ES2615081T3

ES2615081T3 - Cultivo a largo plazo de células germinales primordiales de pollo

Info

Publication number: ES2615081T3
Application number: ES06734219.6T
Authority: ES
Inventors: Marie-Cecile Van De Lavoir; Philip A. Leighton
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2017-06-05
Anticipated expiration: 2026-02-01
Also published as: US20140237633A1; US20140127812A1; US20060174363A1; CN101155509B; CN104585133A; US20060174362A1; NZ598769A; JP2008529483A; IL184775A0; CN101155509A; US20170086431A1; EP3090629A1

Abstract

Un método para producir un pollo transgénico que comprende: incorporar un transgén en el genoma de una célula germinal primordial (PGC), obtenida cultivando sangre completa de un embrión de pollo en etapa 12 a 17 en medios acondicionados con células de hígado de rata Buffalo (BRL) y que contienen factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de células madre, suero de pollo y células de soporte que no son de pollo, en el que el transgén comprende una secuencia de ADN exógena que codifica una proteína farmacéutica y está flanqueada por al menos un aislador, y de ese modo se produce una PGC transformada; seleccionar una PGC transformada clonal cuyo genoma comprende y expresa de manera estable el transgén; insertar la PGC en un pollo receptor, eclosionar un pollo quimérico del embrión, en el que el pollo quimérico comprende una célula de la línea germinal obtenida de la PGC transformada clonal que comprende y expresa de manera estable el transgén; y criar el pollo quimérico para producir un pollo transgénico, en el que el genoma del pollo transgénico procede de la célula de la línea germinal clonal y comprende y expresa de manera estable el transgén.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

PGCs obtenidas directamente de sangre completa que crecen en grandes concentraciones de células en cultivo, que pueden someterse a un número ilimitado de pases, y que exhiben un crecimiento y proliferación intensas, de forma que las PGCs en cultivo son básicamente las únicas células que crecen y proliferan. Estas condiciones de cultivo proporcionan una ventaja importante, y de ese modo hacen que la recogida, el almacenamiento, y el mantenimiento de las PGCs en cultivo sea especialmente simple y eficaz, y proporciona una fuente fácilmente disponible de células donantes para crear quimeras de la línea germinal que pasan el genotipo de las células PGC cultivadas a la descendencia.

Las PGCs mantenidas en cultivo por los inventores han mostrado la existencia de un cultivo no terminal, y han existido hasta la actualidad durante al menos 327 días en cultivo. Estas células están creciendo y proliferando de la misma manera que se observó a los 40, 60, 80, o 100 días (y todos los valores enteros entre medias), y las células siguen contribuyendo a las quimeras de la línea germinal como se describe más adelante, y, así, exhiben las características distintivas primarias de las PGCs verdaderas, es decir, la contribución exclusiva a la línea germinal cuando se introducen en un embrión receptor. La metodología de cultivo tal como se describe incluye usar sangre completa, que contiene eritrocitos y otros tipos de células metabólicamente activas, colocar una mezcla de células en cultivo junto con células germinales primordiales y permitir que el cultivo se desarrolle para que consista básicamente en PGCs aviares que expresan las características de cultivo a largo plazo descritas en la presente memoria. La técnica de cultivo celular descrita en la presente memoria evita cualquier proceso o técnica de separación de células, y se basa únicamente en las condiciones de crecimiento diferencial para producir la predominancia de las PGCs en cultivo. El uso de sangre completa como fuente de las células PGC establecidas y cultivadas ofrece ventajas prácticas en la eficacia y utilidad del establecimiento de los cultivos y el uso de las células para propósitos agrícolas o transgénicos. Por lo tanto, en un aspecto de la invención, el medio de cultivo se acondiciona con BRL (células de hígado de rata Buffalo), contiene factores de crecimiento de fibroblastos, factor de células madre, y suero de pollo. Las características particulares del medio se describen con más detalle más adelante.

En un aspecto, se establece un cultivo que tiene un gran número de PGCs que son genéticamente idénticas y que proliferan para producir un cultivo celular a largo plazo. Estas PGCs se pueden usar repetidamente para crear quimeras de la línea germinal introduciendo las PGCs de un cultivo a largo plazo en proliferación en los embriones receptores. En los intentos previos de uso de PGCs para crear quimeras de la línea germinal, se limitó intrínsecamente el número de quimeras que se pudieron crear por la incapacidad de desarrollar cultivos a largo plazo de PGCs verdaderas que conservasen el fenotipo de PGC. Debido a que la presente descripción posibilita los cultivos a largo plazo, se puede crear cualquier número de quimeras de la línea germinal a partir del mismo cultivo celular, y se puede establecer una población completa de quimeras de la línea germinal que tienen líneas germinales genéticamente idénticas, derivadas de PGC. En un aspecto, se puede crear un gran número, que incluye más de 3, más de 4, más de 5, 10, 15 y 20 animales quiméricos de la línea germinal que tienen todos células derivadas de PGC genéticamente idénticas en su línea germinal. Un aspecto es la creación de una población de quimeras de la línea germinal que tienen en general células derivadas de PGC idénticas en su línea germinal que tienen, en la población, diferenciales de edad que reflejan el uso del mismo cultivo celular a largo plazo para crear las quimeras de la línea germinal. Los diferenciales de edad superan la capacidad disponible actualmente de cultivar células germinales primordiales a lo largo del tiempo, y son de hasta 190 días sin congelación. Dos o más quimeras de la línea germinal tienen células derivadas de PGC idénticas en su línea germinal que difieren en edad en más de 40 días, 60 días, 80 días, 100 días, 190 días, etc., o puede existir cualquier otro valor entero entre medias, sin congelar las células. Pueden existir quimeras de la línea germinal sexualmente maduras que tengan células derivadas de PGC genéticamente idénticas en su línea germinal, ya que se usó un cultivo de PGC no terminal para crear estas quimeras de la línea germinal, y a partir del cual se pueden crear quimeras adicionales de la línea germinal.

Debido a que las PGCs se pueden mantener en cultivo de una manera que es extremadamente estable, las células también se pueden crioconservar y descongelar para crear una metodología de almacenamiento a largo plazo para crear quimeras de la línea germinal que tienen la capacidad de producir una descendencia definida por el fenotipo de las PGCs mantenidas en el cultivo.

