ES2606706T3 - Un ensayo de doble híbrido fluorescente (F2H) para la visualización directa de interacciones de proteínas en células vivas - Google Patents
Un ensayo de doble híbrido fluorescente (F2H) para la visualización directa de interacciones de proteínas en células vivas Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento in vitro para detectar interacciones proteína-proteína, que comprende: (a) expresar en una célula eucariota una primera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula; y (ii) un (poli)péptido que se une específicamente a la proteína verde fluorescente (GFP) (b) expresar en la misma célula una segunda proteína de fusión que comprende (i) GFP; y (ii) un (poli)péptido señuelo (c) expresar en la misma célula una tercera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la de GFP; y (ii) un (poli)péptido presa (d) detectar la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la segunda y la tercera proteína de fusión en la célula tras la excitación, en el que una colocalización de la emisión de fluorescencia de ambas proteínas de fusión en el núcleo de la célula es indicativa de una interacción del dicho (poli)péptido señuelo y presa.
Description
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debilitar la interacción de dos (poli)péptidos, en la que una disminución de la colocalización de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión en el núcleo de la célula en comparación con la observada en el núcleo de una célula de referencia que no está en contacto con el compuesto de prueba es indicativa de que el compuesto puede debilitar la interacción del (poli)péptido señuelo y presa.
"Capaz de debilitar la interacción de dos (poli)péptidos", en el contexto de la presente invención, significa, en primer lugar, la influencia de un compuesto sobre la afinidad de unión de un (poli)péptido hacia otro (poli)péptido, que conduce a un debilitamiento o a la interrupción completa/anulación de la interacción o afinidad de unión. Como se describe anteriormente, esto puede tener lugar por cambios conformacionales inducidos en un (poli)péptido tras la unión del compuesto. En segundo lugar, el compuesto puede competir directamente con el (poli)péptido de interacción por el mismo sitio de unión o uno diferente adyacente a dicho sitio de unión en el otro (poli)péptido. Un debilitamiento o anulación completa de la interacción es detectable como una disminución o ausencia completa de colocalización de ambas señales fluorescentes.
Una célula de referencia, en el contexto de la presente invención, indica una célula que no se ha puesto en contacto con el compuesto de prueba. En consecuencia, la influencia del compuesto sobre el comportamiento de interacción del (poli)péptido señuelo y presa se puede comparar directamente.
En otro modo de realización preferente de este aspecto de la invención, el compuesto de prueba puede inducir o potenciar la interacción de dos (poli)péptidos, en la que un aumento en la colocalización de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión en el núcleo de la célula en comparación con la observada en el núcleo de una célula de referencia que no está en contacto con el compuesto de prueba es indicativo de que el compuesto puede inducir
o potenciar la interacción del (poli)péptido señuelo y presa.
"Capaz de inducir la interacción de dos (poli)péptidos" indica la influencia de un compuesto sobre la afinidad de unión de un (poli)péptido hacia otro (poli)péptido, que conduce a una afinidad de unión aumentada. Por ejemplo, si no se detecta o se detecta colocalización únicamente menor de las señales fluorescentes (poli)péptido señuelo y presa en la célula de referencia, un aumento en la colocalización indica una interacción reforzada.
En un aspecto diferente, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para determinar la fuerza relativa de la interacción de dos proteínas con una tercera proteína, que comprende: (a) expresar en una célula eucariota una primera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula; y (ii) un (poli)péptido que se une específicamente a GFP; (b) expresar en la misma célula una segunda proteína de fusión que comprende (i) GFP; y (ii) un (poli)péptido señuelo;
(c) expresar en la misma célula una tercera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la de GFP; y (ii) un primer (poli)péptido presa; (d) expresar en la misma célula una cuarta proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la de GFP y de la del (poli)péptido fluorescente de dicha tercera proteína de fusión; y (ii) un segundo (poli)péptido presa; y (e) detectar la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la segunda y la tercera proteína de fusión en la célula tras la excitación, en el que una magnitud de colocalización de la emisión de fluorescencia de la segunda y la tercera proteína de fusión diferente en comparación con que de la segunda y la cuarta proteína de fusión en el núcleo de la célula es indicativa de una fuerza de unión diferente del primero y el segunda (poli)péptido presa al (poli)péptido señuelo.
Este y los siguientes dos aspectos de la invención se basan en dos construcciones básicas, una construcción presa y señuelo, y se puede aplicar en los casos en los que no están disponibles bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican proteínas que comprenden GFP.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para detectar interacciones proteína-proteína, que comprende: (a) expresar en una célula eucariota una primera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente; (ii) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula; y (iii) un (poli)péptido señuelo; (b) expresar en la misma célula una segunda proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere del (poli)péptido fluorescente comprendido en dicha primera proteína de fusión; y (ii) un (poli)péptido presa y (c) detectar la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la primera y la segunda proteína de fusión en la célula tras la excitación, en el que una colocalización de la emisión de fluorescencia de ambas proteínas de fusión en el núcleo de la célula es indicativa de una interacción del (poli)péptido señuelo y presa.
