ES2607185T3 - GNLY como marcador epigenético para la identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56 - Google Patents

GNLY como marcador epigenético para la identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56 Download PDF

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ES2607185T3 ES09005876.9T ES09005876T ES2607185T3 ES 2607185 T3 ES2607185 T3 ES 2607185T3 ES 09005876 T ES09005876 T ES 09005876T ES 2607185 T3 ES2607185 T3 ES 2607185T3
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Abstract

Un procedimiento de identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56 en una muestra derivada de un mamífero, que comprende analizar el estado de metilación de los motivos CpG en un amplicón de acuerdo con SEQ ID NO: 29 a 34, en el que una desmetilación de dichos motivos CpG hasta al menos un 70 % en un linfocito citolítico natural en dicha muestra, cuando se compara con un linfocito citolítico no natural, es indicativa de un linfocito citolítico natural que expresa CD56.

Description

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una proteína madura de 529 aminoácidos.
Se describe como una NK-SDR la 5’ UTR de FGR, o preferentemente la 3’ UTR de FGR. Además, se ha descrito que las regiones desmetiladas específicas de los linfocitos citolíticos naturales se localizan en las secuencias intrónicas de este gen. En particular también se prefieren las NK-SDR que se localizan alrededor de los límites exónintrón de FGR, preferentemente los límites entre el primer exón y el primer intrón y/o el primer intrón y el segundo exón y/o el segundo exón y el segundo intrón y/o el segundo intrón y el tercer exón y/o el tercer exón y el tercer intrón y/o el tercer intrón y el cuarto exón y/o el cuarto exón y el cuatro intrón y/o el cuarto intrón y el quinto exón y/o el quinto exón y el quinto intrón y/o el quinto intrón y el sexto exón y/o el sexto exón y el sexto intrón y/o el sexto intrón y el séptimo exón y/o el séptimo exón y el séptimo intrón y/o el séptimo intrón y el octavo exón y/o el octavo exón y el octavo intrón y/o el octavo intrón y el noveno exón y/o el noveno exón y el noveno intrón y/o el noveno intrón y el décimo exón y/o el décimo exón y el décimo intrón y/o el décimo intrón y el onceavo exón, o cualquier combinación preferida de los anteriores.
Está bien establecido en la técnica que los elementos reguladores genéticos que están sometidos a regulación genética por metilación están localizados corriente arriba y corriente abajo de la fase de lectura abierta de un gen determinado -por ejemplo, regiones amplificadoras que son sitios de unión para reguladores transcripcionales indispensables. Por lo tanto, se describen NK-SDR, que se localizan en 10000 bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción de FGR, preferentemente 9000 bases, 8000 bases, 7000 bases, 6000 bases, 5000 bases, 4000 bases, 3000 bases o 2000 bases corriente arriba de FGR, incluso más preferida es una región 1000 bases corriente arriba del inicio transcripcional de FGR, y las NK-SDR más preferibles en las primeras 500 bases corriente arriba del inicio transcripcional de FGR. Se localizan NK-SDR particulares en el gen promotor de FGR.
Además se describen NK-SDR corriente abajo de la fase de transcripción abierta (ORF) de FGR, preferentemente en 10000 bases corriente abajo de la ORF de FGR, más preferible 8000 bases corriente abajo de FGR, incluso más preferida es una región 6000 bases corriente abajo de la ORF de FGR, preferentemente 4000 bases corriente abajo de FGR y las NK-SDR más preferibles en las primeras 2000 bases corriente abajo de la ORF de FGR.
Se describen grupos de NK-SDR de FGR, que comprenden cualquier combinación posible de las NK-SDR preferidas de FGR mencionadas anteriormente.
También se describen NK-SDR de FGR que se encuentran en las regiones de SEQ ID NO: 2, preferentemente una región que se selecciona de entre el grupo de SEQ ID NO: 17 a 28, preferentemente de SEQ ID NO: 17, o cualquier combinación de los mismos. Se prefieren adicionalmente amplicones de FGR que se generan utilizando un par de cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 96 a 137, en los que los cebadores que tienen el mismo número en su nombre, pero se diferencian en la última posición del nombre, son pareja.
GNLY
El gen GNLY en seres humanos se localiza en la cadena directa del segundo cromosoma. La región del gen engloba 4,7 kb de ADN genómico que comprende las UTR 5’ y 3’, 6 exones y 5 regiones intrónicas (publicación Ensembl 53, marzo de 2009). Hay cuatro variantes empalmadas alternativamente de las transcripciones que codifican productos proteicos de entre 89 y 145 aminoácidos.
