ES2614880T3

ES2614880T3 - Vacuna de ADN de HER2 como tratamiento auxiliar para cánceres en animales de compañía

Info

Publication number: ES2614880T3
Application number: ES11770986.5T
Authority: ES
Inventors: Laurent Bernard Fischer
Original assignee: Merial Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2031-10-13
Also published as: JP2013545447A; LT2629791T; SMT201700061T1; PL2629791T3; WO2012054294A1; HRP20170253T1; AU2011318369B2; EP2629791B1; MX2013004222A; EP2629791A1; PT2629791T; JP6113659B2; JP2016208988A; RS55692B1; ME02604B; SMT201700061B; MX343848B; US20150374808A1; US9901628B2; DK2629791T3

Abstract

Un antígeno Her2/neu xenogénico que es xenogénico de un antígeno Her2/neu expresado por células mamarias de un perro, para uso en el tratamiento de carcinoma/tumor mamario canino en un perro que padece carcinoma/tumor mamario canino, donde el antígeno Her2/neu xenogénico está en una cantidad inmunológicamente eficaz y el antígeno Her2/neu xenogénico se administra después de la retirada quirúrgica de tumores en sujetos que padecen dichos cánceres, y donde el antígeno Her2/neu asociado a tumor de glándula mamaria xenogénico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antígeno Her2/neu asociado a tumor de glándula mamaria terapéutico xenogénico bajo el control de un promotor que promueve la expresión del antígeno Her2/neu asociado a tumor de glándula mamaria en perro.

Description

DESCRIPCION

Vacuna de ADN de HER2 como tratamiento auxiliar para canceres en animales de companla 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] Esta solicitud se refiere a composiciones para el tratamiento de la diferenciacion de canceres dependientes de antlgeno y a procedimientos de uso de dichas composiciones. La invencion utiliza composiciones que contienen antlgenos de diferenciacion xenogenica que estan asociados a canceres para proporcionar una

10 terapia eficaz.

[0002] Los antlgenos de diferenciacion son antlgenos especlficos de tejido que son compartidos por tumores autologos y algunos alogenicos de derivacion similar y en contrapartidas de tejido normal en la misma etapa de diferenciacion. Se ha mostrado que los antlgenos de diferenciacion se expresan por una variedad de tipos

15 tumorales, incluyendo melanoma, leucemia, linfomas, carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de prostata, carcinoma de ovario, carcinomas de pancreas y canceres de pulmon. Por ejemplo, los antlgenos de diferenciacion expresados por celulas de melanoma incluyen Melan-A/MART-1, Pmell7, tirosinasa y gp75. El antlgeno de diferenciacion expresado por linfomas y leucemia incluye los marcadores de diferenciacion de linfocitos B CD 19 y CD20/CD20 B. Es un ejemplo de un antlgeno de diferenciacion expresado por carcinoma colorrectal, 20 carcinoma de mama, carcinoma de pancreas, carcinoma de prostata, carcinoma de ovario y carcinoma de pulmon el polipeptido de mucina muc-1. Es un antlgeno de diferenciacion expresado, por ejemplo, por carcinoma de mama Her2 (sinonimos: Her2/neu, ECBB2, ErbB2, c-erb-2), que es un gen que codifica un receptor tirosina cinasa que es un miembro de la familia de receptores de factor de crecimiento epidermico (De Maria y col., 2005). Se ha demostrado sobreexpresion de Her2 en tumores de glandula mamaria tanto en gato (Winston y col., 2005) como en 25 perro (Rungsipipat y col., 2008). Winston y col. (2005) usaron procedimientos de ensayo existentes (HERcEpTEsT™, Dako USA, Carpinteria, CA; NCL-CB11, Novocastra, Newcastle, RU) para graduar exitosamente los niveles de expresion de Her2 en tumores mamarios de felino como 0= mlnimo/ausente, 1= debil, 2= moderado o 3= intenso. Los ensayos HERCEPTEST™ y NCL-CB11 identificaron a 27 y 23 gatos respectivamente, de los 30 examinados, por tener un grado 2 o 3 de expresion de Her2 en muestras de tumor mamario.

30

[0003] Ademas de graduar exitosamente los niveles de sobreexpresion de Her2 en tumores mamarios de felino, Winston y col. (2005) usaron HERCEPTEST™ para detectar bajos niveles de expresion de Her2 en tejidos epiteliales felinos normales y en tipos de celulas que incluyen: follculo piloso, glandula mamaria, foveola gastrica, conducto de glandula salival, tubulos corticales y medulares renales, cripta colonica y del intestino delgado, cerebro,

35 conducto e islotes pancreaticos, macrofagos esplenicos, corteza suprarrenal, hepatocitos y celulas de Leydig testiculares. Se ha documentado la expresion de Her2 en una serie de tipos de celulas epiteliales humanas incluyendo gastrointestinales, respiratorias, reproductivas, urinarias, cutaneas, mamarias y placentarias (Press y col., 1990). Estos hallazgos indican que la expresion de Her2 es comun en una serie de tipos de tejido de seres humanos y gatos. El hallazgo de la sobreexpresion de Her2 en tumores mamarios de perro sugiere que esta especie 40 compartirla caracterlsticas de expresion identificadas en seres humanos y gatos. Los ensayos y reactivos existentes pueden servir como herramientas para cribar los niveles de expresion de Her2 en canceres de animal de companla para justificar el tratamiento con la vacuna del cancer de Her2.

