ES2615524T3 - Método para analizar anticuerpos anti- Treponema pallidum - Google Patents

Método para analizar anticuerpos anti- Treponema pallidum Download PDF

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Abstract

Un método para ensayar un anticuerpo anti- Treponema pallidum que comprende poner en contacto un reactivo que comprende una partícula que soporta un antígeno de Treponema pallidum sobre la misma y un copolímero disuelto en un medio y obtenido por copolimerización de 2-metacriloiloxietilfosforilcolina y un monómero hidrófilo con una muestra tomada de un sujeto para producir en la muestra una reacción entre un anticuerpo anti- Treponema pallidum con el antígeno de Treponema pallidum soportado sobre la partícula, y medir en la muestra ópticamente un grado de aglutinación causada por la reacción para analizar el anticuerpo anti-Treponema pallidum.

Description

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pallidum y el copolímero en el mismo medio, o, como alternativa, también puede usarse como un reactivo del tipo de dos componentes que incluye un primer reactivo que contiene el vehículo insoluble que soporta el antígeno de Treponema pallidum sobre el mismo y un segundo reactivo que incluye un tampón preparado mediante la adición del copolímero a un medio.
5 El medio no está particularmente limitado, y ejemplos de los mismos incluyen un tampón de fosfato, un tampón de glicina, un tampón de Tris-HCL, y similares.
En el reactivo de látex del tipo de un componente, se pueden disolver según sea adecuado seroalbúmina de bovina, sacarosa, cloruro de sodio, EDTA 2Na, tensioactivo y similares.
Además, también en el caso de que el reactivo se utilice como el reactivo del tipo de dos componentes, seroalbúmina bovina, sacarosa, cloruro de sodio, EDTA 2Na, tensioactivo y similares pueden disolverse en los respectivos reactivos según sea adecuado.
15 Por otra parte, una concentración de la seroalbúmina bovina no está particularmente limitada, sin embargo, el límite inferior deseable es 0,1 % y el límite superior deseable es 15 %, y, además, el límite inferior más deseable es 1,0 % y el límite superior más deseable es 10,0 %.
Al utilizar el reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum, un grado de la aglutinación causada por la reacción antígeno-anticuerpo con el anticuerpo anti-Treponema pallidum en una muestra se va a medir ópticamente. Por lo tanto, el anticuerpo anti-Treponema pallidum en la muestra puede analizarse.
El límite inferior deseable de un pH cuando se lleva a cabo la reacción antígeno-anticuerpo mediante el uso del
25 reactivo para el ensayo de los anticuerpos anti-Treponema pallidum es 4,5 y el límite superior deseable es 10,0, y, además, el límite inferior más deseable es 6,0 y el límite superior más deseable es de 8,0.
Por otra parte, el límite inferior deseable de una temperatura de reacción es de 0 ºC y el límite superior deseable es 50 ºC. Se selecciona un tiempo de reacción según sea apropiado.
Como método para medir el grado de la aglutinación ópticamente, se utiliza un método conocido convencionalmente. Por ejemplo, el aumento y disminución de la intensidad de dispersión de luz, la absorbancia y la intensidad de la transmisión se pueden medir mediante el cambio del tamaño de las partículas del vehículo insoluble para su uso, la concentración del vehículo insoluble o el parámetro del tiempo de reacción. Además, es posible utilizar estos
35 métodos en combinación. Aquí, una longitud de onda de la luz en la realización de la medición es, de manera deseable, de300 a 900 nm.
Como un aparato utilizado para la medición óptica, se pueden usar un dispositivo óptico capaz de detectar la intensidad de dispersión de luz, la intensidad de la transmisión, la absorbancia y similares, y se puede utilizar cualquiera de los analizadores automáticos bioquímicos usados generalmente.
Como método para observar visualmente el grado de la aglutinación, normalmente se pueden usar un método para mezclar una muestra y el reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum en un portaobjetos de prueba y para la determinación de una presencia o ausencia de aglutinación después de vibrar la mezcla líquida, y
45 similares pueden. Aquí, para observar el grado de aglutinación, un método para grabar un estado de aglutinación con una cámara de vídeo y para el procesamiento de la imagen también se puede utilizar, además de la observación visual.
