ES2615534T3 - Modulación de la expresión de huntingtina - Google Patents

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ES2615534T3 ES10816206.6T ES10816206T ES2615534T3 ES 2615534 T3 ES2615534 T3 ES 2615534T3 ES 10816206 T ES10816206 T ES 10816206T ES 2615534 T3 ES2615534 T3 ES 2615534T3
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Susan M. Freier
Holly Kordasiewicz
Lisa Stanek
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Seng H. Cheng
Lamya Shihabuddin
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Abstract

Un oligonucleótido de una sola hebra modificado dirigido a un ácido nucleico que codifica la huntingtina y capaz de inhibir la expresión de huntingtina, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-azúcar de metoxietilo; en el que las uniones entre nucleósidos dentro del segmento de espacio, los enlaces que conectan el segmento de hueco 5' o segmento de ala 3', y los enlaces de los nucleósidos 5'-más y 3'-más de cada segmento de ala son todos enlaces de fosforotioato, los enlaces entre nucleósidos que conectan el resto de los nucleósidos tanto de 5' y 3' segmentos de ala son enlaces de fosfodiéster; y en el que todas las citosinas son 5-metilcitosinas; y en el que la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido consiste en una secuencia indicada en SEQ ID NO: 22 o 32.

Description

2Modulación de la expresión de huntingtina Descripción Campo de la invención 5 [0001] Este documento describe compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARNm huntingtina y proteína en un animal. Tales compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington. 10 Antecedentes [0002] La enfermedad de Huntington (HD) es una devastadora enfermedad neurodegenerativa autosómica dominante, causada por una expansión de repetición del trinucleótido CAG que codifica un tracto de poliglutamina anormalmente largo (PolyQ) en la proteína huntingtina. El gen de la enfermedad de Huntington se mapeó por 15 primera vez en 1993 (The Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell, 1993, 72: 971-83), que consistía en un gen, IT 15, que contenía una repetición trinucleotídica polimórfica que se expandió e inestable en cromosomas HD. Aunque las repeticiones CAG en el rango de tamaño normal son generalmente heredadas como alelos mendelianos, las repeticiones HD expandidas son inestables a través de la transmisión meiótica y se encuentran que se expanden más allá del rango de tamaño normal (6-34 unidades repetidas) en pacientes HD. 20 [0003] Tanto la proteína normal como la variante huntingtina se localizan principalmente en el citoplasma de neuronas (DiFiglia et al, Neuron 1995, 14: 1075-1081). Como resultado de la excesiva longitud de poliglutina, la proteína huntingtina forma agregados en el citoplasma y el núcleo de las neuronas del SNC (Davies et al., Cell 1997, 90: 537-548). Tanto los animales transgénicos como las líneas celulares genéticamente modificadas se han utilizado 25 para investigar los efectos de las repeticiones de polyQ expandidas en la localización y procesamiento de huntingtina. Sin embargo, todavía no está claro si la formación de agregados per se es la etapa citotóxica esencial o una consecuencia de la disfunción celular. [0004] HD se caracteriza por la corea progresiva, cambios psiquiátricos y el deterioro intelectual. Este trastorno 30 dominante afecta a hombres y mujeres igualmente, y ocurre en todas las razas (Gusella y MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol., 1995 5: 656-62). Los síntomas de HD se deben a la muerte de las neuronas en muchas regiones del cerebro, pero es más evidente en el estriado, particularmente en el núcleo caudado, que sufre un gradiente progresivo de pérdida celular que, en última instancia, diezma toda la estructura. Aunque el gen que codifica la huntingtina se expresa de forma ubicua (Strong, TV et al., Nat. Genet., 1995, 5: 259-263), se observa pérdida 35 selectiva de células y astrocitosis fibrilar en el cerebro, particularmente en el caudado y putamen del estriado y en la corteza cerebral de pacientes con HD (Vonsattel, JP y col., Neuropathol, Exp. Neurol., 1985, 44: 559-577) y, en menor grado, en el hipocampo (Spargo, E. et al. , J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56: 487-491) y el subtálamo (Byers, RK et al., Neurology 1973, 23: 561-569). 40 [0005] La huntingtina es crucial para el desarrollo normal y puede ser considerada como un gen de supervivencia celular (Nasir et al., Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431 a 1435). La función normal de la huntingtina permanece incompleta, pero basada en las interacciones proteína-proteína, parece estar asociada con el citoesqueleto y necesaria para la neurogénesis (Walling et al., J. Neurosci Res. 1998, 54: 301-8). La huntingtina es específicamente escindida durante la apoptosis por una cisteína de proteasa clave, apopaina, que se sabe que desempeña un papel 45 fundamental en la muerte celular apoptótica. La tasa de escisión se ve reforzada por más largos tramos de poliglutamina, lo que sugiere que la apoptosis inadecuada subyace HD. [0006] La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y por lo tanto puede resultar ser únicamente útil en un número de diagnóstico terapéutico, y 50 aplicaciones de investigación para la modulación de la expresión de huntingtina. (Véanse las Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. 2008/0039418 y 2007/0299027). [0007] Compuestos antisentido para modular la expresión de huntingtina se describen en las solicitudes de patente publicadas anteriormente mencionadas. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de otros compuestos de este 55 tipo. Resumen de la invención [0008] La invención proporciona un oligonucleótido modificado de una única hebra dirigido a una huntingtina de 60 codificación de ácido nucleico y capaz de inhibir la expresión de huntingtina, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de hueco consistente en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos unidos; 65 y un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos unidos; 3 en el que el segmento de separación está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en el que los enlaces internucleósidos dentro del segmento de hueco, los enlaces que conectan el segmento de hueco con el segmento de ala 5’ o 3' y los enlaces para los nucleósidos 5’ y 3' más de cada segmento de ala son 5 todos los enlaces de fosforotioato, los enlaces internucleósidos que conectan el resto de los nucleósidos de los segmentos de ala 5’ y 3' son enlaces de fosfodiéster; y donde todas las citosinas son 5-metilcitosinas; y donde la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido consiste en una secuencia indicada en SEQ ID NO: 22 o 32. 10 [0009] La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. [0010] La invención también proporciona un compuesto o una composición de la invención para uso en terapia. 15 [0011] La invención también proporciona un compuesto o una composición de la invención para su uso en una prevención, tratamiento, mejorando o retardando la progresión de la enfermedad de Huntington en un animal. [0012] Otros aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. 20 Resumen de la Divulgación [0013] Se describen en este documento métodos, compuestos y composiciones para modular la expresión de huntingtina y tratar, prevenir, retrasar o mejorar la enfermedad de Huntington y/o un síntoma de la misma. 25 Breve descripción de las figuras [0014] FIG. 1: La relación PK/PD de la expresión del ARNm de la huntingtina en el tejido intraestriatal con concentración 30 ISIS 387898 en el cerebro del ratón. A ratones C57/BL6 se les administró un único bolo de 50 µg de ISIS 387898 y la expresión de ARNm de la huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. La CE50 de ISIS 387898 también se calculó. FIG. 2: La comparación de la expresión de ARNm en el tejido huntingtina intraestriatal y ISIS 387898 35 concentraciones en diferentes puntos de tiempo. Ratones C57/BL6 se les administró un único bolo de 50 µg de ISIS 387898 y la expresión del ARNm de la huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. Se observó que la duración de la acción (tal como se mide por la expresión de ARNm htt) de ISIS 387898 (línea discontinua) era más larga, incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido. 40 FIG. 3: La relación PK/PD de la expresión del ARNm de huntingtina en el tejido cortical anterior con concentración ISIS 387898 en el cerebro del ratón. A ratones BACHD se les administró una infusión intracerebroventricular de 75 µg de ISIS 387898 durante 2 semanas y la expresión del ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. La CE50 de ISIS 387898 también 45 se calculó. FIG. 4: La comparación de la expresión de ARNm de huntingtina en el tejido de la corteza anterior y concentraciones de ISIS 387898 en diversos puntos temporales. A los ratones BACHD se administraron infusión intracerebroventricular de 75 µg de ISIS 387898 durante 2 semanas, y la expresión del ARNm de la huntingtina, 50 así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. Se observó que la duración de la acción (tal como se mide por la expresión de ARNm htt) de ISIS 387898 (línea discontinua) era más larga, incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido. FIG. 5: La comparación de la expresión del ARNm de huntingtina en el tejido cortical posterior y concentraciones 55 de ISIS 388241 en diferentes puntos de tiempo. A los ratones BACHD se administraron infusión intracerebroventricular de 50 µg de ISIS 388241 durante 2 semanas, y la expresión del ARNm de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. Se observó que la duración de la acción (tal como se mide por la expresión de ARNm htt) de ISIS 388241 (línea discontinua) era más larga, incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido. 60 FIG. 6: La comparación de la expresión del ARNm de la huntingtina en el tejido cortical posterior y concentraciones de ISIS 443139 en diferentes puntos de tiempo. A los ratones BACHD se administraron infusión intracerebroventricular de 50 µg de ISIS 443139 durante 2 semanas, y la expresión del ARNm de la huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido se midieron. Se observó que la duración de 65 la acción (tal como se mide por la expresión de ARNm htt) de ISIS 443139 (línea discontinua) era más larga, 4incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea continua) en el tejido. FIG. 7. El efecto del tratamiento de oligonucleótido antisentido en el rendimiento motor de los ratones de BACHD utilizando el ensayo rotarod. Los ratones de BACHD fueron tratados con 50 µg/día ICV de ISIS 388241 o PBS durante dos semanas. Los grupos de control de compañeros de camada no transgénicos se trataron de manera 5 similar con ISIS 388241 o PBS. El ensayo de Rotarod de aceleración se realizó entonces. Los animales se colocaron sobre el Rotarod a una velocidad de 2 RPM; El Rotarod aceleró a 40 RPM durante 5 minutos. Se registró la duración de la caída. Los valores basales a los 6 meses de edad fueron registrados antes del tratamiento y los puntos de tiempo dados son la edad de los ratones en los que se realizó el ensayo. Las barras representan la duración a la caída en segundos por ratones de BACHD tratados con ISIS 388241 (negro); por 10 ratones de BACHD tratados con PBS (hash); y por compañeros de camada no transgénicos tratados con PBS (blanco). Los ratones tratados con ISIS 388241 mostraron una mayor duración de la caída y, por lo tanto, un rendimiento de motor mejorado en el Rotarod, en comparación con el control de PBS. FIG. 8. El efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en el peso del cerebro de los ratones R6/2. 15 Ratones de R6/2 de seis meses de edad fueron tratados con ICV de ISIS 388817 50 µg/día o oligonucleótidos de control de ISIS 141923 o PBS durante 4 semanas. Los grupos de control de compañeros de camada no transgénicos se trataron de forma similar con ISIS 388817 o PBS. Se incluyó en el estudio un grupo de control de ratones R6/2 pre-sintomáticos de ocho semanas de edad y no se les administró ningún tratamiento. Las barras representan el peso del cerebro de ratones R6/2 no tratados de ocho semanas de edad; ratones R6/2 tratados 20 con ISIS 141923; ratones R6/2 tratados con PBS; ratones R6/2 tratados con ISIS 388817; compañeros de camada no transgénicos tratados con PBS; y compañeros de camada no transgénicos tratados con ISIS 388817. Había un aumento en el peso del cerebro de ratones R6/2 tratados con ISIS 388817 en comparación con el control de PBS. 25 FIG. 9 Caracterización del comportamiento de los ratones YAC128 tratados con oligonucleótidos antisentido utilizando el ensayo de campo abierto. Ratones de YAC128 de cinco meses de edad fueron tratados con 50 µg/día ICV de ISIS 388241 o el control de oligonucleótidos de ISIS 141923 o PBS durante 14 días. Se incluyó en el estudio un grupo de control de compañeros de camada no transgénicos de FVB/NJ y no recibieron ningún tratamiento. Los ratones fueron colocados en una zona de campo abierto que usa rompimientos de fotomedia 30 para medir el movimiento horizontal y vertical durante una sesión de prueba de 30 minutos. Los datos se analizaron utilizando el software Activity Monitor para examinar el movimiento ambulatorio total dentro de la zona y el movimiento dentro del centro de la zona como una medida de la ansiedad. Las barras representan el tiempo en segundos transcurridos en el centro del campo por ratones de FVB/NJ, YAC128 tratados con PBS y ratones de YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241 pasaron más tiempo en el 35 centro y por lo tanto se consideraron menos propensos a ansiedad que el control de PBS. FIG. 10 La caracterización del comportamiento de los ratones YAC128 tratados con oligonucleótidos antisentido utilizando el ensayo de laberinto elevado. Ratones de YAC128 de cinco meses de edad fueron tratados con 50 µg/día ICV de ISIS 388241 o oligonucleótidos de control de ISIS 141923 o con PBS durante 14 días. Se incluyó 40 un grupo de control de compañeros de camada FVB/NJ no transgénicos como control no tratado. Los ratones se colocaron en el centro de un aparato que consistía en dos brazos abiertos y dos brazos cerrados, midiendo cada uno de los cuales 65 x 6,25 cm y se elevaba 50 cm por encima del suelo. La ubicación de los ratones en el aparato y la cantidad de tiempo que pasó en los brazos abiertos se registró durante una sesión de prueba de 5 minutos como medida de ansiedad. Las barras representan el porcentaje de tiempo pasado en los brazos 45 abiertos por control FVB/NJ, YAC128 tratados con PBS y ratones YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241 pasaron más tiempo en los brazos abiertos y por lo tanto se consideraron menos propensos a ansiedad que el control PBS. Descripción detallada 50 [0015] Se ha de entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En este caso, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente memoria, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras 55 formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. [0016] Los títulos de las secciones que aparecen aquí son para fines de organización y no deben interpretarse como 60 una limitación del objeto descrito. Definiciones [0017] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los 65 procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica 5descrita en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Las técnicas estándar se pueden utilizar para la síntesis química, y el análisis químico. [0018] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados: 5 "2'-O-metoxietilo" (también de 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxi-etílica de la posición 2' de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado en 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado. [0019] "NucleótidO2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo. 10 [0020] "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo de metilo unido a la posición 5’. Una 5-metilcitosina es una nucleobasa modificada. [0021] "Agente farmacéutico activo" se refiere a la sustancia o sustancias de una composición farmacéutica que 15 proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones un oligonucleótido antisentido dirigido a huntingtina es un agente farmacéutico activo. [0022] "Región diana activa" o "región diana" se refiere a una región a la que uno o más compuestos activos antisentido está dirigido. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles 20 de ácidos nucleicos diana o niveles de proteína. [0023] "Administrado concomitantemente" se refiere a la co-administración de dos agentes en cualquier forma donde los efectos farmacológicos de ambos se manifiesta en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de 25 dosificación, o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos sólo tienen que superponerse durante un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos. [0024] "Administración" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye, pero no está limitado 30 a la administración por un profesional de la medicina y la auto-administración. [0025] "Mejora" se refiere a una disminución de al menos un indicador, muestra, o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores puede determinarse por medidas subjetivas o objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica. 35 [0026] "Animal" se refiere a un ser humano o animal no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitado a, monos y Chimpancés [0027] "Actividad antisentido" se refiere a cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un 40 compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por dicho ácido nucleico diana. [0028] "Compuesto antisentido" se refiere a un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar la hibridación 45 con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. [0029] "Inhibición antisentido" se refiere a la reducción de los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles objetivo de ácido nucleico o los niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido. 50 [0030] "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobasas que permite hibridación a una región correspondiente o segmento de un ácido nucleico diana. [0031] "Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado por el puente de dos átomos del anillo no 55 geminales. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado. [0032] "Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico. 60 [0033] "Estructura Cap" o "resto cap terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido. [0034] "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna forma 65 químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 6nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo. [0035] "Compuesto anti-sentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas. 5 [0036] "Co-administración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración comprende la administración paralela 10 o secuencial. [0037] "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobasas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. 15 [0038] "Nucleobasas contiguas" significa nucleobasas inmediatamente adyacentes entre sí. [0039] "Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser una solución líquida, por ejemplo salina. 20 [0040] "Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una única administración, o en un período de tiempo especificado. Se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, cuando se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente mediante una única inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más 25 inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o continuamente. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. [0041] "Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado 30 fisiológico deseado en un individuo que necesita del agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratarse, del grupo taxonómico de los individuos a tratar, de la formulación de la composición, de la evaluación de la condición médica del individuo y de otros factores relevantes. 35 [0042] "Ácido nucleico de huntingtina" significa cualquier codificación de ácido nucleico de huntingtina. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de huntingtina incluye una secuencia de ADN que codifica huntingtina, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica huntingtina (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica huntingtina. "ARNm de caza" significa un ARNm que codifica una proteína de huntingtina. 40 [0043] "Totalmente complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobasa de una secuencia de nucleobasa de un primer ácido nucleico tiene una nucleobasa complementaria de una segunda secuencia de nucleobasa de un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico. 45 [0044] "Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que se coloca una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que apoyan la RNasa H de escisión entre las regiones exteriores tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distinta del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse un "segmento de 50 separación" y las regiones externas pueden denominarse "segmentos de ala". [0045] "Gap-ensanchado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5’ y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos. 55 [0046] "Hibridación" significa la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. 60 [0047] "Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes. [0048] "Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia. 65 [0049] "Enlace internucleósido" se refiere al enlace químico entre nucleósidos. 7[0050] Nucleósidos enlazados significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí. [0051] "Desajuste" o "nucleobasa no complementaria" se refiere al caso cuando una nucleobasa de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la correspondiente nucleobasa de un ácido nucleico segundo o diana. 5 [0052] "Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace ósido internucleósido de origen natural (es decir, un enlace de fosfodiéster internucleósido). [0053] "Nucleobasa modificada" se refiere a cualquier nucleobasa distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobasa no modificada" significa las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases 10 pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). [0054] "Nucleótido modificado" significa que un nucleótido tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace de internucleósido modificado, o nucleobasa modificada. Un nucleósido modificado significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o nucleobasa modificada. 15 [0055] "Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado. [0056] "Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural. 20 [0057] "Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido. [0058] "Enlace internucleósido natural" significa un enlace fosfodiéster de 3’ a 5’. [0059] "Unidad de azúcar natural" significa un azúcar encontrado en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). 25 [0060] "Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos nucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, pequeños ácidos ribonucleicos (siARN) y microARNs (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula. 30 [0061] Nucleobasa significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico. [0062] "Secuencia nucleobasa" significa el orden de nucleobasas contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace, o modificación de la nucleobasa. 35 [0063] "Nucleósido" significa una nucleobasa unida a un azúcar. [0064] "Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. 40 [0065] "Compuesto oligomérico" o "oligómero" se refiere a un polímero de subunidades monoméricas con enlaces que es capaz de hibridarse con al menos una región de una molécula de ácido nucleico. [0066] "Oligonucleótido" se refiere a un polímero de nucleósidos ligados, pudiendo ser cada uno de los cuales 45 modificados o no modificados, uno independiente del otro. [0067] "Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración 50 intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica o corta o intermitente. [0068] "Péptido" significa una molécula formada por la vinculación de al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas. 55 [0069] "Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para su administración a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril. [0070] "Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los 60 compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido de los padres y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo. [0071] "Enlace de fosforotioato" significa una unión entre nucleósidos en el que el enlace fosfodiéster se modifica mediante la sustitución de uno de los átomos de oxígeno sin puente con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato 65 es un enlace internucleósido modificado. 8[0072] "Porción" significa un número definido de nucleobasas contiguas (es decir, relacionadas entre sí) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobasas contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobasas contiguas de un compuesto antisentido. 5 [0073] "Prevenir" se refiere al retraso o prevención de la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno, o condición por un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa la reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición. [0074] "Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una 10 forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos o condiciones. [0075] "Efectos secundarios" se refiere a respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento aparte de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de la inyección, 15 anormalidades en la función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en el suero puede indicar toxicidad hepática o anormalidad en la función hepática. Por ejemplo, la bilirrubina aumentada puede indicar toxicidad hepática o anormalidad en la función hepática. 20 [0076] "Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria. [0077] "Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, 25 mientras que exhiben un mínimo o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. [0078] "Orientación" o "orientado" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que 30 específicamente hibridan con un ácido nucleico diana e inducen un efecto deseado. [0079] "Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de diana de ARN" todos se refieren a un ácido nucleico capaz de ser blanco de compuestos antisentido. 35 [0080] "Segmento diana" significa que la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana a la que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5’" se refiere al nucleótido 5' más de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana. [0081] "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un 40 beneficio terapéutico a un individuo. [0082] "Tratar" se refiere a la administración de una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o condición. 45 [0083] "Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobasas de origen natural, restos de azúcar, y los enlaces entre nucleósidos. Un nucleótido no modificado puede ser un nucleótido de ARN (es decir, beta-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, β-D-desoxirribonucleósido). Ciertas realizaciones 50 [0084] Ciertas realizaciones proporcionan compuestos y composiciones para inhibir la expresión de huntingtina. [0085] Ciertas formas de realización proporcionan compuestos antisentido orientados a alquitrán a un ácido nucleico de huntingtina. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de huntingtina es cualquiera de las secuencias 55 expuestas en el Nº de Acceso de GENBANK NM_002111.6 (incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 1), Nº de Acceso de GENBANK NT_006081.17 truncado desde los nucleótidos 462000 a 634000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), número de acceso de GENBANK NM_010414.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), el complemento del Nº de Acceso GENBANK NW_001109716.1 truncado en los nucleótidos 698000 a 866000 (incorporado en la presente memoria como SEQ ID NO: 4), y el Nº de Acceso de GENBANK NM_024357.2 60 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5). [0086] Se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos ligados en los que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadass en SEQ ID NOs: 6, 9, 65 10, 11 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18 , 22, 32. En 9ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, o al menos 12 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de la nucleobasa indicadas en las SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En ciertos casos, las secuencias de la nucleobasa son las citadas en las SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, 5 o al menos 12 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas recitadas en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32 y 33. [0087] Se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15 a 25 nucleósidos ligados en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8 nucleobasas 10 contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18 , 22, 32. In certain instances, the modified oligonucleotide comprises at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14 or at least 15 contiguous nucleobasas of a sequence selected from among the nucleobasa sequences recited in SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33 , 35, 36, 10, 15 11, 12, 13, 18, 22, 32. In certain instances, the nucleobasa sequences are those recited in SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. In certain instances, the modified oligonucleotide comprises at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14 or at least 15 contiguous nucleobasas of a sequence selected from among the nucleobasa sequences recited in SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, and 33. 