[0004] Desgraciadamente, en la mayorla de casos, el sistema inmunitario del individuo es tolerante a dichos 45 antlgenos de diferenciacion y no consigue crear una repuesta inmunitaria eficaz. Se han considerado varias

tecnologlas para enfrentarse a este reto: (citocinas como coadyuvantes geneticos (Chang y col., 2004), vacunacion xenogenica (Pupa y col., 2005), electrotransferencia (Quaglino y col., 2004), combinacion con quimioterapia (Bernhardt y col., 2002). Aunque los resultados son esperanzadores, se requerirla mayor eficacia para que estos enfoques fueran considerados un componente clave de una estrategia terapeutica. Ademas, hallazgos recientes 50 indican que se requieren tanto inmunidad de anticuerpo como mediada por celula para la erradicacion tumoral despues de inmunizacion, lo que explica quizas la falta de exito en el campo (Orlandi y col., 2007). Por lo tanto, para el tratamiento de canceres donde el tumor expresa antlgenos de diferenciacion, serla deseable tener un procedimiento de estimulacion de una respuesta inmunitaria terapeuticamente eficaz contra el antlgeno de diferenciacion in vivo. Es un objeto de la presente invencion proporcionar dicho procedimiento.

55

Referencias

[0005]

60 Orlandi y col. “Antibody and CD8+ T cell Responses against HER2/neu Required for Tumor Eradication after DNA Immunization with a Flt-3 Ligand FusionVaccine”. Clin Cancer Res 2007; 13(20) 15 de octubre de 2007.

Amici A. y col. Venanzi FM, Concetti A. “Genetic immunization against neu/erbB2 transgenic breast cancer”. Cancer

Immunol Immunother 1998; 47: 183-90.

Bergman PJ y col. “Long-Term Survival of Dogs with Advanced Malignant Melanoma after DNA Vaccination with Xenogeneic Human Tyrosinase: A Phase I Trial”. CCR, Vol. 9, 1284-1290, abril de 2003.

Bargmann y col. “The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein”. Nature, 16-22 de 5 enero de 1986; 319(6050): 226-30.

Norell H y col. “Vaccination with a plasmid DNA encoding HER2/neu together with low doses of GM-CSF and IL-2 in patients with metastatic breast carcinoma: a pilot clinical trial”. JTM, 7 de junio de 2010, 8:53.

Jacob, JB y col. “Combining Human and Rat Sequences in Her2 DNA Vaccines Blunts Immune Tolerance and Drives Antitumor Immunity”; Cancer Res, 1 de enero de 2010, 70; 119.

10 De Maria R y col. “Spontaneous Feline Mammary Carcinoma is a Model of Her2 Overexpressing Poor Prognosis Human Breast Cancer”; Cancer Res 2005: 65 (3); 907-912.

Philibert JC y col. “Influence of Host Factors on Survival in Dogs with Malignant Mammary Gland Tumors”; J Vet Intern Med 2003; 17: 102-106.

Press MF y col. “Expression of the Her2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues”; Oncogene, 5: 15 953-62.

Rungsipipat A y col.; “C-erbB-2 oncogene and P21WAF/CIPI tumor suppressor gene expression as prognostic factors in canine mammary adenocarcinomas”; Comp Clin Pathol 2008, 17: 35-41.

Winston J y col. “Immunohistochemical detection of Her=2/neu expression in spontaneous feline mammary tumours”; Veterinary and Comparative Oncology 3, 1, 8-15, 2005.

20 Chang sY y col. “Enhanced efficacy of DNA vaccination against Her2/neu tumor antigen by genetic adjuvants”; IJC vol 111 paginas 86-95, 10 de agosto de 2004

Pupa y col. “HER2: A biomarker at the crossroads of breast cancer immunotherapy and molecular medicine”. JCP vol. 205 paginas 10-18, 10 de mayo de 2005.

Quaglino E y col. “Concordant morphologic and gene expression data show that a vaccine halts HER2/neu 25 preneoplastic lesions”. JCI, vol. 113 N° 5 marzo de 2004.

Bernhard H y col. “Vaccination against the HER2/neu oncogenic protein”. Endocrine-Related Cancer 9 (1) 33-44, 2002.

Berta, GN y col. “Anti-HER2 DNA vaccine protects Syrian hamsters against squamous cell carcinomas”. Br J Cancer, vol 93(11), 28 de noviembre de 2005.

30 Disis y col. “Peptide-based, but not whole protein, vaccines elicit immunity to HER2/neu, an oncogenic self-protein”. The Journal of Immunology 156: 3151-3158, 1 de mayo de 1996.

Eck y col. (“Gene Based Therapy in The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Goodman and Gilman, Eds, 1996, pag. 77-101).

Zhai y col. “Antigen-Specific Tumor Vaccines”. The Journal of Immunology 156: 700-710, Enero de 1996. Verma y 35 Somia. “Gene and therapy-promises, problems and prospects”. Nature 389: 239-242, septiembre de 1997.

Miller y Vile. “Targeted vectors for gene therapy”. FASeB J. 9: 190-199, 1995.

Deonarain, Mahendra. “Ligand-targeted receptor-mediated vectors for gene delivery”. Exp. Opin. Ther. Patents 8(1): 53-69, 1998.

Crystal. “Transfer of Genes to Humans: Early Lessons and Obstacles to Success”. Science 270: 404-410, 20 de 40 octubre de 1995.

