ES2611142T3 - Aceite esencial de orégano para el tratamiento de queratosis cancerosas - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un aceite esencial extraído de plantas del género Origanum, para una utilización terapéutica en el ser humano, en la prevención o el tratamiento dirigido de queratosis en fase de transformación cancerosa, de queratinocitos cancerosos, o de carcinoma proveniente de la transformación de queratosis, caracterizándose dichas queratosis, queratinocitos cancerosos o carcinoma, por células portadoras de mutaciones en el gen p53.

Description

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DESCRIPCION

Aceite esencial de oregano para el tratamiento de queratosis cancerosas

La presente invencion se encuentra en el ambito de la prevencion y del tratamiento terapeutico dirigido de las queratosis actmicas.

La luz solar es una causa demostrada del desarrollo de canceres cutaneos, en particular de carcinomas espinocelulares (SCC) y basocelulares (BCC), que implican a los queratinocitos (Cleaver, J.E., et al. 2002). El espectro ultravioleta (300-400 nm) esta mayoritariamente implicado en este proceso, con un impacto preponderante de los UVB (300-320 nm), aunque tambien los UVA contribuyen al aumento del riesgo. Esta claramente establecido en la bibliograffa que los UV solares inducen lesiones en el ADN del genoma de las celulas epidermicas, en particular de los dfmeros de pirimidina. Estos danos, si no se reparan correctamente, son una fuente de mutaciones que constituyen la primera etapa hacia la tumorigenesis (Marrot, L. et al. 2008).

La protema p53 juega un papel muy importante en la homeostasis cutanea, en particular a nivel del control del ciclo celular. Cuando se inducen lesiones al ADN, la p53 es modificada por diversas fosforilaciones (principalmente en la serina 15) que la activan como factor de transcripcion. Si el nivel de dano es aceptable, la p53 permite la detencion del ciclo celular en fase G0/G1 y estimula las funciones de reparacion del ADN. Por el contrario, si el material genomico esta demasiado alterado, la p53 favorece la activacion de la apoptosis, eliminando de este modo las celulas en riesgo (Kulms, D. et al. 2000).

El gen que codifica la protema p53 es danado habitualmente por los UV y, en ciertos casos, experimenta mutaciones, concretamente mutaciones de CC a TT. Las celulas mutadas de este modo pueden perder la respuesta espedfica a los UV controlada por la protema p53: la reparacion es entonces menos eficaz y la presencia de danos al ADN ya no conlleva parada de la proliferacion: la replicacion puede desarrollarse en presencia de lesiones, aumentando de este modo el riesgo de errores (mutaciones) y conllevando, con el tiempo, una fuerte inestabilidad genetica. Como las celulas mutadas entran menos facilmente en el proceso de apoptosis, terminan por manifestar una ventaja de crecimiento con respecto a las celulas normales. Este proceso de expansion clonal de celulas anormales crea parches precancerosos en los organos afectados (Brash, D. E. 2006).

La apoptosis es un proceso complejo que puede tener diversos ongenes, pero hoy en dfa esta establecido que la mitocondria desempena en el un papel importante. Diferentes senales moleculares, como por ejemplo, el equilibrio Bcl2/Bax con el posible concurso de p53, son capaces de modificar la permeabilidad de la membrana mitocondrial y de favorecer la liberacion de citocromo C en el citosol. Este proceso puede iniciar la activacion de las vfas de las caspasas, enzimas a cargo de la degradacion de ciertos compuestos intracelulares, que conduce de forma irreversible a la apoptosis (Gogvadze et al., 2008). Por otro lado, tambien se ha demostrado que la permeabilizacion de la membrana mitocondrial permitfa el vertido de diferentes moleculas mitocondriales pro-oxidantes en el citosol, permitiendo la induccion de la apoptosis. En el caso de la piel, se ha demostrado que las queratosis y los

carcinomas estaban, a menudo, constituidas por queratinocitos portadores de mutacion en el gen p53 (Taguchi, M.

et al. 1994). Ademas, el analisis de las secuencias en las que se producen estas mutaciones muestra que estas corresponden muy frecuentemente a sitios favorables a la formacion de los dfmeros de pirimidina.

En el plano dermatologico, las queratosis aparecen como zonas de displasia epitelial que se encuentran en las regiones del cuerpo frecuentemente expuestas al sol, y estan asociadas a menudo al fotoenvejecimiento. Entre el 1 % y el 10 % de estas queratosis pueden evolucionar hacia una cancerizacion, con desarrollo de carcinomas escamosos SCC, las demas revierten espontaneamente (Ortonne, J. P. 2002).

Para estudiar los mecanismos de cancerizacion cutanea, es posible utilizar queratinocitos que portan mutaciones en el gen p53. Este es el caso de la lmea HaCat que fue descrita inicialmente por Fusenig et al. (Fusenig, N. E. et al. 1998) y que hoy en dfa se emplea muy frecuentemente en diferentes laboratorios de investigacion en dermatologfa. De este modo por ejemplo, celulas HaCat se integraron en un modelo organotfpico de piel en presencia de

queratinocitos normales: en dicho sistema, fue posible imitar los efectos promotores de la exposicion solar,

demostrando la capacidad de los UVB para estimular la expansion clonal de las celulas HaCat (Mudgil, A. V. et al. 2003) que estan mutadas en p53. Mas recientemente, se ha notificado que celulas HaCat expuestas a los UVA y reimplantadas en ratones podfan estar en el origen de tumores cutaneos (Wischermann, K. et al. 2008). Estos datos sugieren que productos que inducen una citotoxicidad significativamente mas intensa en celulas HaCat con respecto a queratinocitos humanos normales (o a lmeas queratinocfticas no mutadas en p53) senan potencialmente capaces de tratar las queratosis actmicas y tambien de reducir el riesgo de desarrollo de carcinomas, concretamente SCC. Es por esta razon que los trabajos descritos a continuacion consistieron en comparar y comprender el efecto citotoxico de aceites esenciales sobre queratinocitos humanos normales, sobre queratinocitos HaCat (portadores de una mutacion en p53) y sobre queratinocitos inmortalizados derivados de carcinoma.

Los aceites esenciales (AE) y sus productos derivados, gozan actualmente de un exito importante entre los consumidores. Esta predileccion espedficamente por los productos de origen natural (agroalimentaria, cosmetologfa, farmacologfa...) o derivados del concepto de “lo natural”, es la consecuencia de una demanda general

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de productos derivados de una produccion de tipo desarrollo sostenible (qmmica verde, agricultura biologica). Este interes por “lo natural” y sus productos de medicina alternativa (aromaterapia, fitoterapia) tambien encuentra su origen en las limitaciones que presentan los tratamientos de la medicina convencional (resistencias virales, bacterianas, tratamiento contra el cancer...). La ausencia de efectos secundarios demasiado importantes, en el marco de tratamientos aromaterapeuticos bien enmarcados y razonados es una baza fundamental para la utilizacion de los aceites esenciales.

Los aceites esenciales son productos volatiles complejos que poseen un olor potente, caractenstico de la parte de la plante utilizada para su fabricacion. De aproximadamente 800.000 especies vegetales catalogadas, solamente las plantas aromaticas se utilizan para la obtencion de aceites esenciales. Se trata de plantas que poseen suficientes celulas que sintetizan y que secretan estas moleculas aromaticas, es decir aproximadamente 3000 plantas de interes biologico. Aproximadamente 300 aceites esenciales representan la mayor parte de los aceites esenciales comercializados.

Los aceites esenciales corresponden a una mezcla compleja de metabolitos secundarios (moleculas no esenciales para la supervivencia de la planta) sintetizados y secretados por organos especializados: los pelos glandulares epidermicos, las bolsas y canales glandulares (esquizogenos o esquizolisfgenos). Estos metabolitos secundarios estan representados por una muy grande diversidad de moleculas qmmicas. Las mas habituales son los terpenos (mono-, sesqui y diterpeno: C10, C15 y C20 respectivamente) y otras moleculas aromaticas (moleculas dclicas). Todas las funciones qmmicas estan presentes en los aceites esenciales: aldetndos, cetonas, alcoholes, peroxidos, lactonas, eteres, esteres...

Los aceites esenciales se obtienen despues de la hidrodestilacion del material vegetal de la planta aromatica. Hoy en dfa se utilizan diferentes metodos de extraccion, entre los cuales se pueden mencionar la extraccion con CO2 supercntico y la extraccion con disolventes.

Los aceites esenciales poseen un potencial cosmetico y terapeutico reconocido, y se utilizan principalmente por sus actividades bactericidas, virucidas, antioxidantes, antiinflamatoiras, pero tambien por su caracter odorante, susceptible de generar una sensacion de bienestar. Son posibles varios modos de utilizacion de los aceites esenciales: inhalacion, ingestion o aplicacion cutanea. Los aceites esenciales puros no se aplican casi nunca directamente sobre la piel, ya que a menudo son irritantes, sino diluidos en otros aceites vegetales (aceite de oliva, de girasol...). Se realiza una aplicacion cutanea en el marco de masajes, de tratamientos locales (infecciones) o incluso durante la utilizacion de perfumes (constituyentes principales).

