ES2611589T3 - Procesos de producción de productos de fermentación - Google Patents
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Abstract
Proceso para producir un producto de fermentación de material que contiene almidón, que comprende (a) licuefacción de dicho material que contiene almidón con una alfa-amilasa; (b) tratamiento con una proteasa; (c) sacarificación en presencia de una enzima generadora de fuente de carbohidratos; y (d) fermentación en presencia de un organismo fermentador, donde los pasos (a) y (b) se realizan simultáneamente durante 0,1 a 12 horas antes del paso (c) y paso (d) que se realizan simultáneamente o consecutivamente
Description
[0052] La proteasa puede estar presente en concentraciones en el rango de 0,0001 a 1,0 % en peso de TS, preferiblemente 0,001 a 0,1 % en peso de TS.
Alfa-amilasa
[0053] La alfa-amilasa puede ser según la invención de cualquier origen. Preferidas son las alfa-amilasas de origen fúngico o bacteriano.
[0054] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, alfa-amilasa ácida fúngica o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "alfa-amilasa ácida" implica una alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) que añadida en una cantidad eficaz tiene una actividad óptima a un pH en el rango de 3 a 7, preferiblemente, de 3,5 a 6 o más preferiblemente de 4-5.
Alfa-amilasas bacterianas
[0055] Según la invención, una alfa-amilasa bacteriana puede preferiblemente derivar del género Bacillus.
[0056] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa Bacillus es derivada de una cepa de B. licheniformis, B. Amyloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus, pero también se puede derivar de otra especie Bacillus. Ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en SEQ ID n.º: 4 en la WO 99/19467, la Bacillus amyloliquefaciens alfa-amilasa (BAN) mostrada en SEQ ID n.º: 5 en la WO 99/19467 y la alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada en SEQ ID n.º: 3 en la WO 99/19467. En una forma de realización de la invención, la alfa-amilasa es una enzima con un grado de identidad de al menos 60 %, preferiblemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80 %, aún más preferentemente al menos 90 %, tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID n.º: 1, 2, 3, 4, o 5, respectivamente, en la WO 99/19467.
[0057] La alfa-amilasa Bacillus también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de la WO 96/23873, la WO 96/23874, la WO 97/41213, la WO 99/19467, la WO 00/60059 y la WO 02/10355. En concreto, variantes de alfa-amilasa contempladas se describen en la Patente US nos. 6,093,562, 6,297,038 o Patente EE.UU. n.º 6,187,576 e incluyen variantes alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) con una deleción de uno o dos aminoácidos en posiciones R179 a G182, preferiblemente una deleción doble descrita en la WO 1996/023873, ver por ejemplo página 20, líneas 1-10, preferiblemente correspondientes a delta (181-182) en comparación con la secuencia aminoácida alfa-amilasa BSG tipo salvaje expuesta en la SEC ID n.º: 3 descrita en la WO 99/19467 o deleción de aminoácidos R179 y G180 usando SEC ID n.º: 3 en la WO 99/19467 para la numeración. Aún más preferidas son las alfa-amilasas Bacillus, especialmente alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus, que tiene una deleción doble que corresponde con delta (181-182) y además comprende una N193F sustitución (denominada también I181* + G182* + N193F) en comparación con la alfa-amilasa de secuencia aminoácida BSG tipo salvaje expuesta en la SEC ID n.º:3 descrita en la WO 99/19467.
[0058] La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica es descrita en la Patente EE.UU. nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628.
Alfa-amilasas de bacteriana híbrida
[0059] Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende residuos de aminoácidos 445 C-terminal de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada como SEQ ID n.º: 4 en WO 99/19467) y los residuos de aminoácidos 37 N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEQ ID n.º: 3 en la WO 99/194676), con uno o más, especialmente todos, de la siguiente sustitución:
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus
licheniformis).
Preferidas también son variantes con una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes
en otra columna vertebral de alfa-amilasa Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o deleción de dos
residuos entre posiciones 176 y 179, preferiblemente, deleción de E178 y G179 (utilizando el SEQ ID n.º: 5
numeración de la WO 99/19467).
[0060] La alfa-amilasa bacteriana se puede adicionar en cantidades como se conocen bien en la técnica. Cuando se miden en unidades KNU (descritas abajo en la sección materiales y métodods") la actividad de alfa-amilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0,0005-5 KNU por g DS, preferiblemente, entre 0,001-1 KNU por g DS, tal como alrededor de 0,050 KNU por g DS.
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Alfa-amilasas fúngicas
[0061] Alfa-amilasas de ácido fúngico incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas a partir de una cepa del género Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o Aspergillus kawachii.
[0062] Una alfa-amilasa de ácido fúngico preferido es una alfa-amilasa de tipo Fungamyl que está preferiblemente derivada a partir de una cepa de Aspergillus oryzae. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa de tipo Fungamyl" indica una alfa-amilasa que muestra una alta identidad, es decir, más del 70 %, más del 75 %, más del 80 %, más del 85 % más del 90 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 %, más del 99 % o incluso 100 % de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID n.º: 10 en la WO 96/23874.
[0063] Otra alfa-amilasa ácida preferida está derivada de una cepa Aspergillus niger. En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa fúngica ácida es la de A. niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el número de acceso primario P56271 y descrita con más detalle en la WO 89/01969 (ejemplo 3). La alfa-amilasa de Aspergillus niger ácida se muestra también como SEQ ID n.º: 1 en la WO 2004/080923 (Novozymes). También se contemplan variantes de dicha amilasa fúngica ácida con al menos 70 % de identidad, tal como al menos 80 % o incluso al menos 90 % de identidad, tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad para SEQ ID n.º: 1 en la WO 2004/080923. Una alfa-amilasa fúngica de ácido disponible comercialmente adecuada derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).