20 [0088] Se describe en el presente documento son compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18 a 21 nucleósidos ligados en el que los nucleósidos con enlaces compriseat menos 8 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al 25 menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. En ciertos casos, las secuencias de nucleobasas son las citadas en SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 30 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleobasas contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33. [0089] Descritos en este documento están compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12-30 nucleósidos ligados en los que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos una porción contigua 35 nucleobasa 8 que es complementaria de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4.622-4.639, 4813-4832, 4814 a 4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928 a 4.947, 4931-4950, 4931-4948 , 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, y 5809-5828, 4928-4947 de la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, la región se selecciona 4384-4403, 4609-4628, 4610-40 4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, y 5809-5828 de la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, se selecciona la región de 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, o al menos una parte nucleobasa contigua 12 de las cuales es complementaria dentro de una región descrita en el presente documento. 45 [0090] Se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15-25 nucleósidos ligados en los que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos una porción contigua nucleobasa 8 que es complementaria de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610 -4629 , 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, y 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. 50 en ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 12, al menos un 13, o al menos una parte nucleobasa contigua 15 de las cuales es complementaria dentro de una región descrita en el presente documento. [0091] Se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que 55 consta de 15-25 nucleósidos ligados en los que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos una porción contigua nucleobasa 8 que es complementaria de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828 , 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 12, al menos un 13, o al menos una parte nucleobasa contigua 15 de las cuales es complementaria dentro de una región descrita en el presente documento. 60 [0092] Se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18-21 nucleósidos ligados en los que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos una porción contigua nucleobasa 8 que es complementaria de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, y 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. 65 En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 1012, al menos un 13, al menos un 14, al menos un 15, al menos un 16, al menos un 17, o al menos una porción de nucleobasa contigua 18 de las cuales es complementaria dentro de una región descrita en el presente documento. [0093] Se describen en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18-21 nucleósidos ligados en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos una porción 5 contigua nucleobasa 8 que es complementaria de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 12, al menos un 13, al menos un 14, al menos un 15, al menos un 16, al menos un 17, o al menos una porción de nucleobasa contigua 18 que es complementaria de una región descrita en el presente documento. 10 [0094] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en un oligonucleótido monocatenario modificado. [0095] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado se compone de 20 nucleósidos enlazados. 15 [0096] En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobasa de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido modificado es al menos 95% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobasa de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido 20 modificado es al menos 99% complementaria sobre toda la longitud de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido modificado es 100% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobasa de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5. [0097] en ciertas realizaciones, el compuesto tiene al menos un enlace entre nucleósidos modificados. En ciertas 25 realizaciones, el enlace entre nucleósidos es un enlace fosforotioato internucleosídico. [0098] En ciertas realizaciones, el compuesto tiene al menos un nucleósido que comprende un azúcar modificado. En ciertos casos, el al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertos casos, el al menos un azúcar bicíclico que comprende un puente 4’-CH(CH3)-O-2’. En ciertas realizaciones, el al menos un azúcar modificado 30 comprende un 2'-O-metoxietilo. [0099] En ciertos casos, el compuesto comprende al menos un nucleósido modificado por tetrahidropirano en el que un anillo de tetrahidropirano sustituye al anillo de furanosa. En ciertos casos, el al menos un nucleósido modificado por tetrahidropiran tiene la estructura: 35 40 45 en donde Bx es un resto de base heterocíclica opcionalmente protegida. [0100] En ciertas realizaciones, el compuesto tiene al menos un nucleósido que comprende una nucleobasa 50 modificada. En ciertas realizaciones, la base nitrogenada modificada es una 5-metilcitosina. [0101] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento hueco que consta de desoxinucleósidos enlazados; 55 (ii) un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados, en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5’3 y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. 60 [0102] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados, en el que el segmento de hueco se coloca 65 inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', donde cada nucleósido de 11cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en el que cada enlace entre nucleósidos es un enlace fosforotioato. [0103] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: 5 (i) un segmento hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5’ que consta de seis nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consta de seis nucleósidos enlazados, en el que el segmento de déficit se coloca inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietilo; y en el que cada enlace entre nucleósidos es un 10 enlace fosforotioato. [0104] En ciertos casos, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento hueco que consta de ocho desoxinucleósidos enlazados; 15 (ii) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados, en el que el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y segmento de ala 3', donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietilo; y en el que cada enlace entre nucleósidos es un enlace fosforotioato. 20 [0105] Se describe aquí una composición que comprende un compuesto como se describe en el presente documento, o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En ciertos casos, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 12 nucleobasas contiguas de una secuencia de 25 nucleobasas seleccionadas de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. [0106] Se describe aquí una composición que comprende un compuesto como se describe en el presente 30 documento, o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En ciertos casos, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 12 nucleobasas contiguos de una secuencia de nucleobasas seleccionadas de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 35 [0107] Se describe en el presente documento métodos para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington. [0108] Se describe en el presente documento procedimientos que comprenden la administración a un animal de un compuesto como se describe en el presente documento a un animal. En ciertos casos, el método comprende la 40 administración a un animal de un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 8 nucleobasas contiguas de una secuencia de nucleobasa seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. 45 [0109] Se describe en el presente documento procedimientos que comprenden la administración a un animal de un compuesto como se describe en este documento a un animal. En ciertos casos, el método comprende la administración a un animal de un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobasas que comprende al menos 8 nucleobasas contiguas de una secuencia de nucleobasa seleccionada de entre las secuencias de nucleobasas indicadas en SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 50 33. [0110] En ciertas realizaciones, el animal es un ser humano. [0111] En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, aminora o disminuye la progresión de enfermedad 55 de Huntington como se describe aquí. [0112] En ciertas realizaciones, el compuesto se co-administra con un segundo agente. [0113] En ciertas realizaciones, el compuesto y el segundo agente se administran concomitantemente. 60 [0114] En ciertas realizaciones, la administración es la administración parenteral. En ciertas realizaciones, la administración parenteral es la administración intracraneal. En ciertas realizaciones, la administración intracraneal es la administración intratecal o intracerebroventricular. 65 [0115] También se describe aquí un método para reducir ARNm de huntingtina o expresión de la proteína en un 12animal que comprende la administración al animal de un compuesto o composición como se describe en el presente documento para reducir el ARNm o expresión de la proteína huntingtina en el animal. En ciertos casos, el animal es un humano. En ciertos casos, la reducción de ARNm de huntingtina o expresión de la proteína previene, trata, aminora, o retrasa la progresión de la enfermedad de Huntington. 5 [0116] También se describe aquí un método para tratar un ser humano con la enfermedad de Huntington que comprende la identificación del humano con la enfermedad y la administración al humano de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste de inquietud, falta de coordinación, movimientos iniciados involuntariamente, movimientos involuntariamente incompletos, marcha 10 inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anormal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones, trastornos del sueño, la planificación, alteración de la flexibilidad, deterioro de pensamiento abstracto, adquisición de regla alterada, deterioro de la iniciación de las acciones apropiadas, deterioro de la inhibición de las acciones inapropiadas, problemas de memoria a corto plazo, deterioro de la memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones, 15 demencia, una ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismos, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad, ideación suicida, la masa cerebral reproducida, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular. [0117] También se describe un método para reducir o prevenir la enfermedad de Huntington, que comprende la 20 administración a un ser humano de un compuesto o composición de cantidad terapéuticamente eficaz como se describe en el presente documento, reduciendo o previniendo de ese modo la enfermedad de Huntington. [0118] También se describe un método para mejorar un síntoma de la enfermedad de Huntington, que comprende la administración a un humano en necesidad del mismo de un compuesto que comprende un oligonucleótido 25 modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, mejorando de este modo un síntoma de la enfermedad de Huntington en el ser humano. [0119] También se describe un método para reducir la tasa de progresión de un síntoma asociado con la 30 enfermedad de Huntington, que comprende la administración a un humano en necesidad del mismo de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, lo que reduce la tasa de progresión de un síntoma de la enfermedad de Huntington en el ser humano. 35 [0120] También se describe un método para revertir la degeneración indicada por un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, la administración a un humano en necesidad del mismo de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, invirtiendo así la degeneración indicada por un síntoma de la enfermedad de Huntington en el ser humano. 40 [0121] En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma físico, cognitivo, trastornos psiquiátricos o periféricos. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste de inquietud, falta de coordinación, movimientos iniciados involuntariamente, movimientos involuntariamente incompletos, marcha inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anormal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, 45 dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones, y trastornos del sueño. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en la planificación de alteración, alteración de la flexibilidad, deterioro de pensamiento abstracto, adquisición de regla alterada, deterioro de la iniciación de las acciones apropiadas, deterioro de la inhibición de las acciones inadecuadas, problemas de memoria a corto plazo, alteración de memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones y 50 demencia. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismos, agresión, comportamiento compulsivos, irritabilidad e ideación suicida. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste de masa reducida cerebral, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular. 55 [0122] También se describen métodos y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención, o mejora de la enfermedad de Huntington. [0123] También se describe aquí el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de 60 un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir la enfermedad de Huntington. [0124] También se describe aquí un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento por la terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los 65 agentes o terapias pueden administrarse conjuntamente o se administran de forma concomitante. 13[0125] También se describe en el presente documento el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento por la terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden administrarse conjuntamente o administrarse de forma concomitante. 5 [0126] También se describe aquí el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en la presente memoria en un paciente que posteriormente se administra por vía de un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. 10 [0127] También se describe aquí un kit para tratar, prevenir, o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe aquí en el que el kit comprende: (i) un compuesto tal como se describe en el presente documento; y, alternativamente, 15 (ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. [0128] Un kit como se describe en el presente documento puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir, o mejorar la enfermedad de Huntington como se describe en el presente documento por la terapia de combinación como se describe aquí. 20 [0129] También se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobasas contiguas de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 25 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, o 36, para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de modo que la expresión de huntingtina se inhibe. En ciertas posturas, la enfermedad o afección es un trastorno neurológico. En ciertos casos, la enfermedad o afección es la enfermedad de Huntington. En ciertos casos, el animal es un humano. 30 [0130] También se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobasas contiguas de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 35 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, o 36, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar, o progresar lentamente la enfermedad de Huntington. 40 [0131] También se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobasas contiguas de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, o 33, para su uso en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante 45 la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de modo que la expresión de huntingtina se inhibe. En ciertos casos, la enfermedad o afección es un trastorno neurológico. En ciertos casos, la enfermedad o afección es la enfermedad de Huntington. En ciertos casos, el animal es un humano. [0132] También se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que 50 consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobasas contiguas de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, o 33, para uso en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar, o 55 progresar lentamente la enfermedad de Huntington. [0133] También se describen en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12-30 ósidos nucleación enlaces, en el que los enlaces nucleósidos al menos un 8, al menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos un 12, al menos un 13, al menos un 14, al menos un 15, al menos un 16, al 60 menos un 17, al menos un 18, al menos un 19, o al menos una parte nucleobasa contigua 20 complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868 -4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEQ ID NO: 1, 65 para uso en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante la administración 14al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de modo que la expresión de huntingtina se inhibe. [0134] También se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 12-30 nucleósidos enlazados, en el que los nucleósidos con enlaces comprenden al menos un 8, al 5 menos un 9, al menos un 10, al menos un 11, al menos una 12, al menos un 13, al menos un 14, al menos un 15, al menos un 16, al menos un 17, al menos un 18, al menos un 19, o al menos una parte nucleobasa contigua 20 complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-10 101105, 115066-115085, 4607-4626, 4.608-4.627, 4.609-4.628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de la SEQ ID NO: 1, para uso en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para prevenir, tratar, mejorar, o progresar lentamente la enfermedad de Huntington. 15 Compuestos antisentido [0135] Compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, registros analógicas de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y siRNAs. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" a un ácido nucleico diana, el sentido de que es capaz 20 de experimentar la hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. [0136] Un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobasa que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. Un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobasa que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', 25 comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. [0137] Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina es de 12 a 30 nucleótidos de longitud. En otras palabras, los compuestos antisentido son de 12 a 30 nucleobasas enlazadas. El compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 30 nucleobasas enlazadas. En ciertos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 o nucleobasas enlazadas de longitud, o un rango definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. 35 [0138] En ciertos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un único nucleósido eliminado del 'extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos nucleósidos eliminados del extremo 5’, o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas 40 desde el extremo 3'. Alternativamente, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar en todo el oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido borrado de extremo 5' y un nucleósido borrado del extremo 3'. [0139] Cuando un solo nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional 45 puede estar situado en el extremo 5’ o 3' del oligonucleótido. Cuando dos o más nucleósidos adicionales están presentes, los nucleósidos adicionales pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos a 'extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido puede dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido añadido al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'. 50 [0140] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de desajuste sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), una serie de oligonucleótidos antisentido 13-25 nucleobasas de longitud se ensayaron para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de 55 ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobasas de longitud con 8 o 11 bases de desajuste cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica de la ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. Del mismo modo, el objetivo específico de escisión se consiguió usando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobasa, incluyendo aquellos con 1 o 3 desajustes. 60 [0141] Gautschi et al (J. Natl Cancer Inst 93: 463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con ARNm de Bcl-2 y que tiene 3 desajustes a la bcl-xL ARNm para reducir la expresión de Bcl-2 y Bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido mostró una actividad antitumoral potente in vivo. 65 15[0142] Maher y Dolnick (Nuc Acid Res 16: 3341-3358,1988) pusieron a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de nucleobasa tándem 14, y unos oligonucleótidos antisentido de nucleobasas 28 y 42 compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido tándem, respectivamente, para su capacidad de detener traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de nucleobasas 14 sola era capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los 28 o 5 42 oligonucleótidos antisentido de nucleobasas. Los motivos de compuesto antisentido [0143] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina tienen 10 subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos, para conferir a propiedades de compuestos antisentido tales como una mayor actividad inhibidora, un aumento de la afinidad de unión para un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo. [0144] Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que 15 confieren un aumento en la resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibitoria. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN: ADN. 20 [0145] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta escisión de RNasaH se sitúa entre las regiones exteriores, teniendo una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo de gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasa, mientras que los 25 segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por el tipo de restos de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden, en algunos casos incluir ß-D-ribonucleósidos, ß-D-deoxiribonucleósidos, 2'-nucleósidos modificados (tales 2'-nucleósidos modificados pueden incluir 2’-MOE, y 2'-O-CH3, entre otros), y los nucleósidos bicíclicos modificados de azúcar (tales nucleósidos bicíclicos modificados de 30 azúcar pueden incluir los que tienen un 4’-(CH2)n-O-2 'puente, donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo de diferencia de ala se describe con frecuencia como "XYZ", donde "X" representa la longitud de la región del ala 5’, "Y" representa la longitud de la zona de lagunas, y "Z" representa la longitud de la región de ala 3'. Como se usa en este documento, un gapmer descrito como "XYZ" tiene una configuración tal que el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos 35 de ala 3' y del segmento de ala 5'. Por lo tanto, no existen nucleótidos que intervienen entre el segmento de ala 5' y segmento de hueco, o el segmento de hueco y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en este documento pueden tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son los mismos, en otros casos son diferentes. En una realización preferida, Y es de entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, 40 gapmers incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2 -16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1,2-8-2, 6-8-6 o 5-8-5. [0146] En ciertos casos, el compuesto antisentido como un motivo "wingmer", que tiene una configuración ala-hueco o hueco-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describe anteriormente para la configuración de gapmer. 45 Por lo tanto, las configuraciones wingmer incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 o 5-13. [0147] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo gapmer 5-10-5. 50 [0148] En ciertos casos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo gapmer 6-8-6. [0149] En ciertos casos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo 55 gapmer 5-8-5. [0150] En ciertos casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un motivo de hueco ensanchado. 60 [0151] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido de hueco ensanchado dirigido a un ácido nucleico de huntingtina que tiene un segmento de hueco a menudo 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentess a y entre los segmentos de las alas de cinco nucleósidos modificados químicamente. En ciertos casos, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otros casos, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE. 65 16[0152] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido de hueco ensanchado dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un segmento de espacio de ocho 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentess a y entre los segmentos de las alas de cinco nucleósidos modificados químicamente. En ciertos casos, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otros casos, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE. 5 [0153] En ciertos casos, un oligonucleótido antisentido de hueco ensanchado dirigido a un ácido nucleico de huntingtina que tiene un segmento de hueco de ocho 2’-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre los segmentos de ala de seis nucleósidos químicamente modificados. En ciertos casos, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otros casos, la modificación química comprende 10 una modificación de azúcar 2’-MOE. Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos [0154] Las secuencias de nucleótidos que codifican la huntingtina incluyen, sin limitación, los siguientes: GENBANK 15 No. de Acceso NM_002111.6, depositado primero con GENBANK® en 31 de mayo 2006 incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1; GENBANK No. de Acceso del No. NT_006081.17 truncado desde los nucleótidos 462.000 hasta 634.000, depositado primero con GENBANK® en 19 de agosto, 2004, e incorporado aquí como SEQ ID NO: 2; GENBANK No. de Acceso NM_010414.1, depositado primero con GENBANK® el día 23 Marzo, 2004, incorporada aquí como SEQ ID NO: 3; el complemento de GENBANK No. de Acceso NW_001109716.1 truncado en 20 los nucleótidos 698.000 a 866.000, depositado primero con GENBANK® en 14 de junio, 2006, incorporado aquí como SEQ ID NO: 4, y GENBANK No. de Acceso NM_024357.2, depositado primero con GENBANK® de 5 de junio de 2008, incorporada aquí como SEQ ID NO: 5. [0155] Se entiende que la secuencia expuesta en la SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en este documento es 25 independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace entre nucleósidos, o una base nitrogenada. Como tales, compuestos antisentido definidos por un SEQ ID NO pueden comprender, de forma independiente, una o más modificaciones en un resto azúcar, un enlace entre nucleósidos o una nucleobasa. Los compuestos antisentido descritos por Número Isis (nº Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobasas y el motivo. 30 [0156] En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3’, una 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificadora, una región de iniciación de traducción, región de terminación de la traducción, u otra región de ácido nucleico definido. Las regiones estructuralmente definidas para la huntingtina se pueden obtener por el 35 número de acceso de las bases de datos de secuencias tales como NCBI. En ciertas realizaciones, una región diana puede comprender la secuencia de un sitio diana 5' de un segmento objetivo dentro de la región diana a un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la región diana. [0157] La orientación incluye la determinación de al menos un segmento diana a la que un compuesto antisentido 40 hibrido, de manera que se produzca un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ARNm diana de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de la proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana. 45 [0158] Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Segmentos dianas múltiples dentro de una región diana pueden solaparse. Alternativamente, pueden no solaparse. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos, es decir, no es más que aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, 50 o es un rango definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertos casos, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' que figuran en el presente documento. 