B. Bouchard y col., "Induction of Pigmentation in Mouse Fibroblasts by Expression of Human Tyrosinase cDNA", J. Exp. Med., 1989, vol. 169, pag. 2029-2042.

B. Bouchard y col., "Production and Characterization of Antibodies against Human Tyrosinase", The Journal of Investigative Dermatology, 1994, vol. 102, n° 3, pag. 291-295.

45 J. Rowell y col., "Lysosome-Associated Membrane Protein-1-Mediated Targeting of the HIV-1 Envelope Protein to an Endosomal/Lysosomal Compartment Enhances Its Presentation to MHC Class II-Restricted T Cells", The American Association of Immunologists, 1995, pag. 1818-1828.

S. Krishnan y col., "Paving the way towards DNA vaccines", Nature Medicine, 1995, vol. 1, n° 6, pag. 521-522.

S. Barclay y col., "Rapid isolation of monoclonal antibodies specific for cell surface differentiation antigens", Proc. 50 Natl. Acad. Sci. USA, 1986 vol. 83, pag. 4336-4340.

S. Vijayasaradhi y col., "Intracellular Sorting and Targeting of Melanosomal Membrane Proteins: Identification of Signals for Sorting of the Human Brown Locus Protein, GP75", The Journal of Cell Biology, 1995, vol. 130, n° 4, pag. 807-820.

D. Pardoll y col., "Exposing the Immunology of Naked DNA Vaccines", Immunity, Cell Press, 1995, vol. 3, pag. 16555 169.

S. Vijayasaradhi y col., "The Melanoma Antigen gp75 is the Human Homologue of the Mouse b (Brown) Locus Gene Product", J. Exp. Med., 1990, vol. 171, pag. 1375-1380.

G. Adema y col., "Molecular Characterization of the Melanocyte Lineage-specific Antigen gyp 100", The Journal of Biology Chemistry, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1994, vol. 269, n° 31, pag. 2012660 20133.

A. Houghton y col., "Recognition of Autoantigens by Patients with Melanoma", Annals New York Academy of Sciences, 1993, pag. 59-69.

C. Naftzger y col., "Immune response to a differentiation antigen induced by altered antigen: A study of tumor rejection and autoimmunity", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, pag. 14809-14814.

F. Ausubel y col., "Expression of Proteins is Insect Cells using Baculoviral Vectors", Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1990, vol. 8, 16.8.1-16.11-7.

5 J. Ulmer y col., "Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Encoding a Viral Protein", Science, 1993, vol. 259, pag. 1745-1749.

C. Tiffs y col., "The Folding and Cell Surface Expression of CD4 Requires Glycosylation", The Journal of Biological Chemistry, 1992, vol. 267, n° 5, pag. 3268-3273.

S. Park, "JL1, A Novel Differentiation Antigen of Human Cortical Thymocyte", J. Exp. Med., The Rockefeller 10 University Press, 1993, vol. 178, pag. 1447-1451.

C. Cabanas y col., "Characterization of a CD 11 c-Reactive Monoclonal Antibody (HCI/I) Obtained by Immunizing with Phorbol Ester Differentiated U937 Cells", Hybridoma, 1988, vol. 7, n° 2, pag. 167-177.

N. Nanda y col. "Induction of Anti-Self-Immunity to Cure Cancer", Cell, 1995, vol. 82, pag. 13-17, citado por otros.

D. Peruzzi y col., Vaccine 28 (2010), pag. 1201-1208 describe a telomerasa y HER-2/neu como dianas de vacunas 15 geneticas del cancer en perros.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0006] Se ha encontrado ahora que puede superarse la tolerancia del sistema inmunitario por antlgenos de 20 diferenciacion diana autoderivados y estimularse una respuesta inmunitaria mediante la administracion de un

antlgeno de diferenciacion xenogenico (de tipo silvestre o mutante) del mismo tipo de una especie diferente del sujeto que se esta tratando (documentos 6.328.969 y US 7.556.805 de Sloan-Kettering).

[0007] Por ejemplo, puede usarse un antlgeno de diferenciacion de rata para estimular una respuesta 25 inmunitaria en el correspondiente antlgeno de diferenciacion en un sujeto canino. La administracion de antlgenos

alterados de acuerdo con la invencion da como resultado una inmunidad eficaz contra el antlgeno original expresado por el cancer en el sujeto tratado. Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas mamarias de perro, para uso en el tratamiento de carcinoma/tumor mamario canino en un perro que padece carcinoma/tumor 30 mamario canino, en el que el antlgeno Her2/neu xenogenico esta en una cantidad inmunologica eficaz y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres, y en el que el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a 35 tumor de glandula mamaria en el perro. Se proporciona tambien un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas de glandula mamaria de perro, para uso en el tratamiento de tumor de glandula mamaria canina en un perro que padece carcinoma/tumor de glandula mamaria canina, en el que el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula 40 mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico en perro, y en el que el vector tiene una secuencia que comprende 106-3885 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1 y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres. Se proporciona ademas un vector que es capaz de expresar in vivo en un canino la protelna expuesta en la SEQ ID NO:2 para uso en el 45 tratamiento de carcinoma/tumores mamarios caninos en un perro que padece carcinoma/tumor mamario canino, en el que el carcinoma/tumor mamario canino es un carcinoma/tumor mamario canino asociado a Her2/neu, en el que el vector se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres. Se proporciona ademas el uso de un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas mamarias de perro, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de 50 carcinoma/tumor mamario canino en un perro que padece carcinoma/tumor mamario canino, en el que el antlgeno Her2/neu xenogenico esta en una cantidad inmunologica eficaz y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres, y en el que el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de 55 un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria en perro. Como aspecto adicional, se proporciona el uso de un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xengenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas de glandula mamaria de perro, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de tumor de glandula mamaria canina en un perro que padece carcinoma/tumor de glandula mamaria canina, en el que el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria xenogenico es 60 un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico en perro, y en el que el vector tiene una secuencia que

comprende 106-3885 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1 y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres. Se define el alcance de la presente invencion por las reivindicaciones. La materia en cuestion fuera del alcance de las reivindicaciones es solo para informacion.

