ES2605247T3 - Métodos para la detección de fármacos hidrófobos - Google Patents

Abstract

Método para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad de un fármaco hidrófobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimús, sirolimús, everolimús y ciclosporina con respecto a la de metabolitos del fármaco hidrófobo, comprendiendo el método: (a) proporcionar en combinación en un medio: (i) una muestra de sangre completa, (ii) un agente de liberación para liberar el fármaco hidrófobo y los metabolitos de restos de unión endógenos en el que el agente de liberación es un éster del fármaco hidrófobo, y (iii) un agente de solubilidad selectiva para el fármaco hidrófobo en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente orgánico, no volátil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfóxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinación de los mismos en el que la concentración del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen, y (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del fármaco hidrófobo con respecto a la de los metabolitos en el medio.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

METODOS PARA LA DETECCION DE FARMACOS HIDROFOBOS DESCRIPCION

Antecedentes

La invencion se refiere a metodos para la determinacion de farmacos hidrofobos tales como, por ejemplo, farmacos inmunosupresores, en muestras, tales como muestras de pacientes, que se sabe o se sospecha que contienen uno o mas de tales farmacos hidrofobos.

El organismo se basa en un complejo sistema de respuesta inmunitaria para distinguir moleculas propias de ajenas. Algunas veces, el sistema inmunitario del organismo debe controlarse con el fin o bien de aumentar una respuesta deficiente respuesta o bien de suprimir una respuesta excesiva. Por ejemplo, cuando se trasplantan organos tales como rinon, corazon, sistema cardiopulmonar, medula osea e hugado en seres humanos, el organismo con frecuencia rechazara el tejido trasplantado mediante un proceso denominado rechazo de aloinjerto.

En el tratamiento del rechazo de aloinjerto, con frecuencia se suprime el sistema inmunitario de una manera controlada con terapia farmacologica. Se administran con cuidado farmacos inmunosupresores a receptores de trasplantes con el fin de ayudar a prevenir el rechazo de aloinjerto de tejido ajeno. Dos farmacos inmunosupresores muy comunmente administrados para prevenir el rechazo de organos en pacientes sometidos a trasplante son ciclosporina (CSA) y FK-506 (FK o tacrolimus). Otro farmaco que encuentra uso como inmunosupresor en los Estados Unidos y otros pafses es sirolimus, tambien conocido como rapamicina. Tambien se dice que derivados de sirolimus son utiles como inmunosupresores. Tales derivados incluyen, por ejemplo, everolimus y similares.

Los efectos secundarios asociados con algunos farmacos inmunosupresores pueden controlarse en parte controlando cuidadosamente el nivel de farmaco presente en un paciente. Se requiere una monitorizacion terapeutica de concentraciones de farmacos inmunosupresores y farmacos relacionados en la sangre para optimizar pautas posologicas para garantizar una inmunosupresion maxima con toxicidad minima. Aunque los farmacos inmunosupresores son agentes inmunosupresores altamente eficaces, su uso debe gestionarse con cuidado porque el intervalo de dosis eficaz es con frecuencia estrecho y una dosificacion excesiva puede dar como resultado efectos secundarios graves. Por otro lado, una dosificacion demasiado escasa de un inmunosupresor puede conducir a rechazo tisular. Dado que la distribucion y el metabolismo de un farmaco inmunosupresor pueden variar en gran medida entre pacientes y debido al amplio intervalo y gravedad de reacciones adversas, resulta esencial una monitorizacion precisa del nivel de farmaco.

En el campo de la monitorizacion de farmacos terapeuticos, detectar de manera selectiva el farmaco original con respecto a sus metabolitos es, con frecuencia, un objetivo importante para disenar inmunoensayos. Esto es especialmente cierto para farmacos inmunosupresores. Por ese motivo, los ensayos de HPLC con EM en tandem se han convertido en metodos convencionales para la medicion de sirolimus y otros farmacos inmunosupresores debido a su capacidad para medir de manera selectiva el farmaco original.

La mayona de los ensayos de sangre completa para detectar farmacos inmunosupresores requieren una etapa manual usando reactivos para extraer el farmaco de constituyentes de la sangre. Como resultado, las moleculas de farmaco y las moleculas de metabolitos de farmaco se disocian de protemas de union endogenas y se extraen a una disolucion relativamente limpia en la que se retiran protemas de plasma y partmulas de lipoprotemas asf como la mayona de las demas moleculas. Dado que habitualmente se usan tecnicas de precipitacion, la muestra extrafda esta basicamente libre de la mayona de las macromoleculas de la sangre incluyendo protemas de union a farmaco. Por tanto, en las muestras extrafdas, el farmaco original y sus metabolitos se disuelven como moleculas individuales, no unidas, y compiten entre sf por la reaccion con un anticuerpo de ensayo en la mezcla de inmunorreaccion. La union del anticuerpo de ensayo al farmaco se produce en ausencia de la mayona de las sustancias endogenas en estos ensayos. La reactividad cruzada de un metabolito de farmaco depende principalmente de su afinidad de union a anticuerpo en tales ensayos.

En un ensayo homogeneo para detectar un farmaco inmunosupresor en el que no hay ninguna extraccion o separacion manual del farmaco de constituyentes de la sangre, un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor tiene que detectar el farmaco en presencia de la mayona o la totalidad de los constituyentes de la sangre, cuya presencia puede interferir con la union del anticuerpo al farmaco inmunosupresor. Ademas, las muestras contienen metabolitos del farmaco y la alta reactividad cruzada de metabolitos presenta un grave problema de precision en ensayos para detectar farmacos inmunosupresores.

El documento WO 2008/082974 A2 da a conocer un metodo para preparar una muestra de prueba para su uso en un ensayo que comprende poner en contacto la muestra de prueba con un reactivo de lisis para formar una mezcla de lisis, que comprende un glicol o un analogo del mismo asf como un alcohol de hasta cinco atomos de carbono por molecula.

El documento WO 2008/147982 A1 se refiere a un inmunoensayo para evaluar la cantidad de un analito en una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

muestra de prueba, en el que el analito es un farmaco hidrofobo que se metaboliza para formar metabolitos con reaccion cruzada, comprendiendo el inmunoensayo las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de prueba con uno o mas reactivos de tratamiento previo para formar una primera mezcla, que somete a lisis cualquier celula y solubiliza cualquier analito presente en la muestra de prueba, (b) poner en contacto la primera mezcla con un anticuerpo espedfico para el analito para formar una segunda mezcla que comprende un complejo del anticuerpo con analito o metabolito, (c) lavar la segunda mezcla para eliminar cualquier analito y cualquier metabolito no complejado con el anticuerpo y para formar una tercera mezcla en la que se reduce la concentracion de analito, (d) poner en contacto la tercera mezcla con una pareja de union espedfica del anticuerpo marcada con un marcador detectable (“indicador”) para formar una cuarta mezcla que comprende un complejo del anticuerpo con indicador, (e) lavar la cuarta mezcla para eliminar cualquier indicador no complejado con anticuerpo, y (f) detectar el complejo anticuerpo-indicador como medida de la cantidad de analito presente en la muestra, en el que el inmunoensayo tiene una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 10% con uno cualquiera o mas metabolitos con reaccion cruzada presentes en la muestra.

El documento US 2005/0112778 A1 describe nuevos derivados de FK506 que son utiles para determinar los niveles de FK 506 en una muestra que pueden usarse para procedimientos de ensayo.

Por tanto, existe una necesidad continuada de desarrollar metodos de diagnostico rapidos y precisos para medir niveles de farmacos inmunosupresores o derivados de los mismos en pacientes. Los metodos deben ser totalmente automatizados y ser precisos incluso cuando se realizan con muestras de sangre completa sin extraccion usando un ensayo homogeneo en el que un anticuerpo empleado en el ensayo tiene que detectar el farmaco en presencia de la mayona, si no la totalidad, de los constituyentes de la sangre y en presencia de metabolitos de farmaco. El ensayo debe detectar de manera selectiva el farmaco original al tiempo que minimiza las imprecisiones resultantes de la reactividad cruzada de sus metabolitos.

Sumario

La presente invencion se refiere a un metodo para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad de un farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, sirolimus, everolimus y ciclosporina con respecto a la de metabolitos del farmaco hidrofobo, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar en combinacion en un medio: (i) una muestra de sangre completa, (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco hidrofobo y los metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco hidrofobo y (iii) un agente de solubilidad selectiva para el farmaco hidrofobo en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2- propanol, o una combinacion de los mismos, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen, y (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio.

La presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar un farmaco hidrofobo en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene el farmaco hidrofobo que comprende el metodo para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, sirolimus, everolimus y ciclosporina con respecto a la de metabolitos del farmaco hidrofobo segun la reivindicacion 1, en el que la combinacion en el medio comprende ademas un agente hemolftico y en el que en la etapa (b) el medio se incuba en condiciones para hemolizar celulas en la muestra y para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio, y en el que el metodo comprende ademas: (c) anadir reactivos al medio para determinar la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra, en el que los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el farmaco hidrofobo, y (d) examinar el medio para determinar la presencia de un complejo que comprende el farmaco hidrofobo y el anticuerpo para el farmaco hidrofobo, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.

La presente invencion se refiere adicionalmente a un metodo para determinar un farmaco inmunosupresor en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene un farmaco inmunosupresor, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar en combinacion en un medio: (i) la muestra, (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y los metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor y (iii) un agente de solubilidad selectiva para el farmaco inmunosupresor en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2- propanol, o una combinacion de los mismos, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen, (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio, (c) anadir al medio (i) un reactivo que comprende (I) un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor y (II) una enzima y (ii) partfculas magneticas que comprenden el farmaco inmunosupresor o un analogo del mismo, y (d) examinar el medio para determinar la presencia de un complejo que comprende el farmaco inmunosupresor y el anticuerpo para el farmaco inmunosupresor, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra, en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, sirolimus y everolimus.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Finalmente, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar la presencia o cantidad de un farmaco inmunosupresor en un medio que se sospecha que contiene un farmaco inmunosupresor, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar en combinacion en un medio: (i) una muestra de sangre completa, (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y los metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor y (iii) un agente de solubilidad selectiva para el farmaco inmunosupresor en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi- 2-propanol, o una combinacion de los mismos, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen, (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio, (c) anadir al medio (i) un fotosensibilizador asociado con una primera partmula y que puede generar oxfgeno singlete, y (ii) una composicion quimioluminiscente que puede activarse mediante oxfgeno singlete y asociada con una segunda partmula, en el que un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor esta asociado con la primera partmula o la segunda partmula o ambas, (d) someter la combinacion a condiciones para la union del anticuerpo al farmaco inmunosupresor, si esta presente, y (e) irradiar el fotosensibilizador con luz y detectar la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente, estando la cantidad de luminiscencia relacionada con la cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra, en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, sirolimus y everolimus.

Alternativamente, en la realizacion anterior, una de la primera partmula o la segunda partmula comprende el anticuerpo y la otra partmula comprende un analogo de farmaco para el farmaco inmunosupresor. Se somete la combinacion a condiciones para la competencia de las partmulas recubiertas con analogo de farmaco y el farmaco inmunosupresor, si esta presente, por el anticuerpo para el farmaco. Alternativamente, en la realizacion anterior, la primera partmula o la segunda partmula comprenden estreptavidina, que se combina con un analogo biotinilado para el farmaco inmunosupresor en el medio. Se somete la combinacion a condiciones para la competencia de analogo de farmaco biotinilado y el farmaco inmunosupresor por el anticuerpo para el farmaco. En cualquiera de las realizaciones alternativas anteriores, se irradia el fotosensibilizador con luz y se detecta la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente. La cantidad de luminiscencia esta relacionada con la cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra.

Descripcion detallada de realizaciones especificas

Discusion general

Los presentes inventores han reconocido que la reactividad cruzada de metabolitos de farmaco puede reducirse haciendo que el farmaco y los metabolitos esten menos unidos a protemas y potenciando la solubilidad del farmaco hidrofobo en una mezcla de ensayo con respecto a metabolitos del farmaco hidrofobo, que los presentes inventores reconocen que son mas hidrofilos que el propio farmaco. La naturaleza mas hidrofila de los metabolitos de farmaco parece deberse a grupos hidroxilo adicionales que resultan del metabolismo del farmaco a traves del tugado mediante desmetilacion e hidroxilacion. La interaccion hidrofoba es un mecanismo importante y comun para la union de farmaco-protema en sangre acuosa. Los presentes inventores observaron que metabolitos hidrofilos tienden a tener menor afinidad por las protemas de union y se difunden mas libremente en sangre acuosa y mezcla de ensayo. Por ese motivo, una mayor parte de las moleculas de metabolitos estan libres, no unidas a protemas y mas accesibles para el anticuerpo de ensayo que el farmaco original en la mezcla de ensayo acuosa. Suponiendo que un metabolito de farmaco tiene la misma afinidad de union al anticuerpo de ensayo que el farmaco original, el metabolito formara mas inmunocomplejos con el anticuerpo que el farmaco original debido a su mayor accesibilidad. El reconocimiento anterior es contrario a una creencia comun de que la reactividad cruzada de metabolitos solo es funcion de la afinidad de union al anticuerpo. Los presentes inventores han determinado que la reactividad cruzada de un metabolito en tales ensayos depende no solo de su afinidad de union al anticuerpo sino tambien de su afinidad de union a las protemas de union endogenas.

