ES2611958B2 - Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de células vegetales en suspensión - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un biorreactor tipo columna de burbujeo para realizar, en condiciones asépticas, el cultivo de células vegetales en suspensión, cuyas características de diseño permiten además, recuperar el medio de cultivo, sustituirlo por otro medio de cultivo y reutilizar la biomasa remanente en el mismo para una siguiente operación de cultivo.#El biorreactor comprende tres partes principales, cuerpo, tapa y soporte, que deben ensamblarse, esterilizarse y conectarse a una línea de aire estéril libre de aceite por minuto para su funcionamiento.
Description
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DESCRICPION
Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension. CAMPO DE LA INVENCION
La presente invention se refiere a un producto consistente en un biorreactor para llevar a cabo, en condiciones asepticas, el cultivo de celulas vegetales en suspension, cuyas caracterlsticas de diseno permiten ademas, recuperar el medio de cultivo, sustituirlo por otro medio de cultivo y reutilizar la biomasa remanente en el mismo para una siguiente operation de cultivo.
ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
El uso de biorreactores esta ampliamente extendido para el cultivo de microorganismos (bacterias, hongos filamentosos, etc.) tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Sin embargo, las caracterlsticas de su diseno, tlpicamente de tanque agitado por dispositivos mecanicos, no siempre son aptas u optimas para el cultivo de celulas vegetales. Ello se debe especialmente a que muestran bastante sensibilidad al estres por cizalla, presentan baja demanda de oxlgeno (cerca de 1pmol O2 a 10"6 celulas), baja tasa crecimiento (tiempo de duplication 25 a 110h) y frecuentemente se presentan como agregados grandes, de 2-4 mm de diametro (Rao, R. S. y Ravishankar, G. A. (2002). Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol Adv. 20: 101-153).
Para disenar un biorreactor apropiado para un bioproceso particular, es necesario conocer el sistema biologico, tanto su patron de crecimiento celular como su metabolismo y los factores que influyen sobre ellos para entender el requerimiento de las celulas sobre su medio ambiente flsico y qulmico.
Ademas, es necesario optimizar y controlar los parametros de operacion del biorreactor como la concentration de oxlgeno disuelto, pH, temperatura, mezclado y el suplemento de nutrientes con la finalidad de favorecer las funciones deseadas tanto para el mantenimiento de las celulas como para la production del metabolito.
Diferentes disenos de biorreactor se han mostrado aptos para el cultivo de celulas y tejidos vegetales, siendo los de agitation neumatica tipo columna de burbujeo y tipo airlift los mas apropiados para el cultivo de celulas en suspension. Sin embargo, un problema que presentan es la necesidad de una aireacion homogenea y constante.
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En cuanto a los materiales de construction hay una tendencia en los ultimos anos al uso de plasticos especiales para la fabrication de vasos de fermentation de un solo uso, sin embargo, los altos costes de consumibles solo se justifican si el producto obtenido es de un alto valor, por ello, solo se ha generalizado para la production de biofarmacos (anticuerpos, vacunas, protelnas terapeuticas) mediante el cultivo de celulas de mamlferos e insectos.
Las celulas vegetales se han cultivado para producir biomasa con diversas aplicaciones y tambien compuestos naturales excretados al medio de cultivo. En ambos casos, el proceso puede requerir el cambio de la composition qulmica del medio, que se hace efectiva por sustitucion del medio, incluso mas de una vez, lo que supone un problema importante porque esto puede requerir una manipulation del cultivo incluso fuera del biorreactor incrementandose mucho el riesgo de contaminacion y perdida del cultivo.
Con el fin de abordar este problema, se estudiaron los requerimientos basicos para el cultivo de celulas de vid y para la production del compuesto bioactivo trans-resveratrol en un biorreactor comercial de agitation mecanica. En base a ello se diseno y construyo un prototipo de biorreactor de bajo coste de agitation neumatica por burbujeo con forma de cono invertido y se llevo a cabo un estudio comparativo con uno comercial (Vera-Urbina, J.C.; Selles-Marchart, S.; Martlnez-Esteso, M.J.; Pedreno, M.A. and Bru-Martinez, R. (2013) Production of grapevine cell biomass (Vitis vinifera L. Gamay) and resveratrol in custom and commercial bioreactors using cyclodextrins and methyl jasmonate elicitors. In. Resveratrol: Sources, Production, and Health Benefits. Editor: Dominique Delmas pp19-39 Nova Science Publishers, Inc.). Los resultados obtenidos demuestran la viabilidad del escalado de matraces a biorreactores de bajo coste, pero sobretodo ponen de manifiesto claras limitaciones en la produccion de biomasa y de compuestos bioactivos, debido a las carencias del diseno. En particular, este diseno no podia satisfacer la demanda de oxlgeno del cultivo a altas densidades celulares que se dan en etapas avanzadas del ciclo de crecimiento asl como en condiciones de production del metabolito por elicitation.