5

[0008] Se usan antlgenos de diferenciacion terapeuticos basados en antlgenos de diferenciacion asociados a carcinoma/tumor de glandula mamaria de acuerdo con la invencion para tratar, por ejemplo, carcinoma de glandula mamaria despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres. En una realization de la invencion, se administra a un sujeto un plasmido que comprende una secuencia que codifica un receptor

10 tirosina cinasa xenogenico, por ejemplo receptor tirosina cinasa de rata, bajo el control de un promotor adecuado. Por ejemplo, se han tratado perros usando plasmidos que comprenden una secuencia de ADN que codifica el receptor tirosina cinasa de rata con un beneficio cllnico pronunciado.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

15

[0009]

La FIG. 1A muestra el tiempo de supervivencia global despues de inmunizacion y resection quirurgica del MGT; la FIG. 1B muestra el tiempo de supervivencia libre de enfermedad despues de inmunizacion y reseccion quirurgica 20 del MGT;

la FIG. 1C muestra el tiempo de supervivencia libre de metastasis despues de inmunizacion y reseccion quirurgica del MGT;

la FIG. 2 muestra un mapa del plasmido pcDNA3.1 (+/-);

la FIG. 3 muestra un mapa y la secuencia del plasmido pING-tirosinasa humana, en que se ha retirado la secuencia 25 de codification de tirosina humana. Es aqul donde se inserto Her2/neu de rata (nucleotidos 17-3799 de la SEQ ID NO: 1) para producir rHer2/neu-pING de la presente invencion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

30 [0010] La presente invencion proporciona un procedimiento para tratar tumores de glandula mamaria en un

sujeto mediante la estimulacion de una respuesta inmunitaria ante un antlgeno de diferenciacion asociado a glandula mamaria. El sujeto es preferiblemente canino o felino, aunque la invencion puede aplicarse a otras especies animales, preferiblemente especies de mamlferos o aves tambien.

35 [0011] Como se usa en la memoria descriptiva y reivindicaciones de esta solicitud, el termino “respuesta

inmunitaria” engloba tanto respuestas inmunitarias celulares como humorales. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es suficiente para proporcionar inmunoproteccion frente al crecimiento de tumores que expresan el antlgeno de diferenciacion diana. El termino “estimula” hace referencia a la estimulacion inicial de una nueva respuesta inmunitaria o a la potenciacion de una respuesta inmunitaria preexistente.

40

[0012] De acuerdo con la invencion, se trata un sujeto mediante la administration de un antlgeno de diferenciacion xenogenico del mismo tipo que un antlgeno de diferenciacion diana expresado por celulas de tumor de glandula mamaria del sujeto en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria. Por tanto, el antlgeno de diferenciacion diana es el antlgeno Her2/neu encontrado en celulas mamarias, y el antlgeno terapeutico

45 es un antlgeno Her2/neu xenogenico.

[0013] En una realizacion, el uso de la invencion puede incluir las siguientes etapas: (1) inmunizacion de un animal necesitado de un antlgeno xenogenico, por ejemplo Her2/neu de rata expuesto en la SEQ ID NO:2 y codificado por los nucleotidos 106-3885 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1, (2) sensibilization sin aguja

50 de respuestas inmunitarias, (3) recuerdo basado en electrotransferencia y (4) vacunacion despues de citorreduccion tumoral por terapia primaria quirurgica.

[0014] En otra realizacion, se lleva a cabo el uso de la invencion en sujetos, incluyendo animales de companla, sin metastasis (concretamente, en etapas relativamente tempranas de la progresion de la enfermedad

55 carcinoma mamario).

[0015] En algunas realizaciones, el recuerdo comprende administrar plasmidos que codifican antlgenos xenogenicos, por ejemplo aquellos que codifican la protelna Her2 de rata (SEQ ID NO:2).

60 [0016] En algunas realizaciones, el antlgeno xenogenico esta codificado por un nucleotido que tiene

sustituciones nucleotldicas favorables con respecto a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1. Las sustituciones favorables incluyen cualquier cambio que de como resultado una respuesta inmunitaria mejorada frente a Her2/neu

expresado por celulas de tumor/carcinoma mamario. Las sustituciones pueden incluir secuencias existentes tales como Her2 de murino (SEQ ID NO:3), Her2 humana (SEQ ID NO:4) o cualquier secuencia de Her2 xenogenica, o un fragmento de las mismas, capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria terapeuticamente eficaz en un animal diana contra un carcinoma mamario asociado a Her2.

5

[0017] En algunas realizaciones, el recuerdo comprende administrar un antlgeno de diferenciacion xenogenico.

[0018] En otras realizaciones, el recuerdo comprende administrar un antlgeno de diferenciacion singenico.