Aspectos de los ensayos descritos en el presente documento son inmunoensayos homogeneos, que tambien pueden denominarse inmunoensayos esencialmente libres de reparto. Aspectos de los presentes ensayos detectan de manera selectiva el farmaco original al tiempo que minimizan la reactividad cruzada de un anticuerpo para el farmaco con los metabolitos de tal farmaco. El uso de agentes de solubilidad selectiva que son disolventes organicos, no volatiles, miscibles con agua, en un ensayo libre de reparto de muestra aumenta de manera selectiva la biodisponibilidad del farmaco original con respecto a la de los metabolitos, y aumenta de manera selectiva la accesibilidad del farmaco hidrofobo al anticuerpo de ensayo con respecto a los metabolitos. Los diferenciales de solubilidad reordenados mediante los agentes de solubilidad selectiva anteriores con respecto a disoluciones de reactivo acuosas habituales minimiza la deteccion de metabolitos mas hidrofilos y potencia la deteccion del farmaco hidrofobo original. Es decir, los agentes de solubilidad selectiva aumentan de manera selectiva la biodisponibilidad del farmaco original con respecto a los metabolitos. Por tanto, los agentes de solubilidad selectiva anadidos a un medio de ensayo ajustan la selectividad o biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a medios acuosos que se emplean habitualmente en tales ensayos. Los agentes de solubilidad selectiva tambien pueden potenciar la biodisponibilidad de un anticuerpo hidrofobo que se emplea en un ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los metodos actuales se centran en la mitigacion de resultados de ensayo imprecisos provocados por reactividad cruzada de metabolitos de farmaco con el anticuerpo reactivo empleado en un inmunoensayo. Los presentes metodos tienen aplicacion para ensayos homogeneos totalmente automatizados en los que, antes del ensayo, no hay ninguna extraccion o separacion del farmaco hidrofobo de otros constituyentes de la muestra incluyendo metabolitos de farmaco. En un ensayo de “extraccion no manual”, una muestra tal como una muestra de sangre completa se combina con un agente de hemolisis y un agente de liberacion en un medio y, tras un periodo de incubacion para permitir la hemolisis y liberacion del farmaco de otros constituyentes de la sangre, se anaden reactivos para llevar a cabo un ensayo para detectar el farmaco hidrofobo al medio y se lleva a cabo el ensayo. Se ha encontrado que la biodisponibilidad de un farmaco hidrofobo en un ensayo para detectar el farmaco puede potenciarse con respecto a los metabolitos del farmaco incubando una muestra que se sospecha que contiene el farmaco hidrofobo con un agente de liberacion y un agente de solubilidad selectiva que potencia la disponibilidad del farmaco hidrofobo para su posterior union a un anticuerpo para el farmaco durante un ensayo para detectar la presencia y/o cantidad del farmaco en el que estan presentes otros constituyentes de la muestra.

El termino “farmaco hidrofobo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un farmaco, habitualmente un farmaco terapeutico, en el que el farmaco presenta una caractenstica de absorcion mediante un resto lipofilo tal como, por ejemplo, una lipoprotema, o de solubilidad reducida en un medio polar. La absorcion o ausencia de solubilidad es tal que interfiere con la cuantificacion del farmaco en un ensayo para detectar el farmaco. La interferencia con la cuantificacion del farmaco significa que la capacidad para realizar una determinacion cuantitativa precisa del farmaco en un ensayo se reduce en al menos aproximadamente el 10%, en al menos aproximadamente el 15%, en al menos aproximadamente el 20%, en al menos aproximadamente el 25%, en al menos aproximadamente el 30%, y asf sucesivamente. Un “anticuerpo hidrofobo” es un anticuerpo que presenta una solubilidad reducida en un medio acuoso en comparacion con otros anticuerpos.

Los farmacos inmunosupresores son un ejemplo de farmacos hidrofobos. Los farmacos inmunosupresores son farmacos terapeuticos que se administran a receptores de trasplantes con el fin de ayudar a prevenir el rechazo de aloinjerto de tejido ajeno. Los farmacos inmunosupresores pueden clasificarse de la siguiente manera: glucocorticoides, compuestos citostaticos, anticuerpos, farmacos que actuan sobre inmunofilinas y otros farmacos tales como interferones, protemas de union a INF de opiaceos, micofenolato, FTY720 y similares. Una clase particular de farmacos inmunosupresores comprende aquellos farmacos que actuan sobre inmunofilinas. Las inmunofilinas son un ejemplo de protemas de union espedfica de alta afinidad que tienen importancia fisiologica. Actualmente se conocen dos familias diferenciadas de inmunofilinas: ciclofilinas y macrofilinas, las ultimas de las cuales se unen espedficamente, por ejemplo, a tacrolimus o sirolimus. Los farmacos inmunosupresores que actuan sobre inmunofilina incluyen, por ejemplo, ciclosporina (incluyendo ciclosporina A, ciclosporina B, ciclosporina C, ciclosporina D, ciclosporina E, ciclosporina F, ciclosporina G, ciclosporina H, ciclosporina I), tacrolimus (FK506, PROGRAF®), sirolimus (rapamicina, RaPAMUNE®), everolimus (RAD, CERTICAN®) y asf sucesivamente.

El termino “biodisponibilidad” tal como se usa en el presente documento con respecto a un “farmaco hidrofobo” se refiere a la cantidad de farmaco hidrofobo en una muestra que esta disponible para su medicion tal como, por ejemplo, disponible para la union a un anticuerpo para el farmaco hidrofobo particularmente en un ensayo en el que hay constituyentes en la muestra que va a analizarse tales como metabolitos del farmaco que reaccionan de manera cruzada con un anticuerpo para el farmaco, interfiriendo asf con la precision de un ensayo para detectar el farmaco. Un factor primario que afecta a la biodisponibilidad y que es preocupante en los presentes metodos es la presencia en una muestra de metabolitos de farmaco que se unen a anticuerpo para el farmaco y que hacen que un ensayo para detectar el farmaco sea impreciso, particularmente cuando hay una minima o ninguna separacion de tales metabolitos con respecto al farmaco y minima o ninguna separacion de otros componentes en una muestra. El termino “biodisponibilidad” tal como se usa en el presente documento con respecto a un “anticuerpo hidrofobo” se refiere a la cantidad de anticuerpo hidrofobo que se emplea en un ensayo y que esta disponible para su union a un analito.

Segun los presentes aspectos “biodisponibilidad potenciada” o “potenciacion de la biodisponibilidad” o “potenciar la biodisponibilidad” con respecto a un farmaco hidrofobo significa que hay una potenciacion o aumento en la cantidad del farmaco hidrofobo disponible para su deteccion en una muestra que contiene metabolitos del farmaco que reaccionan de manera cruzada con un anticuerpo para el farmaco. Segun los presentes aspectos “biodisponibilidad potenciada” o “potenciacion de la biodisponibilidad” o “potenciar la biodisponibilidad” con respecto a un anticuerpo hidrofobo significa que hay una potenciacion o aumento en la cantidad del anticuerpo hidrofobo disponible para su union a un analito.

Segun los presentes aspectos “biodisponibilidad potenciada de manera selectiva” o “potenciacion selectiva de la biodisponibilidad” o “potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad” con respecto a un farmaco hidrofobo significa que hay una potenciacion o aumento en la cantidad del farmaco hidrofobo disponible para su union a un anticuerpo para el farmaco hidrofobo y, por tanto, para su deteccion en una muestra, con respecto a la cantidad de metabolitos del farmaco hidrofobo que reaccionan de manera cruzada con un anticuerpo para el farmaco y que estan disponibles para reaccionar de manera cruzada con el anticuerpo para el farmaco hidrofobo.

La frase “al menos” tal como se usa en el presente documento significa que el numero de elementos especificados

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

puede ser igual o superior al numero mencionado. La frase “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento significa que el numero mencionado puede diferir en mas o menos el 10%; por ejemplo, “aproximadamente 5” significa un intervalo de 4,5 a 5,5.

Por consiguiente, tal como se menciono anteriormente, una realizacion de la presente invencion es un metodo para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad de un farmaco hidrofobo con respecto a metabolitos del farmaco hidrofobo. Se forma una combinacion en un medio en el que la combinacion comprende la muestra, un agente de liberacion y un agente de solubilidad selectiva para el farmaco hidrofobo. El agente de liberacion desplaza el farmaco hidrofobo, y sus metabolitos, de restos de union endogenos. El agente de solubilidad selectiva fomenta la igualacion de la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo y la de los metabolitos en el medio. El agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua y esta presente en el medio en una concentracion suficiente para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio.

La muestra que va a analizarse es una que se sospecha que contiene uno o mas analitos de farmacos hidrofobos. La muestra comprende normalmente uno o mas restos de union endogenos que se unen al farmaco hidrofobo. Los restos de union endogenos pueden ser protemas de union que se unen a un farmaco hidrofobo tales como una lipoprotema, por ejemplo, una protema que comprende un resto lipfdico u otras sustancias que se unen al farmaco hidrofobo tales como colesterol, triglicerido, y asf sucesivamente. Las muestras son preferiblemente de seres humanos o animales e incluyen ftquidos biologicos tales como sangre completa, suero, plasma, esputo, ftquido linfatico, semen, mucosa vaginal, heces, orina, ftquido cerebroespinal, saliva, deposiciones, ftquido cefalorraqrndeo, lagrimas, mucosa y similares; tejido biologico tal como cabello, piel, secciones o tejidos escindidos de organos u otras partes del cuerpo; y asf sucesivamente. La muestra es sangre completa. La muestra no se trata previamente para eliminar tales restos de union endogenos.

La muestra puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con un ensayo; generalmente se emplea un medio acuoso. La naturaleza del medio se comenta con mas detalle a continuacion. Un agente de liberacion y un agente de solubilidad selectiva para el farmaco hidrofobo segun los presentes metodos se combinan en el medio, que tambien puede incluir un agente hemolftico.

Agente hemolftico

Un agente hemolftico es un compuesto o una mezcla de compuestos que alteran la integridad de las membranas de globulos rojos liberando asf el contenido intracelular de las celulas. Se conocen numerosos agentes hemoftticos en la tecnica. Los agentes hemoftticos incluyen, por ejemplo, detergentes no ionicos, detergentes anionicos, detergentes anfoteros, disoluciones acuosas de baja fuerza ionica (disoluciones hipotonicas), agentes bacterianos, anticuerpos que provocan lisis dependiente del complemento, y similares. Los detergentes no ionicos que pueden emplearse como agente hemolftico incluyen tanto detergentes sinteticos como detergentes naturales. Los ejemplos de detergentes sinteticos incluyen TRITON™ X-100, TRITON™ N-101, TRITON™ X-114, TRITON™ X-405, TRITON ™ SP-135, TWEEN® 20 (monolaurato de polioxietilen (20)-sorbitano), TWEEN® 80 (monooleato de polioxietilen (20)-sorbitano), DOWFAX®, ZONYL®, palmitato de pentaeritritilo, ADOGEN® 464, tensioactivo ALKANOL® 6112, 1,2-butoxilato-bloque-etoxilato de alcohol aftlico HLB 6, BRIJ®, tetrakis(etoxilato-bloque- propoxilato)tetraol de etilendiamina, IGEPAL®, MERPOL®, poli(etilenglicol), etil eter de 2-

[etil[(heptadecafluorooctil)sulfonil]amino], polietileno-bloque-poli(etilenglicol), tetraoleato de polioxietilen-sorbitano, hexaoleato de polioxietilen-sorbitol, tErGITOL® NP-9, GA-FAC ® (RHODAFAC®, un ester fosfato de alquil- polioxietilenglicol tal como, por ejemplo, fosfato de alfa-dodecil-omegahidroxipoli(oxi-1,2-etanediilo)), y EP110® y similares. Los detergentes que se producen de manera natural que pueden emplearse como agente hemolftico incluyen, por ejemplo, saponinas, acido graso neutralizado con sodio o potasio, fosfoftpidos neutralizados, diacilglicerol, fosfatidilserina neutralizada, fosfatidato, fosfatidiletanoliamina neutralizada, fosfatidil-colina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, sal biliar, colesterol no esterificado, esfingosina neutralizada, ceramida y similares. Tambien pueden emplearse combinaciones de uno o mas detergentes sinteticos o uno o mas detergentes que se producen de manera natural y combinaciones de detergentes sinteticos y detergentes que se producen de manera natural.

La naturaleza y cantidad o concentracion de agente hemolftico empleado depende de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del farmaco hidrofobo, la naturaleza del resto de los componentes reactivos, las condiciones de reaccion y similares. La cantidad del agente hemolftico es al menos suficiente para provocar la lisis de globulos rojos para liberar el contenido de las celulas. En algunos aspectos la cantidad del agente hemolftico es de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, y asf sucesivamente (el porcentaje es en peso/volumen).

