ES2605237T3

ES2605237T3 - Novedosos marcadores para la detección del cáncer de vejiga

Info

Publication number: ES2605237T3
Application number: ES08802026.8T
Authority: ES
Inventors: Isabelle Renard; Wim Van Criekinge
Original assignee: MDxHealth SA
Current assignee: MDxHealth SA
Priority date: 2007-09-17
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2017-03-13
Anticipated expiration: 2028-09-11
Also published as: US20100280134A1; WO2009036922A2; US10113202B2; EP2198042B1; CA2699606C; PL2198042T3; EP2198042A2; JP5697448B2; JP2010538624A; JP2015051006A; US9322065B2; CA2699606A1; DK2198042T3; WO2009036922A3; US20160208341A1; EP3147375A1

Abstract

Un método para detectar la incidencia de un cáncer de vejiga en una muestra que comprende detectar un cambio epigenético en al menos TWIST1 y opcionalmente también al menos un gen seleccionado entre NID2, RUNX3, BMP7, CCNA1, PDLIM4, TNFRSF25, APC, RASSF1A, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, OSMR y TJP2 donde la detección del cambio epigenético es indicadora de la incidencia del cáncer de vejiga y donde el cambio epigenético es metilación.

Description

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En un formato Amplifluor variante, el cebador específico de la secuencia transporta una secuencia "Z" de adición en su extremo 5' y da como resultado un producto de amplificación inicial que contiene el complemento de la secuencia "Z". Se diseña un segundo cebador con una configuración de tallo-bucle para contener la secuencia "Z" y se hibrida al molde que contiene el complemento de "Z". Durante la reacción de polimerización, las moléculas indicadora e

5 inactivadora se incorporan al producto. Este producto sirve como molde para la amplificación adicional. Como la conformación en horquilla del molde se despliega durante la polimerización, se observa una señal de fluorescencia.

En Heavymethyl, el cebado es específico de la metilación, pero los bloqueantes de oligonucleótidos no extensibles proporcionan esta especificidad en vez de los propios cebadores. Los bloqueantes se unen al ADN tratado con bisulfito de una manera específica de la metilación, y sus sitios de unión solapan los sitios de unión del cebador. Cuando el bloqueante está unido, el cebador no se puede unir y por tanto no se genera el amplicón. Se puede usar Heavymethyl en combinación con la detección en tiempo real o en punto final.

Los sistemas Plexor™ qPCR y qRT-PCR pueden aprovechar la interacción específica entre dos nucleótidos

15 modificados para conseguir el análisis de la PCR cuantitativa. Uno de los cebadores de la PCR contiene una marca fluorescente adyacente a un resto iso-dC en el extremo 5'. El segundo cebador de la PCR está sin marcar. La mezcla de reacción incluye desoxinucleótidos y un sitio iso-dGTP modificado con el inactivador dabcyl. Dabcyl-isodGTP se incorpora preferentemente en la posición complementaria al resto iso-dC. La incorporación del dabcyl-isodGTP en esta posición da como resultado la inactivación del colorante fluorescente en la hebra complementaria y una reducción en la fluorescencia, que permite la cuantificación durante la amplificación. Para estas reacciones multiplete, se usa una pareja de cebadores con un fluoróforo diferente para cada secuencia diana.

La PCR en tiempo real detecta la acumulación del amplicón durante la reacción. Sin embargo, no necesitan utilizarse los métodos en tiempo real. Muchas aplicaciones no requieren cuantificación y la PCR en tiempo real se 25 usa solo como herramienta para obtener una presentación y almacenamiento de datos conveniente, y al mismo tiempo para evitar una manipulación posterior a la PCR. De esta manera, se pueden llevar a cabo solo los análisis para confirmar si el ADN diana está presente en la muestra o no. Dicha verificación de punto final se lleva a cabo tras finalizar la reacción de amplificación. Este conocimiento se puede usar en un laboratorio diagnóstico médico para detectar una predisposición, o incidencia, de cáncer en un paciente. Las técnicas de detección de la fluorescencia de la PCR de punto final pueden utilizar los mismos enfoques que se han utilizado ampliamente para la PCR en tiempo real. Por ejemplo, el detector "Gene" permite la medida de la fluorescencia directamente en tubos de la PCR. De acuerdo con ello, en una realización preferida adicional, el estado de metilación de al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR, se determina mediante la amplificación de la PCR específica de metilación

35 y, preferentemente la PCR específica de metilación se vigila en el punto final de la amplificación.

En una realización particular, se proporcionan cebadores útiles en la MSP transportados en el gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. Los cebadores de la invención se diseñan preferentemente para unirse a secuencias genómicas completamente metiladas en las regiones en investigación. Estos cebadores pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en las siguientes secuencias:

S= cebador de sentido directo (5' -3') AS= cebador de sentido contrario (5' -3') 45 MB= baliza molecular (balizas de modificación: 5' FAM, 3' DABCYL)

RASSF1A_S (SEC ID NO. 1): GCGTTGAAGTCGGGGTTC RASSF1A_AS (SEC ID NO. 2): CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG RASSF1A_MB (SEC ID NO. 3): CGTCTGCGTGGTTTCGTTCGGTTCGCGTTTGTTAGGCAGACG

APC(2)_S (SEQ ID NO. 4): TAT TGC GGA GTG CGG GTC APC(2)_AS (SEQ ID NO. 5): TCG ACG AAC TCC CGA APC(2)_MB (SEQ ID NO. 6): CGACATGCGTTGTGTAATTCGTTGGATGCGGATTAGGGCGGCATGTCG

55 CCNA1_gron_S (SEC ID NO. 7): GTTATGGCGATGCGGTTTC CCNA1_gron_AS (SEC ID NO. 8): CCAACCTAAAAAACGACCGA CCNA1_gron_MB (SEC ID NO. 9): CGACATGCACGACGCCCCCGAACCTAACGCATGTCG

TNFRSF25_1_S (SEC ID NO. 10): GTCGTCGAGAAGGGTTCGTTT TNFRSF25_1_AS (SEC ID NO. 11): GCGTATTCTACTTAACCTATCCGC TNFRSF25_1_MB (SEC ID NO. 12): CGACATGCACGACCCCGCCTCCCCCCGCCGCATGTCG

TUBB4_2_S (SEC ID NO. 13): TAAATTAGATCGTCGTTTCGGAG TUBB4_2_AS (SEC ID NO. 14): TACCTCAATTTCTCGATCCGC 65 TUBB4_2_MB (SEC ID NO. 15): CGACATGCTGGGAGGGTTCGCGGTTATTGTAAGGAGCATGTCG NTRK2_1_M_S (SEC ID NO. 16): GTTAGAGCGCGTTTTTAGCGT

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normales, tras el tratamiento con SssI metiltransferasa, como control positivo.

