ES2603952T3 - Procedimiento para producir alfa,omega-dioles a partir de alcanos de C4 o 1-alcanoles de C4 que emplean una CYP153 alcano hidroxilasa - Google Patents

Procedimiento para producir alfa,omega-dioles a partir de alcanos de C4 o 1-alcanoles de C4 que emplean una CYP153 alcano hidroxilasa Download PDF

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ES2603952T3 ES13791954.4T ES13791954T ES2603952T3 ES 2603952 T3 ES2603952 T3 ES 2603952T3 ES 13791954 T ES13791954 T ES 13791954T ES 2603952 T3 ES2603952 T3 ES 2603952T3
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Abstract

Un método que comprende las etapas de a) proporcionar un alcano o 1-alcanol, b) poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolución acuosa con un citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxígeno durante al menos 3 horas, en el que el alcano o 1-alcanol se convierte en el α,ω-diol correspondiente, y el alcano o 1-alcanol es butano, isobutano, butanol o isobutanol.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para producir alfa,omega-dioles a partir de alcanos de C4 o 1-alcanoles de C4 que emplean una CYP153 alcano hidroxilasa
La presente invencion se refiere a un metodo que comprende las etapas de
a) proporcionar un alcano o 1-alcanol,
b) poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolucion acuosa con un citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante al menos 3 horas,
en el que el alcano o 1-alcanol se convierte en el a,o-diol correspondiente,
y el alcano o 1-alcanol es butano, isobutano, butanol o isobutanol.
Los alcanos sustituidos, por ejemplo alcoholes, aldetndos, cetonas, acidos carboxflicos y aminas, representan una clase de compuestos industrialmente buscados preparados tradicionalmente mediante conversion de compuestos obtenidos a partir de fuentes de carbono fosiles. En una era de suministros cada vez mas restrictivos de combustibles fosiles no renovables, hay un considerable interes en procedimientos biotecnologicos para producir alcanos y derivados de los mismos partiendo de fuentes renovables, es decir, materiales que son facil y, en terminos de escalas de tiempo geologicas, rapidamente reponibles.
En la tecnica anterior se han dado a conocer numerosos metodos para convertir un alcano en alcano sustituido, en particular alcanos oxidados. La metano monooxigenasa cataliza la insercion, dependiente de NADH, de un atomo de oxfgeno en el enlace C-H excepcionalmente estable de metano para formar metanol, la primera etapa en la degradacion de metano mediante metanotrofos tales como Methylosinus trichosporium y Methylococcus capsulatus. La metano monooxigenasa soluble tiene tipicamente un espectro ancho de sustratos, incluyendo hidrocarburos saturados e insaturados, lineales, ramificados, y dclico, de hasta alrededor de C8, asf como compuestos aromaticos, heterodclicos, y clorados (Merkx M, Kopp DA, Sazinsky MH, Blazyk JL, Muller J, Lippard SJ (2001), Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins iJ, Best DJ, Hammond RC. 1980). Los nuevos hallazgos en bacterias que utilizan metano destacan su importancia en la biosfera y su potencial comercial. Las alcano monooxigenasas dependientes de rubredoxina, tales como la alcano monooxigenasa de Pseudomonas putida GPo1, catalizan la oxidacion de alcanos de longitudes de cadena medias, produciendo una mezcla de alcoholes y acidos carboxflicos (Grant C., Woodley, J. M, y Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486).
Sin embargo, aunque los alquilos que tienen dos o mas sustituciones son esenciales para muchos usos, por ejemplo como agentes de reticulacion en la produccion de polfmeros industriales, el grado de sustitucion que se puede lograr usando tales enfoques biotecnologicos es limitado. Se han dado a conocer muchos sistemas para convertir un alcano en el 1-alcanol correspondiente, pero existen pocos procedimientos biotecnologicos que se puedan usar para producir el a,o-diol correspondiente, es decir, una cadena de alquilo, en el que los dos atomos de carbono terminales poseen cada uno un grupo hidroxilo. Ademas, muchas oxidasas tienden a sobreoxidar el sustrato de alcano con el efecto de que aldetndos y acidos carboxflicos no deseados contaminan el producto de alcohol buscado. Finalmente, la oxidacion necesita ser selectiva, queriendo decir que no se debenan de oxidar atomos de carbono alcanicos distintos de los terminales.
El documento de FUJII, T. ET AL.: “Production of alpha,omega-Alkanediols Using Escherichia coli Expressing a Cytochrome P450 from Acinetobacter sp. OC4” (BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 70, n° 6, junio de 2006, paginas 1379-1385) describe un metodo para convertir un alcano de C5-C14 o un 1-alcanol de C6-C12 en el a,o-diol correspondiente, que comprende poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolucion acuosa con una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante 24 horas.
Ademas, el documento de SCHEPS, D. ET AL.: “Regioselective omega-hydroxylation of medium-chain n-alkanes and primary alcohols by CYP153 enzymes from Mycobacterium marinum and Polaromonas sp. strain JS666” (ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY, vol. 9, n° 19, 7 de octubre de 2011, paginas 6727-6733) describe un metodo para convertir un alcano de C5-C12 o un 1-alcanol de C8-C12 en el a,o-diol correspondiente, que comprende poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolucion acuosa con un citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante 4 horas.
El documento de KOCH, D.J. ET AL.: “In Vivo Evolution of Butane Oxidation by Terminal Alkane Hydroxylases AlkB and CYP153A6” (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 75, n° 2, enero de 2009, paginas 337344) describe un metodo para convertir un C3-C8 en el 1-alcanol correspondiente, que comprende poner en contacto dicho en una disolucion acuosa con una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante 1 hora.