En un aspecto adicional, una NK-SDR preferida de la presente invención es la 5’ UTR de GNLY, o es preferible la 3’ UTR de GNLY. Además, las regiones desmetiladas específicas de linfocitos citolíticos naturales de la presente invención se localizan en las secuencias intrónicas de este gen. En particular se prefieren también las NK-SDR que se localizan alrededor de los límites exón-intrón de GNLY, preferentemente el límite entre el primer exón y el primer intrón y/o el primer intrón y el segundo exón y/o el segundo exón y el segundo intrón y/o el segundo intrón y el tercer exón y/o el tercer exón y el tercer intrón y/o el tercer intrón y el cuarto exón y/o el cuarto exón y el cuarto intrón y/o el cuarto intrón y el quinto exón y/o el quinto exón y el quinto intrón y/o el quinto intrón y el sexto exón, o cualquier combinación posible preferida de los anteriores.
Está bien establecido en la técnica, que los elementos reguladores importantes que están sujetos a regulación genética por metilación están localizados corriente arriba y corriente abajo de la fase de lectura abierta de un determinado gen – por ejemplo, regiones amplificadoras que son sitios de unión para reguladores de la transcripción indispensables. Por lo tanto, como una realización preferida de la presente invención se proporcionan NK-SDR, que se localizan en 10000 bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción de GNLY, preferentemente 9000 bases, 8000 bases, 7000 bases, 6000 bases, 5000 bases, 4000 bases, 3000 bases, o 2000 bases corriente arriba de GNLY, incluso es más preferida una región de 1000 bases corriente arriba del inicio transcripcional de GNLY y las NK-SDR más preferibles en las primeras 500 bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción de GNLY. Sin embargo, se prefiere particularmente, que las NK-SDR de la presente invención se localicen en el gen promotor de GNLY.
Además, las realizaciones preferidas de la presente invención comprenden NK-SDR corriente abajo de la fase de lectura abierta (ORF) de GNLY, preferentemente en 10000 bases corriente abajo de la ORF de GNLY, más preferentemente 8000 bases corriente abajo de GNLY, incluso es más preferida una región 6000 bases corriente abajo de la ORF de GNLY, preferentemente 4000 bases corriente abajo de GNLY y las NK-SDR más preferidas en
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las primeras 2000 bases corriente abajo de la ORF de GNLY.
La presente invención proporciona además preferentemente grupos de NK-SDR de GNLY, que comprenden cualquier combinación posible de las NK-SDR de GNLY preferidas mencionadas anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere entonces a NK-SDR de GNLY que se encuentran en las regiones de SEQ ID NO: 3, preferentemente una región que se selecciona de entre el grupo de SEQ ID NO: 29 a 34, preferentemente de SEQ ID NO: 29, o cualquier combinación de las mismas. Se prefieren además los amplicones de GNLY que se generan utilizando un par de cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 138 a 159, en el que los cebadores que tienen el mismo número en su nombre, pero se diferencian en la última posición del nombre, son pareja.
El siguiente aspecto de la invención se refiere entonces a las regiones de desmetilación específicas de linfocitos citolíticos naturales combinadas, en las que las combinaciones de la invención se componen de NK-SDR únicas preferidas del gen GNLY anterior, combinado con NKG7, CX3CR1, y/o FGR. Por lo tanto, preferentemente para el análisis de una muestra de células, se combinan los múltiples patrones de desmetilación de NK-SDR para concluir la presencia de un CD56 que expresa el linfocito citolítico natural o una sub-fracción de linfocitos citolíticos naturales, preferentemente linfocitos NK CD56oscuros o CD56brillantes y/o linfocitos NK CD16+ o CD16-y/o linfocitos NK CD8+ o CD8-.
En otra realización, el procedimiento de acuerdo con la presente invención se prefiere, en el que dicho análisis del estado de metilación comprende la amplificación con al menos un cebador del par de cebadores útil para amplificar un amplicón que se selecciona de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 a 34.
Preferentemente, la amplificación implica una enzima polimerasa, una PCR o reacción química de amplificación u otros procedimientos de amplificación que conoce el experto como se describe posteriormente, por ejemplo, en el contexto de MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, ensayos de restricción específica de secuenciación metílica MethylLight. Con la amplificación, el amplicón de la NK-SDR o de cualquier otra región del gen GNLY o cualquier parálogo u ortólogo que se describe en el presente documento constituye una “herramienta” particularmente preferida para llevar a cabo el procedimiento(s) de acuerdo con la presente invención. En consecuencia, constituyen realizaciones preferidas de la primera invención un oligómero de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO: 48, 49 y 138 a 159 o el amplicón que se amplifica con el par de cebadores que se selecciona de entre SEQ ID NO: 48, 49 y 138 a 159, o cualquier otra secuencia del locus GNLY.
