ES2605011B2 - Cepa bacteriana de streptomyces carnosus productora de loboforinas y loboforina producida por la misma. - Google Patents
Cepa bacteriana de streptomyces carnosus productora de loboforinas y loboforina producida por la misma. Download PDFInfo
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Abstract
Cepa bacteriana de Streptomyces carnosus productora de loboforinas y loboforina producida por la misma.#La invención proporciona una nueva cepa bacteriana de Streptomyces carnosus que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el número de acceso 9162, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentación compuestos antibióticos de la familia de las loboforinas. Concretamente, esta cepa es productora de una nueva loboforina, designada en la presente invención como loboforina K, que presenta actividad citotóxica frente a células tumorales, preferiblemente humanas, y actividad antibiótica o antibacteriana frente a bacterias patógenas Gram-positivas, preferiblemente humanas.
Description
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DESCRIPCION
Cepa bacteriana de Streptomyces carnosus productora de loboforinas y loboforina producida por la misma.
La presente invencion se encuadra dentro del campo farmaceutico, y especfficamente se refiere a nuevos productos naturales con aplicacion en oncologia y en el tratamiento de infecciones bacterianas, que se obtienen por fermentacion de una cepa bacteriana productora de compuestos antitumorales y/o antibioticos de la familia de las loboforinas. La invencion tambien se refiere a una nueva loboforina, la loboforina K, a su procedimiento de obtencion y a composiciones farmaceuticas que la comprenden, las cuales son utiles para el tratamiento y/o prevencion de tumores, preferiblemente de pancreas y mama en humanos y de infecciones bacterianas provocadas por bacterias patogenas Gram-positivas como Staphylococcus aureus.
Estado de la tecnica
Las loboforinas son productos naturales de origen marino con interes farmacologico debido a sus diversas actividades biologicas. Estructuralmente, son miembros de la familia de espirotetronato, descrita por primera vez como compuestos antiinflam atorios, como las loboforinas A y B (Jiang et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2003-2006). Otras loboforinas han sido estudiadas por sus actividades antibioticas tales como las loboforinas E y F (Niu et al., 2011, J. Antibiot 64:711-6), la loboforina G (Chen et al., 2013 Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:3885-92) y loboforinas H e I (Pan et al., 2013 Mar. Drugs 11:3891-901; Lin et al., 2014, J. Antibiot 67:121-6). Desafortunadamente, debido a una superposicion en las fechas de publicacion, los dos ultimos artlculos anaden confusion a la nomenclatura de la familia de las loboforinas, dado que los nombres de loboforina H e I fueron asignados a nuevos compuestos aislados independientemente por dos grupos de investigacion cuyas estructuras no son coincidentes. El compuesto llamado como loboforina I en el artlculo de Lin et al. corresponde a loboforina H en el artlculo de Pan et al., y el compuesto cuyo nombre fue asignado como loboforina H en el de Lin et al. serla un nuevo producto natural cuyo nombre deberla tal vez ser reasignado como loboforina I* con el fin de no anadir mas confusion y teniendo en cuenta la fecha de la publicacion de dichos artlculos. Muy recientemente, tres miembros adicionales de la familia de las loboforinas, las loboforinas CR1, CR2 y CR3, fueron aislados de cultivos de Streptomyces sp. 7790_N4 (Cruz et al., 2015, ACS Med. Chem. Lett. 6:877-81). Ademas, algunas loboforinas muestran actividades citotoxicas frente a diferentes lfneas celulares tumorales, como las loboforinas C y D frente a lfneas de celulas tumorales de hfgado y de mama (Wei et al., 2011, Mar. Drugs 9:359-68); loboforina F contra SNC, lfneas de celulas tumorales de mama y pulmon (Niu et al., 2011, J. Antibiot. 64:711-6) y loboforinas CR1 y CR2 contra lfneas celulares de cancer oral (Cruz et al., 2015, ACS Med. Chem. Lett. 6:877-81).
Los ambientes marinos estan emergiendo como una fuente de nuevos productos naturales de importancia farmacologica. Los arrecifes coralinos se han revelado como una fuente que merece ser investigada para descubrimiento de productos naturales estructuralmente unicos con relevancia biomedica (Seifried et al., 2015, Microbiologyopen 4: 475-90). Los corales de aguas profundas, conocidos en todos los oceanos del planeta, son ecosistemas delicados, muy vulnerables a las actividades humanas (Margan, 2005, Current: Journal of Marine Education 21: 1-4; Brana et al., 2015, Microb. Ecol. 69: 512524;). Existen pocos informes acerca de actinobacterias asociadas a corales de aguas
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profundas, y todos ellos se refieren al noreste Atlantico (Galkiewicz et al., 2011, FEMS Microbiol. Ecol. 77: 333-46; Neulinger et al., 2008, Appl. Enviran. Microbiol. 74: 7272-85).
Trabajos previos en el mar Cantabrico (Bahia de Vizcaya), Atlantico Noreste, han revelado que actinobacterias con actividad biologica, principalmente especies de Streptomyces, estan asociadas a corales y otros invertebrados que viven hasta 4.700 m de profundidad en el canon submarino de Aviles (Brana et al., 2015, Microb. Ecol. 69: 512-524; Sarmiento-Vizcafno et al., 2015, lnt J. Syst. Evol. Microbiol. 65: 1328-1334).
En resumen, existe una necesidad creciente de nuevos agentes antitumorales, con actividades mejoradas, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparacion con los farmacos actualmente en uso. En la lucha contra el cancer se hace necesaria la obtencion de nuevos antitumorales con propiedades farmacologicas mejoradas. Ademas, debido a la creciente aparicion en el ambito clfnico de bacterias patogenas resistentes a los antibioticos de uso actual, se hace necesaria la obtencion de nuevos antibioticos con potencial biomedico en el tratamiento o prevencion de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patogenas. Asimismo, es necesario disponer de procedimientos simples, cortos y economicos para la obtencion de dichos compuestos con actividad antitumoral y/o antibacteriana.
Descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona una nueva cepa bacteriana de Streptomyces carnosus que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo bajo el numero de acceso 9162, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentacion compuestos citotoxicos de la familia de las loboforinas. Concretamente, esta cepa es productora de una nueva loboforina, designada en la presente invencion como loboforina K, que presenta actividades citotoxicas frente a diferentes lfneas celulares tumorales, preferiblemente humanas.