Agente de liberacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El agente de liberacion desplaza el farmaco hidrofobo de restos de union endogenos. El agente de liberacion puede desplazar, y en muchos casos desplaza metabolitos del farmaco hidrofobo de restos de union endogenos. En muchos aspectos el agente de liberacion tiene alta afinidad de union a las protemas de union endogenas de modo que desplaza facilmente el farmaco hidrofobo, y sus metabolitos, de protemas de union endogenas. Ademas, el agente de liberacion no se une en ningun grado significativo a un anticuerpo para el farmaco que se usa en el ensayo. Mediante la frase “no se une en ningun grado significativo” quiere decirse que el grado de union debe ser lo suficientemente bajo de modo que puede llevarse a cabo un ensayo preciso para detectar el farmaco. El agente de liberacion puede ser cualquier resto, ya sea un compuesto individual o una mezcla de compuestos, que logra el resultado deseado de desplazamiento sin union significativa a un anticuerpo de ensayo. En muchos aspectos el agente de liberacion desplaza el farmaco hidrofobo y su metabolito de sustancias de union endogenas para hacer que tanto el farmaco hidrofobo como los metabolitos esten accesibles de manera sustancialmente igual para un anticuerpo para el farmaco hidrofobo. “Accesible de manera sustancialmente igual” significa que la cantidad de farmaco hidrofobo disponible para su union a anticuerpo no vana en ningun grado significativo con respecto a la cantidad total de metabolitos del farmaco hidrofobo que estan disponibles para su union al anticuerpo. La cantidad de metabolitos disponibles para su union a un anticuerpo para el farmaco hidrofobo depende de consideraciones tales como, por ejemplo, la afinidad de union de metabolitos particulares para el anticuerpo para el farmaco hidrofobo. Los porcentajes anteriores se basan en la suposicion de que los metabolitos de farmaco tienen aproximadamente la misma afinidad de union por el anticuerpo para el farmaco hidrofobo que el propio farmaco hidrofobo. De lo contrario, los porcentajes anteriores deben ajustarse basandose en la afinidad de union real de los metabolitos de farmaco hidrofobo.

En algunos aspectos el agente de liberacion es un analogo, incluyendo analogos estructurales, del farmaco hidrofobo. Un analogo de farmaco hidrofobo es un farmaco modificado que puede desplazar el farmaco hidrofobo analogo de una protema de union pero no compite en ningun grado sustancial por un receptor tal como un anticuerpo para el farmaco hidrofobo. La modificacion proporciona medios para unir un analogo de farmaco hidrofobo a otra molecula. El analogo de farmaco hidrofobo se diferenciara habitualmente del farmaco hidrofobo en mas de una sustitucion de un hidrogeno por un enlace que une el analogo de farmaco a un nucleo o marcador, pero no es necesario. El analogo de farmaco hidrofobo puede ser, por ejemplo, el farmaco hidrofobo conjugado con otra molecula a traves de un grupo de union, y asf sucesivamente. Para farmacos hidrofobos que comprenden una funcionalidad hidroxilo o acido carboxflico, el agente de liberacion puede ser un ester del farmaco hidrofobo, que tiene una alta afinidad de union para protemas de union endogenas con respecto al farmaco hidrofobo que va a detectarse y que no tiene ninguna afinidad de union significativa para un anticuerpo para el farmaco hidrofobo. Por ejemplo, en una determinacion para detectar sirolimus, puede emplearse un ester de sirolimus como agente de liberacion siempre que cumpla los requisitos anteriores. Un analogo estructural es un resto que tiene caractensticas estructurales o espaciales iguales o similares a las del farmaco hidrofobo de tal manera que el analogo estructural logra un resultado igual o similar al del analogo del farmaco hidrofobo. El analogo estructural puede ser, por ejemplo, otro compuesto que esta relacionado con el farmaco hidrofobo. Por ejemplo, en una determinacion para detectar sirolimus, puede emplearse un ester de tacrolimus como el agente de liberacion. El ester puede ser, por ejemplo, un carbamato, un carbonato, un ester de un acido carboxflico C1 a Ca, y similares. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.186.518. Otros ejemplos de agentes de liberacion incluyen [Thr2,Leu5,D-Hivs,Leuio]- ciclosporina A para ciclosporina A, FK506 para sirolimus, sirolimus para FK506, y similares. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.187.547.

La concentracion del agente de liberacion en el medio es la suficiente para lograr el resultado deseado de desplazar el farmaco hidrofobo, y en muchos casos los metabolitos del farmaco hidrofobo, de restos de union endogenos para hacer que el farmaco y los metabolitos esten accesibles para su union a un anticuerpo para el farmaco tal como se comento anteriormente. La cantidad o concentracion del agente de liberacion empleado depende de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del farmaco hidrofobo, la naturaleza de los metabolitos de farmaco, la naturaleza de otros componentes reactivos, las condiciones de reaccion y similares. En algunos aspectos, la cantidad del agente de liberacion es de aproximadamente el 0,000001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,2%, y asf sucesivamente (el porcentaje es en peso/volumen).

Agente de solubilidad selectiva

El agente de solubilidad selectiva fomenta la igualacion de la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo y la de los metabolitos en el medio. La naturaleza del agente de solubilidad selectiva es tal como para proporcionar un medio casi hidrofobo para disolver farmaco y/o metabolitos de farmaco, que se liberan de restos de union endogenos mediante el agente de liberacion. Al usar el agente de solubilidad selectiva, el farmaco y el metabolito se vuelven accesibles de manera similar para el anticuerpo de ensayo, dando como resultado una reduccion de la reactividad cruzada de metabolito que de lo contrario sena superior debido a su menor union a protemas y mayor solubilidad en una disolucion acuosa pura en comparacion con el farmaco original. La presencia de un agente de solubilidad selectiva segun los aspectos en el presente documento garantiza que tanto el farmaco liberado como los metabolitos se disuelven de manera sustancialmente igual en el medio de tratamiento previo y/o en el medio de ensayo. En

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

algunos aspectos el agente de solubilidad selectiva potencia la biodisponibilidad de un anticuerpo hidrofobo que se emplea en un ensayo.

El agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua y es habitualmente un lfquido a temperatura ambiente (de aproximadamente 18°C a aproximadamente 23°C). El agente de solubilidad selectiva debe comprender una region hidrofila o polar en la molecula para ser miscible con agua y una region hidrofoba o no polar de modo que pueda disolver farmacos hidrofobos y, por tanto, tener una capacidad de disolucion de farmaco hidrofobo. No obstante, la polaridad global es tal que el disolvente organico es miscible con agua. El disolvente organico es miscible con agua cuando puede disolverse en agua en todas las proporciones a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 50°C. Los disolventes organicos que pueden usarse como agente de solubilidad selectiva tienen solubilidad ilimitada en un medio acuoso.

Tal como se menciono anteriormente, el agente de solubilidad selectiva, cuando se anade al medio de tratamiento previo o medio de ensayo, ayuda a disolver farmacos hidrofobos en el medio. El grado en el cual se disuelve un farmaco hidrofobo en un medio que contiene el agente de solubilidad selectiva frente al mismo medio en ausencia del agente de solubilidad selectiva es superior a aproximadamente el 80%, o superior a aproximadamente el 85%, o superior a aproximadamente el 90%, o superior a aproximadamente el 95%, o aproximadamente 100% o superior. Por ejemplo, si se disuelven 2 ng/ml de farmaco hidrofobo en un medio sin el agente de solubilidad selectiva y se disuelven 4 ng/ml de farmaco hidrofobo en el mismo medio que contiene la solubilidad selectiva en el intervalo apropiado, el aumento sera del 100%.

El termino “no volatil” significa que el disolvente organico tiene una presion de vapor de tan solo, o inferior a, la de agua pura a una temperatura dada, y, tras la combinacion con agua en un porcentaje segun los presentes metodos, el medio resultante tiene una presion de vapor, a una temperatura dada, de tan solo, o inferior a, la de agua pura. Por ejemplo, la presion de vapor de DMSO a 8°C es de 21,7 Pa y la presion de vapor de agua a 8°C es de 1044 Pa; la presion de vapor de DMSO al 15% en agua es de 978 Pa, lo cual es inferior a la del agua pura. Por otro lado, el etanol, por ejemplo, no sera un agente de solubilidad selectiva adecuado segun los presentes metodos porque su presion de vapor a 8°C es de 2754 Pa, muy superior a la del agua pura. La presion de vapor de una mezcla de etanol al 10% en agua tiene una presion de vapor de 1115 Pa, lo cual es superior a la del agua pura.

Aspectos del agente de solubilidad selectiva incluyen dimetilsulfoxido y/o 1-metoxi-2-propanol.

La concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es suficiente para lograr la potenciacion selectiva de la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo, con respecto a la de los metabolitos, en el medio. La potenciacion selectiva de la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de sus metabolitos se logra cuando la cantidad de farmaco hidrofobo que puede detectarse se aumenta con respecto a la obtenida en ausencia del agente de solubilidad selectiva en al menos aproximadamente el 50%, en al menos aproximadamente el 75%, en al menos aproximadamente el 90%, en al menos aproximadamente el 100%, en al menos aproximadamente el 125%, en al menos aproximadamente el 150%, en al menos aproximadamente el 175%, en al menos aproximadamente el 200%, en al menos aproximadamente el 225%, en al menos aproximadamente el 250%, en al menos aproximadamente el 275%, en al menos aproximadamente el 300%, en al menos aproximadamente el 325%, en al menos aproximadamente el 350%, en al menos aproximadamente el 375%, en al menos aproximadamente el 400%, y asf sucesivamente. En otras palabras, la potenciacion selectiva de la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de sus metabolitos se logra cuando la cantidad de farmaco hidrofobo que puede detectarse se aumenta con respecto a la obtenida en ausencia del agente de solubilidad selectiva en de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 veces, o de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 4 veces, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 veces, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5 veces, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 veces, o de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 3,5 veces, o de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 2,5 veces, o de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 2 veces, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3,5 veces, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2,5 veces, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, y asf sucesivamente.

La cantidad o concentracion de agente de solubilidad selectiva empleado depende de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del farmaco hidrofobo, la naturaleza del disolvente organico, la naturaleza de otros componentes reactivos, las condiciones de reaccion, si el medio es un medio de tratamiento previo o un medio de ensayo, y similares. En algunos aspectos la cantidad del agente de solubilidad selectiva en un medio de tratamiento previo es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 11% a aproximadamente el 25%,

de aproximadamente el 12% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 13% a aproximadamente el 19%,

de aproximadamente el 14% a aproximadamente el 18%, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 17%,

de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 25%, de aproximadamente el 16% a aproximadamente el 24%,

de aproximadamente el 17% a aproximadamente el 23%, de aproximadamente el 18% a aproximadamente el 22%,

de aproximadamente el 19% a aproximadamente el 21%, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 20%,

de aproximadamente el 16% a aproximadamente el 19%, y asf sucesivamente (volumen con respecto a volumen). En algunos aspectos la cantidad del agente de solubilidad selectiva en un medio de ensayo es de aproximadamente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

el 1,0% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 2,0% a aproximadamente el 9,0%, de aproximadamente el 2,1% a aproximadamente el 8,0%, de aproximadamente el 2,2% a aproximadamente el 7,0%, de aproximadamente el 2,3% a aproximadamente el 6,0%, de aproximadamente el 2,4% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 2,5% a aproximadamente el 4,5%, de aproximadamente el 3,0% a aproximadamente el 6,0%, de aproximadamente el 3,1% a aproximadamente el 5,0%, de aproximadamente el 3,2% a aproximadamente el 4,9%, de aproximadamente el 3,3% a aproximadamente el 4,8%, de aproximadamente el 3,4% a aproximadamente el 4,7%, de aproximadamente el 3,5% a aproximadamente el 4,5%, y asf sucesivamente (volumen con respecto a volumen).

Tratamiento previo de muestra

La muestra, un agente hemolttico (si se emplea), el agente de liberacion y el agente de solubilidad selectiva se combinan en un medio, que, tal como se menciono anteriormente, es habitualmente un medio acuoso y se denomina en el presente documento medio de tratamiento previo. Todo lo anterior puede combinarse simultaneamente en el medio o uno o mas de los reactivos anteriores pueden anadirse secuencialmente en concentraciones tal como se comento anteriormente. El medio tambien puede comprender uno o mas conservantes tal como se conoce en la tecnica tales como, por ejemplo, azida de sodio, sulfato de neomicina, PROCLIN® 300, estreptomicina, y similares. El pH para el medio estara habitualmente en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, mas habitualmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5.

Pueden usarse diversos tampones para lograr el pH deseado y mantener el pH durante el periodo de incubacion. Los tampones ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris, barbital, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS, BICINE y similares. El medio tambien puede comprender agentes para prevenir la formacion de coagulos de sangre. Tales agentes se conocen bien en la tecnica e incluyen, por ejemplo, EDTA, EGTA, citrato, heparina y similares. Pueden emplearse diversos materiales auxiliares en los metodos anteriores. Por ejemplo, ademas de tampones y conservantes, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. Todos los materiales anteriores estan presentes en una concentracion o cantidad suficiente para lograr el efecto o la funcion deseados.