El experto en la técnica será capaz además de seleccionar subgrupos específicos de posiciones CpG con el fin de minimizar la cantidad de sitios que se van a analizar, por ejemplo todos los sitios presentes en los amplicones de acuerdo con SEQ ID NO: 29 a 34, o cualquier otra secuencia del gen GNLY.
Con el fin de analizar el estado de metilación de posiciones CpG, se puede utilizar cualquier procedimiento conocido para analizar la metilación de ADN. En una realización del procedimiento de acuerdo con la presente invención, el análisis del estado de metilación comprende un procedimiento que se selecciona de metilación específica de digestiones enzimáticas, secuenciación por bisulfito, análisis seleccionados de la metilación de promotor, metilación de isla de CpG, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE u otros procedimientos que se basan en una detección de ADN amplificado. Estos procedimientos son bien conocidos por el experto, y se pueden encontrar en la bibliografía.
Otro importante aspecto de la presente invención se refiere entonces al uso de un amplicón de acuerdo con SEQ ID NO: 29 a 34 o un amplicón producido por un par de cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 48, 49, y 138 a 159, y/o un oligómero que se hibrida con una secuencia que se selecciona de entre SEQ ID NO: 29 a 34, preferentemente un oligómero que se selecciona de SEQ ID NO: 48, 49, y 138 a 159 para identificar y/o controlar linfocitos citolíticos naturales CD56oscuros o CD56brillantes en un mamífero con los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Estos amplicones proporcionan herramientas importantes para llevar a cabo las realizaciones preferidas de los procedimientos de la presente invención.
Además, se prefiere un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende adicionalmente la etapa de analizar los marcadores celulares CD56, CD16 y/o CD8. Con el fin de analizar estos marcadores adicionales, se puede utilizar cualquier procedimiento conocido para analizar la expresión, tal como los procedimientos que utilizan anticuerpos, y/o análisis desmetilación. El análisis de estos marcadores preferentemente mejoran adicionalmente la precisión del análisis, y pueden permitir identificar subgrupos de células. Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende una identificación que es una distinción de dichos linfocitos citolíticos naturales a partir de los tipos celulares de sangre periférica principales o de células no sanguíneas.
El procedimiento de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo en cualquier mamífero que tenga los marcadores anteriores u ortólogos o parálogos de los mismos, se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que el mamífero es un ratón, rata, mono o ser humano, preferentemente un ser humano.
El procedimiento(s) de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo in vitro. En general, se pueden utilizar todas las muestras biológicas, siempre que contengan células adecuadas o el ADN adecuado de las células de interés. Se prefiere un procedimiento en el que dicha muestra se selecciona de entre una muestra reciente, reciente congelada o totalmente preparada que incluye un fluido corporal de mamífero, preferentemente muestras de
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También se describe un procedimiento mejorado de tratamiento de enfermedades que se relacionan con la expresión de genes marcadores tal como enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes, cáncer, alergias y/o cualquier enfermedad relacionada directamente con linfocitos NK, tal como, pero sin limitarse a SCID-X1, que comprende un procedimiento como el que se ha descrito anteriormente en el presente documento. El término “tratamiento” también incluye una prevención de enfermedades relacionadas con la expresión de genes marcadores.