Por lo tanto, el problema subyacente de la presente invencion es proporcionar una ruta biotecnologica hacia la conversion de un alcano o 1-alcanol al a,o-diol correspondiente, en la que el grado de sobreoxidacion este limitado y/o la reaccion sea suficientemente espedfica, preferiblemente por cuanto los atomos de carbono distintos de los
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atomos de carbono terminales no se sustituyan o se sustituyan en menor grado.
El problema subyacente de la presente invencion se resuelve mediante un metodo que comprende las etapas de
a) proporcionar un alcano o 1-alcanol,
b) poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolucion acuosa con una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante al menos 3 horas,
en el que el alcano o 1-alcanol se convierte en el a,o-diol correspondiente,
y el alcano o 1-alcanol es butano, isobutano, butanol o isobutanol.
En una primera realizacion, el problema se resuelve mediante un metodo en el que, ademas de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, esta presente una ferredoxina y una ferredoxina reductasa, en el que tanto la ferredoxina como la ferredoxina reductasa son capaces de interaccionar funcionalmente con dicha citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153.
En una segunda realizacion, el problema se resuelve mediante un metodo en el que la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 es la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 de Alcanivorax borkumensis (codigo de acceso YP_691921) o una variante de la misma, la ferredoxina es la ferredoxina procedente de Alcanivorax borkumensis o una variante de la misma, y la ferredoxina reductasa es la ferredoxina reductasa de Alcanivorax borkumensis (codigo de acceso YP_691923) o una variante de la misma.
En una tercera realizacion que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a segunda, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el alcano es butano o isobutano.
En una 4a realizacion que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a tercera, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el alcano o 1-alcanol es butanol o isobutanol.
En una 5a realizacion que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 4a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el alcano es un alcano gaseoso proporcionado a una presion parcial de 1 a 50, preferiblemente 1 a 20, lo mas preferible 1 a 10 bares.
En una 6a realizacion, que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 5a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que al menos una de las enzimas seleccionada del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa se proporcionan en forma de un catalizador de celula completa que expresa dicha enzima o enzimas.
En una 7a realizacion, que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 6a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que todas las enzimas seleccionadas del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa se proporcionan en forma de un biocatalizador de celula completa que expresa dichas enzimas.
En una 8a realizacion, que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 7a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que al menos una, preferiblemente todas, de las enzimas seleccionadas del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa son recombinantes y/o estan sobreexpresadas, preferiblemente estan sobreexpresadas.
En una 9a realizacion, que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 8a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el biocatalizador de celula completa expresa un polipeptido de la familia de AlkL, preferiblemente AlkL de Pseudomonas putida (codigo de acceso CAB69081) o una variante de la misma.
En una 10a realizacion, que es tambien una realizacion de las realizaciones primera a 9a, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el biocatalizador de celula completa es una celula procariota, preferiblemente E. coli.
La presente invencion se basa en el hallazgo sorprendente de que se puede usar citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 para convertir un alcano no solo en el 1-alcanol correspondiente, sino tambien en el a,o-diol correspondiente.
La presente invencion se centra alrededor de un metodo que comprende la etapa de poner en contacto butano, isobutano, butanol o isobutanol con una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153. En una realizacion preferida, la expresion “citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153”, como se usa aqrn, se refiere a una citocromo oxidasa citosolica que es naturalmente parte de un sistema de 3 componentes que comprende no solo la oxidasa sino tambien una ferredoxina y una ferredoxina reductasa, oxidasa la cual tiene un sitio de union a alcano y es capaz de hidroxilar alcanos. En una realizacion mas preferida, la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 tiene al menos 80, preferiblemente 90, mas preferiblemente 95, y lo mas preferible 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoacidos con la citocromo P450 oxidasa de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de acceso YP_691921), y tiene, ademas, actividad de alcano hidroxilasa. En otra
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realizacion preferida, la citocromo P450 alcano hidroxilasa tiene, ademas de dicho grado de identidad de secuencia de aminoacidos, dicho sitio de union y dicha actividad de alcano hidroxilasa, el motivo de secuencia de aminoacidos LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN. Los codigos de las bases de datos citados a lo largo de esta solicitud se refieren a aquellos de la version en lmea de la base de datos de NCBI el 12 de octubre de 2012.
Para proporcionar un suministro de electrones tan eficiente como sea posible desde el agente reductor para sostener la actividad de hidroxilasa de la citocromo P450 alcano hidroxilasa, se prefiere que la alcano hidroxilasa se use en combinacion con una ferredoxina reductasa y una ferredoxina que interaccionan funcionalmente con dicha alcano hidroxilasa. La ferredoxina y la ferredoxina reductasa pueden ser polipeptidos aislados, o se pueden coexpresar en el caso de que se use un biocatalizador de celula completa para proporcionar la citocromo P450 alcano hidroxilasa. El hecho de si una ferredoxina reductasa y/o una ferredoxina interaccionan funcionalmente o no con una citocromo P450 alcano hidroxilasa de interes se puede determinar mediante la persona experta en la tecnica monitorizando si el agente reductor se oxida mas alla de un nivel de fondo en presencia de un sustrato alcanico y los tres polipeptidos, siendo estos ultimos preferiblemente polipeptidos aislados. Como alternativa, se puede usar un ensayo enzimatico descrito por Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, y Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727, que indica una velocidad de reaccion incrementada en el caso de que se usen polipeptidos que interaccionan funcionalmente. En una realizacion preferida, la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa proceden del mismo organismo, mas preferiblemente de Alcanivorax borkumensis SK2, en cuyo caso los codigos de acceso son YP_691921, YP_691923 y YP_691920, respectivamente.