Los inventores de la presente invencion han aislado dicha cepa, Streptomyces carnosus M-207, de los ecosistemas de arrecifes de coral desde el canon submarino de Aviles. Dicha cepa fue aislada asociada al coral de agua frfa Lophelia pertussa recolectado a 1.800 m de profundidad durante una expedicion Oceanografica al canon submarino de Aviles y fue estudiada e identificada posteriormente. Se describe por tanto en la presente invencion dicha cepa, un procedimiento para obtener loboforinas por fermentacion a partir de la misma y un nuevo producto natural de la familia de las loboforinas con actividad citotoxica frente a lfneas tumorales humanas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, lfneas de carcinoma pancreatico y adenocarcinoma de mama. La loboforina K presenta ademas actividad antibacteriana in vivo frente a bacterias patogenas clfnicas Gram- positivas, como por ejemplo aunque sin limitarnos, Staphylococcus aureus.
Los inventores determinaron las condiciones de cultivo de la cepa para la produccion de la nueva loboforina, posteriormente purificaron la misma, procedieron a su elucidacion estructural y ensayaron su actividad citotoxica frente a diversas lfneas tumorales humanas y antibiotica frente a una variedad de patogenos clfnicos tanto Gram-negativos como Gram-positivos.
La presente invencion representa asf una solucion a la necesidad de disponer de nuevos compuestos antitumorales con potencial biomedico en el tratamiento o prevencion de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patogenas Gram positivas.
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Asimismo, representa una solucion a la necesidad de disponer de procedimientos simples, cortos y economicos para la obtencion de dicho compuesto con actividad antitumoral y antibiotica, ya que el procedimiento descrito en la presente invencion permite producir el citado compuesto por fermentacion con una actinobacteria, en lugar de por sfntesis quimica, proceso mas complejo, largo y costoso. En este sentido, en procesos biotecnologicos que implican la obtencion de productos naturales estructuralmente complejos, como es el caso de las loboforinas, la produccion por fermentacion mediante el microorganismo productor es el procedimiento preferido, ya que es mas sencillo, mas corto y mas economico que el procedimiento de sfntesis organica.
Asl, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una cepa bacteriana de Streptomyces carnosus M-207 depositada el 16 de junio de 2016 en la Coleccion Espanola de Cultivo Tipo bajo el numero de acceso 9162. De ahora en adelante se hara referencia a esta cepa bacteriana como "cepa de la invencion” o "cepa bacteriana de la invencion”.
Otro aspecto de la invencion se refiere a un sobrenadante o extracto de un cultivo de la cepa bacteriana de la invencion. A este sobrenadante se hara referencia como “sobrenadante de la invencion”, y comprende al menos un compuesto de formula general (I) descrito mas adelante.
El sobrenadante de la invencion que comprende al menos un compuesto de formula (I) puede obtenerse mediante el cultivo de la cepa de la invencion en presencia de un medio de cultivo adecuado y en condiciones de fermentacion. Dichas condiciones de fermentacion y dicho medio de cultivo son, preferiblemente, los que se describen mas adelante en el procedimiento de la invencion. Posteriormente, se puede proceder a la centrifugacion de dicho cultivo bacteriano, mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la materia para tal fin, y a la eliminacion de los sedimentos depositados como consecuencia de este paso de centrifugacion, obteniendose asl el sobrenadante de la invencion que comprende al menos un compuesto de formula (I) y otros metabolitos producidos y secretados por la cepa de la invencion en cultivo.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la cepa bacteriana de la invencion para la produccion de compuestos de formula general (I):
o cualquiera de sus sales o tautomeros,
donde R se selecciona entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo 5 sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido o acilo sustituido o no sustituido;
Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la obtencion de un compuesto de formula general (I) descrito anteriormente, de ah ora en adelante 10 “procedimiento de la invencion ", que comprende:
a. cultivar la cepa bacteriana de la invencion en un medio de cultivo en condiciones de fermentacion, y
15 b. purificar el compuesto de formula general (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a).
El cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invencion se puede llevar a cabo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, inoculando la cepa o esporas de la cepa en un medio de 20 cultivo apropiado. Los expertos en la materia reconoceran los medios de cultivo bacterianos que pueden ser empleados en esta etapa del procedimiento de la invencion.
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El “medio de cultivo” es un medio nutritivo adecuado, es decir, que comprende los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento in vitro de la cepa de la invencion, para el desarrollo de su actividad fermentadora y, por tanto, para la produccion de los compuestos de formula (I) descritos anteriormente. Dicho medio de cultivo puede ser llquido, solido o semisolido. Para que la cepa de la invencion crezca adecuadamente en el medio de cultivo, este debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, agitacion, grado de humedad, luz/oscuridad y presion de oxigeno adecuadas, asl como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Asl, el cultivo de la etapa (a) tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende, por ejemplo aunque sin limitarnos, agar o gelatina o albumina, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o manitol), fuentes de nitrogeno (por ejemplo, peptonas), azufre, fosforo, fuentes de vitaminas, aminoacidos y hormonas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, extracto de carne o extracto de levadura), MOPS, sales inorganicas (por ejemplo, calcio en forma de CaCl2, magnesio, manganeso, sodio o potasio), iones de hidrogeno, etc. En una realizacion preferida, el medio de cultivo empleado en el procedimiento de la invencion es un medio de cultivo que comprende nutrientes y propiedades ffsico-qufmicas similares a las del medio marino. mas preferiblemente el medio es R5A marino.
La cepa de la invencion se puede cultivar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cultivo en matraz con agitacion, y fermentacion a pequena o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentacion discontinua o feed- batch, o en estado solido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar los compuestos de formula (I) descritos anteriormente. Los compuestos de la invencion se secretan, junto con otros metabolitos o compuestos, en el medio nutritivo. y estos se pueden recuperar directamente del medio.
El experto en la materia reconocera las condiciones de fermentacion adecuadas para ser aplicadas en el paso (a) del procedimiento de la invencion. Preferiblemente, dichas condiciones comprenden la incubacion en agitacion, mas preferiblemente en agitador orbital, del cultivo de la invencion durante entre 2 y 7 dlas, preferiblemente entre 3 y 5 dlas, mas preferiblemente durante 4 dfas; a una temperatura esencialmente constante de entre 25 y 30°C, preferiblemente entre 27 y 29°C, mas preferiblemente a 28°C; a entre 200 y 300 rpm, preferiblemente entre 250 y 270 rpm, mas preferiblemente a 250 rpm y a un pH constante de entre 6.0 y 7.5, preferiblemente de entre 6.0 y 7.0, mas preferiblemente a 6.7.