En un aspecto diferente, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para identificar un compuesto que modula la interacción de dos (poli)péptidos (a) expresando en una célula eucariota una primera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente; (ii) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula; y (iii) un (poli)péptido señuelo; (b) expresando en la misma célula una segunda proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la del (poli)péptido fluorescente comprendido en dicha primera proteína de fusión; y
(ii) un (poli)péptido presa que se sabe o se sospecha que interacciona con el (poli)péptido señuelo; (c) poniendo en contacto la célula con un compuesto de prueba; y (d) detectando la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la primera y la segunda proteína de fusión en la célula tras la excitación; en el que un cambio en el
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grado de colocalización de la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión en el núcleo de la célula en comparación con la observada en el núcleo de una célula de referencia que no está en contacto con el compuesto de prueba es indicativo de que el compuesto puede modular la interacción del (poli)péptido señuelo y presa.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la fuerza relativa de la interacción de dos proteínas (usado de manera intercambiable con el término "(poli)péptidos") con una tercera proteína (o (poli)péptido), que comprende (a) expresar en una célula eucariota una primera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente; (ii) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula; y (iii) un (poli)péptido señuelo; (b) expresar en la misma célula una segunda proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la del (poli)péptido fluorescente comprendido en dicha primera proteína de fusión; y (ii) un primer (poli)péptido presa; (c) expresar en la misma célula una tercera proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente, cuya longitud de onda de excitación y/o emisión difiere de la del (poli)péptido fluorescente comprendido en dicha primera y segunda proteína de fusión; y (ii) un segundo (poli)péptido presa; y (d) detectar la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la primera, la segunda y la tercera proteína de fusión en la célula tras la excitación, en el que una magnitud de colocalización de la emisión de fluorescencia de la primera y la segunda proteína de fusión diferente en comparación con la de la primera y la tercera proteína de fusión en el núcleo de la célula es indicativa de una fuerza de unión diferente de la primera y la segunda proteína presa al (poli)péptido señuelo.
En un modo de realización preferente de los aspectos de la presente invención que se refiere a procedimientos para detectar interacciones proteína-proteína, la detección se emplea para investigar la dependencia de las interacciones proteína-proteína de los procesos celulares, en el que el procedimiento comprende además (d1) supervisar la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de la primera y la segunda proteína de fusión en la célula en el curso de uno o más procesos en la célula; en el que un cambio en el grado de colocalización de la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión en la célula es indicativo de una dependencia de la interacción de uno o más procesos celulares.
"Dependencia de los procesos celulares" indica la posibilidad de que el (poli)péptido señuelo o presa o ambos alteren su comportamiento de interacción debido a modificaciones en el curso de los procesos celulares, tales como el ciclo celular. Las proteínas que desempeñan un papel en el ciclo celular experimentan varias modificaciones tales como fosforilación y desfosforilación, que podrían alterar su afinidad de unión hacia otras proteínas. Dependiendo del punto temporal o el período durante un proceso celular cuando se logra esta modificación, un (poli)péptido podría perder o ganar afinidad de unión a uno o más (poli)péptidos diferentes.
En un modo de realización más preferente, el proceso celular es el ciclo celular, la secreción, la traslocación o la transducción de señales.
En otro modo de realización preferente, la detección se emplea para determinar la fuerza de una interacción proteína-proteína, en el que el procedimiento comprende además (d2) en caso de que se detecte una colocalización de la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión, la extinción selectiva de la fluorescencia de dicha segunda proteína de fusión y el control del restablecimiento de la colocalización de la emisión de fluorescencia de las partes fluorescentes de ambas proteínas de fusión en el tiempo, en el que el tiempo necesario para establecer colocalización es indicativo de la fuerza de la interacción proteína-proteína.
Este modo de realización de la presente invención, en parte, utiliza el procedimiento FRAP (recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueado) bien establecido. Este procedimiento indica una técnica óptica que puede cuantificar la difusión y la movilidad de sondas marcadas con fluorescencia. Esta técnica proporciona una gran utilidad en estudios biológicos de unión de proteínas y se usa comúnmente junto con proteínas fluorescentes (FP), en la que la proteína estudiada está fusionada con una FP. Cuando se excita por una longitud de onda específica de la luz (típicamente, un haz de láser), la proteína emitirá fluorescencia. Cuando la proteína que se está estudiando se produce con la FP, entonces la fluorescencia se puede rastrear. Después de la fotodestrucción de la FP (típicamente con un pulso de láser fuerte/intenso), la cinética de la recuperación de fluorescencia en la zona blanqueada proporciona información acerca de la fuerza de las interacciones de las proteínas, la continuidad del orgánulo y el tráfico de proteínas que evitar o retarda el intercambio de FP blanqueadas y sin blanquear. Esta observación se ha explotado más recientemente para investigar la unión de proteínas.
En otro modo de realización preferente de la presente invención, los componentes (i), (ii) y/o (iii) de dicha primera proteína de fusión y/o los componentes (i) y (ii) de dicha segunda proteína de fusión y/o los componentes (i) y (ii) de dicha tercera proteína de fusión están conectados a través de un engarce.