En una realizacion preferida, la expresion “poner en contacto”, como se usa aqrn, significa provocar el contacto directo entre butano, isobutano, butanol o isobutanol y oxidorreductasa de manera que esta ultima sea capaz de oxidar al primero. Por ejemplo, la celula y el alcano o 1-alcanol pueden no estar en diferentes compartimentos separados por una membrana tal como una membrana inorganica impermeable para la celula y el butano, isobutano, butanol o isobutanol. Si el alcano o 1-alcanol es solido o soluble, simplemente se puede anadir a la oxidorreductasa en una disolucion acuosa. Si el alcano o 1-alcanol es gaseoso, la disolucion acuosa que comprende la celula se puede rociar con un gas que comprende dicho alcano o 1-alcanol gaseoso.
En el caso de que el alcano o 1-alcanol sea solido, se puede solubilizar usando disolventes organicos adecuados, y despues se puede anadir a la disolucion acuosa. Los disolventes organicos preferidos son disolventes biocompatibles, es decir, disolventes que permiten la viabilidad de la celula usada y/o la actividad de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 escogida. El disolvente organico es un acido graso que comprende 5 o mas, mas preferiblemente 8 o mas, lo mas preferible 12 o mas atomos de carbono, o derivados del mismo, tales como esteres alqmlicos. El disolvente organico es ester metilico del acido laurico.
La citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 puede ser una hidroxilasa recombinante. En una realizacion preferida, la expresion citocromo P450 alcano hidroxilasa “recombinante” de la familia de CYP153, como se usa aqrn, significa que el acido nucleico que codifica la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 no es un acido nucleico endogeno del organismo usado para expresarla, o no es de hecho endogeno para ningun organismo de tipo natural, sino que se ha obtenido usando ingeniena genetica. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con plasmidos adecuados, elementos de acidos nucleicos, por ejemplo secuencias promotoras, y metodos que se pueden usar para obtener tales plasmidos. Los metodos de biologfa molecular estandar se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning-A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Aunque en principio se puede usar una cepa de tipo natural que exprese una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, se prefiere que la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 se sobreexprese en una cepa recombinante. En una realizacion preferida, el termino “sobreexpresada”, como se usa aqrn, significa que la concentracion del polipeptido en cuestion, en comparacion con su concentracion en la celula de tipo natural respectiva, es elevada. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con tecnicas que se pueden usar para sobreexpresar una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, por ejemplo el uso del sistema pET o pGEX de plasmidos.
La citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 puede ser un polipeptido purificado o aislado. En una realizacion preferida, el termino “purificado”, como se usa aqrn, significa que el polipeptido citado como tal es mas puro que lo que lo es en el momento de su expresion en una celula. La pureza se puede juzgar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida seguido de tincion con azul de Coomassie del gel producido. En una realizacion preferida, el polipeptido es mas de 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % puro, pero en principio se puede usar en cualquier grado de pureza, desde el lisado celular bruto hasta el polipeptido 100% puro. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con metodos de purificacion de protemas, por ejemplo cromatograffa de afinidad, precipitacion con sulfato de amonio y cromatograffa de filtracion en gel.
El alcano o 1-alcanol se pone en contacto con la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 en un entorno compatible con la actividad de la citocromo P450 alcano hidroxilasa. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con parametros estandar, tales como fuerza ionica, temperatura y composicion de amortiguadores acuosos adecuados que necesitan ser considerados con respecto a la actividad enzimatica, y es capaz de
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determinar condiciones adecuadas dentro del alcance de la experimentacion habitual. Las condiciones adecuadas para mantener la actividad de la citocromo P450 alcano hidroxilasa se describen, por ejemplo, en Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, y Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727.
Es esencial que el oxfgeno este presente mientras que se produzca la oxidacion del alcano o 1-alcanol catalizada por la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153. Tfpicamente, la hidroxilasa esta en una disolucion acuosa, y el oxfgeno se introduce agitando la vasija de reaccion en condiciones aerobias, es decir, en presencia de oxfgeno molecular (O2). Como alternativa, la disolucion se puede rociar con oxfgeno molecular puro o mezclas de gases que comprenden oxfgeno molecular, preferiblemente ademas de gases inertes tales como nitrogeno o argon. Si el alcano o 1-alcanol a oxidar es gaseoso en las condiciones contempladas, puede ser parte de tal mezcla. En una realizacion preferida, la disolucion acuosa esta en contacto con el aire para proporcionar oxfgeno.
En una realizacion preferida, el oxfgeno molecular puede estar presente a una presion parcial que supere la presion atmosferica, preferiblemente medida a temperatura ambiente (25°C), preferiblemente a mas de 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 bares.