Por todo lo anteriormente expuesto, se hace necesaria la realization de un nuevo diseno de biorreactor que presente las caracterlsticas optimas para cultivo de celulas vegetales y que supere las limitaciones en production de biomasa y compuestos bioactivos, para los cuales el cambio de medio de cultivo sea un requisito.
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La invention se refiere al diseno de un nuevo biorreactor para el crecimiento de celulas vegetales en condiciones asepticas en suspension en un medio liquido cuya composition satisface los requerimientos nutricionales y fisiologicos de las celulas y que es capaz de mantener unas condiciones fisicoquimicas apropiadas.
El prototipo se ha realizado para pruebas a escala de laboratorio, por lo que el tamano del mismo se ha limitado por la restriction que imponen las dimensiones de los equipos estandar de esterilizacion de laboratorio.
El biorreactor es de 7 litros con geometha cilmdrica y agitation neumatica por burbujeo apto para llevar a cabo el cultivo de suspensiones celulares vegetales, apto para la recuperation y sustitucion del medio de cultivo y apto para la reutilizacion de la biomasa, todo ello en un entorno aseptico permanente.
Los materiales reutilizables, como vidrio y metal, con disenos de agitacion neumatica son los mas apropiados para cultivo de celulas vegetales.
El biorreactor se compone de tres partes principales ensambladas y esterilizadas que son las siguientes:
• Cuerpo: recipiente de section transversal circular con paredes rectas que comprende al menos dos partes, una parte cilmdrica y una esferica.
• Tapa: pieza de forma cilmdrica que cierra la parte superior abierta del cuerpo.
• Soporte: pieza que permite la sujecion del cuerpo y la tapa.
Caracterizado porque el cuerpo comprende una base porosa que separa las dos partes del mismo, la parte cilmdrica y la esferica, permitiendo el flujo de fluidos de forma constante y uniforme entre ambas partes (pero no de partmulas de tamano superior al del poro) y comprende tambien al menos dos orificios entubados, uno de ellos conectado a una lmea de aire esteril libre de aceite con flujo regulable y otro para que circulen liquidos o gases; para poder asi suministrar aire al cultivo celular y realizar la agitacion neumatica del mismo manteniendo su homogeneidad y una eficaz transferencia de masa. Ademas, la tapa comprende al menos orificios para llenado, trasvase del cultivo y entrada/salida de gases lo que permite el cambio de medio en el biorreactor en condiciones asepticas.
En una realizacion en particular, el cuerpo comprende una pluralidad de orificios entubados para la conexion de tubos flexibles y la entrada y salida de fluidos.
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En una realization en particular, el cuerpo, en su parte cillndrica, comprende una doble pared que esta rematada con un reborde horizontal que permite el apoyo del cuerpo en el soporte y de la tapa sobre el cuerpo para el cierre hermetico del biorreactor.
En una realization en particular, el cuerpo, en la doble pared de la parte cillndrica, comprende al menos un orificio entubado de entrada y otro de salida para que circule un llquido atemperado y asl, intercambiar calor con el cultivo y mantener constante su temperatura. En cualquier caso, la temperatura puede mantenerse ambiente por otros medios.
En una realization en particular, el cuerpo es transparente u opaco.
En una realization en particular, el cuerpo es de vidrio o de acero.
En una realization en particular, la tapa tiene una pluralidad de orificios para poder fijarla al soporte y acoplar accesorios, como tapon, tubos de muestreo y llenado.
En una realization en particular, la tapa es de acero inoxidable.
En una realization en particular, el soporte es una pieza que comprende al menos cuatro tubos, en disposition paralela equidistante, soldados en el extremo de apoyo al suelo, a un tubo en forma de circunferencia incompleta y por el otro, a un aro macizo con orificios que permiten el acople con la tapa.
