ES2614955T3 - Nanocuerpos anti-VCAM-1 - Google Patents

Abstract

Nanocuerpo dirigido contra VCAM-1 que comprende: a) las secuencias de aminoácidos (i) YTNSIMYMA (SEQ ID NO: 1) como CDR1, (ii) AIRFPDDS (SEQ ID NO: 2) como CDR2 y (iii) RSSPYSFAWNDPSNYNY (SEQ ID NO: 3) como CDR3; o b) las secuencias de aminoácidos (i) FTYSSYYMS (SEQ ID NO: 4) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 5) como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 6) como CDR3; o c) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSNYYMT (SEQ ID NO: 7) como CDR1, (ii) RINSDGS (SEQ ID NO: 8) como CDR2 y (iii) GKSSV (SEQ ID NO: 9) como CDR3; o d) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSSYYMS (SEQ ID NO: 10) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 11) como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 12) como CDR3; o una variante funcionalmente conservadora del nanocuerpo definida en a), b), c) o d) que comprende una sustitución conservadora de uno o dos aminoácidos en, respectivamente una, dos o tres de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanocuerpos anti-VCAM-1

[0001] La presente invención se refiere a nanocuerpos anti-VCAM-1 que permiten la detección in vivo de 5 placas de ateroma.

[0002] Las enfermedades cardiovasculares representan la primera causa mundial de mortalidad y la enfermedad coronaria es responsable por sí sola de más de la mitad de los fallecimientos. Los accidentes coronarios se deben, en la inmensa mayoría de los casos, a la ruptura de una placa de ateroma coronaria vulnerable. La 10 coronografía, técnica de referencia actual para el diagnóstico de la enfermedad coronaria, no permite la identificación de las placas no estenosantes.

[0003] El diagnóstico por imagen nuclear presenta, sin duda, ventajas significativas para el diagnóstico por imagen molecular de la placa de ateroma vulnerable. Para el diagnóstico por imagen molecular, se han evaluado 15 experimentalmente numerosos indicadores de diferente naturaleza química, entre los que se encuentran lipoproteínas, péptidos, oligopéptidos, anticuerpos, azúcares, nucleótidos de hebra no codificante y nanopartículas (Riou et al. (2009) Curr. Med. Chem. 16:1499-1511). Los principales objetivos evaluados han sido las LDL oxidadas y sus receptores, el fenómeno inflamatorio mediante técnicas de imagen celular de los macrófagos, o las técnicas de imagen de los receptores o enzimas expresados por este tipo celular, el fenómeno apoptótico y el fenómeno 20 neoangeogiénico. Entre los marcadores dirigidos al proceso inflamatorio, el 99mTc-MCP-1 para la tomografía SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) y el [18F]-FDG para la tomografía PET (Positron Emission Tomography) han permitido el diagnóstico por imagen in vivo no invasivo de la acumulación de macrófagos en lesiones ateroscleróticas experimentales. En el ámbito clínico, [18F]-FDG y 99mTc-Annexin A5 han permitido el diagnóstico por imagen no invasivo de la acumulación de macrófagos y de células apoptóticas, respectivamente, en 25 las placas de ateroma carotídeas de pacientes sintomáticos. Sin embargo, ninguno de estos radiomarcadores se utiliza actualmente en práctica clínica de forma rutinaria, principalmente debido a su incapacidad para alcanzar índices suficientes de lesiones sobre ruido de fondo en las lesiones coronarias. De hecho, el diagnóstico por imagen nuclear de las placas vulnerables en las arterias coronarias es especialmente difícil, debido al reducido volumen de las lesiones y a su cercanía con la sangre que contiene un marcador circulante no unido. Por ello, no existe ningún 30 ensayo clínico que a día de hoy demuestre la viabilidad del diagnóstico por imagen del ateroma coronario.

[0004] VCAM-1 es una glicoproteína de la familia de las inmunoglobinas cuya expresión se induce en condición proaterógena. Su expresión se restringe a las zonas de desarrollo de las placas de ateroma y perdura durante todo el desarrollo de la placa vulnerable. La función de VCAM-1 es garantizar que se reclutan células de la 35 inflamación (linfocitos y monocitos) hacia la placa. La expresión de VCAM-1, por tanto, está en correlación directa con la acumulación de macrófagos, que está reconocida como uno de los criterios más importantes en la definición de una placa vulnerable (Naghavi et al. (2003) Circulation 108:1772-1178).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN 40

[0005] La solicitud europea EP 2 206 726 describe el uso de derivados del péptido B2702p ligando de VCAM-1 en métodos de diagnóstico por imagen in vivo, no invasivos.

[0006] Anteriormente, los presentes inventores han desarrollado radiomarcadores que contenían una 45 secuencia peptídica capaz de unirse a VCAM-1. Demostraron, sobre un modelo de conejo ateroesclerótico, que la fijación de este radiomarcador en las imágenes autoradiográficas ex vivo estaba correlacionada con las zonas de desarrollo de las placas de ateroma y con la expresión de VCAM-1 (Broisat et al. (2007) Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 34:830-840). Sin embargo, debido a la actividad sanguínea circulante de este marcador, no es posible utilizarlo in vivo en técnicas de diagnóstico por imagen. 50

[0007] De hecho, de forma general, el cociente señal/ruido debe ser elevado para realizar un diagnóstico por imagen de calidad. Así, un radiomarcador ideal se caracteriza por una elevada afinidad y especificidad para su objetivo, una buena solubilidad y estabilidad, un radiomarcado eficaz, un reducido pequeño así como una eliminación sanguínea rápida, de forma que las imágenes con alto nivel de contraste puedan obtenerse rápidamente 55 después de la administración del marcador. Esto es particularmente crucial en el caso de la placa de ateroma, por su reducido tamaño y su localización intravascular.

[0008] La presente invención es el resultado del descubrimiento por parte de los inventores de que cuatro nanocuerpos, llamados cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9, que contienen secuencias de 60 CDR específicas, presentaban, de forma sorprendente, y contrariamente a otros nanocuerpos que se unen a VCAM-1, todas las características definidas anteriormente y por tanto constituían radiomarcadores eficaces para el diagnóstico por imagen no invasivo de las placas de ateroma, en particular de las placas de ateroma coronarias.

[0009] La presente invención tiene por objeto un nanocuerpo dirigido contra VCAM-1 que comprende: 65

a) las secuencias de aminoácidos (i) YTNSIMYMA (SEQ ID NO: 1) como CDR1, (ii) AIRFPDDS (SEQ ID NO: 2) como CDR2 y (iii) RSSPYSFAWNDPSNYNY (SEQ ID NO: 3) como CDR3; o

b) las secuencias de aminoácidos (i) FTYSSYYMS (SEQ ID NO: 4) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 5) como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 6) como CDR3; o

c) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSNYYMT (SEQ ID NO: 7) como CDR1, (ii) RINSDGS (SEQ ID NO: 8) como 5 CDR2 y (iii) GKSSV (SEQ ID NO: 9) como CDR3;

d) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSSYYMS (SEQ ID NO: 10) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 11) como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 12) como CDR3;

o una variante funcionalmente conservadora del nanocuerpo definida en a), b), c) o d) que comprende una 10 sustitución conservadora de uno o dos aminoácidos en, respectivamente una, dos o tres de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

[0010] La presente invención se refiere igualmente al nanocuerpo tal como se ha definido más arriba, para 15 utilizarlo como agente de contraste en las técnicas de formación de por imagen in vivo, no invasivas, para utilizarlo en técnicas de diagnóstico o de pronóstico y para utilizarlo como medicamento.

[0011] Asimismo, tiene por objeto la utilización de dicho nanocuerpo para la detección in vitro de VCAM-1 en una muestra. 20

[0012] Por último se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho nanocuerpo asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

VCAM-1 25

[0013] El término «VCAM-1» o «vascular cell adhesion molecule 1» designa una proteína de adhesión celular cuya transcripción se induce en las células endoteliales pero que también se expresa por otros tipos celulares. VCAM-1 fue descubierta y clonada por Osborn et al. en el año 1989 (Osborn et al. (1989) Cell. 59:1203-1211). VCAM-1 interactúa con la integrina α4β1, también llamada VLA-4 (Very Late Antigen 4), que se expresa de forma 30 constitutiva por los linfocitos y los monocitos, especialmente. Como otras moléculas de adhesión, como la ICAM-1, 2 y 3, VCAM1 está implicada en la adhesión de los monocitos al endotelio durante la aterosclerosis. VCAM-1 interactúa igualmente con la integrina α4β7 para reclutar linfocitos en el intestino.

Nanocuerpos anti-VCAM 35

[0014] En el contexto de la presente invención, los términos «anticuerpos» e «inmunoglobulina» tienen el mismo significado y se utilizan indistintamente. En los anticuerpos convencionales, las dos cadenas pesadas están unidas una a la otra por puentes disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un puente disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera: las cadenas ligeras lambda (λ) y kappa (κ). Existen cinco clases 40 principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de un anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia diferentes. La cadena ligera comprende dos dominios: un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada comprende cuatro dominios: un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, conjuntamente llamados CH). Las regiones variables de cadena pesada (VH) y ligera (VL) determinan el reconocimiento de unión y la especificidad del antígeno. Los 45 dominios de las regiones constantes de la cadena ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes, como la asociación de cadenas de anticuerpos, la secreción, la movilidad transplacentaria, la unión con el complemento y la unión con los receptores Fc. El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina consistente en las porciones variables de una cadena ligera y de una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el punto de combinación del 50 anticuerpo y el determinante antigénico. Los puntos de combinación del anticuerpo están hechos de residuos que provienen principalmente de las regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Ocasionalmente, los residuos que provienen de las regiones no hipervariables o regiones «estructurales» («framework», FR) pueden influir en la estructura global del dominio y, por tanto, el punto de combinación.

55

[0015] En el contexto de la invención, el término «CDR» se refiere a las secuencias de aminoácidos, que juntas, definen la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un punto de unión nativo de una inmunoglobulina. La cadena pesada y ligera de una inmunoglobulina tienen, cada una, tres CDR, designados como H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 y L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 respectivamente. Un punto de unión con el antígeno incluye, por tanto, 6 CDR, que comprenden la totalidad de los CDR de una región variable de una cadena pesada y 60 de una región variable de una cadena ligera.

[0016] El experto en la materia puede localizar los CDR en la secuencia de un anticuerpo o de un nanocuerpo, utilizando las técnicas antes descritas. Típicamente, los CDR pueden identificarse secuenciando el ADN del anticuerpo o del nanocuerpo con un sistema apropiado, como el 3730 XL DNA Analyser y ABI PRISM 65 BigDye Terminator cyc, y analizando las secuencias así obtenidas con ayuda de bases de datos dedicadas como la

International ImMunoGeneTics database o IMTG (Lefranc (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55).

[0017] En el contexto de la invención, el término «región estructural», «framework» o «FR» hacen referencia a las secuencias de aminoácidos intercalados entre los CDR.

5

[0018] En el contexto de la invención, los términos «nanocuerpo», «nanobody», «VHH», «fragmento de anticuerpo VHH» y «anticuerpo de dominio único» se utilizan indistintamente y designan el dominio variable de la cadena pesada única de anticuerpo del tipo de los que se encuentran en los camélidos, que por naturaleza están desprovistos de cadenas ligeras. A falta de cadena ligera, los nanocuerpos tienen cada uno tres CDR, designados como CDR1, CDR2, y CDR3 respectivamente. Los nanocuerpos según la invención pueden ser, en particular, 10 nanocuerpos de camellos, de dromedarios, de llamas o de alpacas. Preferentemente, los nanocuerpos según la invención son nanocuerpos de dromedarios.

[0019] Por «nanocuerpo dirigido contra VCAM-1» se entiende aquí un nanocuerpo capaz de unirse de forma selectiva a VCAM-1. Preferentemente, el nanocuerpo es específico de VCAM-1, es decir, que se une a VCAM-1, 15 excluyendo cualquier otra molécula.