Ademas de sus intereses cosmeticos, los aceites esenciales se utilizan tambien en el marco de ciertos tratamientos antibioticos, por su capacidad para aumentar su eficacia, o incluso para luchas contra infecciones de las vfas respiratorias. De la misma forma, una proporcion no despreciable (aproximadamente el 35 %) de los pacientes europeos aquejados de cancer, cuyos tratamientos convencionales no fueron capaces de lograr la curacion, recurrieron a metodos complementarios y alternativos a la medicina convencional (Molassiotis, A. et al. 2005), como la aromaterapia. Ciertos estudios demuestran propiedades anticancerosas y/o antiproliferativas de los aceites esenciales frente a ciertas lmeas cancerosas. De este modo, trabajos recientes demostraron actividades potencialmente anticarcinogenas o antiproliferativas de ciertos aceites esenciales sobre lmeas de celulas leucemicas (Kumar, A. et al. 2008), (Verma, M. et al. 2008), lmeas de cancer del colon (Sharma, P. R. et al. 2008), celulas de cancer de mama (Diaz, C. et al. 2008), celulas de melanoma (Loizzo, M. R. et al. 2008).

Otros trabajos mostraron tambien una actividad antiproliferativa de ciertos compuestos aislados de los aceites esenciales, como alfa santalol sobre una lmea de carcinoma epidermoide (Kaur, M et al. 2005), o incluso la del terpinene-4-ol del aceite esencial de arbol del te sobre celulas de melanomas (Calcabrini, A. et al. 2004).

En lo que respecta a los queratinocitos, se ha estudiado la citotoxicidad de ciertos AE frente a la lmea queratinodtica HaCat mutada en p53 (Koba K. et al. 2009) o a la lmea queratinodtica SVK14 (Itharat, A. et al. 2004).

La solicitud US2008213410 divulga una composicion que comprende aceite esencial de oregano que se utiliza para tratar las verrugas.

La invencion se refiere a un aceite esencial extrafdo de plantas del genero Origanum, o una composicion que comprende dicho aceite, para una utilizacion terapeutica en el ser humano en la prevencion o el tratamiento dirigido de queratosis en fase de transformacion cancerosa, de queratinocitos cancerosos, o de carcinoma proveniente de la transformacion de queratosis, caracterizandose dichas queratosis, queratinocitos cancerosos o carcinoma, por celulas portadoras de mutaciones en el gen p53.

La invencion se refiere, mas particularmente, al aceite esencial extrafdo de las diferentes partes (rafces, tallos, corteza, hojas) de Origanum compactum.

En efecto, de forma sorprendente, los inventores de la presente invencion demostraron que el aceite esencial de oregano compacto (Origanum compactum, familia de las Lamiaceas) y el aceite esencial de palo de rosa (Aniba

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rosaeodora, familia de las Lauraceas), pueden inducir la muerte celular por apoptosis de forma dirigida en queratinocitos humanos cancerosos y mutados en p53 precancerosos con respecto a los queratinocitos normales. Los inventores han demostrado tambien que el efecto citotoxico dirigido esta presente con los constituyentes preponderates de estos aceites esenciales, incluso en ausencia de los otros constituyentes.

Este tratamiento tiene la ventaja, ademas, de no generar inflamacion, no siendo la apoptosis un proceso proinflamatorio.

La invencion se refiere, mas espedficamente, a diferentes aplicaciones terapeuticas de composiciones que comprende aceite esencial de Origanum compactum en la prevencion o el tratamiento de queratosis, mas particularmente de las queratosis en fase de transformacion, precancerosas, o bien cancerosas, concretamente de los carcinomas cutaneos, preferentemente inducidos por UV. Las diferentes aplicaciones terapeuticas de acuerdo con la invencion son preferentemente para ser humano.

Las aplicaciones profilacticas o terapeuticas en el sentido de la presente invencion toman como referencia tratamientos que pretenden preservar o restaurar la salud del paciente, y no tratamientos con pura intencion estetica o cosmetica.

En el marco de esta invencion, las composiciones consideradas son para una utilizacion en el tratamiento o la prevencion de las queratosis en fase de transformacion. Dichas queratosis a tratar contienen celulas tumorales o bien celulas potencialmente tumorales. En esta situacion en efecto, un medico recomendana la escision de las queratosis por razones terapeuticas, dada la evolucion probable o segura hacia un carcinoma. Las queratosis consideradas son, preferentemente, de gran tamano, estas presentan concretamente un importante riesgo de cancerizacion a corto o medio plazo.

La presente invencion tambien se refiere a composiciones para una utilizacion en el tratamiento o la prevencion de la aparicion de queratinocitos cancerosos o de carcinoma proveniente de la transformacion de queratosis, concretamente carcinomas cutaneos inducidos por UV.

Por queratosis (o queratodermia o hiperqueratosis) se entiende una hiperplasia de la capa cornea (Stratum corneum) epidermica. Por queratosis actmica o queratosis solar, se hace referencia a una queratosis inducida por la exposicion a la radiacion solar. En el marco de la presente invencion, las queratosis mas particularmente preferidas para las aplicaciones terapeuticas, son queratosis actmicas. Preferentemente, las queratosis consideradas estan constituidas o comprenden mayoritariamente celulas mutadas en p53.

Debido a su multiplicacion, estas ultimas decadas, existe en efecto una fuerte necesidad de prevencion y/o de tratamiento de las queratosis en fase de transformacion, que presentan un peligro de cancerizacion, y carcinomas derivados de dichas queratosis.

Por prevencion de las queratosis en fase de transformacion, de los queratinocitos precancerosos o cancerosos, o de los carcinomas que provienen de la transformacion de queratosis, se entiende concretamente la obtencion de un efecto preventivo tal que las queratosis no se transformen, o no evolucionen hacia un estadio canceroso.

Por tratamiento de las queratosis en fase de transformacion, de los queratinocitos cancerosos o de los carcinomas que provienen de la transformacion de queratosis, se entiende concretamente un efecto tal que las queratosis cancerosas o bien en fase de transformacion, ya existentes, detengan su crecimiento y reviertan, incluso desaparezcan totalmente o bien vuelvan a un estadio no canceroso, o bien el numero de celulas cancerosas o en fase de transformacion disminuya. La prevencion o el tratamiento de las queratosis son particularmente apropiados en el caso de pieles que hayan estado sometidas a fuertes exposiciones a los UV o exposiciones repetidas a los UV. Estas situaciones son, en efecto, susceptibles de producir mutaciones en p53, el desarrollo de queratosis y su evolucion hacia un estadio canceroso.

La prevencion o el tratamiento de las queratosis cancerosas o en fase de transformacion, en una aplicacion terapeutica de acuerdo con la invencion, es tambien particularmente apropiado en el caso de queratosis en fase de desarrollo, es decir que las queratosis estan ya presentes en la piel y que crecen. En el transcurso de este proceso, el riesgo de evolucion hacia un estadio canceroso esta, en efecto, incrementado. En dicha situacion, las composiciones para la utilizacion terapeutica de acuerdo con la invencion permiten reducir el riesgo de transformacion hacia un estadio canceroso.

Una de las ventajas principales de las composiciones, para la utilizacion en terapia descrita, reside en la accion dirigida de los aceites esenciales de Origanum compactum En efecto, el aceite esencial de Origanum compactum y el de Aniba rosaeodora, o al menos uno de sus constituyentes, presentan, en una ventana de concentracion, una accion dirigida contra celulas precancerosas y cancerosas (mutadas en p53), que pueden ser hiperproliferativas; las celulas normales resultan, a su vez, poco afectadas por la citotoxicidad. Es posible, por lo tanto, tratar el conjunto de la piel de un individuo sin ningun efecto perjudicial para los queratinocitos normales. Esta cualidad es particularmente apreciable en el marco de un tratamiento, ya que permite evitar los efectos secundarios vinculados a

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la terapia; en efecto la toxicidad de este tratamiento frente a celulas normales, concretamente queratinocitos normales, que circundan las zonas a tratar, es escasa.

Debe observarse que los inventores son, en efecto, los primeros en haber realizado un estudio comparado de los impactos de los aceites esenciales sobre queratinocitos mutados en p53 y sobre queratinocitos normales. No se hada obtenido ningun dato relativo a dicha comparacion de citotoxicidad antes de la presente invencion. La accion dirigida de los aceites esenciales y de sus constituyentes no hada sido, por lo tanto, puesta de relieve nunca antes de la invencion. En vista de lo anterior, la presente invencion permite, por lo tanto, una prevencion o un tratamiento dirigido de las queratosis cancerosas o en fase de transformacion.

Por citotoxicidad dirigida en el sentido de la invencion, se entiende que la propiedad de citotoxicidad se induce preferentemente en las celulas hiperproliferativas y/o mutadas en p53 (por ejemplo HaCat y A431) con respecto a las celulas no hiperproliferativas, no mutadas en p53 (por ejemplo HEK001 y NHEK894), es decir que los indices de toxicidad son al menos 1,5 veces mas elevados en las celulas mutadas que en las celulas no mutadas, preferentemente al menos 2 veces mas elevados. Preferentemente, la viabilidad de las celulas no hiperproliferativas, no mutadas sigue siendo del orden del 40 % al menos, incluso del 50 %, preferentemente del 60 %. Los inventores han puesto de manifiesto, en efecto, la existencia de intervalos de concentraciones a las que podfa obtenerse dicha citotoxicidad dirigida, respetando las celulas sanas, concretamente los queratinocitos normales no cancerosos.