Tras el cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invencion, puede tener lugar un paso adicional de centrifugacion tras el cual se descartan los sedimentos y se seleccionan los sobrenadantes, obteniendo asl el sobrenadante de la invencion. Dichos sobrenadantes pueden ser posteriormente filtrados en el paso (b) del procedimiento de la invencion y se pueden someter a continuacion a un procedimiento de extraccion, como por ejemplo aunque sin limitarnos, a extraccion en fase solida, con el fin de eluir el compuesto de la invencion presente en los mismos.
El compuesto de la invencion secretado al medio de cultivo por la cepa de la invencion puede recuperarse del medio empleando procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitacion,
centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion y/o precipitacion.
El compuesto de la invencion producido por la cepa en cultivo puede purificarse mediante 5 una diversidad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin limitacion, cromatografla (por ejemplo, HPLC, intercambio ionico, afinidad, hidrofobica, cromatoenfoque, y exclusion molecular), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion con sulfato amonico), SDS-PAGE, precipitacion o extraccion, con el fin de obtener el 10 compuesto de la invencion sustancialmente puros.
El compuesto de la invencion producido por la cepa en cultivo puede detectarse usando procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos de deteccion pueden incluir, por ejemplo aunque sin limitarnos, UPLC, Uv, RMN, espectrometrla de masas, o 15 similares.
Otro aspecto de la invencion se refiere a un compuesto de formula general (I) o a cualquiera de sus sales o tautomeros (a partir de ahora "compuesto de formula (I) de la invencion”)
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donde R se selecciona entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido o acilo sustituido o no sustituido.
En los compuestos de la presente invencion, R se selecciona preferentemente entre hidrogeno, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquilacilo C1-C6 sustituido o no sustituido, bencilo sustituido o no sustituido y benzoilo sustituido o no sustituido.
Mas preferentemente el grupo R se elige de entre hidrogeno, metilo sustituido o no sustituido, etilo sustituido o no sustituido, n-propilo sustituido o no sustituido, iso-propilo sustituido o no sustituido, n-butilo sustituido o no sustituido, terc-butilo sustituido o no sustituido, vinilo sustituido o no sustituido, alilo sustituido o no sustituido, etinilo sustituido o no sustituido, acetilo sustituido o no sustituido, bencilo sustituido o no sustituido o benzoilo sustituido o no sustituido.
Incluso mas preferentemente, el grupo R se selecciona de entre hidrogeno, acetilo, bencilo y benzoilo
Incluso todavla mas preferido es el compuesto en el que R es hidrogeno.
Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion, de ahora en adelante "composicion de la invencion”, que comprende la cepa de la invencion, el sobrenadante de la invencion o el compuesto de formula (I) de la invencion. Dicha composicion puede ser una composicion farmaceutica o cosmetica, que comprende la cepa de la invencion, el sobrenadante de la invencion o el compuesto de formula (I) de la invencion, y un excipiente o vehlculo farmaceutica o cosmeticamente aceptable. Preferiblemente, la composicion de la invencion comprende la cepa de la invencion, el sobrenadante de la invencion o el compuesto de formula (I) de la invencion en una cantidad terapeuticamente efectiva.
Se entiende por "cantidad terapeuticamente efectiva” la cantidad de cepa de la invencion, sobrenadante de la invencion o compuesto de la invencion, que cuando se administra al sujeto para tratar un proceso tumoral o para tratar y/o prevenir una infeccion bacteriana produce el efecto deseado. Dicho efecto deseado puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, eliminar o reducir el numero de celulas tumorales o el numero de bacterias causantes de la infeccion. La cantidad terapeuticamente efectiva puede variar dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo pero sin limitarnos, del tipo de tumor o infeccion y su severidad, as I como de la edad, peso, sexo, condicion ffsica, capacidad de respuesta o tolerancia, etc. del individuo al que le va a ser administrada la composicion de la invencion.
Los excipientes y vehlculos farmaceutica o cosmeticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composicion de la invencion son los conocidos por los expertos en la materia.
El termino "excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion de los elementos de la composicion de la invencion, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparacion de la composicion en el sentido de darle consistencia. Asl pues, los excipientes podrfan tener la funcion de mantener los ingredientes unidos, como por
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ejemplo es el caso de almidones, azucares o celulosas, la funcion de endulzar, la funcion de colorante. la funcion de proteccion de la composicion, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentacion, como por ejemplo es el caso del fosfato de calcio dibasico, la funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo.
El “vehlculo farmacologicamente aceptable”, al igual que el excipiente, es una sustancia o combinacion de sustancias que se emplea en la composicion para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El termino “vehlculo” se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar la composicion de la invencion; obviamente, dicho vehlculo debe ser compatible con dicha composicion. Los vehlculos farmaceuticamente aceptables pueden ser, aunque sin limitarnos, solidos, llquidos, disolventes o tensioactivos. Ejemplos de vehlculos son, aunque sin limitarnos, agua, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrollfero, animal, vegetal o sintetico, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo, aceites de ricino, polisorbatos, esteres de sorbitano, eter sulfatos, sulfatos, betalnas, glucosidos, maltosidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxameros, polioxietilenos, polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares. El vehlculo farmacologicamente aceptable es una sustancia inerte o de accion analoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composicion de la presente invencion. La funcion del vehlculo es facilitar la incorporation de otros elementos, permitir una mejor dosificacion y administration o dar consistencia y forma a la composicion. Cuando la forma de presentacion es llquida, el vehlculo farmacologicamente aceptable es el diluyente.