[0020] Los presentes inventores han identificado más precisamente cuatro nanocuerpos dirigidos contra VCAM-1 y que presentan características adicionales no esperadas que no poseen otros nanocuerpos anti-VCAM-1. Estos cuatro nanocuerpos cAbvCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8, cAbVCAM1-9, presentan una reacción 20 cruzada para VCAM-1 humana y murina, tienen una gran afinidad para VCAM-1 murina o humana, y se fijan muy fuertemente a las placas de ateroma in vivo, pero sin producir por ello un ruido de fondo en los órganos del paciente.

[0021] Estos cuatro nanocuerpos se han secuenciado:

25

- el nanocuerpo cAbVCAM1-5 presenta la secuencia de aminoácidos QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTNSIMYMAWFRQAPGKKREG VAAIRFPDDSAYYAGSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNNLNPEDTAMYYC AARSSPYSFAWNDPSNYNYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 13),

- el nanocuerpo cAbVCAM1-3 presenta la secuencia de aminoácidos 30 QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTYSSYYMSWVRQAPGKGLE WVSGINVDGSNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYY CATGSGRDSYDCYSGSWCPKGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 14),

- el nanocuerpo cAbVCAM1-8 presenta la secuencia de aminoácidos QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMTWVRRAPGKGLE 35 WVSRINSDGSTLYLPSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTGWYY CVEGKSSVRGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 15), y

- el nanocuerpo cAbVCAM1-9 presenta la secuencia de aminoácidos QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLE WVSGINVDGSNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYY 40 CATGSGRDSYDCYSGSWCPKGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 16).

[0022] Los CDR de estos cuatro nanocuerpos se han secuenciado más específicamente, y son los siguientes:

45

• cAbVCAM1-5

o CDR1: YTNSIMYMA (SEQ ID NO: 1)

o CDR2: AIRFPDDS (SEQ ID NO: 2)

o CDR3: RSSPYSFAWNDPSNYNY (SEQ ID NO: 3)

50

• cAbVCAM1-3

o CDR1: FTYSSYYMS (SEQ ID NO: 4)

o CDR2: GINVDGSN (SEQ ID NO: 5)

o CDR3: GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 6) 55

• cAbVCAM1-8

o CDR1: FTFSNYYMT (SEQ ID NO: 7)

o CDR2: RINSDGS (SEQ ID NO: 8)

o CDR3: GKSSV (SEQ ID NO: 9) 60

• cAbVCAM1-9

o CDR1: FTFSSYYMS (SEQ ID NO: 10)

o CDR2: GINVDGSN (SEQ ID NO: 11)

o CDR3: GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 12) 65

[0023] El experto en la materia sabe que la combinación de los CDR1, CDR2 y CDR3 basta para definir un punto de unión con el antígeno. Por consiguiente, un objeto de la presente invención se refiere a un nanocuerpo dirigido contra VCAM-1 que comprende:

a) las secuencias de aminoácidos (i) SEQ ID NO: 1 como CDR1, (ii) SEQ ID NO: 2 como CDR2 y (iii) SEQ ID NO: 3 5 como CDR3; o

b) las secuencias de aminoácidos (i) SEQ ID NO: 4 como CDR1, (ii) SEQ ID NO: 5 como CDR2 y (iii) SEQ ID NO: 6 como CDR3; o

c) las secuencias de aminoácidos (i) SEQ ID NO: 7 como CDR1, (ii) SEQ ID NO: 8 como CDR2 y (iii) SEQ ID NO: 9 como CDR3; o 10

d) las secuencias de aminoácidos (i) SEQ ID NO: 10 como CDR1, (ii) SEQ ID NO: 11 como CDR2 y (iii) SEQ ID NO: 12 como CDR3;

o una variante funcionalmente conservadora del nanocuerpo definida en a), b), c) o d) que comprende una sustitución conservadora de uno o dos aminoácidos en, respectivamente una, dos o tres de las secuencias SEQ ID 15 NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

[0024] Asimismo, los inventores han secuenciado las regiones «estructurales» (FR) de estos nanocuerpos. Las secuencias correspondientes son las siguientes: 20

• cAbVCAM1-5

o Región FR1: QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO: 17)

o Región FR2: WFRQAPGKKREGVA (SEQ ID NO: 18)

o Región FR3: AYYAGSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNNLNPEDTAMYYCAA (SEQ ID NO: 19) 25

o Región FR4: WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 20)

• cAbVCAM1-3

o Región FR1: QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASG (SEQ ID NO: 21)

o Región FR2: WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 22) 30

o Región FR3: TYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCAT (SEQ ID NO: 23)

o Región FR4: KGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 24)

• cAbVCAM1-8

o Región FR1: QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO: 25) 35

o Región FR2: WVRRAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 26)

o Región FR3: TLYLPSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTGWYYCVE (SEQ ID NO: 27)

o Región FR4: RGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 28)

• cAbVCAM1-9 40

o Región FR1: QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO: 29)

o Región FR2: WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 30)

o Región FR3: TYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTALYYCAT (SEQ ID NO: 31)

o Región FR4: KGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 32)

45

[0025] Según un modo de realización particular, la invención se refiere a un nanocuerpo que comprende o consiste en el encadenamiento de las secuencias FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 como las que se han definido más arriba de uno de los nanocuerpos identificados por los inventores.

[0026] Preferentemente, el nanocuerpo según la invención es por tanto un nanocuerpo que comprende o 50 consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, o una variante funcionalmente conservadora de este que comprenda una sustitución conservadora de uno o dos aminoácidos en uno, dos o tres de los CDR comprendidos respectivamente en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 16. La variante funcionalmente conservadora tal y como se ha definido más arriba, puede 55 comprender además una o varias sustituciones, en concreto, una o varias sustituciones conservadoras en las regiones respectivamente de las secuencias aminoácidas SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 16 que no son CDR, como las regiones «estructurales», en concreto las regiones «estructurales» definidas más arriba. De forma más preferente todavía, el nanocuerpo según la invención es un nanocuerpo que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste en las secuencias de 60 aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. Según la forma más preferente de todas, el nanocuerpo según la invención es un nanocuerpo que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13

[0027] En el contexto de la invención, la expresión «variante funcionalmente conservadora» hace referencia a 65 las variantes en las que un aminoácido dado en un nanocuerpo según la invención es sustituido sin alterar la

conformación global y la función del nanocuerpo, incluyendo una sustitución de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares (por ejemplo, polaridad, potencial de unión de hidrógeno, acidez, alcalinidad, hidrofobia, presencia de un grupo aromático, etc). El experto en la materia conoce los aminoácidos que tienen propiedades similares. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina, aminoácidos hidrófilos-básicos que pueden ser intercambiables. De forma similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede sustituirse por la leucina, la 5 metionina o la valina. Dichos cambios no deberían tener ningún o casi ningún efecto sobre el peso molecular aparente o el punto isoeléctrico del nanocuerpo. Un aminoácido natural puede sustituirse por un aminoácido no natural, como un aminoácido de configuración D, aminoácido beta o gamma.

[0028] En la siguiente tabla 1 se presentan ejemplos de sustituciones conservadoras 10

Tabla 1: Sustituciones conservadoras I

Característica de la cadena lateral

Aminoácido

No polar

G A P I L V

Polar sin carga

C S T M N Q

Polar con carga

D E K R

Aromático

H F W Y

Otros

N Q D E

[0029] Alternativamente, los aminoácidos conservadores pueden agruparse, como se describe en Lehninger 15 (1975, Biochemistry, 2ª edición, Worth Publishers, Inc. New-York: NY., p. 71-77), como se indica en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Sustituciones conservadoras II

Característica de la cadena lateral

Aminoácido

No polar

Alifático A L I V P

Aromático

F W

Con contenido de azufre

M

Frontera

G

Polar sin carga

Hidróxilo S T Y

Amidas

N Q

Sulfhidrilo

C

Frontera

G

Cargada positivamente (básico)

KRH

Cargada negativamente (ácido)

DE

20

[0030] Según otra alternativa, en la tabla 3 que aparece a continuación se presentan ejemplos de sustituciones conservadoras:

Tabla 3: Sustituciones conservadoras III

Residuo de origen

Ejemplo de sustitución

A

VLI

R

KQN

N

QHKR

D

E

C

S

G

N

E

D

H

NQKR

I

LVMAF

L

IVMAF

K

RQN

M

LFI

F

LVIA

P

G

S

T

T

S

W

Y

Y

WTFS

V

ILMFA

25

[0031] Estas variantes funcionalmente conservadoras conservan la capacidad de unir VCAM-1. Preferentemente, dichas variantes funcionalmente conservadoras presentan una afinidad de unión con VCAM-1

igual o aumentada respecto del nanocuerpo correspondiente.

[0032] El experto en la materia que conozca la secuencia de aminoácidos del nanocuerpo de interés, es capaz de producir los nanocuerpos según la invención, en particular los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9 definidos más arriba, mediante técnicas convencionales de producción de 5 polipéptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse utilizando el método bien conocido de síntesis en fase sólida (Merrifield (19962) Proc. Soc. Ex. Boil. 21:412; Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Tam et al. (1983) J. Am. Chem. Soc- 105:6442), preferentemente utilizando un aparato de síntesis peptídica disponible comercialmente (como el de Applied Biosystems, Foster City, California), y siguiendo las instrucciones del fabricante.

10

[0033] Alternativamente, los nanocuerpos según la invención pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante conocidas por el experto en la materia (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 51-54 et 412-430). Por ejemplo, pueden obtenerse como productos de expresión de ADN tras incorporación de secuencias de ADN codificante del polipéptido de interés en los vectores de expresión e introducción de dichos vectores en los anfitriones procariotas o eucariotas apropiados que expresarán el 15 polipéptido de interés, a partir de los que, a continuación se podrán aislar utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia. El experto en la materia sabe que cuando una proteína se sintetiza por técnicas de ADN recombinante, generalmente se sintetiza asociada a un marcador que facilite su purificación. Dichos marcadores son conocidos por el experto en la materia e incluyen por ejemplo la hexahistidina (6His), la glutatión-S-transferasa (GST) o la hemaglutinina del virus de la gripe (HA). Preferentemente, los nanocuerpos según la invención contienen 20 un marcador hexahistidina. Por consiguiente, un objeto de la invención también está constituido por un nanocuerpo que comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos elegida en el grupo constituido por las secuencias SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 que comprende además en su extremo C-terminal o N-terminal, preferentemente en su extremo C-terminal, seis residuos histidina. Un nanocuerpo que comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos elegida dentro del grupo constituido por las 25 secuencias SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 también forma parte de la invención.

[0034] Otro objeto de la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleica codificante del nanocuerpo según la presente invención.

30

[0035] Según un modo de realización particular, el ácido nucleico según la invención comprende o consiste en una secuencia nucleica codificante de un nanocuerpo definido por una de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 16. De manera preferida, el ácido nucleico según la invención comprende o consiste en una secuencia nucleica codificante del nanocuerpo definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13. 35

[0036] Típicamente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o de ARN, que puede estar incluida en cualquier vector apropiado como un plásmido, un cósmido, un episoma, un cromosoma artificial, un bacteriófago o un vector viral.

[0037] Los términos «vector», «vector de clonado» y «vector de expresión» significan el vehículo por el cual 40 la secuencia de ADN o de ARN puede introducirse en la célula anfitriona, de forma que transforme al anfitrión y promueva la expresión (p. ej. transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

[0038] Por consiguiente, otro objeto de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico según la invención.

45

[0039] Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, como un promotor, un activador, un finalizador, para causar o dirigir la expresión del polipéptido. Algunos ejemplos de promotores y de activadores utilizados en los vectores de expresión para célula animal incluyen el promotor precoz y el activador de SV40 (Mizukami et al. (1987) J. Biochem. 101:1307-1310), el promotor LTR y el activador de virus de la leucemia del ratón Moloney, el promotor (Mason et al (1985) Cell 14:479-487) y el activador (Gillies et al. (1983) Cell 33:717-728) de la 50 cadena de la inmunoglobulina, etc.