Se describe además un kit para identificar y/o controlar linfocitos citolíticos naturales, en particular linfocitos citolíticos naturales CD56oscuros o CD56brillantes, y/o CD16+ o CD16-, y/o CD8+ o CD8-, en un mamífero basándose en el análisis del estado de metilación de las posiciones CpG en uno o más genes seleccionando de entre CX3CR1, FGR, NKG7 y GNLY, que comprende materiales para llevar a cabo un método que se describe en el presente documento, en particular un kit que comprende a) un reactivo de bisulfito, y b) materiales para el análisis de metilación de posiciones CpG que se seleccionan de entre las posiciones CpG del gen CX3CR1-1 (1452) de acuerdo con SEQ ID NO: 5, o los amplicones de CX3CR1 ROI956 a 966; GNLY de acuerdo con SEQ ID NO: 6 a 16; FGR de acuerdo con SEQ ID NO: 2, preferentemente del amplicón FGR-1 (Amp. 1454) de acuerdo con SEQ ID NO: 17, o los amplicones de FGR ROI967 a 977 de acuerdo con SEQ ID NO: 18 a 28; GNLY de acuerdo con SEQ ID NO: 3, preferentemente del amplicón GNLY 1 (1458) de acuerdo con SEQ ID NO: 29 o los amplicones GNLY ROI978 a 982 de acuerdo con SEQ ID NO: 30 a 34 y/o NKG7 de acuerdo con SEQ ID NO: 4, preferentemente del amplicón NKG7-1 (1455) de acuerdo con SEQ ID NO: 35 o amplicones NKG7 ROI983 a 988 de acuerdo con SEQ ID NO: 36 a 41. El experto será capaz adicionalmente de seleccionar materiales para subgrupos específicos de posiciones con el fin de minimizar la cantidad de sitios que se van a analizar, por ejemplo, todos los sitios presentes en un amplicón como anteriormente o todos los sitios presentes en otro amplicón como anteriormente, o posiciones CpG ortólogas o parálogas de las mismas. El kit puede ser un kit de diagnóstico.
En otro aspecto más la presente invención, se refiere al uso de un oligómero o amplicón de acuerdo con la presente invención para identificar y controlar linfocitos citolíticos naturales CD56oscuros o CD56brillantes, o CD16+ o CD16-, y/o CD8+ o CD8-en un mamífero.
La presente invención se describirá a partir de ahora con más detalle en forma de realizaciones preferidas de la misma en los siguientes ejemplos, sin embargo, sin limitarse a los mismos.
Breve descripción de los dibujos y secuencias
La Figura 1 muestra la medición de varias fracciones celulares de leucocitos, incluyendo linfocitos NK (segundo por la izquierda). Cada línea representa una CpG individual ejemplar en el amplicón representativo y seleccionado del gen CX3CR1 (amplicón 1452: CX3CR1-1, SEQ ID NO: 5). Comenzando desde la izquierda, cada línea respectiva muestra la metilación de las CpG que se dan, en linfocitos B, linfocitos T CD3+ positivos a CD8, monocitos, linfocitos NK, y granulocitos. Los códigos de color indican el nivel de metilación en cada tipo celular siendo el azul el que representa metilación completa y el verde que indica una disminución importante de la metilación.
La Figura 2 muestra la medición de varias fracciones celulares de leucocitos, incluyendo linfocitos NK. Cada línea representa una CpG individual ejemplar en el amplicón representativo y seleccionado del gen FGR (amplicón 1454: FGR-1, SEQ ID NO: 17). Comenzando por la izquierda cada línea respectiva muestra la metilación de las CpG que se nombran en linfocitos B, linfocitos T CD3+, linfocitos CD3+ positivos a CD4, monocitos, linfocitos NK, y granulocitos. Los códigos de color indican que el nivel de metilación en cada tipo celular representando el azul la metilación completa e indicando el verde una disminución importante de la metilación.
La Figura 3 muestra la medición de varias fracciones celulares de leucocitos, incluyendo linfocitos NK. Cada línea representa una CpG individual ejemplar en el amplicón representativo y seleccionado del gen NKG7 (amplicón 1455: NKG7-1, SEQ ID NO: 35). Comenzando por la izquierda cada línea respectiva muestra la metilación de las CpG que se nombran en linfocitos B, linfocitos T CD3+ positivos a CD8, linfocitos CD3+ positivos a CD4, monocitos, células NK, y granulocitos. Los códigos de color indican el nivel de metilación en cada tipo celular representando el azul la metilación completa e indicando el verde una disminución importante de la metilación.
La Figura 4 muestra la medición de varias fracciones celulares de leucocitos, incluyendo linfocitos NK. Cada línea representa una CpG ejemplar individual en el amplicón representativo y seleccionado del gen GNLY (amplicón 1458: GLNY-1, SEQ ID NO: 29). Comenzando por la izquierda cada línea respectiva muestra la metilación de las CpG que se nombran en linfocitos B, linfocitos T CD3+ positivos a CD8, linfocitos CD3+ positivos a CD4, monocitos, linfocitos NK, y granulocitos. El código de color indica el nivel de metilación en cada tio celular representando el azul la metilación completa y el verde una disminución importante de la metilación.
SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la región genética humana de CX3CR;
SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de nucleótidos de la región genética humana de FGR;
SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de nucleótidos de la región genética humana de GNLY;
SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de nucleótidos de la región genética humana de NKG7;
SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de nucleótidos de los amplicones CX3CR1-1 de CX3CR1;
SEQ ID NO: 6 to 16 muestran las secuencias de nucleótidos de los amplicones ROI956 a 966 de CX3CR1;
SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de nucleótidos de los amplicones FGR-1 de FGR;
SEQ ID NO: 18 to 28 muestran las secuencias de nucleótidos de los amplicones ROI967 a 977 de FGR; SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de nucleótidos de los amplicones GLNY-1 de GLNY; SEQ ID NO: 30 to 34 muestran las secuencias de nucleótidos de los amplicones ROI978 a 982 de GLNY; SEQ ID NO: 35 muestra la secuencia de nucleótidos de los amplicones NKG7-1 de NKG7; SEQ ID NO: 36 to 41 muestran las secuencias de nucleótidos de los amplicones ROI983 a 988 de NKG7; y SEQ ID NO: 42 to 181: muestran las secuencias de cebador que se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1: Secuencias de cebador
Nombre del cebador
Nombre del gen diana Secuencia SEQ ID NO:
1455o
NKG7 TAAAACTATAAATCCCACCCAC 42
1455p
NKG7 AAGGATTAGGAGAAGAAGGTTT 43
1452q
CX3CR1 TAGGGGTTAGGTAGGTAATGAA 44
1452r
CX3CR1 ACACAACTCTTCTCCTCAAAAT 45
1454o
FGR CCAACCCCAAAAATATAAACAT 46
1454p
FGR ATGTGGGTAAATGAGGATGTAG 47
1458q
GLNY ATTGGATTAAGTTTGGTTTTGA 48
1458r
GLNY ACCCTAAACTACTTCTTCACACA 49
1503r
CX3CR1 CCCCAAACTTAAAATTCAATAC 50
1503q
CX3CR1 TTAGGAGAGAAGTTGTTATTGGT 51
1504p
CX3CR1 AGGTAGGGGATTAGGAAAGTAG 52
1504o
CX3CR1 AATTCCAACCAAATAAAAACAT 53
1505p
CX3CR1 ATTTAAGTAGTGAGGATGGAGG 54
1505o
CX3CR1 CCAATAAACCAATCTTTCCTAA 55
1506p
CX3CR1 TTTAGAAATGGGAAGGGG 56
1506o
CX3CR1 AAAAATCACTAAACCTACAACAAA 57
1507r
CX3CR1 AAACCCTTTACAAAATCAAAAA 58
1507q
CX3CR1 GGATAGTAGTAGGGATGTGGAA 59
1508p
CX3CR1 TGTTTTGTAAATTATGGAGTGAGT 60
1508o
CX3CR1 AAAACCTACCACTATATCCACC 61
1509r
CX3CR1 TCACTCATTACCCAAACTAAAA 62
1509q
CX3CR1 TTAGAGGAAGTGGTGTGTGTAG 63
1510r
CX3CR1 CCATTCTCCTACCTCAACC 64
1510q
CX3CR1 AAAAATAAAAGTTAAGGGGTTTATAG 65
1511r
CX3CR1 CACAATCCAATCATACTCTTTTAAT 66
1511q
CX3CR1 ATGTAATGTGGGTTAGGTATGG 67
1512p
CX3CR1 AATTGGGAGGTAGTAGAGTGGT 68
1512o
CX3CR1 TCACCCAAACAAAAATACTAAA 69
1513p
CX3CR1 GGAAGGGAAGAGAGTTTGTTA 70
1513o
CX3CR1 ACCCCTTAATACCTCTCCTAAA 71
1514p
CX3CR1 TTAGTGTTAGAAAGTGGATGGG 72
1514o
CX3CR1 AATCTATAACCCCTTCAAAACC 73
1515p
CX3CR1 TTTTATTTTTAGGTTGGGGTAA 74
