ES2610703T3

ES2610703T3 - Administración dirigida de fármacos, ácidos nucleicos terapéuticos y ácidos nucleicos funcionales a células mamíferas mediante células bacterianas muertas intactas

Info

Publication number: ES2610703T3
Application number: ES13191266.9T
Authority: ES
Inventors: Himanshu Brahmbhatt; Jennifer Macdiarmid
Original assignee: EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd
Current assignee: EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2027-06-20
Also published as: AU2007278899A2; AU2007278899A8; US20180250413A1; US11357860B2; HK1129845A1; AU2007278899B2; US9878043B2; EP2712618A1; CA2658058C; EP2040725A2; US20080038296A1; PT2712618T; US11147883B2; CN101505768B; SI2040725T1; WO2008012695A3; DK2040725T3; AU2007278899A1; HUE033007T2; CN101505768A

Abstract

Una composición para uso en el tratamiento de una enfermedad, en donde la composición comprende: (a) una pluralidad de células bacterianas muertas, en donde cada célula bacteriana muerta de dicha pluralidad posee una pared celular y/o una membrana celular intacta, que contiene material genético que es endógeno a las especies bacterianas, y que abarca (i) un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto, tal como un péptido, polipéptido o proteína, cuya producción se desea en una célula diana, (ii) un fármaco que es una sustancia fisiológica o farmacéuticamente activa que produce un efecto local o sistémico deseado en mamíferos y seres humanos o (iii) una molécula de ácido nucleico funcional que, tras la introducción en una célula hospedante, interfiere específicamente con la expresión de una proteína, (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable para ello, y (c) un ligando biespecífico unido a cada célula bacteriana muerta intacta.

Description

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DESCRIPCION

Administracion dirigida de farmacos, acidos nucleicos terapeuticos y acidos nucleicos funcionales a celulas mai^eras mediante celulas bacterianas muertas intactas

Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de administracion dirigida, mediante celulas bacterianas muertas intactas, de moleculas bioactivas, incluidos acidos nucleicos terapeuticos, acidos nucleicos funcionales, farmacos, peptidos, protemas, carbohidratos y lfpidos, a celulas hospedantes mairnferas.

Una serie de obstaculos siguen siendo un reto para la administracion dirigida de moleculas bioactivas a celulas marnfferas (p. ej., celulas cancerosas), particularmente in vivo. Esos obstaculos incluyen (a) composicion, caractensticas funcionales y estabilidad de los vedculos de administracion, (b) empaquetado de concentraciones terapeuticamente significativas de moleculas bioactivas, (c) dirigir las celulas patologicas deseadas in vivo, (d) superar una serie de barreras intracelulares y administrar exitosamente concentraciones terapeuticas de moleculas bioactivas a dianas intracelulares, (e) evitar una gama de elementos inmunes del hospedante tales como anticuerpos, complemento y macrofagos que pueden destruir un vector antes de que llegue a una diana, (f) cruzar la barrera endotelial de las paredes de los vasos, particularmente en el sitio de una masa tumoral, (g) migrar a traves de varias capas de celulas para llegar a una diana (p. ej., se sabe que un tumor solido es una estructura organizada que contiene tanto celulas tumorales como celulas normales; en consecuencia un vector debe atravesar varias capas de celulas normales para acceder a las celulas malignas), (h) migrar a traves de una matriz extracelular (ECM) comprendida por glucoprotemas, glucosaminoglucanos sulfatados, hialuronano, proteoglucanos y colageno que rellena el espacio entre las celulas y en consecuencia obstaculiza el transporte de un vector, y (i) abordar la hipertension intersticial (presion hidrostatica elevada fuera de los vasos sangumeos) en el microentorno del tumor, que puede limitar el acceso de moleculas bioactivas.

Se ha propuesto una serie de distintos vectores para administracion de acidos nucleicos y de farmacos, incluidos vectores vmcos, no vmcos y no vivos y vmcos no vivos. Los vectores no vmcos y no vivos se han adaptado para administracion de acidos nucleicos y de farmacos. Los otros dos tipos de vectores se han adaptado para administracion de acidos nucleicos. Los vectores vivos no vmcos se estan desarrollando principalmente para funciones de inactivacion de celulas tumorales. Si bien todos estos vectores poseen ventajas, tambien poseen desventajas.

Se han desarrollado vectores vmcos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus de la varicela, virus de herpes simples y lentivirus, para administracion de genes. No obstante, los vectores vmcos son incapaces de administrar genes sistemica y espedficamente a celulas tumorales primarias y/o con metastasis sin infectar a los tejidos normales (Akporiaye y Hersh, 1999; Biederer et al., 2002; Green y Seymour, 2002). Ademas, la capacidad de difusion extremadamente limitada de los viriones dentro de los espacios extracelulares obstaculiza significativamente la diseminacion de vectores vmcos. Asimismo, los virus son antigenicos, y por lo tanto dan origen a respuestas inmunes del hospedante. Dichas respuestas inmunes incluyen tanto respuestas adaptativas espedficas como respuestas innatas no espedficas (Chen et al., 2003; Ferrari et al., 2003; Wakimoto et al., 2003). Estas ultimas cumplen una funcion importante en la eliminacion de vectores adenovmcos (Liu y Muruve, 2003) y HSV (Wakimoto et al., 2003).

Los vectores no vmcos, no vivos se ejemplifican mediante polfmeros cationicos (poliplejos), lfpidos cationicos (liposomas, lipoplejos) y nanopadculas sinteticas (nanoplejos). Son mas versatiles que los vectores vmcos y ofrecen varias ventajas distintivas debido a que su composicion molecular puede ser controlada; dado que la elaboracion y el analisis de dichos vectores es bastante simple, pueden alojar una amplia gama de tamanos de transgenes (Kreiss et al., 1999; de Jong et al., 2001) y son menos inmunogenicos (Whitmore et al., 1999, 2001; Dow et al., 1999; Ruiz et al., 2001). La eficiencia de la administracion de genes con vectores no vmcos, no vivos es significativamente menor, no obstante que con los vectores vmcos. Se necesitan por lo menos 106 copias de plasmidos para transfectar una sola celula, con aproximadamente 102-104 copias realmente conformando el nucleo para expresion transgenica (Feigner y Ringold, 1989; James y Giorgio, 2000; Tachibana et al., 2002). Esta eficiencia es atribuible a la incapacidad de los vectores no vmcos, no vivos de superar los enormes desaffos enfrentados entre un sitio de administracion y localizacion en el nucleo de celulas diana incluidos, (a) la estabilidad ffsico-qdmica de ADN y su vedculo de administracion en el espacio extracelular, (b) captacion celular por endocitosis, (c) escape de los compartimientos endosomicos antes de circular hacia los lisosomas y transporte citosolico, y (d) localizacion nuclear del plasmido para transcripcion. Ademas de estos obstaculos ffsico-qdmicos, existen barreras biologicas, tales como respuestas inmunogenicas al vector propiamente dicho y la estimulacion inmune por ciertas secuencias de ADN que contienen un motivo CpG central no metilado (Yew et al., 1999; Scheule, 2000; Ruiz et al., 2001).

Como una alternativa a vedculos de administracion de acidos nucleicos no vivos/farmacos, tambien se han desarrollado los vectores bacterianos para terapia dirigida a tumores (Pawalek et al., 2003; Soghomonyan et al., 2005). Estos vectores no portan una carga de acidos nucleicos o farmacos, pero preferencialmente se acumulan en celulas tumorales, se replican de forma intracelular y destruyen las celulas infectadas (Pawelek et al., 1997). Se cree que este fenomeno es facilitado por un sistema bacteriano complejo para introducir las protemas bacterianas

directamente en las celulas mai^eras, lo que puede resultar en la induccion de apoptosis (Chen et al., 1996; Monack et al, 1996; Zhou et al, 2000). Actualmente, Bifidobacterium (Yazawa et al., 2000; 2001; Li et al., 2003), Clostridium (Minton et al., 1995; Fox et al., 1996; Lemmon et al., 1997; Theys et al., 2001; Dang et al., 2001; Nuyts et al., 2002a; 2002b; Liu et al., 2002) Salmonella (Pawelek et al., 1997; Low et al., 1999; Platt et al., 2000; Luo et al., 5 2001; Rosenberg et al., 2002) y Vibrio (Yu et al., 2004) se encuentran bajo investigacion como vectores bacterianos

vivos selectivos de tumores.

Las bacterias atenuadas vivas tambien se han explorado como vehmulos para administrar acidos nucleicos (Paglia et al., 2000; Weiss y Chakraborty 2001; Yuhua et al., 2001), que pueden codificar inhibidores angiogenicos (Lee et al., 2005a; 2005b;

10 Li et al, 2003), enzimas convertidoras de profarmacos (King et al., 2002) o citocinas (Yamada et al., 2000). Las desventajas importantes de este enfoque incluyen (a) las bacterias recombinantes vivas gradualmente pierden el ADN plasmfdico in vivo, principalmente debido a la ausencia de presion de seleccion y segregacion de plasmidos asociada, (b) las bacterias que portan ADN plasmfdico tienden a tener un mdice de crecimiento inferior y parecen acumularse a niveles inferiores y residir por un periodo de tiempo mas corto dentro de los tumores que las bacterias 15 sin plasmidos, (c) los vectores bacterianos gramnegativos vivos pueden causar respuesta de endotoxinas severa en hospedantes mamfferos, posiblemente debido a la diseminacion in vivo de la endotoxina (lipopolisacarido; LPS), y evocan una respuesta del receptor de tipo toll debido a la invasion celular, (d) la mayona de las bacterias vivas dirigidas al tumor se acumulan y crecen en los focos necroticos y relativamente hipoxicos dentro de los tumores, pero no en tumores bien oxigenados en el reborde de los nodulos crecientes en donde las celulas tumorales son 20 normalmente mas agresivas, (e) el riesgo asociado con la posible reversion a un fenotipo virulento de estas bacterias es de gran preocupacion (Dunham, 2002), y (f) el riesgo de infectar las celulas normales puede conducir a bacteremia y choque septicemico asociado. Esto ultimo puede ser particularmente un problema en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes con cancer terminal.

Dado que los problemas siguen obstaculizando el exito de los agentes terapeuticos contra el cancer en particular, 25 existe una necesidad urgente de estrategias de administracion dirigida que administren selectivamente agentes bioactivos a celulas tumorales y organos diana, o que protejan a los tejidos normales de los agentes antineoplasicos administrados. Dichas estrategias debenan mejorar la eficacia del tratamiento, aumentando los indices terapeuticos de los agentes antineoplasicos, y a la vez minimizando los riesgos de la toxicidad relacionada con la terapia.

La presente invencion describe un vehmulo de administracion versatil para mejora de farmacos, estrategias de 30 administracion de acidos nucleicos y acidos nucleicos funcionales, especialmente, aunque sin limitarse a ello, en el contexto de quimioterapia contra el cancer.

Compendio de la invencion

Para abordar estas y otras necesidades, la presente invencion da a conocer, en un aspecto, una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad, en donde la composicion comprende:

35 (a) una pluralidad de celulas bacterianas muertas intactas, en donde cada celula bacteriana muerta de dicha

pluralidad posee una pared celular intacta y/o una membrana celular, que contiene material genetico que es endogeno a las especies bacterianas y que comprende (i) un acido nucleico terapeutico que codifica un producto, tal como un peptido, polipeptido o protema, en donde dicha produccion se desea en una celula diana, (ii) un farmaco que es una sustancia fisiologicamente o farmaceuticamente activa que produce un efecto local o sistemico deseado 40 en mairnferos y seres humanos o (iii) una molecula de acido nucleico funcional que, tras la introduccion en una celula hospedante, interfiere espedficamente con la expresion de una protema,

(b) un vehmulo farmaceuticamente aceptable para ello, y

(c) un ligando biespedfico unido a cada celula bacteriana muerta intacta.

Como se indica, las celulas bacterianas muertas contienen un acido nucleico terapeutico, un farmaco o un acido 45 nucleico funcional. Con respecto a esto ultimo, en una realizacion el acido nucleico funcional esta libre de plasmido. En este sentido, los acidos nucleicos funcionales se empaquetan directamente en las celulas bacterianas muertas atravesando la membrana intacta de las celulas bacterianas, sin usar constructos de expresion basados en plasmidos, ni la maquinaria de expresion de una celula hospedante. Dichos acidos nucleicos funcionales libres de plasmidos se ejemplifican mediante ADN o ARN mono, bi o multicatenario. En una realizacion, las celulas 50 bacterianas muertas contienen acido nucleico funcional libre de plasmido que es ARN regulador. En una realizacion preferida, la composicion esta esencialmente libre de endotoxina. Se describen tambien ligandos biespedficos utiles para dirigir celulas bacterianas muertas hacia celulas hospedantes mamfferas. El ligando biespedfico puede ser un polipeptido, carbohidrato o glucopeptido, y puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En realizaciones preferidas, el ligando biespedfico tiene una primera rama que porta especificidad hacia una estructura 55 superficial bacteriana y una segunda rama que porta especificidad hacia una estructura superficial de celulas mamfferas. Asimismo, la primera rama y la segunda rama del ligando biespedfico pueden ser monoespedficas o multivalentes.

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Una estructura superficial bacteriana deseable para la union al ligando es un componente O-polisacarido de un lipopolisacarido (LPS). Las estructuras superficiales de las celulas mairnferas deseables para union al ligando son receptores, preferiblemente aquellos capaces de activar la endocitosis mediada por el receptor.

De acuerdo con otro aspecto, se describe un metodo de administracion, que comprende poner una pluralidad de celulas bacterianas muertas en contacto con celulas mamfferas que son fagocitosis o endocitosis-competentes, de modo tal que las celulas bacterianas muertas son fagocitadas por las celulas mamfferas y liberan su intracelularidad de carga. La carga puede comprender un acido nucleico terapeutico, un acido nucleico funcional o un farmaco.

En una realizacion descrita en este documento, un metodo para administrar un acido nucleico funcional comprende (a) proveer una pluralidad de celulas bacterianas muertas en un veldculo farmaceutico, en donde cada celula bacteriana muerta de la pluralidad comprende (i) un acido nucleico funcional o (ii) un plasmido compuesto por un segmento que codifica un acido nucleico funcional y luego (b) poner en contacto dichas celulas bacterianas muertas de la pluralidad con celulas mamfferas diana, de modo tal que dichas celulas mamfferas fagociten a dicha celula bacteriana muerta, mediante lo cual dicho acido nucleico funcional es liberado al citoplasma de la celula diana. En un aspecto, las celulas bacterianas muertas estan libres de plasmidos, mientras que en otro, el acido nucleico funcional es ARN regulador.

De acuerdo con otro aspecto, se describe un metodo de administracion dirigida que comprende poner en contacto ligandos biespedficos con (i) celulas bacterianas muertas intactas que contienen una carga deseada y (ii) celulas mamfferas, preferiblemente celulas mamfferas no fagodticas. Los ligandos biespedficos tienen especificidad hacia un componente superficial en las celulas bacterianas muertas intactas y un componente superficial en las celulas mamfferas, tal como un receptor. En consecuencia, los ligandos causan que la celula bacteriana muerta se una a las celulas mamfferas, que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas y que la carga contenida en las celulas bacterianas muertas sea liberada en el citoplasma de la celula mam^era.

La carga puede comprender un acido nucleico terapeutico, un acido nucleico funcional o un farmaco.

Incluso en otro aspecto, se describe un metodo para superar la resistencia a los farmacos o la resistencia a apoptosis y tratar un tumor maligno en un sujeto, administrando un acido nucleico funcional a una celula diana. El metodo comprende poner en contacto una celula bacteriana muerta que contiene (i) una molecula de acido nucleico funcional o (ii) un plasmido comprendido por un segmento que codifica una molecula de acido nucleico funcional con una celula mam^era diana. La celula mamffera fagocita a la celula bacteriana muerta. El acido nucleico funcional es liberado en el citoplasma, transportado al nucleo y expresado por la celula diana.

En relacion con la presente invencion, el contacto entre las celulas bacterianas muertas y las celulas mamfferas puede ser in vitro o in vivo.

Tambien se describen metodos para cargar celulas bacterianas muertas con un farmaco. Dicho metodo implica crear un gradiente de concentracion del farmaco entre un medio extracelular que contiene las celulas bacterianas muertas y el citoplasma de las celulas bacterianas. El farmaco naturalmente reduce este gradiente de concentracion, hacia el citoplasma de la celula bacteriana muerta. La fuga del farmaco del citoplasma bacteriano se previene debido a que las celulas bacterianas son metabolicamente inactivas.

Otro metodo para cargar celulas bacterianas muertas con un farmaco implica cultivar una celula bacteriana bajo condiciones tales que la celula bacteriana transcribe y traduce un acido nucleico terapeutico que codifica el farmaco, de modo tal que el farmaco sea liberado en el citoplasma de la celula bacteriana, y luego inactivar la celula bacteriana para formar una o mas celulas bacterianas muertas que contienen el farmaco en su citoplasma.

De acuerdo con otro aspecto, la presente memoria contempla un metodo para formular una celula bacteriana muerta con un acido nucleico funcional libre de plasmido. El metodo comprende co-incubar una pluralidad de celulas bacterianas muertas con un acido nucleico funcional, tal como ARN regulador como siRNA, miRNA o shRNA, en un tampon. En algunas realizaciones, la co-incubacion puede implicar agitacion moderada mientras que en otras la co- incubacion es estatica. En algunos aspectos, la co-incubacion dura aproximadamente media hora, mientras que en otros, dura aproximadamente una hora. En una realizacion, el tampon comprende disolucion salina tamponada, por ejemplo, una disolucion de tampon de fosfato 1X. En otra realizacion, la co-incubacion se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C, aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C, aproximadamente 25°C o aproximadamente 37°C. La co-incubacion puede comprender aproximadamente 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 o 1013 celulas bacterianas muertas.

La presente memoria contempla el uso de celulas bacterianas muertas intactas y ligandos biespedficos en la preparacion de un medicamento, para uso en un metodo para tratar una enfermedad o modificar un rasgo por administracion del medicamento a una celula, tejido u organo. En el medicamento, las celulas bacterianas muertas contienen una molecula de acido nucleico terapeutica, un farmaco o una molecula de acido nucleico funcional, y, opcionalmente, ligandos biespedficos que son capaces de unirse a las celulas bacterianas muertas y dirigir celulas mamfferas no fagodticas. Dichos medicamentos son utiles para tratar diversas afecciones y enfermedades aumentando la expresion o funcion de una protema deseada, o inhibiendo la expresion o funcion de una protema diana. Ilustrativos de dichas afecciones y enfermedades son un cancer y una enfermedad adquirida, tal como sida,

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neumoma, enfisema y tuberculosis. Alternativamente, el tratamiento puede afectar un rasgo, tal como la fertilidad, o una respuesta immune asociada con un alergeno o un agente infeccioso.