El medio se incuba en condiciones para hemolizar celulas en la muestra, para liberar el farmaco hidrofobo y sus metabolitos de restos de union endogenos y para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo. El periodo de incubacion puede ser de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente

1 segundo a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente

2 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 1 segundo a

aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 10 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a

aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de

aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a

aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de

aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 5 segundos a

aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 10 segundos, o de aproximadamente 10 segundos a

aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de

aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a

aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de

aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 10 segundos a

aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 20 segundos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a

aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de

aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a

aproximadamente 2 minutos, o de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de

aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a

aproximadamente 3 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 2 minutos, o de

aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, o similares.

La temperatura durante la incubacion es habitualmente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 45°C, o de

aproximadamente 10°C a aproximadamente 35°C, o de aproximadamente 10°C a aproximadamente 25°C, o de

aproximadamente 15°C a aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 35°C, o de

aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C, o de

aproximadamente 20°C a aproximadamente 35°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C, o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

similares.

Descripcion general de ensayos para detectar un farmaco hidrofobo

Tras el periodo de incubacion anterior, se anaden reactivos para determinar la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra al medio. La naturaleza de los reactivos depende del tipo particular de ensayo que va a realizarse. En general, el ensayo es un metodo para la determinacion o medicion de la presencia y/o cantidad de un analito hidrofobo. A continuacion se comentan diversos metodos de ensayo a modo de ilustracion y no de limitacion.

En muchos aspectos los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el farmaco hidrofobo. Mediante la frase “anticuerpo para el farmaco hidrofobo” quiere decirse un anticuerpo que se une espedficamente al farmaco hidrofobo y no se une en ningun grado significativo a otras sustancias que alteranan el analisis para detectar el farmaco hidrofobo.

Los anticuerpos espedficos para un farmaco hidrofobo para su uso en inmunoensayos pueden ser monoclonales o policlonales. Tales anticuerpos pueden prepararse mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica tales como inmunizacion de un huesped y recogida de sueros (policlonal) o mediante preparacion de lmeas celulares hubridas continuas y recogida de las protemas secretadas (monoclonal) o mediante clonacion y expresion de secuencias de nucleotidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos para las secuencias de aminoacidos requeridas para la union espedfica de anticuerpos naturales.

Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab', y similares. Ademas, pueden usarse agregados, polfmeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado siempre que se mantenga la afinidad de union para una molecula particular.

Se obtiene antisuero que contiene anticuerpos (policlonal) mediante tecnicas bien establecidas que implican inmunizacion de un animal, tal como un conejo, cobaya o cabra, con un inmunogeno apropiado y obtencion de antisueros de la sangre del animal inmunizado tras un periodo de espera apropiado. Se proporcionan revisiones del estado de la tecnica por Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., EE.UU., 1976), Butler, J. Immunol. Met. 7: 1-24 (1975); Broughton y Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).

Tambien pueden obtenerse anticuerpos mediante tecnicas de hibridacion de celulas somaticas, denominandose tales anticuerpos comunmente anticuerpos monoclonales. Pueden producirse anticuerpos monoclonales segun las tecnicas convencionales de Kohler y Milstein, Nature 265:495-497, 1975. Se encuentran revisiones de tecnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981).

En otro enfoque para la preparacion de anticuerpos, la secuencia que codifica para sitios de union a anticuerpo puede escindirse del ADN cromosomico e insertarse en un vector de clonacion, que puede expresarse en bacterias para producir protemas recombinantes que tienen los sitios de union a anticuerpo correspondientes.

Tal como se comento anteriormente, un anticuerpo seleccionado para su uso en un inmunoensayo para detectar un farmaco hidrofobo, por ejemplo, debe unirse de manera espedfica y preferible al farmaco hidrofobo y sus metabolitos farmaceuticamente activos con respecto a otros ligandos tales como otros metabolitos o farmacos relacionados. Por ejemplo, un anticuerpo para tacrolimus debe unirse de manera espedfica y preferible a tacrolimus con respecto, por ejemplo, a rapamicina. En general, un anticuerpo debe poder distinguir entre un farmaco hidrofobo con respecto a un segundo farmaco hidrofobo. Al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, o al menos aproximadamente 20 veces, del primer farmaco hidrofobo se unira al anticuerpo si el anticuerpo se combina con una muestra que contiene el farmaco hidrofobo. Aunque la union tambien depende de la concentracion relativa del farmaco hidrofobo, la union sera superior para el primer farmaco hidrofobo si la constante de union para el primer farmaco hidrofobo es mayor que la constante de union para el segundo farmaco hidrofobo, al menos aproximadamente 10 veces superior o al menos aproximadamente 50 veces superior y hasta 1000 veces o superior.

Se incluyen otros reactivos en el medio de ensayo dependiendo de la naturaleza del ensayo que va a llevarse a cabo. Tales ensayos implican habitualmente reacciones entre parejas de union tales como un analito de farmaco hidrofobo y un anticuerpo correspondiente o la union entre un anticuerpo y una pareja de union correspondiente tal como un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo. Por consiguiente, la pareja de union puede ser una protema, que puede ser un anticuerpo o un antfgeno. La pareja de union puede ser un miembro de un par de union espedfica (“miembro de sbp”), que es una de dos moleculas diferentes, que tienen una zona en la superficie o en una cavidad que se unen espedficamente a, y se define de ese modo como complementaria a, una organizacion espacial y polar particular de la otra molecula. Los miembros del par de union espedfica seran habitualmente miembros de un par inmunologico tal como antfgeno-anticuerpo, aunque pares de union espedfica tales como

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, enzima-sustrato, duplex de acido nucleico, IgG-protema A, pares de polinucleotido tales como ADN-ADN, ADN-ARN, y similares no son pares inmunologicos pero se incluyen dentro del alcance de miembro de sbp.

Por consiguiente, la union espedfica implica el reconocimiento espedfico de una de dos moleculas diferentes por la otra en comparacion con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moleculas. Por otro lado, la union no espedfica implica la union no covalente entre moleculas que es relativamente independiente de las estructuras de superficie espedficas. La union no espedfica puede resultar de diversos factores incluyendo interacciones hidrofobas entre moleculas. Parejas de union preferidas son anticuerpos.

Pueden emplearse muchos tipos de inmunoensayos en los presentes metodos para determinar la presencia y/o cantidad de un analito de farmaco hidrofobo en una muestra que se sospecha que contiene tales analitos. Los inmunoensayos pueden implicar reactivos marcados o no marcados.

Los inmunoensayos que implican reactivos no marcados comprenden habitualmente la formacion de complejos relativamente grandes que implican uno o mas anticuerpos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, metodos de inmunoprecipitacion y aglutinacion y tecnicas de dispersion de la luz correspondientes tales como, por ejemplo, nefelometna y turbidimetna, para la deteccion de complejos de anticuerpos. Los inmunoensayos marcados incluyen inmunoensayos enzimaticos, inmunoensayos de polarizacion de fluorescencia, radioinmunoensayo, ensayo de inhibicion, luminiscencia inducida, ensayo de canalizacion de oxfgeno fluorescente, y asf sucesivamente.

En muchos de los ensayos comentados en el presente documento, se emplea un marcador; el marcador es habitualmente parte de un sistema de produccion de senal (“sps”). La naturaleza del marcador depende del formato de ensayo particular. Un sps incluye habitualmente uno o mas componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable, que genera una senal detectable que esta relacionada con la cantidad de marcador unido y/o no unido, es decir la cantidad de marcador unido o no unido al farmaco hidrofobo que esta detectandose o a un agente que refleja la cantidad del farmaco hidrofobo que va a detectarse. El marcador es cualquier molecula que produce o puede inducirse que produzca una senal, y puede ser, por ejemplo, un agente que fluoresce, radiomarcador, enzima, agente con quimioluminiscencia o fotosensibilizador. Por tanto, la senal se detecta y/o se mide detectando la actividad enzimatica, luminiscencia, absorbancia de luz o radiactividad, y asf sucesivamente, segun sea el caso.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”) y peroxidasa del rabano; ribozima; un sustrato para una replicasa tal como QB replicasa; promotores; colorantes; agentes que fluorescen, tales como fluorescema, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehfdo y fluorescamina; complejos tales como los preparados a partir de CdSe y ZnS presentes en nanocristales semiconductores conocidos como puntos cuanticos; agentes con quimioluminiscencia tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos enzimaticos; radiomarcadores tales como 125I, 131I, 14C, 3H, 57Co y 75Se; partfculas tales como partfculas de latex, partfculas de carbono, partfculas metalicas incluyendo partfculas magneticas, por ejemplo, partfculas de dioxido de cromo (CrO2), y similares; sol metalica; cristalito; liposomas; celulas, etc., que pueden marcarse adicionalmente con un colorante, catalizador u otro grupo detectable. Se dan a conocer enzimas y coenzimas adecuadas en Litman, et al., patente estadounidense n.° 4.275.149, columnas 19-28, y Boguslaski, et al., patente estadounidense n.° 4.318.980, columnas 10-14; se dan a conocer agentes que fluorescen y agentes con quimioluminiscencia adecuados en Litman, et al., patente estadounidense n.° 4.275.149, en las columnas 30 y 31.

El marcador puede producir directamente una senal y, por tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una senal. Numerosas moleculas organicas, por ejemplo, agentes que fluorescen, pueden absorber luz ultravioleta y visible, en las que la absorcion de luz transfiere energfa a estas moleculas y las sube a un nivel energetico excitado. Despues se disipa esta energfa absorbida mediante emision de luz a una segunda longitud de onda. Otros marcadores que producen directamente una senal incluyen isotopos radiactivos y colorantes.

Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una senal, y el sistema de produccion de senal incluira entonces todos los componentes requeridos para producir una senal medible. Tales otros componentes pueden incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimaticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, eliminadores, iones metalicos y una sustancia de union espedfica requerida para la union de sustancias que generan senales. Puede encontrarse una discusion detallada de sistemas de produccion de senales adecuados en Ullman, et al., patente estadounidense n.° 5.185.243, columnas 11-13.

El marcador u otros miembros de sps pueden unirse a un soporte. Un derivado o analogo de farmaco hidrofobo puede unirse a un soporte solido de cualquier manera conocida en la tecnica, siempre unicamente que la union no interfiera sustancialmente con la capacidad de los analogos para unirse a un anticuerpo. En algunos aspectos, el derivado o analogo de farmaco hidrofobo puede estar recubierto o unido de manera covalente directamente a la fase solida o puede tener capas de una o mas moleculas de portador tales como poliaminoacidos incluyendo protemas tales como albuminas sericas o inmunoglobulinas, o polisacaridos (hidratos de carbono) tales como, por ejemplo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

dextrano o derivados de dextrano. Tambien pueden usarse grupos de union para acoplar de manera covalente el soporte solido y el farmaco hidrofobo. Tambien son posibles otros metodos de union de los derivados de farmaco hidrofobo. Por ejemplo, un soporte solido puede tener un recubrimiento de un aglutinante para una molecula pequena tal como, por ejemplo, avidina, un anticuerpo, etc., y una molecula pequena tal como, por ejemplo, biotina, hapteno, etc., puede unirse al derivado de farmaco hidrofobo o viceversa. La union de componentes a la superficie de un soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente y puede lograrse mediante tecnicas bien conocidas, comunmente disponibles en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, “Immobilized Enzymes”, Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970).

El soporte puede estar compuesto por un material organico o inorganico, solido o lfquido, insoluble en agua, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de varias formas, tales como partfcula, incluyendo perla, pelfcula, membrana, tubo, pocillo, tira, vastago, superficies planas tales como, por ejemplo, placa, papel, etc., fibra, y similares. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede poder suspenderse o no en el medio en el que se emplea. Ejemplos de soportes que pueden suspenderse son materiales polimericos tales como latex, bicapas lipfdicas o liposomas, gotitas de aceite, celulas e hidrogeles, partfculas magneticas, y similares. Otras composiciones de soporte incluyen polfmeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon, poli(butirato de vinilo), etc.; usados o bien en sf mismos o bien junto con otros materiales.

El soporte puede ser una partfcula. Las partfculas deben tener un diametro promedio de al menos aproximadamente 0,02 micrometros y no mas de aproximadamente 100 micrometros. En algunos aspectos las partfculas tienen un diametro promedio de desde aproximadamente 0,05 micrometros hasta aproximadamente 20 micrometros, o desde aproximadamente 0,3 micrometros hasta aproximadamente 10 micrometros. La partfcula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad que se aproxima a la del agua, generalmente de desde aproximadamente 0,7 g/ml hasta aproximadamente 1,5 g/ml, y compuesta por material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partfculas pueden ser materiales biologicos tales como celulas y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus, E. coli, virus, y similares. Las partfculas tambien pueden ser partfculas compuestas por polfmeros organicos e inorganicos, liposomas, partfculas de latex, partfculas magneticas o no magneticas, vesfculas de fosfolfpidos, quilomicrones, lipoprotemas, y similares. En algunas realizaciones, las partfculas son partfculas de dioxido de cromo (cromo) o partfculas de latex.