El término "engarce" se refiere a la conexión entre los componentes de las proteínas de fusión de la invención. Un engarce puede ser un enlace peptídico o un tramo de aminoácidos que comprende al menos un resto de aminoácido que puede estar dispuesto entre los componentes de las proteínas de fusión en cualquier orden. Dicho engarce puede ser útil en algunos casos, por ejemplo, para mejorar el plegamiento por separado de los dominios individuales
o para modular la estabilidad de la proteína de fusión. Además, dichos restos de engarce pueden contener señales
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para el transporte, secuencias de reconocimiento de proteasa o señales para modificación secundaria. Los restos de aminoácido que forman el engarce pueden estar estructurados o no estructurados. Preferentemente, el engarce puede ser tan corto como de 1 residuo de aminoácido o de un máximo 2, 3, 4, 5, 10, 20 o 50 restos. En casos particulares, el engarce puede incluso implicar un máximo de 100 o 150 restos.
En otro modo de realización preferente de la presente invención, el (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula, interacciona directamente con estructuras proteicas o no proteicas acumuladas en sitios distintos en el núcleo de la célula.
En un modo de realización preferente diferentes de la presente invención, el (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula, interacciona indirectamente con estructuras proteicas o no proteicas acumuladas en sitios distintos en el núcleo de la célula.
La interacción indirecta de nuevo se puede producir a través de moléculas proteicas o no proteicas tales como (poli)péptidos o ácidos nucleicos.
En un modo de realización preferente diferente, cualquiera de los (poli)péptidos presa comprende una señal de localización nuclear.
Una señal de localización nuclear dirige un producto de expresión al núcleo de la célula. Un ejemplo de una NLS es la secuencia peptídica PKKKRKV (señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 (Kalderon et al., 1984)), que puede dirigir proteínas heterólogas al núcleo. Más NLS son, por ejemplo, KR [PAATKKAGQA]KKKK, la NLS de la nucleoplasmina como un prototipo de una señal bipartita ubicua o KIPIK, la NLS del represor Mata2 de la transcripción de levaduras. Muchas otras secuencias de señales de localización nuclear son conocidos para los expertos en la técnica y se describen en la literatura.
Una NLS tiene que estar presente si el (poli)péptido presa fusionado al (poli)péptido fluorescente no se puede traslocar por sí mismo al núcleo. En general, (poli)péptidos de un tamaño de un máximo de 60 kDa se pueden traslocar al núcleo. Además, la composición de aminoácidos del (poli)péptido desempeña un papel, es decir, varios aminoácidos básicos consecutivos en un (poli)péptido pueden promover la traslocación del (poli)péptido al núcleo. Para garantizar que el (poli)péptido presa se trasloca y se acumula en el núcleo, es preferente que esté presente una NLS. Lo mismo es cierto para (poli)péptidos que se acumulan en sitios distintos del núcleo, pero que únicamente se traslocan al núcleo si está presente una NLS. Un ejemplo de dicho (poli)péptido es el represor de lac que por sí mismo no comprende una NLS.
En un modo de realización preferente diferente, la expresión en la célula eucariota se logra transfectando las moléculas de ácido nucleico que codifican dicha primera y segunda proteína de fusión en uno o más vectores.
La transfección es la introducción de moléculas de ácido nucleico en células eucariotas. Los procedimientos comúnmente usados comprenden, pero no se restringen a, transfección usando cloruro de calcio, JetPEI™ (PolyPlus) o lipofectin™ (Invitrogen).
El vector que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica dicha primera y/o segunda y/o tercera y/o cuarta proteína de fusión es un vector de expresión eucariota, preferentemente un vector de expresión de mamífero. La incorporación de la molécula de ácido nucleico en un vector ofrece la posibilidad de introducir la molécula de ácido nucleico de manera eficaz en las células y, preferentemente, el ADN de una célula huésped. La célula huésped puede ser una única célula tal como una célula de una línea celular. Dicha medida hace posible expresar, si se eligen los vectores de expresión, la molécula de ácido nucleico respectiva en la célula huésped. Por lo tanto, la incorporación de la molécula de ácido nucleico en un vector de expresión abre el camino a un nivel elevado de forma permanente del (poli)péptido o proteína codificada en cualquier célula o un subconjunto de células seleccionadas de la célula huésped.
En otro modo de realización preferente, el (poli)péptido acumulado en sitios distintos del núcleo de la célula se ha introducido en la célula. En un modo de realización preferente diferente, en caso de que dicho (poli)péptido interaccione con estructuras proteicas o no proteicas acumuladas en sitios distintos en el núcleo, dichas estructuras proteicas o no proteicas se pueden introducir en la célula.
De manera similar al vector o vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de la presente invención, también las moléculas de ácido nucleico que codifican las estructuras proteicas o no proteicas se pueden introducir en un vector. La molécula de ácido nucleico se integra preferentemente de manera estable en los cromosomas de la célula, lo que conduce a la generación de una línea celular estable.
En un modo de realización preferente diferente, los sitios distintos de la célula forman estructuras inertes.