Se describe tambien un metodo farmaceuticamente aceptable para purificar celulas bacterianas muertas intactas. El metodo combina (i) inactivar celulas bacterianas vivas con antibioticos, (ii) filtracion de flujo cruzado y/o filtracion en lmea (dead-end), para eliminar sedimentos celulares libres de endotoxinas, acidos nucleicos libres, ampollas de la membrana bacteriana, contaminante del medio y (iii) secuestracion basada en anticuerpos, para eliminar la endotoxina libre residual.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra efectos antitumorales altamente significativos mediante celulas bacterianas muertas intactas empaquetadas con farmacos quimioterapeuticos dirigidos a anticuerpos biespedficos. El xenoinjerto de cancer de mama humano (MDA-MB-468) se establecio subcutaneamente (entre los omoplatos) en ratones Balb/c nu/nu y cuando se alcanzaron volumenes del tumor de ~70 mm3, los ratones se trataron (n= 11 ratones por grupo) por via intravenosa (i.v.) con doxorrubicina libre (G2) o celulas S. Typhimurium muertas intactas no dirigidas empaquetadas con dox (G3), o con celulas bacterianas S. Typhimurium muertas intactas dirigidas por EGFR empaquetadas con dox (G4). Los ratones G1 eran controles y recibieron disolucion fisiologica esteril (i.v.). Los tratamientos se administraron en los dfas marcados por un triangulo en el eje x y se midio el volumen del tumor como se muestra en el eje y. El resultado demostro un efecto antitumoral altamente significativo cuando se uso S. typhimuriumDox muerta con E FR (G4) como un tratamiento, mientras que los ratones G2 y G3 no demostraron efectos antitumorales. Se expone la desviacion estandar para cada medicion.

La Figura 2 muestra graficamente que las celulas bacterianas muertas intactas empaquetadas con paclitaxel o siRNA inhiben el crecimiento de tumores de celulas de cancer de colon humano (HCT116) in vivo.

La Figura 3 muestra la reversion de la resistencia a los farmacos en ratones que portan xenoinjertos de cancer de colon humano (Caco-2), usando un protocolo de tratamiento dual, en donde el primer tratamiento comprende S. typhimurium muerta empaquetada con EGFR que porta anti-MDR-1 shRNA y el segundo tratamiento comprende S. typhimurium empaquetada con EGFR muerta que porta o bien Irinotecan o 5-fluorouracil (5-FU). El primer tratamiento y el segundo tratamiento se exponen con un triangulo y una flecha, respectivamente, debajo del eje x.

Descripcion detallada

Los presentes inventores han determinado que las celulas bacterianas intactas son vehfculos eficaces para la administracion dirigida de acidos nucleicos terapeuticos, acidos nucleicos funcionales y farmacos a las celulas enfermas, particularmente celulas cancerosas, tanto in vitro como in vivo. Una serie de descubrimientos sorprendentes fundamentan esa determinacion.

Por ejemplo, los inventores descubrieron que cuando las composiciones comprenden (a) celulas bacterianas muertas intactas que contienen una carga de acido nucleico terapeutico, farmaco o acido nucleico funcional (b) ligandos de direccionamiento biespedficos, y (c) un vehfculo farmaceuticamente aceptable en contacto con celulas enfermas in vitro o in vivo, los velmculos celulares bacterianos inactivados intactos se someten a endocitosis con gran eficiencia en las celulas mairnferas no fagodticas diana. Este descubrimiento fue sorprendente porque si bien los ligandos biespedficos se han usado para dirigir vetnculos de administracion vmcos y no vmcos a celulas mamfferas no fagodticas (Wickham et al., 1996; Nettelbeck et al, 2001; Boucher et al, 2003; Ogris & Wagner, 2002), se cree que la endocitosis mediada por el receptor no funcionana para partfculas tan grandes como las celulas bacterianas.

Por ejemplo, los vectores adenovmcos han sido redirigidos a los receptores de la superficie celular mamffera diana, tales como endoglina en celulas endoteliales, e internalizados mediante vesfculas recubiertas de clatrina en la membrana plasmatica de las celulas mamfferas. Wickham et al., 1996; Nettelbeck et al, 2001; Boucher et al, 2003. Las vesfculas recubiertas de clatrina se asemejan a una taza que fagocita el vector, pero se entiende que el tamano de la taza tiene un factor limitativo. Las vesfculas recubiertas de clatrina tienen un tamano limitado de 85-110 nm, debido al tamano del recubrimiento de clatrina. Swanson y Watts, 1995. Las celulas bacterianas, en contraste, tienen por lo menos 400 nm de diametro y 1.000 nm de largo. En consecuencia, no se esperaba que dicho planteamiento de direccionamiento funcionara en celulas bacterianas muertas.

El conocimiento con respecto a otros grandes vectores respaldo la expectativa de que las celulas bacterianas muertas no senan internalizadas a traves de vesfculas recubiertas de clatrina. Por ejemplo, grandes lipoplejos (vectores no vmcos de hasta 500 nm) preferencialmente ingresanan en las celulas mediante endocitosis independiente de receptores y de clatrina, mientras que los lipoplejos mas pequenos (menos de 200 nm) se pueden internalizar mediante un procedimiento dependiente de clatrina no espedfico. Simoes et al, 1999. Asimismo, grandes virus, tales como el virus de la variolovacuna, en el orden de 350 nm x 250 nm de tamano, no infectan las celulas mamfferas mediante una ruta recubierta con clatrina. Essani y Dales, 1979.

De modo similar, las celulas mamfferas no fagodticas no pueden fagocitar grandes patogenos, como las celulas bacterianas. Solamente los fagocitos profesionales como los macrofagos fagocitan a dichos patogenos, y el proceso

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de fagocitosis es independiente de clatrina y de receptores, lograndose mediante fagocitosis. La interaccion de grandes patogenos con la superficie celular induce una cascada de senalizacion, que conduce a reordenamientos de actina en la membrana plasmatica para formar una gran taza fagocftica, que fagocita a la bacteria. Dramsi y Cossart, 1998. Las cascadas de senalizacion que son responsables, en la entrada bacteriana, para reordenamientos que se activa en la membrana plasmatica, no se entienden bien. Galan, 1996; Menard et al., 1996; Finlay y Cossart, 1997; Dramsi y Cossart, 1998.

Las investigaciones espedficas del efecto del tamano de partmula sobre la endocitosis mediada por receptores demuestran que el proceso es fuertemente dependiente del tamano. Por ejemplo, Aoyama et al., 2003, estudiaron el efecto del tamano de partfcula sobre la administracion de genes glucovfticos y concluyeron que el tamano de partmula optimo para la endocitosis mediada por receptores es ~25 nm. Veanse tambien Nakai et al, 2003; Osaki et al., 2004. Gao et al., 2005, confirmaron esa conclusion.

Asimismo, aunque se describe que los ligandos espedficos se han usado para redirigir vectores vfticos, el metodo no siempre ha sido exitoso en el contexto de la administracion de genes. En el intento de redirigir virus de sus receptores naturales a receptores alternativos, se ha demostrado que la union a la superficie celular es insuficiente para el ingreso vftico sostenido y la expresion genica. Ademas, cuando se modificaron las protemas de fagocitacion del virus para redireccionamiento, exhibieron baja actividad de fusion, que resulto en la entrada vftica ineficiente en las celulas. Zhao et al., 1999. En ausencia de estrategias de direccionamiento espedfico, las estrategias han dependido de la inyeccion directa a un sitio localizado. Akporiaye y Hersh, 1999.

Por lo tanto, la tecnica sugirio que los ligando biespedficos no permitinan que los vehftculos celulares bacterianos inactivados ingresaran en celulas mamfferas no fagocfticas. Para respaldar incluso mas este punto, los inventores descubrieron que las celulas bacterianas muertas no dirigidas son incapaces de adherirse espedficamente y administrar una carga a celulas mamferas no fagocfticas, incluso despues de repetidos intentos con periodos de incubacion prolongada en un numero de lmeas de celulas mamfferas. En particular, las celulas bacterianas muertas no dirigidas no son internalizadas por las celulas mamfferas no fagocfticas. En contraste, las celulas bacterianas muertas son facilmente fagocitadas por fagocitos profesionales como los macrofagos. Esto corrobora los hallazgos precoces de que las micropartfculas hasta 12 pm son fagocitadas por fagocitos profesionales (Kanke et al., 1983) y de que la absorcion maxima de microparticulas en macrofagos ocurre con partfculas de < 2 pm (Tabata y Ikada, 1988; 1990). A diferencia de los vectores vmcos que se adhieren especialmente a los receptores vmcos y desencadenan su internalizacion, por lo tanto, las celulas bacterianas muertas no tienen mecanismo similar de invadir celulas mairnferas no fagocfticas ingresantes.

En contra de estos antecedentes, los inventores tambien descubrieron que los ligandos biespedficos pueden dirigir la endocitosis de celulas bacterianas muertas intactas dentro de celulas mamfferas no fagocfticas. Los datos preliminares sugieren que la internalizacion de celulas bacterianas puede ocurrir mediante la ruta dependiente de los receptores y de la macropinocitosis, aunque los solicitantes no estan influenciados por dicha teona.

Los inventores descubrieron tambien que despues de la endocitosis, las bacterias muertas se degradan completamente en vacuolas intracelulares, presumiblemente compartimientos endo-lisosomicos. Esto fue sorprendente porque se crefa que los mecanismos de degradacion rigurosos que son capaces de degradar grandes partfculas biologicas como las celulas bacterianas y parasitarias operaban solamente en fagocitos profesionales, como los macrofagos. Se crefa que esos mecanismos permitfan el procesamiento y la presentacion completa de antfgenos por fagocitos profesionales. Dado que la mayona de las celulas no fagocfticas no procesan ni presentan antfgenos, se crefa que conteman solamente sistemas de procesamiento de antfgenos leves que se utilizaban principalmente para reciclar componentes celulares.

Despues de ser internalizados por endocitosis mediada por receptores, los vectores son cercados por membranas endosomicas o lisosomicas, y por lo tanto se separan del citoplasma. Esto constituye un impedimento importante para la administracion de carga, especialmente debido a que los compartimientos endosomicos y lisosomicos pueden volverse altamente causticos y degradar mas de 99% de una carga, tal como los acidos nucleicos en un vector. Los vectores de administracion genica exitosos tienen mecanismos que permiten que los acidos nucleicos ingresen en el citoplasma, pero los expertos no esperanan que las minicelulas tuvieran dichos mecanismos.

Los virus, por ejemplo, han desarrollado procesos sofisticados para ingresar en el citoplasma de las celulas mamfteras. Los retrovirus fagocitados, tales como VIH-1, adquieren acceso al citoplasma por fusion directa con la membrana plasmatica. Stein et al., 1987. Los virus no fagocitados utilizan diversas estrategias para penetran en la membrana endosomica despues de la endocitosis. Por ejemplo, los virus de la gripe incluyen la fusion de las membranas endosomicas y vfticas, que es desencadenada por el entorno acido del endosoma. Marsh y Helenius, 1989. A pH bajo, la glucoprotema hemaglutinina (HA) de la fagocitacion del virus de la gripe predominante se somete a cambios de conformacion, conduciendo a la prominencia de un pico hidrofobo hacia la membrana endosomica que inicia la fusion de la membrana. Bullough et al., 1994. Se cree que los adenovirus escapan hacia el citosol mediante un mecanismo ligado a la acidificacion del endosoma. El pH bajo tiene varios efectos sobre la capsida adenovftica. Por ejemplo, la protema penton de la capsida se somete a cambios de conformacion que exponen las regiones hidrofobas para interaccion de las membranas endosomicas. Seth et al., 1985. Ademas, la

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actividad de proteasa intrmseca de la capsida adenovftica tambien parece contribuir al escape endosomico. Greber et al., 1996.

Para vectores liposomicos, la barrera de la membrana endosomica sigue limitando la eficiencia de la administracion del gen. Se entiende que la liberacion exitosa de acidos nucleicos liposomicos resulta de la ruptura de la membrana del endo-lisosoma. Xu & Szoka, 1996; El Ouahabi et al., 1997; Zelphati & Szoka, 1996a; Wattiaux et al, 2000. Se cree que la ruptura de la membrana endo-lisosomica ocurre mediante un movimiento transbicapa flip-flop de ftpidos, lo que lleva a la desestabilizacion y penetracion de la membrana de ADN desnudo en el citoplasma. Zelphati y Szoka, 1996a; 1996b; Mui et al., 2000. Los estudios tambien han demostrado que la liberacion citoplasmica de contenidos liposomicos implica (a) neutralizacion de la carga de un agente cationico de formacion de complejo con macromoleculas anionicas tales como ftpidos anionicos y proteoglicanos, (b) la fusion mediada por ftpidos cationicos, y (c) la desestabilizacion de la membrana por ftpidos sensibles al pH. Wrobel & Collins, 1995; Meyer et al., 1997; Clark & Hersh, 1999. Estudios adicionales han demostrado que una mezcla de ftpido neutro (DOPE) con ftpido cationico facilita la ruptura e incrementa la cantidad de contenidos liposomicos en el citoplasma, ya que DOPE promueve la fusion de partmulas de liposomas con membranas endosomicas. Farhood et al., 1995; Fasbender et al., 1997; Hafez et al., 2001. Ademas, se han utilizado los dendnmeros cationicos de PEI y poliamina para facilitar la ruptura de la membrana endolisosomica, ya que tienen una amplia capacidad como tampones que provocan la expansion y ruptura de los endosomas. Klemm, 1998; Sonawane et al., 2003. Se puede incorporar una funcionalidad adicional a los vectores de liposomas en la forma de una protema formadora de poros endosomoftticos de monocitogenes de Listeria, listeriolisina O (LLO). Lorenzi y Lee, 2005. LLO es capaz de romper la membrana endosomica, permitiendo asf el escape de contenidos endosomicos en el citoplasma. Lee et al., 1996.

Por lo tanto, las descripciones actuales sugieren que los mecanismos sofisticados son necesarios para permitir que cierta carga del vector escape de la membrana lisosomica. La celula bacteriana muerta es una partmula no viva y no porta ninguna funcion desestabilizante de la membrana lisosomica. Los inventores descubrieron que si las celulas bacterianas muertas portan por lo menos 70 a 100 copias de ADN plasirftdico, entonces parte de este ADN puede escapar de la membrana endosomica sin la necesidad de desestabilizar ni romper la membrana endosomica. Esto sugiere que si bien la mayor parte del ADN plasirftdico es propenso a degradarse en las vacuolas endo-lisosomicas, fue posible sobrepasar el sistema y permitir asf que parte del ADN escape intacto al citoplasma de celulas mairftferas. Ademas, los inventores descubrieron que si bien no se cree que las celulas mairftferas no fagocfticas posean mecanismos de procesamiento lisosomico rigurosos que podnan degradar estructuras de multiples componentes complejas como las celulas bacterianas, esto puede no ser cierto. La perspectiva actual especifica que la degradacion intracelular de dichas estructuras complejas como las celulas bacterianas esta limitada a las celulas fagocfticas profesionales que son capaces de procesamiento y presentacion de antfgenos completa.

En un aspecto relacionado, los inventores descubrieron que una concentracion importante de farmaco bioactivo portado por celulas bacterianas muertas empaquetadas con farmaco y dirigidas a un ligando biespedfico tambien escapa de la membrana endo-lisosomica e ingresa en el citoplasma de la celula mairftfera. Adicionalmente, descubrieron que las celulas bacterianas muertas son altamente versatiles en su capacidad de empaquetar una diversidad de farmacos distintos (p. ej., farmacos hidrofilos, hidrofobos y anfipaticos tales como doxorrubicina, paclitaxel, cisplatino, carboplatino, 5- fluorouracil e irinotecan) y han descubierto que todos se empaquetan facilmente en celulas bacterianas muertas en concentraciones terapeuticamente significativas.

Los inventores descubrieron tambien que cuando las celulas bacterianas muertas empaquetadas en un farmaco y dirigidas a anticuerpos (para simplicidad, tambien denominadas “terapeuticas”) se administraron por via intravenosa a ratones atfmicos que portaban xenoinjertos de tumor humano, se extravasaron de las paredes de los vasos sangumeos que rodeaban la masa tumoral e ingresaron en el microentorno del tumor.

El direccionamiento de sistemas basados en partmulas en el contexto de terapia del cancer ha explotado la vasculatura del tumor con fugas (Jain, 1998) y la carencia de un drenaje linfatico eficaz (Maeda y Matsumura, 1989; Seymour, 1992; Yuan et al., 1994), que resulta en un mejor efecto de permeabilidad y retencion (EPR) (Maeda, 2001) de las partmulas circulantes (direccionamiento pasivo). Los vasos de tumores tienen un diametro irregular, un patron de ramificacion anormal, y no encajan bien en la clasificacion usual de arteriolas, capilares o venulas. Warren, 1979; Less et al., 1991, 1997; Konerding et al., 1995. De particular importancia funcional, los vasos de tumores tienen fugas inusuales. Peterson y Appelgren, 1977; Gerlowski y Jain, 1986; Jain, 1987, 1997; Dvorak et al., 1988. La hiperpermeabilidad de los microvasos de tumores a las grandes moleculas se ha observado en numerosos estudios. Gerlowski y Jain, 1986; Jain, 1987; Jain 1996. No obstante, el ftmite de tamano superior para agentes que pueden atravesar los vasos de distintos tumores y como se regula no se entiende bien. Un estudio midio el tamano umbral del poro de un carcinoma de colon humano desarrollado subcutaneamente en ratones inmunodeficientes entre 400-600 nm. Yuan et al., 1995. Otros informaron que algunos tumores poseen un tamano umbral del poro de solamente 100 nm. Hobbs et al, (1998). Por consiguiente, fue sorprendente hallar que las celulas bacterianas muertas intactas de mas de 1.000 pm son capaces de extravasar la pared celular endotelial que rodeaba a los tumores. Este descubrimiento permite el uso de celulas bacterianas muertas intactas para terapia de tumores in vivo.

Adicionalmente, se sugirio que el microentorno del tumor anormal se caracteriza por hipertension intersticial (presion hidrostatica elevada fuera de los vasos sangumeos; Less et al, 1992; Jain, 2001) que limita el acceso de agentes terapeuticos antineoplasicos. Por ejemplo, se informo que cuando se estudiaron tumores de cancer de mama (MDA-

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MD-231) consolidados en forma ortotopica en ratones SCID despues de una inyeccion intravenosa de agente de contraste Gadolinio dietilenotriamina-penta-acetato, hubo una reduccion en el ingreso del agente de contraste al tumor. Dadiani et al., 2004. Los autores de ese informe especularon que el incremento observado en la hipertension intersticial sugiere que la alta presion intersticial fuerza el fluido a reingresar en los vasos sangumeos, incrementando asf la relacion de flujo saliente a flujo entrante. Cabe destacar que los inventores descubrieron que las celulas bacterianas muertas no son obstaculizadas por dicha hipertension intersticial, pero son capaces de lograr efectos antitumorales altamente significativos (Fig. 1).

La siguiente descripcion senala la invencion asociada con estos descubrimientos, sin limitar la descripcion de las realizaciones particulares, la metodolog^a, los protocolos o reactivos descritos. Asimismo, la terminologfa utilizada en este documento describe realizaciones particulares solamente, y no limita el alcance de la invencion. A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en esta descripcion tienen el mismo significado que utilizan comunmente los expertos en la tecnica relevante. Ademas, las formas en singular “un” “una” y “el” “la” incluyen la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La invencion se define en las reivindicaciones.