Esta accion dirigida permite tambien prever aplicaciones repetidas, debido a que las composiciones no son peligrosas para las celulas sanas.

En las composiciones de acuerdo con la presente divulgacion, el aceite esencial considerado, o el constituyente de aceite esencial considerado, constituye el principio activo de la composicion, o uno de los principios activos, debido a que los inventores pusieron de manifiesto la citotoxicidad dirigida de los aceites esenciales y de sus constituyentes contra queratinocitos mutados. De acuerdo con una realizacion preferida de la presente divulgacion, la composicion contiene al menos uno de los constituyentes del aceite esencial de Origanum compactum o de Aniba rosaeodora, preferentemente esta comprende al menos el 10 %, o al menos el 15 o el 20 % en masa de linalol, de carvacrol o de timol. Preferentemente se trata de una composicion que comprende un aceite esencial o una mezcla de aceites esenciales, tal que la mezcla comprende dichas proporciones de linalol, de carvacrol o de timol. La invencion tambien se refiere a composiciones en las que dichos porcentajes corresponden a porcentajes cromatograficos. En efecto, en la seccion experimental, se estudio la citotoxicidad de dos aceites esenciales, el aceite esencial de oregano compacto (Origanum compactum, familia de las Lamiaceas) y el aceite esencial de palo de rosa (Aniba rosaeodora, familia de las Lauraceas), sobre celulas epidermicas humanas: la lmea queratinodtica HaCat (mutada en p53 e inmortalizada espontaneamente), la lmea A43l (derivada de un carcinoma espinocelular) asf como sobre queratinocitos epidermicos primarios normales humanos.

El aceite esencial de oregano compacto se compone mayoritariamente de dos monofenoles (terpenoides): timol y carvacrol. Este aceite esencial esta recomendado en el marco de tratamiento de colitis, de trastornos pulmonares. Este aceite permite luchar contra la fatiga pero es, sobre todo, un potente bactericida de amplio espectro. Es irritante y hepatotoxico.

El aceite esencial de palo de rosa se compone en un 80 % de linalol. Sus propiedades se utilizan para tratar las pieles irritadas, fatigadas y arrugadas. Tambien es antiinfeccioso (menos potente que el aceite esencial de oregano), inmunoestimulante y tiende a mejorar los comportamientos depresivos. Es muy poco irritante y poco toxico.

La presente divulgacion se refiere, preferentemente, a composiciones que contienen aceite esencial de Origanum compactum y/o de Aniba rosaeodora o al menos uno de sus constituyentes mayoritarios seleccionados entre linalol, timol y carvacrol.

Aunque la actividad citotoxica de un constituyente aislado sea menor que la de un aceite esencial completo, de acuerdo con otra realizacion de la divulgacion, la composicion comprende al menos un constituyente del aceite esencial de Origanum compactum o de Aniba rosaeodora, por ejemplo comprende un aceite esencial que contiene al menos un constituyente del aceite esencial de Origanum compactum o de Aniba rosaeodora.

Los diferentes constituyentes de los aceites esenciales son bien conocidos por el experto en la materia y pueden obtenerse de las compares que comercializan dichos aceites esenciales. El ejemplo 1 de la presente solicitud proporciona una caracterizacion analftica de los diferentes constituyentes detectados en los aceites esenciales de Origanum compactum y de Aniba rosaeodora. Debe observarse que ninguno de estos dos aceites esenciales contiene alfa-santalol.

Se prefiere mas particularmente, en el marco de la presente invencion, que el constituyente de uno de los dos aceites esenciales mencionados, del que se hace uso no sea el oxido de linalol, incluso preferentemente, no sea un oxido.

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Preferentemente, el componente utilizado es un alcohol o un fenol, de manera mas particularmente preferida un terpenol o alcohol terpenico, tal como linalol, terpineol, nerol, geraniol, citronelol, o mentanol, o un terpenoide tal como citral, mentol, carvacrol o timol, otros terpenos tambien previstos son P-cimeno, terpineno, mirceno y beta cariofileno. Son constituyentes mas particularmente preferidos linalol, carvacrol y timol.

De acuerdo con otras realizaciones preferidas de las composiciones para una utilizacion terapeutica tal como se ha descrito anteriormente, el constituyente se selecciona entre 1,8-cineol, terpinoleno, linalol, alfa-terpineol, geraniol, alfa-copaeno, alfa y beta-selineno, benzoato de bencilo, alfa-tujeno, alfa pineno, mirceno, alfa-felandreno, alfa- terpineno, paracimeno, beta-felandreno, gamma-terpineno, timol, carvacrol y beta-cariofileno. Se trata, en efecto, de los constituyentes de uno u otro de los dos aceites esenciales de oregano y de palo de rosa, cuya proporcion en la parte volatil del aceite es superior al 0,5 % (en porcentajes cromatograficos).

De acuerdo con otra realizacion de las composiciones para la aplicacion terapeutica mencionada, se hace uso de un aceite esencial que comprende al menos el 0,5 % en masa o en porcentajes cromatograficos, preferentemente al menos el 1 %, incluso el 5 %, de al menos uno de los siguientes componentes: 1,8-cineol, terpinoleno, linalol, alfa- terpineol, geraniol, alfa-copaeno, alfa y beta-selineno, benzoato de bencilo, alfa-tujeno, alfa pineno, mirceno, alfa- felandreno, alfa-terpineno, paracimeno, beta-felandreno, gamma-terpineno, timol, carvacrol y beta-cariofileno. Preferentemente, se trata de un porcentaje cromatografico, que se aplica a la parte volatil del aceite esencial.

De manera mas particularmente preferida, se hace uso de composiciones que comprenden al menos un constituyente de aceite esencial seleccionado entre los siguientes componentes: linalol, timol y carvacrol. Se trata en efecto, para linalol, del compuesto mayoritario del aceite esencial de palo de rosa, y para timol y carvacrol, de los dos compuestos mayoritarios del aceite esencial de oregano.

De acuerdo con una realizacion preferida, para una utilizacion en terapia tal como se ha descrito, la invencion tambien se refiere a una composicion que consiste en o que comprende un aceite esencial que tiene al menos uno de los siguientes constituyentes: linalol, timol y carvacrol. Preferentemente, al menos uno de estos constituyentes esta presente, en el aceite esencial o en la composicion, en una proporcion superior al 0,5 %, preferentemente superior al 1 %, 5 % incluso 10 %, 15 % o 20 % en masa. Como alternativa, puede tratarse de porcentajes cromatograficos. Dicho aceite esencial es, por ejemplo, el aceite esencial de tomillo, de serpol o de ajedrea (proporcion importante de timol o carvacrol) o el aceite esencial de albahaca, de tomillo (con linalol, Thymus vulgaris linaloliferum), de lavanda o de palo de Shiu (tambien llamado palo de Ho).

La presente divulgacion se refiere, mas particularmente, a composiciones para la aplicacion terapeutica mencionada, que comprenden al menos el 10 %, preferentemente al menos el 15 % o al menos el 20 % de uno de los siguientes constituyentes: linalol, carvacrol y timol. Otras composiciones tambien previstas son tales que el contenido acumulado de linalol, carvacrol y timol es superior al 10 %, preferentemente superior al 15 %, incluso superior al 20 % en masa. Como alternativa, puede tratarse de porcentajes cromatograficos.

De acuerdo con otra realizacion de la divulgacion, el componente de aceite esencial de Origanum compactum o de Aniba rosaeodora, que entra en las composiciones para las aplicaciones terapeuticas previstas, se selecciona entre alfa pineno, canfeno, mirceno, alfa terpineno, paracimeno, trans-ocimeno, gamma-terpineno, linalol, terpinen-4-ol, beta-cariofileno, alfa-humuleno y oxido de cariofileno. Se trata, en efecto, de los componentes que son comunes a los dos aceites esenciales de oregano y de palo de rosa.

De acuerdo con otra realizacion, la divulgacion tambien se refiere a una composicion que comprende un aceite esencial que tiene al menos un constituyente en comun con el aceite esencial de palo de rosa o de oregano compacto, para una utilizacion terapeutica en el tratamiento de las queratosis. Preferentemente, dicho componente es uno de los siguientes componentes: alfa pineno, canfeno, mirceno, alfa terpineno, paracimeno, trans-ocimeno, gamma-terpineno, linalol, terpinen-4-ol, beta-cariofileno, alfa-humuleno y oxido de cariofileno. Preferentemente, al menos uno de estos componentes esta presente en proporcion superior al 0,5 %, preferentemente superior al 1 %, 5 % incluso 10 %, 15 % o 20 % en masa. Como alternativa, puede tratarse de porcentajes cromatograficos.

De acuerdo con otra realizacion divulgada en el marco de la presente invencion, el aceite esencial, que tiene un constituyente comun con el aceite esencial de palo de rosa o de oregano compacto, se extrae de plantas de la familia de las Lamiaceas o de las Lauraceas.

Mas particularmente, el aceite esencial que tiene un constituyente comun con el aceite esencial de palo de rosa o de oregano compacto, se extrae de plantas que provienen de uno de los siguientes generos botanicos, de la familia de las Lamiaceas: Origanum, Acinos, Agastache, Ajuga, Calamintha, Glechoma, Hyssopus, Lamium, Lavandula, Leonurus, Lycopus, Melissa, Melittis, Mentha, Micromeria, Monarda, Ocimum, Orthosiphon, Perilla, Perovskia, Phlomis, physostegia, Pogostemon, Prostanthera, Prunella, Rosmarinus, Salvia, Satureja, Scutellaria, Slderitis, Solenostemon, Stachys, Teucrium y Thymus. Preferentemente, se trata del genero Origanum.