(continuación)
Nombre del cebador
Nombre del gen diana Secuencia SEQ ID NO:
1515º
CX3CR1 ACTCTTCCATCCCCTTAAAC 75
1516p
CX3CR1 AGGGGAATTTTTGTTGTTTTAT 76
1516o
CX3CR1 ACAACTTTTCTTCCTTACTCACA 77
1517p
CX3CR1 GGGTGGAAAATATGGTTTTTA 78
1517o
CX3CR1 AATAATCCTCAAAACTCTCCAA 79
1518r
CX3CR1 TTACATTACTCAAAACATCCCA 80
1518q
CX3CR1 TTATTTGTGAAGTGGGGTTAGT 81
1519p
CX3CR1 TTTTTGGGGTTGAGAATTTA 82
1519o
CX3CR1 TCTACAAACTACACTCCCCTTC 83
1520p
CX3CR1 GGAATGTTAGGTTTAGAGGTTTT 84
1520o
CX3CR1 CAAACTACAATACCCTTTTCTCA 85
1521r
CX3CR1 AACCTTCACCATAAATCAATTC 86
1521q
CX3CR1 GGTGTTGTTATTAAAATGGTTGT 87
1522p
CX3CR1 AAAATGAATGTTTTGGTGATTA 88
1522o
CX3CR1 AACACTTCCATACCTACTCCTTT 89
1523p
CX3CR1 AAAAGTTTAGAGTTGGTTGGG 90
1523o
CX3CR1 CTTCCCACTTACCATCTTATTT 91
1524p
CX3CR1 TTTATTGTTATGGGGAAAATTG 92
1524o
CX3CR1 AAAAATTCCTACCACCCACT 93
1525p
CX3CR1 AGTGGGTGGTAGGAATTITT 94
1525o
CX3CR1 CTCTTCTTTTATTTCTCAAACCA 95
1526p
FGR GGATTATTTAAGGTTGGGATTT 96
1526o
FGR CCTCTTCTCACTCCTACTTTCA 97
1527p
FGR AAAGGTAAGGTATTGGGAGATT 98
1527o
FGR CAAAATAACAACATTACTTCTCAAA 99
1528p
FGR AGATTGGAATTGATAGAGGATG 100
1528o
FGR TCCTAACTAACACAATAAAAACCC 101
1529p
FGR GGTTTTTAGTGATGGAGAAAAG 102
1529o
FGR CACTACTTAACCTACCCAATCC 103
1530p
FGR GAGTAAGGTGATAGTTAAAGGGAT 104
1530o
FGR CAATTACACCCCAAATTCTC 105
1531p
FGR TAATGAGTAGTGGGGGTTTTAG 106
1531o
FGR AATAAACTTTCACTTCCCTCCT 107
1532r
FGR ATCTAAACTCCCATCCCTTAAC 108
1532q
FGR GTTGGTTAGGTTGTTTTTGAAT 109
1533p
FGR AGGGTTATAGGGTAGATGTTGA 110
1533o
FGR TCTAAATCCTTAATACAACAAACAA 111
(continuación)
Nombre del cebador
Nombre del gen diana Secuencia SEQ ID NO:
1534p
FGR GGTTTAGAGGAAGGATTGTTTT 112
1534o
FGR CATACTCAACTCCCTCACAAT 113
1535r
FGR AACTTCTAACCTAATCCTTTCTCTAA 114
1535q
FGR TGTAGTTTTAGTTATTTGGGAGG 115
1536r
FGR CCCTTAATACTTCTACCCCATA 116
1536q
FGR TGATTAGGTGGTTTGGTTATTT 117
1537p
FGR ATTTTATTITGGGGAAAGTTGT 118
1537o
FGR TCAATAATACCCACTTCCTACC 119
1538p
FGR GTTGTTGGAATAGAGAGGTTGT 120
1538o
FGR AACACAAACATAAAACTCCCC 121
1539p
FGR TTGTGGTTTTTGTAGAGGGTAT 122
1539o
FGR ACAACTTTCCCCAAAATAAAAT 123
1540p
FGR AGGTTAAGATTGGGATTAGGTT 124
1540o
FGR CTACTTTCCTCCAAAAACTCAC 125
1541p
FGR GGTTTGTGAGGTGATTGTGTA 126
1541o
FGR TTCTCCTCTACCCTAATCTAAAAA 127
1542p
FGR GGGAGAGGGTTTTGATAAGATA 128
1542o
FGR CCAACTCCCTAATAATCTCACT 129
1543p
FGR GTGAGATTATTAGGGAGTTGGG 130
1543o
FGR AACTACCATATCCACCAATTAAAA 131
1544r
FGR AACTCTACTTCATAACCCCTCC 132
1544q
FGR GAGGTTGTTTTGTTAGGATTTT 133
1545r
FGR TCTTTAACAAATTCACCATCAA 134
1545q
FGR TTAAGTTAGTTTGGGGGTTTT 135
1546r
FGR CCTCCCACCTATTAACTATTCA 136
1546q
FGR TATTTTGGTAGGGGTTGTATTT 137
1547p
GLNY GGGTATTATGGGTGGGAA 138
1547o
GLNY AAACCAAACACTACAATAAATCC 139
1548r
GLNY ACAAAACCTCAACCCAACT 140
1548q