La composicion de la presente invencion puede formularse para su administracion a un animal, preferiblemente a un mamlfero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la tecnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composicion solida (comprimidos, plldoras, capsulas, polvos, granulas, barras, lapices, vaporizadores. aerosoles. etc.), semisolida (unguento. crema, pomada, gel, hidrogel, espuma, locion, jabon, jalea, gelatina, etc.) o liquida (soluciones acuosas o no acuosas, soluciones hidroalcoholicas o hidroglicolicas, suspensiones, emulsiones, jarabes, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, balsamos, linimentos. sueros, etc.) para administracion oral, topica o parenteral. La composicion de la presente invencion tambien puede estar en forma de formulaciones de liberation sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberacion. El termino “liberacion sostenida” se utiliza en sentido convencional refiriendose a un sistema de vehiculizacion de un compuesto que proporciona la liberacion gradual de dicho compuesto durante un perlodo de tiempo y preferiblemente, aunque no necesariamente, con niveles de liberacion del compuesto relativamente constantes a lo largo de un perlodo de tiempo. Ejemplos ilustrativos de vehlculos o sistemas de liberacion sostenida incluyen, aunque no se limitan a, liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicapsulas, microcapsulas, nanocapsulas, esponjas, ciclodextrinas, veslculas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfollpidotensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartlculas, milipartlculas, micropartlculas, nanopartlculas, nanopartlculas solidas lipid icas, soportes lipldicos nanoestructurados, materiales polimericos, parches o implantes biodegradables o no biodegradables, o micropartlculas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables.
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Tales composiciones y/o sus fonmulaciones pueden administrate en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradermica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardlaca, intramuscular, intranasal, intracraneal. cutanea o subcutanea, intraorbital, intracapsular, topica, oftalmologica u ocular, mediante parches transdermicos o via rectal o vaginal, mediante la administracion de un supositorio o encapsulado, percutanea, espray nasal, implante quirurgico, pintura quirurgica interna, bomba de infusion o via cateter.
Las composiciones de la presente invencion son aptas para su aplicacion mediante dispositivos medicos que permitan la liberacion del principio activo en concentraciones adecuadas para el tratamiento de procesos tumorales o infecciones bacterianas. Estos dispositivos deben ser, preferiblemente, adecuados para la administracion del principio activo de forma local, permitiendo que el tratamiento actue en la zona afectada y no se disperse. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar el principio activo en su interior o ir recubiertos con el mismo.
El uso de la cepa de la invencion, del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invencion o de la composicion de la invencion puede ser usado tanto en el tratamiento del cancer como en la prevencion y/o tratamiento de infecciones bacterianas, preferiblemente de enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias patogenas resistentes o multi-resistentes, y en la inhibicion de la formacion de biopellculas bacterianas sobre cualquier superficie.
Por ello, otro aspecto de la invencion se refiere al uso del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invencion o de la composicion, preferiblemente farmaceutica, de la invencion, para la elaboracion de un medicamento. Alternativamente, este aspecto de la invencion se refiere al sobrenadante de la invencion, el compuesto de formula (I) de la invencion o la composicion de la invencion para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invencion o de la composicion de la invencion para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento del cancer. Alternativamente, este aspecto de la invencion se refiere al sobrenadante de la invencion, el compuesto de formula (I) de la invencion o la composicion de la invencion para su uso en el tratamiento y/o prevencion de infecciones bacterianas.
El compuesto de formula (I) de la invencion es inhibidor del crecimiento de tumores y es por tanto util en el tratamiento del cancer.
De esta forma, estan incluidas en la presente descripcion las composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Esta tambien incluido en la presente descripcion el uso de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo en la manufacturacion de un medicamento.
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Esta tambien incluido en la presente descripcion el uso de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo para inhibir el crecimiento de un tumor.
Tal como es usado aqul, “inhibir” significa disminuir, hacer mas lento o detener. Por tanto, un compuesto de esta invencion puede disminuir, hacer mas lento o detener el crecimiento de una celula tumoral. Tal como es usado aquf, “crecimiento” significa aumento en tamano, o proliferacion o ambos. Por tanto, un compuesto de esta invencion puede inhibir el aumento de tamano de una celula tumoral y/o puede impedir que la celula tumoral se divida y aumente el numero de celulas tumorales. Una “celula tumoral” es una celula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo), el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno). Una celula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sangulneos/linfaticos y formar metastasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una celula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sangulneos/linfaticos, y tampoco puede formar metastasis en tejidos alejados del tumor original.
Esta tambien incluido en la presente descripcion el uso de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo para tratar el cancer.
Esta tambien incluido en la presente descripcion el uso de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo en la manufacturacion de un medicamento con actividad antitumoral.
Esta tambien incluido en la presente descripcion el uso de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo en la manufacturacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
Esta tambien incluido en la presente descripcion un metodo de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cancer, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de formula I o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable.
En otra realizacion preferida, el medicamento al que se refiere la presente invencion es para el tratamiento del cancer mediante la inhibicion del crecimiento de las celulas que constituyen el tumor, con lo que previene la invasion de tejidos normales y vasos sangulneos/linfaticos por parte de las celulas tumorales y, por tanto, previene metastasis. Ejemplos de canceres que pueden ser tratados incluyen pancreas y mama, pero no estan limitados a ovario, prostata, testlculo, melanoma, rinon, sistema nervioso central y leucemia (etc.). La expresion “composicion farmaceutica aceptable” consiste en un material adecuado biologicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biologicos sustancialmente daninos.
En otra realizacion preferida, el medicamento al que se refiere la presente invencion es como agente antibacteriano para el tratamiento y prevencion de infecciones bacterianas.
Se entiende por “agente antibacteriano” una sustancia qulmica, producida de forma sintetica o natural (sintetizada por ejemplo por hongos o bacterias), que inhibe el crecimiento (bacteriostatico) o mata (bactericida) a las bacterias. El agente antibacteriano
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puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, un antibiotico, un inhibidor de la bomba de eflujo o un agente permeabilizante de la membrana bacteriana.
Las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invencion son provocadas por una bacteria Gram positiva. En una realizacion mas preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invencion son provocadas por una bacteria de la especie Staphylococcus aureus.
En una realizacion preferida, el medicamento al que se refiere la presente invencion es para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades infecciosas bacterianas o enfermedades provocadas por infecciones bacterianas. Mas preferiblemente, dichas enfermedades se seleccionan de la lista que consiste en: infecciones cutaneas (tales como impetigo, foliculitis, celulitis, abscesos, infeccion de heridas), osteomielitis, mastitis, faringoamigdalitis, conjuntivitis, epiglotitis, otitis, meningitis, meningococemia, bacteriemia, sepsis, endocarditis, infecciones del tracto respiratorio (tales como neumonfa o sinusitis), infecciones intraabdominales (colecistitis, peritonitis, abscesos viscerales), asl como infecciones nosocomiales.