De acuerdo con otra realizacion de la divulgacion, se hace uso de una composicion que comprende un aceite esencial, que tiene un constituyente comun con el aceite esencial de palo de rosa o de oregano compacto, o de un

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constituyente del aceite esencial de palo de rosa o de oregano, que sea capaz de generar una situacion pro-oxidante endogena, que se produce espedficamente en queratinocitos mutados en p53. Aceites esenciales que tienen esta propiedad son, concretamente, el aceite esencial de oregano compacto y el aceite esencial de palo de rosa. Resultados en este sentido se presentan en el ejemplo 2 de la parte experimental. El analisis molecular detallado en la seccion experimental muestra que estos aceites esenciales provocan una desestabilizacion de la membrana mitocondrial y una liberacion de especies reactivas de oxfgeno, en el origen de la citotoxicidad dirigida a las celulas precancerosas (celulas HaCaT) y cancerosas (celulas A431) mutadas en p53.

En los ejemplos, tambien se definen ensayos sencillos para poner de manifiesto la generacion de una situacion prooxidante, concretamente mediante deteccion de la produccion del anion superoxido mitocondrial.

El aceite de acuerdo con la invencion, puede extraerse de las rafces, de los tallos, de la corteza o de las hojas de dicha planta. Actualmente se conocen tecnicas bien dominadas para la extraccion de los aceites esenciales, concretamente la extraccion en fno que consiste en someter a la sustancia vegetal a una fuerte presion con ayuda de una prensa hidraulica, el arrastre por vapor, que consiste en formar vapor de agua que atraviesa las plantas y se lleva con el las moleculas aromaticas, y la destilacion en seco. El aceite esencial obtenido mediante destilacion es una esencia vegetal modificada mediante un fenomeno de oxidacion y de hidrolisis. Una temperatura controlada y una presion baja son esenciales para conservar una calidad aromatica y una composicion qmmica lo mas cercanas posible a la esencia vegetal que se busca extraer. La mayor parte de los aceites esenciales se obtienen mediante destilacion y arrastre con vapor de agua (hidrodestilacion). Otras tecnicas de extraccion son bien conocidas y el experto en la materia sabra, en funcion de la planta en cuestion, que tecnica es la mas apropiada. Tambien sabra, que tecnica es la mas apropiada en funcion de la parte de la planta que se va a utilizar para la extraccion de aceite esencial.

Por supuesto, preferentemente se hace uso de tecnicas que permiten la mejor pureza y que garantizan la ausencia de disolventes en el producto extrafdo obtenido (aceite esencial o constituyente de aceite esencial).

En el marco de las diversas aplicaciones terapeuticas de acuerdo con la presente invencion, se hace uso preferentemente de composiciones que comprenden un aceite esencial en combinacion con otros compuestos. Los otros compuestos pueden ser, concretamente, aceites vegetales. Entre los aceites vegetales mas particularmente preferidos en combinacion con los aceites esenciales de acuerdo con la invencion, o sus constituyentes, se puede citar el aceite de pepitas de uva, el aceite de almendra dulce, pero tambien el aceite de avellana, el aceite de macadamia, el aceite de girasol y el aceite de oliva. De acuerdo con realizaciones particulares, la composicion de acuerdo con la invencion comprende un aceite esencial en combinacion con un filtro solar, o en combinacion con una solucion hidratante o un aceite vegetal, o bien ambos.

De acuerdo con otras realizaciones, las composiciones de acuerdo con la invencion, pueden contener una combinacion de al menos dos aceites esenciales distintos, por ejemplo un aceite esencial extrafdo de una planta del genero Origanum y un aceite esencial extrafdo de una planta de la familia de las Lauraceas.

Tambien puede tratarse de una combinacion que comprende un aceite esencial de una planta con un constituyente de este mismo aceite esencial, lo que conduce a modificar las proporciones naturales de los diferentes constituyentes de dicho aceite esencial. Puede tratarse concretamente de una composicion que comprende aceite esencial de Origanum compactum complementado con timol, carvacrol y/o linalol. Como alternativa, puede tratarse de una combinacion que comprende un aceite esencial de una planta del genero Origanum con un constituyente proveniente de otro aceite esencial, extrafdo de una planta diferente, concretamente aceite esencial de Origanum compactum en asociacion con linalol.

Tambien puede tratarse de una composicion que comprende dos constituyentes distintos, uno presente exclusivamente en el aceite esencial de Origanum compactum y el otro presente exclusivamente en el aceite esencial de Aniba rosaeodora. Por ejemplo, los dos constituyentes seleccionados de este modo no se encuentran juntos de forma natural dentro de cualquier aceite esencial, o bien no se encuentran de forma natural en estas proporciones dentro de cualquier aceite esencial. Otros compuestos adicionales pueden seleccionarse en funcion de la textura deseada y del modo de aplicacion deseado, para las composiciones de acuerdo con la invencion, para una utilizacion en el tratamiento o la prevencion de las queratosis en fase de transformacion, de los queratinocitos cancerosos y de los carcinomas que provienen de la transformacion de queratosis.

Por otro lado, en la presente invencion, los inventores han puesto de manifiesto la existencia de un intervalo espedfico de concentracion de aceite esencial de Origanum compactum y de Aniba rosaeodora, o de constituyente de estos dos aceites esenciales, para el que la citotoxicidad esta espedficamente dirigida a las celulas hiperproliferativas y/o mutadas en p53, en oposicion a las celulas normales o queratinocitos normales. Las utilizaciones en terapia previstas en el marco de la presente invencion son, preferentemente, utilizaciones en el intervalo de concentracion que permite una citotoxicidad dirigida a las celulas mutadas en p53 y que garantiza una viabilidad de al menos el 40 %, incluso de al menos el 50 o el 60 % de las celulas normales no mutadas. La implementacion de los protocolos detallados en los ejemplos 2 y 3 de la seccion experimental permite al experto en

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la materia determinar los intervalos de concentracion adecuados para cualquier aceite esencial o uno de sus componentes.

En el caso de un cultivo in vitro, los inventores han demostrado (vease el ejemplo 4) que dichos intervalos de concentracion son: del 0,0125 % al 0,0175 % para el aceite esencial de oregano y del 0,035 % al 0,045 % para el aceite esencial de palo de rosa, para obtener una citotoxicidad dirigida a las celulas mutadas en p53.

En funcion de estos datos, el experto en la materia sabra adaptar la composicion de acuerdo con la invencion para obtener un intervalo de concentracion comparable. Puede adaptar concretamente la composicion de acuerdo con la invencion en forma de parche para garantizar una puesta en contacto prolongada. Tambien es previsible recomendar aplicaciones repetidas, por ejemplo cada 24 horas durante una semana, o durante un mes, o mas.

Las diversas utilizaciones terapeuticas en el sentido de la invencion incluyen utilizaciones en condiciones tales que inducen una citotoxicidad preferencial en los queratinocitos cancerosos o precancerosos con respecto a los queratinocitos normales.

En el marco de esta invencion, las utilizaciones en terapia mencionadas estan previstas principalmente para aplicaciones topicas, cutaneas. Esta es, en efecto, la via de administracion que garantiza no solamente la mejor eficacia, sino tambien un mejor direccionamiento a las celulas a tratar.

Sin embargo, son previsibles otras vfas de administracion, concretamente por via oral, topica, intratumoral, enteral, parenteral, ocular, sublingual, inhalada, subcutanea, intramuscular, intravenosa, transdermica, local o rectal. No obstante, se prefieren las formas orales y topicas. Preferentemente, la composicion farmaceutica esta envasada en una forma conveniente a una aplicacion por via topica, por ejemplo en forma de parcha. Por via topica, se entiende una aplicacion sobre la piel y/o las mucosas.

Una composicion utilizada en el marco de la presente invencion comprende una concentracion de aceite esencial de Origanum compactum de aproximadamente el 0,03 % al 0,15 %, preferentemente de aproximadamente el 0,03 % al 0,1 % de aceite esencial de oregano, concretamente para una aplicacion cutanea.

Las composiciones de acuerdo con la invencion comprenden generalmente al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable, seleccionado de acuerdo con la forma farmaceutica deseada y la via de administracion seleccionada. La formulacion de la composicion se adaptara en funcion de la via de administracion seleccionada. Para las formulaciones con objetivo terapeutico, se pueden prever las siguientes formulaciones:

Para una administracion por via oral, la composicion farmaceutica puede presentarse en forma de comprimidos, de capsulas duras, de grageas, de jarabes, de suspensiones, de soluciones, de polvos, de emulsiones, de capsulas, de microesferas o nanoesferas o vesfculas lipfdicas o polimericas que permiten una liberacion controlada.

Por via parenteral, la composicion puede presentarse en forma de soluciones o suspensiones para perfusion o para inyeccion.