GLNY TGGTATTTTAGGAATTGGTTTATT 141
1549r
GLNY CTTTCAACTTCACTCTTTCCAT 142
1549q
GLNY GGGTTGTTGGAGGTTAGTAGT 143
1550r
GLNY TCCTCCCTAACAAAATATCAAT 144
1550q
GLNY TTGAAGTGTAGTGGTGTGATTT 145
1551p
GLNY TTAAGATAAGTAAAAGGGTGGG 146
1551o
GLNY CTCTAAAATTCATCCACAAACA 147
(continuación)
Nombre del cebador
Nombre del gen diana Secuencia SEQ ID NO:
1552p
GLNY GGTTAGGGATTTTGGTTTTAAT 148
1552o
GLNY TAACCCACTCTCAACACAAAC 149
1553r
GLNY AAACCCAACTCCTATCCTAAAC 150
1553q
GLNY GGGTGAGATTTTAGAGGATTTT 151
1554p
GLNY ATTGAAGAAGATGGTGGATAAG 152
1554o
GLNY CCTAACTTCTCTAAAACAAACCC 153
1555r
GLNY ACCAATCTTAAACCAAACCTTA 154
1555q
GLNY AATTTTTAGGAGGTATTTTTGTTG 155
1556r
GLNY CCCACAACTAACTATTCTCTCC 156
1556q
GLNY TTTATTGGTTTGAGAGTTTTTG 157
1557r
GLNY ACCCCACAACCTACTCAAA 158
1557q
GLNY AGGATAGTAGAGGGAGTTAGGG 159
1456o
NKG7 CAAACCAACCTCATATAACAAA 160
1456p
NKG7 GAGGGGAAGTAGGATAGGATTA 161
1558r
NKG7 ATTCCTAATCTCACACACAACC 162
1558q
NKG7 TGAGTAGTTGGATAAAAATGGG 163
1559p
NKG7 GTTGGAAGAGATTTGGGTG 164
1559o
NKG7 ATTATCCCCACCTTCCTAAATA 165
1560p
NKG7 GGTTGAGAAAGTTGTTGGAG 166
1560o
NKG7 CAAACTAATCACAAACCCAAA 167
1561r
NKG7 ACCCCAACTACCTTACCTTTAT 168
1561q
NKG7 ATTTGGTITTAGTGAGTTTTTGTAT 169
1562r
NKG7 AATTTTCCTAAACCTTCTACCTAA 170
1562q
NKG7 GTGTTGGGGGATATAAGGAT 171
1563p
NKG7 AAGGTGAAGGGGAAGTAAGT 172
1563o
NKG7 CCTAATAACCTTTATCACCAAAA 173
1564r
NKG7 CTCTCTCACCTCTTCCAAAA 174
1564q
NKG7 GTAAGTAGTTGGGGTAGTGAGG 175
1565r
NKG7 ATCTAACACCCTCAATACCCT 176
1565q
NKG7 GAGTGGGTGGGATTTATAGTT 177
1566r
NKG7 CCCCAAATACCCTAAACCTA 178
1566q
NKG7 GTTGGAGAAGGGGAGATATAGA 179
1567r
NKG7 ATTCCAAAAACCTCATCTAAAA 180
1567q
NKG7 TTTGGTAAGGGGGATAAAAT 181
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Ejemplo 1: Análisis de NKG7
Los inventores han purificado varios subgrupos sanguíneos que incluyen linfocitos T CD3/CD4, CD/CD8 intactos y de memoria, linfocitos citolíticos naturales CD56, linfocitos B intactos y de memoria CD19, monocitos CD14 y granulocitos CD15. El ADN de las células purificadas se trató con bisulfito y se analizó en varios motivos de dinucleótido CpG. Los inventores compararon entonces el estado de metilación (hallando C por Citosina que estaba metilada en la secuencia original (genómica) frente a T para la citosina que no estaba metilada en la secuencia original).
Los datos mostraban varios motivos CpG y áreas en el gen NKG7 que estaban desmetiladas en todas las muestras de linfocitos NK mientras que estaban totalmente metiladas en otros tipos de células sanguíneas. Estos datos se generaron en dos etapas: inicialmente, en un experimento Illumina Golden Gate, los inventores encontraron metilación diferencial para un número limitado de CpG, como se indica en la tabla 2.