La capacidad de producir un gran número de quimeras de la línea germinal también proporciona la capacidad de pasar el genotipo derivado de las PGCs a la descendencia de la quimera de la línea germinal, lo que da como resultado poblaciones de quimeras de la línea germinal que tienen células derivadas de las PGCs genéticamente idénticas en la línea germinal, y también a la descendencia de las quimeras de la línea germinal cuyo genotipo y fenotipo se determina completamente por el genotipo de las PGCs expandidas en cultivo. La transmisión de un fenotipo derivado de PGC a través de la línea germinal se ha observado para más de 20 aves en porcentajes de transmisión de hasta un 86%. Así, se puede crear una descendencia de una quimera de la línea germinal mediante la transmisión por la línea germinal de un genotipo de una célula germinal primordial mantenida en cultivo. Así, puede existir un cultivo de células germinales primordiales que contiene PGCs de un fenotipo definido, una quimera de la línea germinal que tiene la misma célula germinal primordial como parte de su línea germinal, y una descendencia de la quimera de la línea germinal que tiene un genotipo y fenotipo dictado por las PGCs del cultivo.

Como se ha descrito previamente, la existencia de cultivos de PGC a largo plazo posibilita la capacidad de transfectar de manera estable las células en cultivo con ADN que codifica proteínas exógenas o introducir otras manipulaciones genéticas deseables, tales como inserciones de genes e inactivaciones de genes de un animal

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

transgénico. Por lo tanto, todas las poblaciones anteriormente descritas de PGCs en cultivo, las quimeras de la línea germinal, y la descendencia de las quimeras de la línea germinal también pueden comprender una construcción de ADN integrada de manera estable en el genoma de la célula germinal primordial, transmitida en la línea germinal de la quimera de la línea germinal, y transmitida a futuras generaciones que constituyen la descendencia de las quimeras de la línea germinal.

La célula germinal primordial puede contener prácticamente cualquier construcción genética modificada, y se puede usar para introducir modificaciones genéticas en aves que superan la limitación de tamaño actualmente impuesta por las técnicas retrovirales, lo que incluye las modificaciones específicas de sitio en el genoma y/o la inserción de transgenes que codifican proteínas exógenas de longitud completa, tales como anticuerpos monoclonales. Los pollos modificados genéticamente pueden expresar proteínas exógenas de una manera específica de tejido en el oviducto para expresar las proteínas exógenas en el huevo.

Los cultivos de PGC tal como se describen son lo suficientemente estables como para permitir que un transgén se integre de manera estable en el genoma de la PGC, para aislar las células genéticamente modificadas de las células sin modificar en el cultivo, y para introducir las células modificadas en un embrión receptor, a la vez que se mantiene la capacidad de las PGCs cultivadas de contribuir a la línea germinal en la quimera resultante. En los casos en los que la expresión del transgén se controla mediante un promotor específico de tejido, el transgén no se expresaría en las PGCs. En estos casos, el transgén se expresaría en los tejidos seleccionados en la descendencia transgénica de la quimera de la línea germinal. Se pueden transferir genomas completos mediante hibridación de células, cromosomas intactos mediante microcélulas, segmentos subcromosómicos mediante transferencia génica mediada por cromosomas, y fragmentos de ADN en el intervalo de kilobases mediante transferencia génica mediada por ADN (Klobutcher, L.A. y F.H. Ruddle, Ann. Rev. Biochem., 50: 533-554, 1981). Se pueden transferir cromosomas intactos mediante transferencia de cromosomas mediada por microcélulas (MMCT) (Fournier, R.E. y Ruddle, F.H., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 319-323, 1977).

Los cultivos estables a largo plazo de PGCs que producen pollos modificados genéticamente son necesarios para varias aplicaciones en transgénesis aviar, que incluyen la producción de proteínas para la industria farmacéutica, la producción de pollos que depositan anticuerpos monoclonales humanos en sus huevos, y para hacer cambios específicos de sitio en el genoma aviar para otras diversas aplicaciones, que incluyen los anticuerpos policlonales de secuencias humanas.

La proporción de PGCs derivadas del donante y derivadas del receptor en un embrión receptor se puede alterar para favorecer la colonización de la línea germinal en las quimeras derivadas de PGCs. En los embriones de pollo y codorniz en desarrollo, la exposición a busulfán reduce enormemente o elimina la población de células germinales primordiales a medida que migran desde la creciente germinal a la cresta gonadal (Reynaud (1977a) Bull Soc. Zool. Francaise 102,417-429; Reynaud (1981) Arch Anat. Micro. Morph. Exp. 70, 251 -258; Aige-Gil y Simkiss (1991) Res. Vet. Sci. 50, 139 -144). Cuando se inyecta busulfán en la yema después de 24 a 30 horas de incubación y se reintroducen las células germinales primordiales en la vasculatura después de 50 a 55 horas de incubación, la línea germinal se repuebla con las células germinales primordiales derivadas del donante y, posteriormente, se producen gametos derivados del donante (Vick et al. (1993) J. Reprod. Fert. 98, 637 -641; Bresler et al. (1994) Brit. Poultry Sci. 35 241 -247).

Los métodos de la invención son como se definen en las reivindicaciones, e incluyen: obtener PGCs de un pollo, tal como de la sangre completa de un embrión en etapa 15, colocar las PGCs en cultivo, hacer proliferar las PGCs para incrementar su número y posibilitar la realización de varios pases, crear quimeras de la línea germinal a partir de estos cultivos celulares a largo plazo, y obtener una descendencia de las quimeras de la línea germinal que tienen un genotipo proporcionado por las PGCs cultivadas. Los métodos también incluyen insertar modificaciones genéticas en una población de PGCs en cultivo para crear PGCs transfectadas de manera estable, seleccionar las células de esta población que portan transgenes integrados de manera estable, inyectar las células modificadas genéticamente que portan los transgenes integrados de manera estable en un embrión receptor, desarrollar el embrión hasta una quimera de la línea germinal que contiene la modificación genética en la línea germinal, criar la quimera de la línea germinal hasta la madurez sexual y cruzar la quimera de la línea germinal para obtener una descendencia transgénica en la que la modificación genética deriva de la PGC cultivada.