Por via topica, la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion esta destinada, mas particularmente, al tratamiento de la piel y de las mucosas y puede presentarse en forma de unguentos, de cremas, de leches, de pomadas, de polvos, de tampones impregnados, de soluciones, de geles, de esprais, de espumas, de lociones o de barras. Tambien puede presentarse en forma de suspensiones de microesferas o nanoesferas o vesfculas lipfdicas o polimericas o de parches polimericos y de hidrogeles que permiten una liberacion controlada. Esta composicion por via topica puede presentarse en forma anhidra, en forma acuosa o en forma de una emulsion.

En el caso de las utilizaciones en profilaxis, las composiciones de acuerdo con la invencion pueden formularse en forma de leche, por ejemplo como leche solar, en forma de pomada o bien en forma de aceite.

Preferentemente, el aceite esencial seleccionado o uno de sus constituyentes, se formulara en combinacion con un aceite vegetal, concretamente para permitir su dilucion y disminuir de este modo su eventual efecto irritante.

La posologfa util, el numero de aplicaciones y la duracion del tratamiento vanan de acuerdo con la edad, el sexo, el peso del paciente y el contexto terapeutico.

La formulacion seleccionada puede ser de liberacion inmediata, prolongada o retardada.

Por otro lado, habiendo puesto los inventores de manifiesto el direccionamiento espedfico del efecto citotoxico de los aceites esenciales de Origanum compactum y de Aniba rosaeodora y de sus constituyentes, concretamente los constituyentes mayoritarios, contra celulas hiperproliferativas tales como las celulas mutadas en p53, la presente invencion tambien se refiere a cualquier utilizacion terapeutica de una composicion que comprende un aceite esencial de Origanum compactum en el tratamiento o la prevencion dirigida de zonas cancerosas de la piel debidas

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a la hiperproliferacion de celulas de la dermis o de la epidermis, por ejemplo debidas a la hiperproliferacion de melanocitos, concretamente en el marco de melanoma.

La composicion que comprende el aceite esencial de Origanum compactum se utiliza preferentemente en combinacion con otros compuestos, concretamente excipientes terapeutica y/o farmaceuticamente aceptables. Dichos excipientes farmaceuticamente aceptables son bien conocidos por el experto en la materia, puede tratarse concretamente de sacarosa, de lactosa, de almidon, de estearato de magnesio, de sorbitol, de gelatina, de celulosa, de polietilenglicol, o bien de agua, de aceite o de alcohol, para las composiciones lfquidas orales. Esta lista de excipientes utilizables no es, por supuesto, exhaustiva.

Preferentemente, las composiciones descritas anteriormente son para una utilizacion en el tratamiento de un sujeto que padece una patologfa asociada a las queratosis, concretamente un sujeto que presenta queratosis en fase de transformacion, queratinocitos precancerosos o cancerosos o bien un carcinoma derivado de queratosis. Los carcinomas mas particularmente considerados en el marco de la presente invencion son los carcinomas espinocelulares (tambien llamados carcinomas epidermoides o carcinomas escamosos), y los carcinomas basocelulares.

Las queratosis, los queratinocitos o los carcinomas, tratados con las composiciones de la invencion, se caracterizan por celulas portadoras de mutaciones en la protema p53. Todas las celulas consideradas no son necesariamente portadoras de mutacion en la protema p53, pero preferentemente al menos el 20 % de las celulas, dentro de la queratosis o del carcinoma a tratar, son portadoras de mutaciones en la protema p53, preferentemente al menos el 30 %, incluso al menos el 50 % o mas.

Un sujeto susceptible de ser tratado con las composiciones de acuerdo con la invencion es un ser humano, hombre o mujer, sea cual sea su edad. Preferentemente, se trata de un adulto, pero la invencion no esta limitada a los adultos y comprende tambien el tratamiento de adolescentes, preferentemente de mas de 15 anos, con las composiciones descritas.

Las composiciones mencionadas anteriormente, de manera particularmente preferida, para una utilizacion en combinacion o en asociacion con otro tratamiento contra las queratosis, por ejemplo en asociacion con una quimioterapia, una radioterapia o una fototerapia dinamica (fTd). Otros tratamientos en combinacion o en asociacion con un tratamiento de acuerdo con la invencion son electrocoagulacion, laser de CO2, la aplicacion de nitrogeno lfquido (crioterapia), la aplicacion de una crema que modula la inmunidad (imiquimod, por ejemplo), la aplicacion de una crema a base de fluorouracilo o mediante electrocoagulacion. Otros tratamientos previsibles en relacion con las queratosis en fase de transformacion, los queratinocitos precancerosos o cancerosos y los carcinomas derivados de queratosis son bien conocidos por el experto en la materia.

La alternancia entre los diferentes tipos de terapia, la duracion de cada uno de ellos y su empleo simultaneo o secuencial, seran definidos por el medico caso por caso dependiendo del paciente.

Esta previsto, concretamente, que la composicion de acuerdo con la invencion se utilice para el tratamiento de las queratosis o de carcinomas, antes, durante, despues o en alternancia con otro tipo de tratamiento contra las queratosis o los carcinomas, concretamente un tratamiento por quimioterapia, por radioterapia o por fototerapia dinamica.

En el marco de la presente invencion, esta previsto tambien que dichas composiciones se utilicen para tratar la piel de un paciente despues de la escision o ablacion de una queratosis en fase de transformacion o que presenta un riesgo de cancerizacion. De esta manera, puede evitarse que celulas no retiradas, en el contorno de la region escindida, causen la reformacion de la queratosis o del carcinoma.

Las diferentes realizaciones descritas anteriormente pueden, por supuesto, combinarse entre sf.

La presente divulgacion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que contienen al menos uno de los constituyentes del aceite esencial de Origanum compactum o de Aniba rosaeodora, preferentemente dicha composicion comprende al menos el 10 %, o al menos el 15 o el 20 %, incluso al menos el 50 % en masa de linalol, de carvacrol o de timol.

La divulgacion tambien se refiere a una composicion que contiene linalol, carvacrol y/o timol para una utilizacion en terapia, por ejemplo una composicion que contiene linalol y timol, o carvacrol y timol, o linalol y carvacrol, o bien una mezcla de los tres, o bien unicamente uno de los tres. Preferentemente, dicha composicion comprende al menos el 10 %, o al menos el 15 o el 20 %, incluso al menos el 50 % en masa de linalol, de carvacrol y/o de timol. Los inventores han demostrado, en efecto, las propiedades terapeuticas de estos tres compuestos aislados (vease el ejemplo 3), que justifican su utilizacion como principio activo en aplicaciones terapeuticas.

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Leyenda de las figuras:

Figura 1: la figura 1 representa la medida de la viabilidad celular (ensayo MTT) en celulas A431, HaCat y NHEK tratadas 4 h con el AE de oregano. La lmea doble (=) corresponde a la dosis letal al 50 % (DL50).

Figura 2: la figura 2 representa la medida de la viabilidad celular (ensayo MTT) en celulas A431, HaCat y NHEK tratadas 4 h con el AE de palo de rosa. La lmea doble (=) corresponde a la dosis letal al 50 % (DL50).

Figura 3: la figura 3 representa la medida de la viabilidad celular (ensayo MTT) en celulas A431, HaCat y NHEK tratadas 20 h con el aE de oregano. La lmea = corresponde a la dosis letal al 50 % (DL50).

Figura 4: la figura 4 representa la medida de la viabilidad celular (ensayo MTT) en celulas A431, HaCat y NHEK tratadas 20 h con el aE de palo de rosa. La lmea doble (=) corresponde a la dosis letal al 50 % (DL50).

Figura 5: la figura 5 representa la medida de la apoptosis (ensayo AV/PI), en las celulas A431, HaCat y NHEK, despues de 12 h de tratamiento con los AE de oregano y de palo de rosa.

Figura 6: la figura 6 representa la medida de la fluorescencia (actividad caspasa) por citometna de flujo. Las celulas no marcadas, las celulas marcadas no tratadas, y las celulas tratadas (con AE) y marcadas, estan etiquetadas.

Figura 7: la figura 7 representa la medida de la fluorescencia (actividad caspasa) por microscopfa de fluorescencia.

Figura 8: la figura 8 ilustra la cuantificacion del numero de celulas A431 y HEK 001 (queratinocitos no mutados) que han sufrido una cafda del potencial membranario mitocondrial despues de 6 h de tratamiento con los AE de oregano y de palo de rosa.

Figura 9: la figura 9 ilustra la deteccion del estres oxidativo inducido despues de 4 h de incubacion con los AE de oregano y de palo de rosa, en las celulas A431, HaCat y NHEK 894, mediante la medida (citometna de flujo) de la fluorescencia de la sonda DHR 123.

Figura 10: la figura 10 representa la medida de la apoptosis (ensayo AV/PI), en las celulas A431 y HEK001 (queratinocitos inmortalizados no mutados), despues de 12 h de tratamiento con los siguientes constituyentes de aceites esenciales: linalol, carvacrol y timol.

Seccion experimental:

Ejemplo 1: Estudio analttico de los aceites esenciales (AE) de oregano y de palo de rosa.

La eleccion de estudiar el AE de oregano se determino mediante los trabajos del laboratorio del Dr Averbeck que han demostrado una actividad antigenotoxica de este AE en la levadura (Bakkali, F. et al. 2006). El AE de palo de rosa se selecciono en relacion con sus propiedades beneficiosas para la piel.