Luego, al hallar la metilación diferencial en dicho experimento Illumina, los inventores analizaron adicionalmente regiones genómicas más grandes por medio de secuenciación por bisulfito. Este último procedimiento servía para explorar y extender las regiones metiladas diferencialmente y se llevó a cabo, o ejemplo, con regiones genéticas metiladas diferencialmente de NKG7 como se muestra en la Figura 3. Las secuencias de cebador que se utilizaron para generar este amplicón particular son las siguientes:
"1455p","AAGGATTAGGAGAAGAAGGTTT" (SEQ ID NO: 42)
"1455o","TAAAACTATAAATCCCACCCAC" (SEQ ID NO: 43)
Se generaron otros amplicones similares que generaban metilación diferencial en este gen por cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 160-181. Los pares de cebadores se indican con números iguales, en los que una letra en la última posición indica la identidad del cebador izquierdo o derecho.
Ejemplo 2: Análisis de CX3CR1
Los inventores han purificado varios subgrupos sanguíneos que incluyen linfocitos T intactos y de memoria CD3/CD4, CD3/CD8, linfocitos citolíticos naturales CD56, linfocitos B intactos y de memoria CD19, monocitos CD14 y granulocitos CD15. El ADN de las células purificadas se trató con bisulfito y se analizó en varios motivos de dinucleótido CpG. Los inventores compararon entonces el estado de metilación (hallando C por Citosina que estaba metilada en la secuencia original (genómica) frente a T para la citosina que no estaba metilada en la secuencia original).
Los datos mostraban varios motivos CpG y áreas en el gen CX3CR1 que estaban desmetiladas en todas las muestras de linfocitos NK mientras que estaban totalmente metiladas en otros tipos de células sanguíneas. Estos datos se generaron en dos etapas: inicialmente, en un experimento Illumina Golden Gate, los inventores encontraron metilación diferencial para un número limitado de CpG, como se indica en la tabla 2. Luego, al hallar la metilación diferencial en dicho experimento Illumina, los inventores analizaron adicionalmente regiones genómicas más grandes por medio de secuenciación por bisulfito. Este último procedimiento servía para explorar y extender las regiones metiladas diferencialmente y se llevó a cabo, o ejemplo, con regiones genéticas metiladas diferencialmente de CX3CR1 como se muestra en la Figura 1. Las secuencias de cebador que se utilizaron para generar este amplicón particular son las siguientes:
"1452r","ACACAACTCTTCTCCTCAAAAT" (SEQ ID NO: 44)
"1452q","TAGGGGTTAGGTAGGTAATGAA" (SEQ ID NO: 45)
Se generaron otros amplicones similares que generaban metilación diferencial en este gen por cebadores de acuerdo con SEQ ID NO: 50 a 95. Los pares de cebadores se indican con números iguales, en los que una letra en la última posición indica la identidad del cebador izquierdo o derecho.
Ejemplo 3: Análisis de FGR
Los inventores han purificado varios subgrupos en la sangre que incluyen linfocitos T CD3/CD4, CD/CD8 intactos y de memoria, linfocitos citolíticos naturales CD56, linfocitos B intactos y de memoria CD19, monocitos CD14 y granulocitos CD15. El ADN de las células purificadas se trató con bisulfito y se analizó en varios motivos de dinucleótido CpG. Los inventores compararon entonces el estado de metilación (hallando C por Citosina que estaba metilada en la secuencia original (genómica) frente a T para la citosina que no estaba metilada en la secuencia original).
Los datos mostraban varios motivos CpG y áreas en el gen FGR que estaban desmetiladas en todas las muestras de linfocitos NK mientras que estaban totalmente metiladas en otros tipos de células sanguíneas. Estos datos se generaron en dos etapas: inicialmente, en un experimento Illumina Golden Gate, los inventores encontraron metilación diferencial para un número limitado de CpG, como se indica en la tabla 2.

Claims (1)

  1. imagen1
ES09005876.9T 2009-04-28 2009-04-28 GNLY como marcador epigenético para la identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56 Active ES2607185T3 (es)

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EP09005876.9A EP2248913B1 (en) 2009-04-28 2009-04-28 GNLY as epigenetic marker for the identification of CD56-expressing natural killer cells

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ID=40887777

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ES09005876.9T Active ES2607185T3 (es) 2009-04-28 2009-04-28 GNLY como marcador epigenético para la identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56

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EP (1) EP2248913B1 (es)
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ES (1) ES2607185T3 (es)
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