ES2610744B2 - Procedimiento para la detección de recombinación homóloga in vivo analizando formas de GFP recombinantes - Google Patents

Procedimiento para la detección de recombinación homóloga in vivo analizando formas de GFP recombinantes Download PDF

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Abstract

Procedimiento para detectar y cuantificar recombinación homóloga in vivo analizando formas de GFP recombinantes. Se emplean células de levadura expresando dos versiones de genes GFP (proteína fluorescente verde) con dos localizaciones subcelulares diferentes, una nucleolar y otra citosólica, gracias a la presencia de: a) un gen integrado en el genoma que expresa GFP fusionada a una proteína de localización nucleolar (RPA190) y b) un gen GFP en un plásmido, expresando una proteína GFP citosólica de baja intensidad. Ambas proteínas GFP-recombinantes se identifican in vivo por microscopía de fluorescencia dada su localización sub-celular.#La recombinación homóloga entre los genes GFP se cuantifica por la frecuencia de pérdida de las formas nucleolar o citosólica frente al total de las células de un cultivo. Es aplicable tanto a análisis de mutaciones en genes que afecten a frecuencia de recombinación (investigación básica) como al estudio de compuestos tóxicos como fármacos o vertidos medioambientales.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la detection de recombination homologa in vivo analizando formas de GFP recombinantes.
Objeto de la invencion
El objeto de la invencion es un procedimiento que permite detectar recombinacion homologa entre dos genes GFP recombinantes presentes en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Antecedentes de la invencion
Existen diferentes formas de analizar la tasa de recombinacion homologa en celulas eucariotas. En el sistema clasico, aplicado a levaduras, se construian genes recombinantes (Aguilera and Klein 1989, Genetics 123: 683) y se utilizaban ensayos Southern blot (o posteriormente PCR) para detectar reorganizaciones genicas producidas por recombinacion. Esto experimentalmente supone hacer al menos una extraction y una electroforesis para analizar una poblacion de acidos nucleicos celular, y combinar esta information con otra sobre cambios en auxotrofias, etc.
Se han descrito diferentes posibilidades de detectar mutaciones que afecten a recombinacion en un determinado gen; asi por ejemplo, el crecimiento en placas sin leucina de cepas que contienen integradas en el genoma formas recombinantes del gen LEU2 interrumpidas. Si se da recombinacion se reconstituye LEU2 y se produce crecimiento (Stirling et al., 2014, Genetics 196: 403-412; Prado and Aguilera 1995, Genetics 139: 109-123; Chavez et al., 2000, The EMBOJ. 19: 5824-5834).
Otra forma de detectar recombinacion es por analisis a posteriori mediante PCR de la posible recombinacion, por el cambio en los tamanos de bandas esperadas. Esta alternativa es mas costosa porque supone analizar un alto numero de muestras con el consiguiente consumo de tiempo y material (enzimas, primers, etc.).
Las nuevas tecnicas como High speed AFM (Atomic Force Microscope) y TIRF-SFM (Total Internal Reflection Fluorescence y Scanning Force Microscope SFM o AFM) y otras relacionadas con Next Generation Sequencing permiten realizar analisis muy detallados de genomas enteros. Pero suponen disponer de esa metodologia y el coste es mucho mayor que la simple visualization de imagenes al microscopio de fluorescencia comparando dos localizaciones sub-celulares.
Description de la invencion
La recombinacion homologa en eucariotas es el proceso mediante el cual dos cadenas de ADN con secuencias altamente conservadas, se combinan entre si en el nucleo de la celula. Es uno de los principales mecanismos de obtencion de variabilidad genetica siendo fundamental en la meiosis, pero tambien en mitosis y en procesos de reparacion de alteraciones en el genoma por diferentes causas, incluyendo el dano en el ADN por agentes externos y consecuentemente muy cancerigenos.