10

[0019] El antlgeno de diferenciacion xenogenico puede administrarse como un antlgeno de diferenciacion purificado derivado del organismo fuente. Las protelnas pueden purificarse con este fin a partir de lisados celulares usando procedimientos de cromatografla en columna. Las protelnas con este fin pueden purificarse tambien a partir de fuentes recombinantes, tales como clones bacterianos o de levadura o llneas celulares de mamlfero o insecto

15 que expresan el producto deseado.

[0020] La administracion del antlgeno de diferenciacion xenogenico puede lograrse por varias vlas. En primer lugar, puede administrarse el antlgeno de diferenciacion xenogenico como parte de una composicion de vacuna que puede incluir uno o mas coadyuvantes tales como alumina, QS21, TITERMAX o sus derivados, coadyuvante de

20 Freund incompleto o completo y relacionados y citocinas tales como factor estimulante de colonias de granulocitos- macrofagos, ligando flt-3, interleucina 2, interleucina 4 e interleucina 12 para aumentar la intensidad de la respuesta inmunitaria. La composicion de vacuna puede estar en forma de un antlgeno de diferenciacion xenogenico en una solucion o suspension, o puede introducirse el antlgeno de diferenciacion terapeutico en un portador lipldico tal como un liposoma. Dichas composiciones se administraran generalmente por via subcutanea, intradermica o 25 intramuscular. Las composiciones de vacuna que contienen antlgeno de diferenciacion xenogenico expresado se administran en cantidades que sean eficaces para estimular una respuesta inmunitaria ante al antlgeno de diferenciacion diana en el sujeto. La cantidad preferida para administrar dependera de la especie del sujeto y del antlgeno especlfico, pero puede determinarse mediante pruebas preliminares rutinarias en que se procuran dosis crecientes y se mide la extension de la formacion de anticuerpos o la respuesta de linfocitos T mediante ELISA o 30 pruebas similares. Las respuestas de linfocitos T pueden medirse tambien mediante ensayos inmunitarios celulares tales como citotoxicidad, ensayos de liberation de citocinas y ensayos de proliferation.

[0021] El antlgeno de diferenciacion xenogenico puede introducirse tambien de acuerdo con la invention usando una tecnica de inmunizacion de ADN en que se introduce ADN que codifica el antlgeno en el sujeto de tal

35 modo que el antlgeno de diferenciacion xenogenico se exprese por el sujeto. Se combina ADNc que codifica el antlgeno de diferenciacion con un promotor que sea eficaz para la expresion del pollmero de acido nucleico en celulas de mamlfero. Esto puede lograrse digiriendo el pollmero de acido nucleico con una endonucleasa de restriction y clonandolo en un plasmido que contiene un promotor tal como el promotor de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) o el promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV). Se usa entonces el constructo resultante 40 como vacuna para inmunizacion genetica. El pollmero de acido nucleico podrla clonarse tambien en vectores de plasmido y vlricos que son conocidos por transducir celulas de mamlfero. Estos vectores incluyen vectores retrovlricos, vectores adenovlricos, vectores de virus Vaccinia, vectores de poxvirus y vectores asociados a adenovirus.

45 [0022] Los constructos de acido nucleico que contienen el promotor y la region de codification de antlgeno

pueden administrarse directamente o pueden empaquetarse en liposomas o recubrirse sobre partlculas de oro coloidal antes de la administracion. Las tecnicas para empaquetar vacunas de ADN en liposomas son conocidas en la materia, por ejemplo, en Murray, ed. "Gene Transfer and Expression Protocols" Humana Pres, Clifton, N.J. (1991). De forma similar, se ensenan tecnicas para recubrir ADN desnudo sobre partlculas de oro en Yang, "Gene transfer 50 into mammalian somatic cells in vivo", Crit. Rev. Biotech. 12: 335-356 (1992), y se encuentran tecnicas para la expresion de protelnas usando vectores vlricos en Adolph, K. ed. "Viral Genome Methods" CRC Press, Florida (1996).

[0023] Para inmunizacion genetica, se administran preferiblemente las composiciones de vacuna por via

55 intradermica, subcutanea o intramuscular mediante inyeccion o bombardeo de partlculas accionado por gas, y se suministran en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria en el organismo hospedador. Las composiciones pueden administrarse tambien ex vivo a sangre o celulas derivadas de medula osea (que incluyen APC) usando transfection liposomica, bombardeo de partlculas o infection vlrica (incluyendo tecnicas de cocultivo). Se reintroducen entonces de nuevo las celulas tratadas en el sujeto para inmunizar. Aunque se entendera que la 60 cantidad de material necesaria dependera de la inmunogenicidad de cada constructo individual y no puede predecirse a priori, el proceso de determination de la dosificacion apropiada para cualquier constructo dado es claro. Especlficamente, se administran una serie de dosificaciones de tamano creciente, partiendo de aproximadamente

0,1 pig, y se observa la respuesta inmunitaria resultante, por ejemplo midiendo el tltulo de anticuerpo usando un ensayo ELISA, detectando la respuesta de CTL usando un ensayo de liberacion de cromo o detectando la respuesta de TH (linfocitos T auxiliares) usando un ensayo de liberacion de citocinas.