Composiciones que comprenden celulas bacterianas muertas intactas

En un aspecto, se describe una composicion que comprende celulas bacterianas muertas intactas y un vehroulo farmaceuticamente aceptable para ello. Las celulas bacterianas muertas pueden contener un acido nucleico terapeutico, un farmaco, una molecula de acido nucleico funcional o una combinacion de estos.

Celulas bacterianas muertas intactas

Las celulas bacterianas muertas son celulas procariotas no vivas de bacterias, cianobacterias, eubacterias y arqueobacterias, como se define en la segunda edicion del Manual Systematic Biology de Bergey. Dichas celulas se consideran “intactas” si poseen una pared celular y/o una membrana celular intacta y contienen material genetico (acido nucleico) que es endogeno a las especies bacterianas.

Acidos nucleicos terapeuticos y productos de expresion terapeuticos

Una molecula de acido nucleico terapeutico codifica un producto, tal como un peptido, polipeptido o protema, cuya produccion se desea en una celula diana. Por ejemplo, el material genetico de interes puede codificar una hormona, receptor, enzima o (poli) peptido de valor terapeutico. Dichos metodos pueden resultar en la expresion pasajera de ADN transferido no integrado, replicacion extracromosomica y expresion de replicones transferidos tales como episomas, o integracion de material genetico al ADN genomico de las celulas hospedantes.

La frase “moleculas de acido nucleico” y el termino “polinucleotidos” denotan formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, o bien ribonucleotidos o desoxinucleotidos. Incluyen ADN o ARN mono, bi o multicatenario, ADN genomico, ADNc, hforidos de ADN-ARN o un polfmero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleotidos naturales, qmmica o bioqmmicamente modificadas, no naturales o derivadas. El esqueleto de un polinucleotido puede comprender azucares y grupos fosfato, como es tfpico para ARN y ADN, o azucar modificado o sustituido o grupos fosfato. Alternativamente, el esqueleto del polinucleotido puede comprender un polfmero de subunidades sinteticas tales como fosforamiditas y por lo tanto puede ser un oligodesoxinucleosido fosforamidato o un oligomero de fosforamidato-fosforodiester mixto. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos, uracilo, otros azucares y grupos de union tales como fluororribosa y tioato, y ramificaciones de nucleotidos. Un polinucleotido puede ademas ser modificado, tal como por conjugacion con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones pueden incluir topes, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales con un analogo, y la introduccion de medios para conectar el polinucleotido con protemas, iones metalicos, componentes de etiquetado, otros polinucleotidos o un soporte solido.

“Polipeptido” y “protema” se utilizan de manera intercambiable en este documento para hacer referencia a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoacidos traducidos, no traducidos, qmmicamente modificados, bioqmmicamente modificados y derivados. Un polipeptido o protema puede ocurrir en forma natural, recombinante o sintetica, o en cualquiera de sus combinaciones. Asimismo, un polipeptido o protema puede comprender un fragmento de una protema o peptido natural. Un polipeptido o protema puede ser una molecula sencilla o puede ser un complejo multi-molecular. Ademas, dichos polipeptidos o protemas pueden tener esqueletos de peptidos modificados. Los terminos incluyen protemas de fusion, incluidas protemas de fusion con una secuencia de aminoacidos heterologa, fusiones con secuencias lfderes heterologas y homologas, con o sin residuos metionina N-terminales, protemas marcadas inmunologicamente y similares.

El termino “expresion” en general se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de polinucleotidos se somete a transcripcion y traduccion exitosas de modo tal que se expresan niveles detectables de la secuencia de aminoacidos o protema. En determinados contextos de este documento, expresion se refiere a la produccion de ARNm. En otros contextos, expresion se refiere a la produccion de protema.

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La transcripcion o traduccion de una molecula de acido nucleico terapeutico puede ser util para tratar el cancer o una enfermedad adquirida, tal como sida, neumoma, enfisema, o para corregir errores congenitos del metabolismo, tales como fibrosis qmstica. La transcripcion o traduccion de un acido nucleico terapeutico puede tambien afectar la esterilizacion anticonceptiva, incluida la esterilizacion anticonceptiva de animales salvajes. Los trastornos inflamatorios mediados por alergenos y mediados por agentes infecciosos tambien pueden contrarrestarse administrando, mediante la presente invencion, una molecula de acido nucleico terapeutica que, tras la expresion en un paciente, afecta la respuesta(s) inmune asociada con el alergeno y el agente infeccioso, respectivamente. Una molecula de acido nucleico terapeutica tambien puede tener un producto de expresion, o puede haber un producto de etapa posterior de modificacion post-traduccion del producto de expresion, que reduce las secuelas inmunologicas relacionadas con el trasplante o que ayuda a facilitar el crecimiento y la regeneracion del tejido.

Los terminos “cancer”, “neoplasia,” “tumor”, “malignidad” y “carcinoma”, utilizados en forma intercambiable en este documento, hacen referencia a celulas o tejidos que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una perdida significativa de control de la proliferacion celular. Los metodos y composiciones descritos por la invencion se aplican particularmente a celulas pre-cancerosas, malignas, pre-metastasicas y no metastasicas.

Una molecula de acido nucleico terapeutica puede ser la contraparte normal de un gen que expresa una protema que funciona de modo anormal o que esta presente en niveles anormales en una patologfa, como es el caso, por ejemplo, con el regulador de conductancia transmembrana en la fibrosis qmstica (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989), con p-globina en anemia de celulas falciformes, y con cualquier a-globina, 13-globina y Y-globina en talasemia. Por lo tanto, una produccion excesiva de a-globina frente a p-globina que caracteriza a la p-talasemia se puede mejorar con genoterapia, de acuerdo con la presente invencion, usando una celula bacteriana muerta intacta modificada para contener un plasmido que incorpora una secuencia que tiene una transcripcion de ARN antisentido vis-a-vis una secuencia diana del ARNm de a-globina.

En el tratamiento del cancer, una molecula de acido nucleico terapeutica adecuada para uso de acuerdo con la presente invencion podna tener una secuencia que corresponde a o deriva de un gen asociado con supresion de tumores, tal como el gen p53, el gen de retinoblastoma y el gen que codifica el factor de necrosis tumoral. Una amplia variedad de tumores solidos -- cancer, papilomas y verrugas - debenan ser tratables con este planteamiento, de conformidad con la invencion. Los tipos de cancer representativos en este sentido incluyen carcinoma de colon, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de piel, cancer de hugado, cancer de hueso, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de cerebro, cancer de cabeza y cuello, y linfoma. Los papilomas ilustrativos son papiloma de celulas escamosas, papiloma de los plexos coroideos y papiloma lanngeo. Los ejemplos de verrugas son verrugas genitales, verrugas plantares, epidermodisplasia verruciforme y verrugas malignas.

Una molecula de acido nucleico terapeutica para uso en la presente invencion tambien puede comprender un segmento de ADN que codifica una enzima que convierte un profarmaco inactivo en uno o mas metabolitos citotoxicos de modo que tras la introduccion in vivo del profarmaco, la celula diana no es forzada, tal vez con celulas aledanas, a suicidarse. Las aplicaciones preclmicas y clmicas de dicho “gen suicida”, que pueden ser de origen no humano o de origen humano, son analizadas por Spencer (2000), Shangara et al. (2000) y Yazawa et al. (2002). Son ilustrativos de genes suicidas aquellos que codifican HSV-timidina cinasa (tk), citosina desaminasa (CDA) + uracil fosfororribosil-transferasa, xantina-guanina fosfororribosil-transferasa (GPT), nitrorreductasa (NTR), purina nucleosido fosforilasa (PNP, DeoD), citocromo P450 (CYP4B1), carboxipeptidasa G2 (CPG2) y D-aminoacido oxidasa (DAAO), respectivamente. Los genes suicidas de origen humano se ejemplifican mediante genes que codifican carboxipeptidasa Al (CPA), desoxicitidina cinasa (dCK), citocromo P450 (cYp2B1,6), LNGFR/FKBP/Fas, FKBP/Caspasas y ER/p53, respectivamente.

Una terapia de genes suicidas podna aplicarse al tratamiento del sida. Esta estrategia ha sido ensayada con vectores suicidas que expresan un producto genico toxico ni bien las celulas mairnferas tratadas se infectan con VIH-1. Estos vectores usan los elementos reguladores de VIH-1, Tat y/o Rev, para inducir la expresion de un gen toxico tal como una toxina de a-difteria, citosina desaminasa o interferon-a2 despues de la infeccion con VIH-1. Veanse Curiel et al., 1993; Dinges et al., 1995; Harrison et al., 1992a; Harrison et al., 1992b; Ragheb et al., 1999.

El acido nucleico terapeutico utilizado en la invencion tfpicamente esta contenido en un plasmido dentro de la celula bacteriana muerta. El plasmido tambien puede contener un segmento de acido nucleico adicional que funciona como elemento regulador, tal como un promotor, un terminador, un potenciador o una secuencia de senal, y que esta operativamente unido al segmento de acido nucleico terapeutico. Un promotor adecuado puede ser espedfico del tejido o incluso espedfico del tumor, como lo indique el contexto terapeutico.

El acido nucleico terapeutico puede codificar un gen suicida o una contraparte normal de un gen que expresa una protema que funciona de modo anormal o esta presente en niveles anormales en la celula mamffera. Asimismo, el acido nucleico terapeutico puede estar contenido en un plasmido comprendido por multiples secuencias de aminoacidos. Ademas, el plasmido puede contener un elemento regulador y/o un elemento indicador.

El termino “gen” se refiere a una secuencia de polinucleotidos que comprende secuencias control y codificantes necesarias para la produccion de un polipeptido o precursor. El polipeptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud total o por cualquier porcion de la secuencia codificante. Un gen puede constituir una

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secuencia codificante ininterrumpida o puede incluir uno o mas intrones, unidos por las mismas uniones de empalme apropiadas. Asimismo, un gen puede contener una o mas modificaciones o bien en las regiones codificantes o en las no traducidas que podran afectar la actividad biologica o la estructura qmmica del producto de expresion, el mdice de expresion o el modo de control de la expresion. Dichas modificaciones incluyen, aunque sin limitarse a ello, mutaciones, inserciones, eliminaciones y sustituciones de uno o mas nucleotidos. En este sentido, dichos genes modificados pueden denominarse “variantes” del gen “natural”.

La expresion “celula hospedante” hace referencia a una celula que puede ser, o que ha sido, utilizada como receptora de un vector recombinante u otra transferencia de polinucleotidos, e incluye la descendencia de la celula original que ha sido transfectada. La descendencia de una sola celula puede no necesariamente ser completamente identica en morfologfa o en el complemento de ADN genomico o total a la celula madre original debido a mutacion natural, accidental o intencional.

Elementos reguladores

Una molecula de acido nucleico que se ha de introducir mediante el planteamiento de la presente invencion puede tambien tener un segmento codificante deseado unido operativamente a un elemento regulador, tal como un promotor, un terminador, un potenciador y/o una secuencia de senal. Un promotor adecuado puede ser espedfico de tejidos o incluso espedfico de tumores, segun lo dicte el contexto terapeutico.

Un promotor es “espedfico de tejidos” cuando se activa preferencialmente en un tejido determinado y, en consecuencia, es eficaz para promover la expresion en el tejido diana de una secuencia estructural operativamente unida. La categona de los promotores espedficos de tejidos incluye, por ejemplo, el promotor espedfico de hepatocitos para albumina y antitripsina a1., respectivamente; la region de control del gen de elastasa I, que es activo en celulas pancreaticas acinares; la region de control del gen de insulina, activo en celulas beta pancreaticas; la region de control del virus de tumor mamario de raton, que es activo en celulas de testmulo, mama, linfocitos y mastocitos; la region de control del gen de protema basica mielina, activo en oligodendrocitos en el cerebro; y la region de control del gen de la hormona liberador gonadotropica, que es activo en celulas del hipotalamo. Veanse Frain et al. (1990), Ciliberto et al. (1985), Pinkert et al., (1987), Kelsey et al. (1987), Swift et al. (1984), MacDonald (1987), Hanahan, (1985), Leder et al. (1986), Readhead et al. (1987) y Mason et al. (1986).

Hay tambien promotores que se expresan preferencialmente en ciertas celulas tumorales o en celulas tumorales per se, y que son utiles para tratar distintos tipos de cancer de acuerdo con la descripcion de la invencion. La clase de promotores que son espedficos para celulas cancerosas se ilustra mediante el promotor de tirosinasa, para dirigir melanomas; el promotor MUC 1 /Df3, para dirigir carcinoma de mama; el promotor tubrido myoD potenciador/SV40, que dirige la expresion hacia rabdomiosarcoma (RMS); el promotor del antfgeno carcinoembrionario (CEA), que es espedfico de celulas que expresan CEA tales como celulas de cancer de colon, y el promotor del gen de hexocinasa de tipo II, para dirigir carcinomas de pulmon de celulas pequenas. Veanse Hart (1996), Morton & Potter (1998), Kurane et al. (1998) y Katabi et al. (1999).

Los promotores que son dependientes o bien de ARN polimerasa (pol) II o de pol II son promotores preferidos para transcripcion genica. Los promotores altamente preferidos para transcripcion de shRNA son los promotores de ARN III polimerasa H1 y U6.

Se puede usar una secuencia de senal para efectuar la segregacion de un producto de expresion o la localizacion de un producto de expresion a un compartimiento celular particular. Por lo tanto, una molecula de polinucleotidos terapeutica administrada mediante celulas bacterianas muertas puede incluir una secuencia de senal, en un marco de lectura correcto, de modo tal que el producto de expresion de interes sea segregado por una celula fagocitante o su progenie, influenciando asf a las celulas circundantes, para que mantengan el paradigma del tratamiento elegido. Las secuencias de senal ilustrativas incluyen la secuencia de segregacion de hemolisina C-terminal descrita en la patente de Estados Unidos num. 5.143.830, la secuencia de segregacion BAR1, descrita en la patente de Estados Unidos num. 5.037.743, y la porcion de la secuencia de senal del polipeptido zsig32, descrita en la patente de Estados Unidos num. 6.025.197.

Elementos indicadores

Una molecula de acido nucleico que se ha de introducir mediante el planteamiento de la presente invencion puede incluir un elemento indicador. Un elemento indicador confiere en su hospedante recombinante un fenotipo facilmente detectable o caractenstico, tfpicamente codificando un polipeptido, no producido de otro modo por el hospedante, que puede detectarse, tras la expresion, por analisis histologico o analisis in situ, tal como por tecnicas de imagenes in vivo. Por ejemplo, un elemento indicador administrado por una celula bacteriana muerta intacta, de acuerdo con la presente invencion, podna codificar una protema que produce, en la celula hospedante fagocitante, un cambio colorimetrico o fluorimetrico detectable mediante analisis in situ y que es una funcion cuantitativa o semi-cuantitativa de la activacion de la transcripcion. Ilustrativas de estas protemas son las esterasas, fosfatasas, proteasas y otras enzimas, cuya actividad genera un cromoforo o fluoroforo detectable.

Los ejemplos preferidos son E. coli p-galactosidasa, que produce un cambio de color mediante escision de un sustrato indigogenico, indolil-p-D-galactosido y una luciferasa, que oxida un aldetudo de cadena larga (luciferasa bacteriana) o un acido carbox^lico heterodclico (luciferina), con la liberacion concomitante de luz.

Tambien es util en este contexto un elemento indicador que codifica la protema fluorescente verde (GFP) de la 5 medusa, Aequorea victoria, como lo describen Prasher et al. (1995). El campo de la tecnologfa asociada a GFP se ilustra en dos solicitudes PCT publicadas, en el documento WO 095/21191 (describe una secuencia de polinucleotidos que codifica una apoprotema GFP de 238 aminoacidos que contiene un cromoforo formado a partir de los aminoacidos 65 a 67) y WO 095/21191 (describe una modificacion del ADNc para el apopeptido de A. victoria GFP, que proporciona un peptido que tiene propiedades fluorescentes alteradas), y en un informe de Heim et al. 10 (1994) de una GFP mutante, caracterizada por una mejona de 4 a 6 veces en amplitud de excitacion.

Otro tipo de elemento indicador esta asociado con un producto de expresion que torna la celula bacteriana muerta recombinante resistente a una toxina. Por ejemplo, el gen neo protege a un hospedante contra niveles toxicos del antibiotico G418, mientras que un gen que codifica dihidro folato reductasa confiere resistencia a metotrexato, y el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) confiere resistencia al cloranfenicol.

15 Otros genes para uso como elemento indicador incluyen aquellos que pueden transformar una celula bacteriana muerta hospedante para expresar antfgenos de superficie celular distinguida, p. ej., protemas de fagocitacion vmca tales como VIH gpl20 o herpes gD, que son facilmente detectables con inmunoensayos.

Farmacos

Los farmacos utiles en la invencion pueden ser cualquier sustancia fisiologica o farmacologicamente activa que 20 produzca un efecto local o sistemico deseado en animales, particularmente en mairnferos y seres humanos. Los farmacos pueden ser compuestos inorganicos u organicos, sin limitacion, incluidos peptidos, protemas, acidos nucleicos y moleculas pequenas, cualquiera de los cuales puede estar caracterizado o no caracterizado. Pueden tener diversas formas, tales como moleculas inalteradas, complejos moleculares, sales farmacologicamente activas, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, laurato, palmitato, fosfato, nitrito, nitrato, borato, acetato, maleato, 25 tartrato, oleato, salicilato y similares. Para farmacos acidos, se pueden emplear las sales de metales, aminas o cationes organicos, por ejemplo, amonio cuaternario. Los derivados de farmacos, tales como bases, esteres y amidas tambien se pueden utilizar. Un farmaco que es insoluble en agua se puede utilizar en la forma de su derivado soluble en agua, o como su derivado de base, que en cualquier caso, o mediante su administracion, es convertido por enzimas, hidrolizado por el pH corporal o por otros procesos metabolicos a la forma terapeuticamente 30 activa original.

Los farmacos utiles incluyen agentes quimioterapeuticos, agentes inmunosupresores, citocinas, agentes citotoxicos, compuestos nucleoltticos, isotopos radiactivos y enzimas activadoras de profarmacos, que pueden ser naturales o producirse por metodos sinteticos o recombinantes.

Los farmacos afectados por resistencia a multiples farmacos clasicos tienen particular utilidad en la invencion, como 35 los vinca alcaloides (p. ej., vinblastina y vincristina), las antraciclinas (p. ej., doxorrubicina y daunorrubicina), inhibidores de transcripcion de ARN (p. ej., actinomicina D) y farmacos estabilizadores de microtubulos (p. ej., paclitaxel). (Ambudkar et al, 1999).

En general, los agentes para quimioterapia del cancer son farmacos preferidos. Los farmacos para quimioterapia del cancer utiles incluyen mostazas de nitrogeno, , nitrosorueas, etilenimina, alcanosulfonatos, tetrazina, compuestos de 40 platino, analogos de pirimidina, analogos de purina, antimetabolitos, analogos de folato, antraciclinas, taxanos, vinca-alcaloides, inhibidores de topoisomerasa y agentes hormonales. Los farmacos para quimioterapia ilustrativos son Actinomicina-D, Alkeran, Ara-C, Anastrozol, Asparaginasa, BiCNU, Bicalutamida, Bleomicina, Busulfan, Capecitabina, Carboplatino, Carboplatino, Carmustina, CCNU, Clorambucil, Cisplatino, Cladribina, CPT-11, Ciclofosfamida, Citarabina, Citosina arabinosido, Citoxan, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorrubicina, 45 Dexrazoxano, Docetaxel, Doxorrubicina, DTIC, Epirrubicina, Etilenimina, Etoposido, Floxuridina, Fludarabina, Fluorouracil, Flutamida, Fotemustina, Gemcitabina, Herceptina, Hexametilamina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecan, Lomustina, Mecloretamina, Melfalan, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, Mitotano, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Pamidronato, Pentostatina, Plicamicina, Procarbazina, Rituximab, Esteroides, Estreptozocina, STI-571, Estreptozocina, Tamoxifeno, Temozolomida, Teniposido, Tetrazina, Thoguanina, Tiotepa, 50 Tomudex, Topotecan, Treosulfan, Trimetrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, VP-16 y Xeloda.