[0040] Se puede usar cualquier vector de expresión para células animales. Algunos ejemplos de vectores apropiados incluyen pAGE107 (Miyaji et al. (1990) Cytotechnology 3:133-140), pAGE 103 (Mizukami et al. (1987) J. Biochem. 101:1307-1310), pHSG274 (Brady et al. (1984) Gene 27:223-232), pKCR (O’Hare et al. (1981) Proc. Natl. 55 Acad. Sci. USA 78:1527-1531), pSG1 beta d2-4 (Miyaji et al. (1990) Cytotechnology 3:133-140), etc.

[0041] Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos multiplicadores, que comprenden un origen de multiplicación, o plásmidos integrativos, como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR, etc.

60

[0042] Otros ejemplos de vectores virales incluyen los vectores adenovirales, retrovirales del virus del herpes y AAV. Dichos virus recombinantes pueden producirse por técnicas conocidas para el experto en la materia, como la transinfección de células de empaquetamiento o por transinfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares. Algunos ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen las células PA317, las células PsiCRIP, las células GPenv+, las células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados de producción de dichos virus 65

recombinantes deficientes para su multiplicación, por ejemplo en las solicitudes WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,887, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 y WO 94/19478.

[0043] Otro objeto de la presente invención se refiere a una célula que ha sido transinfectada, infectada o transformada con un ácido nucleico y/o un vector según la invención. 5

[0044] El término «transformación» significa la introducción de un gen o de una secuencia de ADN o de ARN «exógeno» (i.e extrínseco o extracelular) en una célula anfitriona, de forma que la célula anfitriona expresará el gen o la secuencia introducida para producir la sustancia de interés, típicamente una proteína codificada por el gen o la secuencia introducida. Una célula anfitriona que recibe y expresa el ADN o el ARN introducido ha sido 10 «transformada».

[0045] Los ácidos nucleicos según la invención pueden utilizarse para producir un nanocuerpo según la invención en un sistema de expresión apropiado. El término «sistema de expresión» significa una célula anfitriona y un vector compatible en condiciones apropiadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por el 15 ADN exógeno transportado por el vector e introducido en la célula anfitriona.

[0046] Los sistemas de expresión convencionales incluyen las células anfitrionas Escherichia coli y los vectores plasmídicos, las células de insecto y los vectores Baculovirus, y las células anfitrionas de mamífero y sus vectores. Otros ejemplos de células anfitrionas incluyen las células procariotas (como las bacterias), y las células 20 eucariotas (como las células de levadura, las células de mamífero, las células de insecto, las células de plantas, etc.). Otros ejemplos específicos incluyen la Escherichia coli, las levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, las estirpes celulares de mamífero (por ej. las células Vero, las células CHO, las células 3T3, las células COS, etc.), así como los cultivos de células de mamíferos primarias o establecidas (es decir producidas a partir de linfoblastos, fibroblastos, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Algunos ejemplos incluyen igualmente células 25 SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), las células P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), las células CHO en las que un gen del dihidrofolato reductasa es defectuoso, las células YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662), etc.

[0047] La presente invención se refiere asimismo a un método de producción de una célula anfitriona 30 recombinante que expresa un nanocuerpo según la invención, dicho método comprende las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico o un vector recombinante como el que se ha descrito más arriba en una célula anfitriona competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula anfitriona recombinante obtenida y (iii) eventualmente seleccionar las células que expresan o secretan dicho nanocuerpo. Dichas células anfitrionas recombinantes pueden utilizarse para la producción de nanocuerpos según la invención. 35

[0048] Los nanocuerpos según la invención se pueden producir con cualquier técnica conocida por el experto en la materia, como por ejemplo cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, sola o en combinación.

[0049] En particular, la invención se refiere además a un método de producción de un nanocuerpo según la 40 invención, dicho método comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula anfitriona transformada según la invención en condiciones apropiadas para permitir la expresión de dicho nanocuerpo, y (ii) recuperar el nanocuerpo expresado.

[0050] Los nanocuerpos según la invención pueden separase convenientemente del medio de cultivo usando 45 procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, como la proteína A-Sefarosa, la cromatografía con hidroxiapatita, la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad.

Nanocouerpos marcados.

50

[0051] Los nanocuerpos según la invención son particularmente útiles para la formación de imagen médica. En el presente contexto, es particularmente interesante disponer de nanocuerpos asociados a un marcador detectable. Los presentes inventores han demostrado que los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9 conservaban sus propiedades cuando se asociaban a un marcador detectable, en particular, un radioelemento como el tecnecio 99m. 55

[0052] Por tanto, la presente invención también se refiere a un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba asociado a un marcador detectable.

[0053] Por «nanocuerpo asociado a un marcador detectable», aquí se entiende que el marcador detectable 60 está unido, de forma directa o indirecta, al nanocuerpo, o está incorporado en el nanocuerpo. En concreto, el marcador detectable puede estar unido al nanocuerpo por sustitución (por ejemplo, sustituyendo un H por un I en los residuos tirosina), por complexión o por quelación.

[0054] Por «marcador detectable» se entiende aquí un compuesto que produce una señal detectable. 65 Cuando se asocia a un marcador, permite seguir el devenir del marcador en el organismo. El marcador detectable

puede ser un agente de contraste para MRI, un agente de contraste para gammagrafía un agente de contraste para diagnóstico por imagen por rayos X, un agente de contraste para ultrasonido, un agente de contraste para diagnóstico por imagen óptica. Algunos ejemplos de marcadores detectables incluyen radioelementos, fluoróforos como la fluoresceína, la Alexa, la cianina, los compuestos quimioluminescentes como el luminol, los compuestos bioluminescentes como la luciferasa o la fosfatasa alcalina, y los agentes de contraste como las nanopartículas o el 5 gadolinio. La elección del marcador detectable apropiado, que depende del sistema de detección utilizado, está al alcance del experto en la materia. A modo de ejemplo, cuando el sistema de detección es la MRI, el marcador detectable es preferentemente una nanopartícula de óxido de hierro o de gadolinio; cuando el sistema de detección es la formación de imagen por nanofluorescencia, el marcador detectable es preferentemente la fluoresceína, el Alexa o la cianina; cuando el sistema de detección es la formación de magen por quimioluminescencia, el marcador 10 detectable es preferentemente el luminol; cuando el sistema de detección es la formación de imagen por bioluminescencia, el marcador detectable es preferentemente la luciferasa o la fosfatasa alcalina; cuando el sistema de detección es la formación de imagen nuclear, el marcador detectable es preferentemente un radioelemento como el Flúor 18 (18F) para la tomografía TEP, o el tecnecio 99m (99mTc) para la tomografía SPECT.

15

[0055] Preferentemente, el marcador detectable es un radioelemento. Algunos ejemplos de radioelementos, que son utilizados más particularmente en las técnicas de diagnóstico por imagen nuclear incluyen el Tecnecio 99m (99mTc), el yodo 123 (123I), el yodo 125 (125I), el indio 111 (111In), el flúor 18 (18F), el galio 67 (67Ga), el galio 68 (68Ga), el cobre 64 (64Cu) y cualquier otro radioelemento utilizable en los seres humanos. Por consiguiente, preferentemente, el radioelemento se elige en el grupo constituido por 99mTc, 123I, 125I, 111In, 18F, 64Cu, 67Ga y 68Ga. 20 De forma más preferentemente entre todas, el radioelemento es el 99mTc.

Uso como agente de contraste

[0056] Los inventores han demostrado que los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y 25 cAbVCAM1-9 constituían marcadores específicos de la placa de ateroma, en concreto de la placa aórtica, y permiten su detección mediante formación de imagen médica.

[0057] Por tanto, la invención propone un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba, para usarlo como agente de contraste en la formación de imagen médica en concreto, en la formación de imagen médica in vivo, 30 no invasiva.

[0058] Igualmente, se refiere al uso de un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba, para fabricar un agente de contraste útil para la formación de imagen médica en concreto, en la formación de imagen médica in vivo, no invasiva. 35

[0059] Por «agente de contraste», se entiende aquí una sustancia o un compuesto que, administrado en el organismo, permite marcar de forma detectable órganos o estructuras (tejido, célula, receptor) que, sin agente de contraste, son poco o nada visibles en la formación de imagen médica. Por extensión, la expresión «agente de contraste» se utiliza para designar un marcador asociado a un indicador como el que se ha definido más arriba. 40

[0060] En el contexto de la invención, los «métodos de formación de imagen» se refieren a métodos que permite visualizar el interior de un organismo u órganos de un organismo. Los ejemplos de métodos de formación de imagen incluyen técnicas invasivas como la ecografía endocoronaria, y técnicas no invasicas como la formación de imagen por resonancia magnética, con rayos X, la ecografía, la formación de imagen óptica o la medicina nuclear 45 como la gammagrafía en particular, la tomografía de emisión monofotónica (SPECT) y la tomografía de emisión de positrones (PET). Preferentemente, el método de formación de imagen según la invención es la gammagrafía, en particular la gammagrafía SPECT o PET.

[0061] La gammagrafía se basa en la administración (generalmente por vía intravenosa) de un agente de 50 contraste, también llamado radiofarmacéutico, constituido por un marcador marcado por un radioelemento. La localización específica de este agente de contraste en el organismo se determina después por detección de los rayos gamma o beta emitidos.

[0062] La tomografía de emisión monofotónica y la tomografía por emisión de positrones son técnicas de formación de imagen nuclear tomográfica basadas en la gammagrafía y que permiten realizar imágenes y 55 reconstrucciones en tres dimensiones de los órganos y de su metabolismo por medio de un conjunto de cámaras que giran alrededor del paciente.

[0063] La presente invención se refiere igualmente a una técnica de formación de imagen médica, en concreto de formación de imagen médica in vivo, no invasiva, en la que un nanocuerpo como el que se ha definido 60 más arriba se administra a un paciente. El método de formación de imagen médica según la invención puede comprender además las etapas de detección del enlace o de la ausencia de enlace del nanocuerpo en las zonas corporales del paciente y de visualización de las zonas corporales del paciente en las que puede detectarse la unión del nanocuerpo.

65

[0064] En el contexto de la invención, un «paciente» designa un mamífero humano o no humano, como un roedor (rata, ratón, conejo), un primate (chimpancé) un félido (gato), un cánido (perro). Preferentemente, el individuo es humano.

[0065] Cualquier método de administración, conocido por el experto en la materia, puede utilizarse para 5 administrar al paciente el nanocuerpo según la invención. En particular, el nanocuerpo puede administrase por ejemplo por vía oral, por inhalación o por vía parenteral (en particular por inyección intravenosa). Cuando se elige la vía parenteral, el nanocuerpo puede estar en forma de soluciones o de suspensiones inyectables, envasado en ampollas o frascos. Las formas de administración parenteral se obtienen convencionalmente por mezcla del nanocuerpo según la invención con amortiguadores, estabilizantes, conservadores, agentes solubilizantes, agentes 10 isotónicos y agentes de puesta en suspensión. Según técnicas conocidas, estas mezclas pueden esterilizarse y prepararse en forma de inyecciones intravenosas. El experto en la materia puede, por ejemplo, utilizar amortiguadores a base de sales de fosfato en calidad de amortiguadores. Algunos ejemplos de agentes de puesta en suspensión incluyen la metilcelulosa, la goma arábiga, y la carmelosa de sodio. Algunos ejemplos de estabilizantes incluyen el sulfito de sodio y el metasulfito de sodio, y algunos ejemplos de conservadores incluyen el 15 p-hidroxibenzoato de sodio, el ácido sórbico, el cresol y el clorocresol.