5 [0024] Una vez se rompe la tolerancia mediante la administracion del antlgeno de diferenciacion xenogenico,

pueden emplearse tratamientos posteriores con diferenciacion singenica para mantener, y en algunos casos potenciar, la respuesta inmunitaria (vease, Weber, y col., "Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA." J Clin Invest 102 (6):1258 (1998)). Por tanto, en una realizacion de la invencion, se trata en primer lugar el sujeto mediante la administracion de un antlgeno de diferenciacion xenogenico

10 (por ejemplo, durante tres ciclos de tratamiento) y posteriormente mediante la administracion de un antlgeno de diferenciacion singenico (por ejemplo, durante tres ciclos de tratamiento adicionales). Como alternativa a los ciclos de tratamiento que usan diferentes agentes terapeuticos, puede usarse un solo agente terapeutico que contenga tanto antlgenos de diferenciacion xenogenicos como singenicos. Por tanto, puede emplearse por ejemplo una mezcla de vectores rHer2-pING y hHer2-pING, o un solo vector que codifica tanto Her2/neu de rata como humana

15 bajo el control de un promotor de tal modo que se expresen en un sujeto canino, para el tratamiento de tumor de glandula mamaria en caninos. Hay vectores disponibles comercialmente, por ejemplo en Stratagene y otras companlas, que pueden expresar dos genes independientes. Comunmente, estos vectores usan un sitio de entrada a ribosoma interno, o IRES, entre los dos genes. Este enfoque tiene la ventaja de requerir la aprobacion de solo un unico agente terapeutico.

20

[0025] Se describira ahora la invencion ademas con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1- Construccion del plasmido de expresion de Her2/neu

25 [0026] Se amplifico por PCR el dominio extracelular de HER2/neu de rata (nucleotidos 17-3799 de la SEQ ID

NO:1) a partir del plasmido pCMVneuNT (Amici y col., 1998) usando los cebadores de codificacion: 5'- CGAAGCTTACCATGGAGCTGGCGGCCTGG-3' (SEQ ID NO:6) e inverso: 5'-

CGGAATTCTTATGTCACCGGGCTGGC-3' (SEQ ID NO:7). Se clono el fragmento HindIII-EcoRI en pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA; y FIG. 2). Se ha descrito anteriormente la secuencia original de ADNc de neu de rata

30 (Bargmann y col., 1986), y se expone en la presente memoria en la SEQ ID NO:1, con la secuencia de codificacion de los nucleotidos 17 a 3799. Se subclono entonces la secuencia de codificacion de HER2/neu de rata en el vector pING (Bergman y col., Clin Cancer Res, 9: 1284-1290, 2003, esqueleto representado en la FIG. 3; mapa representado en la FIG. 3A; y secuencia expuesta en la SEQ ID NO:5), procurando HER2/neu-pING de rata.

35 Ejemplo 2 - Inmunizacion de caninos positivos de tumor de glandula mamaria (MGT) con pING-rHer2

[0027] En este ensayo, se inscribieron 10 perros con MGT y se inmunizaron con 100 pg de ADN de pING-

rHer2 por dosis. Se expone en la Tabla 1 la caracterizacion para estos perros y se expone en la Tabla 2 la estadificacion tumoral.

40

: Edad (anos) Raza Peso (kg)

MGT 01: 9 Yorkshire terrier 1,75

MGT 02: 13 Mixta 9,8

MGT 03: 12 Yorkshire terrier 5

MGT 04: 7 Lhasa Apso 11

MGT 05: 10 Maltesa 3,35

MGT 06: 12 Cavalier King Charles Spaniel 9

MGT 07: 8 Pomerania 2,8

MGT 08: 12 Maltesa 3,9

MGT 09: 13 Pomerania 2,7

MGT 10: 12 Yorkshire terrier 3

Mediana: 12 3,6

Tabla 2. Estadificacion tumoral

: Tamano de tumor (cm) Tipo de MGT Etapa

MGT 01: 2x2x4 0,2x0,2x0,2 0,2x0,3x0,2 0,1x0,1x0,1 0,5x0,5x0,5 0,2x0,2x0,2 0,5x0,5x0,5 Carcinoma tubulopapilar T3N0M0

MGT 02: 12x10x8 5x3x1,5 1x1x1 1x1x0,5 0,5x0,1x0,1 Carcinoma rico en llpidos T3N0M0

MGT 03: 5,6x4,8x4,6 1,8x1,5x1,2 Carcinoma tubulopapilar con fibroadenoma T3N0M0

MGT 04: 4,2x5,6x2,5 Carcinoma tubulopapilar T3N0M0

MGT 05: 1,2x1x0,5 1x1,4x0,5 1x1x0,4 0,5x0,5x0,5 Adenoma simple T1N0M0

MGT 06: 10x4x3 Adenoma rico en llpidos con fibroadenoma T3N0M0

MGT 07: 1x1x1 0,5x0,5x0,5 Tipo compleio T1N0M0

MGT 08: 1x1x1 0,5x0,5x0,5 Tipo complejo T1N0M0

MGT 09: 2,5x2x1 1,5x2x1 Tipo complejo T1N0M0

MGT 10: 1x1x1 0,5x0,5x0,5 0,1x0,1x0,1 Carcinoma tubulopapilar T1N0M0

5 [0028] Como se indica, este grupo inclula cinco perros en etapa I y cinco en etapa II, que recibieron todos

tres dosis de vacuna a intervalos de dos semanas. Se administraron la primera y segunda dosis con el dispositivo transdermico VITAJET™ y la tercera dosis por inyeccion intramuscular simultaneamente con electroporacion. Se inicio la vacunacion despues de la retirada quirurgica del MGT con ovariohisterectomla (OHE) simultanea. Todos los perros eran negativos de metastasis regional en nodulo linfatico y pulmonar. Se calcularon los tiempos de 10 supervivencia libre de enfermedad y global usando el dla de cirugla como el dla 0, con los resultados presentados en la Tabla 3.

