ES2609974T3 - Procedimiento de medición y kit para la medición de la concentración de antibióticos - Google Patents

Procedimiento de medición y kit para la medición de la concentración de antibióticos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para la medición de la concentración de un antibiótico, que comprende: la preparación de partículas magnéticas unidas a un antibiótico; la preparación de partículas fluorescentes recubiertas con sílice a las que se ha unido al menos un anticuerpo del antibiótico; dejar que las partículas magnéticas reaccionen con las partículas fluorescentes recubiertas con sílice; e la irradiación de las partículas fluorescentes recubiertas con sílice, que han reaccionado con las partículas magnéticas, con haces de láser.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento de medicion y kit para la medicion de la concentration de antibioticos.
5 REIVINDICACION DE PRIORIDAD
[0001] Esta solicitud reivindica prioridad con respecto a la Solicitud de Patente Coreana N° 2012-0108074 depositada el 27 de septiembre de 2012 en la Korean Intellectual Property Office (KIPO).
10 ANTECEDENTES
1. Campo tecnico
[0002] Los ejemplos de realizaciones de la presente invention ser refieren en general a un procedimiento y a 15 un kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico.
2. Tecnica relacionada
[0003] Los antibioticos son metabolitos que son producidos por microorganismos, y por lo tanto pueden ser 20 usados en pequenas cantidades para inhibir el crecimiento de otros microorganismos o para destruir otros
microorganismos. Por lo tanto, los antibioticos han sido ampliamente usados en los animales destinados al consumo domestico, tales como cerdos, pollos y reses. Sin embargo, dado que los antibioticos usados en los animales destinados al consumo domestico no se descomponen facilmente en el cuerpo de un animal, los antibioticos pueden ser facilmente introducidos en el cuerpo del animal cuando se ingiere el animal destinado al consumo domestico. 25 Los antibioticos introducidos en el cuerpo del animal pueden afectar al sistema nervioso central, y desencadenar tambien resistencias en los patogenos a los suministros medicos.
[0004] Por lo tanto, la monitorizacion de la concentracion de los antibioticos en los animales destinados al consumo domestico se considera uno de los aspectos clave en los ensayos de seguridad alimentaria.
30
[0005] El documento JP H 07 151756 A describe un procedimiento para la medicion de un anticuerpo. Para separar de forma rapida y facil sustancias sin reaccionar de un producto de reaction y limpiar las sustancias sin reaccionar, se usan partlculas magneticas y partlculas fluorescentes. Se hacen reaccionar un primer reactivo que contiene partlculas magneticas insolubles portadoras del anticuerpo que se encuentra con el anticuerpo que se va a
35 medir, y el anticuerpo que se va a medir, entre si en un medio llquido contenido en un recipiente de reaccion. Despues de la reaccion, las partlculas magneticas son atraldas hacia la pared del recipiente mediante la utilization de la action de un campo magnetico, y el medio llquido se retira del recipiente. Entonces se hace reaccionar un segundo agente que contiene partlculas insolubles marcadas con un pigmento fluorescente portadoras de un antlgeno que se une especlficamente al anticuerpo que se va a medir, y las partlculas magneticas atraldas hacia la 40 pared del recipiente, entre si, en el medio llquido. A continuation, las partlculas magneticas son atraldas de nuevo hacia la pared del recipiente mediante la utilizacion de la accion del campo magnetico, y el medio llquido y las partlculas marcadas con pigmento sin reaccionar se retiran, y despues se mide la intensidad de la fluorescencia de las partlculas marcadas con pigmento que han reaccionado con las partlculas magneticas.
45 [0006] YOSHIO KOBAYASHI ET AT: "Silica-coating of fluorescent polystyrene microspheres by a seeded
polymerization technique and their photo-bleaching property" COLLOIDS AND SURFACES A: PHYSIOCHEMICAL AND ENGINEERING ASPECTS, vol. 242, n° 1-3. 15 de junio de 2004, paginas 47-53, describen el recubrimiento con sllice de microesferas de poliestireno incorporadas con colorantes fluorescentes (microesferas fluorescentes) mediante una tecnica de polimerizacion por siembra basada en el metodo de Stober. El recubrimiento con sllice de 50 los microesferas fluorescente se lleva a cabo en presencia de 0-10 g/l de polivinilpirrolidona (PVP), 1,13-17 M de agua, 0-1,2 M de amonlaco acuoso y 0,00038-0,2 M de tetraetoxiortosilicato (TEOS). La adicion de PVP suprime la production de partlculas libres de sllice y mejora la uniformidad del espesor de la cubierta. El espesor de la cubierta de sllice aumenta desde 13 hasta 138 nm con un aumento en la concentracion de TEOS a 10 g/l PVP, 0,4 M de amonlaco acuoso y 10,9 M de agua. El espesor tambien aumenta con la concentracion de amonlaco y con la 55 concentracion de agua. Las microesferas fluorescentes recubiertas de sllice muestran una fluorescencia mas estable a la irradiation con un laser que las microesferas no recubiertas.