El termino “medicamento”, tal y como se usa en esta invencion, hace referencia a cualquier sustancia usada para el tratamiento de tumores y la prevencion, alivio, tratamiento o curacion de infecciones en el hombre, o cualquier otro animal, y plantas. En el contexto de la presente invencion, este termino se refiere a una preparacion que comprenda el sobrenadante de la invencion, el compuesto de formula (I) de la invencion o la composicion de la invencion.
El medicamento al que se refiere la presente invencion puede ser de uso humano o veterinario. El “medicamento de uso humano” es toda sustancia o combinacion de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevencion de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiologicas ejerciendo una accion farmacologica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnostico medico. El “medicamento de uso veterinario” es toda sustancia o combinacion de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiologicas ejerciendo una accion farmacologica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnostico veterinario, incluyendo, pero sin limitarse, a las premezclas medicamentosas. Se entiende por “premezcla medicamentosa”, o “premezcla para alimentos medicamentosos”, todo medicamento veterinario preparado de antemano con vistas a la fabricacion ulterior de alimentos medicamentosos. Se entiende por “alimento medicamentoso” toda mezcla de medicamento(s) veterinario(s) y de alimento(s) preparada previamente a su comercializacion y destinada a ser administrada a los animales sin transformacion, en razon de las propiedades curativas o preventivas o de otras propiedades del medicamento.
El medicamento de la invencion puede utilizarse tanto solo como en combinacion con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento de procesos tumorales. Asl, los medicamentos de la presente invencion pueden ser empleados junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composicion o bien pueden ser proporcionados mediante una composicion distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
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La composicion de la presente invencion, preferiblemente farmaceutica o cosmetica, puede incluir alternativa o adicionalmente otro antibiotico, antibacteriano y/o antifungico, fungicida o fungistatico.
EL termino “tratamiento”, tal como se entiende en la presente invencion, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la infeccion, enfermedad o condicion patologica de interes en un sujeto (preferiblemente mamffero, y mas preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la infeccion, enfermedad o condicion patologica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la infeccion, enfermedad o la condicion patologica, es decir, causar la regresion de la infeccion, enfermedad o la condicion patologica o su sintomatologla;
(iii) estabilizar la infeccion, enfermedad o la condicion patologica.
El termino “prevencion”, tal como se entiende en la presente invencion, consiste en evitar la aparicion de la infeccion o enfermedad infecciosa o biopellcula bacteriana, es decir, evitar la aparicion de una biopellcula en una superficie o evitar que se produzca la infeccion o la enfermedad infecciosa en un sujeto (preferiblemente mamffero, y mas preferiblemente un humano), en particular cuando dicho sujeto tiene predisposicion para sufrir una infeccion pero aun no se ha diagnosticado que la tenga, como es el caso, por ejemplo, de neonatos, ancianos o pacientes inmunodeprimidos o sometidos recientemente a intervencion quirurgica.
El termino “infeccion” es el termino cllnico empleado para describir la colonizacion de un organismo huesped por microorganism os de otras especies. En cllnica, el organismo colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y supervivencia del huesped. Como se usa aqul, el termino “enfermedades infecciosas bacterianas” o “enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias” se refiere a enfermedades precedidas por una infeccion bacteriana, incluyendo infecciones sistemicas (bacteriemia y sepsis) e infecciones en cualquier organo o tejido del organismo huesped. Los organos o tejidos incluyen, pero sin limitacion, musculo esqueletico, piel, tejidos blandos o mucosas, torrente sangulneo, rinones o cualquier otro tejido del tracto urinario, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, organos sexuales, oldo, ojo, corazon, pulmones o hueso. Estas infecciones pueden estar causadas por bacterias Gram positivas y/o Gram negativas.
En la presente invencion, dichas infecciones ocurren en un sujeto que puede ser, pero sin limitarnos, un animal, en particular un mamffero y mas particularmente un humano, o un animal domestico, por ejemplo cerdo, raton, rata, gato, jerbo, conejo, perro, mono, chimpance, etc., o un ave.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la cepa de la invencion, del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invencion o de la composicion de la invencion para la eliminacion y/o prevencion y/o inhibicion de la formacion de biopeliculas bacterianas, preferiblemente sobre superficies inertes, es decir ex vivo.
En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion, las biopeliculas bacterianas son provocadas por una o mas bacterias del genero Staphylococcus. En una realizacion
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mas preferida, las biopellculas bacterianas son provocadas por bacterias de la especie Staphylococcus aureus.
Se entiende por “biopellculas” o “biofilms” las comunidades de microorganism os que crecen embebidos en una matriz de exopolisacaridos y adheridos a una superficie inerte o a un tejido in vivo o ex vivo (en cultivo). Es una comunidad de bacterias (de una unica especie o varias) que se adhiere a una superficie solida. Las biopellculas son una causa comun de infecciones bacterianas, tanto en humanos como en otros animales y plantas. Ejemplos de biopellculas son aquellas que se forman en la cavidad oral, tales como las caries (placa dental) o enfermedad periodontal.
Los mecanismos por los que el biofilm produce los slntomas de la enfermedad todavla no estan completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir exotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sangulneo, se vuelven resistentes a la accion fagocitarla de las celulas del sistema inmune y, por otro lado, constituyen un nicho para la aparicion de bacterias resistentes a los tratamientos antibioticos. Este ultimo aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrlan extenderse de paciente a paciente a traves de las manos del personal sanitario.
Por otro lado, la contaminacion biologica de superficies por formacion de biofilms es comun, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies hidrofobas, hidrofilas, bioticas o abioticas, y conduce a la degradacion del material, productos de contaminacion, bloqueo mecanico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuaticos. Los biofilms son tambien la primera causa de contaminacion biologica en alimentos, cateteres, drenajes o implantes, as! como en los sistemas de distribucion de agua potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biofilms en los sistemas antiincendios.
El termino “Gram positiva” se refiere a las bacterias que se tinen de azul oscuro o violeta en el protocolo de tincion Gram e incluyen, pero sin limitarse, Staphylococcus (incluyendo Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophytics). Streptococcus (incluyendo Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. avium, S. bovis, S. lactis, S. sanguis y Streptococcus del grupo C, Streptococcus del grupo G y Streptococcus viridans), Enterococcus (incluyendo Enterococcus faecalis y E. faecium), Clostridium, Corynebacterium, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Chlamydia spp. (incluyendo C. pneumoniae), Micrococcus y Mycobacterium tuberculosis. Las cepas habituales de S. aureus son resistentes a la penicilina. La aparicion de cepas de esta especie resistentes a la meticilina y vancomicina representa un serio problema sanitario.