Las partfculas de polfmero pueden formarse mediante polfmeros de adicion o condensacion. Las partfculas seran facilmente dispersables en un medio acuoso y pueden ser adsorbentes o funcionalizables para permitir la conjugacion con un analogo de farmaco hidrofobo, o bien directa o bien indirectamente a traves de un grupo de union. Las partfculas tambien pueden derivarse de materiales que se producen de manera natural, materiales que se producen de manera natural que se modifican sinteticamente y materiales sinteticos. Entre los polfmeros organicos de interes particular estan los polisacaridos, particularmente polisacaridos reticulados, tales como agarosa, que esta disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa, almidon, y similares; polfmeros de adicion, tales como poliestireno, poli(alcohol vimlico), homopolfmeros y copolfmeros de derivados de acrilato y metacrilato, particularmente esteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres, y similares.

El marcador y/u otro miembro de sps puede unirse a un miembro de sbp u otra molecula. Por ejemplo, el marcador puede unirse de manera covalente a un miembro de sbp tal como, por ejemplo, un anticuerpo; un receptor para un anticuerpo, un receptor que puede unirse a una molecula pequena conjugada con un anticuerpo, o un analogo de ligando. La union del marcador al miembro de sbp pude lograrse mediante reacciones qmmicas que dan como resultado la sustitucion de un atomo de hidrogeno del marcador por un enlace con el miembro de sbp o puede incluir un grupo de union entre el marcador y el miembro de sbp. Otros miembros de sps tambien pueden unirse de manera covalente a miembros de sbp. Por ejemplo, dos miembros de sps tales como un agente que fluoresce y un agente de extincion pueden unirse cada uno a un anticuerpo diferente que forma un complejo espedfico con el analito. La formacion del complejo pone el agente que fluoresce y el agente de extincion en estrecha proximidad, permitiendo, por tanto, que el agente de extincion interaccione con el agente que fluoresce para producir una senal. En la tecnica se conocen bien metodos de conjugacion. Vease, por ejemplo, Rubenstein, et al., patente estadounidense n.° 3.817.837.

Enzimas de particular interes como protemas marcadoras son enzimas redox, particularmente deshidrogenasas tales como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, etc., y enzimas que implican la produccion de peroxido de hidrogeno y el uso del peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor de colorante para dar un colorante. Las combinaciones particulares incluyen sacarido oxidasas, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, o compuesto heterodclico oxidasas, tales como uricasa y xantino oxidasa, acoplada con una enzima que emplea el peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor de colorante, es decir, una peroxidasa tal como peroxidasa del rabano, lactoperoxidasa o microperoxidasa. En la tecnica se conocen combinaciones de enzimas adicionales. Cuando se usa una unica enzima como marcador, otras enzimas pueden encontrar uso tales como hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas, preferiblemente hidrolasas tales como fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Alternativamente, pueden usarse luciferasas tales como luciferasa de la luciernaga y luciferasa bacteriana.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las coenzimas ilustrativas que encuentran uso incluyen NAD[H], NADP[H], fosfato de piridoxal, FAD[H], FMN[H], etc., habitualmente coenzimas que implican reacciones de ciclizacion. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.318.980.

Con protemas marcadoras tales como, por ejemplo, enzimas, el intervalo de peso molecular sera de desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 600.000 o desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 300.000 de peso molecular. Habitualmente hay al menos aproximadamente 1 analogo de farmaco hidrofobo por aproximadamente 200.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 150.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 100.000 de peso molecular, o al menos aproximadamente 1 por aproximadamente 50.000 de peso molecular, y asf sucesivamente. En el caso de enzimas, el numero de grupos de analogo de farmaco hidrofobo es habitualmente de desde 1 hasta aproximadamente 20, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.

El termino “marcadores distintos de poliaminoacidos” incluye aquellos marcadores que no son protemas (por ejemplo, enzimas). El marcador distinto de poliaminoacidos puede detectarse directamente o puede detectarse mediante una reaccion de union espedfica que produce una senal detectable. Los marcadores distintos de poliaminoacidos incluyen, por ejemplo, radioisotopos, compuestos luminiscentes, soportes, por ejemplo, partmulas, placas, perlas, etc., polinucleotidos, y similares. Mas particularmente, el marcador distinto de poliaminoacidos puede ser isotopico o no isotopico, habitualmente no isotopico, y puede ser un polinucleotido que codifica para un catalizador, promotor, colorante, coenzima, sustrato enzimatico, grupo radiactivo, una molecula organica pequena (incluyendo, por ejemplo, biotina, moleculas fluorescentes, moleculas quimioluminiscentes, y similares), secuencia de polinucleotido amplificable, un soporte tal como, por ejemplo, una partmula tal como partmula de latex o carbono o partmula de dioxido de cromo (cromo) o similares, sol de metal, cristalito, liposoma, celula, etc., que puede estar adicionalmente marcada o no con un colorante, catalizador u otro grupo detectable, y similares.

Un grupo general de inmunoensayos que pueden emplearse incluye inmunoensayos que usan una concentracion limitada de anticuerpo. Otro grupo de inmunoensayos implica el uso de un exceso de uno o mas de los reactivos principales tal como, por ejemplo, un exceso de un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor. Otro grupo de inmunoensayos son ensayos homogeneos libres de separacion en los que los reactivos marcados modulan la senal de marcador tras reacciones de union de farmaco hidrofobo-anticuerpo. Otro grupo de ensayos incluye ensayos de competencia limitados por reactivo de anticuerpo marcado para detectar farmaco hidrofobo que evitan el uso de haptenos marcados problematicos. En este tipo de ensayo, el analito de farmaco hidrofobo inmovilizado en fase solida esta presente en una cantidad constante, limitada. El reparto de un marcador entre el analito de farmaco hidrofobo inmovilizado y analito de farmaco hidrofobo libre depende de la concentracion de analito en la muestra.

Los ensayos pueden realizarse o bien sin separacion (homogeneos) o bien con separacion (heterogeneos) de cualquiera de los componentes o productos de ensayo. Los inmunoensayos homogeneos se muestran a modo de ejemplo mediante el ensayo EMIT® (Syva Company, San Jose, CA) dado a conocer en Rubenstein, et al., patente estadounidense n.° 3.817.837, columna 3, lmea 6 a columna 6, lmea 64; metodos de inmunofluorescencia tales como los dados a conocer en Ullman, et al., patente estadounidense n.° 3.996.345, columna 17, lmea 59 a columna 23, lmea 25; inmunoensayos de canalizacion de enzimas (“ECIA”) tales como los dados a conocer en Maggio, et al., patente estadounidense n.° 4.233.402, columna 6, lmea 25 a columna 9, lmea 63; el inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia (“FPIA”) tal como se da a conocer, por ejemplo, entre otros, en la patente estadounidense n.° 5.354.693; y asf sucesivamente.

Otros inmunoensayos enzimaticos son el inmunoensayo mediado por modulador enzimatico (“EMMIA”) dado a conocer por Ngo y Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288; el inmunoensayo de fluorescencia marcado con sustrato (“SLFIA”) dado a conocer por Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904; los inmunoensayos de donador enzimatico combinado (“CEDIA”) dados a conocer por Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240; inmunoensayos marcados con partmulas homogeneos tales como inmunoensayos de inhibicion turbidimetrica potenciada por partmulas (“PETINIA”), inmunoensayo turbidimetrico potenciado por partmulas (“PETIA”), etc.; y similares.

Otros ensayos incluyen el inmunoensayo de partmulas de sol (“SPIA”), el inmunoensayo de colorante dispersado (“DIA”); el metaloinmunoensayo (“MIA”); los inmunoensayos de membrana enzimatica (“EMIA”); luminoinmunoensayos (“LIA”); y asf sucesivamente. Otros tipos de ensayos incluyen ensayos de inmunosensores que implican la monitorizacion de los cambios en las propiedades opticas, acusticas y electricas de una superficie inmovilizada con anticuerpo tras la union de un farmaco hidrofobo. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunosensores opticos, ensayos de inmunosensores acusticos, ensayos de inmunosensores de semiconductor, ensayos de inmunosensores de transductor electroqmmico, ensayos de inmunosensores potenciometricos, ensayos de electrodos amperometricos, y similares.

En unos aspectos, el ensayo es un inmunoensayo de luminiscencia inducida, que se describe en la patente estadounidense n.° 5.340.716 (Ullman, et al.) titulada “Assay Method Utilizing Photoactivated Chemiluminiscent

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Label” (“ensayo de luminiscencia inducida”). En un enfoque, el ensayo usa una partfcula que incorpora un fotosensibilizador y una partfcula de marcador que incorpora un compuesto quimioluminiscente. La partfcula de marcador se conjuga con un miembro de sbp, por ejemplo, un anticuerpo para el farmaco hidrofobo que puede unirse al analito de farmaco hidrofobo para formar un complejo, o a un segundo miembro de sbp para formar un complejo, en relacion con la presencia del analito de farmaco hidrofobo. Si el analito de farmaco hidrofobo esta presente, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente entran en proximidad. El fotosensibilizador genera oxfgeno singlete y activa el compuesto quimioluminiscente cuando los dos marcadores estan en estrecha proximidad. Posteriormente, el compuesto quimioluminiscente activado produce luz. La cantidad de luz producida esta relacionada con la cantidad del complejo formado, que a su vez esta relacionada con la cantidad de analito de farmaco hidrofobo presente.

A modo de ilustracion adicional, se emplean partfculas quimioluminiscentes, que comprenden el compuesto quimioluminiscente asociado con las mismas tal como mediante incorporacion en las mismas o fijacion a las mismas. Un miembro de sbp que se une al analito de farmaco hidrofobo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo para un farmaco hidrofobo, se une a un polisacarido que recubre las partfculas. Un segundo miembro de sbp que se une al analito de farmaco hidrofobo es parte de un conjugado de biotina. La estreptavidina se conjuga con un segundo conjunto de partfculas que tienen un fotosensibilizador asociado con las mismas. La union de la estreptavidina a este segundo conjunto de partfculas (partfculas de fotosensibilizador) puede implicar o no un polisacarido en las partfculas. Las partfculas quimioluminiscentes se mezclan con una muestra que se sospecha que contiene un analito de farmaco hidrofobo y las partfculas de fotosensibilizador. El medio de reaccion se incuba para permitir que las partfculas se unan al analito de farmaco hidrofobo gracias a la union de los miembros de sbp al analito de farmaco hidrofobo. Despues, se irradia el medio con luz para excitar el fotosensibilizador, que puede, en su estado excitado, activar oxfgeno para dar un estado de singlete. Dado que el compuesto quimioluminiscente de uno de los conjuntos de partfculas esta ahora en estrecha proximidad con el fotosensibilizador gracias a la presencia del analito de farmaco hidrofobo, se activa mediante oxfgeno singlete y emite luminiscencia. Despues se examina el medio para detectar la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando la presencia de la misma relacionada con la presencia y/o cantidad del analito de farmaco hidrofobo.

Otro ejemplo particular de un ensayo que puede emplearse para la determinacion de un analito de farmaco hidrofobo se comenta en la patente estadounidense n.° 5.616.719 (Davalian, et al.), que describe inmunoensayos de canalizacion de oxfgeno fluorescentes.

En algunos aspectos pueden usarse inmunoensayos de multiples analitos en los que el analito de farmaco hidrofobo puede ser el objeto de deteccion junto con uno o mas de otros analitos tales como otros farmacos y similares. Tales sistemas de multiples analitos se describen, por ejemplo, en Loor, et al., J. Anal. Toxicol. 12: 299 (1988).

Los ensayos comentados anteriormente se llevan a cabo normalmente en un medio tamponado acuoso a un pH moderado, generalmente el que proporciona sensibilidad de ensayo optima. El pH para el medio de ensayo estara habitualmente en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, mas habitualmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5. El pH sera habitualmente un compromiso entre la union optima de los miembros de union de cualquier par de union espedfica, el pH optimo para otros reactivos del ensayo tales como miembros del sistema de produccion de senal, y asf sucesivamente.

Pueden usarse diversos tampones para lograr el pH deseado y mantener el pH durante la determinacion. Los tampones ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris, barbital y similares. El tampon particular empleado no es cntico, pero en un ensayo individual puede preferirse uno u otro tampon. Pueden emplearse diversos materiales auxiliares en los metodos anteriores. Por ejemplo, ademas de tampones, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. Con frecuencia, ademas de estos aditivos, pueden incluirse protemas, tales como albuminas; sales de amonio cuaternario; polianiones tales como sulfato de dextrano; potenciadores de la union, o similares.