El presente ejemplo se refiere a la caracterizacion de la parte volatil de 2 AE biologicos adquiridos en el mercado: un aceite esencial de palo de rosa y un aceite esencial de oregano.

La metodologfa aplicada pone en juego, un analisis GC-MS, en 2 columnas de polaridades diferentes (columna apolar OV1 y columna polar VF WAX).

Material y metodo

1. Material

Los analisis se realizaron en aparatos Agilent con 2 tipos de columnas:

- Columna capilar apolar: Columna capilar HP-1 longitud: 50 m, diametro interno: 0,2 mm, pelmula: 0,33 |im.

- Columna capilar polar: Columna capilar VF WAX, longitud 60 m, diametro interno 0,25 mm, pelmula: 0,25 |im.

Es importante subrayar que todos los porcentajes obtenidos son porcentajes cromatograficos y no porcentajes reales de compuestos presentes en la fase volatil. Para cuantificar exactamente los constituyentes, sena preciso utilizar un patron interno para librarse de las variaciones debidas al instrumental.

2. Identificacion de los ingredientes a partir de una cromatograffa en fase gaseosa en 2 columnas de polaridades diferentes, acoplada a un detector espectrometro de masa (GC/MS). La identificacion de las moleculas se realiza con ayuda de bibliotecas de espectros de masa espedficos para los perfumes.

La sensibilidad de los aparatos permitio cuantificar compuestos para los cuales el porcentaje relativo es superior o igual al 0,001 %.

La presentacion de los resultados y la cuantificacion se realizan, en GC/FID en columna apolar, la cuantificacion de los constituyentes coeluidos se realiza en columna polar.

3. Muestras analizadas

- AE de palo de rosa

- AE de oregano 5

Resultados:

Aceite esencial de palo de rosa:

10 En vista de los resultados, parece que:

- Se identifica con certidumbre el 99,12 % del area total del cromatograma.

- Se identificaron y cuantificaron 62 moleculas.

- La tabla 1 de composicion (en porcentajes cromatograficos) establecida para el AE de palo de rosa se encuentra

15 a continuacion:

Tabla 1:

PALO DE ROSA

Composicion en % GC PALO DE ROSA Composicion en % GC

6 METHYL 5 HEPTENE 2 ONE

0,12 TERPINEN 4 OL 0,2

LINALOYL OXIDE = LIMETOL

0,33 ALPHA TERPINEOL 4,52

BETA PINENE

0,14 GAMMA TERPINEOL 0,04

MYRCENE

0,05 NEROL 0,38

HERBOXIDE (isomero) = DESOXYDE

0,02 NERAL 0,04

BENZYL ALCOHOL

0,01 GERANIOL 1,47

ALPHA TERPINENE

0,02 GERANIAL 0,05

PARA-CYMENE

0,08 METHYL ANISOATE 0,02

LIMONENE

0,46 GERANYL ACETATE 0,02

1,8 CINEOLE

0,57 ALPHA COPAENE 1,15

CIS BETA OCYMENE

0,03 BETA ELEMENE 0,13

5 DIMETHYL 2,2 TETRAHYDROFURAN = CITROXIDE

0,05 ALPHA GURJUNENE 0,15

TRANS BETA OCIMENE

0,09 TRANS BETA CARYOPHYLLENE 0,04

GAMMA TERPINENE

0,02

CIS LINALOOL OXIDE

1,9 ALPHA GUAIENE 0,05

TRANS LINALOOL OXIDE

1,28 ALPHA HUMULENE 0,02

TERPINOLENE

0,52 ALLO AROMADENDRENE 0,06

LINALOOL

78,93 GAMMA MUUROLENE 0,04

HOTRIENOL

0,2 SELINA 4,11 DIENE 0,14

BETA SELINENE 0,82

ALPHA FENCHOL

0,02 ALPHA SELINENE 0,77

GAMMA CADINENE 0,12

MYRCENOL

0,06 DELTA CADINENE 0,28

CIS OCIMENOL

0,14 TRANS NEROLIDOL 0,27

NEROL OXIDE

0,03 SPATHULENOL 0,11

TRANS OCIMENOL

0,16 CARYOPHYLLENE OXIDE 0,07

EPOXY LINALOOL 1 = CIS LINALOOL OXIDE (PYRANOID)

0,15 alcohol sesquit C15H24O HP1: 1637 0,23

EPOXY LINALOOL 2 = TRANS LINALOOL OXIDE (PYRANOID)

0,25 alcohol sesquit C15H24O HP1: 1646 0,15

7 EPI ALPHA EUDESMOL 0,12

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PALO DE ROSA

Composicion en % GC PALO DE ROSA Composicion en % GC

BORNEOL

0,06 alcohol sesquit C15H24O 1689 0,27

PALO DE ROSA

Composicion en % GC PALO DE ROSA Composicion en % GC

alcohol sesquit C15H24O HP1: 1697

0,29 BENZYL BENZOATE 0,6

alcohol sesquit C15H24O HP1: 1701

0,4 TOTAL (%) 99,12

- El compuesto mayoritario del AE es el linalol (78,93 %).

- Los compuestos presentes en mayor cantidad en el AE, despues del linalol, son alfa terpineol (4,52 %), oxido de linalol cis (1,90 %), geraniol (1,47 %), oxido de linalol trans (1,28 %) y alfa copaeno (1,15 %).

- El compuesto minoritario es el alcohol bendlico (0,01 %).

Los porcentajes en masa de los compuestos mayoritarios del aceite esencial de palo de rosa son los siguientes:

- Linalol: 78,93 %

- Alfa terpineol: 4,91 %.

Aceite esencial de oregano:

En vista de los resultados, parece que:

- Se identifica con certidumbre el 97,69 % del area total del cromatograma.

- Se identificaron y cuantificaron 20 moleculas.

- La tabla 2 de composicion (en porcentajes cromatograficos) establecida para el AE de oregano se encuentra a continuacion:

Tabla 2:

OREGANO COMPOSICION EN % GC

Thujene alpha

0,87

Pinene alpha

0,64

Camphene

0,12

1 octen-3-ol

0,23

Octanone 3

0,17

Myrcene

1,86

Phellandrene alpha

0,23

Terpinene alpha

1,47

Paracymene

12,65

Phellandrene beta

0,56

Ocimene trans

0,07

Terpinene gamma

15,45

Sabinene trans hydrate

0,19

Linalol

1,66

Terpinenol 4

0,61

Thymol

20,23

Carvacrol

38,61

Caryophyllene beta

1,88

Humulene alpha

0,1

Caryophyllene oxyde

0,09

TOTAL (%)

97,69

- Los compuestos mayoritarios del AE son carvacrol (38,61 %), timol (20,23 %), gamma terpineno (15,45 %) y paracimeno (12,65 %).

- El compuesto minoritario es ocimeno trans (0,07 %).

- Existen 12 moleculas comunes entre el AE de oregano y el AE de palo de rosa: alfa pineno, canfeno, mirceno, alfa terpineno, paracimeno, ocimeno trans, gamma terpineno, linalol, terpinenol 4, beta cariofileno, alfa humuleno, oxido de cariofileno. Estos compuestos son principalmente terpenos.

Los porcentajes en masa de los compuestos mayoritarios del aceite esencial de oregano son los siguientes:

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- Paracimeno: 12,27%

- Gamma terpineno: 16,10%,

- Timol: 18,65%

- Carvacrol: 31,83%.

Conclusiones:

La composicion qmmica precisa de cada AE se determino mediante analisis en cromatograffa en fase gaseosa (vease las tablas 1 y 2). La observacion de la composicion qmmica de cada AE revela una diferencia cualitativa muy clara si se considera el numero de compuestos mayoritarios. Aunque el AE de palo de rosa presenta un mayor numero de moleculas qmmicas diferentes (aproximadamente 62), posee un compuesto muy mayoritario: el linalol, presente en mas del 78 % de la fraccion analizada. Por el contrario, el AE de oregano, en sus 20 moleculas censadas, muestra cuatro moleculas mayoritarias: carvacrol (38 %), timol (20 %), gamma terpineno (15 %) y paracimeno (12 %). A este respecto, el aE de palo de rosa se denomina «monomolecular» y el AE de oregano se denomina «polimolecular». Hay que senalar tambien que el AE de oregano esta compuesto principalmente por mono-fenol (carvacrol y timol) mientras que el AE de palo de rosa esta constituido mayoritariamente por alcohol terpenico (linalol).

Ejemplo 2:

En el presente trabajo, se ha estudiado mas particularmente la citotoxicidad de dos AE: el AE de oregano compacto (Origanum compactum, familia de las Lamiaceas) y el AE de palo de rosa (Aniba rosaeodora, familia de las Lauraceas) sobre celulas epidermicas humanas: la lmea queratinocftica HaCat (mutada en p53 e inmortalizada espontaneamente), la lmea A431 (derivada de un carcinoma espinocelular) asf como sobre queratinocitos epidermicos primarios normales humanos.

Estos tres modelos permitieron evaluar los efectos biologicos potenciales de estos dos AE sobre celulas epidermicas normales, mutadas en p53 (que pueden ser asimiladas como precancerosas) y cancerosas, representando el conjunto en cierta medida, las diferentes situaciones entre piel sana y piel que presenta un riesgo de cancer no melanoma.

