ES2604702T3 - Método para inhibir la replicación del VIH en células de mamíferos y humanos - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para inhibir la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) mediante la modulación negativa o alteración del citoesqueleto, específicamente de proteínas que forman parte de los filamentos intermedios del citoesqueleto, más específicamente de las proteínas vimentina y/o queratina-10. La intervención sobre la estructura de estas proteínas causa una inhibición de la replicación del virus en células humanas. La invención se relaciona además con el uso de agentes, que comprenden péptidos y/o ARN interferentes y/o compuestos lipídicos, y producen la modulación negativa o alteración del citoesqueleto celular, para prevenir o tratar la infección por el VIH. La invención proporciona medios y métodos para alterar la estructura del citoesqueleto/filamento de la célula, lo que interfiere con la infección por VIH de las células humanas y que puede incluso ser inhibida completamente. El citoesqueleto es alterado al reducir la cantidad de vimentina y/o queratina-10 (por ejemplo, por control transcripcional utilizando ARN interferentes) o mediante el uso de péptidos que alteran el citoesqueleto.

Description

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difiere en no más de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramas en sus cadenas laterales difiere en no más de uno. Se considera que los aminoácidos con grupos fenilo o fenilo sustituido en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamaño y forma. A continuación se listan cinco grupos de aminoácidos. El reemplazo de un aminoácido en un polipéptido con otro aminoácido del mismo grupo da lugar a una sustitución conservadora: Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas sustituídas con C1 C4 alifático o C1-C4 hidroxilo (de cadena lineal o mono-ramificada). Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales C1 C4 alifáticas sustituidas con ácido carboxílico (no ramificadas o un punto de ramificación). Grupo

III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales C1 C4 alifáticas sustituidas con amina o guanidina (no ramificadas o un punto de ramificación). Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales C1 C4 alifáticas sustituidas con amidas (no ramificadas o un punto de ramificación). Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.

El término "% de identidad de secuencia" se define aquí como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica a los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos de interés, después de alinear las secuencias y opcionalmente introducir brechas, si es necesario, para alcanzar el máximo procentaje de identidad de secuencia. Son bien conocidos en la técnica métodos y programas de ordenador para alineaciones. Como se usa aquí, los términos "secuencia de ácidos nucleicos" y "nucleótidos" también abarcan moléculas no naturales basadas en y/o derivadas de secuencias de ácidos nucleicos, tales como por ejemplo secuencias de ácidos nucleicos modificadas artificialmente, ácidos nucleicos peptídicos, así como secuencias de ácidos nucleicos que comprenden al menos un nucleótido modificado y/o un nucleótido no natural tal como por ejemplo inosina.

El término "interferencia de ARN" se refiere al proceso en donde un ARN de interferencia (ARNi) causa la degradación intracelular de ARNm específico y puede usarse para interferir con la traducción de un objetivo deseado de ARNm.

El término "ARN de interferencia" se refiere a un agente de ARN de cadena doble o simple (ARNi), por lo que se entiende una molécula de ácido nucleico pequeña usada para interferencia de ARN. Los agentes de ARNi cortos que tienen aproximadamente 15-30 nucleótidos de longitud se denominan "ARN de interferencia pequeña" o "ARNsi". Los agentes ARNi más largos se denominan generalmente "ARN bicatenario" o "ARNdb", otras formas de agentes ARNi son microARN (miARN) y moléculas de ARN de horquilla cortas (ARNsh). Los agentes de ARNi pueden ser moléculas de ácido nucleico no modificadas o químicamente modificadas. Los agentes de ARNi pueden ser sintetizados químicamente o expresados a partir de un vector o sintetizados enzimáticamente. El uso de un agente de ARNi modificado químicamente puede mejorar una o más propiedades de un agente de ARNi a través de una mayor resistencia a la degradación, una mayor especificidad a las unidades estructurales objetivo, una captación celular mejorada y similares. Una molécula de ADN que transcribe ARNds o ARNsi (por ejemplo, como una horquilla dúplex) también provee interferencia de ARN. Las moléculas de ADN para transcribir ARNds se divulgan en la Patente U.S. No. 6,573,099 y en las Publicaciones de Patente U.S. Nos. 20020160393 y 20030027783. Las moléculas de ADN para transcribir ARNsi se revisan en Tuschl and Borkhardt, Molecular Interventions, 2: 158 (2002).

