ES2609280T3

ES2609280T3 - Inhibidor de reacción no específica

Info

Publication number: ES2609280T3
Application number: ES08827899.9T
Authority: ES
Inventors: Yoshikazu Takagi; Yuichi Shintani
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2028-08-22
Also published as: AU2008289857B2; EP2184608A1; CA2697656A1; EP2184608B1; EP2184608A4; US20110189704A1; US10168325B2; JP5189098B2; KR101491700B1; WO2009025364A1; US20150050666A1; KR20100076951A; JPWO2009025364A1; AU2008289857A2; CA2697656C; AU2008289857A1

Abstract

Uso de un complejo de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente a un factor de reacción no específica, y un polímero, como inhibidor de reacción no específica en una medición inmunológica, en el que el factor de reacción no específica se selecciona entre el grupo que consiste en IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, el complemento, factores reumatoides, y el receptor Fc.

Description

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DESCRIPCION

Inhibidor de reaccion no espedfica Campo tecnico

La presente invencion se refiere al uso de un complejo como se define en las reivindicaciones como inhibidor de reaccion no espedfica en una medicion inmunologica, particularmente como inhibidor de reaccion no espedfica capaz de inhibir una reaccion no espedfica que puede interferir con la deteccion o cuantificacion fiable de una sustancia traza en un procedimiento de medicion inmunologico.

Antecedentes de la tecnica

Incluso en un procedimiento de medicion muy espedfico que utiliza una reaccion antigeno-anticuerpo, existe un problema de que algunas muestras que no contienen un antigeno que se va a medir, muestran valores medidos positivos, es decir, valores medidos diferentes de los valores verdaderos. Este fenomeno se denomina reaccion no espedfica.

Como procedimiento de medicion inmunologica que utiliza un soporte insoluble sobre el cual se inmoviliza un anticuerpo unido espedficamente a un antigeno que se va a medir, se conocen un procedimiento de medicion optica de la aglutinacion de latex y un inmunoensayo enzimatico. Cuando dicho procedimiento se usa para medir la concentracion de un antigeno contenido en las muestras, existen algunos casos donde determinadas muestras contienen un factor que es diferente del antigeno, pero que puede reconocer y reaccionar con el anticuerpo inmovilizado (un factor de reaccion no espedfica). En estos casos, dichas muestras suscitan el problema de que las muestras que no contienen un antigeno que se va a medir muestran valores medidos positivos, es decir, valores medidos diferentes de los valores verdaderos.

El factor de reaccion no espedfica contenido en las muestras no esta particularmente limitado, siempre que este sea una sustancia que sea diferente del antigeno que se va a medir, y pueda reaccionar con un transportador inmovilizado con un anticuerpo. Los ejemplos de factor de reaccion no espedfica que se producen frecuentemente incluyen anticuerpos que se producen naturalmente tales como IgM, IgG, e IgA. Cuando una muestra es un fluido corporal humano, tal como un suero o plasma, la IgM humana o la IgG humana participan frecuentemente en reacciones no espedficas, y se produce una aglutinacion no espedfica de los soportes de latex en el procedimiento de medicion optica de la aglutinacion de latex.

Se conoce procedimiento para inhibir una reaccion no espedfica producida por el factor de reaccion no espedfica, un procedimiento de evitar el efecto de la IgM humana o de la IgG humana suplementando un reactivo de medida con un anticuerpo dirigido contra la IgM humana, un anticuerpo dirigido contra la IgG humana, o similar. Como inhibidor concreto anadido en este procedimiento, se propone un componente serico obtenido de animales diferentes de seres humanos (referencia de patente 1). La referencia de patente 2 divulga un procedimiento para suplementar un reactivo de medida con un anticuerpo obtenido inmunizando un animal con un factor de reaccion no espedfica. Se puede hacer disminuir una reaccion no espedfica suplementando un reactivo de medida con este tipo de anticuerpo.

Sin embargo, la IgG o IgM obtenida de un suero animal tiene multiples sitios para el reconocimiento de un antfgeno. Por ejemplo, una molecula de IgG tiene dos sitios de reconocimiento del antfgeno, y una molecula de IgM tiene al menos diez sitios de reconocimiento del antfgeno. Ademas, la IgG y la IgM presentan una propiedad muy hidrofoba, en comparacion con otras protemas. Por estos motivos, cuando IgG o IgM coexisten en el mismo lfquido de reaccion con un antfgeno que es una diana de IgG o IgM, se produce una reaccion inmunologica nefelometrica. La reaccion inmunologica nefelometrica es un fenomeno en el que multiples antfgenos se reticulan con IgG o IgM para formar un enorme complejo inmunologico, que produce una opacidad capaz de detectarse opticamente como turbidez. Por ejemplo, cuando se anade IgM a un lfquido de reaccion que contiene un anticuerpo espedfico para la IgM humana, se produce una reaccion inmunologica nefelometrica y el lfquido de reaccion se vuelve turbio. En estas condiciones, cuando se lleva a cabo el procedimiento de medicion optica de aglutinacion del latex, en el que la cantidad de antfgeno se determina midiendo la turbidez optica, algunas veces no se puede obtener un valor de medicion fiable debido a la reaccion inmunologica nefelometrica. Como se describe anteriormente, se puede evitar una reaccion no espedfica debido a un factor de reaccion no espedfica, pero sigue habiendo el problema de evitar nuevamente los resultados en una reaccion inmunologica nefelometrica secundaria. Ademas, existe otro problema cuando una muestra contiene factores reumatoides, la reaccion inmunologica nefelometrica esta aumentada debido a los factores reumatoides que se unen con la region Fc de una molecula de IgG o IgM.

Estos problemas pueden resolverse anadiendo una cantidad menor de anticuerpo a un reactivo de medida. Sin embargo, cuando la cantidad anadida es menor que la cantidad suficiente para inhibir el efecto de un factor de reaccion no espedfica, el efecto de inhibir la reaccion no espedfica es insuficiente.

En estas circunstancias, los presentes inventores examinaron un procedimiento utilizando, como inhibidor de reaccion no espedfica, un "fragmento de anticuerpo" obtenido digiriendo un "anticuerpo", por ejemplo, F(ab')2 obtenido digiriendo una molecula de IgG con una proteasa, pepsina. Una molecula de IgG o IgM contiene una region

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Fc que tiene una elevada hidrofobicidad, pero F(ab')2 no contiene la region Fc. Por tanto, cuando se usa F(ab')2, la reaccion inmunologica nefelometrica producida por la adicion de un anticuerpo no se produce facilmente y, por tanto, se puede anadir una gran cantidad de F(ab')2 a un reactivo de medida. Ademas, se puede evitar el efecto de los factores reumatoides ya que F(ab')2 no contiene la region Fc. Por tanto, los anteriores problemas producidos por la adicion de IgG (es decir, la reaccion inmunologica nefelometrica y el efecto de los factores reumatoides) se puede evitar utilizando F(ab')2. En estas circunstancias, el efecto de F(ab')2 de inhibir la reaccion no espedfica es el mismo que el de la IgG. Como se ha descrito anteriormente, el procedimiento que utiliza un fragmento de anticuerpo F(ab')2 como inhibidor de reaccion no espedfica es mas practico que la invencion que utiliza un anticuerpo. Los presentes inventores evaluaron ademas un reactivo de medida que contiene el F(ab')2 como inhibidor; se descubrio que el reactivo de medida tiene la desventaja de mantener el efecto de inhibir la reaccion no espedfica.

La molecula F(ab')2 es una molecula en la que dos moleculas de Fab' se unen mediante un enlace disulfuro de la region bisagra. F(ab')2 se caracteriza por una elevada sensibilidad a la reaccion de oxidacion reduccion. F(ab')2 se reduce y degrada facilmente a dos moleculas de Fab'. Ademas, como el componente serico contiene una proteasa que escinde un enlace peptfdico en la region bisagra de F(ab')2, F(ab')2 se degrada si la purificacion de F(ab')2 a partir del suero es insuficiente o si el reactivo de medida esta contaminado con la proteasa o similar. Por tanto, cuando un reactivo de medida coexiste con F(ab')2, F(ab')2 se degrada facilmente de acuerdo con el procedimiento de almacenamiento del reactivo de medida. Como Fab' presenta un efecto muy debil de inhibicion de una reaccion no espedfica en comparacion con un anticuerpo o F(ab')2, se considero que la degradacion de F(ab')2 en el reactivo de medida reduce el mantenimiento del efecto de inhibir una reaccion no espedfica. Realmente, el efecto de inhibir una reaccion no espedfica no se observo significativamente en el reactivo de medida suplementado con Fab' como inhibidor de reaccion no espedfica.