De acuerdo con la presente divulgación, es posible proporcionar el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos, que permite un diagnóstico preciso de la infección sifilítica y es excelente en la estabilidad de almacenamiento a largo plazo, y el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum, que permite el diagnóstico preciso de la infección sifilítica mediante la prevención de la aparición de interferencia de suero.
(Ejemplo 1) 55
(1) Preparación de un reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos
De acuerdo con los procedimientos siguientes, se preparó un reactivo del tipo de dos componentes que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo.
(1–1) Preparación del primer reactivo
Se añadió una cantidad de 1,2 % en peso de LipidureD02 (fabricado por NOF Corp., peso molecular de 550.000) neutralizada con NaOH a un tampón fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina ("Lote A", hecha por
65 Serologicals Corporation), para preparar el primer reactivo.
8
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(2) Evaluación de la estabilidad de almacenamiento
Después del almacenamiento del primer reactivo a una temperatura de 30 ° C, la medición de la solución de referencia del anticuerpo anti-fosfolípido se llevó a cabo como se describe en la medición (1) para obtener una
5 relación de reducción de Δabs cuando la Δabs se definió inmediatamente después la preparación como 100 %; Por lo tanto, se evaluó la estabilidad de almacenamiento En general, los reactivos para el ensayo de anticuerpos antifosfolípidos se almacenan a una temperatura de 2 a 10 ºC, sin embargo, el almacenamiento de los mismos a una temperatura de 30 ºC permite la evaluación de la estabilidad de almacenamiento como un ensayo acelerado.
En el presente documento, la medición se llevó a cabo después de un intervalo de 5 días, 15 días, 18 días y 25 días a partir de la preparación.
Los resultados obtenidos mediante el uso de cada una de las soluciones de referencia del anticuerpo antifosfolípidos de 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 U.R. se muestran, respectivamente, en la Figura 1 a la figura 4.
15 El uso de cualquiera de las soluciones de referencia del anticuerpo anti-fosfolípido con una concentración de 1,0
U.R. o 2,0 U.R., como se muestra en la Figura 1 y la figura 2 causó reducciones del 15 al 30 % en las cantidades de cambio de absorbancia después de un intervalo de 25 días en los casos en que se utilizaron pululano, PVP y dextrano. Por el contrario, en los casos donde se utilizaron LipidureD02, LipidureD03 y LipidureD05, se encontró que las cantidades de cambio de absorbancia eran del 5 % o menos.
(Ejemplo 4)
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1,
25 excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 0,66 % en peso de LipidureD03 (fabricado por NOF Corp.) neutralizad con NaOH, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina (Lote B).
(Ejemplo 5)
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 0,66 % en peso de LipidureD03 (fabricado por NOF Corp.) neutralizad con NaOH, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina (Lote C).
(Ejemplo 6)
35 El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 0,66 % en peso de LipidureD03 (fabricado por NOF Corp.) neutralizad con NaOH, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina (Lote D).
[Ejemplo comparativo 4]
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 1,1 % en peso de pululano (fabricado por Hayashibara Co., Ltd.) en lugar de LipidureD02, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina
45 (Lote B) y se disolvió en el mismo.
[Ejemplo comparativo 5]
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 1,1 % en peso de pululano (fabricado por Hayashibara Co., Ltd.) en lugar de LipidureD02, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina (Lote C) y se disolvió en el mismo.
[Ejemplo comparativo 6]
55 El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que, en la preparación del primer reactivo (1-1), se añadió 1,1 % en peso de pululano (fabricado por Hayashibara Co., Ltd.) en lugar de LipidureD02, a un tampón de fosfato que contenía 1 % de seroalbúmina bovina (Lote D) y se disolvió en el mismo.
Evaluación (2)
Con respecto a cada uno de los reactivos para el ensayo de anticuerpos anti-fosfolípidos obtenidos en los Ejemplos 4 a 6 y los Ejemplos Comparativos 4 a 6, se llevaron a cabo las siguientes evaluaciones.