En una realizacion en particular, el soporte es de acero inoxidable.
En una realizacion en particular, el biorreactor se conecta a reservorios para el intercambio de llquido. Estos reservorios se conectan mediante tubos flexibles de silicona autoclavables con las entradas y salidas del biorreactor. Mediante derivation de los tubos y valvulas, el flujo de aire puede entrar por la base del cuerpo del biorreactor para airear el cultivo, o por la tapa, produciendose en este caso el vaciado del llquido hacia un reservorio vaclo. Reconfigurando la llnea de nuevo con las valvulas, el medio contenido en un reservorio lleno puede ser empujado por presion hacia el biorreactor y, entrando por la base, dar lugar al llenado del mismo. Son imprescindibles para realizar las operaciones de extraction y/o sustitucion de medio de cultivo para las cuales se ha ideado especlficamente este diseno.
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En una realization en particular, el biorreactor se conecta con un dispositivo de toma aseptica de muestras. Este dispositivo puede ser de fabrication casera o comercial y solo necesita conectarse al tubo de toma de muestras ensamblado en la tapa.
La invention aporta una serie de ventajas:
• Diseno adaptado a las necesidades del cultivo de celulas vegetales en suspension.
• Reduction de coste estructural frente a modelos comerciales de tanque agitado o airlift de tamano similar: cualquier dispositivo/sensor no imprescindible se elimina (ej. pH stato).
• Reduccion de coste operacional frente a modelos de un solo uso, especialmente apto para la obtencion de productos (biomasa y/o metabolitos) de valor comercial bajo o moderado.
• Posibilidad de cambio de medio y reutilizacion de biomasa asepticamente sin necesidad de un entorno aseptico (ej. cabina de flujo laminar).
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Para completar la description que se esta realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracterlsticas de la invention, se acompana como parte integrante de dicha description, las siguientes figuras con caracter ilustrativo y no limitativo, que representan lo siguiente:
FIGURA 1: Diseno del cuerpo del biorreactor: vista exterior y section mostrando el diseno interior.
FIGURA 2: Diseno de la tapa del biorreactor.
FIGURA 3: Diseno del soporte del biorreactor.
FIGURA 4: Partes del biorreactor ensambladas.
FIGURA 5: Reservorio para intercambio de llquidos con el biorreactor.
EXPOSICION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACION
Para una mejor comprension de la invention, se ha desarrollado la description detallada de las partes que componen las distintas configuraciones que se presentan.
Segun se aprecia en la figura 1, el biorreactor 4 comprende las siguientes partes:
• Cuerpo 1: recipiente hueco de una sola pieza de section circular con paredes rectas y de fondo curvo, es decir forma cillndrica hueca como un casquete esferico hueco.
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El cuerpo comprende la parte cillndrica 6 y la esferica 7, separadas internamente por la base porosa 5, de vidrio o acero, delimitando as! las dos partes antes mencionadas, cuya porosidad permite el flujo de fluidos entre ellas, pero no de partlculas de tamano mayor al del poro. La parte cillndrica 6 tiene doble pared para delimitar el compartimento 8 con orificios entubados de entrada 9 y salida 10 por donde puede circular un llquido atemperado para regular la temperatura de la parte cillndrica 6. La parte superior del cuerpo esta rematada con un reborde horizontal 11 que permite el apoyo del cuerpo en el soporte y de la tapa sobre el mismo para el cierre hermetico una vez ensambladas las partes. La parte esferica 7 del cuerpo posee al menos dos orificios entubados 12 y 13 para la conexion de tubos flexibles y la entrada y salida de fluidos.
• Tapa 2: pieza metalica de forma cillndrica maciza de unos pocos millmetros de espesor y un diametro algo mayor que el del borde superior del cuerpo. Esta tapa tiene varios orificios 14 redondos para poder atornillarla al soporte y otros para acoplar accesorios, como tapon 15, tubos de muestreo 16, llenado 17 y trasvase del cultivo 18. En la cara exterior, la tapa tiene soldadas unas portillas cortas del mismo material para conectar tubos flexibles para adicion de fluidos 19 y entrada/salida de gases 20. En la cara interna, la tapa pose un surco periferico para el acoplamiento de una junta torica de caucho o silicona para posibilitar un sellado hermetico con el cuerpo.