[0007] WACHIRA TANSUB ET AL: "Synthesis of Antibodies-Conjugated Fluorescent Dye-Doped Silica
Nanoparticles for a Rapid Single Step Detection of Campylobacter jejuni in Live Poultry", JOURNAL OF
NANOMATERIALS, vol. 22, n° 1, 1. Enero de 2012, paginas 1743-7, describen la preparacion de nanopartlculas de sllice dopadas con un colorante fluorescente conjugadas con anticuerpos (FDS-NP) para la deteccion de celulas de Campylobacter jejuni bajo un microscopio de fluorescencia. Las partlculas preparadas mediante tecnicas de microemulsion en sol-gel tienen una forma redonda con un tamano medio de 43 ± 4 nm. Son muy fotoestables y 5 emitan una fuerte fluorescencia de color naranja durante 60 min. Ambas propiedades funcionalizadas de amina y de carboxilo son evidentes a partir de los espectros de FTIR y de FT Raman. Las FDS-NP conjugadas con anticuerpos contra C. jejuni estan bien dispersadas en una solucion de PBS a 20 mM de NaCl. La conjugacion con anticuerpos monoclonales contra C. jejuni tuvo exito. La observacion directa de las FDS-NP conjugadas con anticuerpos que se unen a C. jejuni con una camara de recuento de Petroff Hausser a 40x es evidente. Las diferentes distancias focales 10 separan claramente bajo el microscopio las FDS-NP unidas de las no unidas.
[0008] HECTOR FONT ET AL: "Immunochemical Assays for Direct Sulfonamide Antibiotic Detection In Milk and Hair Samples Using Antibody Derivatized Magnetic Nanoparticles", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, no. 3, 13 de febrero de 2008, paginas 736-743, describen dos ensayos de inmunoadsorcion enzimatica
15 directa (ELISA) para la deteccion de residuos del antibiotico sulfonamida en muestras de leche. Uno de ellos es la utilizacion de nanopartlculas magneticas (MNP) para la captura/enriquecimiento del objetivo (Ab-MNP-ELISA), y el segundo se lleva a cabo mediante la utilizacion de placas de microtitulacion. Unos anticuerpos policlonales selectivos, creados contra el acido 5-[6-(4-amino-bencensulfonilamino)-piridin-3-il]-2-metil-pentanoico (SA1), usados junto con un trazador enzimatico preparado con el mismo hapteno, permitieron alcanzar un llmite de deteccion (LOD) 20 menor de 0,5 pg l-1 para ambos formatos de ELISA. Se detectan sulfapiridina, sulfametoxipiridazina, sulfatiazol y sulfacloropiridazina por debajo de los llmites residuales maximos establecidos por la Union Europea para estos antibioticos en la leche (100 pg l-1). Los estudios de los efectos y la precision de la matriz realizados con leche entera y con extractos de cabello indicaron la ausencia de interferencias de estas matrices de muestras y unos valores de recuperacion muy buenos, especialmente cuando se usa el formato Ab-MNP. Las muestras de leche y los 25 extractos de cabello se miden sin ningun tratamiento previo.
RESUMEN
[0009] Consecuentemente, se proporcionan ejemplos de realizaciones de la presente invencion para obviar 30 sustancialmente uno o mas de los problemas debidos a las limitaciones y los inconvenientes de la tecnica anterior.
[0010] Los ejemplos de realizaciones de la presente invencion proporcionan un procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico, que incluye procesos simples y tiene un llmite de deteccion bajo.
35 [0011] Tambien, los ejemplos de realizaciones de la presente invencion proporcionan un kit para la medicion
de la concentracion de un antibiotico, que incluye procesos simples y tiene un llmite de deteccion bajo.
[0012] En algunos ejemplos de realizaciones, un procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico incluye la preparacion de partlculas magneticas unidas a un antibiotico, la preparacion de partlculas
40 fluorescentes recubiertas con sllice a las que esta unido que al menos un anticuerpo del antibiotico, dejando que las partlculas magneticas reaccionen con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, e irradiando las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice que han reaccionado con haces de laser.
[0013] En otros ejemplos de realizaciones, un kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico 45 incluye una primera unidad de medicion que comprende partlculas magneticas a las que esta unido un grupo
funcional capaz de unirse a un antibiotico, y una segunda unidad de medicion que comprende partlculas fluorescentes recubiertas con sllice a las que esta unido un anticuerpo del antibiotico.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS 50
[0014] Los ejemplos de realizaciones de la presente invencion seran mas evidentes mediante la descripcion detallada de los ejemplos de realizaciones de la presente invencion con referencia a los dibujos anexos, en los que:
la FIG. 1 es un diagrama que muestra las formulas qulmicas de los antibioticos enrofloxacino, ciprofloxacino, 55 salinomicina y sulfatiazol;
la FIG. 2 es un diagrama conceptual que muestra esquematicamente un procedimiento para la medicion de la concentracion de enrofloxacino segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion;
la FIG. 3 es un diagrama de flujo que muestra esquematicamente un procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion;
la FIG. 4 es una grafica que muestra los resultados de la medicion del isotiocianato de fluorescelna (FITC) y de las partlculas de FITC recubiertas con sllice en una prueba de estabilidad frente al pH;
la FIG. 5 es una grafica que muestra los resultados de la medicion del FITC, de partlculas de formadas por FITC y de partlculas de FITC recubiertas con sllice en una prueba de estabilidad frente al fotoblanqueamiento;
5 la FIG. 6 es una grafica que muestra los resultados de la medicion del FITC en una prueba de estabilidad de inactivacion con metales; y
la FIG. 7 es una grafica que muestra los resultados de la medicion las partlculas de FITC recubiertas con sllice en una prueba de estabilidad de inactivacion con metales.