Las ensenanzas de la presente invencion pueden llevarse a cabo no solo usando macromoleculas biologicas que tienen las secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos exactas citadas explfcitamente en esta solicitud, por ejemplo mediante el nombre o numero de acceso, o implfcitamente, sino tambien usando variantes de tales secuencias. El termino “variante”, como se usa aqrn, comprende secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos, respectivamente, que son mas de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% identicas a la secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos de referencia, en el que preferiblemente los aminoacidos distintos de aquellos esenciales para la funcion, por ejemplo la actividad catalttica de una protema, o el plegamiento o la estructura de la molecula, se suprimen, sustituyen o reemplazan por inserciones, o los aminoacidos esenciales se sustituyen de manera conservativa. El estado de la tecnica comprende algoritmos que se pueden usar para alinear dos secuencias de acidos nucleicos o de aminoacidos dadas y para calcular el grado de identidad; veanse Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3a edicion, Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994, y Katoh et al., Genome Information, 16(1), 22-33, 2005. El termino “variante” se usa de forma sinonima e intercambiable con el termino “homologo”. Tales variantes se pueden preparar introduciendo supresiones, inserciones o sustituciones en secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos, asf como fusiones que comprenden tales macromoleculas o variantes de las mismas. En una realizacion preferida, el termino “variante”, con respecto a la secuencia de aminoacidos, comprende, preferiblemente ademas de la identidad de secuencia anterior, secuencias de aminoacidos que comprenden uno o mas cambios de aminoacidos conservativos con respecto a la secuencia de referencia o de tipo natural respectiva, o comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos que comprenden uno o mas cambios de aminoacidos conservativos. En una realizacion preferida, el termino “variante” de una secuencia de aminoacidos o secuencia de acido nucleico comprende, preferiblemente ademas del grado anterior de identidad de secuencia, cualquier porcion activa y/o fragmento de la secuencia de aminoacidos o de la secuencia de acido nucleico, respectivamente, o cualquier secuencia de acido nucleico que codifique una porcion activa y/o fragmento de cualquier secuencia de aminoacidos. En una realizacion preferida, la expresion “porcion activa”, como se usa aqrn, se refiere a una secuencia de aminoacidos o una secuencia de acido nucleico que es menor que la secuencia de aminoacidos de longitud completa o codifica menos de la secuencia de aminoacidos de longitud completa, respectivamente, en el que la secuencia de aminoacidos o la secuencia de aminoacidos codificada, respectivamente, retiene al menos algo de su actividad biologica esencial. Por ejemplo, una porcion activa y/o fragmento de una proteasa es capaz de hidrolizar enlaces peptfdicos en polipeptidos. En una realizacion preferida, la expresion “retiene al menos algo de su actividad biologica esencial”, como se usa aqrn, significa que la secuencia de aminoacidos en cuestion tiene una actividad biologica que excede y es distinta de la actividad de fondo, y los parametros cineticos que caracterizan dicha actividad, mas espedficamente, kcat y Km, estan preferiblemente dentro de 3, mas preferiblemente 2, lo mas preferible un orden de magnitud de los valores presentados por la molecula de referencia con respecto a un sustrato espedfico. En una realizacion preferida, el termino “variante” de un acido nucleico comprende acidos nucleicos cuya hebra complementaria se hibrida, preferiblemente en condiciones restrictivas, al acido nucleico de referencia o de tipo natural. La restriccion de las reacciones de hibridacion es facilmente determinable por alguien de pericia normal en la tecnica, y en general es un calculo empmco que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura del lavado y de la concentracion de sal. En general, sondas mas largas requieren mayores temperaturas para la recombinacion apropiada, mientras que sondas mas cortas necesitan temperaturas mas bajas. La hibridacion depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a recombinarse a hebras complementarias que estan presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor es el grado de homologfa deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que mayores temperaturas relativas tendenan a hacer a las condiciones de reaccion mas restrictivas, mientras que menores temperaturas las hanan menos. Para detalles adicionales y explicacion de la restriccion de las condiciones de hibridacion, vease F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Ademas, la persona experta en la tecnica puede seguir las instrucciones dadas en el manual “The DlG System Users Guide for Filter Hybridization”, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania, 1993 y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991) sobre como identificar secuencias de ADN por medio de la hibridacion. En una realizacion preferida, las condiciones restrictivas se aplican para cualquier hibridacion, es decir, la hibridacion se produce solamente si la sonda es 70% o mas identica a la secuencia diana. Las sondas que tienen
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un grado menor de identidad con respecto a la secuencia diana se pueden hibridar, pero tales hforidos son inestables y se eliminaran en una etapa de lavado en condiciones restrictivas, por ejemplo reduciendo la concentracion de sal hasta 2 x SSC u, opcional y subsiguientemente, hasta 0,5 x SSC, mientras que la temperatura es, a fin de incrementar la preferencia, aproximadamente 50°C-68°C, aproximadamente 52°C-68°C, aproximadamente 54°C-68°C, aproximadamente 56°C-68°C, aproximadamente 58°C-68°C, aproximadamente 60°C-68°C, aproximadamente 62°C-68°C, aproximadamente 64°C-68°C, aproximadamente 66°C-68°C. En una realizacion particularmente preferida, la temperatura es aproximadamente 64°C-68°C o aproximadamente 66°C- 68°C. Es posible ajustar la concentracion de sal hasta 0,2 x SSC, o incluso 0,1 x SSC. Los fragmentos polinucleotfdicos que tienen un grado de identidad con respecto a la secuencia de referencia o de tipo natural de al menos 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% se pueden aislar. En una realizacion preferida, el termino “homologo” de una secuencia de acido nucleico, como se usa aqm, se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico que codifica la misma secuencia de aminoacidos que la secuencia de acido nucleico de referencia, en lmea con la degeneracion del codigo genetico.
Como alternativa, la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 se puede proporcionar como un biocatalizador de celula completa en lugar de un polipeptido aislado. En una realizacion preferida, la expresion “biocatalizador de celula completa”, como se usa aqm, se refiere a cualquier celula viable que expresa la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 de una manera que permite poner en contacto esta ultima con el alcano o 1-alcanol. En una realizacion preferida, la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 esta situada fuera de la celula en la membrana celular exterior, y se expone asf a la disolucion acuosa que rodea al biocatalizador de celula completa. Como alternativa, la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 se expresa en el interior de la celula, preferiblemente en el citosol de la celula. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con las maneras para generar de forma rutinaria biocatalizadores de celulas completas; vease, por ejemplo, el documento US 12/742.318.