Adicional, o alternativamente, se pueden emplear controles negativos adecuados con los métodos de la invención. En el presente documento, los controles adecuados pueden incluir evaluar el estado de la metilación de un gen

5 conocido que se va a desmetilar o un gen que se ha desmetilado artificialmente. Este experimento actúa como control negativo para asegurar que no se obtienen resultados falsos positivos. En una realización, el gen seleccionado entre NID2, a TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR se puede evaluar en células normales como control negativo ya que se ha mostrado por primera vez en el presente documento que el gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR está desmetilado en tejidos normales.

Aunque la PCR es la técnica de amplificación de ácidos nucleicos preferida, se puede utilizar también para detectar el estado de metilación del gen implicado. Dichas técnicas de amplificación son bien conocidas en la materia e

15 incluyen métodos tales como NASBA (Compton, 1991), 3SR (Fahy et al., 1991) y la amplificación mediada por transcripción (TMA). Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barringer et al, 1990), amplificación selectiva de las secuencias del polinucleótido diana (patente de Estados Unidos N.º 6.410.276), reacción en cadena de la polimerasa cebada con la secuencia consenso (patente de Estados Unidos N.º 4.437.975) reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (documento WO 90/06995), tecnología de invasor, tecnología de desplazamiento de hebra, y amplificación de desplazamiento de muescas (documento 2004/067726). No se pretende que esta lista sea exhaustiva; se puede usar cualquier técnica de amplificación de ácidos nucleicos con la condición de que el producto de ácido nucleico adecuado se amplifique específicamente. De esta manera, estas técnicas de amplificación pueden vincularse, por ejemplo, a las técnicas de secuenciación con MSP y/o bisulfito.

25 La aplicación de los métodos de la presente invención sobre pequeñas cantidades en exceso de ADN metilado anómalamente, que se liberan en los fluidos recogidos tales como, por ejemplo, suero, orina, muestras de lavados, etc., puede requerir la generación y amplificación de una biblioteca de ADN antes del ensayo para determinar la metilación de cualquier gen específico. Se describen métodos adecuados sobre la amplificación del genoma completo y la generación de bibliotecas para dicha amplificación (por ejemplo, tecnología Methylplex y Enzyplex, Rubicon Genomics) en los documentos US 2003/0143599, WO 2004/081225 y WO 2004/081183. Además, el documento WO 2005/090507 se refiere a métodos de generación/amplificación de bibliotecas que requieren aplicaciones basadas tanto en la conversión del bisulfito o sin bisulfito. El tratamiento con bisulfito puede producirse antes o después de la construcción de bibliotecas y puede requerir el uso de adaptadores resistentes a la conversión

35 del bisulfito. Met-DOP-PCR (Di Vinci et al, 2006), una amplificación mediante la PCR cebada con oligonucleótidos degenerados modificados (DOP-PCR) que está combinada con MSP proporciona otro método adecuado para la detección específica en una cantidad pequeña de ADN. La gestión mejorada de los cuidados al paciente puede requerir estos métodos y técnicas existentes para suplementar los métodos de la invención.

Como el silenciamiento epigenético de un gen se manifiesta por sí mismo más frecuentemente en la expresión disminuida en células tumorales, la invención proporciona un método para detectar el cáncer o la predisposición a cáncer, en concreto, en el cáncer de vejiga, que comprende detectar el silenciamiento epigenético de al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR, donde en el silenciamiento epigenético del gen del al menos un gen se

45 determina por la medida de los niveles de expresión del gen y donde la expresión reducida del gen es indicadora del cáncer o la predisposición a cáncer.

Puede observarse en la muestra la pérdida total de expresión de la proteína del gen seleccionado entre los genes NID2, TJR2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR a fin de concluir un diagnóstico o predisposición a cáncer de vejiga, o para tomar una decisión del mejor curso de tratamiento de acuerdo con los otros métodos de la invención. Sin embargo, la pérdida parcial de la expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR puede ser también relevante, debido a la metilación del gen relevante.

55 La disminución en el nivel de expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR puede medirse, según sea necesario, para determinar si este es estadísticamente significativo en la muestra. Esto ayuda a proporcionar un test fiable para los métodos de la invención. Se puede utilizar cualquier método para determinar si el nivel de expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF-1A y OSMR es significativamente reducido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y se emplean de manera rutinaria. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo análisis estadísticos utilizando un análisis del test de la varianza. Los valores p típicos para su uso en dicho método serían valores P de < 0,05 o 0,01 o 0,001 cuando se determina si la expresión o la actividad relativa es estadísticamente significativa. Un

65 cambio en la expresión puede considerarse significativo si, por ejemplo, existe al menos una disminución del 10%. El ensayo pude hacerse más selectivo realizando el cambio al menos un 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 50%, por

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ejemplo, a fin de considerarse estadísticamente significativo.

En una realización preferida, se determina el estado de metilación de la región promotora del al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2,

5 ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR con referencia a la muestra del control. Esta muestra del control se toma preferentemente de tejido normal (es decir, no tumorigénico) en el sujeto cuando la expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR es normal. Adicional, o alternativamente, las muestras del control pueden también utilizarse cuando se sabe que tienen una ausencia de expresión del gen involucrado. Se pueden incluir también controles adicionales adecuados para asegurar que el ensayo está funcionando adecuadamente, tal como los niveles de medición de la expresión o la actividad de un gen de referencia adecuado en las muestras de ensayo y de control.