A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
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Descripcion de la figura
FIG. 1. Arbol filogenetico obtenido por el metodo “neighbour-joining” obtenido por analisis matriciales de distancias de las secuencias del gen 16S rRNA mostrando la posicion de Streptomyces carnosus M-207 y sus parientes filogeneticos mas proximos.
Los numeros de los nodos son valores bootstrap (1000 muestreos; solo se presentan valores >50%). La barra indica un 0.5% de divergencia de secuencias.
Ejemplos
A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores. que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa de la invencion en la produccion de un nuevo compuesto de la familia de las loboforinas (designado en la presente invencion como loboforina K), con actividad antitumoral asl como actividad antimicrobiana frente a bacterias patogenas Gram positivas.
Ejemplo 1. Seccion experimental
Procedimientos experimentales generales
Los analisis y separaciones mediante HPLC semipreparativo se llevaron a cabo utilizando un sistema cromatografico de Alliance con una columna SunFire C18 (10 pm, 10 x 250 mm, Waters). Para los analisis de UPLC se uso un UPLC Acquity equipado con una columna BEH C18 (1,7 pm, 2.1 x 100 mm, Waters). La rotacion optica fue determinada con un polarlmetro JASCO P-2000. Los espectros de IR fueron medidos con un espectrometro JASCO FT/IR-4100 equipado con un accesorio ATR de PIKE MIRacle™ (reflexion simple). Los espectros de RMN se registraron en un espectrometro Bruker Avance III (500 y 125 MHz para 1H y 13C RMN, respectivamente) equipado con una sonda TCI MicroCryoProbe™ de 1,7 mm, usando la senal del solvente residual como referencia interna (5H 7,27 y 5C 77,0 ppm para CDCl3). Los espectros de HRESIMS fueron adquiridos usando un espectrometro de masas Bruker maXis QTOF.
Microorganismos y condiciones de fermentacion
La cepa M-207 (CECT 9162) fue aislada de una muestra de coral de profundidad recogida en el mar Cantabrico a una profundidad de 1.800 m. 30 matraces Erlenmeyer (250 ml), conteniendo cada uno 50 ml de medio R5A, anteriormente descrito (Brana et al., 2014. Microb Ecol 69: 512-24), fueron inoculados con esporas y se incubaron en un agitador orbital a 28°C y 250 rpm durante 4 dfas.
Analisis filogenetico (taxonomia) del microorganismo productor
La cepa M-207 (CECT 9162) fue sometida a analisis filogenetico en base al analisis de la secuencia del 16S rRNA. El analisis filogenetico fue realizado usando MEGA version 6.0 despues de un alineamiento multiple de los datos mediante CLUST ALO. Las distancias (opciones de distancia segun el modelo de dos parametros de Kimura) y alineamiento con el metodo neighbour-joining fueron determinadas usando valores bootstrap basadas en 1000 replicaciones.
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Actividad antimicrobiana del compuesto
Para probar las propiedades antibioticas del compuesto se utilizaron metodos previamente descritos (Audoin et al., 2013, Mar Drugs 11: 1477-1489). El compuesto se diluyo en serie en DMSO con un factor de dilucion de 2 para proporcionar 10 concentraciones para todos los ensayos. La CMI se definio como la concentracion mas baja del compuesto que inhibe > 90% del crecimiento de un microorganism o despues de la incubacion durante la noche. El Software Genedata discriminador (Genedata, lnc.) fue utilizado para analizar los datos y calcular el factor RZ para estimar la solidez de las pruebas (Zhang el al., 1999, Biomol Screen 4: 67-73). En todos los experimentos realizados el factor RZ1 obtenido fue entre 0,85 y 0,92. El compuesto fue probado en dos dfas diferentes y en triplicado en las concentraciones de ensayo final entre 160 gg/ml y de 0,31 gg/ml.
Actividad citotoxica del compuesto
Los ensayos calorimetricos MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetilthiazol-2-il- 2,5-difeniltetrazolio), que miden la actividad metabolica mitocondrial, se realizaron con cinco lfneas de celulas tumorales y una lfnea de celulas saludables. diez mil celulas por pocillo (para analisis de 72 h) fueron introducidas en placas de 96 pocillos con un sistema robotica del cultivo celular, SelecT (TAP Biosystems, Royston, Reino Unido). Despues de 24 h de incubacion, el compuesto fue agregado con el sistema automatizado de manejo llquido Biomek FX (Beckman Coulter, Pasadena, CA), y las placas se incubaron durante 72 h adicionales. El compuesto fue ensayado por triplicado con las diluciones % de la curva. Se agrego MTI y las placas fueron leldas en un espectrofluorometro Victor2TM Wallac (PerkinEimer).
Ejemplo 2. Resultados
Taxonomla de la ceca M-207
El 16S rDNA de la cepa productora M-207 (CECT 9162) fue amplificado mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciado. El analisis de la secuencia demostro una identidad del 100% con Streptomyces carnosus M-40 (HG965214). El arbol filogenetico generado por el metodo de neighbour-joining basado en la secuencia del gen 16S rRNA revelo claramente la relacion evolutiva de la cepa M-207 con un grupo de especies de Streptomyces conocidas (Figura 1). Por lo tanto, esta cepa fue identificada como Streptomyces carnosus M-207.
Aislamiento y purificacion de loboforina K
Los cultivos se centrifugaron, se descartaron los sedimentos y los sobrenadantes fueron filtrados y aplicados a un cartucho de extraccion en fase solida (Sep-Pak Vac C18, 10g, Waters). El material retenido se eluyo con una mezcla de metanol y 0,05% de acido trifluoroacetico (TFA) en agua. Un gradiente lineal de 0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min, fue utilizado. Las fracciones fueron recogidas cada 5 minutos y analizadas por UPLC con condiciones cromatograficas descritas (Brana et al., 2014, Microb Ecol 69: 512-24). En fracciones tomadas entre 45 y 55 min se observo un pico correspondiente a una loboforina desconocida. Estas fracciones se agruparon y secaron en vaclo, y el residuo fue posteriormente redisuelto en un pequeno volumen de DMSO y m etanol (1:1). El mismo pico tambien fue encontrado en el extracto organico de los sedimentos del
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cultivo, que fue procesado en la misma forma. El compuesto deseado se purifico por HPLC preparativa usando una columna SunFire C18 (10 pm, 10 x 250 mm, Waters). La fase movil era una mezcla de acetonitrilo y 0.05% TFA en el agua en condiciones isocraticas, a 7 ml/mln. La purificacion se realizo en dos pasos, con 90% de acetonitrilo en el primer paso y el 50% en el segundo paso. En ambos casos, la solucion que contiene el pico recogido fue parcialmente evaporada en el rotavapor para reducir la concentracion de solvente organico y luego aplicada a un cartucho de extraccion en fase solida (Sep-Pak C18, aguas). El cartucho fue lavado con agua, el compuesto retenido fue eluido con metanol y finalmente liofilizado, con un rendimiento de 1,9 mg de producto en estado puro.