La conversion de un alcano en un diol usando una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 expresada por un biocatalizador de celula completa esta limitada no solo por la actividad de la hidroxilasa expresada, sino tambien por la cantidad de sustrato importando al citosol del biocatalizador de celula completa usado. En una realizacion preferida, el biocatalizador de celula completa expresa, ademas de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, el polipeptido codificado por alkL de Pseudomonas putida (codigo de acceso CAB69081.1) o una variante de la misma, para facilitar la importacion del sustrato de alcano. En el documento WO2011/131420 se describen celulas ejemplares que expresan AlkL y maneras para hacer uso de su capacidad para importar sustratos al citosol de una celula biotecnologicamente relevante.
Si el a,o-diol no es el producto final buscado, se puede convertir en otros productos aguas abajo, tal como una diamina, usando reacciones catalizadas por catalizadores sinteticos u otras enzimas. En el caso de que se haga uso de otras enzimas, se prefiere que se use un biocatalizador de celula completa que exprese, ademas de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, otras enzimas, por ejemplo una o mas del grupo que comprende una transaminasa, una alcohol deshidrogenasa, una alanina deshidrogenasa, y similar. En el documento US 12/742.318 se describen otras enzimas ejemplares.
Si se usa un biocatalizador de celula completa que expresa la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, y opcionalmente ademas otras enzimas, el biocatalizador de celula completa se puede modificar adicionalmente para incrementar el rendimiento del producto, por ejemplo mediante supresion o inactivacion de enzimas capaces de degradar o metabolizar dicho producto. Por ejemplo, si el producto buscado es un ester, se pueden suprimir o inactivar una o mas ester hidrolasas, preferiblemente aquellas endogenas a la celula y codificadas en el genoma de la celula. Ademas, se puede suprimir o inactivar cualquier oxidasa capaz de sobreoxidar uno o dos de los grupos hidroxilo terminales del a.o-diol buscado.
Las ensenanzas de la invencion se pueden llevar a cabo usando un amplio intervalo de celulas como biocatalizador de celula completa. En una realizacion preferida, el termino “celula”, como se usa aqm, se refiere a cualquier celula permanentemente unicelular que comprende bacterias, arqueas, hongos, algas y similares. En una realizacion preferida, la celula es una celula bacteriana, mas preferiblemente una del grupo que comprende Pseudomonas, Corynebacterium y Escherichia, lo mas preferible Escherichia coli. En otra realizacion preferida, la celula es una eucariota inferior, mas preferiblemente un hongo del grupo que comprende Saccharomyces, Candida, Picchia, Schizosaccharomyces y Yarrowia, y es muy preferiblemente Saccharomyces cerivisiae. A lo largo de esta solicitud, el termino “celula” se usa de forma sinonima e intercambiable con el termino “microorganismo”.
La celula puede ser una celula aislada, en otras palabras, un cultivo puro de una unica cepa de celula, o puede comprender una mezcla de al menos dos cepas. Las celulas biotecnologicamente relevantes estan disponibles comercialmente de, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC) o la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Los protocolos para conservar y modificar microorganismos estan disponibles en la tecnica anterior, por ejemplo Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, 2a edicion, y Fuchs/Schlegel (2007), Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlag.
En una realizacion preferida, el biocatalizador de celula completa usado para llevar a cabo las ensenanzas de la
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invencion tiene una capacidad reducida de degradacion de acidos grasos. La degradacion de acidos grasos en microorganismos se logra mediante una secuencia de reacciones y sucesos como sigue. En primer lugar, es necesario que los acidos grasos sean transportados a traves de la membrana celular v^a un mecanismo de transporte/activacion adlica que implica al menos una protema de la membrana exterior y una protema asociada a la membrana interior que tiene actividad de acido graso-CoA ligasa, denominadas en el caso de E. coli como FadL y FadD, respectivamente. Dentro de la celula, el acido graso a degradar se somete a la ruta de p-oxidacion. La primera etapa implica la conversion de acil-CoA en enoil-CoA a traves de acil-CoA deshidrogenasa, denominada FadE en el caso de E. coli. La enoil-CoA resultante se convierte en 3-cetoacil-CoA via 3-hidroxilacil-CoA a traves de hidrogenacion y oxidacion, catalizadas por enoil-CoA hidratasa/3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, denominada FadE en el caso de E. coli. Finalmente, 3-cetoacil-CoA tiolasa, FadA en el caso de E. coli, cataliza la escision de 3- cetoacil-CoA, para dar acetil-CoA y una acil-CoA acortada en dos atomos de carbono. En una realizacion preferida, la expresion “un microorganismo que tiene una capacidad reducida de degradacion de acidos grasos”, como se usa aqrn, se refiere a un microorganismo que tiene una capacidad reducida para captar y/o degradar acidos grasos, preferiblemente aquellos que tienen cadenas de al menos ocho carbonos. La capacidad de degradacion de acidos grasos de un microorganismo se puede reducir de diversas maneras. En una realizacion preferida, el microorganismo tiene, en comparacion con su tipo natural, una actividad reducida de una enzima implicada en la ruta de p-oxidacion, por ejemplo una enzima que interacciona directamente con un acido graso o un derivado del mismo formado como parte de la degradacion de dicho acido graso via la ruta de p-oxidacion, preferiblemente reconociendo el acido graso o derivado del mismo como un sustrato y convirtiendolo en un metabolito formado como parte de la ruta de p-oxidacion y mas proximo a una acetil-CoA en vez de al acido de longitud completa. En una realizacion particularmente preferida, este incluye un importador de acidos grasos, mas espedficamente cualquier componente de la maquinaria de importacion de acidos grasos. Por ejemplo, la acil-CoA deshidrogenasa es una enzima implicada en la ruta de p-oxidacion puesto que interacciona con el ester de acido graso-CoA y convierte el ester en enoil-CoA, que esta mas proximo a acetil-CoA que a ester de acido graso-CoA. En una realizacion preferida, la expresion “enzima implicada en la ruta de oxidacion de acidos grasos”, como se usa aqrn, comprende cualquier polipeptido del grupo que comprende importador de acidos grasos y componentes del mismo, acil-CoA deshidrogenasa, 2,4-dienoil-CoA reductasa, enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa y 3-ceto-acil- CoA tiolasa.