Como tecnica anterior diferente de la inhibicion anteriormente mencionada de una reaccion no espedfica en una medicion inmunologica, se conoce el uso de un Fab' qmmicamente modificado para un farmaco antitumoral. Por ejemplo, Delgado C. y col. (referencia no de patente 1) divulga un farmaco antitumoral que contiene un Fab' qmmicamente modificado con polietilenglicol. La referencia de patente 3 divulga un farmaco antitumoral que contiene Fab' unido a un farmaco y a un polfmero mediante grupos tioles de Fab'.

[referencia de patente 1] Publicacion de patente japonesa pendiente de examen (Kokai) N.° 2006-38823 [referencia de patente 2] Publicacion de patente japonesa pendiente de examen (Kokai) N.° 11-287801 [referencia de patente 3] Patente de Estados Unidos N.° 5.541.297

[referencia no de patente 1] British Journal of Cancer, (Reino Unido), 1996, vol. 73, n.°. 2, p. 175-182

El documento US 2002052009 divulga la reduccion de la union no espedfica a una fase solida tratando la fase solida con biomoleculas modificadas con polioxido de alquileno. La biomolecula es un analito no espedfico o biomolecula inerte, que se une a la fase solida y no interfiere con el procedimiento de deteccion, tal como por ejemplo albumina o anticuerpos no espedficos.

Divulgacion de los problemas de la que van a resolver mediante la invencion

Como se ha descrito anteriormente, la adicion de un anticuerpo a un inhibidor de reaccion no espedfica da como resultado una reaccion inmunologica nefelometrica. La adicion de F(ab')2 tuvo la desventaja de mantener el efecto de inhibir la reaccion no espedfica. En estas circunstancias, un objeto de la presente invencion es resolver estos problemas y proporcionar un inhibidor de reaccion no espedfica que sea eficaz en pequenas cantidades, desde el punto de vista de la eficacia economica.

Medios para resolver los problemas

Aunque IgG o F(ab')2 tienen el efecto de inhibir la reaccion no espedfica, Fab' tiene un efecto muy debil de inhibir la reaccion no espedfica. Se sugirio como causa

(1) que Fab' tiene un sitio de reconocimiento del antfgeno; y

(2) que Fab' puede unirse a un antfgeno, pero no tiene el efecto de inhibir la reaccion no espedfica, es decir, existe la posibilidad de que un Fab' que tenga un tamano molecular menor de un determinado tamano molecular pueda unirse a un factor de reaccion no espedfica, pero no inhiba la reaccion no espedfica producida por el factor de reaccion no espedfica. Los presentes inventores prepararon un enorme complejo uniendo Fab' a diversos polfmeros y examinaron si se recupero o no el efecto de inhibir la reaccion no espedfica. Como resultado, se recupero el efecto de inhibir la reaccion no espedfica modificando Fab' con uno cualquiera de polietilenglicol, dextrano, albumina de suero bovino (BSA), y acido poliglutamico, independientemente de los tipos de enlace utilizados en la modificacion con un polfmero. Este resultado dejo claro que el motivo de que Fab' perdiera el efecto de inhibir la reaccion no espedfica era principalmente el supuesto (2). En concreto, se encontro que Fab' unido a polietilenglicol presento el efecto de inhibir la reaccion no espedfica en una pequena cantidad (aproximadamente 1/5 a 1/10) en comparacion con IgG o F(ab')2. Ademas, se encontro que Fab' modificado no produce facilmente la reaccion inmunologica nefelometrica.

Se realiza convencionalmente la modificacion de la protema con polietilenglicol. Se llevaron a cabo practicamente todas las modificaciones para aumentar la estabilidad de la protema. Cuando se administra la protema a un ser

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humano u otros animales como agente terapeutico, la protema se modifica a menudo con un poUmero para evitar el efecto de las proteasas del organismo o para alargar la vida media en sangre. Por el contrario, se lleva a cabo la modificacion del anticuerpo con un polfmero en la presente invencion para aumentar el tamano molecular del inhibidor de la reaccion no espedfica que contiene el fragmento de anticuerpo, y de esta manera, el objeto de la presente invencion es diferente del de los productos modificado por polfmero conocidos, es decir, la mejora de la estabilidad.

Una modificacion qmmica de la protema con un polfmero es un procedimiento conocido. Una revision por Roberts M.J. y col. (Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54, 459-476) y una revision por Francesco M. y col. (Biomaterials 2001, 22, 405-417) divulga los procedimientos principales de la modificacion qmmica. Por ejemplo, se divulga un procedimiento de unir un polfmero a una protema utilizando, como diana, un grupo amino de la cadena secundaria de los aminoacidos que constituyen la protema, un grupo tiol de un resto de cistema, un grupo carboxilo del extremo carboxilo, un grupo amino del extremo amino, o un grupo hidroxilo de un resto de serina, un resto de treonina, o similar. Ademas, es conocido un procedimiento de union de un polfmero a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En particular, cuando un anticuerpo esta qmmicamente modificado, se considera util que un anticuerpo qmmicamente modificado se prepare sin perdida de actividad de anticuerpo, es decir, una actividad de union con un antfgeno. Como se divulga en una revision por Andrew P. y col. (Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 531545), como el sitio de reconocimiento del antfgeno contiene grupos amino o grupos carboxilo, cuando se une un polfmero utilizando estos grupos funcionales como diana, el sitio de reconocimiento del antfgeno se enmascara a menudo con el polfmero y, como resultado, la actividad del anticuerpo esta disminuida por la modificacion qmmica. Para evitar la desventaja asociada con dicha modificacion de polfmero se conoce, por ejemplo, un procedimiento de union a un polfmero utilizando como diana un grupo tiol de la region bisagra de Fab' o un grupo tiol de la IgG reducida. Una revision de Slinkin M.A. y col. (Bioconjug Chem. 1992, 3(6), 477-483) divulga un ejemplo de trabajo en el que se unio un polfmero a un grupo tiol de un fragmento de anticuerpo Fab'. Una revision de Delgado C. y col. (Br J Cancer. 1996, 73(2), 175-182) divulga un ejemplo de trabajo de un farmaco antitumoral que contiene Fab' qmmicamente modificado con polietilenglicol. La patente de Estados Unidos 5.541.297 divulga un farmaco antitumoral que contiene Fab' unido a un farmaco y a un polfmero mediante grupos tioles de Fab'.

El diagnostico y tratamiento se puede clasificar generalmente en un caso in vivo y un caso in vitro. Se utilizan casi todos los usos del anticuerpo modificado por polfmero en el tratamiento o diagnostico in vivo. Por ejemplo, cuando se administra un anticuerpo unido a un farmaco o un isotipo a un organismo como cuerpo como agente terapeutico o agente de deteccion de una lesion tal como un tumor, el anticuerpo se modifica con un polfmero. Por el contrario, en el diagnostico in vitro, no se ha encontrado el uso de un anticuerpo modificado con polfmero y no se ha utilizado un anticuerpo modificado con polfmero. No se administra un agente a un organismo in vitro, en contraste con los casos in vivo. Por tanto, cuando se examino el uso in vitro, fueron necesarios efectos notablemente ventajosos diferentes a la mejora de la estabilidad. Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion proporciona una nueva aplicacion en el diagnostico in vitro para la recien encontrada utilidad como "inhibidor de reaccion no espedfica".

La presente invencion es para proporcionar un nuevo uso como "inhibidor de reaccion no espedfica", y la presente invencion muestra efectos ventajosos en comparacion con las tecnicas convencionales de inhibir una reaccion no espedfica.

Los presentes inventores llevaron a cabo intensos estudios sobre inhibidores de reaccion no espedfica y, como resultado, encontraron que los problemas que implicaban la reaccion inmunologica nefelometrica y el mantenimiento del almacenamiento podnan resolverse uniendo qmmicamente un polfmero a un anticuerpo espedfico de un factor de reaccion no espedfica o un fragmento del anticuerpo, y que el producto modificado por el polfmero presentaba el efecto de inhibir una reaccion no espedfica cuando se utilizaron cantidades pequenas. La presente invencion se refiere al uso de un complejo de un anticuerpo o un fragmento del anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un factor de reaccion no espedfica, y un polfmero, como inhibidor de reaccion no espedfica en una medicion inmunologica, en el que el factor de reaccion no espedfica se selecciona entre el grupo que consiste en IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, el complemento, factores reumatoides, y un receptor Fc.

De acuerdo con una realizacion preferida del uso de la presente invencion, el polfmero es un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en un polisacarido, una protema, y un polfmero organico de elevado peso molecular, y es mas preferentemente polietilenglicol.

De acuerdo con otra realizacion preferida del uso de la presente invencion, el peso molecular del polfmero es de 1 kDa a 1000 kDa.