Lo siguiente describe el hallazgo inesperado de que las PGCs se pueden aislar de la sangre de embriones en Etapa 12-17 (H&H), que las células proliferarán rápidamente y mantendrán su fenotipo de PGC, que las PGCs se pueden someter a pases diarios o a intervalos de 2 días o 3 días, que las PGCs colonizarán la línea germinal pero no los tejidos somáticos después de al menos 110 días en cultivo, que se puede obtener una descendencia viable de células que han estado en cultivo durante 110 días, que las PGCs se pueden modificar genéticamente mediante transfección con un transgén, y que las PGCs modificadas genéticamente se pueden aislar y propagar hasta una colonia de PGCs modificadas genéticamente.

Se han obtenido líneas celulares de PGC de pollo a partir de sangre tomada de embriones en Etapa 14-16 (H&H) que tienen una morfología grande y redondeada (Figura 1). Se confirmó que estas células son PGCs de pollo por su morfología tras el cultivo a largo plazo y su capacidad de producir una descendencia derivada de las PGCs. Además, los cultivos de PGCs expresan los genes específicos de la línea germinal Dazl y CVH (Figura 2), y las células en

15

25

35

45

cultivo producen la proteína CVH (Figura 3). Las PGCs en cultivo también expresan telomerasa (Figura 4), lo que indica que tienen un fenotipo inmortal. Además, las PGCs darán lugar a células germinales embrionarias (EG) en las condiciones adecuadas de cultivo (Figura 5). Por analogía, las PGCs de ratón y humanas darán lugar a células EG cuando se traten de forma análoga. Las células EG de ratón contribuirán a los tejidos somáticos, y las células EG de pollo también contribuyen a los tejidos somáticos, tal como se indica por la pigmentación negra de las plumas en las quimeras (Figura 6). Las PGCs de pollo se han modificado genéticamente tal como se indica mediante análisis de Southern (Figura 7). En esta realización, se integra de manera estable el promotor CX en el genoma de una PGC y se usa para facilitar la expresión del gen que codifica la aminoglicósido fosfotransferasa (APH), que también se integra en el genoma de una PGC y se usa para conferir resistencia a la neomicina añadida a los medios de cultivo para seleccionar las PGCs que se han modificado genéticamente.

Ejemplo 1. Obtención de cultivos de PGCs de pollo

Se incubaron de dos a cinco µL de sangre tomada del seno terminal de embriones en Etapa 14 -17 (H&H) en placas de 96 pocillos en un medio que contenía factor de células madre (SCF; 6 ng/ml o 60 ng/ml), factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano (hrFGF; 4 ng/ml o 40 ng/ml), 10% de suero bovino fetal, y 80% de medio acondicionado KO-DMEM. Preferiblemente, se tomaron de uno a tres µL de la vasculatura de un embrión en etapa 15-16 (H&H). Los pocillos de las placas de 96 pocillos se sembraron con células STO irradiadas a una concentración de 3 x 104 células/cm2.

Se prepararon medios acondicionados KO-DMEM cultivando células BRL hasta la confluencia en DMEM complementado con un 10% de suero bovino fetal, 1% de pen./estrep.; glutamina 2 mM, piruvato 1 mM, nucleósidos 1X, aminoácidos no esenciales 1X y ß-mercaptoetanol 0,1 mM y que contenía un 5% de suero bovino fetal durante tres días. Después de 24 h, se retiró el medio y se acondicionó un lote nuevo de medio durante tres días. Esto se repitió una tercera vez y los tres lotes se combinaron para producir el medio de cultivo de PGCs.

Después de aproximadamente 180 días en cultivo, se cultivó una línea de PGCs en medios compuestos de un 40% de medios acondicionados KO-DMEM, 7,5% de suero bovino fetal y 2,5% de suero de pollo. En estas condiciones, el tiempo de duplicación de las PGCs fue de aproximadamente 24-36 horas.

Cuando se inició el cultivo, el tipo de células predominante fueron los eritrocitos fetales. En tres semanas, el tipo de células predominante fue el de una PGC. Se obtuvieron dos líneas celulares de PGCs a partir de 18 cultivos que se iniciaron de embriones individuales.

Una línea de PGCs ha estado en cultivo durante más de 9 meses, mantiene una morfología redondeada, y sigue sin adherirse (Figuras 1A y B). Se han descongelado con éxito PGCs tras la crioconservación en un medio independiente de CO2 que contiene un 10% de suero y un 10% de DMSO.

Ejemplo 2. Las PGCs cultivadas expresan CVH y Dazl

La expresión de CVH, que es el homólogo de pollo del gen específico de la línea germinal VASA en Drosophila, se limita a las células de la línea germinal de pollos, y se expresa en aproximadamente 200 células de la creciente germinal (Tsunekawa et al., 2000). La expresión de CVH es necesaria para la función adecuada de la línea germinal en machos; la pérdida de la función de CVH provoca infertilidad en ratones macho (Tanaka et al., 2000). La expresión de Dazl se limita a la línea germinal en ranas (Houston y King, 2000), ajolote (Johnson et al., 2001), ratones (Schrans-Stassen et al., 2001), ratas (Hamra et al., 2002), y seres humanos (Lifschitz-Mercer et al., 2000). La deleción de Dazl condujo a defectos espermatogénicos en ratones transgénicos (Reijo et al., 1995).

Después de 32 días, las PGCs se lavaron con PBS, se sedimentaron y se aisló el mARN de las muestras de tejido con el kit Oligotex Direct mRNA (Qiagen). Después se sintetizó cADN a partir de 9 µl de mARN mediante el uso del sistema SuperScript RT-PCR para la síntesis de la primera cadena de cADN (Invitrogen). Se usaron dos µl de cADN en la reacción de PCR posterior. Las secuencias de los cebadores que se obtuvieron de la secuencia de CVH (número de acceso AB004836), la secuencia de Dazl (número de acceso AY211387), o la secuencia de β-actina (número de acceso NM_205518) fueron:

V-1 GCTCGATATGGGTTTTGGAT (SEQ ID Nº 1)

V-2 TTCTCTTGGGTTCCATTCTGC (SEQ ID Nº 2)

Dazl-1 GCTTGCATGCTTTTCCTGCT (SEQ ID Nº 3)

Dazl-2 TGC GTC ACA AAG TTA GGC A (SEQ ID Nº 4)

Act-RT-1 AAC ACC CCA GCC ATG TAT GTA (SEQ ID Nº 5)

Act-RT-2 TTT CAT TGT GCT AGG TGC CA (SEQ ID Nº 6)

Se usaron los cebadores V-1 y V-2 para amplificar un fragmento de 751 pb a partir del transcrito de CVH. Se usaron los cebadores Dazl-1 y Dazl-2 para amplificar un fragmento de 536 pb a partir del transcrito de Dazl. Se usaron los

imagen7

imagen8

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Después de 19 días, las células se retiraron de la selección y se expandieron para el análisis. Se mantuvo una proporción de las PGCs con 300 µg/ml durante otros 31 días, lo que demuestra que las PGCs fueron funcionalmente resistentes al antibiótico.