Puede medirse la expresión de un ácido nucleico en una muestra de ensayo para el ARN o la proteína. Se pueden

15 emplear métodos que empleen la hibridación de la sonda de ácido nucleico a los transcrito(s) relevantes(s) de un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR para medir la presencia y el nivel de ARNm. Dichos métodos incluyen el uso de matrices de sondas de ácidos nucleicos (tecnología de micromatrices) y transferencias Northern. Los avances en las tecnologías genómicas permiten ahora el análisis simultáneo de miles de genes, aunque pueden estar basados en el mismo concepto de hibridación de la diana específica de sonda. Los métodos basados en la secuenciación son una alternativa. Estos métodos se inician con el uso de etiquetas de las secuencias expresadas (EST) y ahora incluyen los métodos basados en etiquetas cortas, tales como el análisis en serie de la expresión del gen (SAGE) y la secuenciación de la firma masivamente en paralelo (MPSS). Diferentes técnicas de expresión proporcionan otros medios diferentes de analizar la expresión génica; esta familia de técnicas se basa en la

25 amplificación aleatoria de fragmentos de ADNc generados por la digestión de restricción, y bandas que difieren entre dos tejidos para identificar los ADNc de interés.

En una realización preferida, los niveles de expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR se determinan usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante la transcriptasa inversa (RT-PCR). La RT-PCR es una técnica bien conocida en la materia que se basa en la enzima transcriptasa inversa para transcribir de forma inversa el ARNm para formar ADNc, que se puede amplificar a continuación en una reacción de la PCR convencional. Los protocolos y kits para llevar a cabo la RT-PCR son extremadamente bien conocidos de los expertos en la materia y están comercialmente disponibles.

35 La RT-PCR se puede llevar a cabo de una manera no cuantitativa. Las medidas de la RT-PCR en punto final cambian los niveles de expresión utilizando tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. Estos métodos tradicionales son bien conocidos en la materia. De forma alternativa, se lleva a cabo la RT-PCR en tiempo real y de manera cuantitativa. La RT-PCR cuantitativa en tiempo real se ha descrito ampliamente en la bibliografía y son posibles una variedad de técnicas. Los ejemplos incluyen el uso de Taqman, balizas moleculares, Scorpion, Plexor y Amplifluor como se ha descrito ya. Todos estos sistemas están comercialmente disponibles y bien caracterizados, y pueden permitir el multiplexado. Como se ha mencionado, la PCR es un método de amplificación preferido, pero se incluyen también variantes de la técnica básica y otras técnicas de amplificación en el alcance de la invención.

45 Los métodos adecuados para determinar la expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR al nivel de la proteína son también bien conocidos por un experto en la materia. Los ejemplos incluyen transferencias western, tinción inmunohistoquímica e inmunolocalización, inmunofluorescencia, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, ensayo de fijación del complemento, reacciones de aglutinación, radioinmunoensayo, citometría de flujo, espectrometría de masas, y diálisis en equilibrio. Estos métodos dependen generalmente de un reactivo específico para identificar el producto génico de un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. El reactivo es preferentemente un anticuerpo y puede comprender anticuerpos monoclonales o policlonales.

55 Pueden utilizarse también fragmentos y anticuerpos derivados, que incluyen sin limitación fragmentos Fab, ScFv, anticuerpos de dominio único, nanoanticuerpos, anticuerpos de cadena pesada, aptámeros, etc..., que retienen la función de unión del producto génico. Puede emplearse cualquier método de detección de acuerdo con la invención. La naturaleza del reactivo no está limitada excepto que debe ser capaz de identificar específicamente el producto génico adecuado.

Por supuesto, en el caso de un diagnóstico positivo de cáncer, habrá niveles reducidos o nulos de las proteínas relevantes codificadas por al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. En una realización esto presentará un resultado negativo. En este caso, el uso de controles adecuados asegura que no se realizarán diagnósticos

65 falsos producidos, por ejemplo, por reactivos degradados o no específicos. De esta manera, se puede ensayar el mismo reactivo sobre muestras donde se sabe que se expresa al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2,

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TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. Un resultado positivo en esta muestra del control, combinado con un resultado negativo en la muestra de ensayo, proporciona un diagnóstico de confianza del cáncer y elimina cualquier duda sobre la calidad del reactivo.

5 La medición de la expresión de un gen por sí mismo no indica que el silenciamiento sea epigenético y el mecanismo de silenciamiento podría ser genético, por ejemplo, por mutación somática. Puede incluirse un tratamiento adicional con reactivos tales como DAC (5'-desazacitidina), TSA u otro tratamiento que afecta a los mecanismos epigenéticos presentes en las líneas de células a fin de determinar si el silenciamiento del gen es epigenético. Normalmente, la expresión se reactiva o invierte tras el tratamiento con dichos reactivos, indicando que el silenciamiento es epigenético.

Tras el diagnóstico, el tratamiento se decide de acuerdo con el estadio del cáncer. El «estadio» del cáncer es un descriptor (usualmente números I a IV) de lo mucho que el cáncer se ha diseminado. El estadio tiene a menudo en cuenta el tamaño del tumor, lo profundo que ha penetrado, si ha invadido órganos adyacentes, sí y cuántos ganglios

15 linfáticos ha metastatizado y si se ha diseminado a órganos diferentes. La estadificación del cáncer es importante ya que el estadio en el diagnóstico es el mejor predictor de supervivencia, y los tratamientos se cambian a menudo basándose en el estadio. Por ejemplo, aproximadamente 70% a 80% de pacientes a los que se les ha diagnosticado cáncer de vejiga presentarán tumores superficiales de vejiga (estadio Ta, Tis, o T1). Los tumores Tis, denominados también CIS (carcinoma in situ), son tumores planos confinados al urotelio pero que, si no se tratan, progresarán hasta una enfermedad invasiva del músculo. Los tumores que son T2 y T3 son indicativos de invasión en el músculo o la grasa de la vejiga. Los tumores en estadio 4 representan aquellos que han invadido la pared pélvica o abdominal o han metastatizado a órganos adyacentes.