Loboforina K: solido amarillo; [a]20D -102.2° (c 0.1, MeOH); IR (ATR) vmax 3427, 2931, 1708, 1630, 1549,1454, 1412, 1378, 1126, 1095, 1060, 1013, 926, 868 cm-1; para los datos de 1H y 13C NMR ver Tabla 1; HRESIMS m/z 1173.6346 [M+H]+ (calcd. para C6tH93N2020+, 1173.6316), 1190.6610 [M+NHJ+ (calcd. para C6TH96N3O20+, 1190.6582), 1195.6154 [M+Na]+ (calcd. para C6TH92N2O20Na+, 1195.6136).
Elucidacion estructural
La loboforina K tiene como formula molecular C61H92N2O20 de acuerdo con el ion protonado a m/z 1173.6346 observado en su espectro ESI-TOF (calc. para C61H93N2O20+, 1173.6316, A 2.6 ppm). Las senales observadas en sus espectros de 1H y 13C RMN (Tabla 1) son indicativas de una estructura tipo loboforina para el compuesto. La molecula presenta un atomo de oxlgeno adicional con respecto a la loboforina A y las principales diferencias entre el espectro de este nuevo compuesto y los de otras loboforinas se encontraron en torno al residuo de desoxiaminoazucar unido al carbono C17 (unidad D). En la mayorla de los compuestos de la serie de loboforinas, un sustituyente amino (-NH2) o nitro (-NO2) se encuentra en la posicion D3. Es de interes que la nueva loboforina presenta un grupo hidroxilamina (-NHOH) sustituyendo esa posicion. Esto representa un estado de oxidacion intermedio entre los grupos funcionales amino y nitro que se encuentran en la serie de las loboforinas en la posicion D3. Este estado de oxidacion intermedio representarla un producto biosintetico intermediario entre ambos tipos de loboforinas. Para la loboforina H y loboforina I (de acuerdo a Lin et al., 2014, J Antibiot (Tokyo) 67: 121-6), que llevan respectivamente un sustituyente amino y nitro en la posicion 03. Los datos de RMN se han descrito en CD30D, lo que permite una comparacion directa de los desplazamientos qulmicos observados para el anillo D con los de la nueva loboforina aquf presentada. Esta comparacion revelo las diferencias esperadas, especialmente en la frecuencia de resonancia del carbono en la posicion D3, que se encuentra a 61.6 ppm en la nueva loboforina y a 57.0 y 92.9 ppm en las loboforinas H e I respectivamente. El desplazamiento qulmico observado en la posicion D3 para la nueva loboforina esta de acuerdo con El desapantallamiento esperado para el grupo funcional hidroxilamino (61.6 ppm) con respecto al grupo amino (57.0 ppm), estando ademas fuertemente apantallado en comparacion con el grupo funcional nitro (61.6 ppm vs. 92.9 ppm).
- Tabla 1. Espectros H y 13C de
- RMN para la loboforina K (CD3OD, 500 MHz)
- 1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN
- Posicion
- tJen ppm (mult, Jen Hz) S en ppm Posicidn <Sin ppm (mult, Ven Hz) 8 en ppm
- 1
- - n. d.
- 2
- - 100.7 A1 4 77 (brd, 4 1) 99.7
- -------3
- - 205.0a A2 2 39 (m), 1.74 (m) 31.0
- 4
- - 524 A3 4.02 (dd, 6.1, 2.9) 69.3
- 5
- 2.08 (m) 44 8 A4 3.26 (dd, 9 6, 3.3) 73.4
- 6
- 1.61 (m) 32 5 A5 4.10 (m) 660
- 7
- 1 61 (m), 1.53 (m) 430 A6 1 21 (d, 6.4) 18 2
- 8
- 2-24 (m) 35 9
- 9
- 3 42 (dd, 10.1, 5.3) 862 B1 5.17 (brd, 3.5) 932
- 10
- 2.09 (m) 39 7 B2 2.09 (m), 1.99 (dt, 14.6, _________3-7) 35.9
- 11
- 5 81 (brd, 10 2) 127.2 B3 4.18 (dd, 6.5, 3.5) 68.1
- 12
- 5.38 (ddd, 10 2,4.9, 1.8) 127.9 B4 3.29 (m) 83 3
- 13
- 3.65 (m) 52 7 B5 4.06 (m) 63.7
- 14
- - 137.1 B6 1.21 (d, 6 3) 18.0
- 15
- 5.20 (brd, 9.4) 124.9
- 16
- 2,40 (m), 2.26 (m) 32,5 C1 4.95 (dd, 9.7, 1.7) 100.7
- 17
- 4.20 (m) 80.3 G2 2.05 (m), 1.72 (m) 38 8
- 18
- - 139 3 C3 4.29 (dd, 5.8, 2.8) 64.4
- 19
- 5.12 (brd 10.5) 120.2 C4 2.85 (dd, 9.4, 2.8) 83.8
- 20
- 3.59 (brd, 10 4) 41.5 C5 3.81 (da, 9.4, 6.2) 69.6
- 21
- 5.43 (brs) 122.7 C6 1.23 (d, 6.3) 18.6
- 22
- - 142.5 C7 3,38 (s) 57.0
- 23
- 2.62 (brp) 29.0
- 24
- 2.39 (m), 1.79 (d, 14.2) 36.4 D1 4.73 (dd, 9.8, 2.5) 99.2
- 25
- - 84.9 D2 1.61 (m), 1.50 (dd, 14.3, 9.8) 37.5
- 26
- - 200.9 D3 - 61.6
- 27
- 1.55 (s) 15.5 D4 3.66 (m) 54.1
- 28
- 0.65 (brd, 4.2) 22.9 D5 4.23 (qd, 6.4, 1.6) 69.4
- 29
- 1.14 (d, 7.0) 148 D6 1.08 (d, 6.4) 17.5
- 30
- 1.38 (brs) 14.2 D7 1.15 (s) 22.6
- 31
- 1.41 (brs) 15,3 D8 - 160.1
- 32
- 4,14 (brs), 4.09 (m) 65.0 D9 3,65 (sj 52.4
- 33
- 1.28 (d, 7.2) 20.5
No determinado (n. d.);3 obtenido del HMBC
5 Actividad citotoxica de la loboforina K
Actividad citotoxica fue observada para el compuesto a las concentraciones ensayadas frente a las lfnea celulares MiaPaca_2 de carcinoma pancreatico y de MCF-7 de adenocarcinoma humano, asl como la lfnea inmortalizada de hepatocitos THLE-2 (Tabla 10 2). Esta loboforina no presento actividad, a la concentracion maxima ensayada, frente a
otras lfneas tumorales humanas como pulmon (A-549), colon (HT-29) y hepatocarcinoma (HepG2).