Presentarnos un sistema que permite detectar recombinacion homologa entre dos genes GFP recombinantes presentes en la levadura Saccharomyces cerevisiae:
1 - el plasmido pGFPKIPD (construido en nuestro laboratorio) que expresa la region codificadora de GFP (Green Fluorescent Protein, protema fluorescente verde) con la
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region 3’-UTR (3’-no traducida) del gen KICYC1. Fue construido partiendo del plasmido pGFP-N_FUS (Niedenthal et al., 1996, Yeast 12:773-786) sustituyendo la region 3 '-UTR del gen CYC1 (260 pares de bases) por la de KICYC1 (1194 pares de bases en los sitios Hindlll-Sall). Esta region 3'-UTR es necesaria para el procesamiento 3' del ARN de KICYC1 y permite modular la expresion genica (Seoane et al., 2005, J. Biotechnol 118:149-156). La secuencia de la region 3'-UTR de KICYC1 fue divulgada (Freire-Picos et al., 2001, Yeast 18:1347-1355).
2 - el gen recombinante RPA190-GFP codifica para una protema de fusion entre RPA190 y GFP. El gen RPA190 codifica para la subunidad mayor de la RNA polimerasa I, de localization nucleolar. Por ello la expresion de este gen hibrido produce una protema fluorescente de localizacion nucleolar (Freire-Picos MA et al., 2013, Yeast 30: 267-277).
Las celulas que expresan estas dos formas de GFP presentan un citosol con una fluorescencia verde tenue (debido a la region 3’-UTR de KlCYCI) y un nucleolo con fluorescencia mas intensa, tambien en verde y claramente distinguible por su morfologia en un microscopio de fluorescencia.
La recombination homologa entre los dos genes GFP recombinantes presentes en la levadura puede tener dos consecuencias:
- perdida de la fusion RPA190GFP (nucleolar), y en su lugar se restaura RPAI90 (que no emite fluorescencia) y GFP pasa a ser citosolico, por tanto se visualiza solo fluorescencia citosolica.
- perdida del GFP plasmidico por integration en el genoma de GFP, esta recombinacion se detectaria como perdida de fluorescencia citosolica.
En la figura 1 se explican tanto los genes como los tipos de recombinacion (R) esperables al expresar las distintas combinaciones genicas en levaduras. Tambien se incluye un esquema de la localizacion de la fluorescencia celular que resultaria en cada caso observable por microscopia de fluorescencia con filtro para GFP.
La recombinacion se detecta por la desaparicion de GFP (bien nucleolar o bien citosolico) y se cuantifica por el ratio entre el porcentaje de celulas que pierden la fluorescencia nucleolar y/o citosolica frente al porcentaje de fluorescencia total (N/FT). Este ratio aumenta en las celulas en las que aumenta la frecuencia de recombinacion por la perdida de fluorescencia. Es importante comparar ese ratio con el de celulas control no sometidas a factores que afecten a recombinacion (Figura 2).
El procedimiento con los dos genes recombinantes dando lugar a las dos formas de GFP con diferente localizacion sub-celular se puede aplicar a cualquier celula eucariota, incluyendo celulas vegetales y humanas. Estas ultimas aplicaciones tienen cabida en medicina y biotecnologia.
La ventaja principal de nuestro procedimiento es que permite identificar la recombinacion de forma sencilla, empleando microscopia de fluorescencia y detectando visualmente si se produce la perdida de GFP nucleolar o citosolica (segun figura 1). La cuantificacion se consigue identificando (por microscopia de fluorescencia) y contando visualmente un numero discreto de celulas (20-30) y la comparacion con un control negativo que no expresa la forma citosolica de GFP.
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La disponibilidad de esta microscopia no implica grandes infraestructuras y de un modo rapido se pueden analizar las frecuencias de recombinacion sin tener que hacer extracciones de acidos nucleicos ni analisis moleculares.
Es importante indicar que no se analiza la intensidad de fluorescencia que puede variar dependiendo de las cepas (mutantes o silvestres etc.), sino la posible perdida de la fluorescencia en una de las dos localizaciones sub-celulares presentes indicando no solo la recombinacion sino tambien el sentido preferente (la copia plasmidica de GFP pasa a ser genomica o al reves).
Nuestro sistema difiere completamente de los anteriores tanto en las caracteristicas de las cepas como en la utilization de dos formas variantes de GFP no disponibles comercialmente. Permite detectar visualmente cambios individuales en celulas dentro de una misma poblacion. Asi por ejemplo, en un cultivo celular, a partir de una unica colonia, se pueden estudiar las frecuencias de recombinacion a lo largo del cultivo.