El estado de metilación y/o el nivel de expresión del gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25,

25 BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR, puede estar correlacionado con el estadio del cáncer. La sección experimental proporciona evidencias sobre la metilación de determinados genes seleccionados entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR que se produce en el estadio temprano del cáncer. Los cambios de la metilación que se desarrollan inicialmente en el proceso de la carcinogénesis no son solo ideales a fines de selección, sino que también son dianas interesantes para vigilar la estadificación y la patología y/o vigilar la progresión o el resultado de la enfermedad, comprobando la recidiva de la enfermedad tras el tratamiento. De esta manera, el marcador es particularmente útil en un método de pronóstico del cáncer que comprende detectar el silenciamiento epigenético del al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR donde el silenciamiento

35 epigenético del gen es indicador del desarrollo del cáncer. Relacionado con lo anterior, la invención proporciona también un método para determinar el estadio del cáncer que comprende determinar el silenciamiento epigenético de un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. En una realización, el sujeto está desarrollando o está en riesgo de desarrollar un cáncer AJCC es estadio I, II, III o IV. En este método, se obtiene una muestra de un sujeto que padece o es sospechoso de padecer cáncer. En todas estas realizaciones, el silenciamiento epigenético se detecta por determinación del estado de metilación y/o la ´medición de los niveles de expresión de al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR.

45 Todos los métodos de la presente invención se utilizan preferentemente vinculados al cáncer de vejiga. Para alcanzar altas tasas de detección de tumores, puede ser necesario complementar los métodos de la invención con métodos establecidos para la identificación del cáncer de vejiga. Los métodos no invasivos pueden ser especialmente adecuados para uso junto con los métodos no invasivos de la invención. Los métodos de la presente invención se usan preferentemente junto con uno o más de los siguientes métodos:

•: Análisis de orina

•: Citología de orina (examen microscópico de orina para observar células cancerosas)

•: Cistoscopia (uso de instrumentos provistos de luz para visualizar el interior de la vejiga. El diagnóstico y la

estadificación del cáncer de vejiga comienza con una cistoscopia) 55 • Biopsia de vejiga (llevada a cabo usualmente durante la cistoscopia)

•: Pielograma intravenoso-IVP (Se inyectan colorantes en el torrente sanguíneo, lo que permiten una mejor visualización de algunos tumores o anomalías en la vejiga usando rayos X de forma rutinaria).

•: Técnicas de diagnóstico por imágenes: Se puede llevar a cabo el diagnóstico por imágenes de rayos X del tracto urinario superior (incluyendo los uréteres y los riñones) para descartar cualquier implicación de estas estructuras. Se pueden usar ultrasonidos para estudiar los riñones y un barrido CT es a menudo muy bueno para estudiar la longitud completa del tracto urinario.

De forma más reciente, se están desarrollando ensayos de marcadores basados en orina y proporcionan otro medio más para complementar los métodos de la invención. Estos nuevos ensayos no son invasivos y son fiables para

65 detectar el cáncer de vejiga de grado bajo y, por tanto, son especialmente útiles en la vigilancia de la recidiva. Comprenden:

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El kit puede incluir también cebadores adecuados para determinar si se metila el al menos un gen seleccionado entre NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR. Estos cebadores pueden comprender cualquiera de los cebadores descritos en detalle con respecto a los diversos métodos de la invención que se pueden emplear a fin de determinar el estado de

5 metilación del gen relevante (al menos uno), y las variantes del mismo.

El kit puede comprender además sondas para la detección en tiempo real de los productos de amplificación. Las sondas pueden comprender cualquier tipo de sonda adecuado para la detección en tiempo real; los ejemplos no limitantes incluyen el uso de sondas TAQMAN y/o sondas MOLECULAR BEACONS y/o cebadores AMPLIFLUOR y/o sondas FRET y/o cebadores SCORPION y/o bloqueantes de oligonucleótidos. Dichos kits para la detección en tiempo real pueden utilizarse para la detección de punto final.

Los cebadores y/o las sondas pueden permitir la determinación directa del estado de metilación del al menos un gen, por ejemplo, tras el tratamiento con bisulfito del (ADN en la) muestra, como se describe en el presente 15 documento.

En las realizaciones específicas, los cebadores y/o sondas del kit se seleccionan entre los que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en cebadores y/o sondas que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en las siguientes secuencias de nucleótidos para los fines de amplificar el ADN metilado o no metilado (tras el tratamiento con bisulfito):

S= cebador de sentido directo AS= cebador de sentido contrario MB= baliza molecular

25 RASSF1A_S (SEC ID NO. 1): GCGTTGAAGTCGGGGTTC RASSF1A_AS (SEC ID NO. 2): CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG RASSF1A_MB (SEC ID NO. 3): 5'-FAM-CGTCTGCGTGGTTTCGTTCGGTTCGCGTTTGTTAGGCAGACG-3'-DABCYL

APC(2)_S (SEQ ID NO. 4): TAT TGC GGA GTG CGG GTC APC(2)_AS (SEQ ID NO. 5): TCG ACG AAC TCC CGA CGA APC(2)_MB (SEQ ID NO. 6): 5'-FAM-CGACATGCGTTGTGTAATTCGTTGGATGCGGATTAGGGCGGCATGTCG3'-DABCYL

35 CCNA1_gron_S (SEC ID NO. 7): GTTATGGCGATGCGGTTTC CCNA1_gron_AS (SEC ID NO. 8): CCAACCTAAAAAACGACCGA CCNA1_gron_MB (SEC ID NO. 9): 5'-FAM-CGACATGCACGACGCCCCCGAACCTAACGCATGTCG-3'-DABCYL

TNFRSF25_1_S (SEC ID NO. 10): GTCGTCGAGAAGGGTTCGTTT TNFRSF25_1_AS (SEC ID NO. 11): GCGTATTCTACTTAACCTATCCGC TNFRSF25_1_MB (SEC ID NO. 12): 5'-FAM-CGACATGCACGACCCCGCCTCCCCCCGCCGCATGTCG-3'-DABCYL

45 TUBB4_2_S (SEC ID NO. 13): TAAATTAGATCGTCGTTTCGGAG TUBB4_2_AS (SEC ID NO. 14): TACCTCAATTTCTCGATCCGC TUBB4_2_MB (SEC ID NO. 15): 5'-FAM-CGACATGCTGGGAGGGTTCGCGGTTATTGTAAGGAGCATGTCG-3'-DABCYL

NTRK2_1_M_S (SEC ID NO. 16): GTTAGAGCGCGTTTTTAGCGT NTRK2_1_M_AS (SEC ID NO. 17): CCGCAATACCTAACACTTCCG NTRK2_1_MB (SEC ID NO. 18): 5'-FAM-CGACATGCCCGACACGCTCCGAAACACCAGCATGTCG-3'-DABCYL