55 [0159] Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5’, una región codificante, una UTR 3’, un intrón, un exón, o una unión exón/intrón. Segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida como el codón de inicio o codón de parada. 60 [0160] La determinación de los segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST se puede utilizar para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede prevenir la selección de secuencias de compuesto antisentido que puede hibridar de manera no específica a secuencias distintas de un 65 ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de diana). 17[0161] Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, tal como se define por el porcentaje de reducción de los niveles diana de ácido nucleico) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de huntingtina son indicativos de la inhibición de la expresión de huntingtina. Las reducciones en los niveles de una proteína huntingtina también son indicativos de la inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de 5 huntingtina. Por ejemplo, el aumento en el tamaño del cerebro a la normalidad, la mejora en la coordinación motora, disminución de los espasmos musculares continuos (distonía), disminución de la irritabilidad y/o ansiedad, mejora de la memoria, o un aumento de la energía, entre otros cambios fenotípicos que pueden ensayarse. Otros indicios fenotípicos, por ejemplo, los síntomas asociados con la enfermedad de Huntington, también pueden ser evaluados como se describe a continuación. 10 Hibridación [0162] En algunas realizaciones, la hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un ácido nucleico de huntingtina. El mecanismo más común de la hibridación implica enlaces de 15 hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido) entre nucleobasas complementarias de las moléculas de ácido nucleico. [0163] La hibridación puede ocurrir bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y se determinan por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar. 20 [0164] Los métodos para determinar si una secuencia es capaz de hibridar específicamente a un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en este documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico de huntingtina. 25 Complementariedad [0165] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobasas del compuesto antisentido pueden formar enlaces de hidrógeno con las nucleobasas correspondientes del ácido nucleico diana, de manera que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición 30 antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina). [0166] Un compuesto antisentido puede hibridar más de uno o más segmentos de un ácido nucleico de huntingtina de tal manera que segmentos que intervienen o adyacentes no están involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla). 35 [0167] Los compuestos antisentido descritos en este documento, o una porción específica del mismo, son, o son por lo menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% complementarias a un ácido nucleico de huntingtina, una región diana, el segmento diana, o parte especificada de la misma. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede 40 determinar usando métodos de rutina. [0168] Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobasas del compuesto antisentido son complementarios con una región diana, y por lo tanto hibridan específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobasas no complementarias restantes pueden ser agrupadas o 45 intercaladas con nucleobasas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con bases nitrogenadas complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que es de 18 nucleobasas de longitud que tiene 4 (cuatro) bases nitrogenadas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completas con el ácido nucleico diana tendría 77,8% de complementariedad en general con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede 50 determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamiento local básico) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410;. Zhang y Madden, Genome Res, 1997, 7, 649 656). Porcentaje de homología, la identidad de secuencia o la complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración 55 predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489). [0169] Los compuestos antisentido divulgados en el presente documento, o partes especificadas de la misma, son totalmente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o parte especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de 60 huntingtina, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en este documento, "totalmente complementaria" significa cada nucleobasa de un compuesto antisentido es capaz de apareamiento de bases precisa con las nucleobasas correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobasas es totalmente complementario a una secuencia diana que es de 400 nucleobasas de longitud, siempre que hay una correspondiente porción de 20 nucleobasas del ácido nucleico diana 65 que es totalmente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también se puede utilizar 18en referencia a una porción específica del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobasas de un compuesto antisentido de 30 nucleobasas puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que es de una longitud de 400 nucleobasas. La porción de 20 nucleobasas del oligonucleótido de 30 nucleobasas es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una parte de 20 nucleobasas correspondientes en la que cada nucleobasa es complementaria a la porción de 20 nucleobasas del 5 compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobasas puede o puede no ser totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobasas restantes del compuesto antisentido también son complementarios a la secuencia diana. [0170] La ubicación de una nucleobasa no complementaria puede estar en el extremo 3' o extremo 5' del compuesto 10 antisentido. Alternativamente, la base nitrogenada o nucleobasas no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobasas no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobasa no complementaria se encuentra en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer. 15 [0171] En ciertos casos, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobasas de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobasa no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o parte especificada del mismo. 20 [0172] En ciertos casos, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobasas de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobasa no complementaria(s) con relación a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o parte especificada del mismo. 25 [0173] Los compuestos antisentido descritos en este documento también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, "parte" se refiere a un número definido de nucleobasas contiguas (es decir, enlaces) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobasas contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobasas 30 de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una parte de nucleobasa 12 de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una parte de nucleobasa 15 de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos un 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o parte más nucleobasa de un segmento diana, o un rango definido por dos de estos valores. 35 Identidad [0174] Los compuestos antisentido descritos en este documento también pueden tener una identidad de porcentaje definida a una secuencia particular de nucleótidos, SEQ ID NO, o un compuesto representado por un número Isis 40 específico, o porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de nucleobasa de emparejamiento. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita sería considerada idéntica a la secuencia de ADN ya que tanto uracilo como timidina se emparejan con adenina. Se contemplan las versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en este documento, así como compuestos 45 que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido descritos también en este documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersadas en todo el compuesto antisentido. La identidad de porcentaje de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen apareamiento idéntico de bases con respecto a la secuencia a la que se está comparando. 50 [0175] Los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a una o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NOs, o una porción del mismo, descritos en este documento. Modificaciones 55 [0176] Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La parte de nucleobasa (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar vinculado al resto de hidroxilo del azúcar 2', 3' o 60 5'. Los oligonucleótidos se forman a través de la unión covalente de los nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos de fosfato se conocen comúnmente como la formación de las uniones entre nucleósidos del oligonucleótido. [0177] Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en internucleosıdicos 65 vínculos, restos de azúcar, o nucleobasas. Compuestos antisentido modificados se prefieren a menudo sobre las 19formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, la captación celular mejorada, afinidad aumentada para el ácido nucleico diana, mayor estabilidad en presencia de nucleasas, o aumento de la actividad inhibitoria. [0178] Nucleósidos químicamente modificados se pueden emplear también para aumentar la afinidad de unión de 5 un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, los resultados comparables a menudo se pueden obtener con compuestos antisentido cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados. Uniones entre nucleósidos modificados 10 [0179] La unión entre nucleósidos de origen natural de ARN y ADN es un enlace de fosfodiéster 3’ a 5’. Los compuestos antisentido que tienen una o más uniones entre nucleósidos modificados, es decir, de origen no natural, se seleccionan a menudo frente a compuestos antisentido que tienen uniones entre nucleósidos de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una mayor absorción celular, una mayor afinidad para los 15 ácidos nucleicos diana, y el aumento de estabilidad en presencia de nucleasas. [0180] Los oligonucleótidos que tienen enlaces entre nucleósidos modificados incluyen uniones entre nucleósidos que retienen un átomo de fósforo, así como uniones entre nucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Uniones entre nucleósidos que contienen fósforo representativo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, 20 metilfosfonatos, fosforamidato, y fosforotioatos. Los métodos de preparación de las uniones que contienen fósforo y que no tienen fósforo son bien conocidos. [0181] Los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden una o más uniones entre nucleósidos modificados. En ciertos casos, las uniones entre nucleósidos modificados son enlaces de 25 fosforotioato. En ciertos casos, cada enlace entre nucleósidos de un compuesto antisentido es un enlace fosforotioato internucleosídico. Restos de azúcar modificados 30 [0182] Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en el que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados de azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa mejorada, aumento de afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertos casos, nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificada. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes 35 (incluyendo grupos sustituyentes 5’ y 2', puenteado de átomos de anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), sustitución del átomo de anillo de oxígeno de ribosilo con S, N(R), o C(R1)(R)2 (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen 2’F-5'-nucleósido sustituido por metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 Publicado el 08/21/08 por otros nucleósidos sustituido 5’,2'-bis divulgados) o sustitución del átomo de oxígeno del anillo de 40 ribosilo con S con una sustitución adicional en las posiciones 2' (véase solicitud de patente de EE.UU. US2005-0130923, publicada el 16 de junio, 2005) o, alternativamente, 5'-sustitución de un BNA (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 BNA Publicada el 22/11/07 donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o un 5'-vinilo). 45 [0183] Ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcares modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo sustituido o alquilo C1-C10 no sustituido. 50 [0184] Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNAs) incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre la átomos de anillo de ribosilo 4' y 2'. Los compuestos antisentido descritos en este documento incluyen uno o más nucleósidos BNA en el que el puente comprende una de las fórmulas: 4’-(CH2)-O-2' (LNA); 4’-(CH2)-S-2'; 4’-(CH2)-O-2' (LNA); 4’-(CH2) 2-O-2' (ENA); 4’-C(CH3)2-O-2' (véase PCT/US2008/068922); 4’-CH(CH3)¬-O-2' y 4’-55 C¬H(CH2OCH3)¬-O-2' (véase la patente de EE.UU. 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4’-CH2-N(OCH3)2' (véase el documento PCT/US2008/064591); 4’-CH2-ON(CH3)2' (véase la solicitud de patente de EE.UU. US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre del 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2' (véase la patente 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(CH3)-2' 4'-CH2-C¬(=CH2)-2’ (véase el documento PCT/LTS2008/066154); y en el que R es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector. Cada uno de los anteriores BNAs incluyen 60 varias configuraciones estereoquímicas de azúcar incluyendo, por ejemplo α-L-ribofuranosa y β-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226). [0185] En ciertos casos, los nucleósidos se modifican por sustitución del anillo de ribosilo con un sustituto de azúcar. Dicha modificación incluye, sin limitación, la sustitución del anillo de ribosilo con un sistema de anillo sustituto (al que 65 a veces se hace referencia como análogos de ADN), tal como un anillo morfolino, un anillo ciclohexenilo, un anillo de 20ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo tales como uno que tiene una de las fórmulas: 5 10 [0186] Muchos otros sistemas de anillo biciclo y el azúcar triciclo sustituto también son conocidos en la técnica que se puede utilizar para modificar los nucleósidos para la incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillo pueden someterse a diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad. 15 [0187] Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos para los expertos en la técnica. [0188] En nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobasas (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana apropiada de ácido nucleico. 20 [0189] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es de 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados de 2’-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. 25 Nucleobasas modificadas [0190] Modificaciones o sustituciones de nucleobasa (o base) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobasas no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto nucleobasas 30 naturales como modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobasas pueden impartir estabilidad nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa para compuestos antisentido. Las nucleobasas modificadas incluyen nucleobasas sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobasas, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un 35 ácido nucleico diana. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han demostrado aumentar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico mediante 0,6-1,2°C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278). [0191] Nucleobasas no modificadas adicionales incluyen citosina 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2-40 aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C ≡ C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-adeninas y guaninas sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-sustituidos uracilos y citosinas, 7-metilguanina 45 y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-deazaguanina y 3-desazaadenina. [0192] Los restos de base heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se sustituye con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. 50 Nucleobasas que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen 5-sustituidas pirimidinas, 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y O-6 purinas sustituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. [0193] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden 55 una o más nucleobasas modificadas. En ciertos casos, los oligonucleótidos antisentido de hueco ensanchado dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden uno o más nucleobasas modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobasa modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina. 60 Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas [0194] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con la sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones farmacéuticas o formulaciones. Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitado a, la 65 vía de administración, extensión de la enfermedad, o la dosis a administrar. 21[0195] El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente farmacéuticamente aceptable o vehículo adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para ser entregado parenteralmente. En consecuencia, empleada en los métodos descritos en este documento es una composición farmacéutica compuesta de un compuesto 5 antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. [0196] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales 10 farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) la metabolito o residuo del mismo biológicamente activo. De acuerdo con ello, por ejemplo, la divulgación también se señala a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero 15 no se limitan a, sodio y sales de potasio. [0197] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinde por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo. 20 Compuestos antisentido conjugados [0198] Los compuestos antisentido pueden unirse covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Grupos 25 conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos lipídicos. Grupos conjugadas adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, ácido fólico, azina fentermina, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. [0199] Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores que 30 generalmente están unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en grupos estabilizadores están estructuras de capitalización. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene terminales de ácido nucleico de la degradación de exonucleasa, y puede ayudar en la entrega y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el 5’-extremo (5'-tapa), o en el extremo 3'-extremo (3'-tapa), o puede 35 estar presente en ambos extremos. Estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas abásicas desoxi invertidas. Además, grupos estabilizantes 3' y 5' que se pueden utilizar para limitar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003. 40 Cultivo de células y tratamiento de compuestos antisentido [0200] Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o expresión de ácidos nucleicos de huntingtina se pueden ensayar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizadas para este tipo de análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, la American Type Culture Collection, 45 Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con el proveedor de instrucciones usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Tipos celulares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep 3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2. 50 Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido [0201] Se describen aquí procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden ser modificados adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido. 55 [0202] En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido, cuando las células alcanzan aproximadamente el 60 a 80% confluencia en cultivo. [0203] Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la transfección de lípidos catiónicos reactivo LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido 60 se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleótido antisentido. [0204] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye 65 LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 222000® en OPTI-MEM® 1 medio de suero reducido (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración LIPOFECTAMINE® que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleótido antisentido. [0205] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® 5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en OPTI-MEM® 1 medio de suero reducido (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración Cytofectin® que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleótido antisentido. [0206] Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la 10 electroporación. [0207] Las células se tratan con los oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento de oligonucleótidos antisentido, en el que el ARN de tiempo o los niveles de proteína de ácidos nucleicos diana se miden por métodos conocidos en la técnica y se describen en este 15 documento. En general, cuando los tratamientos se llevan a cabo en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados. [0208] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular en particular son bien 20 conocidos en la técnica. Oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que van de 1 nM a 300 nM cuando se transfecta con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectina o Citofectina. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más altas que van desde 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación. 25 Aislamiento de ARN [0209] El análisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos recomendados 30 por el fabricante. Análisis de inhibición de los niveles diana de expresión [0210] La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de huntingtina se puede ensayar en una 35 variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción de cadena de polimerasa competitiva (PCR), o PCR en tiempo real cuantitativa. Análisis de ARN puede llevarse a cabo en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. PCR en tiempo real cuantitativa puede realizarse convenientemente usando el sistema de 40 detección de secuencia ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 disponible comercialmente, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Análisis de PCR en tiempo real cuantitativa de niveles de ARN diana 45 [0211] La cuantificación de los niveles de ARN diana puede realizarse por PCR cuantitativa en tiempo real usando el ABI PRISM® 7600, 7700, o 7900 del sistema de detección de secuencias (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con el fabricante de las instrucciones. Métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica. 50 [0212] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (TI), que produce ADN complementario (ADNc) que se utiliza entonces como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. El TI y las reacciones de PCR en tiempo real se llevan a cabo secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Reactivos TI y PCR en tiempo real se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Reacciones de TI, PCR en tiempo real se llevan a cabo por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. 55 [0213] Cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan utilizando ya sea el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tales como la ciclofilina A, o mediante la cuantificación de ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, al ejecutarse simultáneamente con la diana, por multiplexación, o por separado. El ARN total se 60 cuantificó usando el reactivo de cuantificación del ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación del ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, LJ, et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) se utiliza para medir la fluorescencia RIBOGREEN®. 65 [0214] Las sondas y cebadores se diseñan para hibridar con un ácido nucleico de huntingtina. Los métodos para el 23diseño de sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software tal como PRIMER EXPRESS® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA). El análisis de niveles de proteína 5 [0215] La inhibición antisentido de ácido nucleico de huntingtina se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína huntingtina. Los niveles de proteína de huntingtina se pueden evaluar o cuantificar de una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos de proteína cuantitativos, ensayos de actividad de la proteína (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), 10 inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden ser identificados y obtenidos a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar a través de métodos monoclonales o policlonales convencionales de generación de anticuerpos bien conocidos en la técnica. Anticuerpos útiles para la detección de huntingtina humana y de rata están disponibles comercialmente. 15 En las pruebas in vivo de los compuestos antisentido [0216] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se ponen a prueba en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de huntingtina y producir cambios fenotípicos. Las pruebas pueden 20 llevarse a cabo en animales normales, o en modelos de enfermedad experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías parenterales de administración. Tras un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, ARN se aisló de tejido y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico de huntingtina. También se miden los cambios en los niveles de proteína huntingtina. 25 Ciertos compuestos [0217] Aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y composición de columna vertebral se ensayaron para determinar su efecto sobre el ARNm de huntingtina humana in 30 vitro en varios tipos de células. Los nuevos compuestos se compararon con unos doscientos cincuenta compuestos diseñados previamente incluyendo ISIS 387916 que previamente se ha determinado que son uno de los compuestos antisentido más potentes in vitro (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos Nos. 2008/0039418 y 2007/0299027 de los alrededor de mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño, se seleccionaron unos sesenta compuestos para estudio adicional basado en in vitro potencia en comparación con ISIS 35 387916. los compuestos seleccionados fueron probados para la tolerabilidad sistémica (véase el Ejemplo 3) y la actividad y tolerabilidad en el cerebro de ratones BACHD (véase el Ejemplo 4) en comparación con ISIS 388241 e ISIS 387916 previamente diseñados. A partir de estos estudios, los compuestos que tienen una secuencia de nucleobasa de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 o 32 fueron seleccionadas como de alta tolerabilidad y alta potencia 40 in vivo. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4867, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 o 4928-4947 de la SEC ID NO: 1. En ciertos casos, los compuestos destinados a las 45 regiones enumeradas, como se describe adicionalmente en este documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una parte nucleobasa de la secuencia indicada en las SEQ ID NOs, como se describe adicionalmente en este documento. En ciertos casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tienen una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas pueden ser de diversas longitudes, como se describe adicionalmente en este documento, y pueden tener uno de varios motivos, como se 50 describe adicionalmente en este documento. En ciertos casos, un compuesto de direccionamiento de una región o tiene una porción de nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas tiene la longitud y el motivo específico como se indica por ISIS NOs: ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 451541, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 55 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, o ISIS 444663. [0218] Los compuestos descritos anteriormente que tienen una alta potencia y tolerabilidad in vivo se ensayaron después por inyección en bolo del SNC en rata para evaluar más la neurotoxicidad (véase el Ejemplo 5), junto con 60 varios compuestos adicionales que tienen una secuencia nucleobasa de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 7, 8, 11, 16, 17. De estas, diez compuestos que tienen una secuencia de nucleobasa de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32 o 13 eran seleccionados por tener una alta tolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, o 5809-5829 de SEQ ID NO: 1. En ciertos 65 casos, los compuestos destinados a las regiones enumeradas, como se describe adicionalmente en este 24documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una parte nucleobasa de la secuencia indicada en las SEQ ID NOs, descritas adicionalmente en este documento. En ciertos casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tiene una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas pueden ser de diversas longitudes, como se describe adicionalmente en este documento, y pueden tener uno de varios motivos, como se describe adicionalmente en este documento. En ciertos casos, un compuesto de 5 direccionamiento de una región o que tiene una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas tiene la longitud y el motivo específico como se indica por ISIS NOs: ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, e ISIS 444661. Los compuestos seleccionados se compararon con el compuesto ISIS 388241 previamente diseñado por la administración ICV en ratones BACHD. 