[0066] La cantidad de nanocuerpos administrada depende naturalmente de la vía de administración, del tamaño y/o del peso del paciente y de la técnica de detección utilizada.

20

[0067] En el contexto de la invención, el término «zona corporal» hace referencia a una región determinada del organismo. Puede tratarse, por ejemplo, de un órgano, de una parte de un órgano o de un tejido, como un pulmón, el corazón, el hígado, el bazo o un riñón, o un vaso sanguíneo como una arteria o una vena, en particular la aorta o las arterias coronarias.

25

[0068] En un modo de realización particular, el nanocuerpo según la invención se utiliza como agente de contraste en el la formación de imagen médica para visualizar placas ateroscleróticas, más concretamente, placas ateroscleróticas aórticas, carotídeas o coronarias, en un paciente.

[0069] En el contexto de la invención, los términos «placa aterosclerótica», «placa de aterosclerosis» y 30 «placa de ateroma», se utilizan indiferentemente y hacen referencia a una lesión de las paredes de los vasos. Preferentemente, una placa aterosclerótica comprende un corazón lipídico y una capa fibrosa, la capa está constituida por células de músculo liso, de colágenos y de una matriz extracelular y que aísla el núcleo lipídico de la luz arterial. Las placas ateroscleróticas pueden encontrarse por ejemplo en la aorta, la carótida o en la arteria coronaria. Cuando la placa comprende una capa fibrosa fina (de 65 a 150 mm de grosor aproximadamente) y un 35 núcleo lipídico importante, se denomina «placa vulnerable» o «placa inestable». Estas placas inestables que presentan una tendencia a la ruptura, se unen en las arterias coronarias y en la aorta y sus ramas. La ruptura de las placas coronarias vulnerables provoca «síndromes coronarios agudos». En caso de trombosis oclusiva completa, se trata del infarto de miocardio. Cuando la trombosis de la arteria es incompleta, se trata de la angina inestable. En la carótida, las placas vulnerables son más estenosantes y menos inflamatorias. Expresan igualmente VCAM-1. 40

[0070] Preferentemente, el nanocuerpo según la invención se utiliza como agente de contraste en la formación de imagen médica para visualizar placas ateroscleróticas vulnerables, en concreto, placas vulnerables aórticas o coronarias.

45

Uso diagnóstico

[0071] La aparición de placas de ateroma es una marca de la aterosclerosis, que constituye en sí misma una enfermedad cardiovascular y puede generar diferentes complicaciones cardiovasculares. La detección de placas de ateroma supone por tanto, la caracterización de una enfermedad cardiovascular. Por otro lado, la posibilidad de 50 seguir a través de técnicas de formación de imagen la evolución, es decir, la progresión o la regresión, de una placa de ateroma previamente identificada representa una modalidad para evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico en un paciente al que se ha diagnosticado una enfermedad cardiovascular.

[0072] La presente invención se refiere por tanto igualmente a un nanocuerpo como el que se ha definido 55 más arriba, para utilizarlo en métodos de diagnóstico o de pronóstico.

[0073] Por «método diagnóstico» o «diagnóstico», se entiende aquí un método que permite determinar si un individuo sufre una patología.

60

[0074] Por «método pronóstico» o «pronóstico», se entiende aquí un método que permite determinar si un individuo es susceptible de desarrollar una patología.

[0075] Preferentemente, le nanocuerpo como se ha definido más arriba se utiliza para el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares. 65

[0076] En el contexto de la presente invención, se designa por «enfermedad vascular» una enfermedad, una lesión, o un síntoma relacionado con un proceso de aterogénesis que afecte al sistema cardiovascular. Esto incluye, en concreto, los estados que marcan el desarrollo de una placa de ateroma (las placas están clasificadas en estados de progresión I a VI, según la clasificación internacional de Stary), así como las complicaciones que derivan de la formación de una placa de ateroma (estenosis, isquemia), y/o de su evolución hacia un accidente isquémico agudo 5 (trombosis, embolia, infarto, ruptura arterial). Las enfermedades cardiovasculares designan por ejemplo aterosclerosis, una placa de ateroma, en particular la placa vulnerable, la enfermedad coronaria, la angina de pecho, la trombosis, el accidente vascular cerebral, el infarto de miocardio, la estenosis vascular, el infarto. Preferentemente, el nanocuerpo según la invención se utiliza para diagnosticar la aterosclerosis o una enfermedad coronaria. 10

[0077] Por «aterosclerosis» se entiende aquí una enfermedad que afecta a los vasos sanguíneos arteriales. La aterosclerosis puede caracterizarse por una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, principalmente debida a la acumulación de macrófagos y promovida por lipoproteínas de baja densidad.

15

[0078] La «enfermedad coronaria» es la manifestación más corriente de la enfermedad cardiovascular. Se trata de una enfermedad progresiva, debida a una mala irrigación del músculo cardíaco, derivada del estrechamiento (estenosis) o de la calcificación (esclerosis) de una o de las arterias coronarias. El síntoma principal de la enfermedad coronaria se manifiesta en forma de dolores que constituyen una angina (estable o inestable), también llamada angina de pecho. La obstrucción completa de una o de las arterias coronarias conduce al infarto. 20

[0079] El «infarto» designa un foco de necrosis circunscrito debido a una obstrucción arterial. Más específicamente, el infarto de miocardio es una necrosis del miocardio que deriva generalmente de una trombosis coronaria aguda, secundaria a una ruptura de placa (generalmente una placa vulnerable) que acarrea la agregación plaquetaria y la oclusión coronaria. 25

[0080] La presencia de una placa de ateroma coronaria, sobre todo si se trata de una placa inestable, expone al sujeto a un riesgo de accidente isquémico agudo, en particular, un infarto de miocardio. El nanocuerpo según la invención puede por tanto utilizarse para detectar un riesgo de sobrevenida de un accidente isquémico agudo, en particular, un riesgo de sobrevenida de un infarto de miocardio, en un paciente. 30

[0081] Por «riesgo de sobrevenida» se entiende aquí la probabilidad de que un individuo desarrolle una patología.

[0082] El «accidente isquémico agudo» designa la disminución del aporte sanguíneo arterial en un territorio 35 del organismo. Sus principales causas locales son la trombosis y la embolia.

[0083] La «trombosis» corresponde a la coagulación de la sangre en las cavidades vasculares (arterias, venas, capilares o cavidades cardíacas) que conducen a la formación de un trombo.

40

[0084] La «embolia» es la migración de un cuerpo extraño, a menudo constituido por un coágulo sanguíneo (trombo), y su parada brusca en un vaso cuyo calibre es insuficiente para dejarlo pasar. Las consecuencias locales de la embolia son perturbaciones circulatorias relacionadas con la obstrucción vascular, que suelen conducir a menudo a un infarto.

45

[0085] La placa de ateroma a menudo puede localizarse en una arteria carótida. Dichas lesiones conducen a accidentes vasculares cerebrales, hemorrágicos (ruptura de aneurisma) o isquémicos (infarto cerebral). El nanocuerpo según la invención puede por tanto utilizarse para detectar un riesgo de sobrevenida de un accidente vascular cerebral en un paciente.

50

[0086] Además, puede tratarse de una placa de ateroma localizada en una arteria renal, dado que el riñón es uno de los órganos a los que afecta la aterosclerosis. Una estenosis importante puede conducir a una hipertensión arterial y/o una insuficiencia renal. La afectación ateromatosa de las arterias renales puede conducir igualmente a un accidente vascular agudo, la embolia renal. El nanocuerpo según la invención puede por tanto utilizarse para detectar un riesgo de sobrevenida de una embolia renal en un paciente. 55

[0087] Las placas de ateroma pueden localizarse en las arterias de los miembros inferiores (riesgo de isquemia aguda de un miembro), o de la aorta (riesgo de ruptura de aneurisma/disección aórtica). El nanocuerpo según la invención puede por tanto utilizarse para detectar un riesgo de sobrevenida de una isquemia de un miembro o de ruptura de aneurisma aórtico en un paciente. 60

[0088] Por consiguiente, el nanocuerpo como se ha definido aquí arriba se usa preferentemente para detectar el riesgo de sobrevenida de un accidente isquémico agudo seleccionado dentro del grupo constituido por el infarto de miocardio, el accidente vascular cerebral, la embolia arterial renal y el accidente isquémico agudo de un miembro.

65

[0089] La presente invención se refiere igualmente a un método, en particular un método in vivo, de

diagnóstico de una enfermedad cardiovascular y/o de detección de un riesgo de sobrevenida de un accidente isquémico agudo en un paciente, dicho método comprende las etapas que consisten en administrar un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba a dicho paciente y en detectar dicho nanocuerpo en el organismo de dicho paciente, la detección de una localización preferente de dicho nanocuerpo a nivel del sistema cardiovascular es indicador de una enfermedad cardiovascular y/o de un riesgo de sobrevenida de un accidente isquémico agudo. 5

[0090] Por «localización preferente» se entiende que la cantidad de nanocuerpo detectada en el sistema cardiovascular es superior al ruido de fondo que corresponde a una localización no específica del nanocuerpo en el organismo.

10

[0091] La invención se refiere asimismo al nanocuerpo como se ha definido más arriba para utilizarlo en el seguimiento terapéutico de una enfermedad cardiovascular en un sujeto al que se le haya diagnosticado una enfermedad cardiovascular.

[0092] También se refiere a la utilización del nanocuerpo como se ha definido más arriba para la fabricación 15 de un agente de contraste útil para el seguimiento terapéutico de una enfermedad cardiovascular en un sujeto al que se le haya diagnosticado una enfermedad cardiovascular.

[0093] Por «seguimiento terapéutico» se entiende aquí la observación de la respuesta del sujeto al tratamiento que se le ha administrado. El efecto terapéutico de un tratamiento generalmente se asocia a una 20 disminución o una inhibición de la progresión de una enfermedad, a una reversión de la enfermedad o de uno o varios síntomas asociados a esta enfermedad. A la inversa, una ausencia de efecto terapéutico puede traducirse por una estabilidad o una aceleración de la progresión de la enfermedad o de uno o varios de sus síntomas.

[0094] Por ejemplo, si la enfermedad cardiovascular en el sentido de la invención es una placa de ateroma, el seguimiento terapéutico puede realizarse observando la desaparición, la regresión, la continuidad o el crecimiento 25 de la placa de ateroma. Así, el uso según la invención puede comprender las siguientes etapas:

a) administrar un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba a un sujeto al que se haya detectado una placa de ateroma;

b) detectar la unión del nanocuerpo a dicha placa de ateroma; 30

c) repetir las etapas a) y b) antes y después de la administración de un tratamiento a dicho sujeto;

una ausencia o una disminución de la unión del nanocuerpo en dicha placa es indicadora de un tratamiento con un efecto terapéutico.

35

Uso como medicamento

[0095] La invención se refiere además al uso de un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba para la fabricación de un medicamento, en particular, un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad cardiovascular. Un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz 40 del nanocuerpo como el que se ha definido más arriba a un paciente que lo necesite, también forma parte de la presente invención.

[0096] La utilización de un ligando de VCAM-1, solo o emparejado a un agente estabilizador de las placas de ateroma, permite, efectivamente, reducir la probabilidad de ruptura de las placas. 45

[0097] Por «tratamiento» de una enfermedad cardiovascular, se entiende el «tratamiento terapéutico» (o curativo) de una enfermedad cardiovascular, que incluye la disminución o la inhibición de la evolución de una placa de aterosclerosis, en particular hacia un estado de placa de aterosclerosis vulnerable, o la regresión de una placa de aterosclerosis, en particular de una placa vulnerable. Asimismo se entiende el «tratamiento profiláctico» de una 50 enfermedad cardiovascular que incluye particularmente la prevención de un accidente isquémico agudo.

[0098] El nanocuerpo según la invención se une ventajosamente a un agente estabilizador de las placas de ateroma, de forma que pone en contacto el agente estabilizador y la lesión. La elección de un agente estabilizador apropiado está al alcance del experto en la materia. Algunos ejemplos de agentes estabilizadores incluyen, 55 particularmente, moléculas antiinflamatorias, como los antiinflamatorios no esteroideos.