El término "ARN antisentido" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier ARN que se une al ARNm con suficiente afinidad para disminuir la cantidad de proteína traducida desde el ARNm. La cantidad de proteína traducida desde el ARNm se reduce preferiblemente en más de un 20%; Más preferiblemente disminuida en más del 50%, 70% y 80%; Y lo más preferiblemente disminuida en más del 90%. Los materiales y métodos de ARN antisentido son bien conocidos en la técnica.

El término expresión, tal como se utiliza aquí, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARNm en sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido. La "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transciptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo.

Por el término “inhibir la expresión” se entiende el silenciamiento o la subregulación de un gen o ácido nucleico que se refiere a una disminución detectable de la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico objetivo, es decir, la secuencia dirigida por el ARNi o una disminución en la cantidad o actividad de la secuencia o proteína objetivo en comparación con el nivel normal que se detecta en ausencia del ARN de interferencia u otra secuencia de ácidos nucleicos. Una disminución detectable puede ser tan pequeña como aproximadamente 5% o 10%, o tan grande como aproximadamente 80%, 90% o 100%. Más típicamente, una disminución detectable es aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70%.

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El término "compuesto lipídico" tal como se utiliza aquí, se refiere a análogos de ácidos grasos derivados de, por ejemplo ácidos grasos monoinsaturados, ácidos grasos poliinsaturados y lípidos que comprenden entre 1 y 6 enlaces triples.

"VIH" es el retrovirus Virus de Inmunodeficiencia Humana, un virus que causa inmunodeficiencia atacando células CD4 + en el cuerpo. El término "VIH", tal como se usa aquí, incluye cualquier VIH, incluyendo todos los grupos y subtipos (clases) de VIH-1 y VIH-2, por ejemplo grupos VIH-1 M y VIH-1 O; La invención abarca cada una de las clases conocidas; Se prefiere el VIH -1.

El término "replicación" tal como se utiliza aquí, se refiere al proceso en donde una cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico se sintetiza mediante una enzima polimerasa. En el contexto particular de la presente invención, el término replicación, tal como se utiliza aquí en referencia a un virus, se refiere a la finalización de un ciclo de vida viral completo o entero, en donde las partículas virales infecciosas o viriones se unen a la superficie de la célula huésped (usualmente que enlazan a una molécula de superficie celular específica logra la especificidad de la infección). Una vez dentro de la célula, los viriones no están recubiertos y los genes víricos empiezan a expresar las proteínas necesarias para la replicación del genoma y la síntesis de nuevas proteínas para producir nuevas cápsides y núcleos que conducen al ensamblaje de partículas de virus infecciosas de progenie que, en sí mismas, son capaces de infectarse, y replicarse en nuevas células huésped. Por lo tanto, un ciclo de vida viral sólo es completo si dentro de una célula individual, la infección por una o más partículas de virus o viriones continúa hasta la producción de partículas de virus de progenie completamente infecciosas. En el caso particular de los retrovirus, un ciclo de vida viral completo involucra partículas virales infecciosas que contienen el ARN viral entrando en una célula, estando el ARN transcipto inversamente en ADN, integrándose el ADN en el cromosoma huésped como un provirus y la célula infectada produciendo proteína de virión y ensamblándolas con ARN genómico viral de longitud completa en nuevas partículas igualmente infecciosas.

El término "célula huésped" tal como se utiliza aquí, se refiere a una célula utilizada para la expresión de un genoma viral, o para la propagación de un vector o virus.

El término "células CD4 +" tal como se usa aquí, se refiere a una clasificación principal de linfocitos T, que se refiere a los que portan el antígeno CD4.