• Soporte 3: pieza metalica de cuatro tubos de unos pocos millmetros de seccion 21, en disposition paralela, soldados en un extremo (el de apoyo en suelo) a un tubo que forma una circunferencia incompleta 22 y por el otro, a un aro macizo 23 del mismo diametro externo que la tapa y diametro interno ligeramente superior al del cuerpo. Este aro 23 tiene varios orificios que coinciden con los de la tapa 14 para que puedan ser acoplados mediante tornillos que atraviesan ambas piezas. El aro tambien tiene asas soldadas 24 para facilitar el transporte de la pieza y tres piezas atornilladas 25 rematadas en material flexible, como teflon, donde apoya el cuerpo para evitar la fractura del vidrio a causa de tensiones.
A continuation se detalla el funcionamiento del biorreactor:
Se llevan a cabo operaciones preparatorias de esterilizacion por separado del biorreactor ensamblado con todos los tubos y tornillos accesorios y todos los orificios cerrados excepto el 20 donde se acopla un filtro de aire. Tambien se dispone de dos reservorios 26 de cierre
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hermetico y capacidad suficiente para contener todo el volumen operativo del biorreactor, conteniendo ambos medio de cultivo. El cierre del reservorio posee dos orificios entubados, uno para entrada/salida de aire 28, al cual se acopla el filtro de aire, y otro para entrada/salida de llquido 27, al cual se acopla internamente un tubo flexible de longitud suficiente para llegar al fondo del biorreactor. Los tres recipientes, biorreactor ensamblado y los dos reservorios estan desconectados de las llneas de aire y agua.
A continuacion, se produce el llenado o vaciado del biorreactor ensamblado esterilizado. Para ello, se conecta el biorreactor mediante tubo de silicona esteril bifurcado con una T entre los orificios 17 y 27 con los dos reservorios 26 llenos de medio esteril. El llquido de un reservorio 26 se trasvasa al biorreactor pinzando el tubo que va al otro reservorio y conectando la llnea de aire a entrada/salida de aire 28 en el reservorio que tiene el paso franco. Para trasvasar el llquido del otro reservorio se operarla de la misma forma. Estas operaciones se pueden revertir en cualquier momento para el vaciado del biorreactor cambiando la llnea de aire de 28 a 20, cerrando el orificio 17 y mediante tubo de silicona esteril bifurcado con una T conectando el biorreactor con un reservorio 26 vaclo entre los orificios 12 y 27. El ciclo de vaciado y llenado se puede repetir tantas veces como se desee. Este modo de realization es el que posibilita el cambio de medio en el biorreactor en condiciones asepticas.
En el siguiente paso se produce el aireado y agitado neumatico del biorreactor lleno. Asl, la llnea de aire esteril libre de aceite se conecta al orificio entubado 13 permitiendo la entrada de aire a la parte esferica 7, el paso de aire a traves de la base porosa 5, lo cual tiene efecto difusor, y el paso de aire difundido en forma de pequenas burbujas a la parte cillndrica 6 por donde ascienden libremente a traves del llquido produciendo el efecto de aireado y agitado neumatico. El aire que atraviesa el llquido sale de la parte cillndrica 6 a traves de la entrada/salida de gases 20, evitando que se produzca sobrepresion en el recipiente. El resto de orificios del biorreactor estan cerrados. Considerando las dimensiones del biorreactor, la llnea de aire esteril debe suministrar un flujo de al menos 5 litros por minuto para una aireacion y agitacion efectivas.
A continuacion, el biorreactor es inoculado. Para ello, la entrada de aire en 13 se desconecta y se cierra temporalmente y se coloca el biorreactor en un entorno aseptico, como el de una campana de flujo laminar. En ese entorno, se retira el tapon del orificio 15 de mayor diametro que el resto y a traves de el se vierte al biorreactor una cierta cantidad de
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suspension de celulas que se desea cultivar. Las celulas vegetales proceden de una suspension celular obtenida por dispersion en medio llquido con agitation orbital moderada (100-150 rpm) de un callo de celulas desdiferenciadas a partir de tejido vegetal cultivado in vitro (Vera-Urbina y col., 2013). La operation se facilita con la ayuda de un embudo previamente esterilizado. Finalmente se vuelve a cerrar el orificio 15 con su tapon.