De acuerdo con otra realizacion preferida mas del uso de la presente invencion, el fragmento del anticuerpo es F(ab')2, Fab', Fab, Fd, una cadena L, una cadena H, o la IgG reducida (rIgG).

De acuerdo con otra realizacion preferida mas del uso de la presente invencion, la union del anticuerpo o uno de sus fragmentos al polfmero es una modificacion qmmica que utiliza un grupo tiol, amino, hidroxilo, o carboxilo, o una union biotina-avidina.

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De acuerdo con otra realizacion preferida mas del uso de la presente invencion, la medicion inmunologica es un procedimiento de medicion optica de aglutinacion, un inmunoensayo enzimatico, un inmunoensayo nefelometrico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, un fluoroinmunoensayo o un radioinmunoensayo.

Efectos de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, el efecto de inhibir una reaccion no espedfica esta notablemente aumentado por la union de un polfmero a un anticuerpo dirigido contra un factor de reaccion no espedfica, o un fragmento del anticuerpo, y se puede inhibir una reaccion no espedfica con una pequena cantidad (aproximadamente 1/5 a 1/10) en comparacion con un anticuerpo convencional sin dicha modificacion. De acuerdo con la presente invencion, se pueden resolver los problemas producidos por la adicion de un anticuerpo, es decir, el problema acerca de la generacion de la reaccion inmunologica nefelometrica y el problema acerca del mantenimiento.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de Fab'Mals y del Fab' bloqueado con un grupo tiol preparado en el Ejemplo 1.

La Figura 2 es una grafica que muestra los efectos de la inhibicion de una reaccion no espedfica (muestra que se va a evaluar = muestra A) con respecto a F(ab')2Suc, Fab'Suc, y Fab'Mal (inhibidores de la reaccion no espedfica de la presente invencion) que estan modificados con polietilenglicol de 20 kDa, asf como F(ab')2 sin modificar a fines comparativos.

La Figura 3 es una grafica que muestra los efectos de la inhibicion de una reaccion no espedfica (muestra que se va a evaluar = muestra B) con respecto a F(ab')2Suc, Fab'Suc, y Fab'Mal (inhibidores de la reaccion no espedfica de la presente invencion) que estan modificados con polietilenglicol de 20 kDa, asf como F(ab')2 sin modificar a fines comparativos.

La Figura 4 es una grafica que muestra los efectos de la inhibicion de una reaccion no espedfica con respecto a Fab'Mal (inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion) que esta modificado con polietilenglicol de 20 kDa, asf como IgG y F(ab')2 a fines comparativos.

La Figura 5 es una grafica que muestra las reacciones nefelometricas inmunologicas detectadas por los cambios en la absorbancia, con respecto a Fab'Mal (un inhibidor de la reaccion no espedfica de la presente invencion) que esta modificado con polietilenglicol de 20 kDa, asf como IgG sin modificar a fines comparativos.

La Figura 6 es una grafica que muestra la estabilidad del almacenamiento, con respecto a Fab'Mal (un inhibidor de la reaccion no espedfica de la presente invencion) que esta modificado con polietilenglicol de 20 kDa, asf como F(ab')2 a fines comparativos.

La Figura 7 muestra el resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) del Fab'BSA preparado en el Ejemplo 6.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

El inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion, es decir, el complejo que se va a usar como inhibidor de reaccion no espedfica en una medicion inmunologica de acuerdo con la invencion, es un complejo (denominado a partir de ahora en el presente documento anticuerpo modificado con polfmero) o un fragmento de un anticuerpo (anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica) o un fragmento del anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un factor de reaccion no espedfica, y un polfmero, como se define en las reivindicaciones.

El termino "factor de reaccion no espedfica" como se usa en el presente documento significa una sustancia que produce una reaccion no espedfica en un procedimiento de medicion inmunologica que utiliza una reaccion antfgeno-anticuerpo. Mas concretamente, los ejemplos del factor, cuando se usa un fluido corporal humano como muestra, incluyen IgM humana, IgG humana, IgA humana, IgE humana, IgG humana, y factores capaces de unirse a estas Ig humanas (por ejemplo, el complemento, factores reumatoides, el receptor Fc, y similares). Los ejemplos cuando se usa un fluido corporal derivado de animales diferentes de seres humanos como muestra incluyen IgM, IgG, IgA, e IgE del animal, y factores capaces de unirse a estas Ig. Un anticuerpo espedfico de un factor de reaccion no espedfica es, cuando el factor de reaccion no espedfica es un factor de reaccion no espedfica de tipo IgM, un anticuerpo dirigido contra la IgM humana (es decir, un anticuerpo dirigido contra la IgM humana). Cuando el factor es un factor de reaccion no espedfica de tipo IgA, el anticuerpo espedfico para un factor de reaccion no espedfica en un anticuerpo Dirigido contra la IgA humana. Cuando el inhibidor de reaccion no espedfica se anade a un reactivo de medicion inmunologica, y se considera que multiples factores de reaccion no espedfica producen reacciones no espedficas (por ejemplo, IgM, IgG, e IgA son factores de reaccion no espedfica), es preferible que se anada una realizacion del inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion preparado utilizando un anticuerpo dirigido contra IgM, un anticuerpo dirigido contra IgG, y un anticuerpo dirigido contra IgA al reactivo de medicion. La presente invencion no se limita a las realizaciones en las que el inhibidor de la reaccion no espedfica contiene solo un componente como el anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica.

Los ejemplos del procedimiento de medicion inmunologica incluyen un procedimiento de medicion optica de aglutinacion de latex, un inmunoensayo enzimatico, un inmunoensayo nefelometrico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, un fluoroinmunoensayo, un radioinmunoensayo, y similares. Se utiliza una reaccion antfgeno- anticuerpo en todos estos procedimientos y ensayos, y se puede usar un anticuerpo policlonal o un anticuerpo

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monoclonal como el anticuerpo utilizado en la deteccion de un antigeno diana.

El anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un factor de reaccion no espedfica puede prepararse sometiendo, por ejemplo, un antisuero o plasma obtenido inmunizando un animal con el factor de reaccion no espedfica, un suero de animal normal, un anticuerpo monoclonal espedfico para el factor de reaccion no espedfica, un anticuerpo recombinante (incluyendo un anticuerpo quimerico) espedfico del factor de reaccion no espedfica, o similar, para un procedimiento de purificacion convencional usado comunmente. Estos anticuerpos incluyen un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de la clase de anticuerpos vanan de acuerdo con el tipo de animal, pero incluyen IgG, IgM, IgA, y similares. Los ejemplos del animal incluyen un conejo, una cabra, un bovido, un raton, una rata, un cerdo, un pollo, y similar. Los ejemplos del procedimiento de purificacion incluyen, desalacion, electroforesis, filtracion en gel, cromatograffa hidrofoba, cromatograffa de afinidad, y similares.

El fragmento de anticuerpo no esta particularmente limitado, siempre que sea una parte del anticuerpo anteriormente mencionado obtenible tratando el anticuerpo con, por ejemplo, una enzima, un agente reductor, o una de sus combinaciones, y se pueda unir con el factor de reaccion no espedfica. El fragmento de anticuerpo puede prepararse mediante un procedimiento conocido, por ejemplo, digestion con una enzima tal como papama, pepsina, o tripsina, escision de un enlace disulfuro con un agente reductor, o una de sus combinaciones. Por ejemplo, un anticuerpo (anticuerpo completo) se digirio con papama para obtener un fragmento Fab y un fragmento Fc. Un anticuerpo se digirio con pepsina para obtener F(ab')2, y F(ab')2 y se redujo con un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, TCEPHCl [clorhidrato de Tris (2-carboxietil)fosfina], 2-mercaptoetil- amina, o similar) para obtener un fragmento Fab'. El fragmento Fab' se trato con un reactivo SH tal como yodoacetamida para obtener una cadena L y Fd. Un anticuerpo (anticuerpo completo) se redujo con un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, TCEP HCl [clorhidrato de Tris (2-carboxietil)fosfina], 2-mercaptoetilamina, o similar) y a continuacion, se trato con un reactivo SH tal como yodoacetamida para obtener una cadena L y una cadena H, o rlgG en la que solo se escinde la union entre las cadenas H.