Tabla 2. Actividad citotoxica de la loboforina K frente a diferentes ifneas celulares tumorales
Loboforina K
(ED50 uM)
- A549
- >42.6
- HT29
- >42.6
- HepG2
- >42.6
- MCF-7
- 23.04
- MiaPaca_2
- 34.05
- THLE2
- 6.30
5
Actividad antibacteriana de la loboforina K.
Para determ inar las propiedades antibioticas de la molecula, se ha probado contra un panel de patogenos cllnicos, bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Como se 10 muestra en la Tabla 3, la loboforina K muestra actividad moderada y selectiva frente a bacterias Gram-positivas como Staphylococcus aureus EPI167, sensible a meticilina con una MIC90 de 40-80 pg/ml. No exhibio, sin embargo, propiedades notables como compuesto antiinfectivo frente a bacterias Gram-negativas como P. aeruginosa, A. baumannii, K. pneumoniae o E. coli.
15
Tabla 3. Valores de CIM90 del compuesto frente a microorganism os Gram-positivos y Gram-negativos.
Loboforina K (ClMgo pg.mL'1)
Gram-positivos
Staphylococcus aureus MSSA EPI167 Staphylococcus aureus MRSA
Gram-negativos
Acinetobacter baumanii 5973 Pseudomonas aeruginosa 5919 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli MB2884
20
En conclusion, un nuevo producto natural, la loboforina K. fue aislado y caracterizado a partir de una actinobacteria marina, Streptomyces carnosus M-207, asociada a un coral de aguas frfas de la especie Lophelia pertusa, recogido a 1.800 m de profundidad en el mar Cantabrico. Este compuesto exhibe importantes actividades citotoxicas contra lfneas 25 celulares tumorales humanas, asl como actividades inhibitorias contra bacterias patogenas Gram-positivas. Estos resultados son un ejemplo de la relevancia de los productos naturales marinos como candidatos en quimioterapia antitumoral y antibacteriana.
40-80
>160
>160
>160
>160
>160
Claims (19)
- REIVINDICACIONES1. Cepa bacteriana de Streptomyces carnosus M-207 depositada en la Coleccion Espanola de Cultivo Tipo bajo el numero de acceso 9162.5
- 2. Sobrenadante de un cultivo de la cepa segun la reivindicacion 1.
- 3. Uso de la cepa segun la reivindicacion 1 para la produccion del compuesto de formula (I) o cualquiera de sus sales o tautomeros:10
imagen1 donde R se selecciona entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido o acilo sustituido o no sustituido.5 4. Procedimiento para la obtencion de un compuesto de formula general (I), o cualquierade sus sales o tautomeros, descrito en la reivindicacion 3 que comprende:a. cultivar la cepa segun la reivindicacion 1 en un medio de cultivo en condiciones de fermentacion, y10b. purificar el compuesto de formula (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a). - 5. Com puesto de form ula general (I):
imagen2 o cualquiera de sus sales o tautomeros.5101520253035404550donde R se selecciona entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido o acilo sustituido o no sustituido. - 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 5 en el que R se selecciona entre hidrogeno, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquilacil C1-C6 sustituido o no sustituido, bencilo sustituido o no sustituido y benzoilo sustituido o no sustituido.
- 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6 en el que R se elige de entre hidrogeno, metilo sustituido o no sustituido, etilo sustituido o no sustituido, n-propilo sustituido o no sustituido, iso-propilo sustituido o no sustituido, n-butilo sustituido o no sustituido, terc-butilo sustituido o no sustituido. vinilo sustituido o no sustituido, alilo sustituido o no sustituido, etinilo sustituido o no sustituido, acetilo sustituido o no sustituido, o benzoilo sustituido o no sustituido.
- 8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 7 en el que el grupo R se selecciona de entre hidrogeno, acetilo, bencilo y benzoilo.
- 9. Un compuesto segun la reivindicacion 8 en el que R es hidrogeno.
- 10. Composicion que comprende el sobrenadante segun la reivindicacion 2 o el compuesto de formula (I) segun las reivindicaciones 5 a 9.
- 11. Composicion segun la reivindicacion 10, que ademas comprende otro agente antitumoral y o antibacteriano.
- 12. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, donde la composicion es una composicion farmaceutica o cosmetica y ademas comprende un excipiente o vehlculo farmaceutica o cosmeticamente aceptable.
- 13. Uso del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun las reivindicaciones 5 a 9o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, para la elaboracion de un medicamento.
- 14. Uso del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun las reivindicaciones 5 a 9 o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de tumores y/o para el tratamiento y/o prevencion de infecciones bacterianas.
- 15. Uso de la reivindicacion 14, donde los tumores son de pancreas o de mama.
- 16. Uso segun la reivindicacion 14, donde las infecciones bacterianas son provocadas por bacterias Gram-positivas.
- 17. Uso segun la reivindicacion 16, donde la bacteria es Staphylococcus aureus.
- 18. Uso de la cepa segun la reivindicacion 1, del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun las reivindicaciones 5 a 9 o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, para la eliminacion y/o prevencion de la formacion de biopellculas bacterianas sobre superficies inertes.
- 19. Uso segun la reivindicacion 18, donde las biopellculas bacterianas son provocadas por bacterias del genero Staphylococcus.
- 20. Uso segun la reivindicacion 19, donde la bacteria es Staphylococcus aureus.5
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