[0064] Otras alfa-amilasas de tipo salvaje contempladas incluyen aquellas derivadas a partir de una cepa de los géneros Rhizomucor y Meripilus, preferiblemente, una cepa de Rhizomucor pusillus o Meripilus giganteus.
[0065] La alfa-amilasa ácida fúngica también puede ser una enzima tipo salvaje que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM) y un dominio catalítico de alfa-amilasa (es decir, ningún híbrido) o un variante del mismo. En una forma de realización, la alfa-amilasa fúngica ácida tipo salvaje está derivada de una cepa de Aspergillus kawachii, por ejemplo, la descrita por Kaneko et al. J. Fermento. Bioeng. 81:292-298(1996) "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; y además como EMBL:#AB008370.
Alfa-amilasa híbrida fúngica
[0066] En una forma de realización, la alfa-amilasa fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Ejemplos preferidos de alfa-amilasas híbridas fúngicas incluyen los descritos en la WO 2005/003311 o EEUU
[0067] Publicación de patente nº 2005/0054071 (Novozymes) o solicitud de pantente de EEUU nº 60/638,614 (Novozymes). Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico de alfa-amilasa (CD) y un módulo/dominio de enlace de carbohidratos (CBM), tal como un dominio de unión al almidón y un enlazador opcional.
[0068] Ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la tabla 1 a 5 en los ejemplos en la solicitud de pantente co-pendiente de EEUU nº 60/638,614, que incluye una variante de fungamil con dominio catalítico JA118 y Athelia rolfsii SBD (SEC ID n.º: 100 en la solicitud US 60/638,614), alfa-amilasa Rhizomucor pusillus con enlazador AMG Athelia rolfsii y SBD (SEC ID n.º: 101 en la US 60/638,614) y alfa-amilasa Meripilus giganteus con enlazador de glucoamilasa Athelia rolfsii y SBD (SEC ID n.º: 102 en la US 60/638,614).
[0069] Otros ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la publicación de patente EEUU nº 2005/0054071, incluyendo aquellas descritas en la tabla 3 en la página 15, tal como alfa-amilasa Aspergillus niger con enlazador de Aspergillus kawachii y dominio de unión al almidón.
Productos alfa-amilasa comerciales
[0070] Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE™ (DSM; Holanda), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X y SAN™, SUPER SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ ETHYL, SPEZYME™ AA, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.) y la alfa-amilasa fúngica ácida vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).
[0071] Unas alfa-amilasas ácidas, según la invención, pueden ser añadidas en una cantidad de 0,1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente, 0,10 a 5 AFAU/g DS, especialmente, 0,3 a 2 AFAU/g DS.
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polímeros de glucosa relativos. Sucesivamente, se retiran las unidades de maltosa de las extremidades de cadena no-reducida de una manera gradual hasta que la molécula se degrada o, en el caso de amilopectina, hasta que se alcanza un punto de derivación. La maltosa liberada tiene la configuración anomérica beta, por lo tanto, el nombre beta-amilasa.
[0081] Las beta-amilasas han sido aisladas de varias plantas y microorganismos (W.M. Fogarty y C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, vol. 15, págs. 112-115, 1979). Estas beta-amilasas se caracterizan por el hecho de que tienen temperaturas óptimas en el rango de 40 °C a 65 °C y pH óptimo en el rango de 4,5 a 7. Una beta-amilasa disponible comercialmente de cebada es NOVOZYM™ WBA de Novozymes A/S, Dinamarca y SPEZYME™ BBA 1500 de Genencor Int., USA.
Amilasa maltogénica
[0082] La amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la configuración alfa. Una amilasa maltogénica de cepa Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S. Las alfa-amilasas maltogénicas están descritas en la Patente US nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628.
[0083] La amilasa maltogénica, en una forma de realización preferida, puede ser añadida en una cantidad de 0,05-5 mg de proteína/gramo DS totales o 0,05- 5 MANU/g DS.
[0084] Aunque no se mencione específicamente en el contexto de un proceso de la invención, debe entenderse que la enzima(s) es(son) usada en una "cantidad efectiva".
[0085] La invención descrita y reivindicada aquí no se limita en su alcance por las formas de realización específicas aquí descritas, ya que estas formas de realización se destinan como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. Cualquier forma de realización equivalente se destina a estar dentro del campo de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se harán aparentes para los expertos en la técnica desde la descripción precedente. Tales modificaciones están también destinadas a encontrarse dentro del campo de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, las definiciones que incluye la presente descripción servirán de control.
[0086] La presente invención está posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no se deberían interpretar como limitación del ámbito de la invención.
Materiales y métodos
Enzimas:
[0087] Proteasa ALC: proteasa alcalina tipo salvaje derivada de Bacillus licheniformis. Glucoamilasa T: glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii y descrita como SEQ ID n.º: 7 en la WO 99/28448. Alfa-amilasa A: variante de alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus con las mutaciones: I81*+G182*+N193F descritas en la Patente US nº 6,187,576 y disponible en la solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca. La peptidasa A es un clan de peptidasa AA de la enzima de la familia A1 derivada de Rhizomucor miehei y producida recombinantemente en el Aspergillus oryzae. La enzima está disponible en la solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca.
Levadura
[0088] RED STAR™ disponible de Red Star/Lesaffre, USA
Métodos:
Actividad de alfa-amilasa (KNU)
[0089] La actividad de amilasa se puede determinar utilizando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima y la reacción está seguida de muestras de mezcla de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo.
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