OSMR_1_S (SEC ID NO. 19): GTGTTAAGAGTGCGTAGTAAGACG

55 OSMR_1_AS (SEC ID NO. 20): GAAACGAACGTACAAAAACGA OSMR_1_MB (SEC ID NO. 21): 5'-FAM-CGACATGCCGAAACTATAAATCAACTACGAAACAAACGCGCAT-GTCG-3'-DABCYL

TWIST1_3_S (SEQ ID NO.22): GTTAGGGTTCGGGGGCGTTGTT TWIST1_3_AS (SEC ID NO. 23): CCGTCGCCTTCCTCCGACGAA TWIST1_3_MB (SEQ ID NO.24): 5'-FAM-CGACATGCCGGCGGGGAAGGAAATCGTTTCGCATGTCG-3'-DABCYL

LOXL1_29309_S (SEC ID NO. 25): TAGAGTACGTGTCGGTCGGAT 65 LOXL1_29309_AS (SEQ ID NO.26): ACAAAAACAAAAACGACGCCT MB_LOXL1_29309b (SEC ID NO. 27): 5'-FAM-CGACATGCCGGGTGTTGTTGGTCGGCGCGCATGTCG-3'

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DABCYL

TJP2_25301_S (SEC ID NO. 28): GAGATCGCGGGTTTTTATTTC TJP2_25301_AS (SEC ID NO. 29): CCAACTTCCTACGACGCAT

5 TJP2_25301_MB (SEC ID NO. 30): 5'-FAM-CGACATGCCTCCCAACCGCGCGACACAAGCATGTCG-3'-DABCYL Runx3_3_M_S (SEC ID NO. 31): CGTAGGGTTGTATTTGAGCGA Runx3_3_M_AS (SEC ID NO. 32): TAACTTTTAACGAAATTACCCCG RUNX3_3_MB2 (SEC ID NO. 33): 5'-FAM-CGACATGCCGGGTTAGGGGGGCGTAAAATTTTATTCGTTGCATGTCG-3'-DABCYL

PDLIM4_4_M_S (SEC ID NO. 34): GGCGTTTAGGTTAATTTTTCGT PDLIM4_4_M_AS (SEC ID NO. 35): CGATCCCATATCTAAAACCGA PDLIM4_4_MB (SEC ID NO. 36): 5'-FAM-CGACATGCCTCGCGATCCGCCCGAAACGCATGTCG-3'-DABCYL

15 BMP7_17911_S (SEC ID NO. 37): AGCGTAGAGATAGGTTGGTAACG BMP7_17911_AS (SEC ID NO. 38): AAAACGATAACCCTTAAACCGA MB_BMP7_17911 (SEC ID NO. 39): 5'-FAM-CGACATGCGCGGAGGGGTTAGCGTGGTTGCATGTCG-3'-DABCYL

NID2_9091_S (SEC ID NO. 40): GCGGTTTTTAAGGAGTTTTATTTTC NID2_9091_AS (SEC ID NO. 91): CTACGAAATTCCCTTTACGCT MB_NID2_9091 (SEC ID NO. 42): 5'-FAM-CGACATGGGTTCGTAAGGTTTGGGGTAGCGGCCATGTCG-3'-DABCYL

25 ARFGAP3_25342_S (SEC ID NO. 43): GCGTTAAGGTACGGGTTTTTC ARFGAP3_25342_A (SEC ID NO. 44): GCCATTTCGCCTAACGAAC ARFGAP3_25342_MB (SEC ID NO. 45): 5'-FAM-CGACATGCACGCGCCCTCCTTCGACACGCATGTCG-3'-DABCYL

β-Actina_S (SEQ ID NO. 46): TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT β-Actina_A (SEQ ID NO. 47): AACACACAATAACAAACACAAATTCAC β-Actina_MB (SEQ ID NO. 48):5'-FAM-CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGGCAGTCG-3'-DABCYL

35 Las marcas indicadas son opcionales. FAM y DABCYL son ejemplos representativos de marcadores fluorescentes que pueden participar en FRET para proporcionar un indicador de la amplificación fiable, como se describe en el presente documento. Se pueden emplear otros fluoróforos e inactivadores, en particular como parejas de FRET, según desee y aprecie una persona experta.

Como se describe, se pueden utilizar controles adecuados para actuar como control de calidad para los métodos e incluirse en el kit. Un ejemplo de un gen de referencia interna adecuado, que generalmente no está metilado, pero que se puede tratar con el fin de metilarse es β-actina. El kit de la invención puede comprender además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico del control que puede comprender al menos un gen seleccionado entre

45 NID2, TJP2, TWIST1, TNFRSF25, BMP7, RUNX3, CCNA1, APC, LOXL1, TUBB4, NTRK2, ARFGAP3, PDLIM4, RASSF1A y OSMR en forma no metilada y/o metilada.

Los kits pueden incluir adicionalmente tampones adecuados y otros reactivos para llevar a cabo los métodos reivindicados de la invención. En una realización, el kit además comprende, consiste esencialmente en, o consiste en tampones de amplificación de ácido nucleico.

El kit puede comprender también adicionalmente, consiste esencialmente en o consiste en enzimas que catalizan la amplificación del ácido nucleico. De esta manera, el kit puede adicionalmente comprender, consistir esencialmente en o consistir en una polimerasa adecuada para la amplificación del ácido nucleico. Los ejemplos incluyen aquellos

55 de las polimerasas de la familia de tipo A y de la familia de tipo B, tales como Taq, Pfu, Vent etc.

Como se indica anteriormente en el presente documento, el kit puede comprender medios para procesar una muestra de orina. Dichos medios para procesar una muestra de orina pueden comprender un tampón y/o reactivos estabilizantes para la extracción/aislamiento/concentración/purificación del ADN. El kit puede incorporar también un recipiente precintable para la recogida de una muestra de orina.

Los diversos componentes del kit pueden envasarse por separado en compartimentos separados o pueden, por ejemplo, almacenarse juntos cuando sea adecuado.