Despues, se cultivan celulas vegetales en modo "lote” a partir de un inoculo de suspension celular. Tras la inoculation se retira el biorreactor del entorno aseptico y se vuelve a conectar la llnea de aire esteril a 13. El cultivo en el biorreactor se mantiene con un suministro continuo de aire para favorecer la homogeneidad y crecimiento del cultivo durante el tiempo necesario, hasta que este alcance la fase estacionaria de crecimiento o una cantidad deseada de biomasa. El cultivo se recupera finalmente desensamblando la tapa y trasvasandolo a otro recipiente.
La llnea de aire 13 puede saturarse de agua haciendola atravesar un recipiente de agua esteril, lo que evitarla perdidas de volumen del biorreactor durante periodos largos de cultivo.
Ademas, se cultivan celulas vegetales en modo "lote alimentado” a partir de un cultivo previo in situ. Tras un cultivo en lote, el medio agotado de nutrientes es desplazado desde el biorreactor a un reservorio 26 vaclo mediante la operacion de vaciado descrita previamente. La biomasa queda retenida en el biorreactor sobre la base porosa ya que el tamano de los agregados celulares es mayor que los poros. Una vez vaciado el medio, el biorreactor se llena con medio nuevo rico en nutrientes contenido en otro reservorio 26 mediante la operacion de llenado descrita previamente. Una vez llenado se continua segun la description de cultivo en "lote” de nuevo. Este ciclo de vaciado de medio agotado, suministro de medio rico y cultivo tecnicamente se puede repetir tantas veces como se desee. Tras el ultimo ciclo, el cultivo se recupera como se describe para modo "lote”.
A continuation se detallan algunos ejemplos de cultivo:
EJEMPLO 1: Cultivo de una suspension celular de Vitis vinifera en modo lote.
El cultivo se hizo por duplicado. Una cantidad de celulas frescas escurridas que se hablan cultivado en matraces agitados hasta fase estacionaria equivalente a un 2,2% peso/volumen
se inoculo en el biorreactor conteniendo 6675mL de medio de cultivo cuya composition esta descrita en la literatura (Bru, R., Selles, S., Casado-Vela, J., Belchi-Navarro, S., Pedreno, M. A. (2006). Modified cyclodextrins are chemically defined glucan inducers of defense responses in grapevine cell cultures. J Agr Food Chem. 54 (1): 65-67). La temperatura del 5 cultivo se mantuvo constante a 24°C mediante flujo de agua termostatizada a traves de la doble pared del cuerpo. Inicialmente se insuflo aire a un flujo de 0,3 litros por litro de cultivo y minuto (l.l"1.min"1) y se fue ajustando para evitar la sedimentation celular a lo largo del cultivo hasta un valor maximo de 0,6 l.l"1.min"1. Periodicamente, el medio se trasvasaba a un recipiente vaclo (ver modos de realization) para medir mediante una escala adosada al 10 cuerpo el volumen de empaquetamiento celular (VEC) como medida de la biomasa. Asimismo, se tomo periodicamente una muestra del cultivo para medir variables relacionados con la actividad metabolica del cultivo (sacarosa, glucosa, pH, conductividad) por metodos descritos en la literatura (Vera-Urbina y col., 2013). El resultado de las dos replicas y los parametros resultantes se muestran en la Tabla 1. De media, el cultivo tardo 15 28,5 dias en alcanzar la fase estacionaria incrementandose la biomasa en 7,1 veces.
Tabla 1. Valores de production y parametros cineticos del crecimiento de biomasa de celulas de vid en el biorreactor. TC: tiempo de cultivo, VO: volumen de operation, PF: peso fresco, FM: Factor de multiplicacion, td: Tiempo de duplicacion.
- Replica
- Biomasa inicial TC VO Biomasa final Incremento Biomasa FM td
- Num.
- (%, m/v) PF (g) (dias) (mL) (%, m/v) PF (g) PF (g) (dias)
- 1
- 2,22 148,5 28 6675 15,1 1008,3 859,79 6,8 5,6
- 2
- 2,23 149,0 29 6675 16,2 1080,9 931,86 7,3 6,4
- Promedio
- 2,3±0,01 148,8±0,3 28,5±0,7 15,7±0,8 1044,6±51.3 7,1±0,4 6,0±0,6
- Replica
- Produccion Productividad Produccion especifica Tasa de crecimiento celular
- Num.