10 [0219] Los estudios adicionales se analizaron después mediante compuestos descritos anteriormente como de alta potencia y tolerabilidad in vivo. Los estudios adicionales fueron diseñados para evaluar más a fondo la neurotoxicidad. Los estudios incluyeron la administración ICV en el ratón de tipo salvaje (véase el Ejemplo 16) y la administración en bolo, en la rata (véase el Ejemplo 17). SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33 fueron seleccionadas 15 por tener una alta neurotolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y desde 4955-4974 de la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, los compuestos destinados a las regiones enumeradas, como se describe adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una parte nucleobasa de la secuencia indicada en las SEQ ID NOs, como se describe adicionalmente en este documento. En 20 ciertos casos, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tiene una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas pueden ser de diversas longitudes, como se describe adicionalmente en este documento, y pueden tener uno de varios motivos, como se describe adicionalmente en este documento. En ciertos casos, un compuesto dirigido a una región o que tiene una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas tiene la longitud y el motivo específico como se indica por ISIS 25 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444652 e ISIS 436689. [0220] Por consiguiente, en este documento se describen compuestos antisentido con características mejoradas. Se describe en este documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado tal como se describe adicionalmente en este documento dirigido a o hibridizable específicamente con la región de nucleótidos de SEQ ID 30 NO: 1. [0221] En ciertas realizaciones, los compuestos como se describe en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos una de un CI50 in vitro de menos de 7 uM, a menos de 6 uM, a menos de 5, uM, a menos de 4 uM, a menos de 3 uM, a menos de 2 uM, a menos de 1 uM cuando se entrega a una línea celular de fibroblastos 35 humanos como descrito en este documento o un ED50 de menos de 10 µg, menos de 9 µg, a menos de 8 µg, menos de 7,5 µg, menos de 7,4 µg, menos de 7,0 µg, menos de 6 µg, menos de 5 µg, menos de 4 µg, menos de 3 µg, o menos de 2 µg por inyección en bolo. Como se describe aquí, la infusión ICV puede resultar en 3 a 4 valores de ED50 veces más altas para los compuestos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos como se describen aquí son altamente tolerables como se demuestra por tener al menos uno de un 40 aumento un valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces, o 2 veces sobre los animales tratados con solución salina; un incremento en el hígado, el bazo o el peso del riñón de no más de 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%; o un aumento de los niveles de AIF1 por no más de 350%, 300%, 275%, 250% 200%, 150% o 100% sobre el control. 45 Ciertas indicaciones [0222] Se describe en el presente documento procedimientos de tratamiento de un individuo que comprende la administración de una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertos casos, el individuo tiene la enfermedad de Huntington. 50 [0223] Como se muestra en los ejemplos siguientes, los compuestos dirigidos a huntingtina como se describe aquí se ha demostrado para reducir la gravedad de los síntomas fisiológicos de la enfermedad de Huntington. En algunos de los experimentos, los compuestos redujeron la tasa de degeneración, por ejemplo, los animales continuaron a experimentar síntomas, pero los síntomas fueron menos graves en comparación con los animales no tratados. En 55 otro de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen ser el resultado en la regeneración de la función en el tiempo; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentó síntomas menos severos que los que se administran los compuestos durante un periodo de tiempo más corto. Como se discutió anteriormente, la enfermedad de Huntington es una enfermedad degenerativa con una progresión tipificada por aumento de la severidad de los síntomas con el tiempo. La capacidad de los compuestos ejemplificados a 60 continuación para restaurar la función, por tanto, demuestra que los síntomas de la enfermedad pueden ser invertidos mediante el tratamiento con un compuesto como se describe en este documento. [0224] Por consiguiente, en el presente documento dan a conocer métodos para mejorar un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington en un sujeto en necesidad del mismo. Se describe un método para reducir la tasa de 65 aparición de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. También se describe un método para reducir la 25gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. También se describe un método para la regeneración de la función neurológica, como se muestra por una mejora de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. En tales casos, los métodos comprenden la administración a un individuo en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de huntingtina. 5 [0225] La enfermedad de Huntington se caracteriza por numerosos síntomas físicos, neurológicos, psiquiátricos, y/o periféricos. Cualquier síntoma conocido para un experto en la técnica que se asocia con la enfermedad de Huntington se puede mejorar o modular de otra manera como se ha expuesto anteriormente en los métodos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste de inquietud, falta de coordinación, movimientos iniciado involuntariamente, movimientos involuntariamente 10 incompletos, marcha inestable, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anormal, la inestabilidad, las expresiones faciales anormales, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, convulsiones, y trastornos del sueño. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en la planificación, alteración de la flexibilidad, la alteración de pensamiento abstracto, deterioro de la adquisición de reglas, deterioro de la iniciación de las acciones apropiadas, deterioro de la inhibición de las acciones 15 inadecuadas, problemas de memoria a corto plazo, alteración de la memoria a largo plazo, paranoia, desorientación, confusión, alucinaciones y demencia. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, embotamiento afectivo, egocentrismos, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideación suicida. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste de masa reducida cerebral, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, intolerancia 20 a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular. [0226] En ciertas realizaciones, el síntoma es la inquietud. En ciertas realizaciones, el síntoma es la falta de coordinación. En ciertas realizaciones, el síntoma consiste en movimientos iniciados involuntariamente. En ciertas realizaciones, el síntoma es involuntariamente movimientos sin terminar. En ciertas realizaciones, el síntoma es 25 marcha inestable. En ciertas realizaciones, el síntoma es la corea. En ciertas realizaciones, el síntoma es la rigidez. En ciertas realizaciones, el síntoma son movimientos de contorsión. En ciertas realizaciones, el síntoma es la postura anormal. En ciertas realizaciones, el síntoma es la inestabilidad. En ciertas realizaciones, el síntoma es expresiones faciales anormales. En ciertas realizaciones, el síntoma es la dificultad de mascar. En ciertas realizaciones, el síntoma es la dificultad para la deglución. En ciertas realizaciones, el síntoma es la dificultad para 30 hablar. En ciertas realizaciones, el síntoma es convulsiones. En ciertas realizaciones, el síntoma es trastornos del sueño. [0227] En ciertas realizaciones, el síntoma es la planificación deteriorada. En ciertas realizaciones, el síntoma es deterioro de la flexibilidad. En ciertas realizaciones, el síntoma es alteración del pensamiento abstracto. En ciertas 35 realizaciones, el síntoma es deterioro de adquisición de reglas. En ciertas realizaciones, el síntoma es inicio alterado de acciones apropiadas. En ciertas realizaciones, el síntoma es deterioro de la inhibición de las acciones inadecuadas. En ciertas realizaciones, el síntoma es deterioro de la memoria a corto plazo. En ciertas realizaciones, el síntoma es deterioro de la memoria a largo plazo. En ciertas realizaciones, el síntoma es paranoia. En ciertas realizaciones, el síntoma es desorientación. En ciertas realizaciones, el síntoma es confusión. En ciertas 40 realizaciones, el síntoma es alucinación. En ciertas realizaciones, el síntoma es la demencia. [0228] En ciertas realizaciones, el síntoma es la ansiedad. En ciertas realizaciones, el síntoma es la depresión. En ciertas realizaciones, el síntoma es embotamiento afectivo. En ciertas realizaciones, el síntoma es egocentrismo. En ciertas realizaciones, el síntoma es la agresión. En ciertas realizaciones, el síntoma es un comportamiento 45 compulsivo. En ciertas realizaciones, el síntoma es la irritabilidad. En ciertas realizaciones, el síntoma es ideación suicida. [0229] En ciertas realizaciones, el síntoma es masa cerebral reducida. En ciertas realizaciones, el síntoma es la atrofia muscular. En ciertas realizaciones, el síntoma es la insuficiencia cardíaca. En ciertas realizaciones, el síntoma 50 es intolerancia a la glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma es la pérdida de peso. En ciertas realizaciones, el síntoma es la osteoporosis. En ciertas realizaciones, el síntoma es la atrofia testicular. [0230] En ciertas realizaciones, los síntomas de la enfermedad de Huntington pueden ser cuantificables. Por ejemplo, la osteoporosis se puede medir y se cuantificó mediante, por ejemplo, exploraciones de densidad ósea. 55 Para este tipo de síntomas, en ciertas realizaciones, el síntoma se puede reducir en aproximadamente un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o de un rango definido por dos de estos valores. [0231] Se describe en el presente documento procedimientos de tratamiento de un individuo que comprende la administración de una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertos casos, el individuo 60 tiene la enfermedad de Huntington. [0232] En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un resultado de ácido nucleico de huntingtina en la reducción de la expresión de huntingtina en al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o de un rango definido por dos de estos valores. 65 26[0233] En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a la huntingtina se utilizan para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible a la enfermedad de Huntington. [0234] Los métodos descritos en este documento incluyen la administración de un compuesto que comprende un 5 oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobasas contiguas tal como se describe en el presente documento de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 o 32. En ciertos casos, los métodos descritos en el presente documento incluyen la administración de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobasas contiguas tal como se describe en el presente documento de una secuencia indicada en 10 SEQ ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33. Administración [0235] En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento se 15 administran por vía parenteral. [0236] En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos infundidos se entregan con una bomba. En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por inyección. 20 [0237] En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones se entregan al SNC. En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones se entregan al líquido cefalorraquídeo. En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones se administran al parénquima cerebral. En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones se entregan a un animal mediante la administración intratecal, o la administración intracerebroventricular. La 25 distribución amplia de compuestos y composiciones, que se describe en este documento, dentro del sistema nervioso central puede lograrse con administración intraparenquimatosa, la administración intratecal, o la administración intracerebroventricular. [0238] En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por inyección. La inyección se puede administrar con 30 una jeringa o una bomba. En ciertas realizaciones, la inyección es una inyección en bolo. En ciertas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido, tal como el cuerpo estriado, núcleo caudado, la corteza, el hipocampo y el cerebelo. [0239] La concentración efectiva media (CE50) de un compuestos antisentido para inhibir la expresión del ARNm de 35 la huntingtina se calculó después de que cualquiera de infusión ICV o inyección en bolo (ver Ejemplos 9 y 10). La CE50 para el compuesto después de la inyección intraestriatal se determinó que era de 0,45 µg/g. La CE50 después de la administración ICV se determinó que era 26,4 µg/g. [0240] Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la entrega de un compuesto o composición descrita en el presente 40 documento pueden afectar el perfil farmacocinético del compuesto o composición. En ciertas realizaciones, la inyección de un compuesto o composición descrita en el presente documento, a un tejido diana mejora el perfil farmacocinético del compuesto o composición en comparación con la infusión del compuesto o composición. En una cierta realización, la inyección de un compuesto o composición mejora la potencia en comparación con amplia difusión, requiriendo menos del compuesto o composición para lograr farmacología similar. En ciertas realizaciones, 45 la farmacología similar se refiere a la cantidad de tiempo que un ARNm diana y/o proteína diana se regula hacia abajo (por ejemplo, duración de la acción). En ciertas realizaciones, los métodos de localización específicamente un agente farmacéutico, tal como mediante inyección en bolo, disminuye concentración mediana eficaz (EC50) por un factor de aproximadamente 50 (por ejemplo, 50 veces menos concentración en el tejido se requiere para lograr el mismo o similar efecto farmacodinámico). En ciertas realizaciones, métodos de localización específica de un agente 50 farmacéutico, tal como mediante inyección en bolo, disminuye concentración mediana eficaz (EC50) por un factor de 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico en un compuesto antisentido como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas enbodiments, el tejido diana es el tejido cerebral. En ciertas enbodiments el tejido diana es el tejido estriatal. En ciertas realizaciones, la disminución de EC50 es deseable ya que reduce la dosis requerida para lograr un resultado farmacológico en un paciente en necesidad del 55 mismo. [0241] La vida media de oligonucleótidos gapmer MOE en el tejido cerebral es de unos 20 días (véanse los Ejemplos 9-11). La duración de la acción tal como se mide por la inhibición de la ARNm de huntingtina se prolonga en el cerebro (véase los Ejemplos 9 y 10). La infusión broventricular Intracerebroventricular de oligonucleótidos 60 antisentido durante 2 semanas como resulta en la inhibición del ARNm de la huntingtina por al menos 50% en el tejido del cuerpo estriado de los ratones BACHD para al menos 91 días después de la terminación de la dosificación. La administración por inyección en bolo dio lugar a una duración de acción similar. [0242] En ciertas realizaciones, la entrega de un compuesto o composición, como se describe en el presente 65 documento, a SNC resulta en regulación hacia abajo en 47% de un ARNm diana y/o proteína diana durante al 27menos 91 días. En ciertas realizaciones, la entrega de un compuesto o composición resulta en al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60 %, al menos 65%, al menos el 70%, o al menos el 75% regulación hacia abajo de un ARNm diana y/o proteína diana durante al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días, al menos 100 días, al menos 110 días, al 5 menos 120 días. En ciertas realizaciones, la entrega al SNC es por administración intraparenquimatosa, la administración intratecal, o administración erebroventricular intratable. [0243] En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido se suministra por inyección o infusión una vez al mes, cada dos meses, cada 90 días, cada 3 meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año. 10 Ciertas terapias de combinación [0244] En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos. En ciertas realizaciones, uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados 15 para tratar la misma enfermedad, trastorno, o condición como las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas formas de realización, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad diferente, trastorno o condición como las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, tales uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones 20 farmacéuticas como se describe aquí. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinatorio. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico. 25 [0245] En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una única 30 formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más agentes farmacéuticos se preparan por separado. [0246] En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que pueden ser co-administrados con una composición farmacéutica incluyen agentes antipsicóticos, tales como, por ejemplo, haloperidol, clorpromazina, clozapina, 35 quetapina y olanzapina; agentes antidepresivos, tales como, por ejemplo, la fluoxetina, clorhidrato de sertralina, venlafaxina y nortriptilina.; agentes tales como, por ejemplo, benzodiacepinas, clonazepam, paroxetina, venlafaxina, y beta-bloqueadores tranquilizantes; agentes estabilizadores del humor tales como, por ejemplo, litio, valproato, lamotrigina, y carbamazepina; agentes paralizantes, tales como, por ejemplo, toxina botulínica; y/u otros agentes experimentales incluyendo, pero no limitados a, tetrabenazina (Xenazina), creatina, conezima Q10, trehalosa, ácidos 40 docosahexanoicos, ACR16, etilo-EPA, atomoxetina, citalopram, dimebon, memantina, fenilbutirato de sodio, ramelteon, ursodiol, ziprexa, xenasina, tiaprida, riluzol, amantadina, [123I] MNI-420, atomoxetina, tetrabenazina, digoxina, detrometorfano, warfarina, alprozam, ketoconazol, omeprazol, y minociclina. EJEMPLOS 45 Divulgación no limitativa e incorporación por referencia [0247] Mientras que ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven solamente 50 para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no están destinados a limitar los mismos. Ejemplo 1: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a secuencias del gen de la huntingtina humana [0248] Aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y 55 composición de columna vertebral dirigidos a la secuencia del gen de la huntingtina humana se ensayaron para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro en varios tipos de células. Estos gapmers fueron diseñadas más con uniones entre nucleósidos que son o bien sólo enlaces fosforotioatos (descritos en la Tabla 1) o que son enlaces de fosforotioato y fosfodiéster (descritos en la Tabla 5). Un número de los oligos de nuevo diseño y dos oligonucleótidos de referencia (previamente diseñados y descritos) se proporcionan en las Tablas 1 y 5. 60 Gapmers con uniones de nucleósidos completamente de fosforotioato [0249] Algunos de los compuestos que se presentan en la Tabla 1 tienen un motivo de 5-10-5 MOE, 6-8-6 MOE, o 5-8-5 MOE. Los 5-10-5 gapmers tienen veinte nucleósidos enlazados, en el que el segmento central hueco tiene diez 65 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que tienen cinco 28nucleósidos cada uno. El gapmer 6-8-6 tiene veinte nucleósidos enlazados, en el que el segmento central hueco tiene ocho 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que tienen seis nucleósidos cada uno. Los 5-8-5 gapmers tienen dieciocho nucleósidos enlazados, en el que el segmento central hueco tiene ocho 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada uno. Para todos los gapmers enumerados en la Tabla 1, cada nucleósido en el 5 segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Las uniones entre nucleósidos a través de cada gapmer son uniones entre nucleósidos de fosforotioato (P = S). Todas las citosinas en cada gapmer son 5-metilcitosinas. Cada gapmer en la Tabla 1 se dirige a la SEQ ID NO: 1 (GenBank No. de Acceso NM_002111.6) o SEC Nº: 2 (GenBank No. de Acceso NT_006081.17 truncado de los nucleótidos 462000 a 634000). 'El sitio de inicio' indica el 5’-más nucleótidos a los que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'El 10 sitio de parada' indica el más nucleótido 3' al que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. Tabla 1 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0250] La complementariedad de los gapmers de la Tabla 1 con el ratón, mono rhesus y las secuencias del gen de huntingtina de rata se describe adicionalmente en los cuadros 2, 3 y 4. [0251] Los gapmers de la Tabla 2 son complementarios con el ARNm de huntingtina de ratón (GenBank Nº de Acceso NM_010414.1, designado aquí como SEQ ID NO: 3). 'Sitio de inicio diana de ratón' indica el 5'-más 65 nucleótido a los que el gapmer se apunta en el ARNm del ratón. 'Sitio de parada diana de ratón' indica la posición 3’-Oligonucleótidos antisentido quiméricos con uniones entre nucleósidos de fosforotioato dirigidas a secuencias del gen de huntingtina humana (SEQ ID NO: 1 y 2) Sitio de inicio Sitio de parada Diana SEQ ID NO. ISIS Nº.Secuencia (5’ a 3’) Motivo SEQ ID NO.4384 44031 436665TAGCATTCTTATCTGCACGG 5-10-5 64511 45301 436668ACCCGTAACTGAACCAGCTG 5-10-5 74599 46181 419627TTCCCTGAACTGGCCCACTT 5-10-5 84605 46241 419628CTCTGATTCCCTGAACTGGC 5-10-5 94607 46261 444607GCCTCTGATTCCCTGAACTG 5-10-5 104608 46271 419629TGCCTCTGATTCCCTGAACT 5-10-5 114608 46271 444578TGCCTCTGATTCCCTGAACT 6-8-6 114609 46281 436671TTGCCTCTGATTCCCTGAAC 5-10-5 124610 46291 444608ATTGCCTCTGATTCCCTGAA 5-10-5 134617 46361 444615TGGAATGATTGCCTCTGATT 5-10-5 144622 46391 437168GTTTGGAATGATTGCCTC 5-8-5 154679 46981 419630CCAATGATCTGTTTTGAATG 5-10-5 164733 47521 419636GCCTTCCTTCCACTGGCCAT 5-10-5 174813 48321 444618CTGCATCAGCTTTATTTGTT 5-10-5 184814 48331 419637CCTGCATCAGCTTTATTTGT 5-10-5 194823 48421 444627AGCTCTTTTCCTGCATCAGC 5-10-5 204860 48771 437507GTAACATTGACACCACCA 5-8-5 214862 48811 388241CTCAGTAACATTGACACCAC 5-10-5 224868 48871 436684ATGAGTCTCAGTAACATTGA 5-10-5 234925 49441 419640TCCTTGTGGCACTGCTGCAG 5-10-5 244928 49471 419641TTCTCCTTGTGGCACTGCTG 5-10-5 254931 49501 419642TCATTCTCCTTGTGGCACTG 5-10-5 264931 49481 437442ATTCTCCTTGTGGCACTG 5-8-5 274955 49741 436689CGAGACAGTCGCTTCCACTT 5-8-5 284960 49771 437175TGTCGAGACAGTCGCTTC 5-8-5 295801 58201 444584TTGCACATTCCAAGTTTGGC 5-10-5 305807 58261 387916TCTCTATTGCACATTCCAAG 5-10-5 315809 58281 444591TTTCTCTATTGCACATTCCA 5-10-5 325809 58261 437527TCTCTATTGCACATTCCA5-8-5 331446 14652 388817GCAGGGTTACCGCCATCCCC 5-10-5 34101088 101105 2 437441ACCTTATCTGCACGGTTC 5-8-5 35115066 115085 2 436754CTCTCTGTGTATCACCTTCC 5-10-5 36 29más nucleótidos a la que el gapmer se apunta en el ARNm del ratón. 'Sitio de inicio diana humano' indica el 5'-más nucleótido a los que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Sitio de parada diana humano' indica la posición 3'-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Número de desajustes' indica el número de discrepancias entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de ratón. 5 Tabla 2 10 15 20 25 30 35 40 45 [0252] Los gapmers de la Tabla 3 son complementarios con la secuencia genómica de huntingtina de mono rhesus (el complemento de GENBANK No. de Acceso NW_001109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 4). 'Sitio de inicio diana de mono rhesus' indica el 5'-más nucleótido a los que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen de mono rhesus. 'Sitio de parada de mono rhesus' indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen mono rhesus. 50 "Sitio del inicio diana humano' indica el 5'-más nucleótido al cual el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Sitio de parada diana humano' indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Número de desajustes' indica el número de coincidencias erróneas entre el oligonucleótido humano y la secuencia del gen mono rhesus. 55 60 65 La complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato con ARNµMurino (SEQ ID NO: 3) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humana ISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratón Nº de desajustes SEQ ID NO. 4384 4403 1436665434343620 64511 4530 1436668447044891 74599 4618 1419627455845770 84605 4624 1419628456445830 94607 4626 1444607456645850 104608 4627 1419629456745860 114608 4627 1444578456745860 114609 4628 1436671456845870 124610 4629 1444608456945880 134617 4636 1444615457645951 144622 4639 1437168458145982 154679 4698 1419630463846570 164733 4752 1419636469247110 174813 4832 1444618477247910 184814 4833 1419637477347920 194823 4842 1444627478248011 204925 4944 1419640488449030 244928 4947 1419641488749060 254931 4950 1419642489049090 264931 4948 1437442489049070 274955 4974 1436689491449333 285807 5826 1387916576357821 315809 5826 1437527576557821 335809 5828 1444591576557841 32101088 101105 2437441434043572 35 30Tabla 3 5 10 15 20 25 30 35 40 [0253] Los gapmers de la Tabla 4 son complementarios con el ARNm de huntingtina de rata (GENBANK Nº de Acceso NM_024357.2, designado aquí como SEQ ID NO: 5). 'Sitio de inicio diana de rata' indica el 5’-más nucleótidos a los que el gapmer se apunta en el ARNm de rata. 'Sitio de parada diana de rata' indica el extremo 3’-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en el ARNm de rata. ‘Sitio del inicio diana humano’ indica el 5’-más 45 nucleótidos a los que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. ‘Sitio de parada diana humano’ indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Número de desajustes' indica el número de discrepancias entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de rata. 50 55 60 65 La complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato con la secuencia del gen de mono rhesus (SEQ ID NO: 4) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humanaISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratónNº de desajustes SEQ ID NO.4511 4530 143666598182982010 64599 4618 14196271013531013721 84609 4628 14366711022561022753 124610 4629 14446081022571022762 134617 4636 14446151022641022830 144622 4639 14371681022691022860 154679 4698 14196301023261023450 164733 4752 14196361023801023990 174813 4832 14446181050301050490 184814 4833 14196371050311050500 194823 4842 14446271050401050590 204860 4877 14375071050771050941 214862 4881 13882411050791050981 224868 4887 14366841050851051040 234925 4944 14196401068441068630 244928 4947 14196411068471068660 254931 4950 14196421068501068690 264931 4948 14374421068501068670 274955 4974 14366891068741068930 284960 4977 14371751068791068960 295801 5820 14445841253311253500 305807 5826 13879161253371253560 315809 5826 14375271253391253560 335809 5828 14445911253391253580 32101088 101105 243744197904979210 35115066 115085 24367541105181105370 36 31Tabla 4 5 10 15 20 25 30 35 40 Gapmers con fosforotioato mezclado y uniones de nucleósidos de fosfodiéster [0254] Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de la Tabla 5 fueron diseñados como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers 5-10-5 tienen veinte nucleósidos enlazados, en el que el segmento central hueco tiene diez 2'-45 desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Las uniones entre nucleósidos dentro del segmento central hueco, los enlaces que conectan el segmento de diferencia con el segmento de ala 5’ o 3', y los enlaces para 5’-más y 3'-más nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala son enlaces de fosforotioato (P = S); las uniones entre nucleósidos de 50 conectar el resto de los nucleósidos de ambos segmentos de alas 5’ y 3' son enlaces de fosfodiéster; es decir, el gapmer tiene un esqueleto mixto. Todas las citosinas lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. Cada gapmer en la Tabla 5 está dirigido a la secuencia de ARNm humano (GENBANK Nº de Acceso NM_002111.6, designado aquí como SEQ ID NO: 1). 'Sitio de inicio' indica el 5'-más nucleótido al que el gapmer está dirigido en el ARNm humano. 'Sitio de parada' indica el 3'-más nucleótidos al que el gapmer se apunta en el ARNm humano. 55 60 65 La complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato con ARNm de rata (SEQ ID NO: 5) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humanaISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratón Nº de desajustes SEQ ID NO. 4384 4403 143666543434362 1 64511 4530 143666844704489 1 74599 4618 141962745584577 0 84605 4624 141962845644583 0 94607 4626 144460745664585 0 104608 4627 141962945674586 0 114608 4627 144457845674586 0 114609 4628 143667145684587 0 124610 4629 144460845694588 0 134617 4636 144461545764595 1 144622 4639 143716845814598 2 154679 4698 141963046384657 0 164733 4752 141963646924711 0 174813 4832 144461847724791 0 184814 4833 141963747734792 0 194823 4842 144462747824801 1 204925 4944 141964048844903 1 244928 4947 141964148874906 1 254931 4950 141964248904909 1 264931 4948 143744248904907 1 274955 4974 143668949144933 3 285801 5820 144458457575776 3 305807 5826 138791657635782 0 315809 5826 143752757655782 0 335809 5828 144459157655784 0 32101088 101105 243744143404357 2 35 32Tabla 5 5 10 15 [0255] La complementariedad de los gapmers de la Tabla 5 con secuencias de genes de ratones, monos rhesus y gen de huntingtina de ratas se describen adicionalmente en las Tablas 6, 7 y 8. 