En particular, la presente invención se refiere a métodos que modulan negativamente, modifican o alterran los IF del citoesqueleto. Los IF preferidos contienen proteínas vimentina y/o queratina-10. En una realización preferida, el método comprende disminuir la cantidad de vimentina y/o queratina-10 en los IF. La disminución de vimentina y/o queratina-10 puede verse afectada de varias maneras. Una realización preferida es la disminución o la inhibición de la expresión de genes que codifican vimentina y/o queratina-10. Más preferiblemente, los niveles de expresión de vimentina y/o queratina-10 en los IF es disminuido o la estructura de la vimentina y/o la queratina-10 del citoesqueleto es alterada. La estructura de los IF del citoesqueleto puede alterarse modificando la estructura de las proteínas IF, por ejemplo, por escisión o plegamiento erróneo, preferiblemente de la estructura de vimentina y/o queratina-10.

Las evidencias referidas en la literatura técnica sugieren que el VIH requiere la escisión de vimentina durante su ciclo de vida. Sorprendentemente, en la presente invención, la replicación vírica se inhibe a través de lo que parece ser un mecanismo natural presente durante la infección viral. No es obvio intentar alterar el citoesqueleto y/o quitar la vimentina como un medio para inhibir la infección por el VIH, de hecho, se podría esperar que la infección sería mucho más rápida, ya que la alteración del citoesqueleto también ocurre durante la infección normal.

Los solicitantes identificaron las proteínas citoesqueléticas vimentina y queratina-10 mediante un análisis proteómico comparativo de células MT4 tratadas con una fracción de un extracto de leucocito humano que mostraba actividad anti-VIH. Se encontró que el extracto de leucocito que tenía actividad anti-VIH mostró una disminución y/o desestabilización de vimentina y/o queratina-10 y/o los IF. Previamente, Thomas et al., demostraron que un anticuerpo anti-vimentina era capaz de bloquear el enlazamiento de la glicoproteína gp120 de VIH-1 a la vimentina de la superficie celular, impidiendo la entrada celular del virus (Thomas EK, Connelly RJ, Pennathur S, Dubrousky L, Haffar OK, Bukrinsky MI 1996. Viral Immunol 9: 73 -87). Sorprendentemente, se detectaron niveles muy bajos de inhibición de la replicación viral bajo las condiciones experimentales probadas para la presente invención, utilizando un anticuerpo contra vimentina (destinado a disminuir la infección por VIH). Thomas et al. utilizaron un anticuerpo contra la vimentina bloqueando así la vimentina que es accesible al anticuerpo. Esto es muy diferente de la acción propuesta en la presente invención. En la presente invención, la vimentina se altera y/o disminuye de tal manera que altera los IF. Bloqueando la vimentina como se hizo en Thomas et al., los IF no se alteran. Los datos experimentales también

confirman el modo de acción de diferencia en los métodos de la presente invención. Se obtuvo un porcentaje muy alto de inhibición de la replicación viral, hasta el 100%, cuando se disminuyeron los niveles de vimentina y/o se desestabilizó la estructura de vimentina en la célula objetivo, como se observó en el Ejemplo 2, Figuras 3 y 4, mientras que en Thomas et al., se observó un máximo de 47% de inhibición. Además, no hay informes sobre el enlazamiento de la queratina-10 a la proteína gp120 viral y, precisamente, la replicación del VIH también se inhibió inhibiendo y/o desestabilizando la queratina-10, como se muestra en el Ejemplo 2, Figuras 3 y 4.

Para obtener información adicional sobre el mecanismo de inhibición de la replicación del VIH, se utilizó un sistema experimental cuya entrada celular no está mediada por la proteína viral gp120. Ese sistema comprende un vector lentiviral no replicante basado en VIH-1 que está desprovisto de gp120 y que también expresa la proteína fluorescente verde (GFP). Como se muestra en el Ejemplo 2, hubo una "infección" eficiente de células MT4 por este lentivirus y los cultivos mostraron un alto porcentaje de expresión de GFP indicativa de una penetración eficiente de la célula e integración en el genoma celular de este vector lentiviral. En este sistema de "infección" lentiviral basado en VIH-1, una disminución de vimentina genera una disminución dramática en la "infección" lentiviral, como se muestra en el Ejemplo 2. Esto demuestra que el método descrito aquí para inhibir la infección por VIH-1 no está relacionado con el enlazamiento de gp120 a vimentina como es propuesto por Thomas et al. Por lo tanto, esta invención describe un método no informado previamente para inhibir la infección por VIH.

