ES2609604T3 - Composición de Bixa orellana para el tratamiento de la degeneración macular - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un extracto de semillas de Bixa orellana para la fotoprotección de células del epitelio pigmentario de la retina en mamíferos.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Composicion de Bixa orellana para el tratamiento de la degeneracion macular

La invencion se refiere al uso de compuestos y de una composicion para prevenir ciertas afecciones de la retina.

La invencion tiene por objeto mejorar la vision de los individuos afectados, o al menos estabilizar la evolucion de estas afecciones.

La degeneracion macular asociada a la edad, o DMAE, es una enfermedad degenerativa de la retina cronica, pro- gresiva e incapacitante, que afecta a las personas mayores y cuyo origen es multifactorial (Bellman et Sahel, 2007). En Francia, es la primera causa de discapacidad visual despues de los 50 anos y se estima en un millon el numero de personas afectadas. La predisposicion genetica a la enfermedad (Fajnkuchen et Cohen, 2008) es responsable de un numero creciente de casos de mala vision, proporcional al aumento de la esperanza de vida. Esta enfermedad afecta a una pequena parte de la retina, la macula, una zona que sirve para fijar los objetos, leer, reconocer las caras y distinguir los colores. La DMAE es sin duda muy poligenica con la intervencion de factores de riesgo como la exposicion prolongada a la luz, la hipertension arterial, la hipercolesterolemia y el tabaquismo. Existen dos tipos de DMAE, la forma seca o atrofica que representa el 80% de los casos, y la forma humeda o exudativa. Solo esta ultima, caracterizada por la aparicion de nuevos vasos detras de la retina, puede actualmente beneficiarse de los trata- mientos.

Los mecanismos fisiopatologicos de la DMAE son aun poco conocidos, pero la implicacion de los procesos de intoxi- cacion que conducen a la muerte de las celulas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) ha sido establecida en los ultimos anos. De hecho, durante el envejecimiento, estas celulas pueden presentar problemas operativos asociados a la acumulacion en los lisosomas de los complejos proteo-lipfdicos denominados granulos de lipofuscina. Estos granulos se forman progresivamente por una acumulacion de protemas y lfpidos no degradados procedentes de segmentos externos de los fotorreceptores fagocitados por el EpR (Finnemann et al., 2002). La lipofuscina contiene tambien compuestos citotoxicos derivados del ciclo visual, como la A2E, que se forma por adicion de dos moleculas de trans-retinal con una molecula de etanolamina. Bajo el efecto de la luz azul, la A2E se oxida e induce oxidaciones proteicas, lipfdicas y del ADN, provocando de este modo un estres oxidante importante en las celulas del EPR durante el envejecimiento (Kim et al., 2006). Los intentos de prevencion o tratamiento de la forma seca de la DMAE se basan en una complementacion nutricional con sustancias susceptibles de reducir la acumulacion y/o los efectos deletereos de la a2e (Dubernard et al., 2006; Souied et al., 2007; Dutot et al., 2008; Lecerf, 2009; Cohen et al., 2010; Lecerf et Desmettre, 2010).

Teniendo en cuenta el papel muy probable de este mecanismo en el desarrollo de la DMAE, los inventores han utili- zado un modelo celular de fototoxicidad inducida por la asociacion de un tratamiento con A2E y una iluminacion con luz azul de los cultivos primarios del EPR en el que se ha medido la supervivencia celular. Este modelo, desarrollado por el Institut de la Vision, permite asf realizar el cribado de moleculas para el descubrimiento de nuevos candidatos para el tratamiento de la forma seca de la DMAE. Este modelo original esta mas cerca de la situacion "fisiologica" que las lmeas celulares utilizadas comunmente en otros laboratorios (Dunn et al., 1996), porque las celulas utilizadas contienen sustancias protectoras aportadas por la alimentacion del animal y por tanto no se encuentran en situacion de "carencia" y su perturbacion es provocada por el aporte de A2E.

La invencion preve por tanto encontrar un tratamiento alternativo a los ya existentes.

Mas precisamente, los inventores han descubierto que la incubacion previa de celulas con ciertas moleculas permitfa disminuir en gran medida la muerte celular provocada por una iluminacion con radiacion azul de celulas del EPR tratadas previamente con A2E.

Segun la invencion, estas moleculas estan presentes en un extracto de bija, o bien proceden de derivados del acido galico o de compuestos de la familia de las antocianidinas.

Un aspecto de la invencion se refiere por tanto a una composicion que comprende un extracto de semillas de bija, para la fotoproteccion de las celulas del epitelio pigmentario de la retina en mairnferos.

La bija, o urucu, o Bixa orellana es un arbol o arbusto de America tropical. Da frutos rojos con espinas rellenos de semillas.