Con respecto a la Figura 8, para el control de plásmido, el ADN del plásmido cx-neo se linealizó con NotI y después se digirió con EcoRI o BamHI para producir un fragmento que es ligeramente más pequeño (5 kb) que el plásmido intacto, lo que se demuestra mediante la digestión con HindIII. Se liberaron fragmentos internos de aproximadamente 2 kb del plásmido cx-neo mediante digestión con StyI o NcoI. Se liberó un fragmento interno mayor de aproximadamente 2,6 kb mediante digestión con EcoRI y KpnI. La digestión del ADN genómico de la línea de PGCs con EcoRI, BamHI y HindIII reveló bandas que son mayores de 6 kb, lo que ilustra que se incorporó el transgén cx-neo en el genoma de PGC. Los fragmentos internos revelados en el ADN plasmídico tras la digestión con StyI, NcoI y EcoRI con KpnI también estuvieron presentes en el ADN genómico de las PGCs, lo que indica que el transgén cx-neo se integró en el genoma de PGC sin ninguna alteración. Mediante el uso de las técnicas de construcción de transgenes convencionales se pueden incorporar elementos adicionales tales como elementos reguladores, promotores específicos de tejido y ADN exógeno que codifica proteínas, por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales son el ejemplo preferido de una proteína codificada por el ADN exógeno, y los anticuerpos monoclonales humanos son las especies preferidas de los mismos.

Como se indicó anteriormente, el funcionamiento de las modificaciones genéticas en las PGCs para producir animales transgénicos solamente se ha demostrado en muy pocas especies. Se pueden conseguir manipulaciones genéticas análogas en PGCs de pollo haciendo referencia a las conseguidas mediante el uso de células ES en ratones. En ratones, se conoce bien el uso por separado de recombinación homóloga seguida de transferencia de cromosomas en células madre embrionarias (mES) para la producción de una descendencia quimérica y transgénica. Se han desarrollado técnicas potentes de recombinación homóloga específica de sitio o selección de genes (véase Thomas, K.R. y M.R. Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987; revisión de Waldman, A.S., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 12: 49-64, 1992). La inserción de ADN clonado (Jakobovits, A., Curr. Biol. 4: 761-763, 1994) y la manipulación y selección de fragmentos de cromosomas mediante las técnicas del sistema Cre-loxP (véase Smith,

A.J. et al., Nat. Genet. 9:376-385, 1995; Ramírez-Solís, R. et al., Nature 378:720-724, 1995; patentes de EE.UU. 4.959.317; 6.130.364; 6.130.364; 6.091.001; 5.985.614) están disponibles para la manipulación y transferencia de genes en células mES para producir quimeras genéticas estables. Muchas de tales técnicas que se ha demostrado que son útiles en los sistemas mamíferos estarían disponibles para aplicarlas en PGCs de pollo si estuvieran disponibles los cultivos necesarios.

Se cree en general que el genoma de las células germinales primordiales está en un estado latente, y por lo tanto la cromatina puede estar en un estado altamente condensado. Los ensayos exhaustivos de los protocolos de electroporación convencionales sugieren que son necesarios métodos especiales para introducir modificaciones genéticas en el genoma de las PGCs. Como se describe más adelante, los transgenes se pueden rodear con elementos aisladores obtenidos del locus de β-globina de pollo para mejorar la expresión. La inclusión de los elementos aisladores de β-globina produce de manera rutinaria clones que se pueden cultivar, analizar e inyectar en embriones receptores.

Los promotores convencionales que se usan para controlar la expresión de los genes de resistencia a antibióticos (p.ej. neomicina, puromicina, higromicina, his-D, blasticidina, zeocina, y gpt) se expresan de manera ubicua. En general, los promotores proceden de genes "constitutivos" tales como β-actina, CMV, o ubiquitina. Aunque los promotores constitutivos son útiles porque se expresan en general a niveles elevados en todas las células, continúan expresándose en la mayoría de tejidos, si no en todos, durante toda la vida del pollo. En general, la expresión se debería limitar solamente al tejido y la etapa del desarrollo durante la que es necesaria la expresión. Para la selección de las células germinales primordiales, el periodo durante el que es necesaria la expresión es cuando están in vitro, cuando el antibiótico está presente en los medios. Una vez que se han insertado las células en el embrión, es preferible terminar la expresión del marcador seleccionable (es decir, el gen de resistencia a antibióticos). Para restringir la expresión de los genes de resistencia a antibióticos, se usa el promotor de "respuesta temprana a inducción neural" (ERNI). Un ERNI es un gen que se expresa de manera selectiva durante las etapas tempranas del desarrollo (p.ej., la Etapa X (E-G&K)) y en cultivo, y, por lo tanto, este promotor se usa para controlar la expresión de genes de resistencia a antibióticos para seleccionar las PGCs que portan una modificación genética. Debido a que ERNI se expresa solamente durante las etapas tempranas del desarrollo, los genes que confieren resistencia a antibióticos no se expresan en los animales maduros.

Ejemplo 11. Homogeneidad de cultivos celulares de PGCs a largo plazo

Para determinar la homogeneidad de los cultivos de PGCs tras el cultivo a largo plazo, se tiñeron ES, EG, DT40 (línea de células B de pollo) y PGCs con anti-CVH, un anticuerpo hacia el homólogo de Vasa de pollo y el anticuerpo 1B3 (Halfter, W., Schurer, B., Hasselhorn, H. M., Christ, B., Gimpel, E., y Epperlein, H. H., An ovomucin-like protein on the surface of migrating primordial germ cells of the chick and rat. Development 122, 915-23. 1996)). La expresión del anticuerpo CVH se limita a las células germinales y, por lo tanto, el anticuerpo anti-CVH es un marcador fiable de ellas. El antígeno 1B3 reconoce una proteína similar a ovomucina presente en la superficie de las PGCs de pollo durante su migración y la colonización de la gónada.

