 2,3 72,9 13,6 0,2
5
8,0 2,5 75,3 11,6 0,3
6
8,2 2,3 75,2 11,8 0,2
7
7,8 2,6 76,3 10,7 0,3
8
7,6 2,4 76,6 11,0 0,2
9
8,2 2,7 75,1 11,4 0,3
10
8,3 2,5 74,4 12,4 0,2
11
8,0 2,5 75,6 11,5 0,2
33
12
8,2 2,4 75,5 11,2 0,2
13
7,4 2,5 76,5 11,3 0,2
14
7,8 2,4 76,3 11,3 0,0
15
7,8 2,6 75,2 12,1 0,3
16
8,3 2,2 74,5 12,4 0,3
17
8,2 2,3 74,6 12,3 0,3
18
8,3 2,3 74,1 12,8 0,2
19
8,5 2,3 73,9 12,6 0,3
20
7,8 2,6 75,5 11,7 0,2
21
7,7 2,5 76,3 11,1 0,2
22
8,3 2,6 74,4 12,2 0,3
23
7,9 2,6 73,8 13,2 0,2
24
7,5 2,5 76,7 11,0 0,1
25
8,0 2,5 75,5 11,5 0,2
26
8,2 2,3 74,7 12,0 0,3
27
7,9 2,4 75,6 11,6 0,2
28
7,9 2,6 74,9 12,0 0,3
29
8,1 2,4 75,3 11,8 0,2
30
8,2 2,4 73,8 12,9 0,4
ND: no determinado
TABLA 2 Composición de ácidos grasos de tres generaciones de algodón transgénico que expresa la construcción de ARNi de LY-2 dirigido a tres genes, a saber ghFad2–1, ghCAD–H y ghFatB–2. LY2-1, LY2-8 y LY2-9 parecen mostrar una composición de ácidos grasos de tipo silvestre y pueden ser “escapes” no transformados.
Muestra
Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico Araquídico
Semillas T2
LY2–1
0,88 21,26 1,47 11,34 65,50 0,00 0,00
LY2–2
0,13 8,22 0,87 78,27 12,37 0,21 0,00
LY2–3
0,20 9,65 0,66 74,23 15,21 0,15 0,00
LY2–4
0,00 9,42 1,46 76,76 12,20 0,16 0,00
LY2–5
0,00 8,88 0,60 76,82 13,70 0,00 0,00
LY2–6
0,16 8,10 1,52 80,67 9,36 0,18 0,00
LY2–7
0,22 8,41 1,68 79,97 9,36 0,23 0,14
LY2–8
0,85 21,37 1,73 12,22 63,58 0,24 0,00
LY2–9
0,67 21,45 1,65 11,50 64,45 0,28 0,00
LY2–10
0,21 8,02 1,46 80,51 9,67 0,13 0,00
Semillas T3
LY2,2–1
0,35 6,97 2,07 83,35 6,94 0,13 0,19
LY2,2–2
0,43 6,88 2,03 83,10 7,25 0,14 0,17
LY2,2–3
0,34 7,16 1,71 83,37 7,15 0,12 0,16
LY2,2–4
0,12 7,13 2,10 82,05 8,28 0,18 0,14
LY2,2–5
0,14 7,13 1,91 83,54 7,00 0,12 0,17
LY2,2–6
0,11 6,82 2,07 83,79 6,87 0,14 0,19
LY2,2–7
0,12 6,85 1,69 85,53 7,48 0,13 0,20
LY2,2–8
0,15 7,18 2,03 83,11 7,22 0,16 0,16
LY2,2–9
0,12 6,69 1,93 84,04 6,87 0,13 0,23
LY2,2–10
0,32 6,45 1,91 85,02 5,94 0,17 0,19
LY2,2–11
0,24 7,85 1,74 83,46 6,39 0,11 0,18
LY2,2–12
0,22 7,38 1,24 85,48 5,39 0,13 0,17
LY2,2–13
0,35 8,57 1,27 83,34 6,15 0,20 0,12
LY2,2–14
0,19 6,83 1,68 85,62 5,37 0,13 0,19
LY2,2–15
0,23 7,47 1,94 83,22 6,79 0,14 0,21
34
imagen28
imagen29
Ejes embrionarios de Coker
N.º de
14: 0 16: 0 16: 1 18: 0 18: 1 18: 1 18: 2 18: 3 DHS MVA STC Total de
semilla
n–9 n–7 CPFA
B.1
0,6 25,1 0,5 3,4 12,0 0,6 44,5 0,7 2,2 7,0 3,0 12,2
B.2
0,6 26,3 0,5 3,5 11,2 0,6 44,3 0,6 2,4 6,5 2,7 11,6
B.3
0,7 26,1 0,4 4,0 10,6 0,6 41,6 0,7 3,1 8,1 3,2 14,4
B.4
0,7 26,7 0,4 3,9 11,5 0,6 42,0 0,6 2,8 7,1 3,0 12,9
B.5
0,6 27,2 0,5 3,7 12,0 0,6 45,0 0,4 2,2 4,4 2,7 9,3
B.6
0,6 27,3 0,5 3,6 11,4 0,6 42,4 0,6 2,7 6,7 2,9 12,3
B.7
0,7 27,2 0,5 3,5 11,6 0,6 43,9 0,6 2,4 5,7 2,7 10,8
B.8
0,6 26,6 0,4 4,1 11,5 0,6 42,8 0,5 2,7 6,4 2,9 12,0
B.9
0,7 26,2 0,4 3,8 11,3 0,6 44,6 0,5 2,4 6,0 2,7 11,2
B.10
0,7 26,8 0,5 3,8 11,6 0,6 42,4 0,6 2,7 6,6 3,0 12,3
B.11
0,7 26,4 0,5 3,3 10,8 0,7 42,8 0,8 2,4 7,9 3,1 13,4
B.12
0,7 27,0 0,4 3,9 11,5 0,6 43,1 0,6 2,4 6,3 2,7 11,4
B.13
0,7 26,5 0,5 3,9 12,0 0,6 42,9 0,6 2,6 6,3 2,8 11,6
B.14
0,7 26,5 0,5 3,7 11,7 0,6 43,7 0,6 2,5 6,1 2,7 11,3
B.15