El fragmento de anticuerpo utilizado en la presente invencion no esta particularmente limitado, siempre que se pueda unir al factor de reaccion no espedfica. Por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fd, una cadena L, una cadena H, y rlgG son fragmentos de anticuerpos que tienen una actividad de union a anffgeno. Se pueden usar otros fragmentos de anticuerpos diferentes de F(ab')2 y Fab', que se describen concretamente en los ejemplos descritos a continuacion, por ejemplo, se pueden utilizar Fab, Fd, una cadena L, una cadena H, o rlgG, como principio activo del inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion uniendo un poffmero al anterior mediante un grupo tiol, un grupo amino, o un grupo carboxilo como una diana. En la presente invencion es preferible que se utilice Fab' modificado con un poffmero como un principio activo del inhibidor de reaccion no espedfica.

Los ejemplos del anticuerpo modificado con poffmero (es decir, un complejo de un anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica de la presente invencion o un fragmento del mismo y un poffmero) usado en el inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion incluye un anticuerpo qmmicamente modificado preparado mediante modificacion qmmica y un anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica o uno de sus fragmentos con un poffmero, y un complejo de un anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica o uno de sus fragmentos y un poffmero mediante la union biotina-avidina.

En la modificacion qmmica, por ejemplo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo hidroxilo, o un grupo carboxilo del anticuerpo se utiliza como diana, y puede formarse un enlace mediante un "derivado reactivo".

Los ejemplos de un "derivado reactivo" utilizado en la modificacion que utilizan un grupo tiol como diana incluyen un compuesto que contiene un grupo reactivo selectivo a tiol, por ejemplo, maleimidas y vinil sulfonas. Ademas, se puede usar un poffmero al cual se une directamente un derivado reactivo, o un agente de reticulacion que contiene un derivado reactivo.

Los ejemplos de un "derivado reactivo" utilizado en la modificacion que utilizan un grupo amino como diana incluyen esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), esteres de N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) y similares. Ademas, se puede usar un compuesto que contiene un grupo aldeddo (tal como glutaraldeddo) un poffmero que contiene previamente un grupo aldeddo, o similar.

En la modificacion que utiliza un grupo carboxilo como diana, se puede usar, por ejemplo, carbodiimida (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) como catalizador para llevar a cabo la reaccion con un grupo amino para obtener el complejo.

En la modificacion que utiliza un grupo hidroxilo como diana, se puede usar un compuesto que contiene un derivado de isocianato para preparar el complejo.

Estos poffmeros en los que se introduce el derivado reactivo se pueden obtener como un producto comercialmente disponible (por ejemplo, NOF CORPORATlON), o se pueden preparar mediante procedimientos qmmicos convencionales.

La presente invencion incluye realizaciones que utilizan, como union entre el anticuerpo y el poffmero, un tipo de enlace que no es un enlace covalente pero que muestra una elevada afinidad, similar a la union biotina-avidina.

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Los ejemplos del poUmero que se puede usar en la presente invencion incluyen polisacaridos, protemas, y poKmeros organicos de peso molecular elevado.

Los polisacaridos incluyen, por ejemplo, dextrano, dextrina, agarosa, carboximetil (CM) celulosa, heparina, un almidon soluble, y similares. Se puede usar, por ejemplo, un polisacarido de cadena lineal o un polisacarido de cadena ramificada.

Se puede llevar a cabo una modificacion de la protema con polisacaridos mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, oxidacion con peryodato, el procedimiento del bromuro de cianogeno, el procedimiento de la carbodiimida, el procedimiento del cloruro de cianuro, el procedimiento de la epiclorohidrina, el procedimiento del reactivo SPDP (propionato de N-succinimidilo 3-[2-piridilditio]), el procedimiento de un ester activo, o similar. Estos polisacaridos en los que se introduce el derivado reactivo se pueden obtener como un producto comercialmente disponible, o se pueden preparar mediante procedimientos qrnmicos convencionales.

Las protemas son complejos en los que multiples aminoacidos se unen mediante enlaces peptidicos. Las protemas pueden purificarse a partir de un animal, pueden prepararse mediante ingeniena genetica, o pueden prepararse mediante smtesis qrnmica como peptidos sinteticos. Los ejemplos de las protemas incluyen casema, casema lactea, gelatina, albumina recombinante, y similares. Los ejemplos de poli(aminoacidos) incluyen homopolfmeros de arginina, lisina, acido glutamico, o similares, y polfmeros aleatorios de lisina y glicina, lisina y serina, o similares. Dicha protema puede unirse a un anticuerpo, por ejemplo, uniendo un agente de reticulacion a una diana tal como un amino, carboxilo, o grupo sulfuro de la protema, y a continuacion uniendo el producto resultante al anticuerpo mediante el agente de reticulacion. De forma alternativa, una protema puede unirse a un anticuerpo utilizando carbodiimida como un catalizador. En la presente invencion, es preferible hacer reaccionar un grupo amino de una protema con un agente de reticulacion, tal como EMCS [N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida; dojin] o SMCC [carbonato de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano; dojin] y hacer reaccionar adicionalmente el agente de reticulacion con un grupo sulfuro de un fragmento de antfgeno. La protema en la que se introduce el derivado reactivo, que se puede usar en la preparacion del inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion, puede obtenerse como un producto comercialmente disponible, o puede prepararse mediante procedimientos qrnmicos convencionales.

Los ejemplos de polfmeros organicos de alto peso molecular incluyen polietilenglicol, alcohol polivimlico, alcohol poliacnlico, polietilenimina, poli(metacrilato de metilo), acido poliacnlico, polialilamina, y polisacaridos. Se puede usar un polfmero organico de alto peso molecular de cadena lineal o un polfmero de alto peso molecular de cadena ramificada o un copolfmero aleatorio que consiste en multiples tipos de monomeros. Se puede usar un polfmero sintetico que tiene una estructura esferica tal como un dendnmero. Se puede usar un polfmero sintetico o un polfmero natural.

Polietilenglicol es un polfmero que tiene una estructura basica en la que se polimeriza etilenglicol. Polietilenglicol puede unirse a un anticuerpo utilizando un grupo funcional introducido en un grupo hidroxilo de polietilenglicol. La activacion de la union del polietilenglicol a un anticuerpo puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, cloruro de cianuro, carbodiimidazol, N-hidroxisuccinimida, o carbodiimida. Se puede usar un producto comercialmente disponible como el polietilenglicol al cual se introduce un grupo funcional. Puede llevarse a cabo una preparacion eficaz usando polietilenglicol comercialmente disponible en el cual se introduce un grupo maleimida, sucinimida, amino, o sulfuro. Es preferible polietilenglicol en el cual se introduce un grupo maleimida o succinimida debido a su buena eficacia de union con un anticuerpo. Se puede usar, por ejemplo, un polietilenglicol de cadena lineal o un polietilenglicol de cadena ramificada. Se puede usar el polietileno en el cual se sustituye una de sus partes con otra estructura qrnmica, o el polietileno modificado con otro polfmero o compuesto.

Una modificacion qrnmica con polfmeros organicos de alto peso molecular diferentes que el polietilenglicol se puede llevar a cabo enlazandolos a un anticuerpo mediante un grupo funcional introducido en el polfmero organico de alto peso molecular, similar a la modificacion qrnmica con polietilenglicol. Cuando se usan polfmeros organicos de alto peso molecular que contienen un derivado reactivo, no se necesita de forma necesaria la introduccion de un nuevo grupo funcional en una etapa de preparacion. En la presente invencion, es preferible usar un polfmero en el cual se introduce un grupo maleimida, succinimida, amino, o sulfuro. Se pueden obtener polfmeros organicos de alto peso molecular en los que se introduce un derivado reactivo como un producto comercialmente disponible, o se pueden preparar mediante procedimientos qrnmicos convencionales.

El tamano molecular de los polfmeros organicos de alto peso molecular no esta particularmente limitado, pero su peso molecular promedio es generalmente de aproximadamente 200 Da a 1000 kDa, por ejemplo, 1 kDa a 1000 kDa, preferentemente 10 kDa a 100 kDa. El peso molecular promedio del polietilenglicol es preferentemente de 20 kDa a 200 kDa. El tamano molecular puede seleccionarse aproximadamente de acuerdo con el tipo del polfmero, a la vista de la hidrofilicidad, la estructura tridimensional, el efecto de inhibir una reaccion no espedfica, o similar.

Se puede usar el inhibidor de la reaccion no espedfica anadiendo el anticuerpo modificado por el polfmero (por ejemplo, el anticuerpo dirigido contra el factor de reaccion no espedfica modificado con polfmero o uno de sus fragmentos) como el principio activo de un sistema de medicion inmunologica. Mas en concreto, se preparo una solucion que contiene un fragmento modificado de un anticuerpo espedfico para un factor de reaccion no espedfica;

se anadio la solucion a una muestra para hacer reaccionar el anticuerpo con el factor de reaccion no espedfica antes de que un anticuerpo espedfico de un antigeno que se va a medir se haga reaccionar con el antigeno; y pueda inhibirse la reaccion no espedfica producida por el factor de reaccion no espedfica. Alternativamente, se anadio un fragmento modificado de un anticuerpo espedfico de un factor de reaccion no espedfica a una solucion 5 que contema un anticuerpo espedfico para un antfgeno que se va a medir; se anadio la solucion a una muestra para hacer reaccionar el factor de reaccion no espedfica con el anticuerpo espedfico del factor; y pueda inhibirse la reaccion no espedfica producida por el factor de reaccion no espedfica.