10 DESCRIPCION DE LOS EJEMPLOS DE REALIZACIONES
[0015] Los ejemplos de realizaciones de la presente invention se describen en el presente documento. Sin embargo, los detalles especlficos estructurales y funcionales descritos en el presente documento son unicamente con fines representativos de la description de los ejemplos de realizaciones de la presente invencion, sin embargo,
15 los ejemplos de realizaciones de la presente invencion pueden realizarse en muchas formas alternativas y no deben ser interpretados como limitados a los ejemplos de realizaciones de la presente invencion establecidos en el presente documento.
[0016] Consecuentemente, aunque la invencion es susceptible de varias modificaciones y formas 20 alternativas, a modo de ejemplo se muestran en los dibujos realizaciones especlficas de la misma, y se describiran
en el presente documento con detalle. Sin embargo, debe entenderse que no hay intencion de limitar la invencion a las formas descritas en particular, sino mas bien al contrario, la invencion debe cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que esten en el ambito de la invencion. A lo largo de la descripcion de las figuras, los mismos numeros se refieren a los mismos elementos.
25
[0017] Se entendera que, aunque en el presente documento pueden usarse los terminos primero, segundo, etc. para la descripcion de varios elementos, estos elementos no deben estar limitados por estos terminos. Estos terminos se usan unicamente para distinguir los elementos entre si. Por ejemplo, un primer elemento podrla ser denominado como un segundo elemento, y de forma similar, un segundo elemento podrla ser denominado como un
30 primer elemento, sin desviarse del ambito de la presente invencion. Segun se usa en el presente documento, el termino "y/o" incluye cualquiera y todas las combinaciones de uno o mas de los elementos indicados asociados.
[0018] Se entendera que cuando se indica que un elemento esta "conectado" o "acoplado" con otro elemento, puede estar conectado o acoplado directamente al otro elemento, o puede haber presentes elementos
35 intervinientes. Por el contrario, cuando se indica que un elemento esta "conectado directamente" o "acoplado directamente" a otro elemento, no hay ningun elemento interviniente presente. Otras palabras que pueden usarse para la descripcion de la relation entre los elementos deben ser interpretadas de una forma similar (es decir, "entre" frente a "directamente entre," "adyacente" frente a "directamente adyacente," etc.).
40 [0019] La terminologla usada en el presente documento es unicamente con el fin de describir realizaciones
en particular, y no pretende ser limitante de la invencion. Segun se usa en el presente documento, las formas singulares "un," "uno/a" y "el/la" pretenden incluir tambien las formas plurales, salvo que el contexto lo indique claramente de otro modo. Adicionalmente se entendera que los terminos "comprende", "que comprende," "incluye" y/o "que incluye", cuando se usan en el presente documento, indican la presencia de las caracterlsticas, los numeros 45 enteros, las etapas, las operaciones, los elementos y/o los componentes establecidos, pero no excluyen la presencia o la adicion de una o mas de otras caracterlsticas, numeros enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos.
[0020] Salvo que se definan de otro modo, todos los terminos (incluyendo los terminos tecnicos y cientlficos) 50 usados en el presente documento tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual
en la materia a la que pertenece esta invencion. Adicionalmente se entendera que los terminos, tales como los definidos en los diccionarios de uso habitual, deben ser interpretados de forma que tengan un significado que sea coherente con su significado en el contexto de la tecnica pertinente, y no deben ser interpretados en un sentido idealizado o excesivamente formal, salvo que expresamente as! se defina en el presente documento.
55
[0021] Tambien debe apreciarse que en algunas implementaciones alternativas, las funciones/actos indicados en los bloques pueden producirse fuera del orden establecido en los diagramas de flujo. Por ejemplo, dos bloques mostrados sucesivamente pueden ser ejecutados de hecho sustancialmente simultaneamente, o a veces los bloques pueden ejecutarse en el orden inverso, dependiendo de la funcionalidad/actos implicados.
[0022] A continuacion, en lo sucesivo, se describiran los ejemplos de realizaciones de la presente invencion
con referencia a los dibujos anexos.
5 [0023] La FIG. 1 es un diagrama que muestra las formulas qulmicas de los antibioticos enrofloxacino,
ciprofloxacino, salinomicina y sulfatiazol. La FIG. 2 es un diagrama conceptual que muestra esquematicamente un procedimiento para la medicion de la concentracion de enrofloxacino segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion. La FlG. 3 es un diagrama de flujo que muestra esquematicamente un procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion. A continuacion, en lo 10 sucesivo se describira con detalle adicional el procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico con referencia a las FIGS. 1, 2 y 3.
[0024] El procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de
realizacion de la presente invencion incluye la preparacion de partlculas magneticas unidas a un antibiotico, la 15 preparacion de partlculas fluorescentes recubiertas con sllice a las que se ha unido al menos un anticuerpo del antibiotico, dejando que las partlculas magneticas reaccionen con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice
(S3), e irradiando las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, que han reaccionado con las partlculas magneticas, con haces de laser (S5).
20 [0025] El antibiotico puede seleccionarse del grupo que consiste en enrofloxacino, ciprofloxacino,
salinomicina y sulfatiazol.