20 [0256] Los gapmers de la Tabla 6 son complementarios con el ARNm de huntingtina de ratón (GENBANK Nº de acceso NM_010414.1; SEQ ID NO: 3). 'Sitio de inicio diana de ratón' indica el 5’-más nucleótidos a los que el gapmer se apunta en el ARNm del ratón. 'Sitio de parada diana de ratón' indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer se apunta en el ARNm del ratón. ‘Sitio del inicio diana humano’ indica el 5’-más nucleótidos a los que 25 el gapmer se apunta en el ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). ‘Sitio de parada diana humano’ indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer se apunta en el ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). 'Número de desajustes' indica el número de discrepancias entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de ratón. 30 Tabla 6 35 40 45 [0257] Los gapmers de la Tabla 7 son complementarios con la secuencia genómica de mono rhesus huntingtina (el complemento de GENBANK Nº de acceso NW_001109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000; SEQ ID NO: 4). ‘Sitio de inicio diana de mono rhesus’ indica 5’-más nucleótidos al que el gapmer está dirigido en la 50 secuencia del gen de mono rhesus. ‘Sitio de parada diana de mono rhesus’ indica la posición 3’-más nucleótidos a la que el gapmer está dirigido en la secuencia del gen mono rhesus. ‘Sitio del inicio diana humano’ indica el 5’-más nucleótidos a los que el gapmer se apunta en el ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). ‘Sitio de parada diana humano’ indica el 3’-más nucleótidos al que el gapmer se apunta en el ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). 'Número de desajustes' indica el número de discrepancias entre el 55 oligonucleótido humano y la secuencia del gen de mono rhesus. 60 Oligonucleótidos antisentido quiméricos con enlaces internucleosídicos de fosforotioato y fosfato dirigidos a ARNm de huntingtina humana (SEQ ID NO: 1) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humana ISIS No. Secuencia (5’ a 3’) Motivo SEQ ID NO. 4607 4626 1444658GCCTCTGATTCCCTGAACTG 5-10-5 104608 4627 1444659TGCCTCTGATTCCCTGAACT 5-10-5 114609 4628 1444660TTGCCTCTGATTCCCTGAAC 5-10-5 124610 4629 1444661ATTGCCTCTGATTCCCTGAA 5-10-5 134813 4832 1444663CTGCATCAGCTTTATTTGTT 5-10-5 184862 4881 1443139CTCAGTAACATTGACACCAC 5-10-5 225809 5828 1444652TTTCTCTATTGCACATTCCA 5-10-5 324928 4947 1451541TTCTCCTTGTGGCACTGCTG 5-10-5 25La complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato y fosfato mixtos con ARNµMurino (SEQ ID NO: 3) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humanaISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratónNº de desajustes SEQ ID NO. 4607 4626 1444658456645850 104608 4627 1444659456745860 114609 4628 1444660456845870 124610 4629 1444661456945880 134813 4832 1444663477247910 185809 5828 1444652576557841 32 33Tabla 7 5 10 15 [0258] Los gapmers de la Tabla 8 son complementarios con el ARNm de huntingtina de rata (GENBANK Nº de Acceso NM_024357.2; SEQ ID NO: 5). 'Sitio de inicio diana de rata' indica el 5’-más nucleótidos al que el gapmer se apunta en el ARNm de rata. 'Sitio de parada diana de rata' indica el 3’-más nucleótidos al que el gapmer está dirigido en el ARNm de rata. ‘Sitio del inicio diana humano’ indica el 5’-más nucleótidos al que el gapmer se apunta en el 20 ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). ‘Sitio de parada diana humano’ indica la posición 3’-más nucleótidos al que el gapmer se apunta en el ARNm humano (GENBANK número de acceso NM_002111.6). 'Número de desajustes' indica el número de discrepancias entre el oligonucleótido humano y la secuencia de ARNm de rata. 25 Tabla 8 30 35 40 Ejemplo 2: Inhibición antisentido de dosis dependiente del ARNm de huntingtina humana in vitro [0259] Aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño de diversas longitudes, motivos y 45 columna vertebral se ensayaron para determinar su efecto sobre el ARNm de huntingtina humana in vitro en varios tipos de células. Estos compuestos se compararon con unos doscientos cincuenta compuestos diseñados previamente incluyendo el compuesto ISIS 387916 que se determinó previamente que un compuesto de considerable potencia in vivo. Como se muestra en este ejemplo, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ISIS 444661, ISIS 437527, ISIS 50 444584, e ISIS 444652 y ISIS 388241 previamente diseñados se encontró que tenían una potencia similar o mejor que la del compuesto de referencia ISIS 387916 in vitro. A. Fibroblastos GM04281 55 [0260] Cultivos de fibroblastos GM04281 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 500 nM, 1,000 nM, 2,000 nM, 4,000 nM, o 8.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 (secuencia de avance CTCCGTCCGGTAGACATGCT, designado aquí como SEQ ID NO: 37; secuencia inversa 60 GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG, designado aquí como SEQ ID NO: 38; secuencia de sonda TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, designado aquí como SEQ ID NO: 39) se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RiboGreen®. Los resultados se presentan en la Tabla 9 como porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada 65 por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. La complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato y fosfato mixtos con la secuencia del gen de mono rhesus (SEQ ID NO: 4) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humanaISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratónNº de desajustes SEQ ID NO.4609 4628 14446601022561022753 124610 4629 14446611022571022762 134813 4832 14446631050301050490 184862 4881 14431391050791050981 225809 5828 14446521253391253580 32La complementariedad de los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato que tienen vínculos y fosfato mixtos con rata ARNm (SEQ ID NO: 5) Sitio de inicio humano Sitio de parada humano SEQ ID NO. de diana humanaISIS No. Sitio de inicio de ratónSitio de parada de ratónNº de desajustes SEQ ID NO. 4607 4626 1444658456645850 104608 4627 1444659456745860 114609 4628 1444660456845870 124610 4629 1444661456945880 134813 4832 1444663477247910 185809 5828 1444652576557840 32 34[0261] La concentración inhibitoria media máxima (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 9 y se calculó mediante el trazado de las concentraciones de los oligonucleótidos utilizados en comparación con la inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina alcanzada en cada concentración, y observando la concentración de oligonucleótido en el que se logró una inhibición del 50% de la expresión de ARNm de huntingtina en comparación con el control. El CI50se expresa en µM. 5 Tabla 9 10 15 20 [0262] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina de humana in vitro. Fibroblastos GM04281 cultivados se ensayaron en un procedimiento similar, como se describe anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 10 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada 25 por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 10 se expresa en µM. Tabla 10 30 35 [0263] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de 40 huntingtina humana in vitro. Fibroblastos GM04281 cultivados se ensayaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 11 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 11 expresada en µM. 45 Tabla 11 50 55 [0264] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641 e ISIS 436754 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos GM04281 cultivados se ensayaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 12 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de 60 huntingtina, respecto a las células de control sin tratar y demostrar la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 12 expresada en µM. 65 Reducción dependiente de dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281ISIS No. 500 nM 1000 nM2000 nM4000 nM8000 nMCI50(mM) 387916 33 739096971,00 388241 44 708295970,61 419641 26 327190931,06 436665 56 678795960,32 436671 12 356882911,55 436689 10 346180911,89 Reducción dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281ISIS No. 500 nM 1000 nM2000 nM4000 nM8000 nMCI50(mM) 387916 56 849498990,34 388241 58 759498990,23 437507 61 748593930,22 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281ISIS No. 500 nM 1000 nM2000 nM4000 nM8000 nMCI50(mM) 387916 40 618594970,70 388241 51 728694980,41 437507 30 557179821,07 35Tabla 12 5 10 [0265] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos cultivados de GM04281 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 250 nM, 500 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 4.000 nM o 8.000 nM de 15 oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 13 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y 20 demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 13 expresada en µM. Tabla 13 25 30 [0266] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 443139, ISIS 444584, ISIS 444615, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, e ISIS 444661 se pusieron a 35 prueba adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos cultivados GM04281 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1250 nM o 2.500 nM de antisentido oligonucleótido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles 40 de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 14 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los datos presentados son la media de dos experimentos. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 14 se expresa en µM. 45 50 55 60 65 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281ISIS No. 500 nM 1000 nM2000 nM4000 nM8000 nMCI50(mM) 387916 58 759398980,22 388241 40 688595980,73 419641 37 588692950,80 436754 44 626384930,59 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281ISIS No. 250 nM 500 nM 1000 Nm 2000 nM 4000 nM 8000 nM CI50(mM) 387916 10 9 61 85 97 99 0,79 388241 0 18 42 90 98 99 1,08 437507 1 0 32 71 92 98 1.30 36Tabla 14 5 10 15 20 25 [0267] ISIS 387916, ISIS 436671, ISIS 444661, ISIS 419641 e ISIS 436665 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos cultivados GM04281 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 13,6719 nM, 27,3438 nM, 54,6875 nM, 109.375 nM, 218,75 nM, 437,5 nM, 875 nM, 1,750 nM, 3,500 nM, o 7.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un 30 período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 15 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción 35 dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15 expresada en µM. 40 45 50 55 60 65 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281 ISIS No. 156,25 nM 312,5 Nm 625 nM 1250 nM 2.500 nm CI50( µm) 387.916 19 22 44 62 85 0,73 388.241 3 13 24 42 71 1,42 419.628 56 45 59 71 83 0,20 419629 42 38 67 70 89 0,33 419.637 24 17 32 61 77 0,91 436.684 15 28 55 73 85 0,59 443.139 13 45 50 64 81 0,61 444.584 0 0 25 50 74 1,28 444.615 36 35 37 38 70 0,12 444.627 40 38 48 73 87 0,43 444.652 15 28 55 73 85 0,59 444.658 50 54 75 84 96 0,18 444.659 47 61 69 79 93 0,18 444.660 41 61 75 84 95 0,22 444.661 47 59 72 84 96 0,19 37 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 38[0268] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437168 e ISIS 437175 y se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos cultivados GM04281 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 250 nM, 500 nM, 1,000 nM, 2,000 nM, 4,000 nM, y 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto 5 de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 15.1 como porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de dosis mediada de oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.1 expresada 10 en µM. Tabla 15. [0269] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437441 e ISIS 437442 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos GM04281 cultivadas se ensayaron en un procedimiento similar al 15 descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 15.2 como porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.2 se expresa en µM. 20 Tabla 15.2 25 30 [0270] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437175 e ISIS 437527 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Fibroblastos GM04281 cultivadas se ensayaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 15.3 como porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada 35 por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 15.3 se expresa en µM. Tabla 15.3 B. Células A549 40 [0271] Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 se ensayaron para determinar su efecto sobre el ARNm de huntingtina humana in vitro. Las células A549 cultivadas a una densidad de 4.000 células por pocillo fueron transfectadas utilizando reactivo de transfección de lipefectina con 7,4074 nM, 22,222 nM, 66,667 nM, o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se 45 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281 ISIS Nº 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000,0 nM 4000,0 nM 8000,0 nM CI50387.916 22 63 70 83 95 96 0,62 388.241 17 45 65 87 96 97 0,56 437.175 47 31 56 60 79 91 1,19 437.168 32 46 64 81 89 95 0,59 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281 ISIS Nº 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM 8000.0 nM CI50387.916 26 47 58 79 91 95 0,65 388.241 30 52 60 81 94 97 0,55 437.441 25 37 56 69 86 47 0,81 437.442 39 43 47 70 85 50 0.59 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en fibroblastos GM04281 ISIS Nº 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM 8000.0 nM CI50387.916 40 45 47 76 92 96 0,50 388.241 40 37 50 90 96 97 0,80 437.175 48 55 55 63 80 93 0,37 437527 33 52 61 80 86 95 0,52 39aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 16 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los 5 niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 16 se expresa en nM. Tabla 16 10 15 [0272] ISIS 387916, ISIS 388241 e ISIS 437507 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de 20 huntingtina humana in vitro. Las células A549 se cultivaron a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con 250 nM, 500 nM, 1,000 nM, 2,000 nM, 4,000 nM o 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina 25 se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 17 expresada como porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 17 expresada en µM. 30 Tabla 17 35 40 C. Células LLC-MK2 [0273] Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humana se ensayaron para determinar su efecto sobre el ARNm de huntingtina de mono rhesus in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron utilizando 45 electroporación con 625 nM, 1,250 nM, 2,500 nM, 5,000 nM, 10.000 nM, o 20.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebadores humana RTS2686 (secuencia hacia adelante GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA, designada aquí como SEQ ID NO: 40; secuencia inversa AAGGGATGCTGGGCTCTGT, designada aquí como SEQ ID NO: 41; sonda secuencia 50 AGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX, designada aquí como SEQ ID NO: 42) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 18 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido 55 antisentido también se presenta en la Tabla 18 se expresa en µM. 60 65 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en células A549 ISIS Nº 7,4074 nM 22.222 nM 66.667 nM 200.00 nM CI50(nM) 387.916 12 37 76 92 33 419.640 21 45 73 93 27 419.641 34 60 83 96 15 419.642 30 58 85 95 16 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en células A549 ISIS Nº 250 nM 500 nM 1000 nM 2000 nM 4000 nM 8000 nM CI50( µm) 387.916 15 17 25 36 52 75 3,09 388.241 12 22 38 58 77 91 1,43 437507 25 28 38 57 58 76 1,84 40Tabla 18 5 10 15 [0274] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, e ISIS 444607 se pusieron a prueba aún más por su efecto sobre el ARNm de huntingtina mono rhesus in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 se ensayaron en un procedimiento similar al 20 descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 19 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 19 se expresa en µM. 25 Tabla 19 30 35 40 45 50 [0275] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, e ISIS 444661 se pusieron a prueba aún más por su efecto en mono rhesus ARNm de huntingtina in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 se ensayaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 20 como el porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina, 55 respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 20 se expresa en µM. 60 65 Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 ISIS Nº 625 nM 1250 nM 2.500 nm 5000 nM 10000 nM 20000 nM CI50( µm) 388.241 21 12 35 46 46 94 4,1 444.591 37 46 50 52 82 96 1,9 419.641 32 52 69 87 94 97 1,2 444.661 45 59 66 85 91 95 0,8 419.642 6 3 56 81 91 98 2,9 436.665 40 43 70 73 84 89 1,2 436.671 31 50 68 82 90 97 1,2 436.689 24 37 59 74 89 98 1,9 437507 21 15 11 33 55 92 6,4 443139 31 36 37 56 76 97 2,6 Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 ISIS Nº 625,0 nM 1250,0 nM 2500,0 nM 5000,0 nM 10000,0 nM 20000,0 nM CI50 387.916 23 42 57 81 88 96 1,95 388.241 6 12 37 43 62 84 5,32 437.168 72 47 60 78 83 92 1,43 437.175 27 48 36 56 68 78 3,58 437.441 29 34 50 67 56 85 2,43 437507 18 29 18 33 45 66 6,12 437527 36 36 48 57 81 90 2,71 436.684 0 12 24 29 36 49 n.d. 444.578 34 40 65 74 82 87 1,70 444.584 28 38 68 75 90 94 1,69 444.591 25 45 55 74 85 94 1,84 444.607 41 54 76 87 92 94 0,96 nd = CI50no se puede medir para ese compuesto 41Tabla 20 5 10 15 20 [0276] ISIS 387916, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 se pusieron a prueba aún más por su efecto en el ARNm de huntingtina de mono rhesus in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 a una densidad de 3.000 células por pocillo fueron transfectadas utilizando el reactivo de transfección de lipofectina con 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los 25 niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 21 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm 30 de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 21 se expresa en nM. Tabla 21 35 40 45 50 [0277] ISIS 387916, ISIS 419641 e ISIS 436689 se pusieron a prueba aún más por su efecto sobre el ARNm de huntingtina de mono rhesus in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 a una densidad de 3.000 células por pocillo se transfectaron usando el reactivo de transfección de LipofectAMINE2000 con 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 55 nM, o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 22 como porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina, respecto a las 60 células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 22 se expresa en nM. 65 Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 Sin ISIS 625,0 nM 1250,0 nM 2500.0 nM5000,0 nM10000.0 nM 20000.0 nM CI50 387.916 35 44 68 74 90 96 1,35 388.241 23 37 54 56 68 89 2,64 444.608 43 50 64 83 90 95 1,07 444.615 29 45 55 76 90 97 1,67 444.618 30 34 57 73 89 95 1,66 444.627 35 56 76 90 97 98 1,00 444.652 32 55 66 55 92 98 1,23 444.658 50 62 80 90 95 97 0,55 444.659 31 56 68 86 95 97 1,17 444.660 38 49 62 86 89 96 1,26 444.661 41 50 75 68 95 97 0,95 Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 ISIS Nº 6,25 nM 12,5 nM 25.0 nM 50,0 nM 100,0 nM 200,0 nM CI50387.916 1 37 37 53 84 90 35 419.627 0 9 18 45 58 72 75 419.628 9 30 49 63 73 77 31 419629 9 16 40 56 80 85 36 419.630 17 8 43 58 71 81 40 419.636 23 25 38 55 72 78 37 419.637 10 35 31 62 78 76 33 419.640 3 28 39 59 74 87 36 419.641 11 34 50 65 85 87 26 419.642 25 30 49 65 85 88 24 42Tabla 22 5 10 [0278] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436665, ISIS 436671, e ISIS 436689 se pusieron a prueba aún más por su efecto sobre el ARNm de mono rhesus huntingtina in vitro. Las células cultivadas LLC-MK2 a una densidad de 3.000 células por pocillo fueron transfectadas utilizando LIPOFECTINa reactivo de transfección con 4,6875 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM, o 150 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de 15 aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 23 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada 20 por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 23 expresado en nM. Tabla 23 25 30 D. BACHD hepatocitos de ratones transgénicos 35 [0279] Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humana se ensayaron para determinar su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Hepatocitos BACHD de ratón cultivados a una densidad de 10.000 células por pocillo se transfectaron usando el reactivo de transfección citofectina con 7,4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, O 200 nM de oligonucleótido antisentido. 40 Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 24 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la 45 reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los datos presentados son la media de dos experimentos. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 24 expresado en nM. Tabla 24 50 55 60 [0280] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641 y se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Hepatocitos BACHD de ratón cultivados a una densidad de 10.000 células por pocillo se transfectaron usando reactivo de transfección de citofectina con 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de 65 sonda de cebador humano RTS2617 se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 Sin ISIS 6,25 nM 12,5 nM 25 nM 50 nM 100 nM 200 nM CI50(nM) 387.916 0 50 31 68 83 90 47 419.641 28 23 28 50 65 81 74 436.689 16 30 29 48 67 83 69 Dose dependent reduction of huntingtin mRNA in BACHD transgenic murine hepatocytes ISIS No. 7.4074 nM 22.222 nM 66.667 nM 200.00 nM CI50(nM) 387916 8 19 58 89 40 419640 15 30 64 93 33 419641 20 35 73 97 31 419642 3 29 70 96 43 Reducción dependiente de la dosis del ARNm de la huntingtina en células LLC-MK2 ISIS Nº 4,6875 nM 9.375 nM 18,75 nM 37,5 nM 75,0 nM 150,0 nM CI50(nM) 387.916 7 6 38 59 82 91 32 388.241 0 0 5 35 62 81 60 436.665 7 0 36 59 64 69 37 436.671 21 7 35 59 80 86 31 436.689 38 45 45 59 76 86 15 43se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.Los resultados se presentan en la Tabla 25 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 25 se expresa en nM. 5 Tabla 25 [0281] ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, ISIS 436665, ISIS 436671 e ISIS 436689 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre ARNm de huntingtina humana in vitro. Hepatocitos BACHD de ratón cultivados se ensayaron de una manera idéntica como se describe anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla 26 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y 10 demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 26 se expresa en nM. Tabla 26 15 20 25 [0282] ISIS 387916, ISIS 419640, ISIS 419641 e ISIS 419642 se ensayaron adicionalmente por su efecto sobre la ARNm de huntingtina de ratón in vitro. Hepatocitos BACHD de ratón cultivados a una densidad de 20.000 células por 30 pocillo se transfectaron usando el reactivo de transfección citofectina con 6,667 nM, 20 nM, 60 nM, o 180 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de murino conjunto de cebadores RTS2633 (CAGAGCTGGTCAACCGTATCC secuencia hacia adelante, designado aquí como SEQ ID NO: 43; la secuencia inversa GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA, designado aquí como 35 SEQ ID NO: 44; secuencia de sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, designado aquí como SEQ ID NO: 45) se utilizó para medir niveles ARNm. Los niveles de ARNm de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 27 como el porcentaje de inhibición de la ARNm de huntingtina, respecto a las células de control sin tratar, y demuestran la reducción dependiente de la dosis mediada por oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina. El CI50 40 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la Tabla 27 expresado en nM. Tabla 27 45 50 Ejemplo 3: La administración sistémica de oligonucleótidos antisentido contra ARNm huntingtina en ratones 55 BACHD Reducción dependiente de la dosis dela ARNm de huntingtina en BACHD hepatocitos murinos transgénicos ISIS No. 12.5 nM 25 nM 50 Nm 100 nM 200 nM CI50(nM) 387916 0 37 51 78 91 51 388241 0 10 45 70 92 68 419641 17 38 70 88 96 34 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en BACHD hepatocitos murinos transgénicos ISIS No. 12.5 nM 25 nM50 nM100 nM200 nM CI50(nM)387916 19 4864869332 388241 20 3454819338 419641 38 5470859521 436665 32 4067849329 436671 32 4258789132 436689 35 4470889625 Reducción dependiente de la dosis de la ARNm de huntingtina en BACHD hepatocitos murinos transgénicos ISIS No. 6.667 nM 20 nM60 nM180 nMCI50(nM) 387916 15 15689437 419640 4 39739432 419641 16 45819624 419642 23 39759325 44 [0283] De los alrededor de mil setecientos compuestos antisentido de nuevo diseño, se seleccionaron sesenta y seis compuestos basados en in vitro potencia en comparación con ISIS 387916 para realizar pruebas en las pantallas de tolerabilidad sistémica. 5 [0284] ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS y se evaluaron para cambios en los niveles de los diversos marcadores metabólicos, así como la inhibición de la ARNm de huntingtina en el hígado. Los oligonucleótidos antisentido que causaron cambios adversos en el peso corporal, peso de los órganos o en los niveles de marcadores metabólicos fueron considerados inadecuados para su utilización en estudios adicionales. 10 Estudio 1. Tratamiento [0285] Se inyectaron Diecinueve grupos de cuatro ratones BACHD cada uno por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg 15 de ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663 dos veces por semana durante 2 semanas. Un grupo de control de cuatro ratones se inyectó por vía intraperitoneal con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se desangraron para la recogida de plasma, 20 después de lo cual se realizó la dislocación cervical y los órganos recogidos. Análisis de ARN [0286] Se extrajo ARN de tejido de hígado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la 25 huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humanos se midieron utilizando la sonda humana imprimación establecer RTS2617. Los niveles de huntingtina normales de ratón se midieron utilizando la sonda de cebador de ratón fijado RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 28 y 29 y se calcularon como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina humanos y murinos, respectivamente, en relación con el control PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan inhibición significativa de los niveles de ARNm 30 de la huntingtina humana. ISIS 388241 tiene más de tres desapareamientos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murino en comparación con el control. Tabla 28 35 40 45 50 55 60 65 Inhibición de porcentaje de la huntingtina humana ARNm en ratones BACHD ISIS Nº % de inhibición 387.916 82 388.241 52 419629 80 419.637 83 436.684 55 444.578 70 444.584 62 444.591 54 444.607 76 444.608 61 444.615 89 444.618 91 444.627 92 444.652 79 444.658 62 444.659 74 444.660 66 444.661 72 444.663 77 45Tabla 29 5 10 15 20 25 30 Mediciones de peso de los órganos [0287] Los pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 30 como un porcentaje de la solución salina de control normalizado para el peso corporal. 35 Tabla 30 40 45 50 55 60 65 Inhibición de porcentaje de la huntingtina murina ARNm en ratones BACHD ISIS Nº % de inhibición 387.916 77 419629 75 419.637 87 436.684 32 444.578 64 444.584 20 444.591 32 444.607 76 444.608 66 444.615 60 444.618 88 444.627 58 444.652 66 444.658 53 444.659 62 444.660 47 444.661 67 444.663 60 Cambio porcentual en el peso de los órganos de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido ISIS No. HígadoBazoRiñón387916 -5-13+6 388241 -1+14-5 419629 +5+13-12 419637 -6-17-25 436684 -2-3+6 444578 +11+18+1 444584 +8+54+1 444591 +4-4-3 444607 +3+22-8 444608 +6+18-3 444615 +6+1+3 444618 +11+0-2 444627 +3-14+14 444652 -11-4-18 444658 -10-16 444659 +1+15-2 444660 -5+4-6 444661 -1+7-1 444663 +7+10+8 46 Evaluación de la función hepática [0288] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS de la función hepática de los ratones descritos anteriormente, las concentraciones plasmáticas de las transaminasas se midieron usando un analizador químico 5 clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) se expresan en UI/Tierra los resultados se presentan en la Tabla 31. Tabla 31 10 15 20 25 30 35 Estudio 2 40 Tratamiento [0289] Se inyectaron catorce grupos de cuatro ratones BACHD cada uno por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 419581, ISIS 419602, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419640, ISIS 419641 o ISIS 419642 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de cuatro ratones BACHD se inyectó por vía intraperitoneal con 12,5 45 mg/kg de ISIS 387916 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de control de cuatro ratones se inyectó por vía intraperitoneal con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se desangraron para la recogida de plasma, después de lo cual se realizó dislocación cervical y se recogieron los órganos. 50 Análisis de ARN [0290] Se extrajo ARN de tejido de hígado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de huntingtina normales de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda 55 de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 32 y 33 y se calcularon como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el control PBS. 60 65 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función hepática ALTAST PBS 4069 387916 6984 388241 4276 419629 5171 419637 5986 436684 6087 444.578 62 93 444.584 48 76 444.591 39 53 444.607 50 111 444.608 48 75 444.615 74 95 444.618 687. 