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

durante la noche, y se aplicó una sonda con secuencias del gen neo radiomarcadas durante 2 horas en Rapid Hyb (Amersham). Después de lavar, la transferencia se expuso a una película durante la noche a -80 °C. Con respecto a la Figura 10, el carril 1 es P84, el carril 2 es P85 y el carril 3 es el plásmido. Para el control de plásmido, se linealizó el ADN plasmídico HS4-β-actina-neo con Not1. Para obtener un fragmento interno de 2,3 Kb se digirió el ADN de PGC y el plásmido linealizado con BamH1. Tanto P84 como P85 muestran un fragmento interno de un tamaño de 2,3 Kb. Se liberó un fragmento interno mayor de aproximadamente 2,6 kb mediante digestión con HindIII. De nuevo, este fragmento interno está presente en las digestiones de P84 y P85. La digestión del ADN genómico de P84 y P85 con EcoR1 y BglII debería revelar bandas mayores de 2,9 Kb si los transgenes están integrados en el genoma. En P84 no se observan fragmentos de unión, lo que indica que P84 es una composición de varios clones diferentes. En P85, los fragmentos de unión de 4,5-5 kb están presentes en la digestión con EcoR1, y un fragmento de unión de 5 Kb está presente en la digestión con BglII, lo que indica que P85 está integrado en el genoma y que el cultivo está constituido sustancialmente de un clon. Este ejemplo muestra la utilidad de los aisladores como elemento preferido de una construcción para la expresión fiable de marcadores seleccionables en células germinales primordiales.

Ejemplo 14: Obtención clonal de PGCs modificadas genéticamente

Los siguientes ejemplos muestran que se pueden obtener de manera clonal líneas modificadas genéticamente de células germinales primordiales.

Primero, se produjo β-actina-eGFP. El gen eGFP se liberó de CX-eGFP-CX-puro con XmnI y KpnI, se liberó β-actina de HS4-β-actina puro con EcoRI y XmnI, y los dos se clonaron en forma de una ligadura de 3 miembros en pBluescript digerido con EcoRI y KpnI para producir β-actina EGFP. Después, se liberó β-actina eGFP con BamHI y KpnI (extremos romos con T4 ADN polimerasa) y se clonó en HS4-β-actina puro digerido con BglII y EcoRV.

Se llevaron a cabo cinco transfecciones mediante el uso de esta construcción. Para cada transfección, se resuspendieron 5x106 PGCs en 400 µl de tampón de electroporación (Specialty Media), y se añadieron 20 µg de ADN linealizado. Se administró un pulso ED (150-200 V; 900 µF) o pulsos SW (350 V, 8 pulsos, 100 µseg). Tras la transfección, las células se colocaron en placas de 48 pocillos individuales y se cultivaron durante varios días antes de añadir la selección (0,5 µg/ml). Se observaron un total de 5 clones en 4 de las 5 transfecciones. Se analizó un clon TP103 mediante Southern (Figura 11). Con respecto a la Figura 11, el ADN de control de plásmido se linealizó con NotI. Se liberó un fragmento interno digiriendo el ADN con KpnI. En TP103 y en el plásmido, se liberó un fragmento del mismo tamaño. La digestión del ADN genómico de TP103 con NcoI, MfeI, y SphI debería revelar bandas que son mayores que los carriles correspondientes de ADN plasmídico digerido. No se observa ninguna banda en el carril de ADN genómico de TP103 digerido con MfeI, lo que se puede deber a que la banda sea demasiado grande. En los carriles que representan las digestiones con NcoI y SphI, se han liberado fragmentos del ADN genómico de TP103 que son sustancialmente mayores que los fragmentos liberados del ADN plasmídico, lo que indica que el transgén está incorporado en el genoma de la línea celular TP103.

Obtención clonal de HS4-β-actina-puro.

Primero, se produjo β-actina puro mediante una ligadura de 3 miembros de puro de CX-EGFP-CX-puro (XmnI-EcoRI), β-actina de β-actina neo en pBS (véase anteriormente) (Sal-XmnI), y pBluescript (SalI-EcoRI). A continuación, se clonó β-actina puro en pBS que contenía dos copias de 2X HS4 ligando β-actina puro digerida con BamHI en el vector 2X HS4 tratado con BamHI/SAP.

Se llevaron a cabo tres transfecciones mediante el uso de esta construcción. Para cada transfección, se resuspendieron 4-5x106 PGCs en 400 µl de tampón de electroporación (Specialty Media), y se añadieron 20 µg de ADN linealizado. Se administró un pulso ED de 200 V, 900 µF. Tras la transfección, las células se colocaron en placas de 48 pocillos individuales y se cultivaron durante varios días antes de añadir la selección (0,5 µg/ml). No se observaron colonias en 2 transfecciones. Se aislaron dos colonias de la tercera transfección.

Obtención clonal de HS4-cx-eGFP-cx-Puro.

Se llevaron a cabo tres transfecciones con HS4-cx-eGFP-cx-Puro. Se resuspendieron 5x106 PGCs en 400 µl de tampón de electroporación (Specialty Media), y se añadieron 20 µg de ADN linealizado. Se administraron ocho pulsos SW de 350 V durante 100 µseg a cada transfección. Tras la transfección, las células se colocaron en placas de 48 pocillos individuales, y se cultivaron durante varios días antes de añadir la selección de puromicina (0,5 µg/ml). Se aislaron un total de 16 clones de 2 transfecciones.

Obtención clonal de cx-neo.

La línea celular PGC13 se sometió a electroporación con un plásmido que portaba un marcador seleccionable cxneo. Tras la exposición a neomicina, se obtuvo una línea celular que fue resistente a neomicina (G-09). Se determinó el cariotipo de esta línea celular, y todas las células exhibieron una deleción en el brazo p del cromosoma 2 (Tabla 3 y Figura 12). Estos datos demuestran que G-09 se obtuvo clonalmente de una PGC que portaba una deleción distintiva en el brazo p del cromosoma 2.

5

10

15

20

25

30

Tabla 3: Análisis cromosómico de la línea celular G-09.