Las condiciones de cultivo son las generales para levaduras a una temperatura de 27-30°C, con una agitation de 200-250 rpm, y en un medio completo sin uracilo para asegurar que se mantiene el plasmido. El volumen del cultivo no es critico (puede ser en matraces de 50 ml o en tubos de cultivo de menor volumen). En funcion del experimento se pueden aumentar auxotrofias o cambiar la temperatura (por ejemplo causar un estres a 37°C) pero esto ya depende de la investigation en la que se quiera aplicar nuestro procedimiento.
Nuestra tecnologia satisfaria la necesidad de poder visualizar y analizar en una poblacion de celulas vivas el cambio en la frecuencia de recombinacion genica muchas veces asociadas a cancer (en el caso de medicina), por la exposition a un agente quimico, medicamento de la industria farmaceutica o en investigaciones con nuevos mutantes cuando se quiera conocer si afectan a recombinacion homologa (investigacion basica).
La tecnologia que proponemos para el analisis de recombinacion in vivo es aplicable a otras celulas eucariotas (tanto animales corno vegetales) puesto que las celulas creceran en su propio sistema.
Description de las figuras
Figura 1. Genes GFP recombinantes expresados en dos cepas de levadura isogenicas. A, cepa empleada como control negativo expresando el plasmido sin GFP que no puede recombinar (-R) con la copia genomica de RPA190GFP. B, cepa expresando el plasmido con GFP y la copia genomica de RPA190GFP.
Posibles recombinaciones genicas (+R). 1 - la recombinacion elimina el GFP plasmidico 2 - la recombinacion elimina el GFP genomico. En todos los casos se muestra el esquema de la celula con las localizaciones de GFP esperables. NI: nucleolar. C: citosolico. N+C: nucleolar y citosolico.
Figura 2. Esquema explicativo del procedimiento a seguir. Las celulas de levadura expresando: las dos formas recombinantes de GFP (a) y un control negativo que no expresa GFP citosolico (b) se cultivan durante 8-12 horas en matraces con medio liquido. El apartado 1 representa a un cultivo en matraz de una cepa silvestre (o no tratada), y el apartado 2 el de una cepa mutada y/o sometida a agentes qtimicos o cambios ambientales. (c) Comprobacion por microscopia de fluorescencia de la localization sub- celular siguiendo los criterios que se indican en la Figura 1. R1 y R2 indican dos posibles sentidos de recombinacion potencialmente detectables (como se recoge en la Figura 1).
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Figura 3. Cuantificacion de los resultados de localization sub-celular de GFP con la puesta en practica del procedimiento empleando las dos cepas:
A - Experimento con la cepa de control negativo expresando el plasmido p-deltaGFP. Solo se detecta fluorescencia nucleolar (1) por la expresion de RP A 190GFP. No hay fluorescencia exclusivamente citosolica (2).
B - Experimento con la cepa expresando ademas GFP citosolico en el plasmido pGFPKIPD. En este caso se detecto perdida de fluorescencia nucleolar. Nucleolar = nucleolar_+ citosolica (1) frente a solo citosolica (2).
Description de una realization preferente
El procedimiento con las dos formas de GFP se puede aplicar a cualquier celula eucariota, incluyendo celulas vegetales y humanas. Estas ultimas aplicaciones tienen cabida en medicina y biotecnologia.
Ejemplos de aplicaciones:
a - Investigation basica: estudiar, in vivo, el aumento de la frecuencia de recombination causada por la mutation de un tercer gen a estudio para determinar si afecta al proceso de recombinacion.
b - Investigacion medioambiental: estudiar, in vivo, el aumento de la frecuencia de recombinacion causada por agentes mutagenos potencialmente presentes en medios acuaticos para de este modo, determinar si un determinado compuesto afecta al proceso de recombinacion con las subsiguientes consecuencias negativas para las celulas.
c - Farmacologico: efecto de un medicamento en la tasa de recombinacion que conlleva un aumento de probabilidades de cancer.
d - Se puede utilizar para el desarrollo de un software para analisis de imagen que permita llevar a cabo el analisis de modo automatico.