[0026] Antes de la preparacion de las partlculas magneticas unidas al antibiotico, el procedimiento segun un ejemplo de realizacion puede incluir adicionalmente un pretratamiento del antibiotico (S11). Esto es, segun un
25 ejemplo de realizacion de la presente invencion, en primer lugar pueden eliminarse las grandes cantidades de protelna y de grasa presentes en la carne de los animales domesticos, tales como un cerdo, un pollo y reses, y puede extraerse un antibiotico de la carne. Algunos ejemplos de procedimientos para la elimination de las protelnas de la carne pueden incluir la introduction de acetonitrilo en la carne, seguido de someter a la carne a una agitation vorticial y a ultrasonidos. Tambien, un ejemplo de un procedimiento de eliminacion de grasas de la carne puede 30 incluir un procedimiento que incluye la recoleccion del sobrenadante a partir de una solution de la cual se retiran las protelnas, la adicion de hexano en la misma proportion de volumen que el acetonitrilo, y someter el sobrenadante a una agitacion vorticial y a ultrasonidos. Para la eliminacion de las impurezas residuales, puede llevarse a cabo adicionalmente la eliminacion de las impurezas que tienen un tamano de 0,2 pm o mas mediante el uso de un filtro de jeringa.
35
[0027] La preparacion de las partlculas magneticas unidas al antibiotico puede incluir la union de un grupo amino a las superficies de las partlculas magneticas (S12), y la formation de un enlace amida entre el grupo amino unido a las partlculas magneticas y el antibiotico (S14). En este caso, la union del grupo amino de las partlculas magneticas (S12) incluye la adicion de 3-aminopropiltrietoxisilano (3-APTES) y de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) a
40 las partlculas magneticas, y la agitacion de la mezcla resultante.
[0028] Adicionalmente puede llevarse a cabo la adicion de un agente de reticulation (S 13) despues de la union del grupo amino a las superficies de las partlculas magneticas (S12). En este caso, como agente de reticulacion puede usarse al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en N-(3-dimetilaminopropil)-N'-
45 etilcarbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS).
[0029] El procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion puede incluir adicionalmente la recoleccion de las partlculas magneticas que han formado el enlace amida con el antibiotico mediante el uso de un iman (S 15) despues de la formacion del
50 enlace amida entre las partlculas magneticas con el grupo amino unido y el antibiotico. Cuando las partlculas magneticas se recogen mediante el uso del iman, puede facilitarse un aumento en la concentracion del antibiotico, que favorece la medicion de la concentracion del antibiotico.
[0030] La preparacion de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice puede incluir la formacion de 55 partlculas fluorescentes recubiertas con sllice mediante el recubrimiento de partlculas fluorescentes que incluyen un
primer material fluorescente, con sllice (S21), y la union de al menos un anticuerpo del antibiotico a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice. Este primer material fluorescente puede ser al menos un material seleccionado entre isotiocianato de fluorescelna (FITC) y cianina (Cy).
[0031] Aqul, las partlcuias fluorescentes que incluyen el primer material fluorescente pueden prepararse mediante la completa disolucion del primer material fluorescente en un disolvente organico mediante la adicion del primer material fluorescente al disolvente organico y la aplicacion de ultrasonidos al primer material fluorescente, y agitando en el disolvente organico en el que el primer material fluorescente se disuelve en un estado protegido de la
5 luz.
[0032] La formacion de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice mediante el recubrimiento de las partlculas fluorescentes que incluyen el primer material fluorescente con sllice (S21) puede incluir la formacion de un sistema en microemulsion inversa mediante la mezcla de una sal de docusato de sodio y agua desionizada (DIW)
10 con heptano y la agitacion de la mezcla resultante, la adicion de las partlculas fluorescentes que incluyen el primer material fluorescente al sistema en microemulsion inversa con agitacion, y la adicion de TEOS y de NH4OH en un estado protegido de la luz.
[0033] Las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice pueden ser preparadas a entre 10 y 90 °C, y
15 preferentemente a entre 75 y 85 °C.
[0034] Dado que las superficies de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice estan recubiertas con sllice, las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice pueden verse menos afectadas por una variedad de factores externos. Por ejemplo, cuando las partlculas fluorescentes estan unidas directamente a moleculas biologicas, la
20 inactivacion puede tener lugar debido a varios factores externos tales como disolventes, aire, metales, sales y similares, y con el tiempo puede haber una tendencia a que se produzca una disminucion en el grado de fluorescencia. Dado que las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice se preparan mediante el recubrimiento de las partlculas fluorescentes con sllice, las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice pueden servir para prevenir cualquier efecto de los diversos factores externos y mantener de forma continua el grado inicial de fluorescencia,
25 incluso con el paso del tiempo. Cuando las partlculas fluorescentes son recubiertas con sllice de una manera similar, las partlculas fluorescentes tienen la ventaja de que pueden ser protegidas frente al fotoblanqueamiento causado por los haces de laser usados como fuente luminosa, y mantener un grado constante de fluorescencia incluso cuando se produce un cambio en el pH.
30 [0035] La union del al menos un anticuerpo del antibiotico a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice
puede incluir la union de un grupo carboxllico a las superficies de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice (S22), y la formacion de un enlace amida entre las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice con el grupo carboxllico unido y el anticuerpo del antibiotico (S24).