0,6 26,9 0,5 3,5 12,2 0,6 44,1 0,5 2,3 5,5 2,6 10,3
B.16
0,6 26,4 0,5 3,3 12,2 0,6 48,0 0,4 1,8 4,2 1,9 8,0
B.17
0,6 26,6 0,5 3,7 11,5 0,6 43,4 0,6 2,6 6,4 2,7 11,8
B.18
0,6 28,8 0,5 4,1 11,2 0,7 39,2 0,7 2,3 7,9 3,2 13,5
B.19
0,7 26,0 0,5 3,2 11,2 0,7 45,3 0,7 2,0 6,5 2,7 11,1
B.20
0,6 26,8 0,5 3,8 10,7 0,6 43,0 0,7 2,1 7,6 3,0 12,7
B.21
0,7 27,2 0,5 3,6 11,3 0,6 40,7 0,7 3,0 7,3 3,6 13,9
B.22
0,7 26,4 0,5 3,2 11,8 0,7 44,5 0,6 2,0 6,2 2,6 10,9
B.23
0,5 24,6 0,5 2,9 12,7 0,6 51,4 0,4 1,0 3,3 1,5 5,8
Promedio
2,4 6,3 2,8 11,5
TABLA 4
Resumen de los identificadores de secuencia
SEQ ID NO:
DESCRIPCIÓN
1
Secuencia de ADNc que codifica FAD2 de algodón del gen ghFAD2 – 1. 1362 nucleótidos, región codificante de proteína: nucleótidos 73–1227
2
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1: 384 aminoácidos
3
Secuencia de nucleótidos del ADN genómico de ghFatB1 que codifica la tioesterasa de la proteína transportadora de acilo-acilo (FatB-1) de Gossypium hirsutum (Yoder et al., 1999 (citado anteriormente)), n.º de acceso AF076535, 5201 pb. La secuencia completa del ADNc corresponde a los nucleótidos 9151397, 1530-1663, 2352-2465, 2716-2887, 3001-3069 y 3322-3591, todos unidos entre sí
4
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 3: 413 aminoácidos
5
Secuencia de ADNc del gen ghFatB  2, 1647 nucleótidos, La región que codifica la proteína es de los nucleótidos 210 a 1472 (codón de terminación TAG)
6
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 5: 420 aminoácidos
7
Secuencia de ADNc del gen ghFatB–3, 1498 nt
8
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 7: 418 aminoácidos
9
Secuencia EST de G. hirsutum (Dowd et al., 2004 (citado anteriormente)). N.º de acceso CD486555
10
Secuencia de nucleótidos de ghCPA–FAS–1 que codifica la ciclopropano ácido graso sintasa (CPA-FAS1), de Gossypium hirsutum, número de acceso AY574036, secuencia completa de ADNc, 2884 pb, región codificante de proteína: nucleótidos 33-2654
11
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 10: 873 aminoácidos
12
Secuencia de nucleótidos de ghCPA–FAS-2 que codifica la ciclopropano ácido graso sintasa (CPA-FAS2), de Gossypium hirsutum, número de acceso AY574037, secuencia completa de ADNc, 2827 pb, región codificante de proteína: nucleótidos 16-2613
13
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 12: 865 aminoácidos
14
Secuencia de nucleótidos de ghCPA–FAS-3 que codifica la ciclopropano ácido graso sintasa (CPA-FAS3), de Gossypium hirsutum, número de acceso AY574038, secuencia completa de ADNc, 2912 pb, región codificante de proteína: nucleótidos 109-2706
15
Secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 4: 865 aminoácidos
16
Fragmento A de MonoCot, que comprende el promotor de lectina específico de la semilla derivado del gen lec1 de la soja: 1771 nucleótidos
17
Fragmento B de MonoCot, ADN quimérico de tres fragmentos del gen diana
18
Fragmento C de MonoCot: Intrón de ghFAD2–1
19
Fragmento D de MonoCot, complementario del ADN quimérico
37
imagen30
imagen31

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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