Hemos aplicado el sistema en levaduras para ver el resultado en una cepa salvaje BY 4741 que expresa la forma recombinante GFP con localizacion nucleolar (Freire-Picos MA et al., 2013, Yeast 30: 267-277) transformada con un plasmido (pGFPKIPD), construido en nuestro laboratorio, que expresa GFP con la region 3’-UTR del gen KICYC1 y (a causa de esa modification en la UTR) tiene una expresion debil de GFP. Analizamos celulas de un cultivo fresco de cada una de ellas en un medio selectivo para que no se pierda el plasmido. En este caso medio completo CM sin uracilo (‘Ura) (Sherman 2002, Methods Enzymol. 350: 3-41).
Una segunda cepa, basada en la anterior, tambien expresa la forma nucleolar e incluye un plasmido con una delecion de GFP (pdeltaGFP) actuando como control negativo del GFP citosolico (Figura 1). El plasmido pdeltaGFP, se obtuvo en nuestro laboratorio, partiendo del plasmido pGFPCFus (Niedental et al., 1996, Yeast 12:773-786) al que se le elimino la region codificadora de GFP.
Se tomaron unos microlitros de los cultivos celulares y se analizaron en un microscopio Nikon con filtro para GFP. El esquema general de trabajo, incluyendo el control negativo, se muestra en la figura 2. Para el contaje fotografiamos celulas sin fijar que se analizaron detalladamente. Tambien cabe la option de fijar GFP, pero no es imprescindible. Procedimos al analisis siguiendo el criterio de la figura 1B. En ella se muestran ejemplos
de los tipos celulares estudiados y su interpretation. Los resultados se muestran en los graficos de la Figura 3 (A y B).
Conclusiones: el aumento en la fluorescencia citoplasmatica respecto al total indica un 5 10% de recombination homologa en la cepa salvaje al expresar los dos genes GFP
recombinantes. El control negativo permite comprobar que la cepa que solo expresa RPA190-GFP da fluorescencia exclusivamente nucleolar.

Claims (6)

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    ES 2 610 744 A1
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la detection de recombination homologa in vivo caracterizado por utilizar celulas eucariotas que expresan dos formas de la protema GFP: GFP fusionada a una protema de localization nucleolar y GFP citosolica atenuada, esta ultima gracias al gen GFP incluido en un plasmido con la 3'-UTR de KICYC1 que disminuye su nivel de expresion citosolica.
  2. 2. Procedimiento para la deteccion de recombinacion homologa in vivo con formas de GFP recombinantes segun reivindicacion 1 caracterizado por estudiar la recombinacion entre los genes que codifican para estas dos formas de GFP en el transcurso de un cultivo celular, donde esas celulas son levaduras.
  3. 3. Procedimiento para la deteccion de recombinacion homologa in vivo con formas de GFP recombinantes segun revindication 1 y 2 caracterizado porque la recombinacion se comprueba por la desaparicion de la fluorescencia de GFP de una de las dos localizaciones sub-celulares frente al mantenimiento de la otra: es decir, perdida del GFP nucleolar frente al mantenimiento del citosolico o bien por el incremento de GFP nucleolar frente a la perdida del citosolico que se detecta por microscopia optica de fluorescencia y que tambien se puede aplicar a celulas fijadas.
  4. 4. Procedimiento para la deteccion de recombinacion homologa in vivo con formas de GFP recombinantes segun reivindicaciones 1, 2 y 3 caracterizado por un control negativo, una cepa expresando el plasmido pdeltaGFP, (sin fluorescencia citosolica) y construido por deletion de GFP en el mismo vector que el anterior. Este control permite descontar cualquier efecto de fondo al visualizar las celulas en el microscopio.
  5. 5. Uso del procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la deteccion de recombinacion homologa in vivo aplicado en mutantes de levadura para comprobar su efecto en la tasa de recombinacion, o en levaduras silvestres cultivadas en presencia de compuestos potencialmente toxicos que puedan aumentar la tasa de recombinacion.
  6. 6. Uso del procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la deteccion de recombinacion homologa in vivo en cultivos de otras celulas eucariotas, incluidas las humanas.
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