En el marco de la invencion, se entiende por "extracto de semillas de Bixa orellana" un extracto preparado a partir de la parte externa de las semillas, es decir de la sustancia cerea que recubre las semillas de Bixa orellana. Se sabe que esta sustancia cerea es rica en bixina y carotenoides, asf como se conoce su uso como colorante alimentario.

Se conoce por el documento WO 01/85183 una composicion para la prevencion y el tratamiento de trastornos ocula- res, pudiendo incluir dicha composicion un extracto de Bixa orellana como inhibidor de la aldosa-reductasa.

Este extracto que comprende acido galico y/o pirogalol, se trata verdaderamente de un extracto de hojas de Bixa orellana, tal como ha descrito Terashima et al. (Chem. Pharm. Bull. 39(12), 3346-3347 (1991)), que muestra efecti-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

vamente su actividad como inhibidor de la aldosa-reductasa.

Ademas, el documento WO 01/85183 muestra la inhibicion de la aldosa-reductasa como formando parte de un me- canismo de proteccion contra las cataratas y la retinopatia diabetica.

El documento WO 01/85183 no muestra por tanto la eficacia de un extracto de semillas de Bixa orellana para la foto- proteccion de las celulas del EPR.

Segun un modo de realizacion de la presente invencion, la composicion a base de semillas de Bixa orellana esta destinada al tratamiento de la degeneracion macular asociada a la edad (DMAE) en mairnferos.

Segun otro modo de realizacion de la invencion, la composicion esta destinada al tratamiento de la enfermedad de Stargardt y/o la retinopatfa pigmentaria. La enfermedad de Stargardt, o smdrome de Stargardt, es una patologfa hereditaria, que asocia una disminucion de la agudeza visual bilateral a una atrofia de la macula.

Segun otro modo de realizacion de la invencion, la composicion esta destinada a prevenir danos de la retina suscep- tibles de ser causados por la exposicion a la radiacion azul. Por radiacion azul se entiende la radiacion correspon- diente a la banda azul del espectro de luz visible, es decir la longitud de onda comprendida entre 435 y 490 nm.

Segun un modo de realizacion de la invencion, la composicion comprende ademas un derivado de acido galico y/o un compuesto de la familia de las antocianidinas.

El derivado de acido galico puede ser acido elagico, principalmente purificado o aportado en forma de un extracto de granada. En efecto, la granada contiene acido elagico en cantidades importantes (Panichayupakarananta et al., 2010).

El compuesto de la familia de las antocianidinas puede ser cianidina, principalmente purificada o aportada en forma de un extracto de acai. Esta planta contiene en efecto glicosidos de cianidina. La cianidina puede igualmente ser aportada en forma de un extracto de hibisco.

La composicion a base de semillas de Bixa orellana se puede utilizar en forma de un alimento, un complemento ali- menticio o un medicamento.

Por complemento alimenticio, se entiende un producto que contiene dicho compuesto o dicho extracto o esta enri- quecido en dicho compuesto, teniendo por objeto dicho extracto complementar la alimentacion aportando nutrientes beneficiosos para la salud segun la definicion dada por la Directiva Europea 2002/46/CE. Por ejemplo, un complemento alimenticio puede ser una capsula o comprimido para tragar o un polvo o pequena ampolla para mezclar con un alimento y que presenta efectos beneficiosos sobre la retina.

Por medicamento, se entiende un producto que contiene una dosis precisa de dicho compuesto, o de dicho extracto, segun la definicion dada por la Directiva Europea 65/65/CE, es decir, cualquier sustancia o composicion que se presenta como poseedora de propiedades curativas o preventivas respecto a enfermedades humanas o de animales. Por ejemplo, el medicamento que contiene el compuesto en dosis terapeuticas se pueden administrar por via oral como una capsula o comprimido o se puede inyectar por via intravftrea o cualquier otra via que permita conferir efectos beneficiosos a la retina.

Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion que comprende un derivado del acido galico y/o un compuesto de la familia de las antocianidinas, para la fotoproteccion de las celulas del epitelio pigmentario de la retina en marnfferos.

El derivado del acido galico es preferiblemente el acido elagico, principalmente purificado o aportado en forma de un extracto de granada. El compuesto de la familia de las antocianidinas es preferiblemente cianidina, principalmente purificada o aportada en forma de un extracto de acai o hibisco.

Las aplicaciones de esta otra composicion son las mismos que las de la composicion previamente citada, que comprende un extracto de semillas de Bixa orellana. Como esta ultima, esta otra composicion se puede utilizar en forma de un alimento, un complemento alimenticio o un medicamento.

La invencion se comprendera mejor a partir de la lectura de la siguiente descripcion y del examen de las figuras que se acompanan. Estas son indicativas y de ninguna manera limitativas de la invencion.