Pueden aplicarse uno o mas periodos de incubacion al medio a uno o mas intervalos incluyendo cualquier intervalo entre adiciones de diversos reactivos mencionados anteriormente. Se incuba el medio habitualmente a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que se produzca la union de diversos componentes de los reactivos. Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el metodo y habitualmente temperatura constante, preferiblemente, temperatura ambiente, durante el periodo de la medicion. Las temperaturas de incubacion oscilan normalmente entre aproximadamente 5° y aproximadamente 99°C, habitualmente entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 70°C, mas habitualmente de 20°C a aproximadamente 45°C. El periodo de tiempo para la incubacion es de aproximadamente 0,2 segundos a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 minutos. El periodo de tiempo depende de la temperatura del medio y la velocidad de union de los diversos reactivos, que se determina mediante la constante de velocidad de asociacion, la concentracion, la constante de union y la constante de velocidad de disociacion. Las temperaturas durante las mediciones oscilaran generalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50°C, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40°C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La concentracion de analito que puede someterse a ensayo vana generalmente desde aproximadamente 10-5 hasta aproximadamente 10-17 M, mas habitualmente desde aproximadamente 10-6 hasta aproximadamente 10-14 M. Consideraciones, tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (con respecto a la cantidad de analito de farmaco hidrofobo presente en la muestra), la tecnica de deteccion particular y la concentracion del analito determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo se determinaran generalmente mediante el intervalo de concentracion de interes del analito de farmaco hidrofobo, la naturaleza del ensayo, y similares. Sin embargo, la concentracion final de cada uno de los reactivos se determina normalmente de manera empmca para optimizar la sensibilidad del ensayo a lo largo del intervalo. Es decir, una variacion en la concentracion de analito de farmaco hidrofobo que es significativa debe proporcionan una diferencia de senal medible con precision. Consideraciones tales como la naturaleza del sistema de produccion de senal y la naturaleza de los analitos determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Aunque el orden de adicion puede variarse ampliamente, habra determinadas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adicion mas sencillo es anadir todos los materiales simultaneamente y determinar el efecto que tiene el medio de ensayo sobre la senal como en un ensayo homogeneo. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse de manera secuencial. Opcionalmente, puede implicarse una etapa de incubacion tras cada adicion tal como se comento anteriormente.

Etapa de examen

En una siguiente etapa del metodo segun la presente divulgacion, se examina el medio para detectar la presencia de un complejo que comprende el farmaco hidrofobo y el anticuerpo para el farmaco hidrofobo. La presencia y/o cantidad del complejo indica la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.

La frase “medir la cantidad de un analito de farmaco hidrofobo” se refiere a la determinacion cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa del analito de farmaco hidrofobo. Se considera que metodos que son cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, asf como todos los demas metodos para determinar el analito de farmaco hidrofobo, son metodos de medicion de la cantidad del analito de farmaco hidrofobo. Por ejemplo, se considera que un metodo, que simplemente detecta la presencia o ausencia del analito de farmaco hidrofobo en una muestra que se sospecha que contiene el analito de farmaco hidrofobo, esta incluido dentro del alcance de la presente invencion. Los terminos “detectar” y “determinar”, asf como otros sinonimos comunes para medir, se contemplan dentro del alcance de la presente invencion.

En muchos aspectos el examen del medio implica la deteccion de una senal del medio. La presencia y/o cantidad de la senal esta relacionada con la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra. El modo particular de deteccion depende de la naturaleza del sps. Tal como se comento anteriormente, hay numerosos metodos mediante los cuales un marcador de un sps puede producir una senal detectable mediante medios externos, de manera deseable mediante examen visual, e incluyen, por ejemplo, radiacion electromagnetica, electroqmmica, calor, deteccion de radiactividad, reactivos qmmicos y asf sucesivamente.

La activacion de un sistema de produccion de senal depende de la naturaleza de los miembros del sistema de produccion de senal. Para aquellos miembros de un sistema de produccion de senal que se activan con luz, el miembro se irradia con luz. Para miembros de sistemas de produccion de senales que estan en la superficie de una partfcula, la adicion de una base puede dar como resultado la activacion. Otros metodos de activacion se les ocurriran a los expertos en la tecnica a la vista de las divulgaciones en el presente documento. Para algunos sistemas de produccion de senales, no se necesita ningun agente para la activacion tales como los sistemas que implican un marcador que es un marcador radiactivo, una enzima, y asf sucesivamente. Para sistemas enzimaticos, puede ser necesaria la adicion de un sustrato y/o un cofactor.

El examen para detectar la presencia y/o cantidad de la senal tambien incluye la deteccion de la senal, que generalmente es simplemente una etapa en la que se lee la senal. La senal se lee normalmente usando un instrumento, cuya la naturaleza depende de la naturaleza de la senal. El instrumento puede ser un espectrofotometro, fluorometro, espectrometro de absorcion, luminometro, quimioluminometro, actinometro, instrumento fotografico, y similares. La presencia y cantidad de senal detectada esta relacionada con la presencia y cantidad del compuesto de farmaco hidrofobo presente en una muestra. Las temperaturas durante las mediciones oscilan generalmente entre aproximadamente 10° y aproximadamente 70°C, o entre aproximadamente 20° y aproximadamente 45°C, o de aproximadamente 20° a aproximadamente 25°C. En un enfoque se forman curvas patron usando concentraciones conocidas de los analitos que van a examinarse. Tal como se comento anteriormente, tambien pueden usarse calibradores y otros controles.

Aspectos especificos de ensayos

En un ensayo homogeneo despues de haber combinado todos los reactivos, se determina la senal y se relaciona

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

con la cantidad de analito en la muestra. Por ejemplo, en un ensayo EMIT® para detectar un farmaco hidrofobo, se combina una muestra que se sospecha que contiene el farmaco hidrofobo en un medio acuoso o bien simultaneamente o bien secuencialmente con un conjugado enzimatico del farmaco hidrofobo, es dedr, un analogo para el farmaco hidrofobo, y anticuerpo que puede reconocer el farmaco hidrofobo. Generalmente, se anade un sustrato para la enzima, lo que da como resultado la formacion de un producto cromogenico o fluorogenico tras una reaccion catalizada por enzima. Enzimas preferidas son glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina, pero pueden emplearse otras enzimas. El analito de farmaco hidrofobo y los restos del conjugado enzimatico compiten por sitios de union en el anticuerpo. Entonces se determina la actividad enzimatica en el medio, habitualmente mediante medios espectrofotometricos, y se compara con la actividad enzimatica determinada cuando se someten a prueba calibradores o muestras de referencia en las que esta presente una cantidad conocida del farmaco hidrofobo. Normalmente, los calibradores se someten a prueba de una manera similar a las pruebas de la muestra que se sospecha que contiene los analitos de farmaco hidrofobo. Los calibradores contienen normalmente concentraciones diferentes, pero conocidas, del analito de farmaco hidrofobo que va a determinarse. Preferiblemente, los intervalos de concentracion presentes en los calibradores abarcan el intervalo de concentraciones de analito de farmaco hidrofobo sospechadas en muestras desconocidas.

Los ensayos anteriormente mencionados pueden llevarse a cabo usando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante como enzima del conjugado enzimatico. Esta enzima mutante se describe en las patentes estadounidenses n.os 6.090.567 y 6.033.890. Ademas, el ensayo puede llevarse a cabo usando anticuerpos para el farmaco hidrofobo y usando procedimientos tal como se da a conocer en las patentes estadounidenses n.os 5.328.828 y 5.135.863.

Los ensayos heterogeneos implican habitualmente una o mas etapas de separacion y pueden ser de competencia o no de competencia. Se da a conocer una variedad de formatos de ensayos de competencia y no de competencia en Davalian, et al., patente estadounidense n.° 5.089.390, columna 14, lmea 25 a columna 15, lmea 9. En un tipo de ensayo de competencia, se pone en contacto un soporte, tal como se comenta en el presente documento, que tiene anticuerpos para el farmaco hidrofobo unidos al mismo con un medio que contiene la muestra y conjugados enzimaticos apropiados del farmaco hidrofobo. Tras separar el soporte y el medio, se determina la actividad enzimatica del soporte o el medio mediante tecnicas convencionales y se relaciona con la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.

En determinados aspectos puede emplearse una segunda enzima ademas de la enzima del conjugado enzimatico. Las enzimas del par de enzimas estan relacionadas en cuanto a que un producto de la primera enzima sirve como sustrato para la segunda enzima.

Otro aspecto de un formato de ensayo es un ensayo de captura. En este formato de ensayo, el anticuerpo para el farmaco hidrofobo se une de manera covalente a una partfcula magnetica. La muestra se incuba con estas partmulas para permitir que el farmaco hidrofobo en la muestra se una a los anticuerpos para el farmaco hidrofobo. Posteriormente, una enzima que tiene el farmaco hidrofobo o un derivado del farmaco hidrofobo unido de manera covalente se incuba con las partmulas magneticas. Tras el lavado, se mide la cantidad de enzima que esta unida a las partmulas magneticas y se relaciona de manera inversa con la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.

En un aspecto se mezcla la muestra de prueba o un patron de sirolimus con un conjugado de sirolimus, es decir, por ejemplo, un analogo de sirolimus que esta unido a biotina. Se deja que el sirolimus de la muestra de prueba y el analogo de sirolimus compitan por la union al anticuerpo para el sirolimus, que puede unirse a sirolimus o al analogo de sirolimus. Tras aclarar con un tampon de lavado apropiado, puede anadirse una molecula de deteccion que consiste en estreptavidina o avidina conjugada con una enzima, molecula fluorescente o quimioluminiscente o resto reactivo al medio, que entonces se examina para detectar la presencia y/o cantidad de senal. La presencia y/o cantidad de senal esta relacionada con la presencia y/o cantidad de sirolimus.

En un aspecto, el ensayo empleado es un ensayo de luminiscencia inducida tal como se describio anteriormente. Los reactivos incluyen dos reactivos de perlas de latex y un anticuerpo monoclonal de raton biotinilado anti-sirolimus. El primer reactivo de perla se recubre con sirolimus o un analogo de sirolimus y contiene colorante quimioluminiscente. El segundo reactivo de perla se recubre con estreptavidina y contiene un colorante fotosensibilizador. En una primera etapa, se incuba una muestra que se sospecha que contiene sirolimus con anticuerpo biotinilado para sirolimus, lo cual permite que sirolimus de la muestra sature una fraccion del anticuerpo biotinilado que esta directamente relacionada con la concentracion de sirolimus. En una segunda etapa, se anade el primer reactivo de perla y conduce a la formacion de inmunocomplejos de perla/anticuerpo biotinilado con la fraccion no saturada del anticuerpo biotinilado. Despues se anade el segundo reactivo de perla y se une a la biotina para formar inmunocomplejos de par de perlas. Cuando se ilumina mediante luz a 680 nm, el segundo reactivo de perla convierte oxfgeno disuelto en la disolucion de reaccion en la forma mas energetica de oxfgeno singlete. En los pares de perlas, el oxfgeno singlete se difunde al primer reactivo de perla desencadenando asf una reaccion quimioluminiscente. La senal quimioluminiscente resultante se mide a 612 nm y es una funcion inversa de la concentracion de sirolimus en la muestra. La cantidad de esta senal esta relacionada con la presencia y/o cantidad de sirolimus en la muestra.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Un ejemplo espedfico de otro formato de ensayo es ACMIA (inmunoensayo mediado por dioxido de cromo de afinidad). Para el formato de ensayo de ACMIA, se emplean partmulas de cromo, que estan recubiertas con sirolimus o un analogo de sirolimus, como primer componente. Un segundo componente es un anticuerpo para sirolimus. Este anticuerpo, reticulado con una enzima indicadora (por ejemplo, beta-galactosidasa), se anade a un recipiente de reaccion en una cantidad en exceso, es decir, una cantidad superior a la requerida para unirse a todo el analito que puede estar presente en una muestra. El conjugado anticuerpo-enzima se mezcla con una muestra que se sospecha que contiene sirolimus para permitir que el analito de sirolimus se una al anticuerpo. A continuacion, se anade el reactivo de partfculas de cromo para unirse a cualquier exceso de conjugado de anticuerpo-enzima. Despues, se aplica un iman, que extrae todas las partmulas de cromo y exceso de anticuerpo- enzima de la suspension mediante traccion, y se transfiere el sobrenadante a un recipiente de reaccion final. El sustrato de la enzima indicadora se anade al recipiente de reaccion final, y se mide la actividad enzimatica de manera espectrofotometrica como cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. La cantidad de esta senal esta relacionada con la presencia y/o cantidad de sirolimus en la muestra.

En un formato de ensayo de tipo sandwich, se emplean un primer reactivo que comprende partmulas de cromo recubiertas con anticuerpos anti-sirolimus y un segundo reactivo que comprende un segundo anticuerpo (o protema de union) para el primer anticuerpo conjugado con una enzima indicadora. En este formato, la muestra que se sospecha que contiene sirolimus se incuba con las partmulas de cromo de modo que todo el sirolimus, si esta presente en la muestra, se une a las partmulas de cromo. Se lavan las partmulas de cromo, usando un iman para separar el analito unido del sobrenadante. Despues, se incuba el segundo reactivo, es decir, anticuerpo (o protema de union) conjugado con una enzima indicadora, con las partmulas de cromo para formar un “sandwich”. Tras el lavado, se mide la cantidad de enzima que esta unida al cromo y se relaciona con la presencia y/o cantidad de sirolimus en la muestra.