Los ejemplos de reactivo de medicion inmunologica incluyen elastasa, cistatina C, sEs (selectina E soluble), SF (fibrina soluble), PC (protema C), PPI (inhibidor de plasmina-plasmina, cTn (trombomodulina), mioglobina, CK-MB, 10 BNP (peptido natriuretico de tipo B), AFP ((a-fetoprotema), p2m (p-2-microglobulina), CEA (antigeno carcinoembrionico), ferritina, CA19-9 (antigeno 19-9 de hidratos de carbono), PAP (fosfatasa acida prostatica, PSA (antfgeno espedfico de prostata), CRP (protema reactiva C), Mb (mioglobina), RF (factor reumatoide), ASO (antiestreptolisina-O), FDP (productos de degradacion de la fibrina, AT III (antitrombina III), plasminogeno, a2PI (inhibidor de la plasmina a-2), dfmero D (dffmero del fragmento D de los productos de degradacion de la fibrina), IgG 15 (inmunoglobulina G), IgA (inmunoglobulina A), IgM (inmunoglobulina M), IgE (inmunoglobulina E), C3 (el tercer componente del complemento), C4 (el cuarto componente del complemento),albumina urinaria, hCG (gonadotropina corionica humana),hPL (lactogeno placentario humano), insulina, antigeno HBs (antfgeno superficial de la hepatitis B) anticuerpo Hbs (anticuerpo dirigido contra el antfgeno superficial de la hepatitis B, anticuerpo HBc (anticuerpo dirigido contra el antfgeno nuclear de la hepatitis B), anticuerpo HCV (anticuerpo dirigido contra el virus de la 20 hepatitis C), Treponema (anticuerpo dirigido contra Treponema pallidum, TSH (hormona estimuladora del tiroides), LH (hormona luteneizante), FSH (hormona estimuladora del folmulo, digoxina, digitoxina, quinidina,procinamida, NAPA (N-acetilprocainamida), teofilina, fenitoma, fenobarbital, carbamazepina, acido valproico, etosuccinimida, gentamicina, tobramicina, amikacina,vancomicina, ciclosporina A, B12 (vitamina B12), acido folico, T3 (triyodotironina), T4 (tiroxina), y estrogeno.

25 Ejemplos

La presente invencion se ilustrara ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, pero esto no significa que este limitada a los mismos.

Ejemplo 1

[Objeto]

30 Los factores dirigidos contra la reaccion no espedfica tales como IgG o F(ab')2 muestran un fuerte efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica, pero el efecto de Fab' es debil. Como causa, se consideraron

(1) la posibilidad de que multiples sitios de reconocimiento de antfgeno sean necesarios en una molecula para mostrar el efecto de inhibir una reaccion no espedfica, y

(2) la posibilidad de que el tamano molecular de un inhibidor de reaccion no espedfica influya sobre el efecto

35 inhibidor. Este Ejemplo se llevo a cabo para examinar esta hipotesis. Si una molecula que tiene un unico sitio de

reconocimiento de antfgeno (tal como Fab') presenta el efecto de inhibir una reaccion no espedfica, se puede negar la posibilidad de (1). Se puede someter a ensayo la posibilidad de (2) preparando diversos polfmeros que tienen un tamano molecular diferente y examinando el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica.

[Procedimientos]

40 Para evaluar el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica mediante la modificacion con polietilenglicol, se utilizo un fragmento (Fab') de una IgG espedfica de una IgM humana para preparar un Fab' modificado con polietilenglicol (denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'Mal). Se llevo a cabo la modificacion con polietilenglicol uniendo una molecula de polietilenglicol a una molecula de Fab' mediante el grupo tiol contenido en la region bisagra del Fab'. Se uso esta forma de modificacion para evitar el enlace del polietilenglicol con el sitio 45 de reconocimiento del antfgeno del Fab'. Se selecciono un Fab' de conejo, y se utilizo polietilenglicol que tema un grupo maleimida en el extremo de un unico lado como un modificador. Ademas, para examinar las diferencias en el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica producida por la longitud (peso molecular) del polietilenglicol utilizado en la modificacion, se utilizaron polietilenglicoles que teman una longitud de 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 20 kDa, o 30 kDa como un modificador para preparar multiples Fab'Mal que teman diversos pesos moleculares. Como 50 control negativo, se utilizo Fab' en el que se bloqueo el grupo tiol con N-etilmaleimida para evitar una reaccion inversa de Fab' a F(ab')2 (denominada a partir de ahora en el presente documento Fab' bloqueado con un grupo tiol). Con respecto al Fab' bloqueado con un grupo tiol, Fab'Mal de 2 kDa, Fab'Mal de 5 kDa, Fab'Mal de 12 kDa, Fab'Mal de 20 kDa, y Fab'Mal de 30 kDa, se evaluaron sus efectos de inhibicion sobre una reaccion no espedfica.

[Preparacion de Fab'Mals]

55 Una IgG de anticuerpo policlonal de conejo dirigida contra IgM humana (de fabricacion artesanal) se digirio con pepsina para preparar F(ab')2. El F(ab')2 resultante se ajusto a 5 mg/ml utilizando un tampon de tris(hidroximetil)aminometano 200 mmol/l (pH 8,2) que contema 150 mmol/l de NaCl. Se redujo F(ab')2 con 10 mmol/l

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de 2-mercaptoetilamina a 37 °C durante 30 minutos, y se sometio a filtracion en gel utilizando un tampon fosfato 50 mmol (pH 6,0) que contema 5 mmol/l de EDTA como tampon de analisis, para recoger una fraccion de Fab'. A una solucion de 5 mg/ml de Fab', se anadio polietilenglicol de 30 kDa que tema un grupo maleimida (fabricado por NOF CORPORATION) para llevar a cabo la reaccion a 4 °C durante 4 horas agitando a la vez. El lfquido de reaccion resultante se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de Fab'Mal, que se concentro a aproximadamente 5 mg/ml. De una manera similar, se prepararon Fab'Mals que tema un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, o 20 kDa.

[Preparacion del Fab' bloqueado con un grupo tiol]

Una IgG de anticuerpo policlonal de conejo dirigida contra IgM humana (de fabricacion artesanal) se digirio con pepsina para preparar F(ab')2. El F(ab')2 resultante se ajusto a 5 mg/ml utilizando un tampon de 200 mmol/l de tris(hidroximetil)aminometano (pH 8,2) que contema 150 mmol/l de NaCl. Se redujo F(ab')2 con 10 mmol/l de 2- mercaptoetilamina a 37 °C durante 30 minutos, y se sometio a filtracion en gel utilizando 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que contema 5 mmol/l de EDTA como tampon de analisis, para recoger una fraccion de Fab'. A una solucion de 5 mg/ml de Fab', se anadieron 5 mmol/l de N-etilmaleimida (fabricado por Sigma-Aldrich Corporation) para llevar a cabo la reaccion a 4 °C durante 4 horas agitando a la vez. El lfquido de reaccion resultante se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de Fab' bloqueada con un grupo tiol que se concentro hasta aproximadamente 5 mg/ml.

El resultado de SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida-(SDS-PAGE) de Fab'Mals resultante y del Fab' bloqueado con un grupo se muestra en la Figura 1. En la figura 1, los marcadores, Fab' bloqueado con un grupo tiol, Fab'Mal de 30 kDa, Fab'Mal de 20 kDa, Fab'Mal de 12 kDa, Fab'Mal de 5 kDa, Fab'Mal de 2 kDa, y se muestran los marcadores (de la banda izquierda).