908 444.627 10 127 444.652 54 64 444.658 46 59 444.659 90 138 444.660 34 64 444.661 49 99 444.663 90 164 47 Tabla 32 5 10 15 20 25 Tabla 33 30 35 40 45 50 Mediciones de peso de los órganos 55 [0291] Los pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 34 como un porcentaje de la solución salina de control normalizado para el peso corporal. 60 65 El porcentaje de inhibición de la huntingtina humana ARNm en ratones BACHD ISIS No. Dosis (mg/kg)% inhibición 387916 12,571419581 12,554 5068419602 12,572 5077419628 12,565 5076419629 12,5 87 50 93 419.640 12,5 69 50 79 419.641 12,5 61 50 80 419.642 12,5 76 50 83 El porcentaje de inhibición de la huntingtina murino ARNm en ratones BACHD ISIS Nº Dosis (mg/kg) % de inhibición 387.916 12,5 70 419.581 12,5 42 50 86 419.602 12,5 77 50 85 419.628 12,5 67 50 86 419629 12,5 90 50 93 419.640 12,5 63 50 84 419.641 12,5 52 50 81 419.642 12,5 56 50 83 48 Tabla 34 5 10 15 20 25 Evaluación de la función hepática 30 [0292] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS de la función hepática de los ratones descritos anteriormente, las concentraciones plasmáticas de las transaminasas se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de ALT y AST se expresan en UI/Tierra los resultados se presentan en la Tabla 35. 35 Tabla 35 40 45 50 55 60 Estudio 3 65 Tratamiento Cambio porcentual en el peso de los órganos de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido ISIS No. (mg/kg) Dosis. HígadoBazo Riñón387916 12.5 -93 -4419581 12.5 -2-6 -1 50 14 -1 -11 419.602 12,5 10 1 -2 50 28 9 -3 419.628 12,5 -2 -7 -2 50 -3 7 -9 419629 12,5 -7 -5 -10 50 16 0 -8 419.640 12,5 -5 -2 -8 50 1 -20 -4 419.641 12,5 -7 -10 -11 50 -2 -13 -9 419.642 12,5 -11 -21 -19 50 -1 -8 -9 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función hepática Dosis (mg/kg)ALT ASTPBS 44 80387916 12.544 75419581 12.556 101 50390 281419602 12.586 108 50240 229419628 12.552 110 5051 73419629 12.5104 118 501262 1150419640 12.536 65 5038 55419641 12.556 103 5057 172419642 12.540 64 5047 101 49[0293] Se inyectaron dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD cada uno por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, ISIS 419641, ISIS 436645, ISIS 436649, ISIS 436668 o ISIS 436689 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de cuatro ratones BACHD se inyectó por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg de ISIS 388241 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de control de cuatro ratones se inyectó por vía intraperitoneal con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos 5 días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se desangraron para la recogida de plasma, después de lo cual se realizó la dislocación cervical y los órganos se recogieron. Análisis de ARN 10 [0294] Se extrajo ARN de tejido de hígado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de huntingtina normales de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 36 y 37 y se calcularon como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina humana y murina, respectivamente, en relación con el 15 control PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan inhibición significativa de los niveles de ARNm de la huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, e ISIS 436645 tienen más de tres desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 436649 e ISIS 436689 tienen tres desapareamientos con ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa 20 de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. Tabla 36 25 30 35 40 45 Tabla 37 50 55 60 Mediciones de peso de los órganos [0295] Los pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 38 como un porcentaje de la solución salina de control normalizado para el peso corporal. Los ratones tratados con ISIS 388263 e ISIS 436645 sufrieron aumentos en el peso del hígado a la dosis 50 mg/kg en comparación con el control PBS. 65 El porcentaje de inhibición de la huntingtina humana ARNm en ratones BACHD ISIS Nº Dosis ( mg/kg ) % de inhibición 388.241 12,5 32 388.250 12,5 21 50 45 388.251 12,5 30 50 34 388.263 12,5 29 50 35 388.264 12,5 35 50 42 419.641 12,5 71 50 73 436.645 12,5 43 50 48 436.649 12,5 40 50 38 436.668 12,5 45 50 69 436.689 12,5 62 50 78 El porcentaje de inhibición de la huntingtina murino ARNm en ratones BACHD ISIS Nº Dosis (mg/kg) % de inhibición 419.641 12,5 68 50 77 436.668 12,5 41 50 62 50Tabla 38 5 10 15 20 25 30 Evaluación de la función hepática [0296] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS de la función hepática de los ratones descritos anteriormente, las concentraciones plasmáticas de las transaminasas se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de la alanina aminotransferasa (ALT) 35 y aspartato aminotransferasa (AST) se expresan en UI/L y los resultados se presentan en la Tabla 39. Tabla 39 40 45 50 55 60 65 Cambio porcentual en el peso de los órganos de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido ISIS Nº Dosis (mg/kg) Hígado Bazo Riñón 388241 12,516 9 388250 12,521 -2 50130 3 388251 12,54-8 1 501919 2 388263 12,548 9 502352 1 388264 12,52-2 3 50129 6 419641 12,5-1-9 3 502-4 3 436645 12,586 5 502625 9 436649 12,510 6 5001 3 436668 12,515 10 50-23 11 436689 12,5-3-5 4 50611 5 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función hepática Dosis (mg/kg) ALT PBS 43 388.241 12,5 43 388.250 12,5 37 50 44 388.251 12,5 42 50 67 388.263 12,5 50 50 55 388.264 12,5 31 50 65 419.641 12,5 39 50 42 436.645 12,5 43 50 179 436.649 12,5 35 50 38 436.668 12,5 36 50 28 436.689 12,5 31 50 49 51Estudio 4 Tratamiento [0297] Se inyectaron dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD cada uno por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg o 5 50 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 437123, ISIS 437132, ISIS 437140, ISIS 437442, ISIS 437446, ISIS 437477, ISIS 437478 o ISIS 437490 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de cuatro ratones BACHD se inyectó por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg de ISIS 387916 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de control de cuatro ratones se inyectó por vía intraperitoneal con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se desangraron para la recogida 10 de plasma, después de lo cual se realizó la dislocación cervical y los órganos se recogieron. Análisis de ARN [0298] Se extrajo ARN de tejido de hígado para análisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de la 15 huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de huntingtina normales de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 40 y 41 y se calcularon como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina humanos y murinos, respectivamente, en relación con el control PBS. ISIS 388241 e ISIS 437490 tienen más de tres desapareamientos con el ARNm huntingtina murino 20 (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 437132 tiene tres desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 437123 e ISIS 437140 tienen dos desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. 25 Tabla 40 30 35 40 45 50 55 60 65 El porcentaje de inhibición de la huntingtina humana ARNm en ratones BACHD ISIS Nº Dosis (mg/kg) % de inhibición 387.916 12,5 50 388.241 12,5 47 50 67 437.123 12,5 0 50 21 437.132 12,5 31 50 33 437.140 12,5 7 50 32 437.442 12,5 42 50 85 437.446 12,5 39 50 70 437.477 12,5 52 50 75 437.478 12,5 54 50 78 437.490 12,5 42 50 44 52Tabla 41 5 10 15 Mediciones de peso de los órganos [0299] Los pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 42 como un 20 porcentaje de la solución salina de control normalizado para el peso corporal. Tabla 42 25 30 35 40 45 50 Evaluación de la función hepática 55 [0300] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS de la función hepática de los ratones descritos anteriormente, las concentraciones plasmáticas de las transaminasas se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de la aminotransferasa de alanina (ALT) y aminotransferasa de aspartato (AST) se expresan en UI/L y los resultados se presentan en la Tabla 43. 60 65 El porcentaje de inhibición de la ARNm huntingtina murina en ratones BACHD ISIS Nº Dosis (mg/kg) % de inhibición 387.916 12,5 48 437.442 12,5 27 50 76 437.446 12,5 38 50 71 437.477 12,5 63 50 87 437.478 12,5 60 50 89 Cambio porcentual en el peso de los órganos de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido ISIS Nº Dosis (mg/kg) Hígado Bazo Riñón387916 12,516 12388241 12,5-316 -2 50-610 0437123 12,5-40 4 5040 -4437132 12,5-2-3 -5 502-6 -2437140 12,5-411 -3 5045 -5437442 12,5-109 3 50-3-20 -10437446 12,5-67 2 50-41 -1437477 12,51-2 0 5025-9 -6437478 12,5-7-4 -9 50224 3437490 12,5-50 -5 50-73 -9 53Tabla 43 5 10 15 20 25 30 Estudio 5 Tratamiento 35 [0301] Se inyectaron Once grupos de cuatro ratones BACHD cada uno por vía intraperitoneal con 12,5 mg/kg de ISIS 388241, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, o ISIS 444661 dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de control de cuatro ratones se inyectó por vía intraperitoneal con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces a la semana 40 durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se desangraron para la recogida de plasma, después de lo cual se realizó la dislocación cervical y los órganos se recogieron. Análisis de ARN 45 [0302] Se extrajo ARN de tejido de hígado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humanos se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de huntingtina normales de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 44 y 45 y se calcularon como porcentaje 50 de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina humanos y murinos, respectivamente, en relación con el control PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan inhibición significativa de los niveles de ARNm de la huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139 y tienen más de tres desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ 55 ID NO: 3) y no muestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. 60 65 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función hepática Dosis (mg/kg)ALT ASTPBS 32 58 387916 12,540 122388241 12,539 93 5028 62 437123 12,538 88 5034 66 437132 12,534 52 5030 52 437140 12,530 62 50 40 63 437.442 12,5 40 106 50 63 119 437.446 12,5 35 119 50 35 89 437.477 12,5 39 68 50 52 162 437.478 12,5 37 53 50 55 71 437.490 12,5 48 71 50 34 59 54Tabla 44 5 10 15 20 Tabla 45 25 30 35 El peso corporal y mediciones de peso de órganos 40 [0303] Los pesos corporales de los ratones se midieron al comienzo del estudio y, posteriormente, dos veces a la semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la Tabla 46 y se expresan como un porcentaje de cambio en los pesos tomadas en el inicio del estudio. Los resultados indican que el tratamiento con estos oligonucleótidos no causó ningún cambio adverso en el peso corporal de los ratones durante todo el estudio. 45 Tabla 46 50 55 60 65 El porcentaje de inhibición de la huntingtina humana ARNm en ratones BACHD ISIS Nº % de inhibición 388.241 53 419.640 34 419.641 63 419.642 55 436.665 63 436.671 66 436.689 57 437507 54 443.139 39 444.591 48 444.661 50 El porcentaje de inhibición de la huntingtina murino ARNm en ratones BACHD ISIS Nº % de inhibición 419.640 24 419.641 50 419.642 34 436.665 49 436.671 63 444.591 41 444.661 46 El porcentaje de cambio en el peso corporal de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido Día 4Día 7Día 10Día 12 PBS -30+2+1 ISIS 388241 -2-1-1+1 ISIS 419640 +10+3+4 ISIS 419641 +1+1+20 ISIS 419642 -3-2+1-5 ISIS 436665 +1+4+5+1 ISIS 436671 +1+2+5+4 ISIS 436689 +1+30-1 ISIS 437507 -1-2+2-2 ISIS 443139 -2+6+4+1 ISIS 444591 -1+1+20 ISIS 444661 +1+3+20 55 [0304] Los pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 47 como un porcentaje de la solución salina de control normalizado para el peso corporal. 5 Tabla 47 10 15 20 25 Evaluación de la función hepática [0305] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS de la función hepática de los ratones descritos 30 anteriormente, las concentraciones plasmáticas de las transaminasas se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de ALT y AST se expresan en UI/L. Los niveles plasmáticos de la bilirrubina y la albúmina también se midieron usando el mismo analizador de química clínica y se expresaron en g/dl. Los resultados se presentan en la Tabla 48. 35 Tabla 48 40 45 50 55 Medición de la función renal [0306] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función renal de los ratones se ha descrito 60 anteriormente, se midieron concentraciones de plasma de nitrógeno de urea en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 49 expresada en mg/dL. 65 Cambio porcentual en el peso de los órganos de los ratones después del tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido ISIS Nº Hígado Bazo Riñón 388241+2+13-7 419640-2+12-12 419641+4+3-13 419642+5+19-8 436665-3+3-13 4366710+1-18 436689-6-10-12 437507-5-5-14 443139-2-9-13 444591-2-10-12 4446610-16-12 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función hepática ALT AST Bilirubina Albumina PBS 42,5 86,5 0,2 3,1 ISIS 388241 39,3 54,5 0,3 3,0 ISIS 419640 36,8 85,8 0,2 2,9 ISIS 419641 50,0 71,8 0,2 3,0 ISIS 419642 42,8 77,0 0,1 3,0 ISIS 436665 51,5 123,0 0,2 3,0 ISIS 436671 52,0 71,0 0,1 3,0 ISIS 436689 38,3 75,3 0,2 3,1 ISIS 437507 37,0 77,5 0,1 3,0 ISIS 443139 41,3 124,8 0,2 3,0 ISIS 444591 46,5 61,3 0,2 3,0 ISIS 444661 67,5 109,8 0,2 3,1 56 Tabla 49 5 10 15 20 La medición de otros parámetros metabólicos 25 [0307] Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en otras funciones metabólicas en ratones descritos anteriormente, las concentraciones plasmáticas de glucosa, colesterol y triglicéridos se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 50 expresados en mg/dl y demuestran que el tratamiento con estos oligonucleótidos no causó ningún cambios 30 adversos en los niveles de estos marcadores metabólicos entre los grupos control y de tratamiento. Tabla 50 35 40 45 50 55 Ejemplo 4: la administración en bolo de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de huntingtina para el cuerpo estriado de los ratones BACHD [0308] Los ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS a través de la administración en bolo a un área del cerebro de ratón definido, el cuerpo estriado, con el propósito de la detección de la actividad de los oligonucleótidos 60 en el tejido cerebral contra la expresión de ARNm de huntingtina humana y de ratón. El tratamiento y la cirugía [0309] A los grupos de cuatro ratones BACHD cada uno se les administró ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419637, 65 ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores de la función renal BUNCreatinina PBS 24,00,17 ISIS 388241 22,60,17 ISIS 419640 21,40,16 ISIS 419641 19,90,16 ISIS 419642 23,60,18 ISIS 436665 20,20,17 ISIS 436671 22,60,17 ISIS 436689 19,20,18 ISIS 437507 19,90,16 ISIS 443139 23,30,16 ISIS 444591 23,50,18 ISIS 444661 25,40,18 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de marcadores metabólicos Glucosa Colesterol Triglicéridos PBS 198 142 225 ISIS 388241 197 133 185 ISIS 419640 198 132 189 ISIS 419641 188 140 219 ISIS 419642 184 128 192 ISIS 436665 199 134 152 ISIS 436671 196 148 174 ISIS 436689 194 132 174 ISIS 437507 198 139 155 ISIS 443139 178 122 239 ISIS 444591 202 145 263 ISIS 444661 180 140 247 57437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, 444661 o ISIS ISIS 444663 entregado como una sola inyección de bolo a concentraciones de 3 µg, 10 µg ó 25 µg g en el cuerpo estriado. 5 [0310] Un grupo de control de 4 ratones BACHD fueron tratados de manera similar con PBS. ISIS 388241 se administró en siete grupos de 4 ratones cada uno y los resultados presentados son la media de los datos derivados de los 28 ratones. ISIS 419628 se administró en 2 grupos de 4 ratones BACHD cada uno y los resultados presentados son la media de los datos derivados de los 8 ratones. Siete días después de la administración de bolo, los ratones se sometieron a eutanasia usando isoflurano y se eliminaron los órganos. Los animales se decapitaron y 10 el cerebro se retiró para la disección del tejido estriatal. Análisis de ARN [0311] Se extrajo ARN de tejido estriado para análisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de la huntingtina. 15 Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de ARNm de la huntingtina normal de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador murino RTS2633. Los resultados para los niveles de ARNm de huntingtina humana se presentan en la Tabla 51 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con el grupo de control PBS. Toda la inhibición dependiente de la dosis efectúa oligonucleótidos antisentido de los niveles de ARNm de la huntingtina 20 humana. Los resultados para los niveles de ARNm murina huntingtina se presentan en la Tabla 52 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con el grupo de control PBS. [0312] Las dosis eficaces (DE50) de cada oligonucleótido para ARNm de huntingtina humana y la ARNm de huntingtina de ratón se calcularon representando gráficamente las concentraciones de oligonucleótidos utilizados en 25 comparación con el porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina niveles de expresión de cualquiera de las especies y observando las concentraciones a las que 50% de inhibición de la expresión del ARNm de la huntingtina se logró para cada especie en comparación con los controles correspondientes. El DE50 (µg) para cada oligonucleótido antisentido también se presenta en las Tablas 51 y 52 de ARNm de huntingtina humana y murina, respectivamente. 30 [0313] ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139, e ISIS 444584 son cada uno no coincidentes por 8 pares de bases o más con la ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no muestran inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 437168 e ISIS 437441 tienen 2 desajustes cada uno con ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no muestran una 35 inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 desapareamientos con el ARNm huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no muestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. Tabla 51 40 45 50 55 60 65 El porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina humana in vivo y DE50 de los oligonucleótidos antisentido ISIS Nº 3 mg10 mg25 mg DE50388241 335568 7,4419628 495883 5,1419637 406279 6,1419640 526477 4,8419641 717789 2,2419642 677083 3,0436665 527160 5,8436671 688084 2,4436684 2 1837 36,9 58 (continuación) 5 10 15 20 25 30 35 Tabla 52 40 45 50 55 60 65 El porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de la huntingtina humana in vivo y DE50 de los oligonucleótidos antisentido ISIS Nº 3 mg10 mg25 mg DE50436689 276381 7,0436754 315461 10,5437168 2 4960 15,2437175 0 5364 12,9437441 3 3238 35,3437442 385056 11,9437507 385979 6,6437527 374759 11,9443139 396170 6,7444578 516675 4,6444584 306371 7,8444591 605470 5,6444607 576975 3,2444608 676882 3,1444615 475591 5,2444618 576483 4,0444627 477061 5,0444652 366266 7,8444658 606679 3,6444659 616784 3,4444660 556266 4,2444661 485770 6,4444663 426080 5,5El porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de huntingtina murinas in vivo y DE50 de los oligonucleótidos antisentido ISIS No. 3 mg 10 mg 25 mg ED50419628 505583 5,1419637 637986 2,6419640 516086 4,9419641 658087 2,7419642 697388 2,5436665 688266 2,7436671 758790 2437442 305382 9437527 677390 2,7 59(continuación) 5 10 15 20 [0314] Los diez compuestos marcados con un asterisco tenían una ED50 mejorado sobre ISIS 388241. 25 Ejemplo 5: Ensayo de los efectos neurotóxicos de la administración en bolo de oligonucleótidos antisentido en el tejido estriado de ratas [0315] Se seleccionaron alrededor de 30 compuestos que tienen alta tolerabilidad y alta potencia. Los compuestos se ensayaron luego por inyección en bolo del SNC en ratas para evaluar más a fondo la neurotoxicidad. 30 [0316] Ratas Sprague-Dawley fueron tratados con oligonucleótidos ISIS a través de la administración en bolo a un área del cerebro definido, el cuerpo estriado, con el propósito de la detección de la inducción del marcador microglial AIF1 como medida de la toxicidad en el SNC. 35 El tratamiento y la cirugía [0317] A los grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se les administró ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 4.196.671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 443168, ISIS 437175, ISIS 40 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663 administradas como una sola inyección en bolo a 50 µg de concentración en el cuerpo estriado. 45 [0318] Un grupo de control de 4 ratas fue tratado de manera similar con PBS. Un grupo de 4 ratas fueron tratados de manera similar con ISIS 104838, un oligonucleótido antisentido contra el TNF-α, como grupo de control negativo. ISIS 387916 se administró en cuatro grupos de 4 ratas cada uno y los resultados presentados son el promedio de los datos derivados de las 16 ratas. ISIS 419628 se administró en dos grupos de 4 ratas cada uno y los resultados presentados son la media de los datos de las 8 ratas. ISIS 419629, ISIS 444584 e ISIS 444618, que tenía 50 indicadores tóxicos en el estudio de la administración sistémica (Ejemplo 3) se ensayaron también en este estudio. Siete días después de la administración de bolo, las ratas se sacrificaron usando isoflurano y se eliminaron los órganos. Los animales se decapitaron y el cerebro se retiró para la disección del tejido estriatal. Análisis de ARN de los niveles de expresión AIF1 55 [0319] Se extrajo ARN de tejido estriado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARN AIF1. Los niveles AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de sonda de cebador de rata rAif1_LTS00219 (secuencia hacia delante AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, designado aquí como SEQ ID NO: 46; secuencia inversa CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, designado aquí como SEQ ID NO: 47; secuencia de sonda 60 CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX, designado aquí como SEQ ID NO: 48). Los resultados se calcularon como el porcentaje de expresión AIF1 sobre el del control PBS y se presentan en la Tabla 53. ISIS 419629, ISIS 444584, ISIS 444618 que tenía indicadores tóxicos en el estudio de la administración sistémica (en el Ejemplo 3), también tenían indicadores tóxicos en este estudio (mayor que 300% por encima de control de solución salina). Estudios posteriores mostraron que ISIS 444584 es neurotolerable y exhibe indicadores tóxicos insignificantes (véase el 65 Ejemplo 16 y 17). El porcentaje de inhibición de los niveles de ARNm de huntingtina murinas in vivo y DE50 de los oligonucleótidos antisentido ISIS No. 3 mg 10 mg 25 mg ED50444578 5065744,9444591 6969812,8444607 5770753,8444608 7072902,5444615 3037889,5444618 6671902,8444627 4160578,8444652 4762664,7444658 6062853,9444659 5462854,2444660 4248649,5444661 4957745,9444663 4265845,1 60 Tabla 53 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Análisis ARN de los niveles de expresión de huntingtina [0320] Se extrajo ARN de tejido estriado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de rata huntingtina se midieron usando la sonda de cebador rata establecer rHtt_LTS00343 (secuencia hacia delante CAGAGCTGGTGAAC- CGTATCC, designado aquí como SEQ ID NO: 49; secuencia 60 inversa GGCTTAAGCAGGGAGCCAAAA, designado aquí como SEQ ID NO: 50; secuencia de sonda ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX, designado en este documento como SEC ID NO: 51). Los resultados se calcularon como el porcentaje de reducción de la expresión de huntingtina sobre la del control PBS y se presentan en la Tabla 54. ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139 y son cada uno no coincidentes por 6 pares de bases o más con la secuencia del gen de rata (SEQ ID NO: 5) y por lo tanto no 65 muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 419640, Expresión de porcentaje de los niveles de ARNm de AIF1 in vivo como una medida de la neurotoxicidad ISIS Nº % expresión104838 111387916 870388241 236419627 168419628 497419629 247419630 227419636 464419637 275419640 305419641 206419642 173436665 217436668 447436671 239436684 700436689 149436754 125437168 130437175 131437441 158437442 157437507 133437527 184443139 143444578 352444584 317444591 194444607 362444608 476444615 645444618 547444627 377444652 336444.658 364 444.659 319 444.660 411 444.661 249 444.663 448 61ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 437442, ISIS 444615, e ISIS 444627 tienen 1 desajuste cada uno con la secuencia del gen de rata (SEQ ID NO: 5) y no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 437168 e ISIS 437441 tienen 2 desajustes cada uno con la secuencia del gen de rata (SEQ ID NO: 5) y no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 436689 e ISIS 444584 tienen 3 desajustes cada uno con la secuencia del gen 5 de rata (SEQ ID NO: 5) y no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. Tabla 54 10 15 20 25 30 35 40 Ejemplo 6: La administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra la ARNm de huntingtina-estudio de tolerabilidad en ratones BACHD [0321] Los compuestos seleccionados se compararon con el compuesto previamente diseñado ISIS 388241 por la 45 administración ICV en ratones BACHD. [0322] Se seleccionaron compuestos seleccionados más el punto de referencia 388241 basado en potencia in vitro y sistémica y la tolerabilidad sistémica, así como la potencia del SNC y la tolerabilidad. 50 [0323] Ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) a un área del cerebro de ratón definido, el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la tolerabilidad de ICV de dosificación en ratones. El tratamiento y la cirugía 55 [0324] A los grupos de cinco ratones BACHD cada uno se les administró ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 444591, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 444661 o ISIS 436689 a 150 µg/día ICV administrado con bombas Alzet 2002 a una velocidad de 12 µl/día durante 2 semanas. Un grupo de control de 4 ratones BACHD fueron tratados de manera similar con PBS. Los ratones se implantaron 60 quirúrgicamente con las bombas de la siguiente manera: Los ratones fueron anestesiados individualmente con 3% de isoflurano para la implantación de la bomba. Después de dos semanas, los ratones fueron anestesiados de nuevo y la bomba se eliminó quirúrgicamente. Los animales se dejaron recuperar durante otras dos semanas antes de sacrificarse. 65 [0325] Se tomaron los pesos corporales de los ratones semanalmente durante los períodos de tratamiento y El porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de la huntingtina rata en ratas ISIS Nº % de reducción 387.916 70 419.627 67 419.628 57 419629 85 419.630 11 419.636 53 419.637 84 436.671 77 437527 86 444.578 72 444.591 35 444.607 57 444.608 68 444.618 56 444.652 75 444.658 61 444.659 55 444.660 63 444.661 52 444.663 59 62recuperación. Después de 4 semanas, los ratones fueron sacrificados usando isoflurano y decapitados. Se extrajo el cerebro para la adquisición de tejido de las secciones anterior y posterior. Análisis de ARN 5 [0326] Se extrajo el ARN desde el hemisferio derecho de la corteza anterior del cerebelo y la sección posterior del sitio de canulación para el análisis PCR de tiempo real de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de ARNm de la huntingtina normal de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador murino RTS2633. Los resultados se calcularon como la inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina humana y 10 murina por ciento en comparación con el control y se presentan en las Tablas 56 y 57 respectivamente. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan inhibición significativa de los niveles de ARNm de la huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507 e ISIS 443139 son cada uno no coincidentes por 8 pares de bases o más con la ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 444591 tiene 1 desajuste con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID 15 NO: 3) y no muestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 desapareamientos con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y no muestra inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. Tabla 56 20 25 30 35 Tabla 57 40 45 50 Medición del peso corporal 55 [0327] Los pesos corporales de los ratones se midieron al comienzo del estudio y, posteriormente, una vez a la semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la Tabla 58 y se expresan como un porcentaje de cambio en los pesos tomadas en el inicio del estudio. Los pesos corporales se considera una medida de la tolerancia de los ratones a la administración ICV de oligonucleótido antisentido. "ND" significa que no había datos disponibles para ese período de tiempo. 60 65 El porcentaje de reducción de la huntingtina humana niveles de ARNm en ratones BACHD través de la administración ICV de oligonucleótidos antisentido ISIS Nº Número de ratones Corteza anterior Corteza posterior388241 3 8270 419640 1 6046 419641 2 7566 419.642 3 29 42 436.665 5 62 38 436.671 3 69 77 436.689 3 49 40 437507 3 77 66 443.139 5 93 90 444.591 5 79 78 El porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de huntingtina murina en ratones BACHD través de la administración ICV de oligonucleótidos antisentido ISIS Nº Número de ratones Corteza anterior Corteza posterior419640 1 2234 419641 2 4026 419642 3 6371 436665 5 7256 436671 3 8071 63Tabla 58 5 10 15 20 La supervivencia de los ratones 25 [0328] La supervivencia de los ratones se evaluó a través de todo el período de estudio. Tabla 59 a continuación muestra el patrón de la supervivencia en los grupos de ratones tratados con oligonucleótidos ISIS, así como el control. Tabla 59 30 35 40 45 Ejemplo 7: La administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra la huntingtina en ratones C57/BL6 50 [0329] Ratones C57/BL6 de tipo salvaje fueron tratados con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) a un área del cerebro de ratón definido, el ventrículo lateral derecho, para el propósito de evaluar la potencia de los oligonucleótidos contra la huntingtina ratón en estos ratones. 