Célula: Cromo somas

1: 2 2p 3 4 Z Micros

1: 2 1 1 2 2 2 69

2
2: 1 1 2 2 2 44

3: 2 1 1 2 2 2 56

4: 2 1 1 2 2 2 56

5: 2 1 1 2 2 2 65

6: 2 1 1 2 2 2 67

7: 2 1 1 2 2 2 59

8: 1 0 1 1 2 1 38

9: 2 1 1 2 2 2 65

10: 2 0 1 2 2 2 55

11: 2 1 1 2 2 2 43

12: 2 1 1 2 2 2 59

13: 2 0 1 2 2 2 55

14: 2 0 1 2 2 2 33

15: 1 1 1 2 2 2 56

16: 2 1 1 2 2 2 62

Ejemplo 15: Expresión específica de tejido de marcadores seleccionables en PGCs.

El gen ERNI se expresa desde la etapa de línea pre-primitiva en el embrión de pollo, y es un gen de respuesta temprana a señales del nódulo de Hensen, Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., y Stem, C. D. (2000). Initiation of neural induction by FGF signalling before gastrulation. Nature 406, 74-8. Además, ERNI se expresa en las células ES de pollo, Acloque, H., Risson, V., Birot, A., Kunita, R., Pain, B., y Samarut, J. (2001). Identification of a new gene family specifically expressed in chicken embryonic stem cells and early embryo. Mech Dev 103, 79-91. El gen ERNI (también denominado cENS-1) tiene una estructura poco habitual en la que un único marco de lectura abierto largo está flanqueado por una repetición directa de 486 pb, además de secuencias UTR en 5' y 3' únicas. Basándose en la idea de que esta estructura recuerda a la de una estructura similar a las LTR retrovirales, Acloque et al. 2001 ensayaron diferentes porciones de la secuencia de cADN en función de la actividad promotora/potenciadora, y descubrieron que una región de la secuencia única en la UTR de 3' actúa como promotor. Se diseñaron cebadores de PCR básicamente como se describió (Acloque et al., 2001) para amplificar un fragmento de 822 pb de la UTR de 3' del gen ERNI. Tras la amplificación de las secuencias ERNI, se clonaron en posición 5' del gen de resistencia a neomicina, con un sitio de poliA de SV40, para generar ERNI-neo (1,8 kb). El aislador 2X HS4 se clonó después a cada lado del casete con marcador seleccionable ERNI-neo.

Se llevaron a cabo dos transfecciones con HS4-Erni-neo. Se resuspendieron 5x106 PGCs en 400 µl de tampón de electroporación (Specialty Media), y se añadieron 20 µg de ADN linealizado. En la primera transfección, se administró un único pulso ED de 175 V, 900 µF, y en la segunda transfección, se administraron 8 pulsos SW de 100 µseg y 350 V. Tras la transfección, las células se colocaron en placas de 48 pocillos individuales, y se cultivaron durante varios días antes de añadir la selección de neomicina (300 µg/ml). En la primera transfección (pulso ED) se aislaron 5 colonias, y en la segunda transfección (pulsos SW) se aislaron 11 colonias.

El aislamiento de clones transfectados de manera estable indica que ERNI se expresa en las PGCs, y se puede usar como un promotor específico de tejido.

Ejemplo 16: Contribución de las PGCs transfectadas a la línea germinal.

Se transfectaron PGCs con HS4-βactina-GFP y se inyectaron en la vasculatura de embriones en Etapa 13-15 (H&H). En D18, se recuperaron las gónadas, se fijaron, se realizaron cortes del tejido y se tiñeron con el anticuerpo CVH para identificar las células germinales. Los cortes de tejido se analizaron después en busca de la presencia de células positivas para GFP en las gónadas. Se hallaron células germinales positivas para GFP en las gónadas de machos (Figura 13) y hembras. El examen de las preparaciones histológicas de cerebro, músculo cardiaco e hígado

10

15

20

25

30

de estos embriones mostró solamente cuatro células verdes en un portaobjetos. Estos datos demuestran que se hallan unas pocas PGCs cultivadas en localizaciones ectópicas, pero la gran mayoría de las PGCs cultivadas colonizan preferentemente la línea germinal.

Para determinar que las células positivas para GFP fueron células germinales, se tiñeron los cortes con el anticuerpo anti-CVH. Como se puede observar en la Figura 14, las células positivas para GFP también se tiñen para la proteína CVH, lo que indica que las células positivas para GFP son células germinales.

Con respecto a la Figura 14, hay células positivas para GFP en este corte, y el panel de DAPI/GFP muestra que estas células positivas para GFP están localizadas dentro del túbulo seminífero. Cuando las células germinales se tiñen con el anticuerpo anti-CVH, exhiben un anillo teñido de rojo intenso que delimita el citoplasma de las células germinales. El panel de DAPI/CVH muestra que estas células están localizadas dentro del túbulo seminífero. El último panel muestra que las células positivas para GFP también se tiñen para CVH, y que los túbulos seminíferos contienen células germinales positivas para CVH que son negativas para GFP.

Ejemplo 17. Transmisión en la línea germinal de PGCs modificadas genéticamente.

Se transfectaron PGCs de raza Barred Rock con uno de los transgenes siguientes: Se inyectó βactina-neo, βactinaeGFP-βactina-puro, cx-eGFP-cx-puro en la vasculatura de embriones en Etapa 13-14 (H&H). Los polluelos eclosionaron, los gallos se criaron hasta la madurez sexual y se cruzaron con gallinas Barred Rock para determinar la transmisión en la línea germinal del transgén. Toda la descendencia negra procedió de las PGCs, y se ensayó la presencia del transgén (Tabla 5). Se calculó la tasa de transmisión en la línea germinal dividiendo el número de polluelos negros por el número total de polluelos en los que se puntuó el color de las plumas (Tabla 5).

Tabla 5: Transmisión en la línea germinal de células germinales primordiales modificadas genéticamente.