[0099] La invención se refiere más particularmente al nanocuerpo como el que se ha definido más arriba para su uso en el tratamiento de la aterosclerosis y/o la prevención de un accidente isquémico agudo, preferentemente para el tratamiento de una placa aterosclerótica vulnerable. 60

[0100] La invención se refiere además al uso de un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la aterosclerosis y/o a la prevención de un accidente isquémico agudo en un paciente susceptible de presentar una enfermedad cardiovascular.

65

[0101] La invención se refiere igualmente a un método de tratamiento de la aterosclerosis y/o de prevención

de un accidente isquémico agudo en un paciente que lo necesite, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba a un paciente que lo necesite.

[0102] Preferentemente, el nanocuerpo según la invención se utiliza para tratar una placa de ateroma vulnerable, más preferentemente una placa de ateroma coronaria o aórtica vulnerable. 5

[0103] Preferentemente, dicho accidente isquémico agudo se selecciona en el grupo constituido por un infarto de miocardio, un accidente vascular cerebral, una embolia renal, una isquemia aguda de un miembro, y una ruptura de aneurisma aórtico.

10

[0104] El nanocuerpo según la invención puede administrarse por ejemplo por vía oral, por inhalación, por vía parenteral (en particular por inyección intravenosa), en una forma apropiada. Cuando se elige la vía parenteral, el nanocuerpo puede estar en forma de soluciones o de suspensiones inyectables envasadas en ampollas o frascos. Las formas de administración parenteral se obtienen de forma convencional por mezcla del nanocuerpo con amortiguadores, estabilizantes, conservadores, agentes solubilizantes, agentes isotónicos y agentes de puesta en 15 suspensión. De conformidad con las técnicas conocidas, estas mezclas pueden esterilizarse y envasarse en forma de inyecciones intravenosas. Como amortiguador, el experto en la materia podrá utilizar amortiguadores a base de sales de fosfato orgánico. Algunos ejemplos de agentes de puesta en suspensión engloban la metilcelulosa, la hidroxietilcelulosa, la hidroxipropilcelulosa, la goma arábiga, y la carmelosa de sodio. Además, los estabilizantes útiles según la invención incluyen el sulfito de sodio y el metasulfito de sodio, mientras que se puede citar el p-20 hidroxibenzoato de sodio, el ácido sórbico, el cresol y el clorocresol como conservadores.

[0105] La cantidad de nanocuerpos administrada depende naturalmente del modo de administración, del tamaño y/o del peso del paciente y de la naturaleza del agente citotóxico que puede asociársele.

25

[0106] La presente invención se refiere igualmente a una composición farmacéutica que contiene dicho nanocuerpo como el que se ha definido más arriba asociada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0107] El término «farmacéuticamente» o «farmacéuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones secundarias, alérgicas o no deseadas de otra forma cuando se 30 administran a un mamífero, en particular a un humano.

[0108] En el contexto de la invención, la expresión «vehículo farmacéuticamente aceptable» incluye cualquier solvente, medio de dispersión, revestimiento, agente bacteriano o antifúngico, agente isotónico o retardante de la absorción, y análogos. El experto en la materia conoce el uso de dichos medios y agentes para las sustancias 35 farmacéuticamente activas. Con excepción del caso en el que el medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se baraja su uso en las composiciones farmacéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios a las composiciones.

Uso para detectar in vitro VCAM-1 40

[0109] La presente invención también se refiere al uso de un nanocuerpo como el que se ha definido más arriba para la detección in vitro de VCAM-1 en una muestra.

[0110] Por «muestra» se entiende aquí una parte de un elemento más grande. Preferentemente, la muestra 45 es una sustancia de origen biológico. Algunos ejemplos de muestras biológicas incluyen, sin limitarse, partes de órganos o de tejidos como el riñón, el hígado, el corazón, el pulmón, etc., las arterias, las venas, etc., la sangre y sus compuestos como el plasma, las plaquetas, las subpoblaciones de células sanguíneas, etc.

[0111] La presente invención se ilustrará más detalladamente con las figuras y ejemplos que aparecen a 50 continuación.

Descripción de las figuras

[0112] 55

La Figura 1 presenta el análisis en citometría de flujo de los nanocuerpos anti-VCAM-1 (cAbVCAM1-1: 1; cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9 y cAbVCAM1-10: 10) en células de ratón bEND5 no tratadas (línea de puntos) o tratadas con TNFα (línea continua). Un anticuerpo monoclonal anti-VCAM-1 de ratón marcado con PE (Ct +) se ha utilizado como 60 control positivo y el nanocuerpo cAbBcII10 (Ct -) se ha utilizado como control negativo.

La Figura 2 representa histogramas que muestran la unión normalizada de los nanocuerpos anti-VCAM-1 (cAbVCAM1-1: 1; cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9 y cAbVCAM1-10: 10) marcados con 99mTc en células bEND5 no 65 tratadas (barras blancas), tratadas con TNFα (y expresando por tanto VCAM-1; barras negras) o tratadas con TNFα

e incubadas con un exceso de nanocuerpo anti-VCAM-1 no marcado (barras grises). *: P<0,05 frente a 99mTcAbBcII10. †: P<0,05 frente a tratadas con TNFα e incubadas con un exceso de nanocuerpos anti-VCAM-1 no marcado.

La Figura 3 muestra los resultados de inmunohistoquímica en muestras de corazón (C), músculo (M), glándula 5 salivar (GS), de tejidos linfáticos que incluyen muestras de médula ósea (MO), ganglio linfático (GL), bazo (B) y timo (T), y muestras de aorta (A) de ratón de control C57BI/6J y de ratón ApoE-/ marcados con un nanocuerpo anti-VCAM-1 (VCAM-1). La especificidad de los resultados se muestra por la ausencia de marcado en ausencia de anticuerpo primario (ct). La barra de escala representa 20 µm, excepto para la aorta (A) donde representa 100 µm.

10

La Figura 4 representa histogramas que muestran la absorción aórtica (en %ID/g) del nanocuerpo cAbVCAM1-5 y del nanocuerpo de control cAbBcII10 en la aorta de ratones de control C57BI/6J (barras blancas) y los segmentos arteriales de ratones ApoE-/- ordenados según el índice de extensión de la lesión (+++: barras negras; ++: barras con rayas diagonales; + barras con rayas verticales; - barras con puntos). Los resultados se expresan en media ± error estandar de la media. *: P<0,05 frente a C57BI/6J. †: P<0,05 frente al índice de extensión de la lesión siguiente. 15

La Figura 5 representa histogramas que muestran la proporción de la lesión sobre el control obtenida con el nanocuerpo cAbVCAM1-5 y el nanocuerpo de control cAbBcII10 por cuantificación de los autorradiogramas: *: P<0,05 frente a cAbBcII10. EN la parte superior derecha de la figura se presentan autorradiogramas representativos (ARG) obtenidos con 99mTc-cAbVCAM1-5 y 99mTc-cAbBcII10 en cortes adyacentes, en los que VCAM-1 además ha sido inmunomarcado (VCAM-1). La barra de escala representa 200 µm. 20

La Figura 6 representa perfiles HPLC del nanocuerpo 99mTc-cAbVCAM1-5 que muestran que el nanocuerpo es estable in vitro 0 hora (A) y 6 horas (B) después del radiomarcado, así como en in vivo en la sangre 3 horas después de la inyección (C).

25

La Figura 7 representa las imágenes de proyecciones de intensidad máxima (MIP) de los nanocuerpos de control 99mTccAbBcII10 (A) y 99mTc-cAbVCAM1-5 (B) obtenidos en cuerpo entero por SPECT/CT in vivo 3 horas después de la inyección intravenosa en ratones C57BI/6J. Se indican la vesícula (V), los riñones (Ri), los ganglios linfáticos (GL), la médula ósea (MO), el timo (T) y el bazo (B).

30

La Figura 8 representa vistas coronarias representativas por gammagrafía CT, SPECT y fusión SPECT/CT in vivo, tomadas en el cayado aórtico de ratones C57BI/6J, 3 horas después de la inyección de nanocuerpo 99mTc-cAbBcII10 (cAbBcII10) o de 99mTc-cAbVCAM1-5 (cAbVCAM1-5). La escala de imágenes SPECT se ha ajustado del 1 al 3,4 % de la dosis inyectada de forma que permita una comparación directa. Los ganglios linfáticos auxiliares (In) y el timo (t) se indican en las imágenes SPECT/CT. L representa la izquierda, R representa la derecha, P representa la cara 35 posterior.

La Figura 9 representa vistas coronarias representativas en gammagrafía CT, SPECT y fusión SPECT/CT in vivo, tomadas en el cayado aórtico de ratones ApoE-/-,, 3 horas después de la inyección de nanocuerpo 99mTc-cAbBcII10 (cAbBcII10) o de 99mTc-cAbVCAM1-5 (cAbVCAM1-5). La escala de imágenes SPECT se ha ajustado del 1 al 3,4 % 40 de la dosis inyectada de forma que permita una comparación directa. Los ganglios linfáticos auxiliares (In), el timo (t) y el cayado aórtico (ao) se indican en las imágenes SPECT/CT. La flecha indica el cayado aórtico en la imagen SPECT. L representa la izquierda, R representa la derecha, P representa la cara posterior.

La Figura 10 representa histogramas que muestran las proporciones in vivo cayado/sangre (panel de la izquierda) y 45 cayado/corazón (panel de la derecha) obtenidos en ratones de control C57BI/6J (barras blancas) o ratones ApoE-/- (barras negras) después de la administración de nanocuerpos de control cAbBcII10 o de nanocuerpos cAbVCAM1-5, en base a cuantificaciones de imágenes SPECT. *: P<0,05 frente a 99mTc-AbBcII10. †: P<0,05 frente a C57BI/6J.

La Figura 11 representa el análisis por citometría de flujo de los nanocuerpos anti-VCAM-1 (cAbVCAM1-1: 1; 50 cAbVCAM1-2: 2; cAbVCAM1-3: 3; cAbVCAM1-4: 4; cAbVCAM1-5: 5; cAbVCAM1-6: 6; cAbVCAM1-7: 7; cAbVCAM1-8: 8; cAbVCAM1-9: 9 y cAbVCAM1-10:} 10) (línea de puntos) en células de hámster CHO no transinfectadas (A) o transinfectadas (B) con un plásmido codificante para el VCAM-1 de conejo. Una condición sin nanocuerpo se ha utilizado como control negativo (línea continua). Los nanocuerpos cAbVCAM1-1 y cAbVCAM1-5 se fijan a las células CHO expresendo el VCAM-1 de conejo. 55

Ejemplo

[0113] El ejemplo que aparece a continuación muestra las propiedades específicas de los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9 según la invención respecto de otros nanocuerpos anti-60 VCAM-1.

Material y métodos

Generación y producción de nanocuerpos 65

[0114] Los nanocuerpos que se dirigen a VCAM-1 se han generado, de forma general, según los métodos anteriormente publicados (Arbabi Ghahroudi et al. (1997) FEBS Lett. 414:521-526). Más específicamente, se ha inmunizado un dromedario con proteínas VCAM-1 recombinantes a la vez humanas y murinas (RnD Systems, Minneapolis, USA). Los linfocitos de la sangre se han aislado y el ARN se ha purificado. Los dominios variables de los nanocuerpos monocatenario (VHH o nanocuerpo) se han amplificado utilizando la técnica de la RT-PCR de dos 5 etapas y se han clonado en fase con la proteína 3 del bacteriófago M13. Los nanocuerpos se han sometido a la expresión de fagos y se han utilizado en biopanning sobre inmunógenos inmovilizados. Se han utilizado extractos bacterianos totales que contienen nanocuerpos solubles para seleccionar ligandos de VCAM-1 individuales en base a una señal positiva en ELISA y en citometría de flujo en células bEND5 estimuladas con TNFα. Después de la secuenciación, los nanocuerpos anti-VCAM-1 seleccionados y los nanocuerpos de control cAbBcII10 no pertinentes 10 se han producido en forma de proteínas marcadas con una hexahistidina en E. coli y purificadas como se describe en Saerens et al. (2005) J. Mol. Biol. 352:597-607.