[Condiciones de ensayo para evaluar los efectos de los inhibidores de reaccion no espedfica]

Se examinaron los efectos de los Fab'Mal y del Fab' bloqueado con un grupo tiol sobre la inhibicion de la reaccion no espedfica mediante un procedimiento de medicion optica con aglutinacion de latex. Se utilizo un dfmero D como antfgeno medido, y se utilizaron dos tipos de muestras (muestra A y nuestra B) como muestras que se van a evaluar. Las muestras eran muestras de plasma humano caracterizadas por que la reaccion no espedfica como se ha descrito anteriormente se produce en la medicion utilizando un reactivo para medir un dfmero D (LPIA-ACE D- dfmero II; Mitsubishi Chemical Medience Corporation) y la sustancia de la reaccion no espedfica es una IgM. La medicion se llevo a cabo mediante procedimientos automatizados utilizando un analizador automatico HITACHI 7170 (fabricado por Hitachi High-Technologies Corporation). La medicion utilizando HITACHI 7170 se compuso principalmente de dos etapas. En la primera etapa, las muestras que se iban a medir se diluyeron con un primer reactivo (denominado a partir de ahora en el presente documento R1) para preparar una solucion de reaccion. En la segunda etapa, a esta solucion de reaccion se anadio un segundo reactivo (denominado en el presente documento R2) caracterizado por contener partfculas de latex sobre las cuales se habfa inmovilizado un dfmero D, para generar una reaccion de aglutinacion del latex. Esta reaccion de aglutinacion se vigilo opticamente para cuantificar el dfmero D o el factor de reaccion no espedfica contenido en las muestras que se van a evaluar. En este Ejemplo, cada uno de los Fab'Mal o el Fab' bloqueado con el grupo tiol se anadio a R1 para absorber la sustancia de reaccion no espedfica en la primera etapa. Esta adicion a R1 se llevo a cabo de tal manera que la concentracion de cada uno de los Fab'Mals o el Fab' bloqueado con un grupo tiol llego a ser de 100 mg/l. Los Fab'Mal y el Fab' bloqueado con un grupo tiol utilizado en este ejemplo se habfa sometido a cromatograffa de afinidad para eliminar componentes capaces de reaccionar con productos de degradacion de la fibrina (incluyendo el dfmero D). La muestra que se va a medir, R1, y R2 se mezclaron en una relacion de 7 pl:125 pl:125 pl. Se detecto la aglutinacion del latex a una longitud de onda de 800 nm. Se calcularon los valores de la medicion a partir de las absorbancias, utilizando una curva de calibracion preparada midiendo el dfmero D a concentraciones conocidas.

[R2 para medir el dfmero D]

Se utilizo un reactivo de latex contenido en un reactivo de diagnostico in vitro (LPIA-ACE dfmero-d ii; distribuido por Mitsubishi Chemical Medience Corporation) como el reactivo R2. Este producto contiene como componente insoluble soportes a los que se une un anticuerpo monoclonal espedfico del dfmero D mediante un enlace qmmico.

[Resultados]

En la Tabla 1 se muestra el resultado. Como se muestra en la Tabla 1, todos los Fab'Mal presentaron el efecto de inhibir la reaccion no espedfica. El efecto de los Fab'Mal era dependiente del peso molecular, y se encontro en la modificacion con polietilenglicol que polietilenglicol que tema un peso molecular mayor tema un efecto de inhibir la reaccion no espedfica superior.

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Tabla 1

SH-blk Fab'Mal

Muestra: Fab' 2 KD 5 KD 12 KD 20 KD 30 KD Sin anadir

A (Mg/Ml): 7,08 2,95 1,18 0,90 1,09 0,85 8,52

B (Mg/ml): 20,28 18,13 7,79 0,26 0,06 0,04 17,66

(SH-blk Fab':: Fab' bloqueado con un grupo tiol)

Ejemplo 2

[Objeto]

El resultado del ejemplo 1 revelo que un Fab' que tiene un unico sitio para el reconocimiento del antigeno muestra el efecto de inhibir una reaccion no espedfica mediante la modificacion con polietilenglicol. El efecto aumenta cuando el polietilenglicol utilizado en la modificacion tiene un peso molecular mayor. Se llevo a cabo este Ejemplo para examinar si el efecto estaba o no aumentado modificando los fragmentos de anticuerpos con un polfmero en comparacion con un fragmento de anticuerpo sin modificar.

[Procedimientos]

F(ab')2 espedficos de un factor de reaccion no espedfica se modificaron qmmicamente con polietilenglicol de 20 kDa que tema un grupo succinimida en el extremo de un lado para preparar un F(ab')2 modificado con polietilenglicol [denominado a partir de ahora en el presente documento F(ab')2Suc]. De forma similar, el Fab' bloqueado con el grupo tiol se modifico qmmicamente con el mismo polietilenglicol para preparar un producto modificado (denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'Suc). Con respecto al efecto inhibidor, F(ab')2Suc, Fab'Suc, y Fab'Mal de la presente invencion se compararon con F(ab')2. A este respecto, estos fragmentos de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo qmmicamente modificados utilizados en este Ejemplo se prepararon a partir del mismo lote de anticuerpo.

[Preparacion de F(ab')2Suc y Fab'Suc]

Una IgG de anticuerpo policlonal de conejo dirigida contra IgM humana (de fabricacion artesanal) se digirio con pepsina para preparar F(ab')2. El Fab' bloqueado con un grupo tiol se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El F(ab')2 resultante y el Fab bloqueado con un grupo tiol se dializaron utilizando un tampon fosfato de 50 mmol/l (pH 6,0) que contema 5 mmol/l de EDTA como fluido externo. A una solucion de 5 mg/ml de Fab bloqueado con un grupo tiol o F(ab')2, se anadio polietilenglicol de 20 kDa que tema un grupo succinimida (fabricado por NOF CORPORATION) para llevar a cabo la reaccion a 4 °C durante 12 horas agitando a la vez. El lfquido de la reaccion resultante se sometio se sometio a filtracion en gel para recoger las fracciones F(ab')2Suc y Fab'Suc de interes, que se concentraron a aproximadamente 5 mg/ml.

En las mismas condiciones de ensayo descritas en el Ejemplo 1, los fragmentos de anticuerpo modificados con polietilenglicol se compararon con F(ab')2 sin modificar para examinar el efecto de inhibicion de la reaccion no espedfica. En este Ejemplo, se evaluo el efecto usando R1 suplementado con cada inhibidor de reaccion no espedfica a una concentracion final de 0 mg/l, 20 mg/l, 50 mg/l, o 100 mg/l. Como muestras a evaluar, se utilizaron las mismas muestras A y B que las utilizadas en el Ejemplo 1.

[Resultados]

Los resultados se muestran en la Figura 2 (muestra A) y en la Figura 3 (muestra B). Como se muestra en la Figura 2, se encontro que F(ab')2Suc, Fab'Suc, y Fab'Mal, que se modificaron con polietilenglicol de 20 kDa, presentaron un efecto notablemente aumentado de inhibicion de la reaccion no espedfica, en comparacion con F(ab')2 sin modificar.

Ejemplo 3

[Objeto]

Como se muestra en los resultados del Ejemplo 2, se descubrio que un fragmento de anticuerpo modificado con polietilenglicol presento un efecto notablemente potenciado de inhibicion de una reaccion no espedfica, en comparacion con un fragmento de anticuerpo sin modificar. El objeto de este Ejemplo es aclarar los efectos de la presente invencion comparando la presente invencion con la adicion de la IgG como tecnica anterior.

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[Procedimientos]

Con respecto al efecto inhibidor, Fab'Mal de 20 kDa, IgG, y F(ab')2 se compararon entre sr Estas tres sustancias se prepararon a partir del mismo lote de IgG.

En las mismas condiciones de ensayo descritas en el Ejemplo 1, se examino el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica. En este Ejemplo 3, se utilizo R1 suplementado con cada uno de IgG, F(ab')2, o Fab'Mal de 20 kDa a una concentracion de 50 mg/l para el examen.

[Resultados]

En la Figura 4 se muestra el resultado. Como se muestra en la Figura 4, se encontro que Fab'Mal modificado con el polfmero presento un efecto notablemente aumentado de inhibicion de una reaccion no espedfica en comparacion con IgG y F(ab')2. Este resultado muestra que la presente invencion es superior a al menos la IgG sin modificar como tecnica anterior en el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica.

Ejemplo 4

[Objeto]

Se ha descubierto que una realizacion del inhibidor de reaccion no espedfica, Fab'Mal, era muy eficaz en la inhibicion de una reaccion no espedfica en comparacion con la IgG y F(ab')2. El siguiente Ejemplo se llevo a cabo para examinar una reaccion inmunologica nefelometrica que era un problema en la tecnica anterior.