En un modo de realización más preferente, la estructura inerte es la lámina nuclear o manchas nucleares.
En un modo de realización preferente diferente, el (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula, interacciona con cuerpos de PML (también denominados cuerpos
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nucleares de PML o PML NB).
Los cuerpos de PML se han asociado con muchas funciones nucleares, incluyendo la transcripción, la reparación del ADN, la defensa vírica, el estrés, la regulación del ciclo celular, la proteólisis y la apoptosis. La célula de mamífero promedio contiene 10-30 cuerpos nucleares de PML. Los cuerpos de PML se definen por la presencia de la proteína PML, identificado por primera vez por su fusión con el receptor alfa de ácido retinoico en la traslocación cromosómica t(15,17) (Borden, 2002; Mutilar et al., 2000; Moller et al., 2003) asociada con la leucemia promielocítica aguda (APL). La proteína PML es esencial para la formación de PML NB y, cuando está ausente, o sus dedos RING (que comprenden dedos de C3HC4 zinc como motivo estructural) están mutados, los cuerpos de PML se interrumpen.
En un modo de realización preferente diferente, el (poli)péptido que se acumula en sitios distintos del núcleo o las estructuras proteicas o no proteicas acumuladas en sitios distintos de la célula es heterólogo.
"Heterólogo", como se usa en la presente invención, indica el origen de una estructura proteica o no proteica que es diferente de la de la célula en la que se expresa, es decir, una especie diferente.
En otro modo de realización preferente, el (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula, interacciona con el ADN.
En un modo de realización más preferente, el ADN es el operador de lac.
En un modo de realización incluso más preferente, el operador de lac está presente en el núcleo en varias copias. El número de copias depende del experimento individual, es decir, del tipo de célula huésped usada o el (poli)péptido señuelo y/o el (poli)péptido presa. El número de copias comúnmente aplicado alcanza de al menos 150 copias de un plásmido que comprende 256 copias del operador de lac (es decir, 38400 copias del operador de lac) hasta aproximadamente 2000 copias de dicho plásmido (es decir, 512000 copias del operador de lac). En caso de que se necesite una mayor sensibilidad, el número de copias puede ser incluso mayor y llegar a un máximo de 3000 copias. De forma alternativa, se puede utilizar cualquier clase de plásmido que comprenda un número de copias diferente para obtener el número de copias deseado del operador de lac. El operador de lac puede estar dispuesto en tándem con o sin extensiones de ácido nucleico separando cada elemento. Los elementos se pueden disponer de forma antiparalela o paralela. Las líneas celulares que tienen varias copias del operador de lac integradas de forma estable en el núcleo son conocidas en la técnica (Janicki et al., 2004; Tsukamoto et al., 2000).
En otro modo de realización preferente, dicha primera proteína de fusión comprende LacI.
El represor de lac LacI es un tetrámero de subunidades idénticas. Cada subunidad contiene un motivo de hélicegiro-hélice (HTH) que se puede unir al ADN. El sitio del operador en el que se une el represor es una secuencia de ADN con simetría de repeticiones invertidas. Los dos semisitios de ADN del operador se unen a dos de las subunidades del represor tetramérico.
Tanto el operador de lac como LacI forman parte del operón lac bacteriano, una unidad de regulación del metabolismo de lactosa de bacterias. Si falta lactosa en el medio de cultivo, el represor se une muy fuertemente al operador de lac localizado en dirección 3 del promotor.
La presente invención hace uso de la interacción entre LacI y el operador de lac para formar una estructura de anclaje no proteica en el núcleo con la que el procedimiento de la invención se puede llevar a cabo convenientemente. En general, la interacción de LacI con el operador de lac se detecta en un sitio distinto en el núcleo.
Una ventaja importante de este modo de realización de la presente invención, en comparación con los procedimientos previamente conocidos, en particular el de (Miller et al., 2007), es que el número de copias del operador de lac que forma una matriz del operador de lac se puede variar para adaptar el sistema al nivel de expresión los (poli)péptidos tanto señuelo como presa. Por ejemplo, si la expresión de uno o ambos (poli)péptidos se encuentra demasiado alta en la célula, por lo tanto, por ejemplo, interfiriendo con los procesos celulares o interrumpiendo la señal fluorescente, se puede tomar otra célula que tenga un número de copias inferior del operador de lac, posibilitando, por lo tanto, una valoración de la detección de la interacción.
En un modo de realización más preferente, dicha segunda proteína de fusión comprende GFP.
En otro modo de realización preferente, la detección se lleva a cabo usando un microscopio de fluorescencia.
Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico usado para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas que usan los fenómenos de fluorescencia y fosforescencia en lugar de, o además de, la reflexión y la absorción. La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda (o longitudes de onda) específica que se absorbe por los fluoróforos, provocando que emitan longitudes de onda más largas de luz (de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida mucho más débil a través del uso de un filtro de emisión. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son la fuente de
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luz (lámpara de descarga de arco de xenón o de mercurio), el filtro de excitación, el espejo dicroico (o divisor de haz dicromático) y el filtro de emisión. Los filtros y el espejo dicroico se eligen para acoplar las características espectrales de excitación y emisión del fluoróforo usado para marcar la muestra. La mayoría de los microscopios de fluorescencia en uso son los microscopios de epifluorescencia (es decir: la excitación y la observación de la fluorescencia son desde arriba (epi) de la muestra). Estos microscopios se han convertido en una parte importante en el campo de la biología, abriendo las puertas para diseños de microscopios más avanzados, tales como el microscopio de barrido de láser confocal (CLSM) y el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Dichas tecnologías son bien conocidas para los expertos en la técnica.
En otro modo de realización preferente, la célula eucariota es una célula viva.
En otro modo de realización preferente, el procedimiento de la invención comprende, además, la localización de los (poli)péptidos señuelo y/o presa en la célula.
Este modo de realización sirve para confirmar que la colocalización tiene lugar, efectivamente, en el núcleo y para descartar la interacción no específica de los (poli)péptidos señuelo y presa. La localización se detecta por el experimentador o bien por un programa informático especializado que puede distinguir diferentes compartimentos celulares y es bien conocido para el experto en la técnica (por ejemplo ImageJ (versión 1.38, http://rsb.info.nih.gov/ij/).
También se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido fluorescente; (ii) un (poli)péptido que, cuando se expresa en una célula, se acumula en sitios distintos en el núcleo de la célula y (iii) un (poli)péptido señuelo.
También se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido que se une al operador de lac y (ii) un (poli)péptido que se une específicamente a GFP, un vector que comprende dicho ácido nucleico y una proteína codificada por dicho ácido nucleico.
Una "molécula de ácido nucleico" incluye ADN, tal como ADNc o ADN genómico, y ARN, tanto la hebra con sentido como la hebra antisentido. Se incluyen, además, moléculas que imitan ácidos nucleicos conocidas en la técnica, tales como derivados sintéticos o semisintéticos de ADN o ARN y polímeros mixtos. Dichas moléculas que imitan ácidos nucleicos o derivados de ácidos nucleicos incluyen ácido nucleico de fosforotioato, ácido nucleico de fosforamidato, ácido 2'-O-metoxietil ribonucleico, ácido morfolino nucleico, ácido hexitol nucleico (HNA) y ácido nucleico bloqueado (LNA) (véase (Braasch y Corey, 2001)). El LNA es un derivado de ARN en el que el anillo de ribosa está limitado por un enlace metileno entre el oxígeno 2' y el carbono 4'. Pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivadas adicionales, como se apreciará fácilmente por los expertos en la técnica.
Se describe en el presente documento, además, que la proteína de fusión comprende LacI.
También se describe en el presente documento una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención. Las características de una proteína o (poli)péptido se definen en otra parte en la presente solicitud.
Se describe, además, que la proteína comprende LacI.
En un aspecto alternativo, la presente invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico caracterizada en las reivindicaciones adjuntas. Las propiedades de un vector se han descrito en otra parte en la presente solicitud. Además de las características ya descritas, el vector de la presente invención puede ser un vector procariota. Los vectores procariotas y sus propiedades son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el vector es un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado convencionalmente, por ejemplo, en ingeniería genética.
La molécula de ácido nucleico se puede insertar en varios vectores disponibles comercialmente. Los ejemplos no limitantes incluyen vectores compatibles con una expresión en células de mamífero como pREP (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBOpSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, plZD35, pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems), pTriEx-Hygro (Novagen), pCINeo (Promega), el vector de expresión de ADNc pcDV1 de Okayama-Berg (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega) o pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia).
Para las técnicas de modificación de vectores, véase Sambrook y Russel (2001), loc. cit. En general, los vectores pueden contener uno o más orígenes de replicación (ori) y sistemas de herencia para la clonación o expresión, uno
o más marcadores para la selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión.
Las moléculas de ácido nucleico insertadas en el vector se pueden sintetiza, por ejemplo, por procedimientos estándar, o se pueden aislar de fuentes naturales. El ligamiento de las secuencias codificantes a elementos reguladores de la transcripción y/o a otras secuencias codificantes de aminoácidos se puede llevar a cabo usando procedimientos establecidos.
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comparación de los resultados de F2H se alienaron las bandas de entrada (izquierda) y unidas (derecha) de Co-PI con las señales correspondientes del ensayo F2H. La mancha de LacI de la construcción señuelo XRCC1-LacI-RFP mostrada en rojo y la fracción unida se alinearon con la señal respectiva de las construcciones de presas marcadas con GFP. Las imágenes de células enteras de los respectivos experimentos F2H se muestran en (a) y la figura 6.