Otro formato de ensayo es EMIT® (tecnologfa de inmunoensayo mediado por enzimas). En este formato de ensayo, se forma un conjugado enzimatico tal como, por ejemplo, un conjugado de G-6-PDH y un analogo de sirolimus. Se incuba un anticuerpo para sirolimus con el conjugado enzimatico y una muestra que se sospecha que contiene sirolimus. El anticuerpo para sirolimus se une al analito de sirolimus en la muestra en lugar de unirse al conjugado enzimatico, lo cual reduce la cantidad de inhibicion de la actividad enzimatica que podna producirse de lo contrario en ausencia de sirolimus en la muestra. De esta manera, las muestras con mas analito de sirolimus produciran una mayor actividad enzimatica, y las muestras sin analito de sirolimus tendran la maxima inhibicion y la menor actividad enzimatica. La cantidad de reduccion de inhibicion de la actividad enzimatica esta relacionada con la cantidad de sirolimus en la muestra.

Los reactivos para llevar a cabo un ensayo particular pueden estar presentes en un kit util para realizar de manera conveniente un ensayo para la determinacion de un analito de farmaco hidrofobo. En una realizacion, un kit comprende en combinacion envasada un anticuerpo para un analito de farmaco hidrofobo y otros reactivos para realizar un ensayo, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular. Los reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados o pueden combinarse diversos reactivos en uno o mas recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir ademas otros reactivos envasados de manera separada para realizar un ensayo tal como detectar miembros de sbp adicionales, reactivos auxiliares tales como un sustrato enzimatico auxiliar, y asf sucesivamente.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimizan sustancialmente las reacciones que se necesita que se produzcan durante el presente metodo y ademas para optimizar sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En circunstancias apropiadas, uno o mas de los reactivos en el kit pueden proporcionarse como polvo seco, habitualmente liofilizado, incluyendo excipientes, que en disolucion proporcionaran una disolucion de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para realizar un metodo o ensayo segun la presente invencion. El kit puede incluir ademas una descripcion escrita de un metodo segun la presente invencion tal como se describio anteriormente.

Otros aspectos

Un aspecto descrito en el presente documento es un metodo para someter a tratamiento previo una muestra de

sangre completa que se sospecha que contiene un farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en

tacrolimus, sirolimus y ciclosporina para llevar a cabo un metodo de ensayo para detectar el farmaco hidrofobo. Se proporciona una combinacion en un medio. La combinacion comprende (i) la muestra, (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco hidrofobo y sus metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco hidrofobo o un ester de un metabolito del farmaco hidrofobo, y (iii) un agente de solubilidad selectiva que proporciona solubilidad sustancialmente igual del farmaco hidrofobo y sus metabolitos en el medio. El agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del

grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos, y esta presente en

el medio en una concentracion suficiente para proporcionar una solubilidad sustancialmente igual del farmaco hidrofobo y sus metabolitos en el medio, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen. Se incuba el medio en condiciones para liberar el farmaco hidrofobo y sus metabolitos de restos de union endogenos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Otro aspecto de la divulgacion es un metodo para determinar un farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, sirolimus y ciclosporina en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene un farmaco hidrofobo. Se proporciona una combinacion en un medio. La combinacion comprende (i) la muestra, (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco hidrofobo y sus metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco hidrofobo o un ester de un metabolito del farmaco hidrofobo, y (iii) un agente de solubilidad selectiva que proporciona una solubilidad sustancialmente igual del farmaco hidrofobo y sus metabolitos en el medio, en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos, y en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es suficiente para proporcionar una solubilidad sustancialmente igual del farmaco hidrofobo y sus metabolitos en el medio, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen. La combinacion en el medio comprende ademas un agente hemolftico. Se incuba el medio en condiciones para hemolizar celulas en la muestra y para liberar el farmaco hidrofobo y sus metabolitos de restos de union endogenos. Al medio se le anaden reactivos para determinar la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra en el que los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el farmaco hidrofobo. Se examina el medio para detectar la presencia de un complejo que comprende el farmaco hidrofobo y el anticuerpo para el farmaco hidrofobo, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.

Otro aspecto de la divulgacion es un metodo para determinar un farmaco inmunosupresor seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, rapamicina y everolimus en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene un farmaco inmunosupresor. Se forma una combinacion en un medio en el que la combinacion comprende la muestra, un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y sus metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor o un ester de un metabolito del farmaco inmunosupresor, y un agente de solubilidad selectiva para el farmaco inmunosupresor y sus metabolitos. El agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos. La concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es suficiente para proporcionar una solubilidad sustancialmente igual del farmaco inmunosupresor y sus metabolitos en el medio, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen. Se incuba el medio en condiciones para liberar el farmaco inmunosupresor y sus metabolitos de restos de union endogenos. Al medio se le anaden (i) un reactivo que comprende (I) un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor y (II) una enzima y (ii) partfculas magneticas que comprenden el farmaco inmunosupresor o un analogo del mismo. Se examina el medio para detectar la presencia de un complejo que comprende el farmaco inmunosupresor y el anticuerpo para el farmaco inmunosupresor, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra.

Otro aspecto de la divulgacion es un metodo para determinar un farmaco inmunosupresor seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, rapamicina y everolimus en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene un farmaco inmunosupresor. Se forma una combinacion en un medio en el que la combinacion comprende la muestra, un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y sus metabolitos de restos de union endogenos, en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor o un ester de un metabolito del farmaco inmunosupresor, y un agente de solubilidad selectiva para el farmaco inmunosupresor y sus metabolitos. El agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos, y la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es suficiente para proporcionar una solubilidad sustancialmente igual del farmaco inmunosupresor y sus metabolitos en el medio, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen. Se incuba el medio en condiciones para proporcionar una solubilidad sustancialmente igual del farmaco inmunosupresor y sus metabolitos en el medio. Al medio se le anaden (i) un fotosensibilizador asociado con una primera partfcula y que puede generar oxfgeno singlete, y (ii) una composicion quimioluminiscente que puede activarse mediante oxfgeno singlete y asociada con una segunda partfcula, en el que un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor esta asociado con la primera partfcula o la segunda partfcula o ambas. Se somete la combinacion a condiciones para la union del anticuerpo al farmaco inmunosupresor, si esta presente. Se irradia el fotosensibilizador con luz y se detecta la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente. La cantidad de luminiscencia esta relacionada con la cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra.

Alternativamente, en el aspecto anterior, una de la primera partfcula o la segunda partfcula comprende el anticuerpo y la otra partfcula comprende un analogo de farmaco para el farmaco inmunosupresor, en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, rapamicina y everolimus. Se somete la combinacion a condiciones para la competencia de las partfculas recubiertas con analogo de farmaco y el farmaco inmunosupresor, si esta presente, por el anticuerpo para el farmaco. Alternativamente, en el aspecto anterior, la primera partfcula o la segunda partfcula comprenden estreptavidina, que se combina con un analogo biotinilado para el farmaco inmunosupresor en el medio, en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, rapamicina y everolimus. Se somete la combinacion a condiciones para la competencia de analogo de farmaco biotinilado y el farmaco inmunosupresor por el anticuerpo para el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

farmaco. En cualquiera de los aspectos alternativos anteriores, se irradia el fotosensibilizador con luz y se detecta la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente. La cantidad de luminiscencia esta relacionada con la cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra.

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente las realizaciones espedficas de la invencion a modo de ilustracion y no de limitacion, y se pretende que describan y no limiten el alcance de la invencion. Las partes y los porcentajes dados a conocer en el presente documento son en volumen a menos que se indique lo contrario.

Ejemplos

Materiales:

Todos los productos qmmicos se adquirieron de la comparua Sigma-Aldrich (St. Louis MO) a menos que se indique lo contrario. El sirolimus en polvo y sus metabolitos, excepto por 27,39-O-didesmetil- (o 32,41-O-didesmetil)- sirolimus, se obtuvieron todos de Wyet Pharmaceuticals. Se obtuvo 27,39-O-didesmetil- (o 32,41-O-didesmetil)- sirolimus del laboratorio del Dr. Uwe Christains del Departamento de Anestesiologfa, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Colorado, Denver, Colorado.

Se realizaron pruebas usando el analizador DIMENSION® RxL, disponible de Dade Behring Inc., Newark DE. Se empleo el instrumento usando tecnologfa de inmunoensayo ACMIA. El metodo de ensayo ACMIA se da a conocer en las patentes estadounidenses n.os 7.186.518, 5.147.529, 5.128.103, 5.158.871, 4.661.408, 5.151.348, 5.302.532, 5.422.284, 5.447.870, 5.434.051. En la realizacion del metodo ACMIA usado en el presente documento y comentado con mas detalle a continuacion, se utilizo competencia entre analogo de sirolimus en partfculas de cromo y sirolimus (SIRO) en muestras de pacientes para detectar anticuerpo para sirolimus conjugado con una enzima (conjugado) para determinar la cantidad de sirolimus en las muestras de pacientes. Se elimino conjugado que se une al analogo de sirolimus en partfculas de cromo mediante separacion magnetica. Se mide la actividad enzimatica del conjugado restante en el sobrenadante y es directamente proporcional a la cantidad de sirolimus en la muestra de paciente. En el formato de ensayo ACMIA empleado, la actividad enzimatica observada cuando se somete a prueba una muestra que no contiene sirolimus fue indicativa de la cantidad de actividad enzimatica que no estaba unida al anticuerpo activo (es decir, no puede unirse a sirolimus en partfculas de cromo). La actividad enzimatica observada cuando no estan presentes partfculas de cromo, es indicativa de la cantidad total de actividad enzimatica en el conjugado. Estos valores pueden usarse para estimar el porcentaje de actividad enzimatica unida al anticuerpo activo.

EJEMPLO 1.

Inmunoensayo automatizado para farmacos hidrofobos con diversos grados de reactividad cruzada de metabolitos utilizando un tratamiento previo no manual

Preparacion de disolucion de tratamiento previo sin carbamato de FK-506 (FKE)

Se preparo esta disolucion de tratamiento previo para contener hemisal de sodio de PIPES™ 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, PLURoNiC® 25R2 al 0,09%, Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. No se anadio ningun disolvente organico en esta disolucion.

Preparacion de disolucion de tratamiento previo que contiene FKE 3,75 ug/ml

Se preparo esta disolucion de tratamiento previo para contener 3,75 pg/ml de un compuesto de carbamato de FK- 506 (o ester de tacrolimus), hemisal de sodio de PIPES™ 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, PLURONIC® 25R2 al 0,09%, Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. No se anadio ningun disolvente organico en esta disolucion. La concentracion de FKE en la mezcla de reaccion final fue de 0,86 pg/ml.

Preparacion de disolucion de tratamiento previo que contiene FKE 15 ug/ml

Se preparo esta disolucion de tratamiento previo para contener 15 pg/ml de un compuesto de carbamato de FK-506 (o ester de tacrolimus), hemisal de sodio de PIPES™ 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, PLURONIC® 25R2 al 0,09%, Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. No se anadio ningun disolvente organico en esta disolucion. La concentracion de FKE en la mezcla de reaccion final fue de 3,4 pg/ml.

Preparacion de disolucion de tratamiento previo que contiene dimetilsulfoxido al 10% (DMSO)

Se preparo esta disolucion de tratamiento previo anadiendo DMSO hasta una concentracion final del 10% (v/v) en un tampon que contema hemisal de sodio de PIPES™ 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, 15 pg/ml de un compuesto de carbamato de FK-506 (o ester de tacrolimus), PLURONIC® 25R2 al 0,09%, Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. La concentracion de DMSO en la mezcla

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de reaccion final fue de aproximadamente el 2,3%.

Preparacion de disolucion de tratamiento previo que contiene DMSO al 15%

Se preparo esta disolucion de tratamiento previo anadiendo DMSO hasta una concentracion final del 15% (v/v) en un tampon que contema hemisal de sodio de PIPES™ 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, 15 |jg/ml de un compuesto de carbamato de FK-506 (o ester de tacrolimus), PLURONIC® 25R2 al 0,09%, Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. La concentracion de DMSO en la mezcla de reaccion final fue de aproximadamente el 3,4%.

Preparacion de disolucion de tratamiento previo que contiene 1-metoxi-2-propanol al 10%

Se preparo esta disolucion base de tratamiento previo anadiendo 1-metoxi-2-propanol (MP) hasta una concentracion final del 10% (v/v) en un tampon que contema hemisal de sodio de PIPES 6,8 mg/ml, EDTA de disodio 0,3 mg/ml, saponina 1,0 mg/ml, 15 jg/ml de un compuesto de carbamato de FK-506 (o ester de tacrolimus), Proclin 300 al 0,2%, sulfato de neomicina 0,024 mg/ml y NaN3 0,99 mg/ml, pH 6,5. La concentracion de MP en la mezcla de reaccion de ACMIA final fue de aproximadamente el 2,3%.

La tabla 1 muestra la composicion del reactivo de tratamiento previo para su uso en el tratamiento previo de una muestra que contiene sirolimus (AI = tal como se indica).