55 El tratamiento y la cirugía [0330] A grupos de diez ratones C57/BL6 se administró ISIS 408737 (5’TCCTAGTGTTACATTACCGC 3' (SEQ ID NO: 52), sitio de inicio 5263 de la SEQ ID NO: 3) a 50 µg/día ICV administrado con bombas Alzet 2002 en una relación de 0,5 µl/día durante 7 días o 14 días. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6 fueron tratados de 60 manera similar con PBS. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas de la siguiente manera: En pocas palabras, las bombas osmóticas Alzet (modelo 2002) fueron ensambladas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Bombas se llenaron con una solución que contiene el oligonucleótido antisentido y se incubaron durante la noche a 37°C, 24 horas antes de la implantación. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en un marco estereotáxico. Después de esterilizar la zona quirúrgica, una incisión en la línea 65 media se realizó sobre el cráneo, y un bolsillo subcutáneo se hizo sobre la espalda, en el que se implantó una El porcentaje de cambio en el peso corporal de los ratones durante el tratamiento BACHD oligonucleótido antisentido semana 1 semana 2 semana 3 semana 4 PBS -1 +2+6+6 ISIS 388241 +3 +11+15+7 ISIS 437507 +21 +10+13-4 ISIS 443139 +10 +10+16+12 ISIS 419640 +21 +11-10+9 ISIS 419641 +24 +3-5-12 ISIS 419642 +45 +39+12+1 ISIS 444591 +18 +38+27+17 ISIS 436665 +34 +43+23+9 ISIS 436671 +19 +17 +11 0 ISIS 444661 +19 -10 -21 n.d. ISIS 436689 +49 +40 +2 -17 Número de supervivientes durante el tratamiento oligonucleótido antisentido semana 1 Semana 2 semana 3 semana 4 PBS 5 5 5 5 ISIS 388241 4 3 3 3 ISIS 437507 5 5 4 4 ISIS 443139 5 5 5 5 ISIS 419640 5 5 4 1 ISIS 419641 5 5 4 2 ISIS 419642 5 5 4 2 ISIS 444591 5 5 5 5 ISIS 436665 5 5 5 5 ISIS 436671 4 4 3 3 ISIS 444661 5 5 1 0 ISIS 436689 4 4 4 3 64bomba osmótica precargada. Un pequeño orificio de trépano se hizo a través del cráneo por encima del ventrículo lateral derecho. Una cánula, conectada a la bomba osmótica a través de un catéter de plástico, después se coloca en el ventrículo y se pega en su lugar usando adhesivo Loctite. La incisión se cierra con suturas. Oligonucleótido antisentido o PBS se infundió durante 7 o 14 días, después de lo cual los animales se sometieron a eutanasia de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee. El tejido cerebral y 5 la médula espinal se recogieron y se congelaron en nitrógeno líquido. Antes de la congelación, el tejido cerebral se corta transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4, y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 fueron de aproximadamente 2 mm uno de otro siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal. Análisis de ARN y proteínas 10 [0331] El ARN total se extrajo de cerebro de ratón y la médula espinal con RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para análisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de la huntingtina utilizando un kit de preparación de RNeasy Mini (Qiagen). Reacciones Q-PCR se llevaron a cabo y se analizaron en un Prism ABI 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Niveles de ARNm de huntingtina de ratón se midieron usando el 15 conjunto de sonda de cebadores murinos ABI # Mm01213820_ml (Applied Biosystems) y se normalizó a niveles de ARNm de isomerasa de peptidilprolilo. Lisados de proteína se prepararon a partir de losas de cerebro de ratón como se describió previamente (Li S.H. y Li X.J., Methods in Molecular Biology (2008), 217: 1940-6029). Los lisados se realizaron en 3-8% de gel de tris-acetato y se transfieren usando el sistema de transferencia seco iBlot (Invitrogen). Las transferencias se sondaron con anti-tubulina beta (Chemicon) y el anticuerpo monoclonal MAB2166 (Millipore) 20 que reacciona específicamente con la proteína de huntingtina murina. Las inmunotransferencias se cuantificaron utilizando el software V3.0 Odyssey. Los resultados se presentan en la Tabla 60 como el porcentaje de reducción en comparación con el control PBS y demuestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de proteína huntingtina y por el oligonucleótido antisentido tanto en el día 7 como día 14. 25 Tabla 60 30 Ejemplo 8: La administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de huntingtina en monos cinomolgos 35 [0332] Monos cinomolgos se trataron con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) a un área del cerebro definido, los ventrículos laterales, con el propósito de la detección de la actividad de los oligonucleótidos en el tejido cerebral contra la expresión del ARNm de la huntingtina. El tratamiento y la cirugía 40 [0333] A dos grupos de 3 monos cinomolgos cada uno se administraron 0,635 mg/ml (1,5 mg/día) o 1,67 mg/ml (4 mg/día) de ISIS 436689 administrado ICV con bombas ambulatorias individuales (Pegasus Vario) en una relación de 0,05 ml/hr durante 4 semanas. A un grupo de control de 2 monos cinomolgos se les administró PBS de una manera similar. A los grupos se les administró ISIS 436689 bilateralmente. A uno de los animales se administró ISIS 436689 45 en la dosis de 4 mg/día unilateralmente al ventrículo derecho. [0334] A los animales se les permitió 10 días para recuperarse de la cirugía antes de la realización de la infusión. Durante el período de recuperación después de la cirugía, los animales se mantuvieron en infusión ICV PBS a un caudal de 0,05 ml/h mediante una bomba de infusión ambulatoria por ventrículo. Al final del período de recuperación, 50 cada cánula se conectó a una bomba ambulatoria individual (Pegasus Vario) colocada dentro de una camisa primate (Lomir, PJ-02NB). Las bombas se mantuvieron conectadas hasta la finalización del período de infusión. Después de la administración de 4 semanas, los animales fueron sacrificados y se recogieron el cerebro, el hígado y el riñón. Análisis de ARN de ARNm htt 55 [0335] El ARN se extrae del caudado anterior, caudado posterior, corteza temporal, corteza parietal, hipotálamo, cerebro medio, hipocampo y médula espinal, así como el hígado y el riñón para análisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 y normalizados a los niveles de mono ciclofilina A. Los resultados se calcularon 60 como la inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina por ciento en comparación con el control de PBS y se presentan en la Tabla 61. ISIS 436689 efectuó una inhibición significativa de los niveles de ARNm de la huntingtina humana en el SNC. 65 El porcentaje de inhibición de ARNm huntingtina murina en ratones C57/BL6 día 7 día 14 ARNm 66 68 proteína 21 49 65Tabla 61 5 10 15 20 25 Ejemplo 9: Medición de la vida media de ISIS 387898 en el cuerpo estriado de los ratones C57/BL6 mediante administración única en bolo [0336] A ratones C57/BL6 se les administró ISIS 387898 como un único bolo para el cuerpo estriado para el propósito de medición de vida media y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión del 30 ARNm de la huntingtina en ese tejido. Tratamiento [0337] Cuarenta ratones C57/BL6 fueron tratados con ISIS 387898 (5’CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3' (SEQ ID 35 NO: 53); posición 4042 inicio de SEQ ID NO: 1 y la posición 4001 de SEQ ID NO empezar: 3) entregada como una solo bolo de 50 µg en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5. C57 Ocho de control/BL6 ratones se trataron con PBS en un procedimiento similar. Los grupos de 4 ratones cada uno se sacrificaron a diversos puntos de tiempo y el tejido estriatal extraído en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5. 40 Análisis de ARN [0338] Se extrajo ARN de tejido estriado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina normal de ratón se midieron utilizando la sonda de imprimación murino establecer RTS2633. Los resultados se presentan en la Tabla 62 y se expresan como porcentaje de inhibición en 45 comparación con el grupo de control PBS en el día 7. Se observó el efecto inhibidor de ISIS 387898 que se prolongue durante al menos 91 días. Tabla 62 50 55 60 65 Efecto de ISIS 387898 como administración de un solo bolo en expresión de ARNm de huntingtina murina en varios puntos de tiempo en estrato C57/BL6 TratamientoDías después de la dosificación% de inhibición ISIS 387898166 774 1468 21 77 28 75 50 63 73 55 91 48 PBS 50 5 El porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de huntingtina en monos cinomolgos a través de la administración ICV de oligonucleótidos antisentido Tissue Dosis (mg/día) 1,5 (bilateral) 4 (bilateral) 4 (right unilateral) 4 (left unilateral) Caudado anterior 59 49 85 12 Caudado posterior 52 81 63 0 Corteza temporal 10 34 41 31 Corteza parietal 22 38 46 24 Hipotálamo 59 71 35 100 Mesencéfalo 32 38 2 0 Hipocampo 18 18 28 10 Espinal cervical 58 65 n.d. s.d. Espinal torácica 50 67 s.d. s.d. Espinal lumbar 49 62 s.d. s.d. Hígado 0 13 s.d. s.d. Riñón 0 13 s.d. s.d. s.d.= sin datos 66 Análisis de la concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: [0339] Los tejidos cerebrales se picadaron, se pesaron, se homogeneizaron y se extrajeron utilizando un método de extracción líquido-líquido con fenol/cloroformo. Esto fue seguido por extracción en fase sólida del sobrenadante en 5 una columna unida de fenilo antes de la inyección electrocinética de electroforesis de gel capilar. Se utilizó un instrumento de electroforesis capilar AP/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) para el análisis electroforético capilar relleno de gel. Picos de oligonucleótidos se detectaron por absorbancia UV a 260 nm. [0340] La concentración de ISIS 387898 en el cerebro (µg/g) se representó frente a la expresión de huntingtina 10 humana como un porcentaje del control PBS (Tabla 63 y Figura 1). La concentración de ISIS 387898 logra una inhibición del 50% de la expresión del ARNm de huntingtina se calculó (CE50). La CE50 se determinó que era de 0,45 µg/g. La concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral y la expresión del correspondiente ARNm de huntingtina de porcentaje también se representó gráficamente (Tabla 64 y la Figura 2) y la vida media del oligonucleótido se calculó como 21 días. 15 Tabla 63 20 25 30 Tabla 64 35 40 45 Ejemplo 10: Medición de la vida media de ISIS 387898 en los ventrículos laterales de ratones BACHD través de la administración ICV 50 [0341] A los ratones BACHD se les administró ISIS 387898 por ICV a los ventrículos laterales del cerebro con el fin de medir la vida media y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión del ARNm de la huntingtina en ese tejido. 55 Tratamiento [0342] Veintiocho ratones BACHD fueron tratados con ISIS 387898 administrado por la administración ICV a 75 µg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Veinteocho ratones BACHD de control se trataron con PBS en un procedimiento similar al que se describe en el Ejemplo 9. Grupos de 4 ratones 60 cada uno de los grupos de tratamiento y de control fueron sacrificados en puntos de tiempo cada dos semanas y tejido cortical anterior extraído en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Análisis de ARN 65 [0343] Se extrajo ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación para análisis PCR Concentración de ISIS 387898 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión ARNm htt como un porcentaje del control concentración ( µg/g) % de expresión ARNm 0 105,0 25 28,8 50 28,2 75 27,9 100 27,8 125 27,8 Concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión ARNm htt como un porcentaje del control Tiempo (días) Conc (µg/g) % de expresión ARNm 1 11635 7 65,727 14 3032 23 34,924 30 12,226 51 2,138 73 1,4 47 92 1,1 53 67en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles de ARNm de la huntingtina normal de ratón se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador murino RTS2633. Los niveles de expresión de ARNm de huntingtina mutada humana se presentan en la Tabla 65 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con la media de la que se mide en los grupos de control de PBS. Niveles de expresión de ARNm de 5 huntingtina murinos normales se presentan en la Tabla 66 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con la media de la que se mide en los grupos de control de PBS. Se observó el efecto inhibidor de ISIS 387898 que se prolongue durante 91 días. Tabla 65 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Análisis de la concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: [0344] El tejido cerebral se procesó en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. La concentración de 55 ISIS 387898 en la corteza anterior del cerebro (µg/g) se representó frente a la inhibición de la huntingtina humana como un porcentaje del control de PBS (Tabla 67 y la Figura 3), y la CE50 se calculó en 26,4 µg/g. La concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido cerebral también se representó gráficamente (Tabla 68 y la Figura 4) y la vida media del oligonucleótido se calculó como 21 días. 60 65 Efecto de ISIS 387898 administrado ICV sobre la expresión de ARNm huntingtina murina en diversos puntos temporales Tratamiento Días después de la dosificación anterior posterior ISIS 387898147465 28 67 61 42 70 61 56 57 52 70 57 43 91 41 61 127 28 16 PBS 1400 28 0 0 42 1 0 56 9 10 70 13 10 91 13 25 127 11 0 ISIS 387898 14 85 81 28 81 69 42 86 79 56 74 69 70 73 58 91 39 63 127 39 0 PBS 14 0 0 28 0 0 42 0 0 56 17 14 70 5 24 91 9 17 127 32 0 68Tabla 67 5 10 15 20 25 Ejemplo 11: Medición de la vida media de ISIS 388241 e ISIS 443139 en los ventrículos laterales de ratones BACHD a través de la administración ICV [0345] A los ratones BACHD se les administró ISIS 388241 o ISIS 443139 por ICV a los ventrículos laterales del 30 cerebro con el fin de medir la vida media y la duración de la acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión del ARNm de la huntingtina en ese tejido. Tratamiento 35 [0346] Veinte ratones BACHD fueron tratados con ISIS 38241 administrado por la administración ICV a 50 µg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Veinte ratones BACHD fueron tratados con ISIS 443139 administrado por la administración ICV a 50 µg/día durante 2 semanas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Veinte ratones BACHD de control se trataron con PBS en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Grupos de 4 ratones cada uno, tanto del grupo de los grupos de tratamiento y de control se 40 sacrificaron en puntos de tiempo cada dos semanas y tejidos extraídos en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Análisis de ARN 45 [0347] Se extrajo ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación para análisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de la huntingtina mutante humana se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los resultados se presentan en la Tabla 69 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con la media de la que se mide en los grupos de control de PBS. Se observaron los efectos inhibitorios tanto de ISIS 388241 como de ISIS 443139 que se prolongue 50 durante al menos 16 semanas. [0348] Tanto ISIS 388241 como su equivalente columna vertebral mixta, ISIS 443139, tienen más de 3 desapareamientos con la ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 5) y por lo tanto no mostraron inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. 55 60 65 Concentración de ISIS 387898 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión ARNm htt como un porcentaje del control Concentración (µg/g) % De expresión ARNm 0 105 10 90,7 100 19,3 200 14,3 300 13,2 400 12,7 500 12,5 600 12,4 14 554,3 28 219,8 42 154 56 146,9 70 48,3 91 46.1 127 11,8 69 Tabla 69 5 10 15 20 25 Análisis de la concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: 30 [0349] El tejido cerebral se procesó en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. La concentración dependiente del tiempo de ISIS 388241 en el tejido cerebral posterior se trazó (Tabla 70 y Figura 5) y la vida media del oligonucleótido se calculó como 20 días. La concentración dependiente del tiempo de ISIS 443139 en el tejido cerebral posterior se representó gráficamente (Tabla 71 y Figura 6) y la vida media del oligonucleótido se calculó como 20 días. 35 Tabla 70 40 45 50 Tabla 71 55 60 Ejemplo 12: Efecto de la inhibición antisentido de la huntingtina humana mutante en el rendimiento motor de los ratones BACHD 65 Efecto de ISIS 388241 e ISIS 443139 administrado ICV sobre la expresión de ARNm de huntingtina humana en diversos puntos temporales Tratamiento Semanas después de la dosificación anterior posteriorISIS 388241 063 64 479 56 867 51 1276 68 1635 34ISIS 443139 035 55 420 62 861 59 12 67 53 1646 37PBS 015 10 4 0 2 8 5 0 1232 4 16 6 2 Concentración de ISIS 384241 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión ARNm htt como un porcentaje del control Días después de la última dosis Conc (ug/g) % de expresión ARNm 0 170,336 28 65,243 56 1349 84 8,232 112 6,966 Concentración de ISIS 443139 en el tejido cerebral y su efecto sobre la expresión ARNm htt como un porcentaje del control Días después de la última dosis Conc (ug/g) % de expresión ARNm 0 71,345 28 47,438 56 11,341 84 11,146 112 5,663 70[0350]: A los ratones BACHD se les trataron con oligonucleótidos ISIS vía intracerebroventricular (ICV) para el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión del ARNm de la huntingtina en su rendimiento motor mediante el ensayo rotarod. Tratamiento 5 [0351] El ensayo de rotarod de aceleración se llevó a cabo en el rotarod Ugo Basile. Los animales se colocaron en el cilindro giratorio a una velocidad de 2 rpm, el rotarod aceleró a 40 RPM durante 5 minutos. La duración de la caída se registró. La duración a caída se define por el animal, ya sea que caen del rotarod, o detienen su ejecución, que cuelga en el rotarod y la rotación en él. Ratones BACHD de seis meses de edad y sus compañeros de camada no 10 transgénicos fueron entrenados para ejecutarse en el rotarod durante una semana antes del tratamiento. Esto consistió en tres ensayos consecutivos de 5 minutos cada uno, con un descanso de 20 minutos entre ensayos. Un grupo de 15 ratones BACHD fueron tratados con ISIS 388241 en 50 µg/día administrado ICV con bombas Alzet 2002 a una velocidad de 12 µl/día durante 2 semanas. Los ratones se implantaron quirúrgicamente con las bombas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Un grupo de control de 14 ratones BACHD fueron tratados con 15 PBS de una manera similar. Un grupo de control de 9 compañeros de camada no transgénicos fueron tratados con PBS de una manera similar. Ensayo de rendimiento de rotarod 20 [0352] Al final del período de tratamiento, las bombas se retiraron y dos semanas más tarde, se llevó a cabo el primer ensayo rotarod post-tratamiento. Comportamiento de Rotarod se analizó mensual hasta que los ratones tenían 11 meses de edad. Cada mes, los animales fueron colocados en el cilindro giratorio de tres corridas de prueba al día durante 2 días. Los resultados se presentan en la Fig. 7, así como en la Tabla 72 expresado como duración a caer en el segundo. Los valores basales a los 6 meses de edad se tomaron antes del tratamiento y los 25 puntos de tiempo dados son la edad de los ratones a los que se llevó a cabo el ensayo. Los datos indican que el tratamiento de ratones con ISIS 388241 BACHD aumentó la duración a caer en comparación con la observada en ratones no tratados BACHD. Tabla 72 30 35 40 Ejemplo 13: Efecto de la inhibición antisentido de la huntingtina mutante humana y el ARNm huntingtina murina de tipo salvaje en el rendimiento motor de los ratones BACHD [0353] Ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) con el 45 propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión del ARNm de la huntingtina en su rendimiento motor mediante el ensayo rotarod. Tratamiento 50 [0354] El ensayo rotarod de aceleración se llevó a cabo en el rotarod Ugo Basile. Los animales se colocaron en el rotarod a una velocidad de 2 rpm, el rotarod aceleró a 40 RPM durante 5 minutos. La duración de la caída se registró. La duración a caída se define por el animal, ya sea que cayendo del rotarod, o deteniendo su ejecución, sujetando el rotarod y rotando en él. Ratones BACHD de dos meses de edad y sus compañeros de camada no transgénicos fueron entrenados para ejecutarse en el rotarod durante una semana antes del tratamiento. Esto 55 consistió en tres ensayos consecutivos de 5 minutos cada uno, con un descanso de 20 minutos entre ensayos. Grupos de 17-21 ratones BACHD cada uno, fueron después tratados con ISIS 388241 en 50 µg/día, ISIS 408737 en 75 µg/día, o ISIS 387898 en 75 µg/día, ICV administrado con bombas Alzet 2002 a una velocidad de 0,5 µl/hora durante 2 semanas. Los ratones se implantaron quirúrgicamente con las bombas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Un grupo control de 20 ratones BACHD fueron tratados con PBS de una manera similar. 60 Los grupos de ratones de control no transgénicos también fueron tratados de manera similar con los oligonucleótidos ISIS o PBS de una manera similar. Ensayo de rendimiento rotarod. 65 [0355] Al final del período de tratamiento, las bombas se retiraron y dos semanas más tarde, se llevó a cabo el Efecto de la inhibición antisentido del ARNm de huntingtina mutante sobre la duración a caída (seg) 6 meses7 meses8 meses9 meses10 meses 11 mesesISIS 38824197108154148144 159Control PBS9411711510499 92Control no transgénico 197 198 215 207 198 199 71primer ensayo rotarod post-tratamiento. El comportamiento de rotarod se analizó mensualmente hasta que los ratones tenían 10 meses de edad. Cada mes, los animales se colocaron en el rotarod durante 3 a 5 pruebas por día durante 3 días consecutivos. Los resultados se presentan en la Tabla 73 expresada como la duración a caída en segundos. Los valores basales a los 2 meses de edad se tomaron antes del tratamiento y los puntos de tiempo dados son la edad de los ratones en los que se realizó el ensayo. El ISIS 387898 (designado en la tabla como ASO 5 de ratón humano) es reactivo cruzado para ARNm de huntingtina humana y de ratón y, por tanto, inhibe tanto el ARNm de huntingtina mutante humana como el ARNm de huntingtina de tipo salvaje en ratones. El ISIS 388241 (designado en la tabla como ASO humana) se dirige específicamente al ARNm de huntingtina humana y no coincide con 8 pares de bases con ARNm de huntingtina murina. Por lo tanto, el ISIS 388241 inhibiría especıficamente solo ARNm de huntingtina mutante humana y no ARNm de huntingtina murina de tipo salvaje en los ratones. El ISIS 10 408737 (designado en la tabla como ratón ASO) se dirige específicamente al ARNm de huntingtina murina y no coincide con 7 pares de bases con ARNm de huntingtina humano. Por lo tanto, ISIS 408737 inhibiría específicamente solo el ARNm de huntingtina murina de tipo salvaje y no el ARNm de huntingtina mutante humana en los ratones. 'Tg' indica que los ratones BACHD y 'Non-Tg' indica los ratones de control no transgénicos. [0356] Los resultados del estudio indican que la inhibición de ARNm de la huntingtina mutada humana por ISIS 15 388241 (ASO Tg-humano) mejoró significativamente el rendimiento de los ratones en el ensayo de rotarod en comparación con el control (Tg-PBS). Los resultados también indican que el tratamiento de ratones con ISIS 387898 (Tg-Human-mouse ASO), que se dirige tanto al ARNm de huntingtina mutante como de tipo salvaje en los ratones, no causó ningún efecto perjudicial sobre el rendimiento motor de los ratones y, de hecho, también mejoró significativamente el rendimiento de rotarod en comparación con el control (Tg-PBS). Los ratones tratados con ISIS 20 408737 (Tg-Mouse ASO) no mostraron un rendimiento de rotarod mejorado en comparación con el control de PBS, como se esperaba, ya que el oligonucleótido no se dirige al mutante de ARNm de huntingtina. Los controles no transgénicos se utilizaron como controles positivos en este ensayo. 25 30 35 40 45 50 55 60 65 72 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 73 Ejemplo 14: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm de huntingtina sobre la masa cerebral de ratones R6/2 5 [0357] Ratones R6/2 fueron tratados con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) para el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos frente a la expresión del ARNm de huntingtina sobre el peso y volumen del cerebro. 10 Tratamiento [0358] Ratones R6/2 fueron alojados en grupos de hasta 5 por jaula (genotipos mixtos, sexo único), Todos los animales fueron alojados en jaulas de caja de zapatos con madera estéril que cubre el suelo la cual se cambia con tanta frecuencia como sea necesario para proporcionar ropa de cama seca a los animales. Este ambiente básico se 15 enriqueció con la adición de túneles de juego, nido desmenuzado, y huesos de plástico para todos los ratones; es decir, una jaula enriquecida con el medio ambiente que contiene un túnel de ratón (color ámbar, certificado, transparente, producto BioServ nº K3323), un Petite Green Gumabone (producto BioServ nº K3214) y un nódulo (Hockley et al., Ann Neurol.: 235 - 242). Alimentos y agua estaban disponibles ad libitum a los ratones en sus jaulas. 20 [0359] A un grupo de ratones de seis meses de edad R6/2 a menudo se administró 50 µg/día de ISIS 388817 administrado ICV con bombas Alzet 1004 a razón de 0,12 µl/h durante 4 semanas. A un grupo de dos compañeros de camada no transgénicos se administró 50 µg/día de ISIS 388817 administrado de una manera similar. A un grupo de control de ratones de cinco R6 2/m se administró 50 g/día de ISIS 141923 adminsitrado de una manera similar. A un grupo de control de nueve ratones R6/2 se administró PBS administrado de una manera similar. A un grupo de 25 ocho compañeros de camada no transgénicos se le administró PBS suministrado de una manera similar. También se incluyeron en el estudio un grupo de cuatro R6/2 pre-sintomáticos sin tratamiento de ocho semanas sin tratar. Medición del peso cerebral 30 [0360] Los animales se anestesiaron con isofluorano y después se sometieron a perfusión transcardial con tampón de fosfato enfriado en hielo de Sorenson (SPB), y se fijaron con 4% en paraformaldihido SPB. Los cerebros fueron removidos y recortados con cortes coronales inmediatamente rostrales al prosencéfalo (retirando los bulbos olfativos) e inmediatamente caudales al cerebelo (retirando la médula espinal). El resto del cerebro se pesó en mg. Los resultados se presentan en la Fig. 8 y Tabla 74 y demuestran el aumento en el peso del cerebro en R6/2 ratones 35 tratados con ISIS 388817 en comparación con el control de PBS Tabla 74 40 45 50 Ejemplo 15: Efecto de la inhibición antisentido del ARNm de huntingtina sobre el rendimiento de ansiedad de ratones YAC128 [0361] Los ratones YAC128 se trataron con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular (ICV) 55 con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleótidos contra la expresión de ARNm huntingtina sobre la ansiedad en estos ratones, medido por su rendimiento en el campo abierto y ensayos de laberinto elevado en cruz. Tratamiento 60 [0362] A un grupo de siete ratones YAC128 de cinco meses de edad se administró 50 µg/día de ISIS 388241 ICV administrado con bombas de Alzet 1004 a una velocidad de 0,5 µl/h durante 14 días. Un grupo de control de cuatro ratones YAC128 se trató de forma similar con PBS. Se incluyeron en el estudio un grupo de control de ocho compañeros de camada no transgénicos de FVB/NJ y no recibieron ningún tratamiento. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas de la siguiente manera: Brevemente, las bombas osmóticas Alzet 65 (Modelo 2002) se ensamblaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bombas se llenaron con una Efecto de la inhibición antisentido de ARNm de huntingtina mutante sobre el peso del cerebro (mg)Modelo de ratón Tratamiento Peso del cerebro R6/2 PBS367 ISIS 141923375 ISIS 388817394 R6/2 (8 weeks old) None402 Non-transgenic ISIS 141923452 ISIS 388817436 74solución que contenía el oligonucleótido antisentido y se incubaron durante la noche a 37ºC, 24 horas antes de la implantación. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en un marco estereotáctico. Después de esterilizar el sitio quirúrgico, se realizó una incisión en la línea media sobre el cráneo, y se creó una cavidad subcutánea en la parte posterior, donde se implantó una bomba osmótica precargada. Se realizó un pequeño orificio de rebaba a través del cráneo por encima del ventrículo lateral derecho. Una cánula, conectada a la 5 bomba osmótica a través de un catéter plástico, se colocó entonces en el ventrículo y se pegó en su sitio usando adhesivo Loctite. La incisión se cerró con suturas. El oligonucleótido antisentido o PBS se infundió durante 14 días, después de lo cual se retiraron las bombas. Se permitió a los animales recuperarse durante 2 semanas después de lo cual se realizó el análisis conductual y los ratones fueron finalmente sacrificados de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales. El cerebro y el tejido de la médula 10 espinal se cosecharon y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Antes de la congelación, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 estaban aproximadamente a 2 mm entre sí, siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal. Ensayo de campo abierto 15 [0363] Los ratones fueron colocados en una arena de campo abierto (Med Associates) que utiliza interrumpciones de barrera para medir el movimiento horizontal y vertical a través de una sesión de prueba de 30 min. Los datos se analizaron utilizando el software Activity Monitor para examinar el movimiento ambulatorio total dentro de la zona y el movimiento dentro del centro de la zona como una medida de ansiedad. Se esperaba que los ratones control 20 YAC128 pasaran menos tiempo en el centro de la zona en comparación con sus compañeros de camada no transgénicos, menos propensos a la ansiedad FVB/NJ. Los resultados se presentan en la Fig. 9 y la Tabla 75 e indican que el tratamiento de ratones YAC128 con oligonucleótidos antisentido disminuyó la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros del ensayo de campo abierto. 