Adicionalmente, se demostró con la ayuda de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que los IF se desestabilizan en células MT4 silenciadas para vimentina (MT4vim(s)), así como en células silenciadas para queratina10 (MT4K-10(s)), dando como resultado una "infección" inhibida del vector lentiviral basado en VIH-1 (Ejemplo 3). Las células MT4vim(s) y MT4K-10(s) se obtuvieron mediante la introducción de horquillas de ARN específicas para cada uno de los genes codificantes de la proteína.

La alteración de los IF puede conseguirse mediante un agente seleccionado de un grupo que consiste en polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos. En una realización preferida, el agente es un péptido, más preferiblemente el péptido es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, y homólogos de los mismos.

En otra realización preferida, el agente es un ARN de interferencia o un oligonucleótido antisentido dirigido a genes de vimentina y/o de queratina-10.

En otra realización preferida, el agente es un compuesto químico o un derivado lipídico. Un compuesto lipídico adecuado es dicho compuesto lipídico es la prostaglandina ciclopentano 15 desoxi-Δ-12,14-PGJ2.

A continuación se describen métodos para tratar y/o prevenir la infección de células humanas por VIH. Estos métodos involucran la alteración de los IF y en particular la alteración de la vimentina y/o la queratina-10 en la célula, con el fin de prevenir o tratar la infección por VIH en la célula.

La regulación negativa ocurre dentro de una célula huésped del VIH de un sujeto dado, para los fines de prevenir o inhibir la infección efectiva de las células huésped del sujeto. Por lo tanto, la presente invención comprende de manera similar métodos para tratar y/o prevenir la infección de un sujeto con VIH.

La inhibición de la infección con VIH mediante el uso del método descrito aquí se aplica tanto a nivel celular como para todo el organismo. El término inhibición implica la inhibición completa o parcial de la infección.

La presente invención describe la manipulación de los IF y en particular, las proteínas citoesqueléticas vimentina y/o queratina-10 para inhibir la replicación del VIH. Esta estrategia provee la ventaja de una resistencia viral mínima o inexistente sobre los fármacos antirretrovirales actualmente disponibles, ya que estas proteínas son proteínas celulares endógenas en lugar de virales. Los mecanismos de acción de los fármacos de la presente invención operan a través de rutas diferentes a las ya descritas y que muestran una alta capacidad de inhibición. Por lo tanto, su combinación con fármacos actualmente disponibles contra la infección por VIH podría potenciar la efectividad de los tratamientos anti-VIH. Además, el uso de los agentes terapéuticos de la presente invención podría combinarse con las nuevas estrategias terapéuticas ya propuestas en el estado de la técnica, como el trasplante de células madre que portan genes endógenos modificados. La modalidad terapéutica de la presente invención provee una nueva opción para aquellos pacientes que muestran resistencia múltiple a fármacos, que representan un alto porcentaje entre los pacientes tratados con la terapia actualmente disponible.

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Las composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos se administran preferiblemente en un rango de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de polinucleótidos para administración local en un protocolo de terapia génica. También se pueden usar rangos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 µg a aproximadamente 500 µg y aproximadamente 20 µg a aproximadamente 100 µg de polinucleótidos durante un protocolo de terapia génica. Factores tales como el modo de acción y la eficacia de la transformación y la expresión son consideraciones que afectarán a la dosificación requerida para la eficacia final de los polinucleótidos. Cuando se desea mayor expresión sobre una mayor área de tejido, se requerirán cantidades mayores de polinucleótidos o las mismas cantidades readministradas en un protocolo sucesivo de administraciones, o varias administraciones a diferentes partes de tejido adyacentes o próximos de, por ejemplo, una terminación nerviosa o sinapsis, para afectar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación rutinaria en ensayos clínicos determinará rangos específicos para el efecto terapéutico óptimo. Una descripción más completa de vectores de terapia génica, especialmente vectores retrovirales, está contenida en el documento WO 98/00542.

Ejemplos

Ejemplo 1. Proteómica comparada de células MT4 tratadas con un extracto de leucocitos que muestra actividad anti-VIH.