Tabla 1

Composicion del reactivo de tratamiento previo para el ensayo ACMIA de sirolimus

Nombre

Cantidad (por ml) Funcion

Ester de FK506

15 jg disocia sirolimus de protema de union

DMSOo MP

AI disolver farmaco y metabolitos

SesquiNa PIPES

6,8 mg tampon

EDTA de disodio

0,3 mg previene la formacion de coagulos

Saponina

1,0 mg lisis de globulos rojos

Pluronic

0,9 |il

Proclin 300

2 jl conservante

Sulfato de neomicina

0,024 mg conservante

NaN3

0,99 mg conservante, matriz

Preparacion de conjugado de P-galactosidasa-anticuerpo anti-tacrolimus

Se conjugo anticuerpo monoclonal anti-sirolimus (Wyet Pharmaceuticals, Cambridge MA) con p-galactosidasa usando un grupo de union SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo) heterobifuncional convencional segun tecnicas conocidas. La disolucion de conjugado de anticuerpo contema conjugado de p- galactosidasa-anticuerpo anti-sirolimus a aproximadamente 7,5 jg/ml, albumina serica bovina libre de proteasa 30 mg/ml, MgCh 0,126 mg/ml, 0,03 ml/ml de etilenglicol, hemisal de sodio de PIPES 35,14 mg/ml, NaCl 50 mg/ml y beta-gal-mutema (beta-galactosidasa inactivada), pH 6,5.

Preparacion de particulas de cromo magneticas

Se prepararon particulas de cromo-sirolimus (fase solida del inmunoensayo) conjugando conjugado de sirolimus- C26- o -C32-CMO con particulas de DA10-dexal-dioxido de cromo usando qmmica de ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.231.982. Las particulas de cromo-sirolimus se convierten entonces en comprimidos de particulas de cromo- sirolimus. Cada comprimido de sirolimus contiene aproximadamente 2 mg de suspension de particulas de cromo- sirolimus, 30,4 mg de dihidrato de trehalosa y 3,6 mg de CARBOWAX® 100 jm.

Ensayo de sirolimus

El principio y el funcionamiento del ensayo ACMIA para detectar sirolimus fueron tal como sigue: se anadio reactivo de tratamiento previo sin FKE o con FKE que contema disolvente organico como agente de solubilidad selectiva a un recipiente de reaccion en el analizador DIMENSION® RxL. A continuacion, se anadieron 18 jl de sangre completa que contema sirolimus o sus metabolitos. Se tomaron muestras de la sangre completa a partir de un recipiente convencional mezclando en primer lugar la sangre con la sonda de muestra de ultrasonidos. El mezclado de la muestra de sangre completa con la disolucion de tratamiento previo garantizo la hemolisis de la sangre completa y el desplazamiento de las moleculas de sirolimus unidas a protemas de sus sitios de union cuando estaban presentes moleculas de carbamato de tacrolimus. A continuacion se anadio conjugado de p-galactosidasa-anticuerpo anti- sirolimus (50 jl) y se permitio que reaccionara con el sirolimus en la muestra. Se anadieron las particulas de cromo con sirolimus-CMO-DA10-Dexal inmovilizado (50 jl) y se permitio que se unieran al conjugado sin unir. El conjugado de p-galactosidasa-anticuerpo anti-sirolimus unido a sirolimus no se unio a las particulas de cromo sino que

5

10

15

20

25

30

35

permanecio en el sobrenadante cuando se aplico un campo magnetico a la mezcla de reaccion anterior para separar la disolucion de las partfculas de cromo. Se detecto el conjugado unido a sirolimus transfiriendo el sobrenadante del recipiente de reaccion a una cubeta fotometrica y midiendo la tasa enzimatica del conjugado en presencia de clorofenol rojo-p-D-galactopiranosido (CPRG). Se midio la tasa bicromaticamente a 577 y 700 nm.

Comparacion de diferentes reactivos de tratamiento previo

Se uso DMSO al 10 o 15% o MP al 10% con FKE para preparar disoluciones de tratamiento previo independientes (tal como se comento con mas detalle anteriormente) para el ensayo ACMIA llevado a cabo en el analizador DIMENSION® RxL para medir concentraciones de sirolimus y sus metabolitos en muestras de sangre completa. Se preparo otra disolucion de tratamiento previo sin los disolventes organicos mencionados anteriormente y FKE como control para el ensayo (“Control”). Se usaron las disoluciones de tratamiento previo con y sin adiciones conocidas de los disolventes organicos mencionados para preparar los cartuchos de reactivo para el ensayo ACMIA de sirolimus en el analizador de qmmica clmica DIMENSION®. Cuando no se usaron los disolventes mencionados anteriormente y FKE, todos los metabolitos mostraron altas recuperaciones en la muestras de sangre completa. En las siguientes tablas se notifican las recuperaciones de metabolitos de sirolimus como porcentaje de la recuperacion del farmaco original, sirolimus.

Durante el experimento, se libero una cantidad sustancial de farmaco sirolimus por FKE tal como se muestra mediante un gran aumento en la separacion de senal frente al control sin FKE. El experimento anterior se realizo sin disolvente organico anadido y la mezcla de reaccion fue basicamente una disolucion acuosa. La adicion de disolvente organico miscible con agua tal como alcohol o DMSO en el reactivo de tratamiento previo redujo significativamente la reactividad cruzada de metabolito tal como se indica en la tabla. Cuando no se anadio ningun disolvente organico, la reactividad cruzada de metabolito fue la mas alta (el control en la tabla 2 a continuacion). Los resultados se resumen en la tabla 2.

Tabla 2

Reactividad cruzada de metabolito* usando reactivo que contiene diversos disolventes organicos

Tratamiento

% de disolvente en el react. % de disolvente en la % de reactividad

de tratamiento previo** mezcla de reaccion cruzada

Control

- - 180

DMSO

10 2,3 100

DMSO

15 3,4 88

Metoxipropanol

10 2,3 92

* Se usa 27,39-didesmetil-sirolimus en este estudio ** El reactivo de tratamiento previo contiene ester de FK506 15 pg/ml

En el estudio al que se hace referencia en la tabla 2 anterior, se uso 27,39-didesmetil-sirolimus para el examen de disolventes organicos debido a su hidrofilia relativamente alta.

La tabla 3 ilustra el efecto de FKE y disolvente organico mostrado a modo de ejemplo por DMSO sobre el porcentaje de reactividad cruzada de metabolitos de sirolimus.

Tabla 3

Efecto de FKE y DMSO sobre la reactividad cruzada de metabolitos de sirolimus

Metabolito

PT* sin FKE ni DMSO PT con FKE 15 pg/ml PT con FKE 15 pg/ml y DMSO al 15%

41-O-desmetil-(sur) hidroxi-sirolimus

62 7 -1

7-O-desmetil-sirolimus

6 7 -3

11-hidroxi-sirolimus

315 78 35

11-hidroxi-sirolimus (isomero del anterior)

114 34 9

(sur)hidroxi-siro-2H

17 11 0

(N-oxido) de hidroxi- sirolimus

152 49 13

(sur)hidroxi-siro-2H (isomero) 41-O-desmetil- (sur)dihidroxi-siro-2H

32 7 0

41-O-desmetil-sirolimus

48 39 40

32-O-desmetil-sirolimus

34 8 -3

27,39-didesmetil- sirolimus

569 165 88

*PT = Reactivo de tratamiento previo

En los reactivos de inmunoensayo acuosos habituales que no contienen FKE ni DMSO, se detecto el 315% de reactividad cruzada para 11-hidroxi-sirolimus debido a su naturaleza hidrofila. En presencia de FKE pero sin DMSO, su reactividad cruzada fue del 78%, significativamente mas baja que en ausencia de FKE pero mas alta que cuando 5 estaban presentes tanto FKE como DMSO. La reactividad cruzada de 11-hidroxi-sirolimus fue la mas baja (35%) cuando se formularon tanto FKE como DMSO en el reactivo de tratamiento previo. La reactividad cruzada de otros metabolites de sirolimus siguio el mismo patron: la reactividad cruzada es la mas alta cuando el reactivo de tratamiento previo no contiene FKE ni DMSO y es la mas baja cuando ambos estan presentes.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad de un farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, sirolimus, everolimus y ciclosporina con respecto a la de metabolites del

   5 farmaco hidrofobo, comprendiendo el metodo:

   (a) proporcionar en combinacion en un medio:

   (i) una muestra de sangre completa,

   10

   (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco hidrofobo y los metabolitos de restos de union endogenos en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco hidrofobo, y

   (iii) un agente de solubilidad selectiva para el farmaco hidrofobo en el que el agente de solubilidad

   15 selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que

   consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen, y

   (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a

   20 la de los metabolitos en el medio.
2. 2. Metodo para determinar un farmaco hidrofobo en una muestra de sangre completa que se sospecha que contiene el farmaco hidrofobo que comprende el metodo para potenciar de manera selectiva la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo seleccionado del grupo que consiste en tacrolimus, sirolimus,

   25 everolimus y ciclosporina con respecto a la de metabolitos del farmaco hidrofobo segun la reivindicacion 1,

   en el que la combinacion en el medio comprende ademas un agente hemolttico y en el que en la etapa (b) el medio se incuba en condiciones para hemolizar celulas en la muestra y para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio, y en el que el metodo comprende ademas:

   30

   (c) anadir al medio reactivos para determinar la presencia y/o cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra en el que los reactivos comprenden al menos un anticuerpo para el farmaco hidrofobo, y

   (d) examinar el medio para determinar la presencia de un complejo que comprende el farmaco hidrofobo y

   35 el anticuerpo para el farmaco hidrofobo, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o

   cantidad del farmaco hidrofobo en la muestra.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que los reactivos en la etapa (c) comprenden ademas un analogo del farmaco hidrofobo y al menos uno del anticuerpo para el farmaco hidrofobo o el analogo comprende un

   40 marcador.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que en la etapa (c) se anade un segundo anticuerpo al medio en el que el segundo anticuerpo se une a un complejo del farmaco hidrofobo y el anticuerpo para el farmaco hidrofobo.

   45
5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, en el que al menos uno de los anticuerpos para el farmaco hidrofobo y el segundo anticuerpo comprende un marcador.
6. 6. Metodo para determinar un farmaco inmunosupresor en una muestra de sangre completa que se sospecha

   50 que contiene un farmaco inmunosupresor, comprendiendo el metodo:

   (a) proporcionar en combinacion en un medio:

   (i) la muestra,

   55

   (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y los metabolitos de restos de union endogenos en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor y

   (iii) un agente de solubilidad selectiva para el inmunosupresor en el que el agente de solubilidad

   60 selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que

   consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen,

   (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a

   65 la de los metabolitos en el medio,

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   (c) anadir al medio (i) un reactivo que comprende (I) un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor y (II) una enzima y (ii) partfculas magneticas que comprenden el farmaco inmunosupresor o un analogo del mismo, y

   (d) examinar el medio para determinar la presencia de un complejo que comprende el farmaco inmunosupresor y el anticuerpo para el farmaco inmunosupresor, indicando la presencia y/o cantidad del complejo la presencia y/o cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra,

   en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, sirolimus y everolimus.

   Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el examen comprende separar las partfculas magneticas del medio.

   Metodo segun la reivindicacion 6, en el que las partfculas magneticas son partfculas de dioxido de cromo.

   Metodo para determinar la presencia o cantidad de un farmaco inmunosupresor en un medio que se sospecha que contiene un farmaco inmunosupresor, comprendiendo el metodo:

   (a) proporcionar en combinacion en un medio:

   (i) una muestra de sangre completa,

   (ii) un agente de liberacion para liberar el farmaco inmunosupresor y los metabolitos de restos de union endogenos en el que el agente de liberacion es un ester del farmaco inmunosupresor y

   (iii) un agente de solubilidad selectiva para el farmaco inmunosupresor en el que el agente de solubilidad selectiva comprende un disolvente organico, no volatil, miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido y 1-metoxi-2-propanol, o una combinacion de los mismos, en el que la concentracion del agente de solubilidad selectiva en el medio es del 10% al 30% en volumen,

   (b) incubar el medio en condiciones para potenciar la biodisponibilidad del farmaco hidrofobo con respecto a la de los metabolitos en el medio,

   (c) anadir al medio (i) un fotosensibilizador asociado con una primera partfcula y que puede generar oxfgeno singlete, y (ii) una composicion quimioluminiscente que puede activarse mediante oxfgeno singlete y asociada con una segunda partfcula, en el que un anticuerpo para el farmaco inmunosupresor esta asociado con la primera partfcula o la segunda partfcula o ambas,

   (d) someter la combinacion a condiciones para la union del anticuerpo al farmaco inmunosupresor, si esta presente, y

   (e) irradiar el fotosensibilizador con luz y detectar la cantidad de luminiscencia generada por la composicion quimioluminiscente, estando la cantidad de luminiscencia relacionada con la cantidad del farmaco inmunosupresor en la muestra,

   en el que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrolimus, ciclosporina, sirolimus y everolimus.

   Metodo segun la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo esta asociado con la primera partfcula y en el que la segunda partfcula comprende un analogo del farmaco inmunosupresor unido a la misma.