Medida de la viabilidad celular:

Los inventores compararon el efecto citotoxico de los aceites esenciales sobre queratinocitos normales, mutados precancerosos (HaCat) y mutados cancerosos (A431).

La viabilidad celular se determina mediante el ensayo MTT despues de un tratamiento de 4 h y 20 h con diferentes concentraciones de AE. Este ensayo (MTT) se basa en la actividad enzimatica mitocondrial de la succinato deshidrogenasa. Cada punto de viabilidad esta representado mediante tres experimentos independientes (NHEK: queratinocitos humanos normales «Normal Human Epidermic Keratinocyte»).

Las figuras 1 y 2 indican que:

- el AE de oregano es mas citotoxico que el AE de palo de rosa, independientemente del tiempo (comparacion entre las 4 h y 20 h de tratamiento) y de la lmea celular utilizada.

- las celulas normales (NHEK) son mas resistentes que las celulas cancerosas (A431) y mutadas precancerosas (HaCat), despues de 4 h de tratamiento.

- el perfil de citotoxicidad es identico entre las celulas A431 y HaCat, despues de 4 h de tratamiento (con los AE de oregano y de palo de rosa).

Las figuras 3 y 4 confirman que esta diferencia de toxicidad entre las celulas A431/HaCat y las celulas NHEK esta conservada despues de 20 h de tratamiento, aunque a este tiempo se observa una diferencia de sensibilidad entre las celulas HaCat y A431.

Estos resultados ponen de manifiesto una toxicidad dirigida de los AE para las celulas cancerosas y mutadas precancerosas con respecto a las celulas normales, a concentraciones de 150 nl/ml y 400 nl/ml de AE de oregano y de palo de rosa respectivamente.

Deteccion de la apoptosis:

La apoptosis se define mediante la induccion de acontecimientos bioqmmicos caractensticos que causan una muerte celular programada. Estos acontecimientos caractensticos son, por ejemplo, la translocacion de un fosfolfpido membranario particular (fosfatidilserina) de la membrana plasmatica interna o incluso la activacion de ciertas proteasas (caspasas) implicadas en este proceso de degradacion de las protemas que causa la muerte celular.

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Los resultados de viabilidad celular pusieron de manifiesto una concentracion para cada AE, en la que se revela la diferencia de sensibilidad de las celulas cancerosas y mutadas precancerosas con respecto a las celulas normales: 150 nl/ml para el AE de oregano y 400 nl/ml para el AE de palo de rosa. Estas concentraciones se utilizaran en el marco de un tratamiento de 16 h (tambien se realizaron 4 h y 12 h).

La figura 5 pone de manifiesto despues de 12 h de tratamiento:

- una viabilidad significativamente mas elevada de las celulas normales (NHEK; viabilidad >70 %) con respecto a las lmeas cancerosa A431 y mutada precancerosa HaCat (mdice de viabilidad < 15 % en las lmeas A431 y HaCat).

- una fuerte induccion de la apoptosis en la lmea cancerosa A431 (plus del 60 % de celulas anexina V positivas).

- una apoptosis tardfa o necrosis en las celulas mutadas precancerosas HaCat.

Estos resultados confirman una sensibilidad mas elevada a la toxicidad de los AE de las celulas mutadas precancerosas HaCat y cancerosas A431 con respecto a los queratinocitos normales NHEK. Tambien ponen de manifiesto una induccion de muerte celular por apoptosis.

Para confirmar la induccion de una muerte celular por apoptosis por los AE, se realiza un segundo ensayo basado en la deteccion de la actividad de las caspasas, una familia de protemas espedficas del mecanismo de la apoptosis, sobre las celulas tratadas con los AE. La activacion de las caspasas es un fenomeno mas precoz que la translocacion de la fosfatidilserina detectada anteriormente por la anexina V. El principio del ensayo se basa en la utilizacion de un sustrato de estas enzimas acoplado a un fluorocromo. Las celulas en apoptosis, en las que las caspasas estan activadas, degradaran el sustrato y emiten fluorescencia. Las celulas no apoptoticas no emiten fluorescencia. La medida de fluorescencia se realiza mediante citometna de flujo y microscopfa de fluorescencia, despues de 4 h de tratamiento con los AE.

La figura 6 pone de manifiesto un desplazamiento hacia la derecha (por lo tanto un aumento de la intensidad de fluorescencia) de la curva que representa las celulas tratadas por los AE con respecto a la curva que representa las celulas marcadas pero no tratadas, en las celulas A431 y HaCat unicamente. Este aumento de fluorescencia, que se confirma mediante microscopfa de fluorescencia (figura 7), traduce una activacion de las caspasas y confirma:

- la induccion de la apoptosis en las celulas cancerosas, y HaCat por los dos AE, a las concentraciones utilizadas.

- que esta induccion se observa unicamente en las celulas A431 y HaCat; las celulas normales son, por lo tanto, mas resistentes que las celulas cancerosas y mutadas precancerosas para un mismo tratamiento con los AE de oregano y de palo de rosa.

Efecto de los AE sobre la mitocondria

Despues del tratamiento con los AE de oregano y de palo de rosa, el analisis de la integridad de la membrana mitocondrial de los queratinocitos mutados cancerosos A431 y de los queratinocitos no mutados se realiza por citometna de flujo (seguida por la fluorescencia ligada a la acumulacion de TMRM en la membrana mitocondrial mtegra). Se constata en la figura 8 que en el ambito de concentraciones seleccionado, tiene, efectivamente, un efecto desestabilizante de la mitocondria ligado al tratamiento con los AE, pero este efecto es particularmente marcado en las celulas A431 con respecto a los queratinocitos no mutados. Este impacto sobre la mitocondria esta muy probablemente asociado al desarrollo del proceso apoptotico (causa y/o consecuencia).

Generacion intracelular de especies reactivas de oxigeno sucesiva al tratamiento con los AE.

Una de las consecuencias de la desestabilizacion mitocondrial es la liberacion de moleculas prooxidantes en el citosol, pudiendo detectarse este fenomeno en citometna de flujo con la sonda DHR123 que emite fluorescencia en caso de estres oxidativo. La figura 9 muestra la evolucion del numero de celulas fluorescentes (por lo tanto, sujetas a una generacion de especies reactivas de oxfgeno detectables por la DHR123) despues de diferentes tratamientos con los AE. Se constata que, a las concentraciones utilizadas, los queratinocitos normales no resultan afectados mientras que un aumento dependiente de la dosis del estado prooxidante intracelular es detectable en las celulas mutadas HaCat o A431. De este modo, los AE son capaces de producir un estres oxidativo significativo y espedfico en los queratinocitos mutados precancerosos o cancerosos, estando este estres probablemente fuertemente implicado en la citotoxicidad dirigida descrita por las figuras 1 a 4.

Conclusiones

Los datos presentados en este documento demuestran una sensibilidad a la citotoxicidad de los AE de oregano y de palo de rosa significativamente mas elevada en queratinocitos humanos cancerosos y mutados precancerosos con respecto a los queratinocitos normales.

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El analisis de los mecanismos en juego permitio demostrar que esta diferencia de sensibilidad se explicaba por la induccion de una muerte por apoptosis en las celulas cancerosas y mutadas precancerosas, mientras que las celulas normales presentaban mdices de viabilidad celular superiores al 70 % para una misma concentracion de AE.

El analisis molecular demuestra que esta toxicidad espedfica con los AE implica modificaciones de la integridad mitocondrial y la generacion de un estres oxidativo endogeno. Es, por lo tanto, previsible dirigirse a queratinocitos mutados precancerosos (en particular en las queratosis o en zonas de la piel danadas por los UV) con el AE y de este modo eliminarlos espedficamente.

Ejemplo 3:

Medida de la actividad proapoptotica de los compuestos aislados mayoritarios de los AE de oregano y de palo de rosa.

El AE de palo de rosa esta compuesto por una molecula mayoritaria (a mas del 80 %): linalol (alcohol terpenico). El AE de oregano compacto contiene dos compuestos mayoritarios (monoterpenol): carvacrol y timol, presentes al 40 % y 20 %, respectivamente.

imagen1

Estas tres moleculas, se incubaron 12 h con queratinocitos inmortalizados no mutados (HEK 001) y queratinocitos cancerosos mutados (A431). Los porcentajes de celulas en apoptosis se midieron mediante el ensayo con Anexina V/Yoduro de propidio. Las concentraciones de las moleculas utilizadas son iguales a las presentes durante tratamientos con los AE. Ejemplo: la concentracion de linalol utilizada en este caso, representa el equivalente del 80 % de linalol presente en el AE de palo de rosa. En efecto, el linalol se utiliza a una concentracion de 320 nl/ml (vease la figura 10), es decir el 80 % de 400 nl/ml de aceite esencial de palo de rosa que es la concentracion demostrada como la mas toxica para las celulas HaCaT y A431, al tiempo que deja un maximo de celulas NHEK y HEK 001 viables (vease el ejemplo 2, conclusiones sobre la seccion «medida de la viabilidad celular» y figura 3 y 4 asi como la seccion «deteccion de la apoptosis» y la figura 5). Lo mismo ocurre para el carvacrol y el timol del AE de oregano.

Los resultados de apoptosis se presentan en la figura 10.