Tabla 3. Tiempo de supervivencia libre de enfermedad y global

Perro: Etapa de OMS Supervivencia libre de enfermedad Tiempo de supervivencia global (dfas) Resultado cllnico

Recurrencia: Metastasis

MGT 05: I 703 703 703 Vivo

MGT 07: I 669 669 669 Vivo

MGT 08: I 548 548 548 Vivo

MGT 09: I 536 536 536 Vivo

MGT 10: I 482 482 482 Muerto

Perros de etapa I: 548 548 548 -

MGT 01: III 779 779 779 Vivo

MGT 02: III 212 182 212 Muerto

MGT 03: III 762 762 762 Vivo

MGT 04: III 575 381 720 Vivo con met.

MGT 06: III 686 686 686 Vivo

Perros de etapa III: 686 686 720

Mediana de todos los perros: 622 609 678

15 [0029] Se identifico un grupo de 19 perros como casos de control historicos. Todos los perros de control

experimentaron la retirada quirurgica de MGT con OHE simultanea y eran negativos de metastasis regional en nodulo linfatico y pulmonar. Este grupo inclula 7 perros en etapa I, 3 en etapa II y 9 en etapa III. Se calcularon los tiempos de supervivencia libre de enfermedad y global para estos perros usando el dla de cirugla como dla 0. Se expone la caracterizacion de estos perros en la Tabla 4 y se expone la estadificacion tumoral para cada perro en la

Tabla 5. Se calcularon los tiempos de supervivencia libre de enfermedad y global para el grupo de control y se presentan en las FIG 1A-1C.

Tabla 4. Caracterizacion del perro de control

: Numero de caso Edad (anos) Raza Peso (kg)

1: 9403460 7 Mixta 1,75

2: 9404023 14 Caniche 2,5

3: 9405132 14 Yorkshire 2,3

4: 9409179 12 Spitz finlandes 6,8

5: 9409043 14 Caniche 3,2

6: 9500057 9 Lhasa Apso 6,5

7: 9500890 14 Maltesa 6

8: 9500959 15 Cocker 14

9: 923543 11 Husky siberiano 16

10: 9405082 13 Caniche 3,9

11: 9505202 9 Mixta 12

12: 9600998 10 Maltes 4,6

13: 9700451 13 Maltes 2,7

14: 892285 12 Yorkshire 1,6

15: 9502927 14 Maltes 3,2

16: 9405356 10 Cocker 12

17: 9409104 11 Maltes 3,8

18: 9503957 6 Schnauzer miniatura 4

19: 9404023 14 Caniche 3

: Mediana 12 3,9

5

Tabla 5. Estadificacion tumoral para perros de control

: N° cllnico Tamano tumoral Tipo de MGT Etapa

1: 9403460 6x6x7 Carcinoma compleio T3N0M0

2: 9404023 3x3x3 Carcinoma espinocelular T2N0M0

3: 9405132 7x4x7 2x2x2 0,3x0,2x0,2 0,5x0,5x0,5 Carcinoma simple o compleio T3N0M0

4: 9409179 13x12x12 6x7x7 1x1x1 Carcinoma simple con carcinoma espinocelular T3N0M0

5: 9409043 3,5x2.x1 3x1,5x1 Carcinoma tubulopapilar T2N0M0

6: 9500057 3x2x2 2x1x1 Carcinoma tubulopapilar T2N0M0

7: 9500890 8x3x1 Carcinoma simple T3N0M0

8: 9500959 8x3x2 2x1x0,5 Adenocarcinoma T3N0M0

9: 923543 5x5x4 0,2x0,2x0,2 Carcinoma simple T3N0M0

10: 9405082 5x4x3,5 3x3,5x3 Carcinoma simple T3N0M0

11: 9505202 0,3x0,3x0,3 1x1x0,5 0,4x0,4x0,4 Carcinoma tubulopapilar T1N0M0

12: 9600998 0,5x0,5x0,4 1x0,5x0,5 Carcinoma T1N0M0

13: 9700451 1x1x1 1x1x1 Carcinoma tubulopapilar T1N0M0

14: 892285 0,5x0,8x0,3 1x0,8x0,5 Carcinoma en tumor mixto benigno T1N0M0

15: 9502927 5x4x4 0,5x0,5x0,5 Carcinoma en tumor mixto benigno T3N0M0

16: 9405356 10x3x1,5 Carcinoma tubulopapilar T3N0M0

17: 9409104 1x1x1 0,5x0,5x0,5 2x2x2 Adenocarcinoma T1N0M0

18: 9503957 2x2x2 0,3x0,3x0,3 Adenocarcinoma, tipo compleio T1N0M0

19: 9404023 2x2x1 Adenocarcinoma T1N0M0

[0030] Philibert y col. (2003) revisaron las estadlsticas de supervivencia para 97 perros con MGT y resenaron

que los tiempos de supervivencia medianos para 41 perros con MGT menor de 3 cm de diametro eran de 22 meses

10 (~666 dlas) frente a 14 meses (~424 dlas) para 56 perros con MGT mayor de 3 cm de diametro. En ausencia de afectacion o metastasis del nodulo linfatico, un tamano tumoral menor de 3 cm se correlaciona con enfermedad de etapa I y mayor de 3 cm se correlaciona con un estado patologico de etapa II o mayor. No encontraron diferencia en el tiempo de supervivencia para los perros en las etapas II, III o IV.