35 [0036] La union del grupo carboxllico a la superficie de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice
(S22) puede incluir la mezcla de 3-APTES y de TEOs con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice con agitacion, y la disolucion de anhldrido succlnico en dimetilsulfoxido (DMSO), y la mezcla de la mezcla resultante con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice con agitacion.
40 [0037] El procedimiento segun la presente invencion puede incluir adicionalmente la adicion de un agente de
reticulacion (S23) despues de la union del grupo carboxllico a las superficies de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice (S22). Aqul, el agente de reticulacion puede seleccionarse entre N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), y una combinacion de los mismos.
45 [0038] El procedimiento segun la presente invencion puede incluir adicionalmente la medicion de la cantidad
de anticuerpo del antibiotico unido a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice (S25) despues de la union del uno o mas anticuerpos de los antibioticos a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice. Por lo tanto, cuando a continuacion se mide la cantidad de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice mediante el uso de un ensayo de fluorescencia, puede medirse facilmente la cantidad del anticuerpo del antibiotico unido a las partlculas
50 fluorescentes recubiertas con sllice, lo que hace posible reducir adicionalmente el llmite de detection de la medicion de la concentration del antibiotico unido al anticuerpo del antibiotico.
[0039] La medicion de la cantidad de anticuerpo del antibiotico unido a las partlculas fluorescentes
recubiertas con sllice (S25) puede incluir la mezcla de un segundo material fluorescente al que esta unido un
55 anticuerpo secundario especlfico para el anticuerpo del antibiotico, con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, y la medicion del primer material fluorescente y del segundo material fluorescente mediante el uso de rayos de luz con diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, cuando se mide el grado de fluorescencia del primer material fluorescente mediante el uso de rayos de luz con unas primeras longitudes de onda, que inciden sobre el primer material fluorescente, el grado de fluorescencia del segundo material fluorescente se mide mediante el uso de rayos
de luz con unas segundas longitudes de onda, que inciden sobre el segundo material fluorescente, y se comparan y analizan los grados de fluorescencia del primer y del segundo material fluorescente, puede medirse la cantidad de antibiotico unido a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice individuales.
5 [0040] La reaccion de las partlculas magneticas con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice (S3)
puede incluir la realizacion de una reaccion de antlgeno/anticuerpo entre el antibiotico unido a las partlculas magneticas y el anticuerpo del antibiotico unido a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice. La reaccion de antlgeno/anticuerpo es muy especlfica, dado que esta reaccion se realiza seleccionando unicamente un antlgeno contra el anticuerpo. Dado que el anticuerpo del antibiotico selecciona y reacciona unicamente con el antibiotico, las 10 partlculas magneticas unidas al antibiotico pueden unirse a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice unidas al anticuerpo del antibiotico. Por lo tanto, puede asociarse directamente el grado de fluorescencia de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice con la concentracion del antibiotico.
[0041] Despues de la reaccion de las partlculas magneticas con las partlculas fluorescentes recubiertas con 15 sllice (S3), el procedimiento segun la presente invention puede incluir adicionalmente la recoleccion de las
partlculas magneticas, que han reaccionado con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, mediante el uso de un iman (S4). Cuando las partlculas magneticas se recogen mediante el uso del iman, puede aumentarse la concentracion del antibiotico y de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, lo que favorece la medicion de la concentracion del antibiotico.
20
[0042] La recoleccion de las partlculas magneticas, que han reaccionado con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, mediante el uso del iman (S4) puede llevarse a cabo junto con la recoleccion de las partlculas magneticas que forman el enlace amida con los antibioticos mediante el uso del iman (S 15), o puede llevarse a cabo una de las operaciones de recoleccion.
25
[0043] La irradiation de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, que han reaccionado con las partlculas magneticas, con haces de laser (S5) puede incluir adicionalmente la medicion del grado de fluorescencia de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice mediante el uso de un ensayo de fluorescencia. El ensayo de fluorescencia puede ser, por ejemplo, un ensayo mediante el uso de un microscopio de fluorescencia inducida por
30 laser (LIFM).
[0044] El procedimiento descrito anteriormente para la medicion de la concentracion de un antibiotico puede ser util para medir rapidamente la concentracion del antibiotico con unos procesos simples y baratos. Tambien, segun el procedimiento descrito anteriormente para la medicion de la concentracion de un antibiotico, la
35 concentracion del antibiotico objetivo que se va a medir puede medirse de forma precisa incluso cuando el antibiotico objetivo esta presente en una cantidad extremadamente pequena. Esto es, el llmite de detection para la medicion de la concentracion de un antibiotico mediante el uso de un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA) es de aproximadamente 1 ppb, pero el llmite deteccion del procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion puede reducirse hasta 40 0,045 ppb.
[0045] En lo sucesivo, a continuation, se describira el kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion. Dado que el kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion es el kit usado en el
45 procedimiento para la medicion de la concentracion de un antibiotico segun un ejemplo de realizacion de la presente invencion, por claridad se describiran las diferencias entre los dos kits.
[0046] El kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico incluye una primera unidad de medicion
que comprende partlculas magneticas a las que se ha unido un grupo funcional capaz de unirse al antibiotico, y una
50 segunda unidad de medicion que comprende partlculas fluorescentes recubiertas con sllice a las que se ha unido un anticuerpo del antibiotico. En este caso, el grupo funcional capaz de unirse al antibiotico puede ser un grupo amino.