[Procedimientos]

Una reaccion inmunologica nefelometrica tiende a aparecer cuando un antfgeno y un anticuerpo espedfico del anterior coexisten a elevadas concentraciones. En este ejemplo, se utilizo una IgM humana (de fabricacion artesanal) como antfgeno, y se utilizo Fab'Mal de 20 kDa como sustancia correspondiente a un anticuerpo. Se anadieron IgG o Fab'Mal a Rl del agente para medir un dfmero D a una concentracion de 200 mg/l. Como muestras a medir, se utilizaron muestras que conteman una IgM humana a concentraciones en un intervalo de 0,99 mg/ml a 5,9 mg/ml, como se muestra en la Figura 5. Se sabe que un nivel de IgM es personas sanas esta comprendido generalmente en un intervalo de 1,00 mg/ml a 1,5 mg/ml. Se llevo a cabo este ejemplo en un intervalo posible de un nivel de IgM en la medicion de una muestra de plasma o suero humano. Se midio opticamente la influencia de la reaccion inmunologica nefelometrica a una longitud de onda de 800 nm utilizando HITACHI 7170.

[Condiciones de ensayo para evaluar la reaccion inmunologica nefelometrica]

Cada muestra, R1, y R2 se hicieron reaccionar en una relacion de 10 pl:180 pl:180 pl, y se midio un aumento en la absorbancia detectada a una longitud de onda de 800 nm utilizando HITACHI 7170.

[Resultados]

En la Figura 5 se muestra el resultado, que muestra cambios en la absorbancia entre la mezcla de cada muestra con el lfquido R1 y el punto inmediatamente anterior a la adicion del lfquido R2. En estas condiciones, se puede juzgar que se produce una reaccion inmunologica nefelometrica cuando se observa un aumento en la absorbancia.

Los presentes inventores confirmaron que no se observo un aumento en la absorbancia incluso cuando se utilizo Fab'Mal a una elevada concentracion de 800 mg/l.

Ejemplo 5

[Objeto]

Se descubrio en el ejemplo 4 que una reaccion inmunologica nefelometrica no se produda facilmente cuando se utilizaba Fab'Mal. En este Ejemplo, se examino la estabilidad en almacenamiento de la presente invencion.

Una molecula de F(ab')2 se degrada a dos moleculas de Fab'. En particular, cuando se anade F(ab')2 a R1 y se almacena como mezcla, F(ab')2 se degrada facilmente a Fab', y este fenomeno supone un problema. Esto es porque Fab' presenta un efecto debil de inhibicion de una reaccion no espedfica, y de esta manera, se observo un aumento gradual en los valores medidos cuando se midio una muestra que produjo una reaccion no espedfica. En el ejemplo 5, se examino el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica tras el almacenamiento a 37 °C para aclarar la estabilidad en almacenamiento de Fab'Mal. En general, se lleva a cabo un almacenamiento adecuado de un reactivo para la medicion inmunologica a 4 °C. Cuando se almacena un reactivo a 37 °C, se puede observar inicialmente una disminucion en el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica en comparacion con el almacenamiento a 4 °C. Esto es porque la degradacion a Fab' se acelera facilmente a 30 °C a 40 °C. Ademas, a este intervalo de temperatura F(ab')2 esta sujeto a factores de mas importancia para promover la degradacion a Fab', tal como un

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factor similar a proteasa o una reaccion de oxidacion reduccion. En este Ejemplo, se examino la estabilidad de Fab'Mal seleccionando las condiciones de almacenamiento a 37 °C lo que promovio de forma notable la degradacion de F(ab')2 y produjo realmente el deterioro del reactivo.

[Procedimientos]

Se preparo un reactivo R1 suplementado con F(ab')2 o Fab'Mal para examinar el efecto de inhibicion de una reaccion no espedfica tras el almacenamiento del reactivo R1 a 37 °C. Se evaluo el efecto inhibidor mediante medicion utilizando la muestra A.

[Condiciones de ensayo para evaluar la estabilidad en almacenamiento]

Se preparo R1 suplementado con 200 mg/l de F(ab')2 o Fab'Mal para examinar las diferencias tras el almacenamiento a 37 °C.

En este ejemplo, se almacenaron los reactivos R1 a 37 °C durante 17 dfas, y se llevo a cabo la medicion de la muestra A en el dfa 0, dfa 5, dfa 10, y dfa 17. Se llevo a cabo la medicion de la muestra A utilizando HITACHI 7170 en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 1.

[Resultados]

En la Figura 6 se muestra el resultado. Como se muestra en la Figura 6, cuando se anadio F(ab')2 a R1 y se almaceno a 37 °C, se aumentaron gradualmente los valores obtenidos midiendo la muestra A. Por el contrario, con respecto a Fab'Mal, no se observo un aumento en los valores medidos hasta el dfa 17. Este resultado dejo claro que Fab'Mal presento una elevada estabilidad en almacenamiento, en comparacion con F(ab')2, que muestra una baja estabilidad.

Ejemplo 6

[Objeto]

Para examinar una realizacion diferente de Fab'Mal, se preparo un complejo (denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'BSA) en el que BSA se une a Fab' mediante el grupo tiol contenido en la region bisagra para examinar el efecto de inhibicion de la reaccion no espedfica.

[Procedimientos]

Un reactivo de reticulacion que tiene un grupo maleimida y un grupo succinimida, EMCS (fabricado por DOJIN), se hizo reaccionar con BSA mediante grupos amino localizados sobre la superficie de BSA. El BSA modificado con EMCS resultante se unio a Fab'. Se midio el efecto inhibidor de una manera similar a la descrita en el ejemplo 1, excepto que se utilizo R1 suplementado con Fab'BSA a una concentracion de 0 mg/l, 33 mg/l, 66 mg/l, o 133 mg/l.

[Preparacion de Fab'BSA]

A una solucion de BSA (5 mg/ml) preparada disolviendo BSA (fabricado por SIGMA) en 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que contema 5 mmol/l de EDTA, se anadio EMCS (DOJIN) hasta llegar a una concentracion de 5 mmol/l. Se incubo una mezcla a 37 °C durante 1 hora, y se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de BSA. Como tampon de analisis para la filtracion en gel, se utilizaron 200 mmol/l de tampon Tris (pH 8,2) que contema 150 mmol/l de NaCl. Se preparo Fab' a partir de un anticuerpo dirigido contra la IgM humana de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El BSA modificado con EMCS se mezclo con 5 mg/ml de Fab', y se hizo reaccionar a 4 °C durante 16 horas agitando a la vez. El lfquido de reaccion se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de Fab'BSA de interes, que se concentro a aproximadamente 5 mg/ml. Como tampon de analisis para la filtracion en gel, se utilizaron 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que contiene 5 mmol/l de EDTA.

En la Figura 7 se muestra el resultado de la SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de Fab'BSA resultante. En la Figura 7, se muestran Fab'BSA, Fab'BSA, F(ab')2, Fab', y los marcadores (de la banda izquierda).

[Resultados]

Como se muestra en la tabla 2, una realizacion de la presente invencion, Fab'BSA, presento el efecto de inhibir una reaccion no espedfica de una manera dependiente de la concentracion. Quedo claro a partir de este resultado que el efecto inhibidor no era espedfico de polietilenglicol, y que se obtuvo el mismo efecto cuando se unio BSA a Fab'.

Tabla 2

Fab'BSA_____0 mg/l______33 mg/l_____66 mg/l_____133 mg/l

Muestra A 10,26_______4,96________2,16________1,01

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Ejemplo 7

[Objeto]

Para examinar una realizacion diferente de Fab'Mal y Fab'BSA, se prepare un complejo (denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'PG) en el que se unio acido poliglutamico a Fab' mediante el grupo tiol contenido en la region bisagra del Fab' para examinar el efecto de inhibicion de la reaccion no espedfica.

[Procedimientos]

Un reactivo de reticulacion que tiene un grupo maleimida y un grupo succinimida, EMCS (fabricado por DOJIN), se hizo reaccionar con acido poliglutamico mediante el grupo amino del extremo amino del acido poliglutamico. El acido poliglutamico modificado con EMCS resultante se unio a Fab'. Se midio el efecto inhibidor de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, excepto que se utilizo R1 suplementado con Fab'PG a una concentracion de 0 mg/l, 5 mg/l, 50 mg/l, o 100 mg/l.

[Preparacion de Fab'PG]

A una solucion de 5 mg/ml de acido poliglutamico preparada disolviendo acido poliglutamico (fabricado por y adquirido de SIGMA) que tiene un peso molecular de 15 kDa a 50 kDa en 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que conterna 5 mmol/l de EDTA, se anadio EMCS (Dojin) hasta llegar a una concentracion de 5 mmol/l. Se incubo una mezcla a 37 °C durante 1 hora, y se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de acido poliglutamico. Como tampon de analisis para la filtracion en gel, se utilizaron 200 mmol/l de tampon Tris (pH 8,2) que conterna 150 mmol/l de NaCl. Se prepare Fab' a partir de un anticuerpo dirigido contra la IgM humana de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 y se ajusto a una concentracion de 5 mg/ml utilizando 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que conterna 5 mmol/l de EDTA. El acido poliglutamico modificado con EMCS se mezclo con Fab', y se hizo reaccionar a 4 °C durante 16 horas agitando a la vez. El lfquido de reaccion se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de Fab'PG de interes, que se concentre a aproximadamente 5 mg/ml. Como tampon de analisis para la filtracion en gel, se utilizaron 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que contiene 5 mmol/l de EDTA.