Evaluación in vitro de nanocuerpos no marcados

15

[0115] Estirpe celular - La estirpe celular endotelial de ratón bEND5 (ECACC, Salisburg, GB) se ha cultivado en un medio DMEM complementado. La expresión de VCAM-1 se ha inducido por estimulación con 10 ng/mL de TNFα durante 18 horas.

[0116] Citometría de flujo - 105 células bEND5 estimuladas con TNFα y no estimuladas se han incubado bien 20 con 200 ng de anticuerpo monoclonal anti-VCAM-1 de ratón marcado con PE (mAb; Abcam), bien secuencialmente con 1 µg de nanocuerpo, 1 µg de anticuerpo monoclonal anti-His-tag (Serotec) y 200 ng de IgG1 de rata anti-ratón (BD Biosciences). El enlace se ha medido en un FACS Canto II analyzer (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA), y los datos se han analizado con el programa FlowJo (TreeStar, Ashland, USA).

25

[0117] Estabilidad térmica - Los valores de Tm (temperaturas de despliegue) se han obtenido en un espectropolarímetro J-715 (Jasco, Easton, MD, USA) como se describe en Vaneycken et al. (2010) J. Nucl. Med. 51:1099-1106.

[0118] Evaluación de la afinidad basada en la resonancia plasmónica de superficie (SPR) - La afinidad de los 30 nanocuerpos para VCAM-1 recombinante humano o murino se ha determinado por análisis SPR sobre un dispositivo Biacore 3000. ICAM-1 de ratón recombinante (RnD Systems) se ha utilizado como control negativo. Las proteínas recombinantes se han inmovilizado sobre un chio sensor CM5 (Biacore, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Se han ensayado diluciones de la mitad en serie de nanocuerpos de 50 a 1 nM en PBS 0,005 % Tween 20®. Se han determinado las constantes de afinidad utilizando un ajuste del modelo de asociación estándar 35 1:1 (software BIAevaluation).

[0119] Competición con el epítopo utilizando la SPR - La SPR se ha utilizado para determinar qué nanocuerpos estaban en competición para el mismo epítopo. Los procedimientos utilizados son idénticos a los descritos en Vaneycken et al. (2011) FASEB J. 25:2433-2446. 40

Radiomarcado y determinación por HPLC de la estabilidad in vitro e in vivo

[0120] Los nanocuerpos se han radiomarcado con 99mTc utilizando el método tricarbonilo como se describe en Gainkam et al. (2008) J. Nucl. Med. 49:788-795. La pureza radioquímica se ha evaluado inmediatamente 45 después del marcado, tras 6 horas a 20ºC en PBS y en sangre de ratón 3 h después de la inyección (p.i.). En el último caso, 100 mL de sangre total muestreada se han centrifugado y el plasma se ha filtrado utilizando una membrana Nanosep 10K Omega. La pureza radioquímica se ha determinado por RP-HPLC utilizando una columna C4 eluida con una fase móvil en gradiente ACN/TFA. La radioactividad se ha visualizado utilizando un radiodetector (γ-RAM Model 4, LabLogic). 50

Evaluación in vitro de los nanocuerpos marcados con 99mTc

[0121] 250x103 células bEND5 se han cultivado en placas de 24 pocillos y se han estimulado durante 18 horas con TNFα a 10 ng/mL. 5 nM de cada nanocuerpo-99mTc se han incubado en 0,5 mL de PBS + 1 % de 55 seroalbúmina humana (HSA) durante 1,5 horas a 37ºC. Se han realizado estudios de competición con un exceso de 500 veces de nanocuerpo no marcado para determinar la especificidad de unión. Después del lavado, los 99mTc-nanocuerpos unidos se han recogido y contado en un contador gamma (Cobra Il Inspector 5003, Canberra Packard, USA). Los experimentos se han realizado por triplicado. Se ha extraído la unión no específica de los pozos, y los resultados se han normalizado con la condición TNFα-negativa. 60

Modelo animal y procesado de las aortas

[0122] Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el comité del Centro de Investigación del Servicio de Salud del Ejército de Grenoble (Centre de Recherche du Service de Santé des Armées de Grenoble, 65 CRSSA). Se han utilizado ratones hembras de control y ApoE-/- de 3161 semanas (Charles-River, Francia). Los

ratones ApoE-/- (n=37) se han alimentado con un régimen occidental con un contenido del 0,25 % de colesterol (Safe, Francia) mientras que los ratones C57BI/6J de control (n=9) se han alimentado con un régimen alimenticio estándar. Cada nanocuerpo anti-VCAM-1 se ha evaluado en 3 ratones salvo el ApoE-/- nanocuerpo cAbVCAM1-5 (n=6), que además se ha evaluado en ratones C57BI/6J de control (n=4). Los anticuerpos cAbBcII10 se han evaluado como control negativo a la vez en los ratones ApoE-/- (n=4) y los ratones de control (n=5). Dos horas 5 después de la administración de nanocuerpos radiomarcados con 99mTc (6764 MBq i.v.), los ratones han sido anestesiados utilizando isoflurano 2 % (Baxter) y se ha realizado la adquisición SPECT/CT (nanoSPECT, Bioscan, ver más abajo). Se ha sacrificado a los animales con una sobredosis de pentobarbital de sodio (CEVA) y las aortas así como los otros órganos importantes se han extraído con precaución. Las aortas se han separado de los tejidos adherentes en una solución de formalina al 10 % y cortadas en 12 segmentos desde la aorta ascendente hasta la 10 bifurcación ilíaca. Se ha atribuido un índice de extensión de la lesión a cada segmento de la siguiente manera: (-) sin lesión (segmentos de control), (+) lesiones que cubran hasta el 50 % de la longitud del segmento arterial, (++) lesiones que cubran más del 50 % de la longitud del segmento arterial y (+++) lesiones que se extienden en toda la longitud del segmento. Los segmentos aórticos y las muestras de tejido se han pesado y su actividad se ha determinado con un contador de pozo de gamma (Cobra II, Packard). Se ha corregido el ruido de fondo y el 15 decrecimiento radioactivo de los resultados y se han expresado en porcentajes de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). Las absorciones de las lesiones aórticas y del control se han definido como la absorción media en todos los segmentos clasificados (+++) o (-) respectivamente. También se han determinado las proporciones lesión/control, lesión/sangre y lesión/corazón.

20

[0123] Se han obtenido criosecciones adyacentes de 20 y 8 mm de grosor a partir de los 12 segmentos aórticos obtenidos para la formación de imágenes por micro-autorradiografía (BASS-5000, Fujifilm) y el marcado inmunohistológico de VCAM-1 respectivamente.

[0124] Además, la depuración sanguínea de 99mTC-cAbVCAM1-5 se ha evaluado en 3 ratones C57BI/6 por 25 recuperación de muestras sanguíneas en diferentes momentos tras la inyección. Los resultados se han expresado en %ID en el volumen de sangre total (%ID/TBV).

Inmunohistoquímica

30

[0125] Tras 1 hora de bloqueo a 20ºC con el 10 % de suero de asno, un anticuerpo primario de cabra anti-VCAM-1 (Santa-Cruz Biotechnology, 0,5 mg/ml) se ha aplicado en las secciones aórticas durante la noche a 4ºC. Un anticuerpo secundario biotinilado de asno anti-cabra (Jackson ImmunoResearch) se ha incubado durante 1 hora a 20ºC y el DAB se ha utilizado como cromógeno. Las sección se han contracoloreado con hematoxilina. La especificidad de marcado se ha verificado omitiendo el anticuerpo primario en cortes de control. En un subgrupo de 35 ratones de control y ApoE-/-, el inmunomarcado VCAM-1 se ha realizado en el corazón, el músculo, las glándulas salivares, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo y el timo.

[0126] Dos horas después de las inyecciones intravenosas, los animales anestesiados se han colocado en un lecho a temperatura controlada y se han realizado las adquisiciones SPECT/CT cuerpo entero (nanoSPECT, 40 Bioscan). El tiempo de adquisición CT aproximado fue de 10 min, utilizando los parámetros de adquisición siguientes: 45kvp, 240 proyecciones y 1000 ms por proyección. La adquisición SPECT helicoidal se ha realizado con 4 cabezas equipadas con colimadores estenopeicos con multiagujeros de resolución de 1 mm (9 x 1,4 mm de diámetro de agujero por cabeza) utilizando 24 proyecciones y 45 minutos de adquisición. Las adquisiciones CT y SPECT se han reconstruido, fusionado y cuantificado utilizando el programa dedicado (InVivoScope). Se han 45 dibujado las regiones de interés (ROIs) en el cayado aórtico, en la cavidad ventricular izquierda y en la pared ventricular izquierda para determinar las proporciones cayado/sangre y cayado/corazón.

Autorradiografía

50

[0127] Para cada animal se han obtenido imágenes autorradiográficas tras una noche de exposición de 3 grupos de cortes de 20 µm de grosor obtenidos a diferentes niveles de los 12 segmentos aórticos. Las imágenes se han cuantificado utilizando el programa dedicado (Image Gauger, Fujifilm). Las ROI se ha dibujado alrededor de las lesiones ateroscleróticas y de la pared aórtica VCAM-1 negativa control. Se ha corregido el ruido de fondo de los resultados que se han expresado en forma de proporciones lesión/control medias. 55

Evaluación de la reactividad de los nanocuerpos no radiomarcados contra el VCAM-1 de conejo.

[0128] Se han incubado secuencialmente 105 células transinfectadas o no de forma transitoria con un plásmido codificante para el VCAM-1 de conejo con 1 µg de nanocuerpo, 1 µg de anticuerpo monoclonal anti-His-tag 60 (Serotec) y 200 ng de IgG1 de rata anti-ratón (BD Biosciences). La unión se ha medido en un FACS Canto II analyzer (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA), y los datos se han analizado con el programa FlowJo (TreeStar, Ashland, USA). Se ha realizado un control negativo omitiendo el nanocuerpo.

Análisis estadístico 65

[0129] Todos los resultados se presentan en forma de media ± error estándar de la media. Los ensayos no paramétricos de Mann&Witney U y de Wilcoxon se han utilizado para comparar los datos emparejados y no emparejados. Las diferencias se han considerado como significativas para p<0,05.

Resultados:

5

Generación de los nanocuerpos anti-VCAM

[0130] Los inventores han querido desarrollar nanocuerpos con reacción cruzada para VCAM-1 humano y murino. Por consiguiente, los nanocuerpos se han generado por inmunización de un dromedario con proteínas recombinantes VCAM-1 a la vez humanas y murinas, y por biopanning de la biblioteca de nanocuerpos inmunes 10 obtenidos por expresión de fagos. Se han tamizado en ELISA extractos bacterianos totales que contienen los nanocuerpos individuales para unirlos con las proteínas recombinantes VCAM-1 y en citometría de flujo para unirlos con las células bEND5 expresando VCAM-1.