[0047] El kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico es facilmente portatil dado que el kit incluye unicamente la primera unidad de medicion y la segunda unidad de medicion. Segun se ha descrito
55 anteriormente, el kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico tambien puede usarse para medir rapidamente una concentracion muy pequena del antibiotico con unos procesos simples y baratos.
[0048] A continuacion, en lo sucesivo, se describira la presente invencion con mas detalle mediante los Ejemplos preparativos, los Ejemplos experimentales y los Ejemplos comparativos. Sin embargo, deberla entenderse
que los detalles descritos en el presente documento se proporcionan unicamente a modo de ilustracion de la presente invention, y no pretenden limitar el ambito de la presente invention.
<Ejemplo preparativo 1> Elaboracion de un kit para la medicion de la concentracion de enrofloxacino
5
(1) Preparation de partlculas magneticas a las que se ha unido un grupo amino
[0049] Se anadieron 55 pl de 3-APTES y de TEOS conjuntamente a partlculas magneticas, y se hicieron reaccionar durante 24 horas con agitation para la union de un grupo amino a las superficies de las partlculas
10 magneticas.
(2) Preparacion de partlculas de FITC recubiertas con silice a las que se ha unido al menos un anticuerpo de enrofloxacino
15 © Preparacion de partlculas de nucleo que incluyen FITC (denominadas en lo sucesivo "partlculas de FITC")
[0050] Se anadieron 10 mg de FITC a 10 ml de etanol, y se sometieron a ultrasonidos durante 5 minutos de forma que se disolviera completamente el FITC en el etanol. A continuation se anadieron al mismo 50 pl de 3- APTES, y se agito durante 24 horas con una barra imantada. La agitacion se lleva a cabo en un estado en el que se
20 protegla de la luz con papel de plata, de forma que se evitara el contacto directo del FITC con la luz.
© Preparacion de partlculas de FITC recubiertas con silice
[0051] Se anadieron 5 mmol de sal de docusato de sodio y 860 pl de DIW a 48 ml de heptano, y se agitaron 25 con una barra imantada durante 10 minutos para preparar un sistema en microemulsion inversa. Se anadieron 300
pl de partlculas fluorescentes que incluian FITC al sistema de microemulsion inversa, y se agito con una barra imantada durante 30 minutos. Posteriormente, se anadieron 430 pl de TEOS y 270 pl de NH4OH al 25 % que servian como catalizador, y se hicieron reaccionar durante 24 horas en un estado protegido de la luz por papel de plata.
30 © Union del grupo carboxilico a las superficies de las partlculas de FITC recubiertas con silice
[0052] Se anadieron 55 pl de 3-APTES y de TEOS conjuntamente a las partlculas de FITC recubiertas con silice, y se hicieron reaccionar durante 24 horas con agitacion para la activation de un grupo amino en superficies de las partlculas de FITC recubiertas con silice. A continuacion, para sustituir el grupo amino por un grupo carboxilico,
35 se disolvio anhidrido succinico en DMSO, se anadio a las partlculas de FITC recubiertas con silice, y se hicieron reaccionar de nuevo durante 2 horas con agitacion.
® Union de al menos un anticuerpo de enrofloxacino a las partlculas de FITC recubiertas con silice a las que se ha unido un grupo carboxilico 40
[0053] Los agentes de reticulation, EDC y NHS, se anadieron conjuntamente en una proportion de 2:1 a las partlculas de FITC recubiertas con silice con el grupo carboxilico unido. A continuacion se anadieron 10 pl de un anticuerpo de enrofloxacino, y se hicieron reaccionar durante 2 horas.
45 <Ejemplo preparativo 2> Elaboracion de un kit para la medicion de la concentracion de ciprofloxacino
[0054] Se elaboro un kit para la medicion de la concentracion de ciprofloxacino sustancialmente de la misma forma que en el Ejemplo preparativo 1, excepto porque se uso un anticuerpo de ciprofloxacino en lugar del anticuerpo de enrofloxacino usado en el Ejemplo preparativo 1.
50
<Ejemplo preparativo 3> Elaboracion de un kit para la medicion de la cantidad del anticuerpo unido a las partlculas fluorescentes recubiertas con silice
(1) Preparacion de partlculas de Cy5 recubiertas con silice a las que se ha unido al menos un anticuerpo de 55 enrofloxacino
[0055] Se prepararon partlculas de Cy5 recubiertas con silice a las que se ha unido al menos un anticuerpo
de enrofloxacino sustancialmente de la misma forma que en el Ejemplo preparativo 1 (2), excepto porque se uso Cy5 en lugar del FITC usado en el Ejemplo preparativo 1 (2).
(2) Preparacion de FITC al que se ha unido un anticuerpo secundario especifico de enrofloxacino
[0056] Los agentes de reticulacion EDC y NHS se anadieron conjuntamente en una proporcion de 2:1 al FITC. A continuacion se anadieron 100 |jl de un anticuerpo secundario especifico del anticuerpo de enrofloxacino, y
5 se hicieron reaccionar durante 2 horas.