El metodo de la invencion comprende incubar butano, isobutano, butanol o isobutanol en una disolucion acuosa en presencia de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153. Esta etapa puede comprender no solo poner en contacto temporalmente el alcano o 1-alcanol con la disolucion, sino de hecho incubar el alcano o 1-alcanol en presencia de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 durante un tiempo suficientemente largo para permitir que se produzca una reaccion de oxidacion, por ejemplo durante al menos 3, 4, 5, 10 o 20 horas. La temperatura escogida debe ser tal que la celula de la invencion permanezca catalfticamente competente y/o metabolicamente activa, por ejemplo 10 a 42°C, preferiblemente 30 a 4o°C, lo mas preferible 32 a 38°C en el caso de que la celula sea una celula de E. coli.
El alcano o 1-alcanol a oxidar puede ser cualquier alcano o 1-alcanol. El termino “alcano”, como se usa aqrn, se refiere a cualquier compuesto representado por la formula CnH2n+2, en la que n es o es mas de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El alcano es un cicloalcano representado por la formula CnH2n, en la que n es o es mas de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El alcano o 1-alcanol es, a temperatura ambiente (25°C) y presion atmosferica, un alcano o 1-alcanol gaseoso, por ejemplo isobutano. El termino “1-alcanol”, como se usa aqrn, se refiere a cualquier compuesto representado por la formula CnH2n+2O, en la que n es o es mas de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El termino “1-alcanol”, como se usa aqrn, se refiere a cualquier compuesto adclico representado por la formula CnH2nO, en la que n es o es mas de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El 1-alcanol es un 1-alcanol alifatico primario.
Un alcano o 1-alcanol gaseoso se proporciona preferiblemente a una presion parcial, medida preferiblemente a temperatura ambiente (25°C), que excede la presion atmosferica, por ejemplo a mas de 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bares. La presion combinada total de todos los compuestos gaseosos presentes, por ejemplo oxfgeno, alcanos o 1- alcanoles gaseosos y nitrogeno, puede ser mas de 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bares.
La expresion “una disolucion acuosa” comprende cualquier disolucion que comprende, como disolvente principal, agua, que se puede usar para mantener al biocatalizador de celula completa que expresa la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, al menos temporalmente, en un estado metabolicamente activo y/o viable, o la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 catalfticamente competente, y comprende, si tal es necesario, cualesquiera sustratos adicionales. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con numerosas disoluciones acuosas, habitualmente denominadas como medios, que se pueden usar para hacer crecer y sostener celulas, por ejemplo medio LB en el caso de E. coli. La disolucion acuosa se mantiene en condiciones aerobias. Es ventajoso usar, para celulas en crecimiento a usar como biocatalizadores de celulas completas, un medio completo, dado el incremento en la velocidad de crecimiento en comparacion con el medio irftnimo.
Es ventajoso usar como disolucion acuosa para llevar a cabo el metodo de la invencion un amortiguador simple o
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medio mmimo, es dedr, un medio de composicion simple razonable que comprenda solamente el conjunto mmimo de sales y nutrientes indispensables para mantener a la celula en un estado metabolicamente activo y/o viable, en contraste con los medios complejos. Por ejemplo, como medio mmimo, se puede usar medio M9. Si el alcano o 1- alcanol a oxidar tiene solubilidad limitada en agua, se puede anadir a la disolucion acuosa un disolvente organico o detergente, tal como Tween o Triton, o se puede usar un disolvente hidrofobo para solubilizar el alcano o 1-alcanol a oxidar. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con la preparacion de diversas disoluciones acuosas y organicas.
La reaccion se puede llevar a cabo en un modo discontinuo o en un modo continuo. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con fermentadores y/o vasijas de reaccion adecuados.
La Fig. 1 muestra un analisis de GC/MS de los productos formados en el Ejemplo 1, en la que el panel superior muestra el analisis de una muestra normal, en la que el analisis de la muestra mostrado en el panel inferior se lleva a cabo en una muestra a la que se ha anadido como patron 1,4-butanodiol sintetico.
La Fig. 2 muestra la produccion de butanol y 1,4-butanodiol en el Ejemplo 1 a lo largo del tiempo.
La Fig. 3 muestra la produccion de 1,4-butanodiol en el Ejemplo 2 a lo largo del tiempo.
Ejemplo 1: Oxidacion de butano usando W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL] de E.coli que expresa la citocromo P450 alcano hidroxilasa de Alcanivorax borkumensis
Tres matraces de 100 ml, que comprenden cada uno 25 ml de medio LB suplementado con kanamicina (composicion: 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 0,5 g/l de NaCl, 50 mg/l de sulfato de kanamicina), se inocularon usando cada 100 ml de criocultivo en glicerol de W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL] de E. coli, y se incubaron durante 20 horas a 37°C y 200 rpm.