[0131] Después de la secuenciación, 31 nanocuerpos anti-VCAM-1 se han identificado y reagrupado en 12 15 familias en base a la similaridad de las secuencias en los bucles de unión en el antígeno. Seis familias de nanocuerpos eran específicas de VCAM-1 murino (mVCAM-1) y 6 familias se unían a la vez con VCAM-1 murino y humano (hVCAM-1). En base a las señales ELISA y de citometría de flujo de los extractos totales, 10 nanocuerpos (llamados cAbVCAM1-1 a -10) se han seleccionado para ser analizados más detalladamente. El rendimiento de producción de nanocuerpo era de 0,5 a 10,5 mg/L de cultivo bacteriano (Tabla 4). 20

Caracterizaciones in vitro

[0132] Las experiencias de citometría de flujo sobre las células bEND5 han mostrado que los 10 nanocuerpos seleccionados interactuaban con VCAM-1 (Figura 1). Como se ha demostrado con los análisis SPR, resumidos en la 25 Tabla 4, todos los nanocuerpos seleccionados se unían a VCAM-1 con altas afinidades que oscilaban entre 0,2 à 45,7 nM. Además, entre los 10 nanocuerpos seleccionados, 6 eran de reactividad cruzada con hVCAM-1 con afinidades que se mantenían en el orden del nanomolar (Tabla 4). Estos seis nanocuerpos fueron cAbVCAM1-1, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-8, cAbVCAM1-9 y cAbVCAM1-10. En base a los estudios de competición SPR, los nanocuerpos cAbVCAM1 se han agrupado en 3 categorías de selección de epítopo: cAbVCAMI-1/5, 30 cAbVCAM1-2/3/6/7/9/10 y cAbVCAM1-4/8. Todos los nanocuerpos han mostrado una fuerte estabilidad térmica, como han demostrado las temperaturas de despliegue que van de 59,4 a más de 87ºC (Tabla 4).

Tabla 4: Comparación entre los 10 nanocuerpos anti-VCAM-1 evaluados.

Radiomarcador

%ID/g de lesión Lesión/Control Lesión/Sangre Lesión/Corazón KD mVCAM-1 (nM) KD hVCAM1 (nM) Rendimiento de producción (mg/L) Tm (°C)

cAbVCAM1-1

0,87±0,08 #9 2,15±0,20 #9 0,74±0,10* #10 2,65±0,23* #9 8,3±1,2 #7 12,4±0,5 #5 2,0 #7 72,3±0,1 #2

cAbVCAM1-2

2,15±0,29* #6 2,90±0,45 #2 3,37±0,32* #5 5,55±0,58* #7 0,3±0,0 #2 Sin reactividad cruzada 5,0 #5 62,3±0,1 #6

cAbVCAM1-3

2,95±0,16* #2 4,07±0,56 #3 5,06±0,39* #1 7,40±0,91* #3 2,4±0,1 #5 9,1±0,9 #4 6,8 #3 59,7±0,1 #9

cAbVCAM1-4

2,21±0,59* #5 3,20±0,74 #9 1,14±0,29 #9 1,96±0,56* #10 0,2±0,0 #1 Sin reactividad cruzada 6,8 #3 59,4±0,1 #10

cAbVCAM1-5

2,53±0,08* #3 4,95±0,85* #1 4,32±0,48* #2 8,30±1,11* #1 2,0±0,0 #4 6,5±0,7 #3 10,5 #1 >87 #1

cAbVCAM1-6

0,73±0,08 #10 4,57±0,93* #2 1,85±0,37 #8 4,98±0,75 #8 5,2±0,6 #6 Sin reactividad cruzada 3,0 #6 72,0±0,1 #3

cAbVCAM1-7

1,27±0,25* #8 2,88±0,65 #7 4,02±1,05* #3 5,98±0,96 #4 26,6±1,2 #9 Sin reactividad cruzada 6,9 #2 60,9±0,3 #8

cAbVCAM1-8

2,48±0,46* #4 1,40±0,10 #10 3,66±0,10* #4 7,71±0,38* #2 13,2±0,3 #8 1,4±0,5 #1 1,5 #8 61,5±0,1 #7

cAbVCAM1-9

2,99±0,07* #1 2,19±0,60 #8 2,51±0,03* #6 5,69±0,36* #6 0,9±0,2 #3 5,3±0,7 #2 0,9 #9 66,8±0,2 #4

cAbVCAM1-10

1,93±0,14* #7 3,47±0,67* #4 2,01±0,14* #7 5,76±0,56* #5 45,7±20,0 #10 18,4±7,0 #6 0,8 #10 63,4±0,2 #5

cAbBcII10

0,68±0,60 1,66±0,28 1,57±0,09 4,00±0,14 - - - -

La media ± error estándar de la media y el rango (#) se dan para los parámetros obtenidos bien ex vivo por conteo-pozo gamma (%ID/g de lesión, proporción lesión/control, proporción lesión/sangre, proporción lesión/corazón), o in vitro, (KD para mVCAM-1 o hVCAM-1, rendimiento de producción y Tm). * p<0,05 frente a cAbBcII10.

[0133] Tras las etapas de radiomarcado con 99mTc y de purificación, las purezas radioquímicas eran superiores al 95 % para los 10 nanocuerpos cAbVCAM1 y el nanocuerpo de control cAbBcII10. El marcado con 99mTc no ha afectado el reconocimiento de VCAM-1 en la mayor parte de los ligandos, como se ha demostrado con el ensayo de unión in vitro sobre las células bEND (Figura 2): los inventores han demostrado, por tanto, que la unión en las células endoteliales VCAM-1 positivas y estimuladas con TNFα era significativamente más fuerte que en las 5 células estimuladas. Además, la unión en las células estimuladas con TNFα se inhibió con éxito por competición con un exceso de nanocuerpo no marcado, lo que demostró su especificidad.

Análisis de las biodistribuciones

10

[0134] Las biodistribuciones de los nanocuerpos marcados con 99mTc en los ratones ApoE-/- se han resumido en la Tabla 5. Todos los nanocuerpos, incluido el de control cAbBcII10, han mostrado una fuerte absorción en los riñones, entre 97±16 y 315±33 %ID/g y fuertes actividades en la vejiga. De forma interesante, las absorciones de 99mTccAbVCAM1 eran elevadas en los tejidos linfáticos e incluso alcanzaron una diferencia estadística para 99mTccAbVCAM1-3 (bazo y timo), 99mTc-cAbVCAM1-4/5 (bazo, timo y médula ósea) y 99mTc-cAbVCAM1-9 (timo) 15 (p<0,05 frente a 99mTc-cAbBcII10). Con excepción de los pulmones y del hígado (absorción media de 2,5±0,8 y 2,7±0,9 %ID/g, respectivamente), la absorción fue inferior a 2 %ID/g en los otros tejidos estudiados, incluidos la sangre y el miocardio.

[0135] Como se muestra en la Tabla 4, la absorción en las lesiones ateroscleróticas era superior a 2 %ID/g 20 para 6 de los 10 nanocuerpos cAbVCAM1, con un valor máximo de 2,99±0,14 %ID/g para 9mTc-cAbVCAM1-9 (P<0,05 frente a 99mTc-cAbBcII10).

[0136] Las proporciones lesión/control, lesión/sangre y lesión/corazón se han determinado a partir de los datos de biodistribución (Tabla 4). La proporción lesión/control fue superior a 2 en todos los nanocuerpos 25 cAbVCAM1 evaluados excepto uno, con una relación máxima de 4,95±0,85 para cAbVCAM1-5 (P<0,05 frente a 99mTccAbBcII10). La proporción lesión/sangre fue superior a 1 en todos los nanocuerpos cAbVCAM1 evaluados excepto uno, con una relación máxima de 5,6±0,39 para 99mTc-cAbVCAM1-3 (P<0,05 frente a 99mTc-cAbBcII10). Por último, la proporción lesión/corazón fue superior a 1 en todos los nanocuerpos, con un valor máximo de 8,30±1,11 para 99mTccAbVCAM1-5 (P<0,05 frente a 99mTc-cAbBcII10). 30

Tabla 5: Biodistribución ex vivo de los nanocuerpos anti-VCAM-1 marcados con 99mTc 3 horas después de la inyección en ratones de control hipercolesterolémicos ApoE-/-.

ApoE-/-

cAbVCAM1-1

cAbBcII10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sangre

1,2±0,1* 0,6±0,1 0,6±0,0 1,5±0,1* 0,6±0,1 0,4±0,1 0,3±0,0 0,6±0,1 1,2±0,0* 1,0±0,2* 0,4±0,0

Corazón

0,3±0,0 0,4±0,1* 0,4±0,0* 1,1±0,0* 0,3±0,1* 0,2±0,0 0,2±0,0 0,3±0,1 0,5±0,0* 0,4±0,1 0,2±0,0

Pulmón

3,2±0,6 1,5±0,2 3,2±0,5 4,1±1,0* 2,3±0,3* 1,7±1,1 1,3±0,2 2,1±0,6 2,5±0,1 2,07±1,0 1,0±0,2

Hígado

2,2±0,24* 2,0±0,1 1,5±0,1 8,3±0,7* 1,8±0,3* 0,8±0,1 1,2±0,2 3,1±0,3* 2,4±0,2* 4,0±0,4* 0,7±0,0

Músculo esquelético

0,6±0,4 0,1±0,0 0,2±0,0 0,2±0,0 0,2±0,0 0,2±0,1 0,1±0,0 0,2±0,1 0,2±0,0 0,2±0,0 0,1±0,0

Piel

0,2±0,1 0,3±0,1 0,3±0,0 0,9±0,5 0,4±0,0 0,3±0,0 0,4±0,0 0,6±0,2 0,4±0,1 0,4±0,1 0,3±0,0

Grasa

0,1±0,0 0,1±0,0 0,1±0,0 0,2±0,0 0,1±0,0* 0,1±0,0 0,1±0,0 0,2±0,1 0,1±0,0 0,1±0,0* 0,1±0,0

Cerebro

0,0±0,0* 0,1±0,0* 0,1±0,0* 0,2±0,0 0,1±0,0* 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1±0,0* 0,0±0,0* 0,0±0,0

Glándulas salivares

0,9±0,3* 0,4±0,0 0,5±0,0 1,2±0,1* 0,5±0,1* 0,3±0,0 0,5±0,1 0,6±0,3 0,6±0,1 0,7±0,1 0,2±0,0

Páncreas

0,3±0,1 0,2±0,0 0,3±0,0 0,6±0,0* 0,3±0,0* 0,2±0,0 0,2±0,0 0,3±0,1 0,4±0,0* 0,3±0,1 0,1±0,0

Tiroides

0,9±0,2 0,5±0,2 1,0±0,2 1,5±0,2 0,7±0,1 1,0±0,6 0,9±0,2 1,1±0,4 1,3±0,5 1,4±0,1 0,1±0,0

Estómago

06±0,0 0,6±0,1 0,6±0,0 1,5±0,3* 06±0,1* 0,3±0,0 0,5±0,1 0,7±0,1 0,7±0,0 0,7±0,1 0,4±0,1

Bilis

0,9±0,2 0,4±0,1 1,7±1,0 0,5±0,0 0,7±0,2 0,5±0,1 0,9±0,1 1,1±0,1 --- 0,8±0,2 0,4±0,1

Intestino

1,4±0,8 0,5±0,1 0,5±0,0 0,7±0,4* 0,5±0,1* 0,3±0,1 0,6±0, 0,5±0,1 0,6±0,0 0,5±0,1 0,2±0,1

Riñón

125±13 228±34 303±68 97±16* 222±12 207±31 254±18 315±33 158±6 304±32 266±14

Orina

265±84* 59±14 96±35 58±33 83±15 77±18 92±25 27±7 98±12 44±14 41±10

Bazo

2,9±0,2 8,0±0,3 20,3±11,4* 35,7±0,3* 9,2±1,0* 1,7±0,0 1,6±0,1 1,6±0,2 8,0±1,2 4,3±0,5 0,4±0,0

Timo

0,4±0,1 0,7±0,1 1,9±0,1* 2,2±0,6* 1,7±0,1* 0,4±0,0 0,5±0,0 0,5±0,1 1,5±0,2* 0,3±0,2 0,2±0,0

Médula ósea

2,6±0,3 5,9±0,8 13,7±5,6 31,8±2,2* 10,7±2,9* 1,9±0,2 2,6±0,1 1,5±0,3 7,0±0,8 3,2±0,7 1,0±0,7

Los resultados se expresan en media ± error estándar de la media. *: p<0,05 frente a cAbBcII10.