<Ejemplo preparativo 4> Preparacion de la muestra de pretratamiento
[0057] Para eliminar las protelnas se anadio acetonitrilo a una muestra de carne picada. La mezcla resultante 10 complementada con un disolvente se sometio a una agitacion vorticial y a ultrasonidos con agitacion durante 10
minutos. El sobrenadante se recogio, y se anadio hexano en la misma proporcion de volumen que el acetonitrilo, de forma que se eliminaran las grasas. A continuacion, el sobrenadante se sometio a una agitacion vorticial y a ultrasonidos con agitacion durante 10 minutos. Despues se elimino una capa de grasa. Para eliminar las impurezas residuales, las impurezas con un tamano de 0,2 jm o mas se eliminaron mediante el uso de un filtro de jeringa.
15
<Ejemplo experimental 1> Prueba de estabilidad de las particulas de FITC recubiertas con silice
(1) Prueba de estabilidad frente al pH
20 [0058] Se preparo un vial, se almaceno en HNO3 al 20 % y se lavo varias veces con DIW para eliminar los
metales presentes en el vial, o los iones capaces de tener cualquier efecto. Se pusieron soluciones (desde pH 1 hasta 13) en viales a unas dosis de 1 ml. Para la preparacion de las soluciones con un pH desde 1 hasta 13, los valores de pH de las soluciones se ajustaron con NaOH y HNO3. Se anadieron 2 jl de las particulas fluorescentes, es decir, FITC o particulas de FITC recubiertas con silice, a las soluciones, y se hicieron reaccionar durante una hora 25 mientras se rotaban con un rotador. El grado de fluorescencia se midio mediante el uso de un LIFM. Los resultados de la medicion obtenidos en la prueba de estabilidad frente al pH se muestran en la FIG. 4.
(2) Prueba de estabilidad frente al fotoblanqueamiento
30 [0059] Se disolvio FITC en etanol y se diluyo con DIW. Tambien se diluyeron las particulas de FITC y las
particulas de FITC recubiertas con silice con DIW, y se probaron de la misma forma a la descrita, preparando asi una muestra. La muestra se irradio de forma continua con haces de laser, y la intensidad de la fluorescencia se midio cada minuto durante un total de 20 minutos mediante el uso de un tubo fotomultiplicador (PMT) y un contador de fotones. Los resultados obtenidos en la medicion de la prueba de estabilidad frente al fotoblanqueamiento se 35 muestran en la FIG. 5.
(3) Prueba de estabilidad de inactivacion con metales
[0060] Las concentraciones de Na+ y de K+ en forma de iones cloruro se ajustaron a 0, 10, 50, 100, 200, 500, 40 700, 1.000 y 5.000 jg/ml. Las soluciones de metales preparadas se pusieron en viales a unas dosis de 1 ml segun la
concentracion, y se anadieron 2 jl de las particulas fluorescentes, es decir, de FITC o de las particulas de FITC recubiertas con silice, a los viales, y se mezclaron concienzudamente. Se midieron los grados de fluorescencia de las mezclas resultantes mediante el uso de un LIFM, un PMT y un contador de fotones. Debido a que el FITC no se disuelve facilmente en el DIW, el FITC se disolvio en 1 mg/ml de etanol, y se diluyeron 10 jl de la solucion con 1 ml 45 del DIW que se va a usar. Los resultados obtenidos en la medicion de la prueba de estabilidad de inactivacion con metales se muestran en las FIG. 6 y 7. La FIG. 6 muestra los resultados de la medicion del FITC en la prueba de estabilidad de inactivacion por metales, y la FIG. 7 muestra los resultados de la medicion de las particulas de FITC recubiertas con silice en la prueba de estabilidad de inactivacion por metales.
50 <Ejemplo experimental 2> Experimento para la medicion de la cantidad de anticuerpo unido a las particulas fluorescentes recubiertas con silice
[0061] La cantidad de anticuerpo unido a las particulas fluorescentes recubiertas con silice se midio mediante el uso del kit elaborado en el Ejemplo preparativo 3. Mas particularmente, se preparo una mezcla que incluye
55 particulas de Cy5 recubiertas con silice a las que se ha unido al menos un anticuerpo de enrofloxacino, y FITC al que se ha unido un anticuerpo secundario especifico para el anticuerpo de enrofloxacino. La mezcla se irradio con haces de laser rojo de He/Ne a 632,8 nm para la medicion del grado de fluorescencia de Cy5, y con haces de laser azul a 473 nm en estado solido bombeado por diodo (DPSS) mediante el uso de un LifM. Se compararon y analizaron el grado de fluorescencia de la Cy5, que representa la cantidad de particulas de Cy5 recubiertas con
sliice, y el grado de fluorescencia del FITC, que representa la cantidad del anticuerpo de enrofloxacino. Como resultado se revelo que el anticuerpo de enrofloxacino estaba presente a una concentracion de 5,28 nmol en las superficies de las partlculas de Cy5 recubiertas con sllice.
5 <Ejemplo 1 > Experimento para o la medicion de la concentracion de enrofloxacino
[0062] Cuando se midieron 10 ng/ml de enrofloxacino con el kit para la medicion de la concentracion de
enrofloxacino preparado en el Ejemplo preparativo 1, se midieron 6,95 ng/ml de enrofloxacino.
10 <Ejemplo 2> Experimento para la medicion de la concentracion de ciprofloxacino
[0063] Cuando se midieron 10 ng/ml de ciprofloxacino con el kit para la medicion de la concentracion de
ciprofloxacino preparado en el Ejemplo preparativo 2, se midieron 7,34 ng/ml de ciprofloxacino.