25 Tabla 75 30 35 Ensayo de Laberinto Elevado en Cruz [0364] El aparato consistía en dos brazos abiertos y dos brazos cerrados midiendo cada uno 65 x 6,25 cm y se eleva 50 cm por encima del suelo. Los ratones se colocaron en el centro del aparato y su ubicación se registró durante una sesión de prueba de 5 minutos. Se esperaba que los ratones control YAC128 pasaran menos tiempo en 40 los brazos abiertos del aparato en comparación con sus compañeros de camada no transgénicos, menos propensos a la ansiedad de FVB/NJ. Los resultados se presentan en la Fig. 10 y la Tabla 76 e indican que el tratamiento de ratones YAC128 con oligonucleótidos antisentido disminuyó la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros del ensayo de laberinto elevado. 45 Tabla 76 50 55 Análisis de ARN y proteínas. [0365] El ARN total se extrajo de cerebro de ratón y la médula espinal con RNeasy Proteger Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina utilizando un kit de preparación de RNeasy Mini (Qiagen). Las reacciones Q-PCR se realizaron y se analizaron en un detector de 60 secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm de caza humana se midieron usando la sonda de cebador humano RTS2686 y normalizaron a los niveles de ARNm de isomerasa de peptidilprolilo A. [0366] Lisados de proteína se prepararon a partir de losas de cerebro de ratón como se ha descrito anteriormente (Li y Li SH XJ, Methods in Molecular Biology (2008), 217: 1940-6029). Los lisados se aplicaron en un gel de tris-acetato Efecto de la inhibición antisentido de ARNµMutante de htt sobre el comportamiento en campo abierto de ratones YAC128 Modelo de ratón Tiempo en el centro (seg) Control FVB 1326 Control YAC128 964 ISIS 388241 tratado YAC1281433 Efecto de la inhibición antisentido de ARNµMutante de htt sobre el rendimiento de laberinto elevado en cruz de ratones YAC128 Modelo de ratones % de tiempo de brazos abiertos FVB control 32 YAC128 control 18 ISIS 388241 treated YAC12827 75al 3-8% y se transfirieron utilizando el sistema de transferencia seca iBlot (Invitrogen). Las manchas se probaron con anticuerpo anti-beta tubulina (Chemicon) y ratón EM48 monoclonal que reacciona específicamente con la proteína de huntingtina humana (Millipore). Las inmunotransferencias se cuantificaron usando software Odyssey V3.0. [0367] Los resultados se presentan en la Tabla 77 como el porcentaje de reducción en comparación con el control 5 PBS y demuestran la inhibición significativa de los niveles de ARNm y de la proteína huntingtina por el oligonucleótido antisentido. Tabla 77 10 15 Ejemplo 16: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra huntingtina en ratones C57/BL6 [0368] Los ratones C57/BL6 fueron tratados con oligonucleótidos ISIS vía administración intracerebroventricular 20 (ICV) al ventrículo lateral derecho, con el propósito de la evaluación de la tolerabilidad de los oligonucleótidos en estos ratones. Tratamiento y cirugía 25 [0369] A los grupos de cinco ratones C57/BL6 cada uno se administraron ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444659, ISIS 444660 o ISIS 444661 a 150 µg/día ICV administrado con bombas Alzet 2002 a razón de 0,5 µl/día durante 2 semanas. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6 se trató de forma similar con PBS. El procedimiento para la implantación de las bombas y administración de oligonucleótidos se describe en el Ejemplo 6. 30 [0370] Los animales se dejaron recuperar durante dos semanas antes de sacrificarse utilizando isoflurano. El cerebro y el tejido de la médula espinal se cosecharon y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Antes de la congelación, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 estaban aproximadamente a 2 mm entre sí, siendo S1 la más 35 rostral y S5 la más caudal. Análisis de ARN [0371] El ARN total fue extraído a partir de cortezas anterior y posterior del cerebro en análisis PCR en tiempo real 40 de los niveles de ARNm de la huntingtina utilizando un kit de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Las reacciones de TI-PCR se realizaron en un Detector de Secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm de huntingtina de ratón se midieron usando un conjunto de sonda de cebador murino RTS2633 y se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina. Los resultados se presentan en la Tabla 78 como porcentaje de reducción en comparación con el control de PBS. ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444627 e ISIS 444652, todos tienen un 45 desajuste con el ARNm de huntingtina murina (SEQ ID NO: 3) y por lo tanto no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm murina en comparación con el control. [0372] El marcador microglial, AIF1 también se midió por análisis de TI-PCR usando el conjunto de sonda de cebador murino mAIF1_LTS00328 (secuencia hacia delante TGGTCCCCCAGCCAAGA, designado aquí como SEQ 50 ID NO: 54; Secuencia inversa CCCACCGTGTGACATCCA, designada aquí como SEQ ID NO: 55 ; Secuencia de sonda AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTGG, designada aquí como SEQ ID NO: 56). Los resultados se presentan en la Tabla 79 e indican que los oligonucleótidos ISIS probados no indujeron una respuesta inflamatoria. 55 60 65 Porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina en ratones YAC128 % de inhibición ARNM 85 proteína 86 76Tabla 78 5 10 15 Tabla 79 20 25 30 35 Mediciones del peso corporal 40 [0373] Los pesos corporales se midieron a intervalos regulares durante todo el período de estudio, y se presentan en la Tabla 80. Estos pesos se utilizaron como un indicador de la tolerabilidad. Los ratones tratados con ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 tuvieron un peso corporal consistente durante todo el período de estudio y se consideraron los más tolerables de todos los oligonucleótidos ISIS incluidos en el estudio. 'n/a' indica que no hay datos para ese grupo de ratones. 45 Tabla 80 Porcentaje de inhibición de ARNm de huntingtina murina en comparación con el control en ratones C57/BL6 ISIS Noanteriorposterior 3879167274 4375275962 4445786969 44458409 4446075979 4446084166 444627 41 45 444652 61 64 444660 35 33 444661 72 69 Porcentaje de aumento en la expresión de ARNm de AIF1 en comparación con el control en ratones C57/BL6 ISIS Noanteriorposterior 38791615967 43752710277 444578227 4445843337 4446073458 444608291 4446274622 4446525950 444660-311 4446616762 Los pesos corporales de los ratones C57/BL6 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido Día 0 Día 4 Día 8Día 12Día 16Día 19Día 23 Día 26 Día 28PBS 105 108 111114111111113 114 112ISIS 387916 107 108 106111106104101 101 97ISIS 437527 105 116 116120111112112 108 108ISIS 444578 105 116 1121151039883 81 87ISIS 444584 105 117 115111105105103 104 102ISIS 444607 105 115 11211010198106 109 106ISIS 444608 102 111 112112979178 75 87ISIS 444627 105 116 12412610510493 94 91ISIS 444652 106 122 124126119113111 111 108ISIS 444659 105 118 123116928968 n/a n/aISIS 444660 104 115 120 118 103 93 89 84 90 ISIS 444661 107 125 120 106 76 86 89 86 91 77Ejemplo 17 Ensayo de efectos neurotóxicos de la administración en bolos de oligonucleótidos antisentido en el tejido estriatal de ratas. [0374] Las ratas Sprague-Dawley fueron tratadas con oligonucleótidos ISIS a través de la administración en bolo para el cuerpo estriado, con el propósito de la detección de la inducción de AIF1 de marcador microglial como 5 medida de la toxicidad en el SNC. Tratamiento y cirugía [0375] A los grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se les administró ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 10 437527, ISIS 444584, ISIS 444591 o ISIS 444652 administrado como un único bolo a una concentración de 25 µg, 50 µg, 75 µg, o 100 µg. [0376] Un grupo de 4 ratas fueron tratados de manera similar con ISIS 387916, administrado como un solo bolo a concentraciones de 10 µg, 25 µg, 50 µg, o 75 µg. Un grupo control de 4 ratas se trató de forma similar con PBS. 15 Siete días después de la administración del bolo, las ratas se sometieron a eutanasia utilizando isoflurano y se retiraron los órganos. Los animales fueron decapitados y el cerebro fue removido para la disección del tejido estriatal. Un par de pinzas finas curvas fue colocado directamente hacia abajo en el cerebro justo antes del hipocampo para hacer una incisión transversal en la corteza y los tejidos subyacentes por disección romo. Las puntas de otro par de fórceps finos curvados se colocaron directamente hacia abajo a lo largo del seno medio entre 20 el hipocampo y el bulbo olfatorio para hacer una incisión longitudinal, cortando el cuerpo calloso por disección romo. El primer par de pinzas se utilizó entonces para reflejar hacia atrás la esquina resultante de la corteza exponiendo el cuerpo estriado y la cápsula interna, y después para diseccionar la cápsula interna fuera del cuerpo estriado. El segundo conjunto de fórceps se colocó de tal manera que los extremos curvados estuvieran a cada lado del estriado y se presionaran para aislar el tejido. El primer conjunto de fórceps fue utilizado para pellizcar el extremo posterior 25 del estriado y para eliminar el estriado del cerebro. Análisis de ARN de los niveles de expresión de AIF1 [0377] Se extrajo ARN de tejido estriado para análisis en tiempo real de los niveles de PCR AIF1 de ARNm. Los 30 niveles de AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de sonda de cebador de rata rAif1_LTS00219. Los resultados se calcularon como el porcentaje de expresión de AIF1 sobre el del control de PBS y se presentan en la Tabla 81. Los resultados indican que ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584 e ISIS 444652 fueron bien tolerados en el cerebro de rata. 35 40 45 50 55 60 65 78Tabla 81 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ARN Análisis de los niveles de expresión de huntingtina [0378] Se extrajo ARN del tejido estriado para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. 50 Los niveles de ARNm de huntingtina de rata se midieron usando el conjunto de sonda de cebador de rata rHtt_LTS00343. Los resultados se calcularon como el porcentaje de reducción de la expresión de la huntingtina sobre el del control de PBS y se presentan en la Tabla 82. ISIS 388241 e ISIS 443139 están desajustados cada uno por 6 pares de bases o más con la secuencia de gen de rata y SEQ ID NO: Por lo tanto no muestran una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. ISIS 444584 tiene 3 desajustes con la 55 secuencia génica de rata (SEQ ID NO: 5) y por lo tanto no muestra una inhibición significativa de los niveles de ARNm de rata en comparación con el control. Tabla 82 60 65 Los pesos corporales de los ratones C57/BL6 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS Nº Dosis (mg) % de incremento 387916 10 145 251575024775316388241 25 29 5012753010041436671 25 37 502751310050443139 25 0 5077516710026444591 25 18 50807550100207437527 259850457523100126444584 25-15010753510031444652 25175046753910048 79Porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de huntingtina de rata en ratas ISIS No Dosis (µg) % de inhibición 387916. 10 6 25 39 50 55 75 60 388241 25 8 50 23 75 27 100 19 436671 25 52 50 57 75 57 100 70 443139 25 35 50 29 75 28 100 27 444591 25 26 50 57 75 68 100 69 437527 25 40 50 55 75 60 100 74 444584 25 43 50 38 75 38 100 41 444652 25 49 50 70 75 55 100 59 5 10 15 20 25 30 35 40 Ejemplo 18: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos primarios de cinomolgous [0379] ISIS 437527, ISIS 444584, e ISIS 444652 se ensayaron en hepatocitos primarios de cinomolgous a diversas 45 dosis. Los oligonucleótidos de referencia, ISIS 387916 e ISIS 388241 también se incluyeron para comparación. Las células se sembraron en placas a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 39.0625 nM, 78.125 nM, 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM y 20.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción de ARNm de huntingtina mediante PCR 50 cuantitativa en tiempo real usando sonda de cebador RTS2686. Los niveles de transcripción de ARNm de huntingtina se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 83 como porcentaje de inhibición de la huntingtina, en relación con las células de control no tratadas. El oligonucleótido de control, ISIS 141923 se incluyó en este ensayo y no demostró la inhibición del ARNm de huntingtina, como se esperaba. 55 [0380] ISIS 437527, ISIS 444584, e ISIS 444652 tenían menores valores de CI50 que el oligonucleótido de referencia, ISIS 388241. ISIS 437527 e ISIS 444652 tenía valores CI50 tan bajos o más bajos que el oligonucleótido de referencia, ISIS 387916. 60 Tabla 83 65 80 5 10 15 20 Ejemplo 19: Medición de la vida media de los oligonucleótidos ISIS en ratones BACHD mediante administración única de bolo intrastriatal [0381] A los ratones BACHD se administraron los oligonucleótidos ISIS como un único bolo para el cuerpo estriado para el propósito de medir la duración de la acción de los oligonucleótidos antisentido contra la expresión del ARNm 25 de la huntingtina, o su vida media, en ese tejido. Tratamiento y cirugía [0382] Los grupos de 25 ratones cada uno BACD fueron tratados con ISIS 388241, ISIS 436689, ISIS 436671 o ISIS 30 444591, entregado como un solo bolo de 40 µg en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 4. Un grupo de control de 25 ratones BACHD se trataron con PBS en un procedimiento similar. En varios puntos de tiempo, 5 ratones de cada grupo se sacrificaron y se extrajo el tejido estriado. Un par de pinzas finas curvas fue colocado directamente hacia abajo en el cerebro justo antes del hipocampo para hacer una incisión transversal en la corteza y los tejidos subyacentes por disección romo. Las puntas de otro par de fórceps finos curvados se colocaron 35 directamente hacia abajo a lo largo del seno medio medio entre el hipocampo y el bulbo olfatorio para hacer una incisión longitudinal, cortando el cuerpo calloso por disección romo. El primer par de pinzas se utilizó entonces para reflejar hacia atrás la esquina resultante de la corteza exponiendo el cuerpo estriado y la cápsula interna, y después para diseccionar la cápsula interna lejos del cuerpo estriado. El segundo conjunto de fórceps se colocó de tal manera que los extremos curvados estuvieran a cada lado del estriado y se presionaran para aislar el tejido. El 40 primer conjunto de fórceps fue utilizado para pellizcar el extremo posterior del estriado y para eliminar el estriado del cerebro. Análisis de ARN 45 [0383] Se extrajo ARN de las secciones anterior y posterior del tejido estriatal para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de la huntingtina. Se midieron los niveles de ARNm de huntingtina mutante humana usando RTS2617. Los niveles de ARNm de caza normal de ratones se midieron usando el conjunto de sonda de cebador murino RTS2633. Los resultados se presentan en las Tablas 84 y 85 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con el promedio del grupo control de PBS en la semana 1, la semana 10 y la semana 20. La vida 50 media de los oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro Se calculó a partir de la inhibición y se presenta en la Tabla 86. 55 60 65 Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de huntingtina en hepatocitos primarios cinomolgosos ISIS 387916 ISIS 388241ISIS 437527ISIS 444584ISIS 444652 ISIS 14192339.0625 nM 0 6000 078.125 nM 17 419016 0156.25 nM 6 0271112 3312.5 nM 19 0231635 0625.0 nM 31 0373050 01250.0 nM 45 0282352 02500.0 nM 62 4334774 05000.0 nM 78 54554286 010000.0 nM 82 80687791 020000.0 nM 84 75706992 0CI50(mM) 1,4 5,42,04,00,8 >20 81Tabla 84 5 10 15 20 25 30 Tabla 85 35 40 45 50 55 60 65 Porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina humana en varios puntos temporales ISIS Nº Tiempo (semana) Posterior Anterior388241 17291 56586 105273 152656 201453 436671 18292 57889 106882 156177 203077 444591 16085 55876 104860 152743 202736 436689 17283 57287 106074 155074 204459 Porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina de ratón en varios puntos temporales ISIS Nº Tiempo (semana) Posterior Anterior 388241 1 1 12 5 22 36 10 17 14 15 7 18 20 9 38 436671 1 84 96 5 77 80 10 64 86 15 51 78 20 19 75 444591 1 74 95 5 70 90 10 57 67 15 34 47 20 33 38 436689 1 40 32 5 47 40 10 35 18 15 34 22 20 36 5 82Tabla 86 5 10 Mediciones del peso corporal 15 [0384] Los pesos corporales se midieron a intervalos regulares, y se presentan en la Tabla 87 como un por ciento del peso de los ratones al inicio del estudio. Estos pesos se utilizaron como un indicador de tolerabilidad. No hubo cambios adversos en el peso corporal en ninguno de los ratones tratados con oligonucleótidos ISIS. Tabla 87 20 Ejemplo 20 Efecto de la administración intratecal de ISIS 437527 en ratas Sprague Dawley [0385] A Ratas Sprague Dawley se les administró ISIS 437527 por la administración intratecal (IT) o bien como una dosis única, dosis repetidas, o infusión continua. 25 Tratamiento y cirugía [0386] Las ratas se anestesiaron con isoflurano y un catéter de poliuretano de calibre 28 se colocó en el espacio lumbar IT de cada rata. El extremo proximal del catéter se unió a un pedestal de dosificación que se extendió a través de la piel para animales en grupos que recibían inyecciones en bolo. El catéter para animales en el grupo que 30 recibió infusión continua se unió a una bomba ALZET (Modelo 2ML1) que se colocó en una bolsa subcutánea en la cara dorsal de cada animal. Después de la cirugía, los animales recibieron una dosis intramuscular única de ceftiofur sódico (5 mg/kg) y tartrato de butamanol (0,05 mg/kg). Las ratas que recibieron infusión continua comenzaron a recibir inmediatamente la dosis de oligonucleótido. A los animales que recibirían inyecciones en bolo se les permitió un período de recuperación quirúrgica de al menos cinco días después de lo cual se evaluó la permeabilidad del 35 catéter. [0387] A un grupo de 5 ratas Sprague Dawley se administró una sola inyección en bolo de 350 µg de ISIS 437527 administrado por vía intratecal. A otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley se administró inyecciones en bolo de 120 µg de ISIS 437527 administrado por vía intratecal tres veces en el transcurso de 1 semana. A otro grupo de 5 ratas 40 Sprague Dawley se administró inyecciones en bolo de 350 µg de ISIS 437527 administrado por vía intratecal tres veces en el transcurso de 1 semana. A otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley se administró 50 µg/día de ISIS 437527 administrado por infusión continua a una velocidad de 0,01 ml/hr durante 7 días. Se administró a un grupo de control de 5 ratas Sprague Dawley inyecciones en bolo de PBS administradas por vía intratecal tres veces durante el transcurso de una semana. A cada grupo se le dio un período de recuperación de 7 días, después de lo 45 cual las ratas fueron sacrificadas. El cerebro y la médula espinal de todos los grupos fueron cosechados y analizados. Análisis de ARN de los niveles de expresión de huntingtina 50 [0388] El ARN se extrae de la corteza frontal, la corteza temporal, y la médula cervical para análisis en tiempo real de los niveles de PCR ARNm de huntingtina. Los niveles de ARNm de huntingtina de rata se midieron usando el conjunto de sonda de cebador rHtt_LTS00343 normalizado a los niveles de ciclofilina. Los resultados se presentan La vida media de los oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro en ratones BACHD después de la inyección de bolo intrastriatal ISIS Nº Vida media (días) 436671 46,6436689 39,4444591 24,3388241 25,8Porcentaje de cambio en el peso corporal de ratones BACHD después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido Semana 5 Semana 10Semana 15 Semana 20PBS 8 192628ISIS 388241 9 222926ISIS 436671 5 193538ISIS 444591 7 213043ISIS 436689 3 183138 83en la Tabla 88 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con el promedio de los grupos de control de PBS. Tabla 88 5 10 15 20 25 Análisis de ARN de los niveles de expresión de AIF1 [0389] Se extrajo ARN de corteza frontal, corteza temporal, y médula cervical para análisis PCR en tiempo real de los niveles de AIF1 de ARNm. Los niveles de AIF1 de rata se midieron usando el conjunto de sonda de cebador de rata rAif1_LTS00219. Los resultados se calcularon como el porcentaje de expresión de AIF1 sobre el del control de 30 PBS y se presentan en la Tabla 89. Los resultados indican que las administraciones repetidas de bolo de TI conducen a inflamación en los tejidos de la médula cervical. La administración continua de TI y las administraciones individuales de bolo de TI fueron bien toleradas en las ratas. Tabla 89 35 40 45 50 55 Ejemplo 21 Medición de la vida media de ISIS 436689 en los tejidos del SNC de monos cinomolgos mediante administración intratecal [0390] A monos cinomolgos se les administró ISIS 436689 por vía intratecal (IT) para el propósito de medir la vida 60 media y la duración de acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión del ARNm de la huntingtina en diversos tejidos del SNC. Tratamiento 65 [0391] El estudio se realizó en Northern Biomedical Research, MI. Antes del inicio del tratamiento, los monos se Porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de huntingtina en ratas Sprague Dawley Tejido Horario de dosis Dosis % de inhibición Corteza frontal Infusión de TI 50 µg/día 11 Bolo de TI individual 350 µg 28 Bolo de IT repetido 120 µg X3 21 Bolo de IT repetido 350 µg X3 0 Corteza temporal Infusión de TI 50 µg/día 0 Bolo de TI individual 350 µg 34 Bolo de IT repetido 120 µg X3 44 Bolo de IT repetido 350 µg X3 48 Cordón cervical Infusión de TI 50 µg/día 22 Bolo de TI individual 350 µg 45 Bolo de IT repetido 120 µg X3 58 Bolo de IT repetido 350 µg X3 46 Porcentaje de expresión de los niveles de ARNm de AIF1 en ratas Sprague Dawley como medida de neurotoxicidad Tejido Horario de dosis Dosis % de inhibición Corteza frontal Infusión de TI 50 µg/día -36 Bolo de TI individual350 µg-4 Bolo de IT repetido120 µg X341 Bolo de IT repetido350 µg X3-7 Corteza temporal Infusión de TI 50 µg/día 15 Bolo de TI individual350 µg22 Bolo de IT repetido120 µg X325 Bolo de IT repetido350 µg X376 Cordón cervical Infusión de TI 50 µg/día 108 Bolo de TI individual350 µg72 Bolo de IT repetido120 µg X3473 Bolo de IT repetido350 µg X3268 84mantuvieron en cuarentena durante un período de 4 semanas, durante el cual se realizaron paneles estándar de química sérica y hematología, examen de muestras fecales de óvulos y parásitos y una prueba de tuberculosis fuera de los monos anormales o enfermos. Los monos fueron implantados con catéteres lumbares intratecales utilizando catéteres de poliuretano conectados a un puerto de acceso de titanio subcutáneo (portal de plástico/titanio P.A.S. PORT® Elite con conector de bloqueo Ultra). Para la infusión continua usando una bomba externa, los animales 5 fueron anestesiados para unir el aparato de dosificación al puerto. Los animales fueron pretratados con sulfato de atropina por inyección subcutánea a una dosis de 0,04 mg/kg. Aproximadamente 15 minutos más tarde, se se administró una dosis intramuscular de 8 mg/kg de ketamina HCl para inducir la sedación. Los animales fueron enmascarados a un plano quirúrgico de anestesia, intubados y mantenidos en aproximadamente 1 L/min de oxígeno y 2% de halotano o isoflurano. Los animales recibieron una dosis intramuscular de 5 mg/kg de ceftiofur sódico 10 antibiótico. Se realizó una incisión cerca del puerto para la colocación del soporte de aguja modificado. La aguja modificada se colocó en el puerto y se aseguró con suturas. Tras la recuperación de la cirugía, una chaqueta se colocó en el animal. [0392] A quince monos cinomolgos macho se les administró 4 mg/día de ISIS 436689 a una concentración de 1,67 15 mg/ml y a una velocidad de flujo de 2,4 ml/día durante 21 días. Se administró a un grupo de control de 3 monos cinomolgos PBS de una manera similar durante el mismo período de tiempo. Se permitió a grupos de 3 monos cada uno de los períodos de recuperación de 1 día, 2 semanas, 4 semanas u 8 semanas, después de lo cual se sacrificaron. Durante el período de estudio, los monos se observaron diariamente para detectar signos de enfermedad o angustia. 20 [0393] Todos los animales fueron sedados con una inyección intramuscular de 8,0 mg/kg de ketamina HCl, mantenido en un halotano o de la mezcla de isoflurano/oxígeno, y provisto de un bolo intravenoso de heparina Na en 200 UI/kg. Los animales se perfundieron a través del ventrículo cardíaco izquierdo con nitrito de sodio al 0,001% en solución salina. 25 [0394] En el momento del sacrificio, el cerebro se cortó en una matriz cerebral a 3 mm de grosor de corte coronal. Se muestrearon varias estructuras cerebrales usando un punzón de biopsia de 4 mm. Una muestra de 4 mm de diámetro de cada estructura se colocó en 2 ml tornillo tubos que contienen 1,0 ml de solución de estabilización de ARN ARNlater (Qiagen, CA), se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se congelaron. Se 30 colocaron muestras adyacentes de 6 mm de diámetro en tubos tapados con tornillo de 2 ml y se congelaron para análisis farmacocinéticos. [0395] La médula espinal se seccionó en secciones de cuello uterino, torácica y lumbar, y se tomaron secciones de aproximadamente 3 mm de espesor de cada área de la médula espinal para el ARN y el análisis farmacocinético. 35 Estas muestras fueron procesadas de una manera similar a las de las muestras de cerebro. [0396] Las muestras de hígado se recogieron para el ARN y análisis farmacocinético. Estas muestras se procesaron de una manera similar a las del cerebro y la médula espinal descritas anteriormente. 40 Análisis de ARN [0397] Se extrajo ARN de la médula espinal lumbar, la médula espinal torácica, la médula espinal cervical, la corteza frontal, la corteza occipital, la corteza cerebelar, el tejido caudado, el hipocampo, el cerebro medio, y la protuberancia para análisis en tiempo real PCR de los niveles de ARNm de huntingtina con conjunto de sonda de 45 cebador RTS2617. Los resultados medidos en las distintas secciones de la médula espinal se presentan en la Tabla 90 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con la medida en el grupo de control PBS a las 8 semanas. Los resultados medidos en las diferentes secciones del cerebro se presentan en la Tabla 91 y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con la medida en el grupo de control PBS a las 8 semanas. 50 Tabla 90 55 60 65 Efecto de ISIS 436689 IT administrado en la expresión del ARNm de la huntingtina en la médula espinal en diversos puntos temporales Período de recuperación Médula espinal lumbar Médula espinal torácica Medula espinal cervical 1 día 36 66 65 2 semanas 56 55 54 4 semanas 0 63 65 8 semanas 48 48 44

Claims (10)

197Reivindicaciones 1. Un oligonucleótido de una sola hebra modificado dirigido a un ácido nucleico que codifica la huntingtina y capaz de inhibir la expresión de huntingtina, en el que el oligonucleótido modificado comprende: 5 un segmento hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', 10 en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-azúcar de metoxietilo; en el que las uniones entre nucleósidos dentro del segmento de espacio, los enlaces que conectan el segmento de hueco 5' o segmento de ala 3', y los enlaces de los nucleósidos 5’-más y 3'-más de cada segmento de ala son todos enlaces de fosforotioato, los enlaces entre nucleósidos que conectan el resto de los nucleósidos tanto de 5’ y 3' segmentos de ala son enlaces de fosfodiéster; y 15 en el que todas las citosinas son 5-metilcitosinas; y en el que la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido consiste en una secuencia indicada en SEQ ID NO: 22 o 32.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido consiste 20 en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 22 (ISIS 443139).
3. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobasa del oligonucleótido consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 32 (ISIS 444652). 25
4. El oligonucleótido de cualquier reivindicación precedente, en el que se conjuga oligonucleótido.
5. Una composición que comprende el oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 30
6. Un oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición de la reivindicación 5, para uso en terapia.
7. Un oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición de la reivindicación 5 para uso en la prevención, el tratamiento, la mejora o la ralentización de la progresión de la enfermedad de 35 Huntington en un animal.
8. El oligonucleótido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el animal es un humano. 40
9. El oligonucleótido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido o la composición se co-administra con un segundo agente.
10. El oligonucleótido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el oligonucleótido o la composición y el segundo agente se administran concomitantemente. 45 50 55 60 65
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