La línea celular MT4 se trató con un extracto de leucocitos que mostraba actividad anti-VIH (Fernández-Ortega C; Dubed M; Ruibal I; Vilarrubia OL; Menéndez JC; Navea L et al. 1996, Biotherapy 9: 33-40) y el resultado del perfil de expresión de proteína se comparó con un control de células no tratadas. Las células se sometieron a lisis y se centrifugaron a 12 000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se recolectó y las pellas se sometieron a un segundo procedimiento de lisis. Después de una segunda etapa de centrifugación bajo las mismas condiciones, el segundo sobrenadante fue recolectado junto con el primero, siendo deslipidado adicionalmente con alcohol etílico y alquilado con poliacrilamida. Posteriormente, se precipitó el ácido desoxirribonucleico (ADN) y se llevó a cabo una electroforesis bidimensional de la muestra utilizando un gel de poliacrilamida Tris-Tricina al 12.5% al 3% a 4ºC.

Las imágenes de los geles analíticos se analizaron utilizando el software Melanie 5. Los puntos que se identificaron se cortaron de los geles preparativos y se digirieron adicionalmente con tripsina. Los péptidos proteolíticos se extrajeron para el análisis de espectrometría de masas y los espectros de masas se obtuvieron usando un espectrómetro de masas híbrido con geometría ortogonal QTOF-2 y equipado con una fuente de ionización por nanoaspersión.

Se analizaron los espectros ESI-MS/MS y se realizaron las respectivas búsquedas para la identificación de proteínas en la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del National Center for Biotechnology Information de los Estados Unidos y en la base de datos del European Molecular Biology Laboratory de Alemania. Se detectó una disminución en las proteínas citoesqueléticas en la muestra tratada con el extracto de leucocitos anti-VIH, particularmente en los que formaban los IF (vimentina y queratina-10) (Figura 1).

Ejemplo 2. ARN de interferencia contra vimentina y queratina-10 inhiben la infección por VIH

La línea celular MT4 se transdujo utilizando los vectores lentivirales pLenti-shARNvim o pLenti-shARNK-10, que portan una secuencia que codifica una horquilla de ARN que silencia la expresión de las proteínas vimentina y queratina, respectivamente. Estos vectores lentivirales se ensamblaron mediante empacado en la línea celular 293T transducida con cuatro plásmidos. Los dichos plásmidos fueron pLP1, pLP2, pLP/VSVG y p-shARN, este último específico para vimentina o queratina-10. El vector pLP1 codifica los productos génicos de las secuencias gag/pol de VIH-1. Los códigos pLP/VSVG para la proteína de superficie del virus de la estomatitis vesicular y el p-shARN contienen el genoma del vector lentiviral que porta las secuencias que codifican las horquillas de ARN específicas de vimentina o queratina-10 (Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T et al., 2004 Nucleic Acids Research 32: 936 -948, Santa Cruz Biotechnology). Todos los plásmidos se amplificaron en la cepa de Escherichia coli XL-1 bajo selección de ampicilina. Los cuatro vectores plasmídicos fueron purificados por calidad de transfección por cromatografía en columna y puestos juntos en contacto con la línea celular de empaquetamiento 293T en presencia de polietilenimina. Las células se incubaron durante 48 h a 37ºC bajo atmósfera de CO2 al 5%, y los viriones se purificaron adicionalmente por ultracentrifugación a 20 000 x g. Una vez purificado el vector lentiviral, se transdujeron células MT4 y se seleccionaron los recombinantes para determinar la resistencia a la blasticidina. Los clones recombinantes se aislaron mediante el ensayo de dilución limitante y se cultivaron en medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino (FBS) bajo atmósfera de CO2 al 5% y humedad relativa del 95% a 37ºC hasta la recolección. Se extrajeron proteínas

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concentración viral (SEQ ID NO: 1, Figura 6A) y a m.o.i. de 0.01 (Figura 6B). El IC50 de péptidos estaba en el rango nanomolar.