Línea Línea celular Edad de Construcción Gallos Nº de % de la línea germinal celular originaria las células ensayados descendencia

TP84: PGC13 267 βactina-neo 5 892 0, 0, 0, 0, 0

TP85: PGC13 260-267 βactina-neo 12 2462 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

0, 0,5, 1

TP103/38: PGC54 134-138 βactina-GFP 8 758 0, 1, 11, 12, 13, 16, 28, 92

TP112/44: PGC13 280 cx-GFP 4 168 0, 0, 0, 4

TP112/21: PGC13 280 cx-GFP 3 378 0, 1, 10

Ejemplo 18. Los transgenes se heredan de manera mendeliana

La descendencia negra de los cruces entre gallos quiméricos que portaban PGCs de la raza Barred Rock que se modificaron genéticamente para que incluyeran uno de βactina-neo, βactina-GFP, o cx-GFP se analizó en busca de la presencia del transgén. Como se muestra en la Tabla 6, el transgén es heredado por aproximadamente un 50 % de la descendencia de las PGCs, lo que indica una herencia mendeliana.

Tabla 6. Segregación mendeliana del transgén.

Construcción: Nº de descendencia negra Nº de descendencia no transgénica Nº de descendencia transgénica

βactina-neo: 3 1 2*

βactina-GFP: 176 93 83*

cx-GFP: 23 9 14*

*no es significativamente diferente de la proporción 1:1 esperada de descendencia transgénica:no transgénica mediante análisis de χ2

Ejemplo 19: Expresión ubicua de transgenes en la descendencia de quimeras que portan PGCs modificadas genéticamente

Se cruzaron quimeras que portaban PGCs en las que se había integrado de manera estable βactina-GFP en el genoma con gallinas de tipo natural, y los embriones se puntuaron por la expresión de GFP. Se muestran ejemplos de expresión en embriones en la Figura 15, que muestra que la GFP se expresa en todos los tejidos de la descendencia transgénica hasta la Etapa 34 (H&H) del desarrollo. En los animales de más edad, se prepararon los tejidos para el examen histológico mediante el uso de cortes congelados. Los tejidos de páncreas, piel, pulmón,

imagen10

15

25

35

45

Figuras 16 y 18). En la etapa 1, se inserta el casete IgL/IgH anti-IL-2Rα en el Ov BAC mediante recombinación homóloga en E. coli mediante ingeniería de recombinación. El anticuerpo está entonces bajo control transcripcional de los elementos reguladores de Ov. En la etapa 2, se elimina el gen de kanamicina usado en la ingeniería de recombinación mediante la Flp recombinasa. Las secuencias codificantes de V del anticuerpo anti-IL-2Rα humanizado se clonan en un casete que contiene las regiones constantes Cκ y Cγ1. Los genes Igκ e IgH se unen mediante una secuencia IRES, de forma que ambos genes se expresan a partir de una única construcción de transgén, y por lo tanto solamente es necesaria una única transfección con BAC. El casete de anticuerpo se inserta en el gen Ov del BAC mediante recombinación homóloga (Lee y Copeland, 2001). El gen Igκ se fusiona a la secuencia Kozak de inicio de la traducción de Ov para una traducción eficaz. Finalmente se añade ERNI-puro, que es un marcador seleccionable en PGCs, al BAC para la transfección y selección de los clones de PGC.

La Figura 16 muestra la construcción de OvBAC-anti-IL-2Rα. Para obtener los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera, se sintetizan 4 oligonucleótidos largos (con alrededor de 20 pb de solapamiento) para cada gen y se hibridan entre sí. Los huecos se rellenan con ADN polimerasa (del bacteriófago T4). Los genes sintéticos se digieren entonces con enzimas de restricción para la clonación en el casete del MAb.

Los oligonucleótidos para la construcción del Mab anti-IL-2Rα humanizado (las secuencias del MAb son de la patente US5585089) son los siguientes.

Gen V de la cadena ligera (oligos 1-4):

Oligo 1: ctc TCTAGA caactcagagttcaccatg gagaccga taccctcctg ctatgggtcc tcctgctatg ggtcccagga tcaaccggag // atattcagat gacccagtct ccatctaccc tctctgctag cgtcggggat (SEQ ID Nº 9)

Oligo 2: ataaattaga agcttgggag ctttgcctgg cttctgctgg taccagtgca tgtaacttat actúantgagctg gcagagcagg ttatggtgac cctatccccg acgctagcag agag (SEQ ID Nº 10)

Oligo 3: gctcccaagc ttctaattta taccacatcc aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg gatctgggac cgagttcacc ctcacaatca gctctctgca gccagatgat ttc (SEQ ID Nº 11)

Oligo 4: ctc GCGATCGC caatagtgaaaaattac gtttgac ctccaccttg gtcccctgac cgaacgtgag tgggtaagta ctcctttgat ggcagtaata agtggcgaaa tcatctggct gcagagagct ga (SEQ ID Nº 12)

Con respecto a la Figura 17, el Oligo 1 tiene un sitio XbaI para la clonación (letras mayúsculas), seguido del péptido señal de VL (sin intrón). La secuencia Kozak de inicio de la traducción de Ov está subrayada; los tres últimos nucleótidos son el codón iniciador. El sitio de escisión del péptido señal (en la secuencia proteica correspondiente) se indica mediante una doble barra. El Oligo 4 tiene un sitio SgfI para la clonación (letras mayúsculas), seguido de 17 pb del intrón J4-Ck de 5' humano para el corte y empalme a Ck (subrayado). El nucleótido G donante de corte y empalme está subrayado doblemente.

Gen V de la cadena pesada (oligos 5-8):

Oligo 5: ctc TCGCGA tctctctgttcacag gcgtgcactct // cagg tccagcttgt ccagtctggg gctgaagtca agaaacctgg ctcgagcgtg aaggtc (SEQ ID Nº 13)

Oligo 6: cccagtcgac ggattaatat atccaatcca ttccagaccc tgtccagggg cctgccttac ccagtgcatc ctgtagctag taaaggtgta gccagaagcc ttgcaggaga ccttcacgct cgagccagg (SEQ ID Nº 14)

Oligo 7: tatattaatc cgtcgactgg gtatactgaa tacaatcaga agttcaagga caaggcaaca attactgcag acgaatccac caatacagcc tacatggaac tgagcagcct gagatctgag gaca (SEQ ID Nº 15)

Oligo 8: ctc TCGCGA ggccattcttac ct gaggagactg tgaccagggt tccttggccc cagtagtcaa agaccccccc ccctcttgca cagtaataga ctgcggtgtc ctcagatctc aggctgct (SEQ ID Nº 16)

El Oligo 5 contiene un sitio NruI (letras mayúsculas) para la clonación, seguido de 15 pb del extremo 3' del intrón del péptido señal de VH humano (subrayado), seguido de 11 pb de la secuencia del exón del péptido señal de VH del gen VH anti-IL-R2α humanizado (subrayado doble). El sitio de escisión del péptido señal (en la secuencia proteica correspondiente) se indica con una doble barra.