Los farmacos para quimioterapia del cancer utiles tambien incluyen agentes alquilantes tales como Tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como Busulfan, Improsulfan y Piposulfan; aziridinas tales como Benzodopa, Carboquone, Meturedopa, y Uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrogeno tales como Clorambucil, 55 Clomafazina, Colofosfamida, Estramustina, Ifosfamida, mecloretamina, mecloretamina oxido hidrocloruro, Melfalan, Novembiehin, Fenesterina, Prednimustina, Trofosfamida, mostaza de uracil; nitroureas tales como Cannustina, Clorozotocin, Fotemustina, Lomustina, Nimustina y Ranimustina; antibioticos tales como Aclacinomicinas, Actinomicina, Autramicina, Azaserina, Bleomicinas, Cactinomicina, Caliqueamicina, Carabicina, Carminomicina,

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Carzinofilina, Cromoinicinas, Dactinomicina, Daunorrubicina, Detorrubicina, 6-diazo-5- oxo-L-norleucina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Esorrubicina, Idambicina, Marcelomicina, Mitomicinas, acido micofenolico, Nogalamicina, Olivomicinas, Peplomicina, Potfiromicina, Puromicina, Quelamicina, Rodorrubicina, Estreptonigrina, Estreptozocin, Tubercidin, Ubenimex, Zinostatina y Zorrubicina; anti-metabolitos tales como Metotrexato y 5- fluorouracil (5-FU); analogos de acido folico tales como Denopterin, Metotrexato, Pteropterin y Trimetrexato; analogos de purina tales como Fludarabina, 6- mercaptopurina, Tiamiprina y Tioguanina; analogos de pirimidina tales como Ancitabina, Azacitidina, 6-azauridina, Carmofur, Citarabina, Didesoxiuridina, Doxifluridina, Enocitabina, Floxuridina y 5-FU; androgenos tales como Calusterona, Propionato de Dromostanolona, Epitiostanol, Rnepitiostano y Testolactona; anti-adrenergicos tales como aminoglutetimida, Mitotano y Trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frolmico; aceglatona; aldofosfamida glucosido; acido aminolevulmico; Amsacrina; Bestrabucil; Bisantreno; Edatraxato; Defofamina; Demecolcina; Diaziquone; Elfornitina; acetato de eliptinio; Etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; Lentinan; Lonidamina; Mitoguazona; Mitoxantrona; Mopidamol; Nitracrina; Pentostatina; Fenamet; Pirarrubicina; acido podofilmico; 2-etilhidrazida; Procarbazina; PSK®; Razoxana; Sizofrran; Espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquone; 2, 2',2”-triclorotrietilamina; Uretano; Vindesina; Dacarbazina; Mannomustina; Mitobronitol; Mitolactol; Pipobroman; Gacitosina; Arabinosido (“Ara-C”); ciclofosfamida; thotEPa; taxoides, p. ej., Paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y Doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); Clorambucil; Gemcitabina; 6-tioguanina; Mercaptopurina; Metotrexato; analogos de platino tales como Cisplatino y Carboplatino; Vinblastina; platino; etoposido (VP-16); Ifosfamida; Mitomicina C; Mitoxantrona; Vincristina; Vinorelbina; Navelbina; Novantrona; Teniposido; Daunomicina; Aminopterina; Xeloda; Ibandronato; CPT- 11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); acido retinoico; Esperamicinas; Capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los mencionados. Tambien se incluyen agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion de las hormonas sobre los tumores tales como anti-estrogenos, incluidos, por ejemplo Tamoxifeno, Raloxifeno, inhibidores de aromatasa 4(5)- imidazoles, 4 Hidroxitamoxifeno, Trioxifeno, Keoxifeno, Onapristona y Toremifeno (Fareston); y anti-androgenos tales como Flutamida, Nilutamida, Bicalutamida, Leuprolida y Goserrelina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Los farmacos utiles tambien incluyen citocinas. Los ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas de polipeptidos tradicionales. Incluida entre las citocinas se encuentran las hormonas del crecimiento como la hormona de crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana N-metionilo y la hormona del crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glucoprotema tales como hormona estimulante de folmulos (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral y a y -p; sustancia anti-mulleriana; peptido asociado a gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-p; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformacion (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento de tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferon-a, -p y -y; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como macrofago-CSF (M-CSF); granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (GCSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-p; y otros factores de polipeptidos incluidos LIF y el kit ligando (KL). Tal como se emplea en esta memoria, el termino citocina incluye protemas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia natural.

Los farmacos pueden ser profarmacos, subsiguientemente activados por una enzima activadora de profarmacos que convierte un profarmaco como un agente quimioterapeutico de peptidilo en un farmaco antineoplasico activo. Veanse, p. ej., los documentos WO 88/07378; WO 81/01145; la patente de Estados Unidos num. 4.975.278. En general, el componente enzimatico incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profarmaco en un modo tal como para convertirlo en su forma citotoxica mas activa.

Para los propositos de la invencion, una celula bacteriana muerta intacta contiene un farmaco si contiene un acido nucleico que codifica un farmaco. Por ejemplo, un plasmido puede codificar un farmaco que se expresa dentro de las celulas mairnferas diana. Esto hace posible la administracion endogena de farmacos, que posee ventajas frente a la naturaleza transitoria de la administracion exogena.

Acidos nucleicos funcionales

[“Acido nucleico funcional” hace referencia a una molecula de acido nucleico que, tras la introduccion en una celula hospedante, interfiere espedficamente con la expresion de una protema. En general, las moleculas de acido nucleico funcional tienen la capacidad de reducir la expresion de una protema interactuando directamente con un transcrito que codifica la protema. El ARN regulador, tal como siRNA, shRNA, ARN cortos (tfpicamente menos de 400 bases de longitud), micro-ARN (miRNA), ribozimas y ARN senuelo, y acidos nucleicos antisentido constituyen acidos nucleicos funcionales ilustrativos.

“ARN regulador” denota una categona inclusiva de ARN que afectan la expresion por interferencia del ARN, supresion de expresion genica u otro mecanismo. Por consiguiente, ademas de shRNA, siRNA, miRNA y ssRNA antisentido, la categona de ARN regulador incluye ribozimas y ARN senuelo, entre otros.

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Dianas de acidos nucleicos funcionales

Los acidos nucleicos funcionales utilizados en la invencion preferiblemente dirigen el gen o el transcrito de una protema que promueve la resistencia del farmaco, inhibe la apoptosis o promueve un fenotipo neoplasico. La aplicacion exitosa de estrategias de acidos nucleicos funcionales en estos contextos se ha logrado en la tecnica, pero sin los beneficios de los vectores de celulas bacterianas muertas. Veanse, p. ej., Sioud (2004), Caplen (2003), Wu et al. (2003), Nieth et al. (2003), Caplen y Mousses (2003), Duxbury et al. (2004), Yague et al. (2004), Duan et al. (2004).

Las protemas que contribuyen a la resistencia a los farmacos constituyen dianas preferidas de acidos nucleicos funcionales. Las protemas pueden contribuir a resistencia a los farmacos adquirida o resistencia a los farmacos intrmseca. Cuando las celulas enfermas, tales como celulas tumorales, responden inicialmente a los farmacos, pero se tornan resistentes en ciclos de tratamiento subsiguientes, se adquiere el fenotipo resistente. Las dianas utiles implicadas en resistencia a los farmacos adquirida incluyen transportadores cassette de union a ATP tales como P- glucoprotema (P-gp, P-170, PGY1, MDR1, ABCB1, protema asociada a MDR, protema de resistencia a multiples farmacos 1), MDR-2 y MDR-3. MRP2 (protema asociada a resistencia a multiples farmacos), BCR-ABL (breakpoint cluster region - proto-oncogen Abelson), una protema asociada a resistencia a STI-571, protema relacionada con resistencia pulmonar, ciclooxigenasa-2, factor kappa nuclear, XRCC 1 (grupo de complemento cruzado de rayos x 1), ERCC1 (gen de complemento cruzado de escision), GSTP 1 (Glutation S-transferasa), P-tubulina mutante y factores de crecimiento tales como IL-6 son dianas adicionales implicadas en resistencia a los farmacos adquirida. Cuando las celulas no tratadas previamente no responden a uno o mas farmacos, el fenotipo de resistencia es intrmseco. Un ejemplo de una protema que contribuye a resistencia intrmseca es LRP (protema relacionada con resistencia pulmonar).

Las dianas particularmente utiles que contribuyen a resistencia a los farmacos incluyen transportadores de cassettes de union a AtP tales como P-glucoprotema, MDR-2, MDR-3, BCRP, APT 11 a y LRP.

Los agentes utiles tambien incluyen protemas que contribuyen a resistencia a apoptosis. Estos incluyen Bcl-2 (linfoma/leucemia de celulas B), Bcl-XL, Al/Bfll, cinasa de adhesion focal, Dihidrodiol deshidrogenasa y protema mutante p53.

Las dianas utiles incluyen ademas protemas supresoras de tumores oncogenicas y mutantes. Los ejemplos incluyen p-Catenin, PKC-a (protema cinasa C), C-rAf, K-Ras (VI2), ARN helicasa caja Dead DP97, DNMT1 (ADN metiltransferasa), FLIP (inhibidor proteico de Flice), C-Sfc, 53BPI, protema del grupo Polycomb EZH2 (homologo del potenciador de zeste) ErbBl, HPV-16 E5 y E7 (papilomavirus humano temprano 5 y temprano 7), Fortilin & MCI1P (protema de leucemia de mielocitos 1), DIP 13a (protema de interaccion con DDC 13a), MBD2 (dominio de union a metil CpG), p21, KLF4 (factor de tipo Kruppel 4), tpt/TCTP (protema de tumores controlada por traduccion), SPK1 & SPK2 (esfingosina cinasa), P300, PLK1 (cinasa de tipo Polo 1), Trp53, Ras, ErbBl, VEgF (factor de crecimiento endotelial vascular), BAG-1 (atanogen asociado a BCL2 1), MRP2, BCR-ABL, STI-571 protema asociada a resistencia, protema relacionada con resistencia pulmonar, ciclooxigenasa-2, factor kappa nuclear, XRCC1, ERCC1, GSTP1, p-tubulina mutante y factores de crecimiento.

Con respecto a la infeccion por VIH, las dianas incluyen VIH-Tat, HTV-Rev, VIH-Vif, VIH-Nef, VIH-Gag, VIH-Env, LTR, CD4, CXCR4 (receptor de quimiocina) y CCR5 (receptor de quimiocina).

Debido a la heterogeneidad de las celulas tumorales, una serie de distintas vfas de resistencia a los farmacos o de resistencia a apoptosis pueden ser operativas en las celulas diana. Por lo tanto, los acidos nucleicos funcionales utilizados en estos metodos descritos en la invencion pueden requerir cambios con el transcurso del tiempo. Por ejemplo, si las muestras de biopsia revelan nuevas mutaciones que resultan en resistencia a los farmacos adquirida, se pueden disenar y codificar siRNA espedficos en un plasmido de expresion adecuado, que se transforma en una cepa bacteriana productora de celulas bacterianas muertas, que se usa para producir celulas bacterianas muertas recombinantes que se administran para abordar la resistencia a los farmacos adquirida.

Moleculas de siRNA

Las moleculas de ARN de interferencia corta (siRNA) son utiles para efectuar interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo de silenciamiento de genes post-traduccion. Como se describe en la invencion, los siRNA hacen referencia a moleculas de ARN bicatenario o moleculas de ARN de horquilla monocatenario de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud, que se denominan por su capacidad de interferir espedficamente con la expresion de protemas. Preferiblemente, las moleculas de siRNA bicatenarias tienen 12-28 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente 15-25 nucleotidos de longitud, incluso mas preferiblemente 19-23 nucleotidos de longitud y lo mas preferiblemente 21-23 nucleotidos de longitud. En consecuencia, las moleculas de siRNA preferidas tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25,26, 27 28 o 29 nucleotidos de longitud.

La longitud de una cadena designa la longitud de una molecula de siRNA bicatenaria. Por ejemplo, un siRNA bicatenario que se describe como de 21 ribonucleotidos de largo (un 21-mer) podna comprender dos cadenas opuestas de ARN que se anelan en 19 pares de base contiguos. Los dos ribonucleotidos restantes en cada cadena formanan una “proyeccion.” Cuando un siRNA contiene dos cadenas de diferentes longitudes, la cadena mas larga

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designa la longitud del siRNA. Por ejemplo, un dsRNA que contiene una cadena que tiene 21 nucleotidos de largo y una segunda cadena que tiene 20 nucleotidos de largo, constituye un 21-mer.

Son convenientes los siRNA bicatenarios que comprenden una proyeccion. La proyeccion puede estar en el extremo 5' o 3 ' de una cadena. Preferiblemente, esta en el extremo 3' de la cadena de aRn. La longitud de una proyeccion puede variar, pero preferiblemente tiene aproximadamente 1 a aproximadamente 5 bases, y mas preferiblemente aproximadamente 2 nucleotidos de longitud. Preferiblemente, el siRNA de uso en la presente invencion comprendera una proyeccion en 3' de aproximadamente 2 a 4 bases. Mas preferiblemente, la proyeccion en 3' tiene 2 ribonucleotidos de largo. Incluso mas preferiblemente, los 2 ribonucleotidos que comprenden la proyeccion en 3' son uridina (U).

Los siRNA utilizados en la invencion estan disenados para interactuar con una secuencia de ribonucleotidos diana, lo que significa que complementan una secuencia diana lo suficiente como para hibridarse a la secuencia diana. En una realizacion, la invencion describe una molecula de siRNA que comprende una secuencia de ribonucleotidos por lo menos 70%, 75%, 80%, 85% o 90% identica a una secuencia de ribonucleotidos diana del complemento de una secuencia de ribonucleotidos diana. Preferiblemente, la molecula de siRNA es por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identica a la secuencia de ribonucleotidos diana o al complemento de la secuencia de ribonucleotidos diana. Lo mas preferiblemente, un siRNA sera 100% identico a la secuencia de nucleotidos diana o al complemento de la secuencia de ribonucleotidos. No obstante, las moleculas de siRNA con inserciones, eliminaciones o mutaciones puntuales sencillas relativas a una diana tambien pueden ser eficaces.

Las herramientas para ayudar en el diseno de siRNA estan facilmente disponibles al publico. Por ejemplo, una herramienta de diseno de siRNA basada en un ordenador esta disponible en internet ingresando en
www.dharmacon.com.

En este contexto, los shRNA comprenden una cadena sencilla de ARN que forma una estructura en tallo-bucle, en donde el tallo consiste en las cadenas sentido y antisentido complementarias que comprenden un siRNA bicatenario, y el bucle es un enlazador de tamano variable. La estructura del tallo de los shRNA en general tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleotidos de largo. Preferiblemente, el tallo de las moleculas de shRNA tiene 12-28 nucleotidos de largo, mas preferiblemente 15-25 nucleotidos de largo, incluso mas preferiblemente 19-23 nucleotidos de largo y lo mas preferiblemente 21-23 nucleotidos de largo. Por lo tanto, las moleculas de shRNA preferidas comprenden tallos que tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 o 29 nucleotidos de longitud.

Ribozimas

Las ribozimas son moleculas de ARN que tienen una actividad enzimatica que puede escindir repetidamente otras moleculas de ARN en un modo espedfico de una secuencia base de nucleotidos. Dichas moleculas de ARN enzimaticas pueden dirigirse practicamente a cualquier transcrito de ARN, y la escision eficiente puede lograrse in vitro.

Se conocen en la actualidad seis variedades basicas de ARN enzimaticos naturales. Cada uno puede catalizar la hidrolisis de enlaces fosfodiester de ARN en trans (y por lo tanto puede escindir otras moleculas de ARN) bajo condiciones fisiologicas. En general, los polinucleotidos enzimaticos actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union ocurre a traves de la porcion de union diana de un polinucleotido enzimatico que se mantiene proximo a una porcion enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. Por consiguiente, el polinucleotido enzimatico reconoce primero y luego se une a un ARN diana a traves de pares de bases complementarios, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad de dirigir la smtesis de una protema codificada. Despues de que un polinucleotido enzimatico se ha unido y escindido su diana de ARN, es liberado de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

La naturaleza enzimatica de una ribozima es ventajosa. Ya que una sola molecula de ribozima es capaz de escindir muchas moleculas de ARN diana, las concentraciones eficaces de ribozima pueden ser bastante bajas.

Las ribozimas utiles pueden comprender uno de varios motivos, incluidos los cabeza de martillo (Rossi et al. (1992)), horquilla (Hampel y Tritz, (1989), Hampel et al. (1990)), el motivo de hepatitis delta virus (Perrotta y Been (1992), intron del grupo I (patente de Estados Unidos num. 4.987.071), RNasaP ARN en asociacion con una secuencia grna de ARN (Guerrier-Takada et al. (1983)), y Neurospora VS ARN (Saville & Collins (1990); Saville & Collins (1991); Collins & Olive (1993)). Estos motivos espedficos no son limitativos, ya que lo importante en una ribozima utilizada en la presente invencion es que tenga un sitio de union al sustrato espedfico que sea complementario a una o mas regiones de ARN diana, y que tenga secuencias de nucleotidos dentro o alrededor de ese sitio de union al sustrato que impartan una actividad de escision del ARN a la molecula.

Las ribozimas utilizadas en la invencion pueden comprender oligonucleotidos modificados (p. ej., mejor estabilidad, direccionamiento, etc.). Las secuencias de acidos nucleicos que codifican las ribozimas pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como, por ejemplo, el promotor de ARN Polimerasa II o ARN polimerasa III, de

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modo que las celulas transfectadas produzcan cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajes endogenos diana e inhibir la traduccion.

Oligonucleotidos antisentido

Los oligonucleotidos antisentido utilizados en la invencion se hibridan espedficamente con un acido nucleico que codifica una protema, e interfieren con la transcripcion o traduccion de la protema. En una realizacion, un oligonucleotido antisentido dirige ADN e interfiere con su replicacion y/o transcripcion. En otra realizacion, un oligonucleotido antisentido se hibrida espedficamente con ARN, incluido pre-ARNm y ARNm. Dichos oligonucleotidos antisentido pueden efectuar, por ejemplo, la translocacion del aRn al sitio de traduccion de la protema, la traduccion de protema del ARN, el empalme del ARN para producir una o mas especies de ARNm, y la actividad catalttica que puede estar implicada o que puede ser facilitada por el ARN. El efecto general de dicha interferencia consiste en modular, reducir o inhibir la expresion de la protema diana.