65 El kit puede incorporar también instrucciones adecuadas para el uso, que pueden imprimirse en una hoja diferente o incorporarse por ejemplo en el kit de envase.

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real. Se espera que el alistamiento total alcance 400 individuos en 2 años. De este ensayo en curso, 218 muestras de orina estuvieron disponibles para el presente estudio. Estas muestras incluían 150 muestras de pacientes sin evidencias de cáncer y 68 muestras de pacientes que cubrían todos los estadios del cáncer de vejiga, representando el 82% de la enfermedad en la etapa temprana (véase la tabla 3 para los detalles). Se usó una alícuota de estas

5 muestras de orina para el análisis de la citología.

Aislamiento del ADN: Se aisló ADN de tejido y orina utilizando un método de aislamiento del ADN normalizado y equipo normalizado. En resumen, para la preparación del ADN de orina, las muestras de orina recogidas recientemente se centrifugaron a baja velocidad a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. El

10 sobrenadante se separó de la fracción de sedimento. Ambas fracciones se almacenaron a -20ºC hasta procesamiento adicional. Antes del aislamiento del ADN de la fracción aglomerada, la muestra congelada se descongeló a temperatura ambiente y se centrifugó a 3000 g durante 5 minutos para separar el sobrenadante restante (unos pocos μl) a partir del aglomerado del desecho celular.

15 Se extrajo el ADN genómico procedente de la fracción de sedimento utilizando el kit de purificación de ADN PUREGENE® de Gentra. 700 μl de solución de lisis celular (proporcionada con kit) se añadieron al aglomerado y se procesaron adicionalmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se rehidrató el ADN añadiendo 45 μl de tampón LoTE y se incubó durante 1 hora agitando a 65ºC seguido por agitación durante la noche a 20ºC.

20 Modificación del ADN: 1,5 μg de ADN (o la totalidad si hay menos de 1,5 μg) se sometieron a modificación con bisulfito en un formato de 96 pocillos en un robot de pipeteado (Tecan) utilizando el kit de metilación del ADN EZ-96 (Zymo Research), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Básicamente, se mezclaron alícuotas de 45 μl con 5 μl de tampón de dilución M y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos agitando a 1100 rpm. A continuación se añadieron 100 μl del reactivo de conversión CT diluido y se incubaron las muestras a 70ºC durante 3 horas, agitando

25 a 1100 rpm en la oscuridad. Tras la conversión, las muestras se desalaron mediante incubación en hielo durante 10 minutos y adición de 400 μl de tampón de unión M. Se cargaron las muestras en una columna Zymo-Spin I en un tubo de recogida y se lavaron tras la centrifugación con 200 μl de tampón de lavado M. Se colocaron 200 μl de tampón de desulfonación M sobre la columna y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la centrifugación de las columnas, se lavaron dos veces con 200 μl de tampón de lavado M. Finalmente, se lavó el

30 ADN de la columna en 50 μl de Tris-HCl 1 mM pH 8,0 y se almacenó a -80°C, hasta procesamiento adicional.

Amplificación del ADN: Se aplicó MSP en tiempo real sobre un sistema sobre un sistema PCR en tiempo real rápido 7900HT (Applied Biosystems). Se añadieron 2,4 μl del ADN modificado a una mezcla de PCR (volumen total de 12 μl) que contenía tampón ((NH4)2SO4 16,6 mM, Tris 67 mM (pH 8,8), MgCl2 6,7 mM, β-mercaptoetanol 10 mM), dNTP 35 (5 mM), cebador directo (6 ng), cebador inverso (18 ng), baliza molecular (0,16 μM), y ADN Jumpstart de polimerasa Taq (0,4 unidades; Sigma-Aldrich). En la tabla 1 se resumen las secuencias de los cebadores y las secuencias de las balizas moleculares utilizadas para cada uno de los genes. El programa de ciclos utilizado fue como sigue: 5 minutos a 95ºC seguido por 45 ciclos de 30 segundos, 95ºC, 30 segundos 57°C (51°C para APC) (=recogida de datos en la meseta), y 30 segundos a 72ºC. Se incluyó una curva patrón (2x106 -20 copias) para determinar el

40 número de copias de las muestras desconocidas mediante la interpolación de los valores Ct en la curva patrón. Además de los genes de la prueba de la vejiga, se midió también la referencia independiente del gen de la β-actina (ACTB):

Cebador directo de la β-Actina 5' -TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT -3'

45 Cebador inverso de la β-Actina 5' -AACACACAATAACAAACACAAATTCAC -3' baliza 5'-FAM-CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGGCAGTCG-3'-DABCYL

Se calcularon las relaciones entre los genes de las pruebas de las vejigas y ACTB para generar los resultados de la prueba. Se clasificaron las muestras como metiladas, no metiladas, o no válidas basándose en el árbol de

50 decisiones que se muestra en la Figura 1.

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Tabla 4: Comportamiento de un panel de marcadores de orina en diferentes grupos de muestras

Grupos de muestras: Panel de orina: NID2, BMP7, TWIST1, CCNA1 y RUNX3

%Sensibilidad (n.º de positivos/ n.º total) [IC del 95%]

Papiloma: 75 (3/4)

Ta: 94 (16/17)

Tis: 100 (2/2)

T1: 71 (10/14)

T2: 100 (14/14)

T3: 50 (1/2)

Desconocido: 78 (7/9)

Estadios tempranos de cánceres (Papiloma, Ta, Tcis, T1 yT2): 88% de sensibilidad (45/51) [79 -97]

Todos los estadios de cáncer: 85 % de sensibilidad (53/62) [76 -94]

Controles (pacientes no cancerosos sintomáticos): 93 % de especificidad (10/143) [89 -97]

Los 143 controles (emparejados por edad) se clasificaron en varios grupos control (57 de prostatitis, 5 de hipertrofia prostática benigna [BPH], 12 de neoplasia intraepitelial prostática de grado elevado [HGPIN], 7 de constricción de la

5 uretra, 7 de cálculos [vejiga o riñón] 2 de BOO [obstrucción de salida de la vejiga], 7 de LUTS [síntomas del tracto urinario inferior], 2 de cistitis, 44 de otros). Se compararon los resultados de la metilación y la citología cuando se llevó a cabo el procesamiento sobre las mismas muestras de orina (Tabla 5). En la Tabla 6 se presenta el comportamiento de los ensayos de metilación entre los diferentes sitios de recogida de muestras.