Figura 3
Análisis F2H de la interacción independiente del ciclo celular de Dnmt1 con PCNA. (a) Boceto esquemático de Dnmt1 de ratón de longitud completa y proteínas de fusión. PBD, dominio de unión a PCNA; NLS, secuencia de localización nuclear; TS, secuencia de dirección; ZnF, región de unión a Zn2 +; BAH 1 y 2, dos dominios de homología adyacentes a bromo. (b) Esquema de las posibilidades de unión de las proteínas de fusión a la matriz del operador de lac (lac op) y en la horquilla de replicación. (c) Células BHK transgénicas que contienen una matriz del operador de lac cromosómico se cotransfectaron con las construcciones PBD-LacI-YFP y RFP-PCNA. RFP-PCNA muestra la distribución dependiente del ciclo celular característica (disperso en células que no están en fase S (fila superior) y patrones focales en fase S (fila inferior)). La parte del represor de lac de la proteína de fusión PBD-LacI-YFP media la unión a la matriz del operador de lac (visible como una mancha verde y destacado por puntas de flecha) y el PBD media la unión a PCNA en los sitios de replicación (patrón focal en fase S). Obsérvese que RFP-PCNA se localiza en la matriz del operador de lac en células en fase S y que no están en fase S, lo que indica una interacción del PBD de Dnmt1 con PCNA en todo el ciclo celular e independiente de la maquinaria de replicación. (d) Células BHK se transfectaron con vectores de expresión para ΔPBD-LacI-YFP y RFP-PCNA. Como anteriormente, RFP-PCNA muestra una distribución dispersa fuera de la fase S (fila superior) y se redistribuye en los sitios de replicación en la fase S (fila inferior). La proteína de fusión ΔPBD-LacI-YFP se une a la matriz del operador de lac (mancha verde marcada por la punta de flecha), pero no se une a sitios de replicación en fase S, ya que carece del PBD. De forma importante, en estas células RFP-PCNA (presa) no se localiza en la matriz del operador de lac (marcado por puntas de flecha), lo que indica que la unión depende de la presencia del PBD, que está ausente en ΔPBD-LacI-YFP (señuelo). Barras de escala 5 μm.
Figura 4
Análisis de las interacciones relacionadas con la enfermedad de Huntington por F2H. Interacciones indicadas entre
(a) SUMO3 y HZFH y (b) HZFH y vimentina reveladas por F2H. (c) El análisis F2H muestra ausencia de interacción entre SUMO3 y vimentina como se describe previamente (Goehler et al., 2004). En (b) el núcleo se perfila mediante una línea discontinua y en (c) la matriz del operador de lac está indicada (puntas de flecha). Barras de escala 5 μm.
Figura 5
Análisis de las interacciones proteína-proteína mitocondriales y el efecto de una mutación asociada con el síndrome de Mohr-Tranebjaerg. (a) Vista general esquemática del complejo hexamérico DDP1-TIMM13 en el espacio intermembrana (IMS) de las mitocondrias. (b + c) Células BHK que expresan la proteína señuelo mCherry-LacI-TIMM13 junto con GFP-DDP1 (b) o el mutante de pérdida de función GFP-DDP1C66W (c). Mientras que la fusión natural funcional GFP-DDP1 muestra interacción con TIMM13 revelada por colocalización de las señales fluorescentes en la matriz del operador de lac (b), el mutante GFP-DDP1C66W se distribuye de forma dispersa por todo el núcleo, lo que indica que no hay interacción (c). Barras de escala 5 μm.
Figura 6
Interacción mediada por BRCT de ADN-ligasa III con XRCC1 revelada por el ensayo F2H. Células BHK transgénicas que contenían una matriz del operador de lac se cotransfectaron con XRCC1-LacI-RFP y varias construcciones de ADN-ligasa III marcadas con GFP. La parte del represor de lac de la proteína de fusión XRCC1-LacI-RFP media la unión a la matriz del operador de lac (visible como una mancha roja). El dominio BRCT es necesario y suficiente para dirigir la ADN ligasa III a la matriz del operador de lac a través de la interacción con XRCC1. Obsérvese que la ADN ligasa I altamente homóloga no se acumula en la matriz del operador de lac, lo que indica que no interacciona con XRCC1. Barras de escala 5 μm.
Figura 7
El ensayo F2H revela la interacción de XRCC1 con PCNA, PARP-1 y PARP-2. Células BHK que contenían una matriz del operador de lac se transfectaron con vectores de expresión para XRCC1-LacI-RFP y GFP-PARP-1, GFP-PARP-2 o GFP-PCNA. La parte del represor de lac de la proteína de fusión XRCC1-LacI-RFP media la unión a la matriz del operador de lac (visible como una mancha roja). GFP-PARP-1, GFP-PARP-2 y GFP-PCNA están dirigidos a la matriz del operador de lac, lo que indica una interacción con XRCC1. Barra de escala 5 μm.
Figura 8
El ensayo F2H revela la interacción mediada por PBD de la ADN-ligasa I con PCNA. Células U2OS transgénicas que contenían una matriz del operador de lac se cotransfectaron con NLS-PCNA-LacI-RFP y varias construcciones de ADN-ligasa I marcadas con GFP. La parte del represor de lac de la proteína de fusión NLS-PCNA-LacI-RFP media la unión a la matriz del operador de lac (visible como una mancha roja). El PBD es necesario y suficiente para dirigir la
ADN ligasa I a la matriz del operador de lac a través de la interacción con PCNA. Barra de escala 5 μm.