La figura 1 ilustra el efecto de un extracto de bija, bixina y norbixina sobre la proteccion del EPR sometido a ensayo de fototoxicidad.

La figura 2 ilustra el efecto de acido clorogenico, rutina y acido elagico sobre la proteccion del EPR sometido a ensa- yo de fototoxicidad.

La figura 3 ilustra el efecto de cianidina, 3-glucosido de cianidina, 3-sambubiosido de delfinidina y 20-hidroxiecdisona sobre la proteccion del EPR sometido a ensayo de fototoxicidad.

Ejemplos de realizacion de la invencion

I. Preparacion de un extracto de Bixa orellana (extracto A)

El extracto A se prepara por agitacion de semillas de bija en etanol absoluto (3 L por kg de semillas) durante 16 ho- ras. La agitacion en alcohol tiene por efecto separar la pelfcula cerea que se encuentra en la superficie de las semi- 5 llas.

Se obtiene una suspension. Se pasa por un tamiz con el fin de eliminar las semillas de bija. Esta suspension se reduce a continuacion hasta 1/8 y luego se decanta. Se forma un deposito solido.

Se elimina el lfquido sobrenadante, rico en Kpidos. Al deposito solido se le anade maltodextrina y se seca por pulve- rizacion.

10 El extracto A contiene 16% en masa de bixina. En los siguientes ejemplos, la concentracion del extracto se expresa en equivalentes de bixina.

El extracto A es igualmente rico en carotenoides. Contiene igualmente otros compuestos terpenicos, tales como ge- ranil-geraniol y tocotrienoles (90% de 6 y 10% de p), asf como varios flavonoides.

El extracto A presenta las siguientes caractensticas para 100 g (Tabla 1):

15 Tabla 1

Valor energetico

319,04 Kcal

Glucidos por diferencia

38,10 g

Bixina

16 g

Protemas

7,7 g

Materia grasa por hidrolisis

1,6 g

Fibras totales

27,9 g

Sodio

8,2 mg

Humedad

6%

Materias minerales

4,3 %

Segun una variante de la invencion, el extracto A puede ser sometido a saponificacion, con el fin de transformar la totalidad o parte de la bixina del extracto en norbixina.

II. Ensayos de actividad

20 Los inventores analizaron 15 sustancias naturales y el extractos A en un modelo celular de fototoxicidad del EPR descrito a continuacion (Tabla 2).

Tabla 2

Tipo

Nombre del compuesto Fuente (ejemplo)

Controles positivos

Lutema Espinacas

Zeaxantina Mafz

Resveratrol Uvas

Carotenoides

Bixina Bija

Norbixina " "

Extracto A " "

Crocetina Azafran

Acido fenolico

Acido clorogenico Yerba mate

Flavona

Orientina Acai

Flavonol

Rutina Hierba sarracena

5

10

15

20

25

30

35

40

Tipo

Nombre del compuesto Fuente (ejemplo)

Flavanona

Naringenina Limon

Benzipirano

Acido elagico Granada

Antocianinas

3-glucosido de cianidina Acai

3-sambubiosido de delfinidina Hibisco

Antocianidina

Cianidina* Acai*

Esteroides

20-Hidroxiecdisona Quinua

*La cianidina se prepara por hidrolisis acida de sus formas glicosiladas

Con el fin de analizar el efecto fotoprotector de las sustancias ensayadas, los inventores utilizaron un modelo celular de fototoxicidad inducida por tratamiento con A2E seguido por iluminacion con radiacion azul. Este modelo se realizo a partir de cultivos primarios del EPR de cerdo adulto. La supervivencia celular se determino por la relacion entre el numero de celulas vivas y el numero total de celulas (vivas + muertas, cuantificadas respectivamente usando tincio- nes espedficas). La obtencion de imagenes se realizo con un microscopio de fluorescencia controlado por el pro- grama informatico Metamorph y las cuantificaciones se realizaron por tratamiento de las imagenes obtenidas por un programa de cuantificacion asignado. Los experimentos se realizaron en microplacas de 96 pocillos por cuadruplica- do y el experimento se repitio al menos cuatro veces. Las celulas se trataron durante 48 horas con estos compues- tos de las cuales las ultimas 24 horas fueron en presencia de A2E, antes de la induccion de la fototoxicidad. Para cada compuesto se analizaron tres concentraciones (0,1, 1 y 10 |jM). Ciertos compuestos se sometieron a ensayos suplementarios a 20 jM con el fin de obtener un intervalo de concentraciones.

III. Resultados

Los resultados, presentados en forma de valores medios y desviaciones tfpicas, se expresan en porcentaje de supervivencia en comparacion con el control sin A2E.