Ejemplo 5. Péptidos sintéticos que inhiben la replicación del VIH en células mononucleares de sangre periférica

Se aislaron PBMCs de sangre entera de individuos sanos mediante gradientes de densidad de Ficoll de cloruro de cesio. Las células fueron preestimuladas durante 2 días en medio RPMI suplementado con FBS al 20%, Interleucina 2 (IL-2) 100 U/mL y 5 µg/mL de fitohemaglutinina (PHA). Subsecuentemente, se mantuvieron en medio libre de PHA y se sembraron a 150 000 células por pozo en placas de 96 pozos. Después de 24 h, los péptidos se añadieron a las diferentes concentraciones y los cultivos se infectaron con la cepa Bru de VIH-1 a m.o.i. de 0.01. Los cultivos se mantuvieron durante 7 días, cambiando el medio y añadiendo péptidos cada 3 días. Se cosecharon los cultivos y se recogieron los sobrenadantes para evaluar la presencia de la proteína viral p24. Los péptidos inhibieron la replicación del VIH-1 de una manera dependiente de la dosis (Figura 7). Se obtuvieron resultados IC50 similares en el rango nanomolar en cultivos infectados con la cepa BaL1 de VIH-1.

Ejemplo 6. Inhibición de VIH-2 por péptidos sintéticos

Se aislaron PBMCs de sangre entera de individuos sanos utilizando gradientes de densidad de Ficoll. Las células se preestimularon durante 2 días con medio RPMI suplementado con FBS al 20%, 100 U/ml de IL-2 y 5 µg/mL de PHA. Las células se mantuvieron subsecuentemente en medio libre de PHA y se sembraron en 150000 células por pozo en placas de 96 pozos. Después de 24 h, se añadieron péptidos a diferentes concentraciones y los cultivos se infectaron con la cepa CBL-20 VIH-2. Los cultivos se mantuvieron durante 7 días, cambiando cada 3 días el medio y se añadieron los péptidos. Se recolectaron los cultivos y se recogieron los sobrenadantes para evaluar la presencia de la proteína viral p24. Los péptidos inhibieron la replicación del VIH-2 de una manera dependiente de la dosis (Figura 8). .

Ejemplo 7. Disminución de vimentina en presencia de péptidos identificados como SEQ ID Nº 1, 4, 5, 7, 8 y 9

La línea celular MT4 se incubó a 50 µM de cada péptido durante 24 h. La proteína vimentina se detectó mediante la técnica de transferencia western. Los extractos celulares se resuspendieron en dodecilsulfato de sodio al 1% (SDS) y se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 10%, siendo además transferidas a una membrana de celulosa Hybond-P. Para fines de inmunoidentificación, se usaron anticuerpos anti-vimentina y anti-β actina (como control). Se utilizó un conjugado de peroxidasa anticuerpo IgG anti-ratón como anticuerpo secundario. La actividad de la enzima peroxidasa se visualizó usando diaminobenzidina en presencia de peróxido de hidrógeno y PBS. La proteína vimentina se redujo en células MT4 tratadas con los péptidos (Figura 9).

Ejemplo 8. Penetración celular de péptidos identificados como SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 3

Las células HeLa CD4 + se sembraron en medio RPMI suplementado con FBS al 10% y se incubaron hasta alcanzar una confluencia del 60% de la monocapa. Las células MT4 se sembraron a 50 000 células por pozo en medio RPMI en FBS al 10%. Los péptidos identificados como SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 3 se resuspendieron en agua de inyección y se evaluaron a concentraciones de 5, 10, 20 y 40 µM. Los péptidos se incubaron durante 24 h a 37ºC bajo una atmósfera de CO2 al 5%, y se evaluó la penetración después de 15, 30 y 60 min. Después de cada período de tiempo, las células se recolectaron y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Se analizaron tres repeticiones por variante experimental. Los péptidos fueron capaces de penetrar por sí mismos en las células MT4 como se muestra en la Figura 10.

Ejemplo 9. Derivado lipídico que se enlaza a la vimentina e inhibe la replicación del VIH-1

Se sabe que la prostaglandina ciclopentano 15 desoxi-Δ-12,14PGJ2 (15d-PGJ2) se enlaza a la proteína vimentina (Stamatakis K, Sánchez-Gómez FJ, Pérez-Sala D 2006, J Am Soc Nephrol 17: 89-98). En la presente invención, se demostró que 15d-PGJ2 inhibe la replicación del VIH in vitro. El ensayo de actividad antiviral se llevó a cabo en células MT4 expuestas con VIH-1 (cepa Bru). Las células se incubaron a diferentes concentraciones de 15d-PGJ2, y se expusieron adicionalmente con VIH-1 a m.o.i. de 0.01. Después de un período de incubación de 5 días, los cultivos celulares se recolectaron y se evaluó la proteína p24 en los sobrenadantes (Figura 11).