Figura 9
Interacción de diferentes proteínas de replicación y reparación con PCNA revelada por el ensayo F2H. Células BHK transgénicas que contenían una matriz del operador de lac que expresaban NLS-PCNA-LacI-RFP y varias proteínas 5 de replicación y reparación marcadas por GFP. Todas las proteínas sometidas a prueba interaccionan con PCNA. Barra de escala 5 μm.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1: Materiales y procedimientos
Construcciones de expresión
10 La secuencia codificante de LacI se amplificó por PCR a partir del vector de expresión p3'SS EGFP-LacI (Robinett et al., 1996) usando los siguientes cebadores: cebador directo 5'-TCT AGA AAG CTT TCC ATG GTG AAA CCA GTA-3' y cebador inverso 5'-CCA TGC CCG GGA CAG TCG TCG TCG GGA AAC-3' (sitios de restricción en cursiva). Este fragmento de PCR se digirió con HindIII y XmaI y se clonó en los mismos sitios de dos vectores de expresión Dnmt1-YFP (MTNY.2 y PBHD-YFP) (Easwaran et al., 2004) generando PBD-LacI-YFP y ΔPBD-LacI-YFP. Las
15 construcciones NLS-PCNA-LacI-RFP y XRCC1-LacI-RFP se generaron mediante amplificación por PCR del ADNc de PCNA y XRCC1 usando los siguientes cebadores (sitios de restricción en cursiva):
- PCNA directo
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- PCNA inverso
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- XRCC1 directo
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- XRCC1 inverso
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Posteriormente, los fragmentos de PCR se clonaron en un vector de expresión LacI-RFP usando los sitios XhoI/HindIII para NLS-PCNA-LacI-RFP y los sitios BglII/EcoRI para el vector de expresión XRCC1-LacI-RFP.
Todas las otras construcciones F2H se generaron por amplificación por PCR de ADNc codificantes y posterior 20 ligamiento en los sitios AsiSI y NotI de los vectores de expresión de señuelo y presa descritos en la figura 1a. Se usaron los siguientes cebadores con el sitio de restricción indicado en cursiva:
- DDP1 directo
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- DDP1 inverso
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- TIMM13 directo
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- TIMM13 inverso
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- HZFH directo
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- HZFH inverso
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- SUMO3 directo
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- SUMO3 inverso
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- Vim directo
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- Vim inverso
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Las construcciones de expresión en mamíferos que codifican fusiones de traducción de DNMT1 humano, ADNligasa I, ADN-ligasa III, p21, FEN I, la subunidad p66 de la polimerasa , PARP-1, PARP-2 y PCNA se describieron previamente (Cazzalini et al., 2003; Maeda et al., 2006; Meder et al., 2005; Mortusewicz et al., 2005; Schermelleh et
25 al., 2005; Sporbert et al., 2005). Las construcciones de deleción y los dominios aislados de ADN-ligasa I y III se describieron en Mortusewicz et al. (Mortusewicz et al., 2006). Las inmunoprecipitaciones se realizaron con un GFPnanotrap (Rothbauer et al., 2007) como se describe anteriormente (Mortusewicz et al., 2006). Todas las construcciones de fusión se sometieron a prueba para la expresión y localización correctas.
Cultivo celular y transfección
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RFP-PCNA que además marca sitios de replicación del ADN, lo que permite la identificación de células en fase S (Easwaran et al., 2005; Sporbert et al., 2005). Las posibilidades de unión de estas proteínas de fusión en la matriz del operador de lac y la horquilla de replicación se resumen en la figura 3b.
Fuera de la fase S, la parte LacI de las proteínas señuelo se une únicamente a la matriz del operador de lac integrado cromosómicamente, que -dependiendo de la ploidía de la célula -se hace visible como una o dos manchas fluorescentes en el núcleo. La interacción de RFP-PCNA con la parte PBD de la proteína señuelo da como resultado la colocalización de las señales fluorescentes en la matriz del operador de lac (panel superior de la figura 3c), mientras que la deleción del PBD en la proteína señuelo conduce a una distribución dispersa de RFP-PCNA en células que no está en la fase S (panel superior de la figura 3d). Esto ilustra claramente que la interacción dependiente de PBD de Dnmt1 con PCNA también se produce fuera de la fase S.
En células en fase S, RFP-PCNA se localiza en sitios de replicación del ADN en curso y, además, se recluta a la matriz del operador de lac por la proteína señuelo PBD-LacI-YFP (panel inferior de la figura 3c). En contraste, cuando RFP-PCNA se coexpresa junto con una proteína señuelo que carece de un PBD funcional (ΔPBD-LacI-YFP), RFP-PCNA se enriquece de forma exclusiva en los sitios de replicación del ADN y no en la matriz del operador de lac, destacado por ΔPBD-LacI-YFP (panel inferior de la figura 3d).
Estos resultados muestran claramente que la localización de RFP-PCNA (presa) en la matriz del operador de lac depende de la presencia del PBD en la construcción señuelo y que esta interacción no está limitada a la fase S.