Los experimentos no mostraron efecto protector de los 15 compuestos ni del extracto a concentraciones de 0,1 y 1 jM (resultados no mostrados para lutema, zeaxantina, resveratrol, crocetina, naringenina y orientina y resultados mostrados para extracto de bija, cianidina y acido elagico, Figuras 1 a 3).

En una serie de ensayos (n = 5), el extracto A permitio observar una proteccion importante, con una supervivencia celular a 20 jM del orden de 93% la del control sin A2E, en comparacion con la del control + A2E, que no es mas que del 45% (Figura 1).

Entre los 15 compuestos analizados a 10jM, dos proporcionan proteccion celular contra la fototoxicidad.

Principalmente, a 10 jM, la cianidina proporciona proteccion del orden del 87% en comparacion con el control sin A2E. A 20 jM, este mismo compuesto proporciona una proteccion casi total (Figura 2).

El acido elagico proporciona igualmente una proteccion del orden del 68% en comparacion con el control sin A2E. A 20 jM, este compuesto proporciona una proteccion del mismo orden que la medida a 10 jM, pero con mejor repro- ducibilidad (Figura 3).

Los efectos fotoprotectores esperados para lutema, zeaxantina y resveratrol ("controles positivos") no se observaron en estas condiciones experimentales.

Referencias

Bellmann C, Sahel J-A. 2007. Aspects pathogeniques de la degenerescence maculaire liee a l'age (DMLA). J. Fr. Ophtalmol. 30 (hors-serie 1), 1S11-1S16.

Cohen SY, Mauget-Faysse M, Oubraham H, Algan, M, Conrath J, Roquet W. 2010. Impact des habitudes nutrition- nelles sur la pathologie maculaire evalue par mesure de la densite optique du pigment maculaire. J. Fr. Ophtalmol. 33, 234-240.

Dubemard G, Adam R, Proenca J, Offret H, Labetoulle M. 2006. Alimentation et degenerescence maculaire l'iee a l'age. NPG 6(33), 19-21.

Dunn KC, Aotaki-Keen AE, Putkey FR, Hjelmeland LM. 1996. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Exp. Eye Res. 62, 155-169.

Dutot M, Rambaux L, Warnet JM, Rat P. 2008. Modulation du stress oxydant par la myrtille riche en polyphenols sur un modele de cellules humaines de retine. J. Fr. Ophthalmol. 31(10), 975-980.

Fajnkuchen F, Cohen SY. Degenerescence maculaire liee a l'age et genetique: donnees actuelles. J. Fr. Ophtalmol. 31(6), 630-637.

Finnemann SC, Leung LW, Rodriguez-Boulan E. 2002. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolyso- somal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 5 3842-2847.

Kim SR, Nakanishi K, Itagaki Y, Sparrow JR. 2006. Photooxidation of A2-PE, a photoreceptor outer segment fluorop- hore, and protection by lutein and zeaxanthin. Exp. Eye Res. 82, 828-839.

Lecerf J-M. 2009. Micronutriments: l'exemple de la degenerescence maculaire liee a l'age (DMLA). Medecine Maladies Metaboliques 3(5), 496-501.

10 Lecerf J-M, Desmettre T. 2010. Nutrition et degenerescence maculaire liee a l'age. J. Fr. Ophtalmol. 33, 749-757.

Panichayupakarananta P, Issuriya A, Sirikatitham A, Wang W. 2010. Antioxidant assay-guided purification and LC determination of ellagic acid in pomegranate peel. J. Chrom. Sci. 48, 456-459.

Souied E, Le Tien V, Coscas G, Soubrane G. 2007. Vers la prevention de la degenerescence maculaire liee a l'age. J. Fr. Ophtalmol. 30(5), 449-455.

15

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1 - Composicion que comprende un extracto de semillas de Bixa orellana para la fotoproteccion de celulas del epitelio pigmentario de la retina en mairnferos.

   2 - Composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, para su aplicacion en el tratamiento de la degeneracion 5 macular asociada a la edad (DMAE) en mai^eras.

   3 - Composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, para su aplicacion en el tratamiento de la enfermedad de Stargardt y/o la retinopatia pigmentaria.

   4 - Composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, para prevenir danos en la retina que pueden ser causa- dos por la exposicion a radiacion azul de longitud de onda comprendida entre 435 y 490 nm.

   10 5 - Composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un vehfculo aceptable

   para ser ingerido o inyectado en el ojo o inyectado en la sangre.

   6 - Composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, como medicamento o complemento ali- menticio o alimento.

   7 - Composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas un derivado de 15 acido galico y/o un compuesto de la familia de las antocianidinas.

   8 - Composicion de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizada porque el derivado del acido galico es el acido elagico.

   9 - Composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque el compuesto de la familia de las antocianidinas es la cianidina.

   20