Inmunohistoquímica

[0137] Como se muestra en la Figura 3, una expresión constitutiva de VCAM-1 ha sido observada en los tejido linfoides (es decir, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo y el timo) a la vez en los ratones de control C57BI/6J y los ratones hipercolesterolémicos ApoE-/-, mientras que no se ha encontrado ninguna expresión de 5 VCAM-1 en el corazón, los músculos y las glándulas salivares. Además, se ha observado un fuerte marcado VCAM-1 en las lesiones aórticas, a nivel del endotelio, así como en el interior de la placa aterosclerótica, pero no en la aorta de los ratones de control C57BI/6J.

Absorción de cAbVCAM1-5 en las lesiones ateroscleróticas: formación de imagen ex vivo e in vivo 10

[0138] En base a los criterios de selección resumidos en la Tabla 4, los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9 han sido considerados por los inventores como los más promotores para servir como radiomarcadores en la formación de imagen médica. El nanocuerpo cAbVCAM1-5 ha sido más particularmente seleccionado para ser objeto de evaluaciones adicionales. 15

[0139] Absorción aórtica - En los ratones ApoE-/-, los inventores han demostrado que la absorción aórtica de 99mTccAbVCAM1-5 concordaba con el índice de extensión de la lesión. Efectivamente, la absorción de 99mTccAbVCAM1-5 ha aumentado al mismo tiempo que el volumen relativo de la lesión aterosclerótica, mientras que dicho gradiente no se ha observado con 99mTc-cAbBcII10 (Figura 4). Además la absorción de 99mTc-cAbVCAM1-5 en 20 la aorta ha sido caracterizada por autorradiografía. Como se muestra en la Figura 5, 99mTc-cAbVCAM1-5 se acumula a nivel de las lesiones ateroscleróticas positivas a VCAM-1 conllevando una relación lesión-control de 8,7±0,5 (P<0,05 frente a cAbBcII10).

[0140] Estabilidad - Los inventores han demostrado por HPLC que 99mTc-cAbVCAM1-5 era estable in vitro 25 hasta 6 horas después del radiomarcado, e in vivo en la sangre 3 horas después de la inyección, en el momento de la realización de la tomografía SPECT (Figura 6).

[0141] Biodistribución en los ratones de control - 99mTc-cAbVCAM1-5 se ha eliminado rápidamente de la circulación, y se ha identificado claramente una absorción en los riñones, la vejiga y los tejidos linfáticos en las 30 imágenes SPECT in vivo a la vez en los ratones de control C57BI/6J y los ratones ApoE-/- ateroscleróticos, mientras que solo los riñones y la vejiga eran visibles tras la inyección de 99mTc-cAbBcII10 (Figura 7). Además, se ha confirmado ex vivo la absorción de 99mTc-cAbVCAM1-5 en los tejidos linfáticos de los ratones de control C57BI/6J con análisis de biodistribución (Tabla 6).

35

Tabla 6: Biodistribución ex vivo de los nanocuerpos cAbVCAM1-5 y cAbBcII10 marcados con 99mTc 3 horas después de la inyección a ratones de control C57BI/6J.

C57BI/6J

cAbVCAM1-5 cAbBcII10

Sangre

0,5±0,1 0,4±0,0

Corazón

0,2±0,0* 0,1±0,0

Pulmón

1,7±0,2* 0,8±0,2

Hígado

1,4±0,2 1,0±0,1

Músculo esquelético

0,1±0,0 0,1±0,0

Piel

0,4±0,0 0,4±0,0

Grasa

0,2±0,0 0,1±0,0

Cerebro

0,0±0,0* 0,0±0,0

Glándulas salivares

0,5±0,0* 0,3±0,0

Páncreas

0,2±0,0* 0,2±0,0

Tiroides

0,7±0,1 0,5±0,1

Estómago

05±0,0* 0,4±0,0

Bilis

0,3±0,0 0,5±0,1

Intestino

0,5±0,1 0,3±0,0

Riñón

287±43 350±16

Orina

59±23 47±8

Bazo

7,4±0,2* 0,3±0,0

Timo

1,5±0,1* 0,1±0,0

Médula ósea

7,9±2,0* 0,4±0,0

Los resultados se presentan en media ± error estándar de la media. *: P<0,05 frente a cAbBcII10.

Efectivamente, los inventores han demostrado que la absorción de 99mTc-cAbVCAM1-5 representaba 7,4±0,2, 1,5±0,1 y 7,9±2,0 %ID/g en el bazo, el timo y la médula ósea, respectivamente (P<0,05 frente a 99mTc-cAbBcII10 en los tres tejidos).

5

[0142] Tomografía PECT/CT - Tras el diagnóstico por tomografía SPECT/CT la absorción de 99mTc-cAbVCAM1-5 se ha visualizado en las lesiones aterosclerótcias del cayado aórtico de ratón ApoE-/-, mientras que no se ha observado ninguna absorción de marcador en el mismo lugar en los animales C57BI/6J (Figuras 8 y 9). Por consiguiente, las proporciones cayado/sangre y cayado/corazón se han revelado significativamente más elevadas en los ratones ApoE-/-respecto de los ratones C57BI/6J y respecto del nanocuerpo de control negativo (P<0,05; Figura 10 10).

[0143] Reactividad de los nanocuerpos no radiomarcados contra el VCAM-1 de conejo - Los inventores han demostrado por citometría de flujo que cAbVCAM1-1 y cAbVCAM1-5 se unían específicamente al VCAM-1 de conejo (Figura 11). 15

Debate

[0144] Este estudio ha sido preparado por los inventores para generar nanocuerpos que reconozcan a la vez los homólogos VCAM-1 humano y murino, en la medida en que dichos ligandos de reactividad cruzada son 20 particularmente interesantes para trasladar a la práctica clínica los resultados validados en modelos animales bien caracterizados. Diez nanocuerpos anti-VCAM-1 se han generado y producido con afinidades para los homólogos murino y/o humano del orden del nanomolar, entre los que están los 6 nanocuerpos con reactividad cruzada. Además, dos nanocuerpos, cAbVCAM1-1 y cAbVCAM1-5 tienen reactividad cruzada con el VCAM-1 de conejo. La elevada resistencia térmica de los nanocuerpos, en particular de cAbVCAM1-5 ha permitido su radiomarcado con 25 99mTc a 50°C con alta pureza radioquímica (> 95%). Además, los ensayos de enlace in vitro en células endoteliales de ratón VCAM-1 positivas han revelado que dichos nanocuerpos marcados seguían siendo ligandos específicos de mVCAM1.

[0145] A causa de su reducido tamaño, los nanocuerpos presentaban una rápida depuración sanguínea in 30 vivo, resultante de una actividad circulatoria media de 0,8% ID/g 3 horas después de la inyección en los ratones Apo-/-. Además, la actividad de ruido de fondo en el miocardio también era mínima. De forma importante, la absorción de los nanocuerpos anti-VCAM1 en las lesiones aórticas era significativamente más elevada que la del nanocuerpo de control negativo cAbBcII10, en concreto para los nanocuerpos cAbVCAM1-5 y cAbVCAM1-3. Por consiguiente, las proporciones lesión/control, lesión/sangre y lesión/corazón también fueron superiores a 1, en concreto en los 35 nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9.

Absorción en los tejidos linfáticos

[0146] Además de ser absorbidos en las lesiones ateroscleróticas, los nanocuerpos según la invención 40 también han sido absorbidos por los tejidos linfáticos, a la vez en los ratones normales e hipercolesterolémicos, como demuestran los experimentos de biodistribución y de tomografía SPECT. En concreto, los tres nanocuerpos de reactividad cruzada con las mayores afinidades para mVCAM-1 (cAbVCAM1-5/3/9) han mostrado las mayores absorciones en el bazo y la médula ósea. La expresión constitutiva de mVCAM-1 se ha observado por inmunohistoquímica en el bazo, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el timo. Por consiguiente, la unión de los 45 nanocuerpos anti-VCAM-1 a los tejidos linfáticos se debía probablemente a su unión específica a la proteína VCAM-1.

Selección de compuestos de interés particular

50

[0147] En base a los parámetros resumidos en la Tabla 4, los nanocuerpos cAbVCAM1-5, cAbVCAM1-3, cAbVCAM1-8 y cAbVCAM1-9 han sido identificados por los inventores como los que tienen propiedades particularmente ventajosas frente a otros nanocuerpos, en particular, con vistas a su utilización en la formación de imagen médica. El nanocuerpo más prometedor es el nanocuerpo cAbVCAM1-5. Efectivamente, cAbVCAM1-5 presenta las proporciones más elevadas de lesión/control y lesión/corazón, así como una fuerte proporción 55 lesión/sangre. Presenta además una buena afinidad a la vez para VCAM-1 humano y murino, y la mayor resistencia

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Nanocuerpo dirigido contra VCAM-1 que comprende:

   a) las secuencias de aminoácidos (i) YTNSIMYMA (SEQ ID NO: 1) como CDR1, (ii) AIRFPDDS (SEQ ID NO: 2) 5 como CDR2 y (iii) RSSPYSFAWNDPSNYNY (SEQ ID NO: 3) como CDR3; o b) las secuencias de aminoácidos (i) FTYSSYYMS (SEQ ID NO: 4) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 5) como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 6) como CDR3; o c) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSNYYMT (SEQ ID NO: 7) como CDR1, (ii) RINSDGS (SEQ ID NO: 8) como CDR2 y (iii) GKSSV (SEQ ID NO: 9) como CDR3; o d) las secuencias de aminoácidos (i) FTFSSYYMS (SEQ ID NO: 10) como CDR1, (ii) GINVDGSN (SEQ ID NO: 11) 10 como CDR2 y (iii) GSGRDSYDCYSGSWCP (SEQ ID NO: 12) como CDR3;

   o una variante funcionalmente conservadora del nanocuerpo definida en a), b), c) o d) que comprende una sustitución conservadora de uno o dos aminoácidos en, respectivamente una, dos o tres de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. 15
2. 2. Nanocuerpo según la reivindicación 1, donde dicho nanocuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada en el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

   20
3. 3. Nanocuerpo según la reivindicación 1 o 2, donde dicho nanocuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.
4. 4. Nanocuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho nanocuerpo está asociado a un marcador detectable. 25
5. 5. Nanocuerpo según la reivindicación 4, donde dicho marcador detectable es un radioelemento.
6. 6. Nanocuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como agente de contraste en la formación de imagen médica in vivo, no invasiva. 30
7. 7. Nanocuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en métodos de diagnóstico o de pronóstico.
8. 8. Nanocuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para utilizarlo como medicamento. 35
9. 9. Uso de un nanocuerpo como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la detección in vitro de VCAM-1 en una muestra.
10. 10. Compuesto farmacéutico que comprende un nanocuerpo como el que se ha definido en cualquiera de 40 las reivindicaciones 1 a 3 asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. 11. Ácido nucleico que comprende una secuencia nucleica codificante del nanocuerpo como el que se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

    45
12. 12. Vector que comprende un ácido nucleico como el definido en la reivindicación 11.
13. 13. Célula transinfectada, infectada o transformada con un ácido nucleico según la reivindicación 11 o un vector según la reivindicación 12.

    50
14. 14. Método de producción de una célula anfitriona recombinante que expresa un nanocuerpo como el que se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho método comprende las etapas que consisten en:

    (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico según la reivindicación 11 o un vector según la reivindicación 12 en 55 una célula anfitriona competente,

    (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula anfitriona recombinante obtenida y

    (iii) eventualmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho nanocuerpo.
15. 15. Método de producción de un nanocuerpo como el que se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho método comprende las etapas que consisten en:

    (i) cultivar una célula transifectada o infectada o transformada según la reivindicación 13, en condiciones apropiadas para permitir la expresión de dicho nanocuerpo, y 5

    (ii) recuperar el nanocuerpo expresado.