A continuación, se analizó la interacción de otras proteínas que contienen PBD con PCNA. Se generó una proteína de fusión señuelo que comprende PCNA fusionado con una NLS adicional, seguida de LacI y RFP (NLS-PCNA-LacI-RFP). Cuando se coexpresaba con GFP-ligasa I, ambas proteínas de fusión se localizaban en la matriz del operador de lac, lo que indica interacción entre PCNA y la ADN ligasa I. La deleción del PBD conduce a una distribución dispersa de ADN ligasa I, mientras que el PBD de la ADN ligasa I en solitario era suficiente para la unión a PCNA en la matriz del operador de lac (figura 8). Esto está de acuerdo con estudios previos que muestran que el PBD de la ADN ligasa I es necesario y suficiente para dirigirse a los sitios de replicación y reparación del ADN (Cardoso et al., 1997; Montecucco et al., 1995; Mortusewicz et al., 2006). De forma destacable, usando el ensayo F2H se pudo demostrar que la ADN ligasa I, así como el PBD aislado, se pueden unir a PCNA también fuera de la fase S. Asimismo, se pudo demostrar la unión de varias proteínas de replicación y reparación adicionales como FEN1, p21 y la subunidad p66 de la polimerasa a PCNA en células que no están en la fase S (figura 9). Tomados conjuntamente, se pudo demostrar que la interacción entre proteínas de replicación y PCNA no está limitada a la fase S, sino que también se produce en células que no están en la fase S y fuera de la maquinaria de replicación. Esto ilustra que el ensayo F2H ofrece el potencial único para analizar cambios específicos del ciclo celular en las interacciones proteína-proteína en células vivas.
Ejemplo 5: Detección de interacciones entre proteínas relacionadas con la enfermedad de Huntington
Para investigar si el ensayo F2H también puede detectar interacciones proteína-proteína que tienen lugar en otros compartimentos celulares, se sometió a prueba el ensayo F2H con interacciones de proteínas identificadas en el contexto de la enfermedad de Huntington por ensayos de doble híbrido de levaduras (Y2H) (Goehler et al., 2004). Se analizó la interacción de una proteína citoplásmica (vimentina) y dos proteínas nucleares (HZFH y SUMO3). La vimentina se ha descrito como un componente del citoesqueleto y participa en procesos de transporte, mientras que HZFH y SUMO3 están implicadas en la regulación de la transcripción y el mantenimiento del ADN (Goehler et al., 2004). Estas proteínas se fusionan con una mCherry-LacI-NLS roja fluorescente o con NLS-GFP para generar conjuntos de proteínas señuelo y presa. Células BHK que portan una matriz del operador de lac se transfectaron con todas las posibles combinaciones de construcciones de expresión y se sometieron a análisis microscópico. Se pudo detectar una interacción entre vimentina y HZFH independiente de si estas dos proteínas se usaban como señuelo o presa (figura 4 y datos no mostrados). También se pudo detectar la interacción indicada entre SUMO3 y HZFH, mientras que vimentina y SUMO3 no interaccionaban, como se describe previamente (figura 4) (Goehler et al., 2004). Estos resultados muestran que las interacciones de las proteínas nucleares y citoplásmicas se pueden estudiar con el ensayo F2H.
Ejemplo 6: Detección de interacciones entre proteínas mitocondriales
A continuación, se investigó si el ensayo F2H también es adecuado para detectar interacciones proteína-proteína que se producen en otros orgánulos celulares. Con este fin, se analizó la interacción entre dos proteínas mitocondriales, DDP1 (péptido 1 de distonía por hipoacusia) y TIMM13. Ambas proteínas están codificadas en el núcleo y se importan al espacio intermembrana mitocondrial (IMS), formando un complejo hexamérico (figura 5a). Dentro del IMS, el complejo DDP1-TIMM13 facilita la importación de proteínas hidrófobas de la maquinaria de importación mitocondrial a la membrana interna mitocondrial (Rothbauer et al., 2001). Una mutación del gen DDP1 se asoció con el síndrome de Mohr-Tranebjaerg, que es un trastorno progresivo y neurodegenerativo (Tranebjaerg et al., 1995). Se sabe que esta mutación sin sentido C66W provoca un fenotipo completo y afecta al motivo Cys(4) altamente conservado de DDP1. Estudios previos han demostrado que este intercambio de aminoácidos anula la interacción entre DDP1 y TIMM13 en el IMS (Hofmann et al., 2002).
Usando una proteína de fusión señuelo roja fluorescente que comprende LacI-NLS-TIMM13 y proteínas presa DDP1 naturales (GFP-DDP1) o mutantes (GFP-DDP1C66W) marcadas con GFP, se analizó esta interacción de proteínas mitocondriales específica con el ensayo F2H. Se descubrió que GFP-DDP1 se colocaliza con TIMM13 en la matriz del operador de lac (figura 5b), mientras que GFP-DDP1C66W estaba distribuida uniformemente (figura 5c). Estos resultados demuestran que el ensayo F2H también es adecuado para el análisis de interacciones proteína-proteína que se producen fuera del núcleo y la caracterización de mutaciones puntuales relacionadas con enfermedades que interrumpen estas interacciones.
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