“Oligonucleotido” hace referencia a un polinucleotido que comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 10 nucleotidos (nt) y aproximadamente 1000 nt. Los oligonucleotidos para uso en la invencion tienen entre aproximadamente 10 nt y aproximadamente 150 nt. El oligonucleotido puede ser un oligonucleotido natural o un oligonucleotido sintetico. Los oligonucleotidos se pueden modificar.

“Oligonucleotido modificado” y “polinucleotido modificado” hacen referencia a oligonucleotidos o polinucleotidos con una o mas modificaciones qmmicas en el nivel molecular de las estructuras moleculares naturales de todas o algunas de las bases, restos azucar, enlaces fosfato internucleosfdicos, ademas de moleculas que tienen sustituciones anadidas o una combinacion de modificaciones en estos sitios. Los enlaces fosfato internucleosfdicos pueden ser fosfodiester, fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetilester, acetamidato, carbamato, tioeter, fosforoamidato puente, metileno fosfonato puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato puente o enlaces internucleotfdicos sulfona, o enlaces 3'-3', 5'-3' o 5'-5', y combinaciones de dichos enlaces similares. El enlace fosfodiester se puede reemplazar con un enlace sustituto, tal como fosforotioato, metilamino, metilfosfonato, fosforoamidato y guanidina, y la subunidad ribosa de los polinucleotidos puede tambien sustituirse (p. ej., hexosa fosfodiester; acidos nucleicos peptfdicos). Las modificaciones pueden ser internas (individuales o repetidas) o al final(s) de la molecula de oligonucleotido, y pueden incluir adiciones a la molecula de los enlaces fosfato internucleosfdicos, como modificaciones de desoxirribosa y fosfato que se escinden o reticularse a las cadenas opuestas o a enzimas u otras protemas asociadas. Las expresiones “oligonucleotidos modificados” y “polinucleotidos modificados” tambien incluyen oligonucleotidos o polinucleotidos que comprenden modificaciones a los restos azucar (p. ej., ribonucleotidos sustituidos en 3 o monomeros de desoxirribonucleotidos), cualquiera de los cuales puede estar unido a otro mediante enlaces 5' a 3'.

Existen varios sitios dentro de un gen que se pueden utilizar para disenar un oligonucleotido antisentido. Por ejemplo, un oligonucleotido antisentido puede unirse a la region que abarca el codon de inicio de la traduccion, tambien conocido como codon de partida, del marco de lectura abierto. En este sentido, “codon de partida” y “codon de inicio de la traduccion” en general se refieren a la porcion de dicho ARNm o gen que abarca entre por lo menos aproximadamente 25 y por lo menos aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de inicio de la traduccion.

Otro sitio para interaccion antisentido que ha de ocurrir es el codon de finalizacion del marco de lectura abierto. Las expresiones “region del codon finalizador” y “region del codon de finalizacion de la traduccion” se refieren en general a una porcion de dicho ARNm o gen que abarca por lo menos aproximadamente 25 a por lo menos aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion desde un codon de terminacion de la traduccion.

El marco de lectura abierto o la region codificante pueden tambien ser dirigidos efectivamente. En general se entiende que el marco de lectura abierto hace referencia a la region entre el codon de inicio de la traduccion y el codon de finalizacion de la traduccion. Otra region diana es la region no traducida 5', que es la porcion de un ARNm en la direccion 5' del codon de inicio de la traduccion. Incluye los nucleotidos entre el sitio cap 5' y el codon de inicio de la traduccion de un ARNm o nucleotidos correspondientes en el gen.

De modo similar, la region no traducida 3' se puede usar como una diana para oligonucleotidos antisentido. La region 3' no traducida es esa porcion del ARNm en la direccion 3' del codon de finalizacion de la traduccion, y por lo tanto incluye los nucleotidos entre el codon de finalizacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm o nucleotidos correspondientes del gen.

Un oligonucleotido antisentido puede tambien dirigir la region cap 5' de un ARNm. La region cap 5' comprende un residuo guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del ARNm via un enlace 5'-5' trifosfato. Se considera que la region cap 5' incluye la estructura cap 5' propiamente dicha y tambien los primeros 50 nucleotidos adyacentes a la region cap.

Si bien algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones de intrones, que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. El resto de las regiones de exones (y por lo tanto traducidas) se empalman unas con otras para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de empalme de ARNm, es decir, las uniones intron-exon, representan posibles regiones diana, y son particularmente utiles en

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situaciones en las que el empalme aberrante esta implicado en la enfermedad, o en las que la produccion excesiva de un producto de empalme de ARNm particular esta implicada en la enfermedad. A su vez, las uniones de fusion aberrantes debido a reordenamientos son tambien dianas posibles para oligonucleotidos antisentido.

Con estos distintos sitios diana en consideracion, se deben elegir los oligonucleotidos antisentido que son suficientemente complementarios a los polinucleotidos diana. “Complementaridad” hace referencia a la compatibilidad topologica o compatibilidad de las superficies de interaccion de dos moleculas. Debe haber un grado suficiente de complementaridad o apareamiento preciso de modo tal que ocurra una union estable y espedfica entre el oligonucleotido y la diana de polinucleotido. Cabe destacar que la secuencia de un oligonucleotido antisentido no necesita ser 100% complementaria a aquella de su polinucleotido diana para ser espedficamente susceptible de hibridacion. Un oligonucleotido antisentido es espedficamente susceptible de hibridacion cuando la union del oligonucleotido antisentido al polinucleotido diana interfiere con la funcion normal del polinucleotido diana causando una perdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementaridad para evitar la union no espedfica del oligonucleotido antisentido a secuencias no diana bajo condiciones en las que se desea la union espedfica, es decir, bajo condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo las condiciones en las que se realizan los ensayos.

Los oligonucleotidos antisentido pueden tener de por lo menos aproximadamente 8 nt a por lo menos 50 nt de longitud. En una realizacion, los oligonucleotidos antisentido pueden tener de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nt de longitud.

Los oligonucleotidos antisentido utilizados de acuerdo con la presente invencion pueden convenientemente y rutinariamente elaborarse a traves de la tecnica conocida de smtesis de fase solida. Varios proveedores venden los equipos para dicha smtesis, incluidos, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro metodo para dicha smtesis conocido en la tecnica puede emplearse adicional o alternativamente. Se conoce el uso de tecnicas similares para preparar oligonucleotidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.

Acidos nucleicos que codifican acidos nucleicos funcionales

Para los fines de la invencion, una celula bacteriana muerta intacta contiene un acido nucleico funcional si contiene un acido nucleico que codifica un acido nucleico funcional. Por ejemplo, un plasmido puede codificar un acido nucleico funcional que se expresa dentro de celulas diana mairnferas. Esto hace que sea posible la administracion endogena de acidos nucleicos funcionales, que tiene ventajas frente a la naturaleza transitoria de la administracion exogena.

Por lo tanto, las celulas bacterianas muertas intactas pueden portar ADN plasmfdico que codifica una o mas secuencias de siRNA destinada a silenciar los genes de resistencia a los farmacos o de resistencia a apoptosis. Con el uso de celulas bacterianas muertas que codifican multiples acidos funcionales, es posible tratar las celulas que expresan mecanismos de resistencia a multiples farmacos. Diferentes secuencias de siRNA pueden expresarse individualmente de diferentes promotores. Por ejemplo, siRNA que dirige Pgp ARNm puede expresarse a partir del promotor U6 y siRNA que dirige Bcl-2 ARNm puede expresarse a partir del promotor H1. Estos cassettes de expresion multiple preferiblemente son portados en un solo plasmido, pero pueden tambien estar en distintos plasmidos. Distintas secuencias de siRNA pueden tambien expresarse a partir de un solo promotor, en donde el plasmido recombinante porta un cassette de expresion comprendido por multiples secuencias que codifican siRNA, que estan unidas mediante secuencias de polinucleotidos no codificantes. Un terminador de transcripcion de un solo gen puede disponerse debajo del cassette de expresion completa.

En una estrategia, un plasmido codifica las cadenas sentido y antisentido de un siRNA como dos transcritos independientes que, despues de la expresion dentro de una celula diana, se hibridan para formar duplex de siRNA funcionales. En una segunda estrategia preferida, un plasmido codifica uno o mas siRNA, en donde cada uno se expresa como una sola transcripcion que forma una estructura horquilla corta tallo-bucle de ARN. La estructura de horquilla puede ser procesada por una enzima Dicer en siRNA funcional.

Vehmulos farmaceuticamente aceptables

“Farmaceuticamente aceptable” se refiere a compatibilidad fisiologica. Un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable no anula la actividad biologica de la composicion que se este administrando, es qmmicamente inerte y no es toxico para el organismo en el cual se administra.

Endotoxina

“Endotoxina” hace referencia a lipopolisacarido (LPS) libre. Por consiguiente, una composicion que esta “libre de endotoxina” carece de LPS que no esta asociado con una membrana de celulas bacterianas. Una composicion que esta “esencialmente libre de endotoxina” carece de una cantidad o concentracion suficiente de LPS para causar toxicidad en un mamffero, tal como un ser humano. Endotoxina/LPS que no esta asociada con una membrana celular bacteriana tambien se denomina “endotoxina libre”.

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La endotoxina tambien puede ser eliminada de una composicion por filtracion a traves de un filtro de 0,2 pm. La endotoxina libre y las micelas de endotoxina son mas pequenas que de 0,2 pm y en consecuencia se filtran facilmente de una composicion que retiene celulas bacterianas muertas, que son mas grandes de 0,2 pm. A su vez, los anticuerpos monoclonales, anti-lfpido A se pueden usar para unirse a la endotoxina libre. Los anticuerpos monoclonales anti-lfpido A se pueden unir a un soporte solido tal como una columna de cromatograffa de afinidad o a esferas magneticas mediante su componente Fc, dejando los fragmentos Fab de union al lfpido A libres para unirse a LPS libre.

Ligandos biespedficos

Las composiciones para uso de la invencion comprenden uno o mas ligandos biespedficos. Los ligandos utiles en la invencion incluyen cualquier agente que se una a un componente superficial en una celula diana y a un componente superficial en una celula bacteriana muerta. Preferiblemente, el componente superficial en una celula diana es un receptor, especialmente un receptor capaz de mediar la endocitosis. Los ligandos pueden comprender un polipeptido y/o un componente de carbohidrato. Los anticuerpos son ligandos preferidos. Por ejemplo, un anticuerpo biespedfico que porta especificidades duales para un componente superficial en celulas bacterianas muertas intactas derivadas de bacterias y un componente superficial en celulas mairnferas diana, se pueden usar eficientemente para dirigir las celulas bacterianas muertas hacia las celulas mamfferas diana in vitro e in vivo. La categona de ligandos utiles tambien incluye receptores, enzimas, peptidos de union, protemas de fusion/quimericas y moleculas pequenas.

La seleccion de un ligando particular se hace en funcion de dos criterios principales: (i) union espedfica a uno o mas dominios en la superficie de las celulas bacterianas muertas intactas y (ii) union espedfica a uno o mas dominios en la superficie de las celulas diana. Por lo tanto, los ligandos preferiblemente tienen una primera rama que porta especificidad para una estructura superficial de celulas bacterianas muertas intactas derivada de bacterias y una segunda rama que porta especificidad para una estructura superficial de celulas mamfferas. Cada una de las primera y segunda ramas puede ser multivalente. Preferiblemente, cada rama es monoespedfica, incluso si es multivalente.

Para union a celulas bacterianas muertas derivadas de bacterias, es conveniente que una rama del ligando sea espedfica para el componente de O-polisacarido de un lipopolisacarido hallado en la celula bacteriana madre. Otras estructuras superficiales de celulas bacterianas muertas que se pueden explotar para union a ligandos incluyen polipeptidos y carbohidratos expuestos a superficies celulares en membranas exteriores, tales como pili, fimbrias, protema de membrana exterior y fragmentos de peptidos expuestos a la superficie celular de los flagelos.

Para union a celulas diana, una rama del ligando es espedfica de un componente superficial de una celula mamffera. Dichos componentes incluyen protemas superficiales celulares, peptidos y carbohidratos, o bien caracterizados o no caracterizados. Los receptores de superficie celular, especialmente aquellos capaces de activar la endocitosis mediada por los receptores, son componentes superficiales celulares convenientes para direccionamiento. Dichos receptores, si se expresan en exceso en la superficie celular diana, confieren selectividad adicional para dirigir las celulas que se han de tratar, reduciendo de este modo la posibilidad de administrar a celulas no diana.

A modo de ejemplo, uno puede dirigir celulas tumorales, celulas metastasicas, celulas de la vasculatura, tales como celulas endoteliales y celulas de musculo liso, celulas de pulmon, celulas de rinon, celulas sangumeas, celulas de medula osea, celulas de cerebro, celulas de fugado, etc, o precursores de cualquier celula seleccionada, seleccionando un ligando que se una espedficamente a un motivo del receptor de la superficie celular en las celulas deseadas. Los ejemplos de receptores de la superficie celular incluyen antfgeno carcinoembrionario (CEA), que se expresa excesivamente en la mayona de los carcinomas de colon, recto, mama, pulmon, pancreas y tubo digestivo (Marshall, 2003); receptores de heregulina (HER-2, neu o c-erbB-2), que frecuentemente se expresan en exceso en tumores de mama, ovario, colon, pulmon, prostata y cuello uterino (Hung et al., 2000); receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), que se expresa altamente en un rango de tumores solidos que incluyen aquellos de mama, cabeza y cuello, pulmon de celulas no pequenas y prostata (Salomon et al., 1995); receptor de asialoglucoprotema (Stockert, 1995); receptor de transferrina (Singh, 1999); receptor del complejo enzimatico de serpina, que se expresa en hepatocitos (Ziady et al., 1997); receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), que se expresa en gran medida en celulas de adenocarcinoma ductal pancreatico (Kleeff et al., 2002); receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), para terapia genica anti-angiogenesis (Becker et al., 2002 y Hoshida et al., 2002); receptor de folato, que se expresa excesiva y selectivamente en 90% de los carcinomas de ovario no mucinosos (Gosselin y Lee, 2002); glicocalix de la superficie celular (Batra et al., 1994); receptores de carbohidratos (Thumher et al., 1994); y receptor de inmunoglobulina polimerica, que es util para la administracion de genes a las celulas epiteliales respiratorias y atractivo para el tratamiento de enfermedades pulmonares tales como fibrosis qrnstica (Kaetzel et al, 1997).

Los ligandos preferidos comprenden anticuerpos y/o derivados de anticuerpos. Tal como se emplea en la presente memoria, el termino “anticuerpo” abarca una molecula de inmunoglobulina obtenida mediante la generacion in vitro o in vivo de una respuesta inmunogenica. El termino “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales, monoespedficos y monoclonales, asf como tambien derivados de anticuerpos, tales como fragmentos de anticuerpos monocatenarios

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(scFv). Los anticuerpos y derivados de anticuerpos utiles en la presente invencion tambien se pueden obtener por tecnicas de ADN recombinante.

Los anticuerpos de tipo silvestre tienen cuatro cadenas de polipeptidos, dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras identicas. Ambos tipos de cadenas de polipeptidos tienen regiones constantes, que no vanan o vanan muy poco entre anticuerpos de la misma clase, y regiones variables. Las regiones variables son unicas de un anticuerpo particular y comprenden un dominio de union al antigeno que reconoce un epftopo espedfico. Las regiones del dominio de union al antigeno que estan mas directamente implicadas en la union de anticuerpos son “regiones determinantes de complementaridad” (CDR).

El termino “anticuerpo” tambien abarca derivados de anticuerpos, tales como fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad de unirse espedficamente a antfgenos. Dichos fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab (un fragmento que contiene el dominio de union al antfgeno y comprende una cadena ligera y parte de una cadena pesada unida en puente mediante un enlace disulfuro), Fab' (un fragmento de anticuerpos que contiene un solo dominio de union al antfgeno que comprende un Fab y una porcion adicional de la cadena pesada a traves de la region bisagra, F(ab')2 (dos moleculas Fab' unidas por enlaces disulfuro entre cadenas en las regiones bisagra de las cadenas pesadas), un Fab biespedfico (una molecula Fab que tiene dos dominios de union al antfgeno, cada uno de los cuales puede estar dirigido a un epftopo distinto), y un scFv (la region determinante de union al antfgeno, variable, de una sola cadena ligera y pesada de un anticuerpo unido mediante una cadena de aminoacidos).

Cuando los anticuerpos, incluidos fragmentos de anticuerpos, constituyen una parte o todos los ligandos, preferiblemente son de origen humano o modificados para ser adecuados para uso en seres humanos. Los llamados “anticuerpos humanizados” se conocen en la tecnica. Vease, p. ej., Osbourn et al., 2003. Han sido modificados por manipulacion genetica y/o tratamiento in vitro para reducir su antigenicidad en un ser humano. Los metodos para humanizar anticuerpos se describen, p. ej., en las patentes de Estados Unidos num. 6.639.055, num. 5.585.089 y num. 5.530.101. En el caso mas sencillo, los anticuerpos humanizados se forman injertando los bucles de union al antfgeno, conocidos como regiones determinantes de complementaridad (CDR), de un mAb de raton hacia una IgG humana. Veanse Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; y Verhoeyen et al., 1988. La generacion de anticuerpos humanizados de alta afinidad, no obstante, en general requiere la transferencia de uno o mas residuos adicionales de las llamadas regiones marco (FR) del mAb madre de raton. Se han desarrollado varias variantes de la tecnologfa de humanizacion. Vease Vaughan el al., 1998.

Tambien se pueden emplear en la invencion anticuerpos humanos, en lugar de “anticuerpos humanizados”. Tienen gran afinidad hacia sus respectivos antfgenos y habitualmente se obtienen de bibliotecas de fragmentos variables monocatenarios muy grandes (scFvs) o bibliotecas de exhibicion de fagos Fab. Veanse Griffiths et al., 1994; Vaughan et al., 1996; Sheets et al., 1998; de Haard et al., 1999; y Knappik et al., 2000.

Los ligandos utiles tambien incluyen anticuerpos monocatenarios biespedficos, que tfpicamente son polipeptidos recombinantes que consisten en una porcion de cadena ligera variable covalentemente conectada a traves de una molecula enlazadora a una porcion de la cadena pesada variable correspondiente. Veanse las patentes de Estados Unidos num. 5.455.030, num. 5.260.203, y num. 4.496.778. Los anticuerpos biespedficos tambien pueden prepararse por otros metodos. Por ejemplo, los heteroconjugados qmmicos pueden crearse uniendo qmmicamente anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos de distintas especificidades. Vease Karpovsky et al., 1984. No obstante, dichos heteroconjugados son diffciles de elaborar en un modo reproducible y son por lo menos dos veces mas grandes que los anticuerpos monoclonales normales. Los anticuerpos biespedficos tambien pueden crearse por intercambio de disulfuro, lo que implica escision enzimatica y re-asociacion de los fragmentos de anticuerpo. Vease Glennie et al., 1987.