- [g-L-1] [g.L-1.dias-1] [g biom. g subs-1] p (dias-1)
- 1
- 132,1 4,7 6,6 0,1248
- 2
- 143,4 4,9 7,2 0,1078
- Promedio
- 137,8±8,0 4,8±0,1 6,9±4,0 0,116±0,012
EJEMPLO 2: Produccion extracelular del compuesto trans-resveratrol en modo lote y modo lote alimentado por una suspension celular de Vitis vinlfera.
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Una cantidad de 1395g de celulas frescas escurridas que se hablan cultivado en matraces agitados hasta fase estacionaria se inoculo en el biorreactor conteniendo 4500mL de medio
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de elicitation cuya composition esta descrita en la literatura (Lijavetzky, D., Almagro, L., Belchi-Navarro, S., Matmez-Zapater, J. M., Bru, R., Pedreno, M. A. (2008). Synergistic effect of methyljasmonate and cyclodextrin on stilbene biosynthesis pathway gene expression and resveratrol production in Monastrell grapevine cell cultures. BMC Research Notes. 1:132), dando un volumen final de 5500mL de cultivo (inoculo equivalente a un 25,3% peso/volumen). La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 24°C y la aireacion tambien a un flujo de 0,43 l.l-1.min-1. Periodicamente se tomo una muestra del cultivo para medir la concentration de trans-resveratrol extracelular, ademas de variables relacionadas con la actividad metabolica del cultivo (sacarosa, glucosa, pH, conductividad) por metodos descritos en la literatura (Vera-Urbina y col., 2013). Cuando la concentration de trans- resveratrol supero los 3g/L se procedio a la sustitucion del medio agotado en nutrientes y rico en producto por medio fresco de elicitacion, mediante el modo de realization "lote alimentado”. De esta forma se realizaron 3 ciclos de production cuyos resultados se resumen en la Tabla 2. La duration media de los ciclos fue de 4,2 dias con una production media de 15,2 g/ciclo.
Tabla 2. Valores de production de trans-resveratrol obtenidos en medio de elicitacion (Lijavetzky et al. 2008) por lote-alimentado mediante inoculation directa (25% -m/v-) con suspensiones celulares de vid (Vitis vinifera L. c.v.Gamay) en el biorreactor.
- Ciclo de production
- Tiempo de Elicitacion (dias) Production Productividad Production especifica
- (mg.mL"1)
- (mg) (mg.mL"1.dias"1) (mg.g biomasa"1) (mg.g sustrato"1)
- Ciclo 1
- 5,6 2,92±0,03 13 153,6±139,9 0,53±0,01 9,4±0,1 146,2±1,6
- Ciclo 2
- 3,4 3,52±0,13 15 504,2±559,1 1,04±0,04 11,1±0,4 172,3±6,2
- Ciclo 3
- 3,6 3,99±0,02 16 937,7±90,8 1,12±0,01 12,1±0,1 188,2±1,0
- Promedio
- 4,2±1,2 3,48±0,53 15 198,5±1900 0,90±0,32 10,9±1,4 168,9±21,2
EJEMPLO 3: Production extracelular del compuesto trans-resveratrol en modo lote alimentado acoplado a un cultivo en modo lote de una suspension celular de Vitis vinifera.
Haciendo uso del diseno ventajoso del biorreactor, los dos procesos necesarios para la production del compuesto extracelular por el cultivo de celulas vegetales, se integran en un
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solo proceso operando solo en modo lote alimentado. Para acortar el periodo de crecimiento de biomasa se utilizo un inoculo mas fuerte, una cantidad de 580g de celulas frescas escurridas que se ha cultivado en matraces agitados hasta fase estacionaria que se inoculo en el biorreactor conteniendo 5300mL de medio de cultivo dando un volumen de cultivo de 5 5827mL (inoculo equivalente a un 10% peso/volumen). La temperatura del cultivo se
mantuvo constante a 24°C y el flujo aire se fue ajustando de 0,47 inicial hasta 0,54 l.l"1.min"1 final. El crecimiento y las variables relacionados con la actividad metabolica del cultivo se midieron como en el Ejemplo 1. Tras 8 dlas de crecimiento se alcanzo un 26,6% VEC (equivalente a 18,4% peso/volumen). En ese momento se procede a la sustitucion del medio 10 de crecimiento por medio fresco de elicitacion, mediante el modo de realization lote alimentado. Procediendo a partir de aqul de la misma forma que en el Ejemplo 2, de modo que se realizaron 4 ciclos de production cuyos resultados se resumen en la Tabla 3. El cuarto ciclo fue muy poco productivo, por lo que los rendimientos se calcularon sobre los ciclos 1 a 3. La duration media de los ciclos fue de 5,6 dlas con una produccion media de 15 11,9 g/ciclo.