10 Tabla 5: Comparación de los resultados de citología y metilación

Casos de cáncer: Casos control %Sensibilidad (nº de positivos/ nº total) %Especificidad (nº de positivos / nº total)

Resultados de la citología: Negativo 31 43 38% (19/50) 96% (2/45)

Positivo/ Atipia: 19 2

Resultados de la metilación: Negativo 9 133 85% (53/62) 93% (10/143)

Positivo: 53 10

Tabla 6: Comportamiento de los ensayos de metilación entre los diferentes centros de recogida de muestras.

%Sensibilidad (nº de positivos/ nº total): %Especificidad (nº de positivos / nº total)

Centro 1: 78 % (18/23) 92 % (5/64)

Centro 2: 93 % (14/15) 95 % (2/40)

Centro 3: 88 % (21/24) 92% (3/39)

Ejemplo 2: Un ensayo MSP en tiempo real para la detección temprana de cáncer de vejiga -conjunto de 15 pruebas de orina 2.

Se estudió adicionalmente el panel de 5 marcadores del Ejemplo 1 con un conjunto independiente de muestras, denominado 'conjunto de prueba de orina 2'. Debido a la reducción del número de genes ensayados (5 en vez de 11), estaba disponible una alícuota mayor de muestra de cada muestra ensayada para cada prueba de ensayo,

20 dando como resultado un volumen de elución BT adaptado y un árbol de decisiones diferente (basándose en las copias y no en las relaciones) para analizar los resultados (Figura 4).

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Un urólogo revisó los formularios de informes de casos de 218 pacientes procedentes del primer conjunto de pruebas (Ejemplo 1). Los 62 casos de cáncer de vejiga se clasificaron en varios grupos de cáncer (4 papilomas, 17 Ta, 2 Tis, 14 T1, 14 T2, 2 T3 y 9 desconocidos). Los 143 controles (emparejados por edad) se clasificaron en varios grupos control (60 de prostatitis, 8 de BPH [hipertrofia prostática benigna], 12 de HGPIN [neoplasia intraepitelial

5 prostática de grado elevado] 7 de obstrucción de la uretra, 8 de cálculos [vejiga o riñón] 2 de BOO [obstrucción de la salida de la vejiga], 7 de LUTS [síntomas en el tracto urinario inferior], 3 de cistitis, 6 de incontinencia, 4 de prolapso, 2 de hidronefrosis, 2 de orquitis, 22 de otros).

Se estudió adicionalmente el panel de marcadores con mejor comportamiento en el primer conjunto de pruebas de

10 orina (5 genes, Ejemplo 1) con un conjunto de muestras independiente recogido prospectivamente del ensayo en curso (conjunto 2 de pruebas de orina). La reducción adicional en el número de genes probados, que dieron como resultado menos ensayos por muestra, permitió una alícuota mayor de la muestra en cada ensayo. Las muestras de orina en el segundo conjunto de pruebas incluían 135 muestras de pacientes sin cáncer y 62 muestras de pacientes que cubrían todos los estadios del cáncer de vejiga. El ensayo proporcionó resultados válidos de 126 controles y 56

15 casos de cáncer de vejiga (Tabla 7). Un urólogo revisó los formularios de informes de casos de aquellos 182 pacientes. Los 56 casos de cáncer de vejiga se clasificaron en varios grupos de cáncer (6 papilomas, 19 Ta, 4 Tis, 12 T1, 12 T2, y 3 desconocidos). Los 126 controles (emparejados por edad) se clasificaron en varios grupos control (19 de prostatitis, 30 de BPH [hiperplasia prostática benigna], 18 de incontinencia, 14 de litiasis, 6 de constricción de la uretra, 2 de BOO [obstrucción de salida de la vejiga] 3 de LUTS [síntomas del tracto urinario inferior], 9 de cistitis,

20 5 de infección urinaria, 4 de inestabilidad vesical, 5 prolapsos, 11 otros). Un panel de 3 marcadores de la metilación basados en orina demostró un 91% de sensibilidad y un 93% de especificidad para identificar pacientes con cáncer de vejiga en estadio temprano (Tabla 8). Se desarrolló también un modelo de regresión logística utilizando los tres marcadores. Se calculó la curva característica del funcionamiento del receptor (ROC) para este modelo de regresión logística para el panel de genes de vejiga representando gráficamente la ttasa de positivo verdader (sensibilidad)

25 frente a la tasa de falso positivo (especificidad-100). El área bajo la curva (AUC) es 0,919. El 95% del intervalo CI fue de 0,870 a 0,995, con una significancia de P = 0,0001 para el área=5 (Figura 5). La sensibilidad y especificidad óptimas obtenidas con este modelo fueron similares a las obtenidas con los modelos de interpretación lineal simples (si algún marcador proporciona un número de copias por encima del corte, la muestra se puntúa como positiva) utilizados para las tablas 8 a 10.

30 Tabla 8: Comportamiento de paneles marcadores de orina con diferentes grupos de muestras. Los cortes de copias usados para el conjunto 2 de pruebas fueron: TWIST1 = 17, RUNX3 = 5 y NID2 = 30.

Grupos de muestras: Conjunto de prueba 1 (Ejemplo 1, tabla 4) Conjunto de prueba 2

NID2, BMP7, TWIST1, CCNA1 y RUNX3: TWIST, RUNX3, NID2

%Sensibilidad (n.º de positivos/ n.º total) [IC del 95%]
%Sensibilidad (n.º de positivos/ n.º total) [IC del 95%]

Papiloma: 75 (3/4) 100 (6/6)

Ta: 94 (16/17) 84 (16/19)

Tis: 100 (2/2) 100 (4/4)

T1: 71 (10/14) 100 (12/12)

T2: 100 (14/14) 83 (10/12)

T3: 50 (1/2) /

Desconocido: 78 (7/9) 100 (3/3)

Estadios tempranos de cánceres (Papiloma, Ta, Tcis, T1 yT2): 88% de sensibilidad (45/51) [79 -97] 91% de sensibilidad (48/53) [80 -97]

Todos los estadios de cáncer: 85% de sensibilidad (53/62) [77 -94] 91% de sensibilidad (51/56) [80 -97]

Controles (pacientes no cancerosos sintomáticos): 93% de especificidad (10/143) [89 -97] 93% de especificidad (9/126) [87 -97]

Se compararon los resultados de la metilación y la citología (ambos conjuntos de prueba de orina) para las mismas 35 muestras de orina (Tabla 9).