Ejemplo 10. Efecto de péptidos sintéticos y 15d-PGJ2 en PBMCs de pacientes infectados con VIH-1

Se aislaron PBMCs de sangre entera de individuos infectados con VIH-1 mediante gradientes de densidad de Ficoll. Las células fueron preestimuladas y tratadas con los péptidos, de forma similar a la descrita en el ejemplo 5, o tratadas

con 5 µM de 15d-PGJ2. La replicación se evaluó determinando la concentración de antígeno p24 en sobrenadantes de cultivo mediante el método ELISA. Los valores de p24 disminuyeron significativamente en PBMCs tratados con los péptidos o con el derivado lipídico, en comparación con células no tratadas (Tabla 1). Esto fue indicativo de la inhibición de la replicación del VIH-1 causada por el tratamiento con estos compuestos.

Tabla 1. Porcentaje de inhibición de VIH-1 en PBMCs de individuos infectados, que se trataron ex vivo con los péptidos

o 15d-PGJ2.

Compuesto

% de inhibición de VIH-1

Péptido 1 (SEQ ID No. 1)

89.3

Péptido 2 (SEQ ID No. 2)

81.1

Péptido 3 (SEQ ID No. 3)

85.3

Péptido 4 (SEQ ID No. 4)

84.9

Péptido 5 (SEQ ID No. 5)

82.1

Péptido 6 (SEQ ID No. 6)

80.5

Péptido 7 (SEQ ID No. 7)

83.7

Péptido 8 (SEQ ID No. 8)

86.7

Péptido 9 (SEQ ID No. 9)

81.3

Péptido 10 (SEQ ID No. 10)

83.4

15d-PGJ2

80.1

La estructura de los IF se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión, siguiendo la metodología descrita en el Ejemplo 3. Se demostró que los IF eran muy cortos en los PBMCs de individuos infectados que se trataron con 10 los péptidos o con el derivado lipídico, en comparación con las células no tratadas.

Ejemplo 11. ARN de interferencia contra vimentina y queratina-10 inhibe VIH en PBMCs de individuos infectados

Se aislaron PBMCs de sangre entera de individuos infectados con VIH-1 mediante gradiente de densidad de Ficoll. Las células se prestimularon durante 2 días en medio RPMI en FBS al 20%, 100 U/mL de IL-2 y 5 µg/mL de PHA. Subsecuentemente, se mantuvieron en medio libre de PHA y se transdujeron adicionalmente con los vectores 15 lentivirales pLenti-shARNvim o pLenti-shARNK-10, que portan una secuencia que codifica una horquilla de ARN para silenciar las proteínas vimentina y queratina-10, respectivamente. Se obtuvieron los vectores como se describe en el Ejemplo 2. La replicación se evaluó determinando las concentraciones del antígeno p24 sobre sobrenadantes de cultivo mediante el método ELISA. Las PBMC silenciadas para las proteínas vimentina o queratina-10 mostraron una alta inhibición de la replicación vírica en comparación con los cultivos no silenciados para cada una de estas proteínas

20 (Tabla 2).

TABLA 2 Porcentaje de inhibición de VIH-1 en PBMCs de individuos infectados, que se transdujeron con ARNsh específico para vimentina o queratina-10

PBMCs de individuos infectados

% de inhibición de VIH-1

PBMCs transducido con pLenti-shARNvim

89.5

PBMCs transducido con pLenti-shARNK-10

75.6

Las estructuras de IF se analizaron por microscopía electrónica de transmisión, siguiendo la metodología descrita en 25 el Ejemplo 3. Se demostró que la estructura de los IF era más corta en aquellas PBMCs de individuos infectados que se transdujeron con los vectores lentivirales, en comparación con células no transducidas.

Ejemplo 12 Tratamiento de pacientes infectados con VIH-1 con formulaciones que contienen los péptidos identificados como SEQ ID No. 1 y 2

Claims (1)

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