Subsiguientemente, se transfirieron cada 25 ml de un medio de cultivo en 75 ml de medio M9 modificado (composicion: 15 g/l de glucosa, 6,8 g/l de Na2PO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 2 g/l de NH4Cl, 15 g/l de extracto de levadura, 0,49 g/l de MgSO4*7H2O, 50 mg/l de sulfato de kanamicina, 15 ml/l de disolucion de oligoelementos US3. La composicion de la disolucion de oligoelementos US3: 36,5 g/l de acido clortndrico al 37%, 1,91 de MnCl2*4H2O, 1,87 g/l de ZnSO4*7H2O, 0,84 g/l de Na-EDTA*2H2O, 0,3 g/l de H3BO3, 0,25 g/l de Na2MoO4*2H2O, 4,7 g/l de CaCh*2H2O, 17,3 g/l de FeSO4*7H2O, 0,15 g/l de CuCh*2H2O). Los matraces se incubaron a 37°C y a 200 rpm durante 2,5 horas. Subsiguientemente, la temperatura se redujo hasta 25°C. Despues de 0,5 horas a 25°C, el cultivo se indujo usando diciclopropilcetona 0,4 mM. Los cultivos se incubaron durante otras 16 horas a 25°C y 200 rpm.
Los cultivos se combinaron, se transfirieron a tubos Falcon de 50 ml y se hicieron girar a 5500 g a 25°C durante 10 minutos. El sobrenadante se desecho, los peletes de 300 ml de cultivo se resuspendieron en 50 ml de amortiguador de conversion a pH 7 (composicion del amortiguador de conversion: 8 g/l de (NH4)H2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 0,49 g/l de MgSO4*7H2O, 50 mg/l de sulfato de kanamicina, 15 ml/l de disolucion de oligoelementos US3; pH ajustado a 7,0 usando disolucion de amomaco al 25%).
Se monto un fermentador de 300 ml que comprende 130 ml de amortiguador de conversion, pH 7, y aproximadamente 3 gotas de agente reaccionante antiespumante sometido a autoclave (Delamex). El fermentador se suministro con gas a partir de un matraz de gas a presion (presion inicial 4 bares) que comprende una mezcla que consiste en 25% de n-butano y 75% de aire sintetico via un sinterperlator que tiene un tamano de poros de 0,2 |im y a un caudal de aproximadamente 10 lN/h. El fermentador se agito en un bano de agua, y la temperatura del fermentador se ajusto en un bano de agua a 30°C y se agito usando un agitador magnetico a 900 rpm. El valor del pH se mantuvo a 7,0 usando amomaco acuoso al 2,5%. Se alimento continuamente disolucion de glucosa (caudal de glucosa a 0,3 g/h). El aire a descartar se transfirio a una botella de lavado enfriada con hielo que comprende 150 ml de agua.
El fermentador se inoculo usando 50 ml de los peletes del precultivo resuspendidos.
La concentracion de la biomasa en el fermentador, segun se indica mediante la densidad optica a 600 nm, fue 16. Se retiraron muestras de 10 ml del fermentador y de la botella de lavado en diversos puntos de tiempo. Las muestras del fermentador se hicieron girar durante 10 minutos a 10000 g y a temperatura ambiente, y el sobrenadante se filtro usando un filtro de 0,2 |im.
El analisis de 1-butanol se llevo a cabo cromatograficamente usando HPLC-RID y un sistema de Agilent Technologies 1200. Se uso una columna Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm). El sistema se hizo funcionar usando H2SO4 10 mM como agente de pasada, a un caudal de 0,6 ml/min. y a una temperatura de columna de 40°C. Los patrones de todas las sustancias a analizar se prepararon en el agua mas pura, y se midieron en condiciones identicas. El analisis se llevo a cabo comparando los valores de los tiempos de retencion.
El analisis de 1,4-butanodiol se llevo a cabo cualitativamente usando GC-MS (TraceGC Ultra/DSQ II de ThermoScientific, columna capilar: 30 m x 0,25 mm ZB-WAX df: 0,259 m, P013). La precipitacion de las protemas de
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la muestra se llevo a cabo usando acetona fna (muestra/acetona 1:9). El sobrenadante que se hizo girar se sometio a analisis de GC-MS. Las sustancias se identificaron comparando los espectros medidos y los espectros de las bases de datos. El 1,4-butanodiol se pudo identificar usando su espectro de EI, y se pudo asignar al pico a un tiempo de retencion de 19,88 min.
A fin de confirmar la identidad, la muestra se rocio usando 10 mg/l de 1,4-butanodiol. La Fig. 1 muestra la cromatograffa de corriente de iones para el ion del fragmento caractenstico m/z 71 de 1,4-butanodiol. La concentracion de 1,4-butanodiol a 17 mg/l se pudo estimar comparando las areas de los picos de la muestra rociada y no rociada, considerando el factor de elucion (VF = 10).
Ejemplo 2:
Oxidacion de 1-butanol a 1,4-butanodiol
Se puede mostrar que la cepa usada en el Ejemplo 1 convierte no solo butano sino tambien 1-butanol en 1,4- butanodiol.
Cultivo de presiembra: se preparo 1 l de medio LB (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 0,5 g/l de NaCl, disuelto en 1 l de agua, sometido a autoclave durante 20 minutos a 121°C).
Cada 25 ml de esta disolucion se transfirio a tres matraces de 100 ml con pantallas, se complemento con 25 |il de disolucion de kanamicina (50 g/l) esterilizada mediante filtracion, y se inoculo usando cada 200 ml de un criocultivo en glicerol de W3110 pcOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL] de E. coli. Estos cultivos se incubaron a 37°C y 200 rpm (amplitud 2,5 cm) durante 20 horas.