Los resultados de este experimento expresados en % de celulas, vivas, en apoptosis o en apoptosis tardia y necrosis muestran:

- Una citotoxicidad y una actividad proapoptotica mas baja de las moleculas mayoritarias aisladas con respecto a la inducida por los AE en su complejidad (70 % de apoptosis inducida en las celulas cancerosas a dosis equivalente de AE de oregano, es decir 150 nl/ml). En efecto, la figura 5 muestra, por ejemplo, que mas del 60 % de las celulas A431 son apoptoticas despues de un tratamiento de 12 h con AE de oregano a una concentracion de 150 nl/ml. La figura 10, por el contrario, muestra que aproximadamente solamente el 25 % de las celulas A431 son apoptoticas despues de 12 h de tratamiento con carvacrol a una concentracion de 60 nl/ml (correspondiente al 40 % de 150 nl/ml) y aproximadamente el 15 % de celulas apoptoticas con un tratamiento con timol a 30 nl/ml (correspondiente al 20 % de 150 nl/ml).

- Indices de viabilidad de las celulas no mutadas (HEK001) superiores a los observados en las celulas mutadas (A431). El direccionamiento preferente a las celulas mutadas, por lo tanto, se conserva.

Este experimento muestra que la muerte por apoptosis dirigida a las celulas cancerosas mutadas se conserva cualitativamente si se utilizan los compuestos mayoritarios del palo de rosa (linalol) o del oregano (carvacrol y timol). Por el contrario, la eficacia citotoxica es menor que con los AE en su complejidad. Existen, por lo tanto, seguramente sinergias con los otros constituyentes.

Este punto se confirma mediante la observacion realizada por los inventores de que la mezcla de varias moleculas aisladas de un mismo aceite esencial reproduce la actividad observada con el aceite esencial, actividad superior a la simple suma de las actividades de las moleculas aisladas tomadas por separado.

Material y metodos para los ejemplos 2 y 3:

Treinta y seis horas antes del tratamiento, las celulas se distribuyen en placas de 96 pocillos (5x10 celulas/ml).

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Solucion de tratamiento de los AE: los AE se diluyen al 1/10° una primera vez en etanol 100 %. A continuacion, se realiza una segunda dilucion en medio de cultivo para obtener las concentraciones deseadas.

La medida de viabilidad se realiza con ayuda del ensayo MTT (1-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazan. Sigma- Aldrich). En resumen, despues del tiempo de tratamiento deseado, el medio de tratamiento se sustituye por medio que contiene la solucion de MTT (0,25 |ig/ml de concentracion final). La placa de 96 de pocillos que contiene las celulas se incuba a continuacion 4 h a 37 °C antes de eliminar la solucion de MTT y de anadir 100 |il de DMSO. La medida de absorbancia se realiza a continuacion a 540 nm despues de haber homogeneizado el precipitado violeta.

La medida del estres oxidativo se realiza con ayuda de la sonda fluorescente DHR 123 (Molecular Probe). Despues de 4 h de tratamiento con los AE, el medio se elimina y las celulas se recogen (por tripsinizacion), se centrifugan y a continuacion se aclaran en 4 ml de PBS 1X. Las celulas se incuban a continuacion 30 minutos (37 °C) en medio de cultivo que contiene la sonda (5 |iM). Antes de la medida de fluorescencia por citometna (Excitacion: 488 nm/Emision: 530 nm), las celulas se aclaran en 4 ml de PBS 1X, se centrifugan y se recuperan en 0,5 ml de PBS.

Deteccion de la apoptosis:

Ensayo con anexina V/yoduro de propidio:

Uno de los marcadores de la apoptosis es la translocacion de la fosfatidilserina de la cara interna hacia la cara externa de la membrana plasmatica (translocacion que permite a que los cuerpos apoptoticos sean reconocidos y fagocitados por los macrofagos).

El ensayo AV/PI permite detectar este acontecimiento, gracias a la afinidad de la protema anexina V por la fosfatidilserina. El yoduro de propidio que se dirige al ADN, permite la discriminacion de las celulas apoptoticas precoces, de las celulas en apoptosis tardfa y/o en necrosis.

Despues del tiempo de tratamiento deseado, el medio se elimina, las celulas se recogen (por tripsinizacion), se centrifugan y se aclaran en 4 ml de PBS 1X. El marcado se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante (Kit Vybrant. Molecular Probe). Rapidamente, las celulas se recuperan en 100 |il de tampon de marcado, en el que se anaden 6 |il de anexina 5, y 3 |ig/ml de yoduro de propidio por muestra. Las celulas se incuban a continuacion 30 minutos en la oscuridad (a temperatura ambiente). Se anaden cuatrocientos |il de tampon de marcado antes de medir la fluorescencia de la anexina 5 (a 530 nm) y del yoduro de propidio (a 610 nm).

Actividad caspasa:

La actividad caspasa es un segundo marcador de la apoptosis. La familia de la caspasa agrupa protemas principalmente implicadas en la regulacion de la muerte celular por apoptosis. La actividad caspasa se detecta con ayuda de un sustrato VAD (por valina-alanina-acido aspartico) acoplado a un fluorocromo (FITC. Emision: 530 nm). La deteccion de esta actividad se realiza siguiendo las instrucciones del kit CasPACE TM (Promega). Despues del tratamiento, las celulas se recogen (por tripsinizacion), se centrifugan y se aclaran en 4 ml de PBS 1X. A continuacion, las celulas se incuban 20 minutos en medio de cultivo que contiene el reactivo (10 |iM), 20 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. Las celulas se aclaran a continuacion 2 veces en 4 ml de PBS 1X antes de fijarlas 30 minutos en una solucion de formalina. Antes de la medida de fluorescencia por citometna de flujo, las celulas se aclaran 3 veces 5 minutos) en PBS 1X y a continuacion se recuperan en 0,5 ml de PBS.

Permeabilizacion mitocondrial:

La permeabilizacion de los poros mitocondriales es tambien un marcador precoz de la apoptosis. Una sonda fluorescente (TMRM: ester metflico de tetrametil rodamina); Molecular Probe) se localizan en la mitocondria, disminuira en intensidad cuando esta migra al citoplasma, sucesivamente a la abertura de los poros mitocondriales. Una cafda de fluorescencia se mide, por lo tanto, por citometna de flujo.

Despues de 4 h de tratamiento, las celulas se tripsinizan y se aclaran en PBS 1X antes de incubarlas 30 minutos a 37 °C en medio de cultivo que contiene la sonda fluorescente (50 nM final). Despues de esta incubacion, las celulas se aclaran 1 vez 5 minutos en PBS 1X y a continuacion se recuperan en 0,5 ml de PBS antes de la medida por citometna.

Ejemplo 4: Intervalo de concentracion de AE: citotoxicidad dirigida

Los intervalos de concentraciones de AE (en % de AE por volumen de medio de cultivo) para las que se observa la propiedad de citotoxicidad inducida preferentemente en las celulas mutadas (HaCat y A431) con respecto a las celulas no mutadas (HEK001 y NHEK894) son:

del 0,0125 % al 0,0175 % de AE de oregano.

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del 0,035 % al 0,045 % de AE de palo de rosa

En estos intervalos de concentraciones, los indices de toxicidad son dos veces mas elevados en las celulas mutadas que en las celulas no mutadas, en las que la viabilidad sigue siendo del orden del 60 %.

Por otro lado, debe subrayarse que estudios demostraron una buena penetracion cutanea de los principales ingredientes de los AE de palo de rosa y de oregano.

Referencias

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Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende un aceite esencial extrafdo de plantas del genero Origanum, para una utilizacion terapeutica en el ser humano, en la prevencion o el tratamiento dirigido de queratosis en fase de transformacion cancerosa, de queratinocitos cancerosos, o de carcinoma proveniente de la transformacion de queratosis, caracterizandose dichas queratosis, queratinocitos cancerosos o carcinoma, por celulas portadoras de mutaciones en el gen p53.
2. 2. Composicion para la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende aceite esencial de Origanum compactum.
3. 3. Composicion para la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende al menos 15 %, preferentemente 20 % en masa, de aceite esencial de Origanum compactum.
4. 4. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende otros compuestos, concretamente aceites vegetales.
5. 5. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para una aplicacion topica cutanea.
6. 6. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dichas queratosis son queratosis actmicas.
7. 7. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho carcinoma es un carcinoma espinocelular.
8. 8. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha utilizacion es en asociacion con otro tratamiento contra las queratosis, concretamente en asociacion con una quimioterapia o una fototerapia dinamica (FTD).
9. 9. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha utilizacion es antes, durante, despues o en alternancia con otro tratamiento contra las queratosis, concretamente un tratamiento por quimioterapia o por fototerapia dinamica.
10. 10. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho tratamiento dirigido esta libre de efectos perjudiciales sobre los queratinocitos normales.
11. 11. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que induce una citotoxicidad preferencial en los queratinocitos hiperproliferativos con respecto a los queratinocitos no hiperproliferativos.
12. 12. Composicion para la utilizacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el aceite esencial constituye un principio activo de la composicion.
13. 13. Aceite esencial de Origanum compactum para una utilizacion en el tratamiento o la prevencion en el ser humano, de queratosis en fase de transformacion cancerosa, de queratinocitos cancerosos, o de carcinoma proveniente de la transformacion de queratosis,

    caracterizandose dichas queratosis, queratinocitos cancerosos o carcinoma, por celulas portadoras de mutaciones en el gen p53.