[Resultados]

En la Tabla 3 se muestra el resultado. Como se muestra en la tabla 3, una realizacion de la presente invencion, Fab'PG, presento el efecto de inhibir una reaccion no espedfica de una manera dependiente de la concentracion. Quedo claro a partir de este resultado que el efecto inhibidor adquirido no era espedfico de polietilenglicol y BSA, y que se obtuvo el mismo efecto cuando se unio acido poliglutamico a Fab'.

Tabla 3

______________0 mg/l_______25 mg/l______50 mg/l______100 mg/l

Muestra D 16,05 7,74 1. 91 1,01

Muestra B 19,14________7,79________6,62_________3,83

Ejemplo 8

[Objeto]

Para examinar una realizacion diferente de Fab'Mal, Fab'BSA y Fab'PG, se prepare un complejo (denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'DX) en el que se unio un polisacarido a Fab' mediante el grupo tiol contenido en la region bisagra del Fab' para examinar el efecto de inhibicion de la reaccion no espedfica.

[Procedimientos]

Se uso un dextrano activado comercialmente disponible en el que alguno de los grupos funcionales se convirtieron en grupos aldehfdo, ya cada grupo aldehfdo se unio al grupo amino del Fab' bloqueado con el grupo tiol para preparar Fab'DX. Se midio el efecto inhibidor de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, excepto que se utilizo R1 suplementado con Fab'DX a una concentracion de 0 mg/l, 27 mg/l, 53 mg/l, 80 mg/l, 101 mg/l, 133 mg/l, o 195 mg/l.

[Preparacion de Fab'DX]

Se adquirio un kit de acoplamiento (fabricado por Pierce) que conterna dextrano activado que terna un peso molecular de 40 kDa, y se llevo a cabo un acoplamiento con Fab' de acuerdo con un protocolo recomendado. El Fab' bloqueado con un grupo tiol se prepare de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Despues se mezclaron 10 mg de dextrano activado (disuelto en un tampon fosfato a una concentracion de 5 mg/ml), 5 mg del Fab' bloqueado con un grupo tiol (disuelto en un tampon fosfato a una concentracion de 5 mg/ml), y 0,4 ml de una solucion de un cianoborohidruro y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 24 horas agitando a la vez, se anadio 1 mol/l de tampon Tris (pH 7,2) a la mezcla a una concentracion final de Tris de 200 mmol/l y se hizo reaccionar a

37 °C durante 1 hora. El Ifquido de reaccion resultante se sometio a filtracion en gel para recoger una fraccion de Fab'DX de interes, que se concentro a aproximadamente 5 mg/ml. Como tampon de analisis para la filtracion en gel, se utilizaron 50 mmol/l de tampon fosfato (pH 6,0) que contiene 5 mmol/l de EDTA.

[Resultados]

5 En la Tabla 4 se muestra el resultado. La unidad de valores medidos del dfmero D que se muestra en la tabla 4 es |jg/ml. Como se muestra en la tabla 4, una realizacion de la presente invencion, Fab'DX, presento el efecto de inhibir una reaccion no espedfica de una manera dependiente de la concentracion. Quedo claro a partir de este resultado que el efecto inhibidor adquirido no era espedfico de polietilenglicol, BSA, y acido poliglutamico, y que se obtuvo el mismo efecto cuando se unio dextrano a Fab'. Con respecto a un procedimiento de enlace, se confirmo 10 que se obtuvo el efecto inhibidor uniendo un polfmero a un grupo amino de Fab' como diana.

Tabla 4

: 0 mg/l 27 mg/l 53 mg/l 80 mg/l

Muestra D: 15,46 11,11 7,26 5,17

Muestra B: 19,09 14,49 15,81 16,27


: 101 mg/l 133 mg/l 195 mg/l

Muestra: D 3,80 2,87 1,99

Muestra: B 16,43 16,51 16,22

Ejemplo 9

[Objeto]

15 Se llevaron a cabo los ejemplos 1 a 8 con respecto a una reaccion no espedfica producida por IgM. En este ejemplo, se examino el efecto de la presente invencion sobre una reaccion no espedfica producida por IgA. Como inhibidor de reaccion no espedfica, se utilizo un complejo de fragmento de anticuerpo [denominado a partir de ahora en el presente documento Fab'(L)Mal] preparado a partir de un anticuerpo que tema una afinidad por una cadena L humana se modifico con polietilenglicol. La cadena L de inmunoglobulinas humanas se incluyo comunmente como 20 un dominio constitutivo en IgG, IgM, IgA, e IgE, y de esta manera, un anticuerpo capaz de unirse con la cadena L humana puede unirse con cualquier tipo de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgA, e IgE. Por tanto, se espera que un anticuerpo dirigido contra la cadena l humana pueda inhibir cualquier reaccion no espedfica producida por IgM, IgG, IgA, o similar. El objeto de este Ejemplo era mostrar las realizaciones que utilizan un anticuerpo diferente que un anticuerpo dirigido contra IgM, y confirmar que el efecto inhibidor de un fragmento modificado del anticuerpo 25 se aumento modificando el fragmento de anticuerpo con polietilenglicol.

[Procedimientos]

Se preparo Fab'(L)Mal a partir de Fab' de un anticuerpo dirigido contra la cadena L humana, de una manera similar al procedimiento de preparacion de Fab'Mal descrito en el Ejemplo 1. Se examino el efecto inhibidor de Fab'(L)Mal para una muestra no espedfica de tipo IgA comparandola con el efecto de un fragmento de anticuerpo F(ab')2 30 utilizado en la preparacion de Fab'(L)Mal. Se utilizo un reactivo para el dfmero D como reactivo de medicion, y se compararon los efectos de la reaccion no espedfica entre sf anadiendo cada protema de anticuerpo a una concentracion de 50 mg/l de R1 contenido en el agente. Como muestra a medir, se uso la muestra E en la que se produjo una reaccion no espedfica producida por IgA.

[Resultados]

35 En la Tabla 5 se muestra el resultado. La unidad de valores medidos del dfmero D que se muestra en la tabla 5 es jg/ml. Con respecto a la muestra E, una realizacion de la presente invencion, Fab'(L)Mal, presento el efecto de inhibir la reaccion no espedfica. Se descubrio que Fab'(L)Mal presento un efecto inhibidor notablemente elevado, en comparacion con la misma cantidad de protema de F(ab')2. Se encontro en este Ejemplo que incluso esta realizacion de la presente invencion preparada a partir de un anticuerpo diferente de un anticuerpo dirigido contra IgM fue eficaz 40 en la inhibicion de una reaccion no espedfica. Se confirmo que esta realizacion presento un efecto inhibidor mayor que el de la tecnica anterior. Se determino el valor verdadero del dfmero D contenido en la muestra E poniendo la muestra en contacto con el anticuerpo dirigido contra IgA para eliminar el factor anticuerpo de la reaccion no espedfica de la muestra, y midiendo a continuacion el valor del dfmero D.

Tabla 5

No se anadio50 mg/l de F(ab')2 50 mg/l de Fab'(L)Mal Valor Muestra E 49U,49d" 12,96 1,88 1,90~

Aplicabilidad industrial

El inhibidor de reaccion no espedfica de la presente invencion puede aplicarse a un uso en una medicion 5 inmunologica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un complejo de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un factor de reaccion no espedfica, y un polfmero, como inhibidor de reaccion no espedfica en una medicion

5 inmunologica, en el que el factor de reaccion no espedfica se selecciona entre el grupo que consiste en IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, el complemento, factores reumatoides, y el receptor Fc.
2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polfmero es un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en un polisacarido, una protema y un polfmero organico de elevado peso molecular.
3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 en el que el polfmero organico de elevado peso molecular es 10 polietilenglicol.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el peso molecular del polfmero es de 1 kDa a 1000 kDa.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el fragmento del anticuerpo es F(ab')2, Fab', Fab, Fd, una cadena L, una cadena H, o rIgG.

15 6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la union del anticuerpo o de un

fragmento del mismo al polfmero es una modificacion qmmica que utiliza un grupo tiol, amino, hidroxilo, o carboxilo, o una union biotina-avidina.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la medicion inmunologica es un procedimiento de medicion optica de aglutinacion de latex, un inmunoensayo enzimatico, un inmunoensayo 20 nefelometrico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, un fluoroinmunoensayo o un radioinmunoensayo.