Cultivo de siembra: se preparo 1 l de medio M9 modificado, que comprende 6,8 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 15 g/l de extracto de levadura, 0,5 g/l de NaCl, 2 g/l de NH4Cl, 15 ml de disolucion de oligoelementos US3 (1 l de la disolucion de oligoelementos US 3 comprende 36,5 g de HCl 37%, 1,91 g de MnCh x 4H2O, 1,87 g de ZnSO4 x 7H2O, 0,84 g de EDTA sodico x 2H2O, 0,3 g de H3BO3, 0,25 g de Na2MoO4 x 2H2O, 4,7 g de CaCh x 2H2O, 17,3 g de FeSO4 x 7 H2O, 0,15 g de CuCl2, disueltos en 1 l de agua), 1 ml de disolucion de (MgSO4 x 7H2O) (246,47 g/l), 30 ml de disolucion de glucosa (500 g/l). 954 de la disolucion que comprende Na2HPO4 a NH4Cl se sometieron a autoclave, los otros componentes se esterilizaron por separado mediante filtracion y se anadieron subsiguientemente. El pH fue 6,8.
Se transfirieron 3 x 175 ml del medio M9 modificado a un matraz de agitacion de 1000 ml con pantallas, se complemento con 75 |il de una disolucion de kanamicina (50 g/l) esterilizada mediante filtracion, se inoculo con 25 ml de cultivo de presiembra cada uno, y se incubo durante a 37°C y 200 rpm (amplitud 2,5 cm). Despues de 2,5 h a 37°C, la temperatura se redujo hasta 25°C. Despues de 0,5 h a 25°C, los cultivos se indujeron usando DCPK 0,4 mM, y se incubaron a 25°C durante 16 h adicionales.
Los cultivos de los matraces de agitacion se reunieron de manera esteril y se hicieron girar (6000 g, 10 min., 25°C) en matraces de centrifugacion. El sobrenadante se desecho, y los peletes se resuspendieron en 30 ml de amortiguador de fosfato de amonio 70 mM a pH 7 (composicion: 8 g/l de (NH4)H2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 0,49 g/l de MgSO4 x 7H2O, 15 ml de disolucion de oligoelementos US3 y 50 |ig/l de kanamicina; para ajustar el pH se uso NH4OH al 5%).
Biotransformacion:
Se transfirieron 150 ml de amortiguador de fosfato de amonio que comprende aproximadamente 3 gotas de reactivo antiespumante sometido a autoclave (Delamex) a un fermentador de 300 ml esteril. Se introdujo aire al fermentador via un sinterperlator metalico que tiene un tamano de poros de 0,2 |im, a un caudal de aproximadamente 10 Nl/h. La temperatura del fermentador se mantuvo a 30°C usando un bano de agua, y sus contenidos se agitaron usando un agitador magnetico a 900 rpm. El aire de salida se hizo pasar a traves de una botella de lavado enfriada con hielo que comprende 150 ml de agua.
El fermentador se inoculo usando 30 ml de los peletes de la biomasa resuspendidos via el tubo que toma la muestra. El pH se mantuvo a 7,0 usando disolucion de amomaco al 2,5%. Se alimento continuamente, a un caudal de alimentacion de 1,12 ml/h, una disolucion de alimentacion que contiene 30 g/l de glucosa y 50 g/l de 1-butanol.
Se retiro una muestra de 6 ml del fermentador tras 0,2, 2, 4, 7, 22,5, 30,5 y 46,6 horas cada vez. Las muestras se hicieron girar durante 10 minutos a 10000 g y temperatura ambiente, y el sobrenadante se filtro. El analisis cromatografico se llevo a cabo usando GC-MS. Los patrones de 1,4-butanodiol se prepararon en amortiguador de fosfato de amonio.
En la Fig. 3 se representa la concentracion de 1,4-butanodiol a lo largo del tiempo.

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo que comprende las etapas de
    a) proporcionar un alcano o 1-alcanol,
    b) poner en contacto dicho alcano o 1-alcanol en una disolucion acuosa con un citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 y oxfgeno durante al menos 3 horas,
    en el que el alcano o 1-alcanol se convierte en el a,o-diol correspondiente, y
    el alcano o 1-alcanol es butano, isobutano, butanol o isobutanol.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el alcano o 1-alcanol se incuba en presencia de una citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 durante al menos 16 horas.
  3. 3. El metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que, ademas de la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, esta presente una ferredoxina y una ferredoxina reductasa, en el que tanto la ferredoxina como la ferredoxina reductasa son capaces de interaccionar funcionalmente con dicha citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153.
  4. 4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 es la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153 de Alcanivorax borkumensis (codigo de acceso YP_691921) o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoacidos que es mas de 70% identica a YP_691921 y que retiene al menos algo de su actividad biologica esencial, la ferredoxina es la ferredoxina procedente de Alcanivorax borkumensis o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoacidos que es mas de 70% identica a la ferredoxina de Alcanivorax borkumensis y que retiene al menos algo de su actividad biologica esencial, y la ferredoxina reductasa es (codigo de acceso YP_691923) o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoacidos que es mas de 70% identica YP_691923 y que retiene al menos algo de su actividad biologica esencial.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el alcano se proporciona a una presion parcial de 1 a 50 bares.
  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos una de las enzimas seleccionadas del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa se proporciona en forma de un catalizador de celula completa que expresa dicha enzima o enzimas.
  7. 7. El metodo segun la reivindicacion 6, en el que todas las enzimas seleccionadas del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa se proporcionan en forma de un biocatalizador de celula completa que expresa dichas enzimas.
  8. 8. El metodo segun las reivindicaciones 6 o 7, en el que al menos una de las enzimas seleccionada del grupo que comprende la citocromo P450 alcano hidroxilasa de la familia de CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina reductasa son recombinantes y/o estan sobreexpresadas.
  9. 9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el biocatalizador de celula completa expresa un polipeptido de la familia de AlkL o una variante del mismo que comprende una secuencia de aminoacidos que es mas de 70% identica al polipeptido de la familia de AlkL y que retiene al menos algo de su actividad biologica esencial.
  10. 10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el biocatalizador de celula completa es una E. coli.
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