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(2) Evaluación de la estabilidad de almacenamiento
Después del almacenamiento del primer reactivo a una temperatura de 30 ° C, la medición de la solución de referencia del anticuerpo anti-fosfolípido se llevó a cabo como se describe en la medición (1) para obtener una
5 relación de reducción de Δabs cuando la Δabs se definió inmediatamente después la preparación como 100 %; Por lo tanto, se evaluó la estabilidad de almacenamiento En general, el reactivo para el ensayo de anticuerpos antifosfolípidos se almacenan a una temperatura de 2 a 10 ºC, sin embargo, el almacenamiento de los mismos a una temperatura de 30 ºC permite la evaluación de la estabilidad de almacenamiento como un ensayo acelerado.
En el presente documento, la medición se llevó a cabo después de un intervalo de 7 días y 14 días, a partir de la preparación.
Los resultados obtenidos mediante el uso de cada una de las soluciones de referencia del anticuerpo antifosfolípidos de 1,0 y 2,0, U.R. se muestran, respectivamente, en las Figuras 5 y 6.
15 Como se muestra en las Figuras 5 y 6 en el caso de utilizar el lote D de PSA y pululano en combinación, se observó una gran pérdida de sensibilidad después del almacenamiento a una temperatura de 30 °C durante 14 días. Sin embargo, en el caso de utilizar el lote D de BSA y LipidureD03 en combinación, solo se observó una pequeña pérdida de sensibilidad. En consecuencia, el resultado muestra que era menos probable que la BSA afectara a la estabilidad de almacenamiento.
(Ejemplo 7)
(1) Preparación de un reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum
25 De acuerdo con los procedimientos siguientes, se preparó un reactivo del tipo de dos componentes formado por un primer reactivo que incluye una solución de látex con antígeno de de Treponema pallidum y un segundo reactivo que incluye un diluyente de la muestra.
(1-1) Preparación de solución de látex con antígeno de Treponema pallidum
Una cantidad de 400 µl de solución de antígeno de Treponema pallidum disuelto en un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) para tener una concentración de proteína de 150 µg/ml se añadió a 100 µl de líquido de látex de poliestileno (10 % (p / v) de contenido de sólidos, fabricado por Sekisui Chemical Co., Ltd.) que tiene un diámetro promedio de
35 partícula de 0,400 µm, y se agitó a una temperatura de 4 ºC durante 1 hora. Posteriormente, se añadieron 2 ml de un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) que contenía 1 (p/v) de seroalbúmina bovina (fabricada por Serologicals Corporation; BSA, Lote 1) y se agitó durante 1,5 horas.
El líquido resultante se centrifugó a 18.000 rpm a una temperatura de 10 ºC durante 30 minutos y se añadió el precipitado obtenido a 4 ml de un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) que contenía 0,25 % (p / v) de BSA (Lote 1) para suspender el látex, por lo que se preparó una solución de látex con antígeno de Treponema pallidum.
(1–2) Preparación del diluyente de la muestra
45 Una cantidad de 0,2 % (p / v) de Lipidure (copolímero de 2-metacriloiloxietilfosforilcolina y ácido metacrílico, de peso molecular de 1.000.000, fabricado por NOF Corp.) se añadió a un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) que contenía 1 % (p / v) de BSA (Lote 1).
(Ejemplo 8)
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 7, excepto que se añadieron 5 ml de un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) que contenía 0,25 % (p/v) de BSA (Lote 2) al precipitado obtenido en la preparación de una solución de látex con antígeno de Treponema pallidum de (1-1) del Ejemplo 7, y se añadió 0,6 % (p/v) de Lipidure al tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) en la
55 preparación de un diluyente de la muestra (1-2).
(Ejemplo 9)
El reactivo para el ensayo de anticuerpos anti-Treponema pallidum se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 7, excepto que se añadieron 12 ml de un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) que contenía 0,25 % (p/v) de BSA (Lote 2) al precipitado obtenido en la preparación de una solución de látex con antígeno de Treponema pallidum de (1-1) del Ejemplo 7, y se añadió 1,0 % (p/v) de Lipidure al tampón de fosfato 100 mM en la preparación de un diluyente de la muestra (1-2).
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