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Tabla 9: Comparación de los resultados de citología con metilación actualmente disponibles

Resultados: Casos de cáncer Casos control %Sensibilidad (n.º de positivos/ n.º total) [IC del95%] %Especificidad (n.º de positivos / n.º total) [IC del95%]

Conjunto de prueba 1

Resultados de la citología: Negativo 39 132 37% (23/62) [25-49] 96% (6/138) [92-99]

Positivo/Atipia: 23 6

Resultados de la metilación: Negativo 9 133 85% (53/62) [77-94] 93% (10/143) [89-97]

Positivo: 53 10

Conjunto de prueba 2

Resultados de la citología: Negativo 32 119 43% (24/56) [30-56] 94% (7/126) [90-98]

Positivo/Atipia: 24 7

Resultados de la metilación: Negativo 5 117 91% (51/56) [84-99] 93% (9/126) [90-98]

Positivo: 51 9

La sensibilidad del panel de 3 marcadores de metilación era significativamente mayor que la sensibilidad de la citología (91% frente a 43%) mientras que la especificidad era similar (93% frente 94%).

5 El comportamiento de los ensayos de metilación entre los diferentes centros de recogida de muestras era muy reproducible (Tabla 10).

Tabla 10: Comportamiento de los ensayos de metilación válidos entre los diferentes centros de recogida de 10 muestras.

Centros de recogida de muestras: Conjuntos de muestras %Sensibilidad (n.º de positivos/ n.º total) %Especificidad (n.º de positivos / n.º total)

Centro 1: conjunto de prueba 1 78% (18/23) 92% (5/64)

conjunto de prueba 2: 89% (8/9) 91% (2/21)

Centro 2: conjunto de prueba 1 93% (14/15) 95% (2/40)

conjunto de prueba 2: 93% (28/30) 94% (3/52)

Centro 3: conjunto de prueba 1 88% (21/24) 92% (3/39)

conjunto de prueba 2: 88% (15/17) 93% (4/53)

Ejemplo 3: Enfoque combinado no invasivo

Para potenciar adicionalmente la sensibilidad el nuevo ensayo de metilación del ADN basado en orina, los

15 inventores investigaron la factibilidad de combinar su ensayo de metilación con los métodos establecidos para la detección del cáncer de vejiga en estadio temprano en muestras de orina. Se usaron los resultados de la citología urinaria convencional (pauta terapéutica habitual) y del análisis de la mutación FGFR3 (particularmente útil para la detección de la recidiva) para complementar los métodos de la invención.

20 Materiales y métodos

Recogida de muestras: se utilizaron muestras de orina del conjunto de prueba 1 y del conjunto de prueba 2 como se describe en los Ejemplos 1 y 2 para demostrar la utilidad de combinar el ensayo de metilación con la citología y/o los resultados de la mutación FGFR3.

25 Diferentes ensayos probados:

Ensayo de metilación del ADN basado en orina de la OMS: Se llevaron a cabo cuantificaciones de los analitos (TWIST, RUNX3, NID2, y ACTB) mediante ensayos MSP como se ha detallado anteriormente.

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Se obtuvieron resultados comparables para el conjunto de prueba 2 y el conjunto de prueba 3 independientemente de si se centrifugaron las muestras de orina en las 4 h desde la recogida o se estabilizaron tras la recogida y el mantenimiento a temperatura ambiente durante hasta 72 h antes de la centrifugación.

5 El tercer estudio, llevado a cabo sobre un conjunto de muestras independiente confirmó que el ensayo de metilación basado en orina (TWIST1, RUNX3 y NID2) identificó correctamente el 91% de todos los cánceres de vejiga ensayados con una tasa de falso positivo de solo el 9% (91% de especificidad).

En la Tabla 16 se muestra el comportamiento individual del gen TWIST1 en el conjunto de pruebas de orina 2 y 3. 10 Se obtuvo una especificidad del 95% con una sensibilidad correspondiente del 77% y 91% respectivamente.

Tabla 16: El ensayo del comportamiento del gen individual Twist 1 presenta un % de especificidad y un % de sensibilidad para los conjuntos de prueba 2 y 3 (corte aplicado para TWIST1=7.5, en ACTB=15)

Grupos de muestras: Conjunto de prueba 2 Conjunto de prueba 3

TWIST1 (7,5)
TWIST1 (7,5)

Papiloma: 83 (5/6) 50 (1/2)

Ta: 74 (14/19) 85 (11/13)

Tis: 75 (3/4) 100 (1/1)

T1: 75 (9/12) 100 (9/9)

T2: 75 (9/12) 100 (5/5)

Carcinoma epidermoide: / 100 (1/1)

Desconocido: 100 (3/3) 100 (1/1)

Todos los estadios de cáncer: 77% de sensibilidad (43/56) [66-88] 91% de sensibilidad (29/32) [81-100]

Controles (sintomáticos): 95% de especificidad (6/124) [91-99] 95% de especificidad (2/44) [89-102]

15 Referencias.

Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L. Assaying DNA methylation based on high-throughput melting curve approaches. Genomics. 2002 Oct;80(4):376-84.

20 Barringer KJ, Orgel L, Wahl G, Gingeras TR. Blunt-end and single-strand ligations by Escherichia coli ligase: influence on an in vitro amplification scheme. Gen 1990 Apr 30;89(1):117-22.

Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991 Mar 7;350(6313):91-2.

25 Cottrell SE, Distler J, Goodman NS, Mooney SH, Kluth A, Olek A, Schwope I, Tetzner R, Ziebarth H, Berlin K. A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10

Di Vinci A, Gelvi I, Banelli B, Casciano I, Allemanni G, Romani M; Meth-DOP-PCR: an assay for the methylation 30 profiling of trace amounts of DNA extracted from bodily fluids; Lab Invest. 2006 Mar;86(3):297-303;

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40 Review Herman JG, Graff JR, Myôhànen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6

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Claims

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