Dado que los fragmentos Fab y scFv son monovalentes, a menudo tienen baja afinidad hacia estructuras diana. Por ende, los ligandos preferidos elaborados a partir de estos compuestos son modificados en conjugados dimericos, trimericos o tetramericos para incrementar la afinidad funcional. Veanse Tomlinson y Holliger, 2000; Carter, 2001; Hudson y Souriau, 2001; y Todorovska et al, 2001. Dichas estructuras de conjugados pueden crearse por reticulaciones qmmicas y/o geneticas.

Los ligandos biespedficos utilizados en la invencion preferiblemente son monoespedficos en cada extremo, es decir, espedficos para un solo componente en celulas bacterianas muertas en un extremo y espedficos para un solo componente en celulas diana en el otro extremo. Los ligandos pueden ser multivalentes en uno o ambos extremos, por ejemplo, en la forma de los llamados diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Vease Hudson y Souriau, 2003. Un diacuerpo es un dfmero bivalente formado por una asociacion no covalente de dos scFvs, que produce dos sitios de union Fv. Asimismo, un triacuerpo resulta en la formacion de un tnmero trivalente de tres scFvs, produciendo tres sitios de union, y un tetracuerpo resulta de la formacion de un tetramero tetravalente de cuatro scFvs, produciendo cuatro sitios de union.

Varios anticuerpos monoclonales humanizados humanos y de raton y sus fragmentos que tienen especificidad hacia receptores en celulas mamfferas han sido aprobados para uso terapeutico humano, y la lista se esta expandiendo rapidamente. Vease Hudson y Souriau, 2003. Un ejemplo de dicho anticuerpo que se puede utilizar para formar una rama de un ligando biespedfico tiene especificidad hacia HER2: Herceptin™; Trastuzumab.

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Las regiones variables de anticuerpos tambien se pueden condensar a una amplia gama de dominios de protemas. La fusion a dominios de inmunoglobulina humana tales como IgG1 CH3 anade masa y promueve la dimerizacion. Vease Hu et al., 1996. La fusion a regiones bisagra Ig-Fc humanas puede anadir funciones efectoras. Ademas, la fusion a dominios de protema heterologos de protemas multimericas promueve la multidimerizacion. Por ejemplo, la fusion de un scFv corto a helices anfipaticas cortas se ha usado para producir minianticuerpos. Vease Pack y Pluckthun, 1992. Los dominios de protemas que forman heterodfmeros, tales como fos/jun, pueden usarse para producir moleculas biespedficas (Kostelny et al., 1992) y, alternativamente, dominios de homodimerizacion pueden modificarse geneticamente para formar heterodfmeros por estrategias de modificacion genetica tales como “boton en ojal” (knobs into holes) (Ridgway et al., 1996). Finalmente, se pueden seleccionar pares de protemas de fusion que proveen tanto multimerizacion como una funcion adicional, p. ej., estreptavidina. Vease Dubel et al., 1995.

Composiciones adicionales

En una realizacion, la composicion comprende una celula bacteriana muerta que contiene una molecula de acido nucleico funcional y un farmaco. La molecula de acido nucleico funcional puede ser una que dirija la transcripcion de una protema que contribuya a la resistencia a los farmacos. Preferiblemente, la molecula de acido nucleico funcional dirige la transcripcion de una protema que contribuye a la resistencia contra el mismo farmaco en la composicion. El farmaco puede estar contenido dentro de una celula bacteriana muerta, incluso la misma celula bacteriana muerta que la molecula de acido nucleico funcional, pero no es necesario que este contenida.

Metodos de administracion para celulas competentes de fagocitosis o endocitosis

En otro aspecto, se describe la administracion mediante union en puente de celulas bacterianas muertas derivadas de bacterias con celulas mamfferas competentes de fagocitosis o endocitosis. Dichas celulas mairnferas, que son capaces de fagocitar a celulas bacterianas madre en el modo de patogenos bacterianos intracelulares, a su vez fagocitan a las celulas bacterianas muertas, que liberan su carga en el citoplasma de las celulas mamfferas. Este planteamiento de administracion se puede efectuar sin el uso de ligandos de direccionamiento.

Puede estar implicada una diversidad de mecanismos para fagocitar celulas bacterianas muertas por un tipo de celula determinada, y la presente invencion no depende de ningun mecanismo particular en este sentido. Por ejemplo, la fagocitosis es un proceso bien documentado en el que los macrofagos y otros fagocitos, tales como neutrofilos, ingieren partmulas extendiendo los pseudopodos sobre la superficie de la partmula hasta que la partmula esta totalmente fagocitada. Si bien se describe como fagocitosis “no espedfica”, se ha demostrado la implicancia de receptores espedficos en el proceso. Veanse Wright y Jong (1986); Speert et al. (1988).

Por lo tanto, una forma de fagocitosis implica la interaccion entre los ligandos superficiales y los receptores de ligandos ubicados en las membranas de los pseudopodos (Shaw y Griffin, 1981). Se cree que esta etapa de sujecion, mediada por los receptores espedficos, depende de las adhesinas de la superficie bacteriana. Con respecto a bacterias menos virulentas, tales como E. coli no enterotoxigenica, la fagocitosis tambien puede ocurrir en ausencia de ligandos superficiales para receptores de fagocitos. Vease Pikaar et al. (1995), por ejemplo. Por ende, la presente invencion describe el uso de celulas bacterianas muertas que o bien poseen o carecen de adhesinas superficiales, para mantener la naturaleza de sus celulas bacterianas madre, o estan fagocitadas por fagocitos (es decir, celulas hospedantes “fagocitosis-competentes”), de las cuales los neutrofilos y los macrofagos son los tipos principales en mamfferos.

Otro proceso de fagocitosis es la endocitosis, mediante la cual los patogenos intracelulares ejemplificados por especies de Salmonella, Escherichia, Shigella, Helicobacter, Pseudomonas y Lactobacilli obtienen ingreso a celulas epiteliales mamfferas y se replican allf Dos mecanismos basicos en este sentido son la endocitosis mediada por receptores dependientes de clatrina, tambien conocida como “endocitosis de vesmulas recubiertas” (Riezman, 1993), y la endocitosis independiente de clatrina (Sandvig y Deurs, 1994). Una de ellas o ambas pueden estar implicadas cuando una celula competente de fagocitosis que actua por endocitosis (es decir, una celula hospedante “endocitosis-competente”) fagocita a las celulas bacterianas muertas de acuerdo con la invencion. Las celulas endocitosis-competentes representativas son celulas epiteliales de mama, enterocitos en el tubo digestivo, celulas epiteliales estomacales, celulas epiteliales de pulmon y celulas epiteliales de las vfas urinarias y la vejiga.

Cuando se efectua la administracion a una celula mamffera competente de fagocitosis sin el uso de un ligando de direccionamiento, la naturaleza de la aplicacion contemplada influira en la eleccion de la fuente bacteriana para las celulas bacterianas muertas empleadas. Por ejemplo, las especies Salmonella, Escherichia y Shigella portan adhesinas que son reconocidas por receptores que median la endocitosis en enterocitos en el tubo digestivo, y pueden ser adecuadas para administrar un farmaco que es eficaz para celulas de cancer de colon. De modo similar, las celulas bacterianas muertas derivadas de Helicobacter pylori, que portan adhesinas espedficas de celulas epiteliales estomacales, podnan ser adecuadas para administracion destinada a celulas de cancer de estomago. La inhalacion o insuflacion puede ser ideal para administrar celulas bacterianas muertas intactas derivadas de una especie Pseudomonas que porta adhesinas reconocidas por receptores en celulas epiteliales de pulmon. Las celulas bacterianas muertas derivadas de bacterias Lactobacilli, que portan adhesinas espedficas de las celulas epiteliales de las vfas urinarias y la vejiga, podnan ser muy adecuadas para administracion intrauretral de un farmaco a un cancer en las vfas urinarias o en la vejiga.

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En una realizacion, el metodo de administracion es un metodo de administracion de acido nucleico terapeutico que comprende poner en contacto las celulas bacterianas muertas que contienen un plasmido comprendido por una secuencia de acido nucleico con celulas mairnferas que son fagocitosis- o endocitosis-competentes, de modo tal que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas. El plasmido preferiblemente codifica un producto de expresion terapeutico. Despues de que las celulas bacterianas muertas entran en contacto con las celulas mamfferas, estas ultimas producen un producto de expresion de la secuencia de acido nucleico terapeutico. El metodo de administracion del acido nucleico terapeutico puede ser in vitro o in vivo.

En otra realizacion, el metodo de administracion es un metodo de administracion de farmacos que comprende poner en contacto las celulas bacterianas muertas que contienen un farmaco con las celulas mamfferas que son fagocitosis o endocitosis-competentes, de modo tal que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas. El farmaco se libera luego al citoplasma de las celulas mamfferas. Alternativamente, las celulas bacterianas muertas pueden contener un plasmido que codifica un farmaco, en cuyo caso el plasmido opcionalmente comprende un elemento regulador y/o un elemento indicador El metodo de administracion del acido nucleico terapeutico puede ser in vitro o in vivo.

En otra realizacion, el metodo de administracion es un metodo de administracion de un acido nucleico funcional que comprende poner en contacto una celula bacteriana muerta que contiene o bien una molecula de acido nucleico funcional o un plasmido que codifica una molecula de acido nucleico funcional con celulas mamfferas que son fagocitosis - o endocitosis-competentes, de modo tal que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mai^eras. El acido nucleico funcional o el plasmido es liberado entonces a la celula mamffera. En caso de que la celula bacteriana muerta contenga un plasmido que codifique una molecula de acido nucleico funcional, el plasmido opcionalmente contendra un elemento regulador y/o un elemento indicador y la celula mamffera preferiblemente expresara el acido nucleico funcional. El metodo de administracion del acido nucleico funcional puede ser in vitro o in vivo.

Por lo tanto, en un aspecto, un metodo para administrar un acido nucleico funcional implica el uso de celulas bacterianas muertas, que comprende acido nucleico funcional libre de plasmido. En este sentido, los acidos nucleicos funcionales se empaquetan directamente en las celulas bacterianas muertas, pasando a traves de la membrana intacta de la celula bacteriana sin usar constructos de expresion basados en plasmidos ni maquinas de expresion de una celula hospedante. En una realizacion, por lo tanto, un metodo para administrar el acido nucleico funcional comprende (a) proveer una pluralidad de celulas bacterianas muertas intactas en un veldculo farmaceuticamente aceptable, en donde cada celula bacteriana de la pluralidad abarca un acido nucleico funcional libre de plasmido y (b) poner las celulas bacterianas intactas de la pluralidad en contacto con celulas mamfferas, de modo tal que las celulas mamfferas fagociten a las celulas bacterianas muertas de la pluralidad, mediante lo cual el acido nucleico funcional es liberado al citoplasma de las celulas diana.

El calificador “libre de plasmido” indica la ausencia de un constructo, tal como un plasmido o un vector vmco, para expresion in situ de un ARN regulador.

Direccionamiento de celulas bacterianas muertas hacia celulas mai^eras espedficas

En otro aspecto, se describe la administracion dirigida mediada que emplea un ligando biespedfico. El ligando pone en contacto una celula bacteriana muerta con una celula mamffera diana, de modo tal que la celula mamffera fagocita a la celula bacteriana muerta, incluida la carga de la celula bacteriana muerta.

En una realizacion, el metodo de administracion dirigida es un metodo de administracion de un acido nucleico terapeutico que comprende poner en contacto ligandos biespedficos con celulas bacterianas muertas que contienen una secuencia de acido nucleico terapeutico y celulas mamfferas no fagodticas. Los ligandos biespedficos causan que las celulas bacterianas intactas se unan a las celulas mamfferas, y que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas. Las celulas mamfferas pueden luego producir un producto de expresion del acido nucleico terapeutico.

La eficiencia de la administracion del acido nucleico se refiere al numero de copias de ADN plasmfdico que portan las celulas bacterianas muertas. Se sabe que un cuello de botella de administracion de acido nucleico es que >99% del ADN internalizado es degradado en el endosoma o lisosoma, sin alcanzar el citoplasma de la celula diana. Como partfculas no vivas, se espera que las celulas bacterianas muertas carezcan de funciones desestabilizantes o perturbadoras de la membrana endo-lisosomica de las celulas diana y es probable que posean mecanismos sofisticados para permitir que el ADN internalizado escape de la membrana endo-lisosomica. De conformidad con la presente invencion, por lo tanto, se prefieren las celulas bacterianas muertas que portan por lo menos 70 a 100 copias de ADN plasmfdico. Los inventores han utilizado dichas celulas bacterianas muertas para administracion exitosa de acidos nucleicos. El resultado exitoso sugiere que incluso si la mayona del ADN plasmfdico se degrada en las vacuolas endo-lisosomicas, es posible agobiar el sistema y hacer que cierto ADN escape intacto hacia el citoplasma de las celulas mamfferas.

En otra realizacion, el metodo de administracion dirigida es un metodo de administracion de farmacos que comprende poner en contacto en puente ligandos biespedficos con celulas bacterianas muertas que contienen una

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molecula del farmaco y celulas mai^eras no fagocticas. Los ligandos biespedficos hacen que las celulas bacterianas muertas se unan a las celulas mairnferas, y que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas. La molecula del farmaco se libera luego en el citoplasma de las celulas mamnferas.

Los inventores han descubierto que una concentracion importante del farmaco portada por celulas bacterianas muertas dirigidas a ligandos biespedficos que escapa de la membrana endo-lisosomica ingresa en el citoplasma de las celulas mamfferas. A su vez, las celulas bacterianas muertas son altamente versatiles en su capacidad de empaquetar una gama de farmacos diferentes, p. ej., hidrofilos, hidrofobos y anfifaticos, tales como doxorrubicina, paclitaxel, cisplatino, carboplatino, 5-fluorouracilo, irinotecan. Todos estos farmacos son facilmente empaquetados en celulas bacterianas muertas en concentraciones terapeuticamente significativas.

En otra realizacion, el metodo de administracion dirigida es un metodo de administracion de acido nucleico funcional que comprende poner en contacto ligandos biespedficos con (a) celulas bacterianas muertas que contienen una molecula de acido nucleico funcional o un plasmido comprendido por un segmento que codifica una molecula de acido nucleico funcional y (b) celulas mamfferas diana. Los ligandos biespedficos causan que las celulas bacterianas muertas se unan a las celulas mamfferas, y que las celulas bacterianas muertas sean fagocitadas por las celulas mamfferas. Una vez que la celula bacteriana muerta queda fagocitada, la molecula de acido nucleico funcional es liberada al citoplasma de la celula diana o expresada por la celula diana.

Estos metodos de administracion dirigida se pueden llevar a cabo in vivo o in vitro, o tanto in vivo como in vitro. El contacto entre un ligando biespedfico, la celula bacteriana muerta y la celula mamffera puede ocurrir en una serie de formas diferentes. Para administracion in vivo, es preferible administrar una celula bacteriana muerta que ya tenga el ligando biespedfico unido a ella. Por lo tanto, la celula bacteriana muerta, el ligando y la celula diana se ponen en contacto cuando la celula bacteriana muerta dirigida al ligando biespedfico llega a la celula diana in vivo. Alternativamente, el ligando biespedfico y la celula bacteriana muerta se pueden administrar por separado in vivo.

El contacto entre los ligandos biespedficos, las celulas bacterianas muertas y las celulas mamfferas tambien puede ocurrir durante una o mas incubaciones in vitro. En una realizacion, los tres elementos se incuban juntos a la vez. Alternativamente, se pueden llevar a cabo incubaciones en etapas. En un ejemplo de un planteamiento en etapas, las celulas bacterianas muertas y los ligandos bi-espedficos se incuban primero juntos para formar las celulas bacterianas muertas dirigidas al ligando biespedfico, que luego se incuban con las celulas diana. En otro ejemplo, los ligandos biespedficos se incuban primero con celulas diana, seguidos de incubacion con celulas bacterianas muertas. Una combinacion de una o mas incubaciones in vitro y administraciones in vivo tambien pueden poner en contacto ligandos biespedficos, celulas bacterianas muertas y celulas diana mai^eras.

Los inventores descubrieron que el planteamiento de administracion dirigida es ampliamente aplicable a una gama de celulas mamfferas, incluidas celulas que normalmente son resistentes a adhesion espedfica y endocitosis de celulas bacterianas muertas. Por ejemplo, los ligandos de anticuerpos biespedficos con especificidad anti-O- polisacarido en una rama y especificidad hacia el receptor anti-HER2, receptor anti-EGF o receptor anti-androgenos en la otra rama une de manera eficiente celulas bacterianas muertas con los receptores respectivos en una gama de celulas no fagodticas diana. Estas celulas incluyen celulas de cancer de pulmon, ovario, cerebro, mama, prostata y piel. Asimismo, la union eficiente precede a la endocitosis rapida de las celulas bacterianas muertas por cada una de las celulas no fagodticas.

Las celulas diana de la invencion pueden incluir cualquier celula en la cual se pueda introducir un acido nucleico terapeutico, farmaco o acido nucleico funcional. Las celulas diana deseables se caracterizan por expresion de un receptor de la superficie celular que, tras la union de un ligando, facilita la endocitosis. Las celulas diana preferidas son no fagodticas, lo que significa que las celulas no son fagocitos profesionales, tales como los macrofagos, las celulas dendnticas y los linfocitos agresores naturales (NK). Las celulas diana preferidas son tambien mamfferas.

Los metodos de administracion utilizados en la invencion se pueden emplear con el proposito de tratar afecciones. Los terminos “tratamiento”, “tratar” y similares hacen referencia a obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en terminos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o su smtoma y/o puede ser terapeutico en terminos de una estabilizacion parcial o completa o cura de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento” cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamffero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que ocurra la enfermedad o el smtoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o el smtoma, pero que todavfa no ha sido diagnosticado por padecerlo; (b) inhibir el smtoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el smtoma de la enfermedad, es decir, causar la regresion de la enfermedad o el smtoma.

Uso de acidos nucleicos funcionales para superar la resistencia a los farmacos y tratar la enfermedad

En otro aspecto, se describe un metodo para superar la resistencia a los farmacos y tratar una enfermedad, tal como cancer o sida, en un sujeto a traves del uso de acidos nucleicos funcionales. El metodo comprende (a) proporcionar una celula bacteriana muerta intacta que contiene una molecula de acido nucleico funcional o un plasmido que comprende un segmento que codifica una molecula de acido nucleico funcional, en donde la molecula de acido nucleico funcional dirige el gen o la transcripcion de una protema que promueve resistencia al farmaco, (b) poner en

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contacto la celula bacteriana muerta con una celula mairnfera diana, de modo tal que la celula mam^era fagocite a la celula bacteriana muerta, y (c) administrar un farmaco a la celula marnfera diana. Preferiblemente, la etapa (c) se lleva a cabo despues de las etapas (a) y (b), para permitir que el acido nucleico funcional disminuya la resistencia al farmaco antes de la administracion del farmaco. La administracion del farmaco y la introduccion del acido nucleico funcional pueden ocurrir de forma consecutiva, en cualquier orden, o en forma simultanea.

Los farmacos pueden administrarse por cualquier metodo. Por ejemplo, los farmacos pueden administrarse por via oral, parenteral (incluidas las vfas subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y por infusion), topica, transdermica o por inhalacion. El modo de administracion y la dosis adecuados de cada farmaco podran ser facilmente determinados por el experto en la tecnica medica.