15 [0031] El tiempo de supervivencia global mediano para todos los perros tratados con vacuna de pING-rHer2

es de 678 dlas. Esto era significativamente mayor en comparacion con los datos historicos de los 19 perros proporcionados por NTU, que indican un tiempo de supervivencia global mediano de 300 dlas, y con los datos publicados por Philibert y col. (2003), que indican 424 dlas de tiempo de supervivencia global para los perros con

MGT de etapa II o mayor.

[0032] La vacuna de ADN de pING-rHer2 se orientara a perros y gatos con tumores que se muestra que

sobreexpresan el antlgeno Her2 basandose en analisis del tejido tumoral, usando ensayos de expresion en tejido de 5 Her2 existentes. La vacuna se administrara usando el dispositivo transdermico Vetjet™ para suministrar 100 pg de ADN al muslo medial de perros o al muslo lateral de gatos, a intervalos de dos semanas para cuatro dosis. Los perros y gatos que sobrevivan recibiran una dosis de recuerdo cada 6 meses.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas mamarias de un perro, para uso en el tratamiento de carcinoma/tumor mamario canino en un perro que padece

5 carcinoma/tumor mamario canino, donde el antlgeno Her2/neu xenogenico esta en una cantidad inmunologicamente eficaz y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres, y donde el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu 10 asociado a tumor de glandula mamaria en perro.
2. El antlgeno Her2/neu xenogenico de la reivindicacion 1 para uso segun la reivindicacion 1, donde el antlgeno de diferenciacion asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico es Her2/neu de rata.

15 3. Un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por las

celulas de glandula mamaria de un perro, para uso en el tratamiento de tumor de glandula mamaria canina en un perro que padece carcinoma/tumor de glandula mamaria canina, donde el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de 20 un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico en perro, y donde el vector tiene una secuencia que comprende 106-3885 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:1 y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres.

25 4. El antlgeno Her2/neu xenogenico de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 para uso de acuerdo con la

reivindicacion 1 o 2, donde:

1) se citorreduce quirurgicamente el carcinoma asociado a Her2/neu;

2) se administra una inmunizacion sensibilizadora que comprende un primer plasmido que codifica un antlgeno Her2/neu xenogenico; y

30 3) se administra una inmunizacion mediante electrotransferencia/electroporacion; donde el recuerdo es el primer plasmido o es un segundo plasmido capaz de expresar in vivo en un canino un antlgeno Her2/neu xenogenico diferente, incluyendo aquellos codificados por las SEQ ID NO:3 o 4, o es un vector recombinante capaz de expresar in vivo cualquier protelna Her2/neu que sea capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria terapeuticamente eficaz contra Her2/neu heterologo expresado por el carcinoma asociado a Her2/neu.

35
5. El antlgeno Her2/neu xenogenico de acuerdo con la reivindicacion 4 para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, donde:

1) la inmunizacion sensibilizadora se administra sin aguja;

2) el primer plasmido es capaz de expresar in vivo en un canino una secuencia expuesta en la SEQ ID NO:2;

40 3) la inmunizacion de recuerdo comprende la administracion del plasmido de la etapa 2.
6. El antlgeno Her2/neu xenogenico de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5 para uso de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, donde se proporciona la inmunizacion de recuerdo a los caninos supervivientes una vez cada 3 a 6 meses.

45
7. El antlgeno Her2/neu xenogenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde se administra el antlgeno de diferenciacion xenogenico mediante la inmunizacion con ADN del sujeto con ADN que codifica el antlgeno de diferenciacion xenogenico en un vector de plasmido no vlrico que comprende ADN que codifica el antlgeno de diferenciacion xenogenico bajo el control de un

50 promotor que promueve la expresion del antlgeno de diferenciacion xenogenico.
8. El antlgeno Her2/neu xenogenico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1, 2 o 7 efectuado simultaneamente a la reseccion de un tumor de glandula mamaria (MGT).

55
9. Un vector que es capaz de expresar in vivo en un canino la protelna expuesta en la SEQ ID NO:2, para uso en el tratamiento de carcinoma/tumores mamarios caninos en un perro que padece carcinoma/tumor mamario canino, donde el carcinoma/tumor mamario canino es un carcinoma/tumor mamario asociado a Her2/neu, donde el vector se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres.

60
10. Uso de un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por celulas de mamlfero de un perro, para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de carcinoma/tumor

mamario canino en un perro que padece carcinoma/tumor mamario canino, donde el antlgeno Her2/neu xenogenico esta en una cantidad inmunologicamente eficaz y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres, y donde el antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno 5 Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria en perro.
11. Uso de un antlgeno Her2/neu xenogenico que es xenogenico de un antlgeno Her2/neu expresado por

celulas de glandula mamaria de un perro, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de tumor de 10 glandula mamaria canina en un perro que padece carcinoma/tumor de glandula mamaria canina, donde el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria xenogenico es un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el antlgeno Her2/neu asociado a carcinoma/tumor de glandula mamaria terapeutico xenogenico bajo el control de un promotor que promueve la expresion del antlgeno Her2/neu asociado a tumor de glandula mamaria xenogenico en perro, y donde el vector tiene la secuencia que comprende 106-3885 de la secuencia 15 expuesta en la SEQ ID NO:1 y el antlgeno Her2/neu xenogenico se administra despues de la retirada quirurgica de tumores en sujetos que padecen dichos canceres.