15 <Ejemplo comparativo 1>
[0064] Cuando se midieron 10 ng/ml de enrofloxacino con el kit para la medicion de la concentracion de enrofloxacino mediante el uso de un ELISA, se midieron 2,17 ng/ml de enrofloxacino.
20 <Ejemplo comparativo 2>
[0065] Cuando se midieron 10 ng/ml de ciprofloxacino con el kit para la medicion de la concentracion de ciprofloxacino mediante el uso de un ELISA, se midieron 2,94 ng/ml de ciprofloxacino.
25 [0066] Segun los ejemplos de realizaciones de la presente invencion, el procedimiento y el kit para la
medicion de la concentracion de un antibiotico tienen los siguientes efectos.
[0067] Esto es, puede medirse la concentracion del antibiotico rapidamente con procesos simples y baratos.
30 [0068] Tambien puede medirse la concentracion exacta del antibiotico, que esta presente en una cantidad
extremadamente baja.
[0069] Los efectos segun la presente invencion no estan limitados por la descripcion detallada ilustrada anteriormente, y en esta memoria descriptiva esta incluida una amplia variedad efectos.
35
[0070] Mientras que se han descrito con detalle los ejemplos de realizaciones de la presente invencion y sus ventajas, deberla entenderse que en el presente documento pueden realizarse diversos cambios, sustituciones y alteraciones sin desviarse del ambito de la invencion.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la medicion de la concentration de un antibiotico, que comprende:
    5 la preparation de partlculas magneticas unidas a un antibiotico;
    la preparacion de partlculas fluorescentes recubiertas con sllice a las que se ha unido al menos un anticuerpo del antibiotico;
    dejar que las partlculas magneticas reaccionen con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice; e la irradiation de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, que han reaccionado con las partlculas 10 magneticas, con haces de laser.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el antibiotico es al menos un antibiotico seleccionado del grupo que consiste en enrofloxacino, ciprofloxacino, salinomicina y sulfatiazol.
    15 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la preparacion de las partlculas magneticas unidas al
    antibiotico comprende:
    la union de un grupo amino a las superficies de las partlculas magneticas; y
    la formation de un enlace amida entre las partlculas magneticas con el grupo amino unido, y el antibiotico.
    20
  3. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, que comprende adicionalmente:
    la adicion de un agente de reticulation despues de la union del grupo amino a las superficies de las partlculas magneticas.
    25
  4. 5. El procedimiento de la reivindicacion 3, que comprende adicionalmente:
    la recoleccion de las partlculas magneticas que forman el enlace amida con el antibiotico mediante el uso de un iman despues de la formacion del enlace amida entre las partlculas magneticas con el grupo amino unido y el 30 antibiotico.
  5. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la preparacion de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice comprende:
    35 la formacion de partlculas fluorescentes recubiertas con sllice mediante el recubrimiento de partlculas fluorescentes que incluyen un primer material fluorescente con sllice; y
    la union de al menos un anticuerpo del antibiotico a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice.
  6. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que el primer material fluorescente es al menos un 40 material fluorescente seleccionado del grupo que consiste en isotiocianato de fluorescelna y cianina.
  7. 8. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que la union del anticuerpo del antibiotico a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice comprende:
    45 la union de un grupo carboxllico a las superficies de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice; y
    la formacion de un enlace amida entre las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice con el grupo carboxllico unido y el anticuerpo del antibiotico.
  8. 9. El procedimiento de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente:
    50
    la adicion de un agente de reticulacion despues de la union del grupo carboxllico a las superficies de las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice.
  9. 10. El procedimiento de la reivindicacion 6, que comprende adicionalmente:
    55
    la medicion de la cantidad del anticuerpo del antibiotico unido a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice despues de la union del uno o mas anticuerpos del antibiotico a las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice.
  10. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la medicion de la cantidad de anticuerpo del
    antibiotico unido a las partlcuias fluorescentes recubiertas con sliice comprende:
    la mezcla de un segundo material fluorescente al que se han unido anticuerpos secundarios especlficos del anticuerpo del antibiotico con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice; y 5 la medicion del primer material fluorescente y del segundo material fluorescente mediante el uso de rayos de luz con diferentes longitudes de onda.
  11. 12. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente:
    10 la recoleccion de las partlculas magneticas, que han reaccionado con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice, mediante el uso de un iman despues de la reaccion de las partlculas magneticas con las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice.
  12. 13. Un kit para la medicion de la concentracion de un antibiotico, que comprende:
    15
    una primera unidad de medicion que comprende partlculas magneticas a las que se ha unido un grupo funcional capaz de unirse a un antibiotico; y
    una segunda unidad de medicion que comprende partlculas fluorescentes recubiertas con sllice a las que se ha unido un anticuerpo del antibiotico.
    20
  13. 14. El kit de la reivindicacion 13, en el que el grupo funcional es un grupo amino.
  14. 15. El kit de la reivindicacion 13, en el que el antibiotico es al menos un antibiotico seleccionado del grupo que consiste en enrofloxacino, ciprofloxacino, salinomicina y sulfatiazol.
    25
  15. 16. El kit de la reivindicacion 13, en el que las partlculas fluorescentes recubiertas con sllice son al menos un material fluorescente seleccionado del grupo que consiste en isotiocianato de fluorescelna y cianina.
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