Si bien la administracion del farmaco puede ocurrir por cualquier medio convencional, se prefiere la administracion mediante celulas bacterianas muertas. En este sentido, los inventores han descubierto que las mismas celulas mai^eras pueden ser re-transfectadas exitosamente por celulas bacterianas muertas intactas que son empaquetadas con diferentes cargas. Por ejemplo, las celulas bacterianas empaquetadas con plasmido que codifican siRNA pueden transfectar una celula mam^era, despues de lo cual las bacterias muertas empaquetadas con farmaco pueden administrarse a la misma celula mam^era. Este descubrimiento fue sorprendente, e indica que los procesos intracelulares asociados con la ruptura de celulas bacterianas muertas, la liberacion endosomica de la carga a dianas intracelulares permanece totalmente funcional despues de la primera tanda de transfeccion y administracion de carga.

El farmaco puede empaquetarse en una celula bacteriana muerta separada del acido nucleico funcional o plasmido que codifica el acido nucleico funcional.

Alternativamente, el farmaco puede empaquetarse en la misma celula bacteriana muerta como la molecula de acido nucleico funcional o el plasmido que codifica la molecula de acido nucleico funcional. Ciertos farmacos pueden interactuar con acidos nucleicos e impedir el empaquetado conjunto de farmaco y acido nucleico en la misma celula bacteriana muerta. Por ejemplo, se sabe que la doxorrubicina interactua con el ADN.

Empaquetado de acido nucleico funcional en celulas bacterianas muertas

El acido nucleico funcional puede empaquetarse directamente en celulas bacterianas muertas intactas. El proceso sortea las etapas previamente requeridas de, por ejemplo, clonar acidos nucleicos que codifican ARN regulador en plasmidos de expresion, transformando bacterias madre que producen minicelulas con los plasmidos y generando minicelulas recombinantes. En cambio, el acido nucleico funcional libre de plasmido puede empaquetarse directamente en las celulas bacterianas muertas co-incubando una pluralidad de celulas bacterianas muertas intactas con acido nucleico funcional en un tampon.

En algunas realizaciones, la co-incubacion puede implicar la agitacion moderada, mientras que en otras, la co-

incubacion es estatica. Una co-incubacion de aproximadamente una hora es suficiente, pero periodos mas cortos,

tales como aproximadamente media hora, tambien pueden ser eficaces. En una realizacion, el tampon comprende

disolucion salina tamponada, por ejemplo una disolucion tamponada con fosfato 1X. La disolucion salina tamponada

puede ser en la forma de gelatina. En otra realizacion, la co-incubacion se lleva a cabo a una temperatura de

aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C; aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C;

aproximadamente 25°C; o aproximadamente 37°C. En otros aspectos, la co-incubacion puede comprender 1 1 1 1

aproximadamente 10, 10, 10, 10 , 10 , 10 o 10 celulas bacterianas muertas. Los parametros espedficos de

temperatura, tiempo, tampon, concentracion de minicelulas, etc. se pueden optimizar para una combinacion

particular de condiciones.

Carga de bacterias muertas con farmacos

Preferiblemente, las celulas bacterianas muertas utilizadas en la invencion contienen una cantidad suficiente de farmaco para ejercer el efecto fisiologico o farmacologico del farmaco en una celula diana. Ademas, preferiblemente los farmacos contenidos dentro de las celulas bacterianas muertas son heterologos, o extranos a las celulas bacterianas muertas, lo que significa que las celulas bacterianas muertas normalmente no producen el farmaco.

Tanto los farmacos hidrofilos como los hidrofobos pueden ser empaquetados en celulas bacterianas muertas creando un gradiente de concentracion del farmaco entre un medio extracelular que contiene celulas bacterianas muertas y el citoplasma de celulas bacterianas muertas. Cuando el medio extracelular contiene una concentracion mayor que el citoplasma de las celulas bacterianas muertas, el farmaco naturalmente se mueve hacia este gradiente de concentracion, hacia el citoplasma de las celulas bacterianas muertas. Cuando el gradiente de concentracion se revierte, no obstante, el farmaco no se mueve de las celulas bacterianas muertas.

Para cargar celulas bacterianas muertas con farmacos que normalmente no son solubles en agua, los farmacos inicialmente pueden disolverse en un disolvente apropiado. Por ejemplo, el Paclitaxel puede disolverse en una mezcla 1:1 de etanol y cremophore EL (aceite de ricino polietoxilado), seguido de dilucion en PBS para lograr una disolucion de Paclitaxel parcialmente diluida en medio acuoso y que porta cantidades mmimas del disolvente organico para asegurar que el farmaco permanezca en disolucion. Las celulas bacterianas muertas pueden

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incubarse en este medio final para la carga del farmaco. Por lo tanto, los inventores descubrieron que incluso los farmacos hidrofobos pueden difundirse en el citoplasma de celulas bacterianas muertas para lograr una carga del farmaco citoplasmica terapeuticamente significativa. Esto es inesperado porque la membrana de la celula bacteriana muerta esta compuesta por una bicapa hidrofoba, que se esperana que evitara la difusion de las moleculas hidrofobas en el citoplasma.

Otro metodo para cargar celulas bacterianas muertas con un farmaco implica cultivar una celula bacteriana madre recombinante bajo condiciones en las que la celula bacteriana madre transcribe y traduce un acido nucleico que codifica el farmaco, de modo tal que el farmaco es liberado al citoplasma de la celula bacteriana madre. Por ejemplo, un agrupamiento de genes que codifica la ruta biosintetica celular de un farmaco deseado puede clonarse y transferirse a una cepa bacteriana madre capaz de producir celulas bacterianas muertas. La transcripcion y traduccion genetica del agrupamiento de genes resulta en la biosmtesis del farmaco dentro del citoplasma de las celulas bacterianas madre, rellenando el citoplasma bacteriano con el farmaco. Cuando la celula bacteriana madre se divide y forma celulas bacterianas muertas de progenie, las celulas bacterianas muertas tambien contienen el farmaco en su citoplasma. Las celulas bacterianas muertas pre-empaquetadas se pueden purificar mediante cualquier procedimiento de purificacion de celulas bacterianas conocido en la tecnica y anteriormente descrito.

De modo similar, otro metodo de carga de celulas bacterianas muertas con un farmaco implica cultivar una celula bacteriana muerta recombinante que contenga un plasmido de expresion que codifique el farmaco bajo condiciones tales que el gen que codifica el farmaco se transcriba y traduzca dentro de la celula bacteriana muerta.

Pureza de las composiciones

Las celulas bacterianas muertas utilizadas en la invencion son sustancialmente libres de celulas bacterianas madre contaminantes, es decir, celulas bacterianas vivas. Por lo tanto, las composiciones de la invencion que contienen celulas bacterianas muertas preferiblemente contienen menos de aproximadamente 1 celula bacteriana madre contaminante por 107 celulas bacterianas muertas, mas preferiblemente contienen menos de aproximadamente 1 celula bacteriana madre contaminante por 108 celulas bacterianas muertas, incluso mas preferiblemente contienen menos de aproximadamente 1 celula bacteriana madre contaminante por 109 celulas bacterianas muertas, incluso mas preferiblemente contienen menos de aproximadamente 1 celula bacteriana madre contaminante por 1010 celulas bacterianas muertas y lo mas preferiblemente contienen menos de aproximadamente 1 celula bacteriana madre contaminante por 1011 celulas bacterianas muertas.

Una composicion que consiste esencialmente en celulas bacterianas muertas y, opcionalmente, acidos nucleicos opcionalmente terapeuticos, farmacos, acidos nucleicos funcionales y ligandos biespedficos, de la presente invencion (es decir, una formulacion que incluye dichas celulas bacterianas muertas con otros constituyentes que no interfieren de manera indebida con la calidad de administracion de la composicion) se puede formular en modo convencional, usando uno o mas vehmulos o excipientes farmaceuticamente aceptables.

Las celulas bacterianas en cultivo se pueden inactivar usando una serie de procedimientos diferentes que incluyen (a) tratamiento con un antibiotico al que es sensible la cepa bacteriana, (b) tratamiento con calor debajo del nivel al cual ocurre la coagulacion de la protema, y (c) tratamiento con disolventes como etanol a una concentracion que no resulte en la perdida de integridad de las celulas bacterianas y cierre de canales de protemas en la membrana bacteriana. El proceso de inactivacion de la celula bacteriana se conoce en la tecnica de fabricacion de vacunas bacterianas muertas. Preferiblemente, el proceso de inactivacion de celulas bacterianas no implica la desnaturalizacion extensa de la configuracion espacial de las moleculas; es decir, el proceso preferiblemente conserva la estructura tridimensional de las macromoleculas de las celulas bacterianas, tal como protemas, polisacaridos y lfpidos. Los expertos en la tecnica conocen otros procedimientos que se pueden emplear para obtener la preparacion bacteriana muerta definida anteriormente.

La ausencia de desnaturalizacion de la membrana en una preparacion bacteriana muerta se puede verificar por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, el ADN plasmfdico se puede extraer de celulas bacterianas muertas recombinantes y secuenciarse para determinar la integridad del ADN. El contenido de plasmido se puede determinar por PCR en tiempo real y compararse con el contenido de plasmido en el mismo numero de celulas bacterianas recombinantes. Si la integridad de la membrana no se conservo en el proceso de inactivacion, entonces se esperana que ocurra la perdida de plasmido. Ademas, si un proceso de inactivacion dano el plasmido recombinante, entonces se observanan aberraciones en la secuencia de ADN. Se puede realizar tambien una prueba en donde el mismo numero de celulas bacterianas vivas e muertas se verifique para la capacidad de empaquetar un farmaco terapeutico.

Las impurezas tales como medios, tampones, sedimentos celulares, ampollas de membrana, acidos nucleicos libes y endotoxina libre se pueden eliminar de una preparacion bacteriana muerta por filtracion, tal como filtracion a traves de una filtracion de flujo cruzado de 0,2 pm. Se prefiere un tamano de poro de filtro de aproximadamente 0,2 pm porque los contaminantes en general son mas pequenos que de 0,2 pm. Por lo tanto, el uso de dicho tamano de poro del filtro permite que los contaminantes sean filtrados, y que las celulas bacterianas muertas intactas sean retenidas. La filtracion puede ser filtracion atenuada o filtracion de flujo cruzado. La filtracion de flujo cruzado tiene la

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ventaja de menos taponamiento del filtro. Ademas, es preferible realizar etapas de lavado con intercambio de tampon, que tambien pueden emplear un tamano de poro del filtro de aproximadamente 0,2 pm.

Rutas de administracion y forma de las composiciones

Las composiciones para uso de la invencion se pueden administrar mediante varias rutas y varios sitios en el cuerpo de un mairnfero, para lograr el efecto(s) deseado, ya sea local o sistemicamente. La administracion se puede lograr, por ejemplo, por administracion oral, por aplicacion de la formulacion a una cavidad corporal, por inhalacion o insuflacion, o por administracion parenteral, intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepatica, peritoneal, subcutanea, intratumoral o intradermica. El modo y el sitio de administracion dependen de la ubicacion de las celulas diana. Por ejemplo, las celulas de fibrosis qmstica pueden dirigirse de manera eficiente por administracion inhalada de las celulas bacterianas muertas dirigidas. De manera similar, las metastasis tumorales pueden ser mas eficientemente tratadas mediante administracion intravenosa de celulas bacterianas muertas dirigidas. El cancer de ovario primario se puede tratar mediante administracion intraperitoneal de celulas bacterianas muertas diana.

Las composiciones se pueden presentar en forma de dosificacion unitaria, p. ej., en ampollas o viales, o en envases de multiples dosis con o sin agregado de conservantes. La composicion puede ser una disolucion, una suspension o una emulsion en vehnculos oleosos o acuosos, y puede contener agente de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizacion y/o dispersion. Una disolucion adecuada es isotonica con la sangre del receptor y se ilustra mediante disolucion salina, disolucion de Ringer y disolucion de dextrosa. Alternativamente, las composiciones pueden ser en forma de polvo liofilizado, para reconstitucion con un vehnculo adecuado, p. ej., disolucion salina esteril, agua apirogena o disolucion salina fisiologica. Las composiciones pueden ademas estar en la forma de una preparacion de deposito. Dichas composiciones de larga duracion pueden administrarse por implantacion (por ejemplo, subcutanea o intramuscular) o por inyeccion intramuscular.

Con respecto a la administracion de las composiciones de la invencion, los terminos “individuo”, “sujeto”, “hospedante” y “paciente”, utilizados de manera intercambiable en este documento, se refieren a cualquier sujeto marnffero para el cual se desea un diagnostico, tratamiento o terapia. En una realizacion preferida, el individuo, sujeto, hospedante o paciente es un ser humano. Se pueden incluir otros sujetos, pero no se limitan a, ganado, caballos, perros gatos, cobayas, conejos, ratas, primates y ratones.

Esquemas de administracion

En general, las composiciones descritas en este documento se pueden usar en dosis apropiadas definidas por pruebas de rutina, para obtener un efecto fisiologico optimo y a la vez minimizar cualquier toxicidad potencial. El esquema de dosificacion puede seleccionarse de acuerdo con una diversidad de factores que incluyen la edad, el peso, el sexo, el estado medico del paciente; la gravedad de la afeccion que se ha de tratar, la ruta de administracion y el funcionamiento renal y hepatico del paciente.

La precision optima para lograr concentraciones de celula bacteriana muerta y terapeuticas dentro del intervalo que produce eficacia maxima con efectos colaterales mmimos puede requerir un esquema basado en la cinetica de la celula bacteriana muerta y la disponibilidad terapeutica para sitios diana y celulas diana. La distribucion, equilibrio y eliminacion de una celula bacteriana muerta o terapeutica se pueden considerar al determinar la concentracion optima para un esquema de tratamiento. Las dosis de las celulas bacterianas muertas y terapeuticas se pueden ajustar cuando se emplean en combinacion para lograr efectos deseados.

Asimismo, la administracion de la dosis de las composiciones se puede optimizar utilizando un sistema de modelado de farmacocinetica/farmacodinamia. Por ejemplo, se pueden escoger uno o mas esquemas de dosificacion y usarse un modelo de farmacocinetica/farmacodinamia para determinar el perfil de farmacocinetica/farmacodinamia de uno o mas esquemas de dosificacion. Luego, se puede seleccionar uno de los esquemas de dosificacion para administracion que logre la respuesta de farmacocinetica/farmacodinamia deseada en funcion del perfil de farmacocinetica/farmacodinamia particular. Vease, p. ej., el documento WO 00/67776.

Concretamente, las composiciones se pueden administrar por lo menos una vez por semana durante el curso de varias semanas. En una realizacion, las composiciones se administran por lo menos una vez por semana durante varias semanas a varios meses.

Mas espedficamente, las composiciones se pueden administrar por lo menos una vez al dfa durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 dfas. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar aproximadamente una vez al dfa, aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30 o 31 dfas o mas.

Las composiciones pueden alternativamente administrarse aproximadamente una vez por semana, aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas o mas. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar por lo menos una vez por semana durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas o mas.

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Alternativamente, las composiciones se pueden administrar aproximadamente una vez por mes, aproximadamente una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o mas.

Las composiciones se pueden administrar en una dosis diaria unica, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas dos, tres o cuatro veces al dfa.

En el metodo en el que las celulas bacterianas muertas se administran antes de un farmaco, la administracion del farmaco puede ocurrir en cualquier momento de varios minutos a varias horas despues de la administracion de las celulas bacterianas muertas. El farmaco puede alternativamente administrarse en cualquier momento de varias horas a varios dfas, posiblemente varias semanas a varios meses despues de las celulas bacterianas muertas.

Mas espedficamente las celulas bacterianas muertas se pueden administrar por lo menos aproximadamente 1 ,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas antes del farmaco. Asimismo, las celulas bacterianas muertas se pueden administrar por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 dfas antes de la administracion del farmaco. Incluso en otra realizacion, las celulas bacterianas muertas se pueden administrar por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas o mas antes del farmaco. En otra realizacion, las celulas bacterianas muertas se pueden administrar por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses antes del farmaco.

En otra realizacion, la celula bacteriana muerta se administra despues del farmaco. La administracion de la celula bacteriana muerta puede ocurrir en cualquier momento de varios minutos a varias horas despues de la administracion del farmaco. La celula bacteriana muerta puede alternativamente administrarse en cualquier momento de varias horas a varios dfas, posiblemente varias semanas a varios meses despues del farmaco.

Ejemplos

Ejemplo 1. Las bacterias muertas se empaquetan exitosamente con el farmaco quimioterapeutico doxorrubicina.

[0182] Se cultivo la cepa de Salmonella typhimurium durante una noche en caldo de soja tripticasa (TSB). La cepa luego se subcultivo (1:100) en 100 ml de TSB y se desarrollo hasta la fase logantmica temprana (OD600 = 0,406). El recuento bacteriano se enumero disponiendo en placas de agar TSB diluciones en serie y realizando un recuento de colonias despues de la incubacion durante toda la noche. El resultado demostro que el cultivo portaba ~ 5 x 108 bacterias/ml. Para inactivar las celulas bacterianas, se incubaron 10 ml de cultivo durante 4 horas con 500 pg/ml de gentamicina y 500 pg/ml de cloranfenicol. Una muestra de 100 pl se dispuso en una placa de agar TSB para determinar que las celulas bacterianas habfan sido muertas.

Las celulas bacterianas (1 x 109) se incubaron con 60 pg/ml de doxorrubicina durante 2 horas a 37°C en 1 ml 1 x BSG (gelatina y disolucion salina tamponada). El exceso de farmaco se elimino de las celulas bacterianas en seis etapas de lavado repetidas en donde las celulas se centrifugaron a 13.200 rpm durante cinco minutos seguidas de resuspension en disolucion de BSG fresca.

La doxorrubicina se extrajo de las bacterias muertas despues de cinco ciclos de agitar en vortex y de sonicacion en presencia de HCl-alcohol isopropflico 97 mM (HC1- IP A). Las muestras luego se diluyeron en un volumen equivalente de agua y se repitieron los cinco ciclos. Despues de centrifugar a 13.200 rpm durante 5 min hasta obtener sedimentos, los sobrenadantes se recogieron para cuantificacion del farmaco por HPLC. La fase movil comprendfa formiato de amonio 100 mM + 0,05% trietilamina (pH, 3.5): MQ:MeCN (acetonitrilo) en una relacion de 28:42,30. La fase estacionaria comprendfa una columna Lichrosphere RP 18 (MERCK) a 40°C. La deteccion fue por excitacion a 480 nm y emision a 550 nm, usando un sistema Shimadzu 10AVP que comprendfa un automuestreador, desgasificador de disolvente, bomba cuaternaria, calentador de columna (40°C) y detector de fluorescencia, version de ejecucion 7.2 SPI rev B software (Shimadzu Corporation).

El area debajo del pico se interpolo en una curva estandar para doxorrubicina y los resultados demostraron que se empaquetaron ~ 2 pg de doxorrubicina en 1 x 109 celulas bacterianas muertas.

Ejemplo 2. Regresion/estabilizacion de tumores despues de la administracion intravenosa de celulas bacterianas muertas empaquetadas con doxorrubicina dirigidas a EGFR en ratones lampinos que portan xenoinjertos de cancer de mama humanos.