Tabla 3. Valores de la produccion de trans-resveratrol obtenidos con suspensiones celulares de vid en medio de elicitacion (Lijavetzky et al. 2008) en el biorreactor implementando un sistema de produccion por lote-alimentado proveniente del acoplamiento 20 de produccion de biomasa seguida de elicitacion.
- Ciclo de produccion
- Tiempo de elicitacion ^as) Produccion Productividad Produccion esperifica
- (mg.mL-1)
- (mg) (mg.mL-1^as-1) (mg. g biomasa-1) (mg. g sustrato-1)
- Ciclo 1
- 6 3,57±0,04 14 867,8±169,3 0,60±0,01 14,0±0,2 165,2±1,9
- Ciclo 2
- 5 2,48±0,13 10 679,1±539,7 0,50±0,03 10,0±0,5 118,7±6,0
- Ciclo 3
- 6 2,35±0,03 10 018,6±144,4 0,39±0,01 9,4±0,1 111,3±1,6
- Ciclo 4
- 4 0,23±0,01 1 018,4±18,5 0,06±0,00 0,96±0,02 11,32±0,2
- Promedio (ciclos 1-3)
- 5,6±0,6 2.80±0.67 11 856,7±2,630 0,49±0.10 11,1±2,5 131,7±29.2
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension que comprende tres partes principales ensambladas y esterilizadas:• Cuerpo: recipiente de seccion transversal circular con paredes rectas que comprende al menos dos partes, una parte cilmdrica y una esferica.• Tapa: pieza de forma cilmdrica que cierra la parte superior abierta del cuerpo.• Soporte: pieza que permite la sujecion del cuerpo y la tapa.Caracterizado porque el cuerpo comprende una base porosa que separa las dos partes del mismo, la parte cilmdrica y la esferica; y comprende tambien al menos dos orificios entubados, uno de ellos conectado a una lmea de aire esteril libre de aceite con flujo regulable y otro para la circulation de liquidos o gases. Ademas, la tapa comprende al menos orificios para llenado, trasvase del cultivo y entrada/salida de gases.
- 2. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el cuerpo comprende una pluralidad de orificios entubados para la conexion de tubos flexibles y la entrada y salida de fluidos.
- 3. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el cuerpo, en su parte cilmdrica, comprende una doble pared que esta rematada con un reborde horizontal.
- 4. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el cuerpo, en la doble pared de la parte cilmdrica, comprende al menos un orificio entubado de entrada y otro de salida para que circule un liquido atemperado.
- 5. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el cuerpo es transparente u opaco.
- 6. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el cuerpo es de vidrio o de acero.
- 7. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde la tapa tiene una pluralidad de orificios para poder fijarla al soporte y acoplar accesorios, como tapon, tubos de muestreo y llenado.
- 8. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde la tapa es de acero inoxidable.
- 9. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el soporte es una pieza que comprende al menos cuatro tubos, en disposition paralela equidistante, soldados en el extremo de apoyo al suelo, a un tubo en forma de circunferencia incompleta y por el otro, a un aro macizo con orificios que permiten el acople con la tapa.
- 10. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el soporte es de acero inoxidable.
- 11. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el biorreactor se conecta a reservorios para el intercambio de liquido mediante tubos flexibles de silicona autoclavables con las entradas y salidas del biorreactor.
- 12. Biorreactor tipo columna de burbujeo para cultivo de celulas vegetales en suspension segun la reivindicacion 1, donde el biorreactor se conecta con un dispositivo de toma aseptica de muestras a traves del tubo de toma de muestras de la tapa.
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