El Oligo 8 contiene un sitio NruI (letras mayúsculas) seguido de 12 pb del extremo 5' del intrón J-Cµ humano (subrayado). El nucleótido C donante de corte y empalme está subrayado doblemente.

Se mezclan los Oligos 1-4, se mezclan los oligos 5-8, y las dos mezclas se hibridan incubando en un vaso de precipitados con agua hirviendo que se deja enfriar lentamente hasta temperatura ambiente. Los huecos en las cadenas complementarias se reparan con ADN polimerasa.

Con respecto a la Figura 18, las Vs de Igκ e IgH se clonan en el casete que contiene los genes Cκ y Cγ1, mediante el uso de sitios de restricción únicos diseñados en los extremos 5' y 3' de las Vs (en este ejemplo, NruI para V de la cadena pesada y XbaI/SgfI para V de la cadena ligera).

10

15

20

25

30

35

40

45

Con respecto de nuevo a la Figura 18, el OvBAC se muestra en la parte superior, con 110 kb de la secuencia de 5' del gen estructural Ov, y 30 kb de la secuencia flanqueante de 3' del gen estructural Ov. El marcador seleccionable ERNI-puro se muestra en el extremo 3'. El casete de MAb se muestra con los elementos siguientes (izquierda a derecha): el brazo de homología de Ov de 5' para la inserción en el OvBAC mediante recombinación homóloga; la Kozak y ATG de Ov; el péptido señal de VL humano (SiGVL); el gen de la región variable de la cadena ligera humana insertado del MAb (VL); el intrón J-Cκ; el gen Cκ; el IRES para la traducción del gen IgH de 3'; el péptido señal de la cadena pesada humana (SiGVH); el gen de la región variable de la cadena pesada insertado del MAb (VH); el intrón J-Cγ; el gen Cγ1 que incluye sus intrones internos; y el brazo de homología de Ov de 3' para la inserción en el OvBAC. (No se muestra el gen de kanamicina para la selección en bacterias).

Para la inserción del casete de anticuerpo en el OvBAC, se produce un vector de selección de ingeniería de recombinación añadiendo brazos de homología al casete Igκ-IRES-IgH. Los brazos de homología son fragmentos del locus Ov que actúan para seleccionar como objetivo el casete de anticuerpo para el gen Ov en el BAC, mediante el uso de la maquinaria de recombinación homóloga de la cepa de E. coli EL250 que alberga el BAC (Lee y Copeland, 2001). El brazo de homología de Ov de 5' está a 124 pb de la secuencia de ovoalbúmina que corresponde al fragmento HincII -XbaI localizado inmediatamente en posición 5' de la secuencia Kozak de inicio de la traducción en el gen Ov, y tiene la secuencia siguiente:

imagen11

El brazo de homología de 5' se amplifica mediante PCR a partir de ADN genómico de pollo o ADN de Ov clonado con el uso de los cebadores siguientes: K8 HincII-F 5'-GGA TAT AGC AAC AGA CAC ATT AC-3' (SEQ ID Nº 18)

K8-TTT NotIXbaI-R 5'-TTT GCG GCC GCT CTA GAG CAA ACA GCA GAA C-3' (SEQ ID Nº 19) El brazo de homología de Ov de 3' está a 125 pb de la secuencia de ovoalbúmina localizada inmediatamente en posición 3' del codón de terminación de la traducción de ovoalbúmina, y tiene la secuencia siguiente:

imagen12

El brazo de homología de Ov de 3' se obtiene en forma de un producto de PCR de 152 pb amplificado a partir del ADN genómico de pollo o ADN de Ov clonado mediante el uso de los cebadores siguientes:

NotI OV (3'TAA)-F 5'-AAAAGCGGCCGCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3' (SEQ ID Nº 21)

3'OVTAA-R2 5'-CTCCGCGGCTCGAGTCTAGATTAAGCTCCAGCTT-3' (SEQ ID Nº 22)

Tras la amplificación de los fragmentos de homología de 5' y 3', se clonan los productos de PCR en un vector plasmídico tal como pBluescript, y se confirman mediante secuenciación. Después, los brazos de homología se colocan a cada lado del casete de MAb; el brazo de homología de Ov de 5' se coloca en el lado 5' del gen IgL y el brazo de homología de Ov de 3' se coloca en el lado 3' del gen IgH. La inserción del casete de MAb en el OvBAC mediante recombinación homóloga da como resultado la deleción del gen estructural Ov. La estructura final del casete de MAb para la selección en el Ov BAC también se muestra en la Figura 17.

Es necesario un marcador seleccionable, tal como un gen que codifica resistencia a kanamicina, para la selección de recombinantes homólogos en la E. coli que alberga OvBAC tras la transformación con el casete de MAb. Así, el vector de selección también contiene un gen de resistencia a kanamicina flanqueado por sitios FRT. Por ejemplo, se libera un casete FRT-Kan de 1,5 Kb de pIGCN21 (un vector que contiene el casete IRES-eGFPcre-FRT-kan-FRT, obtenido del laboratorio de Neal Copeland en el NCI) mediante Xma I y Bgl I (Nt4644-6131), y se hacen romos los extremos. Este fragmento se inserta después en el sitio Not I romo en el casete de MAb flanqueado por brazos de homología de Ov. El vector de selección se somete a electroporación en bacterias que portan el OvBAC de tipo natural, y se seleccionan las colonias resistentes a kanamicina. La selección correcta se estudia mediante cartografía de restricción de los clones. La mayoría de las colonias resistentes a kanamicina deberían seleccionarse correctamente. El casete de resistencia se elimina después mediante la expresión transitoria de Flp recombinasa mediante inducción con arabinosa del gen Flp en la cepa EL250, lo que da como resultado OvBAC-anti-IL-2Rα. Se criban los clones sensibles a kanamicina y se verifican mediante cartografía de restricción.

Para la selección de las células PGC transformadas con BAC, se añade después un marcador seleccionable activo en PGCs al BAC. Se ha usado el gen de resistencia a puromicina controlado por el promotor de ERNI para obtener

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

Claims

imagen1

imagen2