Este ejemplo demuestra que las celulas muertas intactas empaquetadas con doxorrubicina y dirigidas al ligando pueden efectuar la regresion de xenoinjertos de tumores de celulas de cancer de mama humanos establecidos en ratones lampinos hembra de 6 semanas de vida.

Como se ha descrito en el Ejemplo 1, se empaquetaron celulas muertas de S. typhimurium con el farmaco quimioterapeutico doxorrubicina y se purificaron de endotoxina libre por centrifugacion repetida y eliminacion del sobrenadante.

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Un anticuerpo biespedfico que porta especificidades anti-LPS y EGFR antihumanas se construyo de la siguiente manera. Se selecciono un anticuerpo monoclonal anti-EGFR debido a que las celulas de xenoinjertos eran celulas de cancer de mama humanas MDA-MB-468 que se sabe sobre-expresan el receptor de EGF en la superficie celular. Se construyo un BsAb con especificidades anti-S. Typhimurium O-antigeno y anti-EGFR, como se describe en el documento PCT/US2004/041010. En smtesis, el anticuerpo biespedfico (BsAb) se construyo uniendo un anticuerpo monoclonal anti-5. Typhimurium O-antfgeno (MAb) (IgGl; Biodesign) y un MAb dirigido contra un receptor de la superficie de celulas diana que es EGFR anti-humano de raton (IgG2a; Oncogen). Los dos anticuerpos se reticularon mediante sus regiones Fc usando protema recombinante purificada A/G (Pierce Biotechnology). En smtesis, la protema A/G (100 ng/ml de concentracion final) se anadio a 0,5 ml de una disolucion premezclada que conterna 20 pg/ml de cada uno de anti-S. Typhimurium O-antfgeno y EGFR Mab anti-humanos, y se incubo durante la noche a 4°C. El exceso de anticuerpos se elimino por incubacion con esferas magneticas conjugadas a protema G y mezclando moderadamente a temperatura ambiente durante 40 min. Despues de la separacion magnetica de las esferas, el complejo de protema A/G-BsAb se incubo con 109 celulas bacterianas muertas empaquetadas con dox durante 1 h a temperatura ambiente para recubrirlas con anticuerpo mediante la union de la rama Fab espedfica de O-antfgeno a LPS superficial.

Los ratones utilizados en este ejemplo se adquirieron de Animal Resources Centre, Perth, WA, Australia, y todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la grna de cuidado y uso de animales de laboratorio, y con la aprobacion del Comite de Etica Animal (Animal Ethics Committee). Los experimentos se realizaron en el establecimiento para animales pequenos acreditado por NSW Agriculture en EnGeneIC Pty Ltd (Sidney, NSW, Australia). Se desarrollaron celulas de adenocarcinoma de mama humanas (MDA-MB-468, ATCC; celulas epiteliales mamarias humanas; no fagodticas) en cultivos de tejido hasta confluencia total en matraces T-75 en medio RPMI 1640 enriquecido con suero de ternero bovino al 5% (GIBCO-BRL Life Technologies, Invitrogen Corporation, Carlsbad, Ca, EE. UU.) y glutamina (Invitrogen) en una atmosfera humidificada de 95% aire y 5% CO2 a 37°C. Se inyectaron subcutaneamente 1 x 106 celulas en 50 ul de medio libre de suero junto con 50 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) entre los omoplatos de cada raton, usando una aguja de calibre 23. Los tumores se midieron dos veces por semana usando un calibrador digital electronico (Mitutoyo, Japon, hasta 0,001 de precision) y se calculo el volumen medio del tumor usando la formula, longitud (mm) x ancho2 (mm) X 0,5 = volumen (mm3). Dieciseis dfas post-implante, los tumores alcanzaron volumenes entre 40 mm3 y 70 mm3, y los ratones fueron aleatorizados a cuatro grupos distintos de cinco por grupo.

El experimento se diseno de la siguiente manera. El grupo 1 (control) recibio una dosis intravenosa de 100 pl de disolucion salina fisiologica esteril. El grupo 2 (control) recibio una dosis intravenosa de doxorrubicina libre (7 mg/kg del peso corporal del raton). El grupo 3 (control) recibio 1 x 108/dosis de bacterias muertas empaquetas con dox (S. typhimuriumDox muerta). El grupo 4 (experimental) recibio 1 x 108/dosis de bacterias muertas empaquetadas con dox dirigidas a EGFR (EGFRS. typhimuriuniDox muerta). Todas las dosis se administraron por via intravenosa, y las dosis se administraron en los dfas 21,28 y 34.

Los resultados demostraron (Figura 1) que egfrs. typhimuriumj)ox muertas fueron altamente eficaces en lograr la regresion/estabilizacion, en comparacion con los tres controles.

Ejemplo 3. Efectos antitumorales despues de la administracion intravenosa de celulas bacterianas muertas empaquetadas con paclitaxel dirigidas a EGFR o empaquetadas con siRNA-protema del huso kinesina en ratones lampinos que portan xenoinjertos de cancer de colon humanos

Este ejemplo considera si las celulas bacterianas muertas intactas empaquetadas con paclitaxel o siRNA pueden inhibir el crecimiento de tumores de celulas de cancer de colon humano in vivo.

Usando los metodos descritos en el Ejemplo, se empaquetaron celulas S. typhimurium muertas con el farmaco quimioterapeutico paclitaxel y se purificaron de endotoxina libre por centrifugacion repetida y eliminando el sobrenadante.

Por separado, se empaqueto siRNA contra la protema del huso kinesina (KSP) en la cepa de S. Typhimurium muerta. KSP, tambien denominada kinesina-5 o Eg5, es una protema motora de microtubulos esencial para la formacion de husos bipolares y la correcta segregacion de cromatidas hermanas durante la mitosis (Enos y Morris, 1990; Blangy et al., 1995; Dagenbach y Endow, 2004). La inhibicion de KSP causa la formacion de husos mitoticos monopolares, activa el punto de control del ensamblaje del huso, y detiene las celulas en la mitosis, lo que provoca la muerte celular subsiguiente (Blangy et al., 1995, Mayer et al., 1999; Kapoor et al., 2000; Tao et al., 2005). Las secuencias de oligonucleotidos bicatenarias KSP-siRNA (cadena sentido; 5'-AAC TGG ATC GTA AGA AGG cAg-3') se sintetizaron y empaquetaron en la cepa de S. Typhimurium muerta incubando 1 x 1010 bacterias con 1 pm de siRNA-KSP. La co-incubacion se llevo a cabo en disolucion tamponada con fosfato 1 x (PBS) (Gibco) durante 12 horas a 37°C mezclando moderadamente. Despues de empaquetar las bacterias se sedimentaron y lavaron dos veces con 1 x PBS por centrifugacion durante 10 minutos a 16.200 x g. Las celulas bacterianas se lavaron dos veces en 1 x PBS para eliminar el exceso de siRNA-KSP no empaquetado.

Se construyo un anticuerpo biespedfico que porta especificidades anti-LPS y EGFR antihumanas como se ha descrito en el Ejemplo 2.

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Los ratones utilizados en este ejemplo se adquirieron de Animal Resources Centre, Perth, WA, Australia, y todos los experimented en animales se realizaron de conformidad con la gma de cuidado y uso de los laboratorios animales, y con la aprobacion del Comite de Etica Animal. Los experimentos se realizaron en un establecimiento para animales pequenos acreditado por NSW Agriculture en EnGeneIC Pty Ltd (Sidney, NSW, Australia). Se desarrollaron celulas de cancer de colon humanas (HCT116, ATCC) en cultivo de tejido hasta una confluencia total en matraces T-75 en medio RPMI 1640 enriquecido con 5% suero de ternero bovino (GIBCO-BRL Life Technologies, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) y glutamina (Invitrogen) en una atmosfera humidificada de 95% aire y 5% CO2 a 37°C. Se inyectaron 1 x 106 celulas en 50 ul de medio libre de suero junto con 50 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) subcutaneamente entre los omoplatos en ratones Balb/c nu/nu (n = 8 ratones por grupo) usando una aguja de calibre 23. Los tumores se midieron dos veces por semana usando un calibrador digital electronico (Mitutoyo, Japon, hasta 0,001 de precision), y se calculo el volumen del tumor promedio utilizando la formula, longitud (mm) x ancho2 (mm) X 0,5 = volumen (mm3). Dieciseis dfas post- implante, los tumores alcanzaron volumenes ~200 mm3, y los ratones se aleatorizaron a cuatro grupos distintos de ocho por grupo.

El experimento se diseno de la siguiente manera. El grupo 1 (control) recibio una dosis intravenosa de 100 pl de disolucion salina fisiologica esteril. El grupo 2 (control) bacterias de S. typhimurium muertas dirigidas a EGFR que no portaban ninguna carga terapeutica (G2; egfrs. typhimurium). El grupo 3 (experimental) bacterias de S. typhimurium muertas dirigidas a EGFR empaquetadas con el farmaco quimioterapeutico paclitaxel (G3; egfrs. typh/mur/umpaclitaxel). El grupo 4 (experimental) bacterias S. typhimurium muertas dirigidas a EGFR empaquetadas con siRNA contra la protema del huso kinesina (G4; egfrs. typhimuriumsiRNA-KSp). Los tratamientos se administraron tres veces por semana.

Los resultados demuestran (Figura 2) que ambos tratamientos, es decir S. typh/mur/umpaclitaxel muertas y S. typhimuriumsiRNA-KSp, demostraron efectos antitumorales altamente significativos en comparacion con los dos controles. Por lo tanto, los datos demuestran que las celulas bacterianas muertas intactas empaquetadas con paclitaxel o siRNA inhiben el crecimiento del tumor de cancer de colon humano in vivo.

Ejemplo 4. Uso de tratamiento dual que comprende shRNA mediado por bacterias muertas dirigidas a receptores seguido por la administracion de farmacos mediados por bacterias muertas dirigidas a receptores.

Para demostrar que las bacterias muertas dirigidas a los receptores pueden revertir la resistencia a los farmacos en celulas cancerosas in vivo, llevamos a cabo el siguiente estudio en ratones Balb/c nu/nu. Para celulas de xenoinjertos, utilizamos la lmea celular de cancer de colon humana Caco-2, que es altamente resistente a los farmacos quimioterapeuticos de primera lmea para cancer de colon, tales como irinotecan y 5-fluorouracil (5-FU).

Usando los metodos descritos en el Ejemplo 1, se empaquetaron bacterias muertas S. typhimurium con el farmaco quimioterapeutico irinotecan o 5-FU. El exceso de irinotecan o 5-FU no espedficamente unido a la superficie exterior de las bacterias muertas se elimino por centrifugacion de las celulas bacterianas a 13.200 rpm durante 10 min, y las celulas lavadas se resuspendieron en PBS fresco 1 x. Esta etapa de lavado se repitio.

Las celulas de S. typhimurium muertas empaquetadas con irinotecan o 5-FU se dirigieron al EGFR mediante la union de un anticuerpo biespedfico anti-O-polisacarido/anti-EGFR a la superficie celular bacteriana, como se describio en los ejemplos previos. Se selecciono un anticuerpo monoclonal anti-EGFR porque se sabe que las celulas de xenoinjerto, Caco-2, sobre-expresan EGFR en la superficie celular (Nyati et al., 2004). Las bacterias muertas empaquetadas con el farmaco dirigidas a EGFR se designaron EGFRS.typhimurium5-FU y EGFRS.typhimuriumirino.

Se genero una cepa de S. typhimurium recombinante que porta un plasmido que codifica la secuencia anti- MDR1 shRNA de la siguiente manera. La secuencia MDR-1 shRNA utilizada en este estudio (5'- TCGAAAGAAACCAACTGTCAGTGTAgagtactgTACACTGACAGTTGGTTTCTTTTTTT-3') fue detectada por Wu et al., 2003. La secuencia de shRNA se sintetizo y subclono en el plasmido IMG-800 (Imgenex Corp., San Diego, CA, EE. UU.) de modo tal que la secuencia pudiese expresarse desde el promotor U6 del plasmido. El plasmido porta el origen pUC de replicacion que permite altos numeros de copias de plasmido en las celulas bacterianas. El plasmido recombinante se secuencio para asegurar que la secuencia de shRNA fuese correcta y estuviese en el marco para expresion desde el promotor U6. El plasmido recombinante se transformo en S. typhimurium, y la cepa recombinante designada S. typhimuriunishRNA-MDR1. S. typhimuriumshRNA-MDR1 dirigida a EGFR se construyo conectando el anticuerpo biespedfico anti-O-polisacarido/anti-EGFR a la superficie de las bacterias recombinantes para generar EGFRS. typhimuriumshRNA-MDR1.

Los diversos grupos de ratones (cinco ratonespor grupo) recibieron los siguientes tratamientos: El grupo 1 (control) disolucion salina esteril; el grupo 2 (control) GFRS. typhimuriumshRNA-MDR1; el grupo 3 (control) bacterias muertas empaquetadas con 5-FU dirigidas a EGFR (egfrS. typhimurium5-FU); el grupo 4 (experimental) egfrs. typhimuriumshRNA-MDRi seguido de egfrs. typhimurium5-FU; el grupo 5 (control) bacterias muertas empaquetas con Irino dirigidas a EGFR (EGFRS. typhimuriumirino); el grupo 6 (experimental) egfrs. typhimuriumshRNA-MDR1 seguido de EGFRS. typhimuriumirino; Los grupos 2 a 6 recibieron 1 x 109 celulas bacterianas, y todos los tratamientos fueron por via intravenosa.

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Los resultados demostraron (Figura 3) que como se espera, las celulas Caco-2 permanecieron resistentes despues de los tratamientos con egfrs. typhimuriumirino, egfrs. typhimurium5-FU y EGFRS. typhimuriumshRNA-MDR1. Las celulas que recibieron tratamiento dual, es dedr, egfrs. typhimuriumshRNA-MDR1 seguido de Egfrs. typhimuriumirino (ratones G6) o egfrs. typhimurium5-Fu (ratones G4), demostraron reversion altamente significativa de resistencia a los farmacos y regresion de los tumores. Los datos demuestran que un protocolo de tratamiento dual, p. ej., administracion de shRN mediada por bacterias muertas dirigidas a los receptores seguida por la administracion del farmaco quimioterapeutico mediada por bacterias dirigidas al receptor, es altamente eficaz para revertir la resistencia a los farmacos en celulas mairnferas no fagocfticas.

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Patente de EE.UU. No. 4,975,278 Patente de EE.UU. No. 4,987,071

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad, en donde la composicion comprende:

(a) una pluralidad de celulas bacterianas muertas, en donde cada celula bacteriana muerta de dicha pluralidad posee una pared celular y/o una membrana celular intacta, que contiene material genetico que es endogeno a las especies bacterianas, y que abarca (i) un acido nucleico terapeutico que codifica un producto, tal como un peptido, polipeptido o protema, cuya produccion se desea en una celula diana, (ii) un farmaco que es una sustancia fisiologica o farmaceuticamente activa que produce un efecto local o sistemico deseado en mairnferos y seres humanos o (iii) una molecula de acido nucleico funcional que, tras la introduccion en una celula hospedante, interfiere espedficamente con la expresion de una protema,

(b) un vehmulo farmaceuticamente aceptable para ello, y

(c) un ligando biespedfico unido a cada celula bacteriana muerta intacta.
2. Una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad, en donde la composicion comprende:

(a) una pluralidad de celulas bacterianas muertas intactas, en donde cada celula bacteriana muerta de dicha pluralidad posee una pared celular y/o una membrana celular intacta, que contiene material genetico que es endogeno a las especies bacterianas, y que abarca (i) un acido nucleico terapeutico que codifica un producto, tal como un peptido, polipeptido o protema, cuya produccion se desea en una celula diana, (ii) un farmaco que es una sustancia fisiologica o farmaceuticamente activa que produce un efecto local o sistemico deseado en mamfferos y seres humanos o (iii) una molecula de acido nucleico funcional que tras la introduccion en una celula hospedante, interfiere espedficamente con la expresion de una protema,

(b) un vehmulo farmaceuticamente aceptable para ello, y

(c) un ligando biespedfico unido a cada celula bacteriana muerta intacta, y en donde el uso comprende

administrar la composicion a una celula, tejido u organo.
3. Una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad administrando una carga a una celula diana in vivo, en donde la composicion comprende:

(a) una pluralidad de celulas bacterianas muertas intactas, en donde cada celula bacteriana muerta de dicha pluralidad posee una pared celular y/o membrana celular intacta, que contiene material genetico que es endogeno a las especies bacterianas, y que abarca una carga seleccionada entre (i) un acido nucleico terapeutico que codifica un producto, tal como un peptido, polipeptido o protema, cuya produccion se desea en una celula diana, (ii) un farmaco que es una sustancia fisiologica o farmaceuticamente activa que produce un efecto local o sistemico deseado en mai^eras y seres humanos y (iii) una molecula de acido nucleico funcional que, tras la introduccion en una celula hospedante, interfiere espedficamente con la expresion de una protema,

(b) un vehmulo farmaceuticamente aceptable para ello, y

(c) un ligando biespedfico unido a cada celula bacteriana muerta intacta, y en donde el uso comprende poner en contacto la celula diana con la composicion, despues de lo cual la celula diana fagocita a una celula bacteriana muerta intacta en la composicion, y despues de ser fagocitada la celula bacteriana muerta intacta libera la carga hacia la celula diana.
4. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas celulas bacterianas muertas contienen un farmaco.
5. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas celulas bacterianas muertas contienen acido nucleico funcional.
6. La composicion para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho acido nucleico funcional esta libre de plasmido.
7. La composicion para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho acido nucleico funcional dirige la transcripcion de una protema que promueve la resistencia a los farmacos, inhibe la apoptosis o promueve un fenotipo neoplasico.
8. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, en donde dicho acido nucleico funcional es un siRNA, shRNA o miRNA que dirige la transcripcion de una protema que promueve la resistencia a los farmacos.
9. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, en donde dicho acido nucleico funcional dirige la transcripcion de P-glucoprotema, MDR-2 o MDR-3.
10. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, en donde dicho acido nucleico funcional dirige la transcripcion de MRP2, BCR-ABL, protema asociada a resistencia STI-571, protema asociada a resistencia pulmonar, ciclo-oxigenasa-2, factor nuclear kappa, XRCC1, ERCC1, GSTP1, p-tubulina mutante o factor de crecimiento.

5 11. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, en donde dicho acido nucleico funcional dirige la

transcripcion de una protema que inhibe la apoptosis.
12. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, en donde dicho acido nucleico funcional dirige una transcripcion de una protema que promueve un fenotipo neoplasico.
13. La composicion para uso segun la reivindicacion 7, que ademas comprende un farmaco.

10 14. La composicion para uso segun la reivindicacion 13, en donde dicho farmaco esta empaquetado en una

celula bacteriana muerta.
15. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicho ligando biespedfico comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
16. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde dicho ligando

15 biespedfico comprende una primera rama que porta especificidad hacia una estructura superficial de la celula

bacteriana y una segunda rama que porta especificidad hacia un receptor superficial de una celula mairnfera no fagodtica.
17. La composicion segun la reivindicacion 2, en donde el acido nucleico terapeutico, tras la introduccion en una celula hospedante, afecta las respuestas inmunes asociadas con el alergeno o agente infeccioso, y en donde la

20 enfermedad es un trastorno inflamatorio mediado por un agente infeccioso o mediado por un alergeno.