ES2615737T3

ES2615737T3 - Composición inmunogénica

Info

Publication number: ES2615737T3
Application number: ES12726374.7T
Authority: ES
Inventors: Cindy Castado
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2017-06-08
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: IL229529B2; US20140093529A1; ES2968455T3; EP3138916A1; US10093722B2; PL2714911T3; EP3564378A1; HUE030823T2; EP3564378B1; CY1119916T1; RS55605B1; DK2714911T3; IL229529A0; PL2714910T3; BR112013030395B1; PT2714910T; JP5952390B2; PT3138916T; ES2660468T3; US9409974B2

Abstract

Un polipéptido que comprende un primer fragmento y un segundo fragmento, en el que (i) el primer fragmento es un fragmento de dominio de repetición de toxina A; (ii) el segundo fragmento es un fragmento de dominio de repetición de toxina B; (iii) el primer fragmento tiene un primer extremo proximal; (iv) el segundo fragmento tiene un segundo extremo proximal; y en el que el primer fragmento y el segundo fragmento están separados por menos de, o exactamente, 5 aminoácidos en la estructura primaria, en el que el polipéptido provoca anticuerpos que neutralizan tanto la toxina A como la toxina B, en el que el primer extremo proximal está dentro de una repetición corta, el segundo extremo proximal está dentro de una repetición corta y el primer extremo proximal y el segundo extremo proximal no interrumpen las porciones de repetición corta - repetición larga - repetición corta.

Description

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(continuación)

Nombre: Posición inicial Posición final

ToxA_III: RC1 2059 2078

RC2: 2079 2099

RC3: 2100 2120

RC4: 2121 2141

RC5: 2142 2161

RL: 2162 2192

TOGA_II: RC1 2193 2212

RC2: 2213 2233

RC3: 2234 2253

RC4: 2254 2275

RL: 2276 2306

ToxA_V: RC1 2307 2326

RC2: 2327 2347

RC3: 2348 2368

RC4: 2369 2389

RC5: 2390 2409

RL: 2410 2440

ToxA_VI: RC1 2441 2460

RC2: 2461 2481

RC3: 2482 2502

RC4: 2503 2522

RL: 2523 2553

ToxA_VII: RC1 2554 2573

RC2: 2574 2594

RC3: 2595 2613

RL: 2614 2644

ToxA_VIII: RC1 2645 2664

RC2: 2665 2686

RC3: 2687 2710

ToxB_I: RC1 1834 1854

RC2: 1855 1876

RC3: 1877 1896

RL: 1897 1926

ToxB_II: RC1 1927 1946

RC2: 1947 1967

RC3: 1968 1987

RC4: 1988 2007

RC5: 2008 2027

RL: 2028 2057

ToxB_III: RC1 2058 2078

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proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1947-1967 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2687-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1877-1896 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2687-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1855-1876 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2687-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 1 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1834-1854 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 4 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1988-2007 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1968-1987 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1947-1967 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1877-1896 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1855-1876 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VIII de la toxina A (aminoácidos 2665-2686 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 1 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1834-1854 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VII de la toxina A (aminoácidos 2594-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 4 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1988-2007 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VII de la toxina A (aminoácidos 2594-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1668-1987 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VII de la toxina A (aminoácidos 2594-2710 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1947-1967 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VII de la toxina A (aminoácidos 2574-2594 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1855-1876 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición VII de la toxina A (aminoácidos 2574-2594 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 1 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1834-1854 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VI de la toxina A (aminoácidos 2482-2502 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 4 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1988-2007 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VI de la toxina A (aminoácidos 2482-2502 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1968-1987 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VI de la toxina A (aminoácidos 2482-2502 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición II de la toxina B (aminoácidos 1947-1967 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VI de la toxina A (aminoácidos 2482-2502 de SEQ ID Nº 1 o sus equivalentes en una cepa diferente) y el segundo extremo proximal está dentro de la repetición corta 2 de la porción de repetición I de la toxina B (aminoácidos 1855-1876 de SEQ ID Nº 2 o sus equivalentes en una cepa diferente). En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la repetición corta 3 de la porción de repetición VI de la toxina A (aminoácidos 2482-2502 de SEQ ID Nº 1 o sus

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recurrentes de una enfermedad provocada por C. difficile.

Una aplicación adicional de la invención es el uso de la composición inmunogénica o vacuna o kit de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad provocada por C. difficile. En una realización se proporciona una composición inmunogénica de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de episodios primarios y/o recurrentes de una enfermedad provocada por C. difficile.

"Alrededor de" o "aproximadamente" se definen como dentro de 10 % más o menos de la cifra dada para los fines de la invención.

Los autores de la invención pretenden que las expresiones "que comprende", "comprende" y "comprenden" de la presente memoria, puedan sustituirse opcionalmente con las expresiones "consistente en", "consiste en" y "consisten en", respectivamente, en cada caso. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprenden" y "comprendiendo", implican la inclusión de un compuesto o composición estipulados (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, antígeno), o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro compuesto, composición, etapas o grupos de los mismos. La abreviatura "p. ej." procede del latín exempli gratia, y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónimo de la expresión "por ejemplo".

Las realizaciones del presente documento que se refieren a "composiciones de vacuna" de la invención también son aplicables a realizaciones relacionadas con "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los términos singulares "un(o)/una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados y se proporcionan para su descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.

Todas las referencias o solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva de patente se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad.

Para que la presente invención pueda entenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse de ninguna manera como que limitan el ámbito de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño de cinco fusiones ToxA-ToxB de C. difficile

Se diseñaron proteínas de fusión que contenían fragmentos de los dominios de repetición C terminal de ToxA y ToxB. Estas fusiones contenían un fragmento del dominio de repetición C terminal de ToxA y un fragmento del dominio de repetición de C terminal de ToxB y una unión entre el extremo C terminal del fragmento ToxA y el extremo N terminal del fragmento ToxB. Se idearon dos estrategias, en la primera estrategia, la fusión se diseñó de tal manera que la estructura alargada de tipo solenoide se mantuvo en la unión entre los dos fragmentos. En la segunda estrategia, los dos fragmentos de las fusiones están separados por un enlazador para permitir su plegamiento correcto independiente.

La parte C terminal de ToxA y B se compone de secuencias repetidas: repeticiones cortas (RC) y repeticiones largas (RL) (PNAS 2005 vol 102: 18373-18378).

La estructura 3D parcial conocida para el dominio C terminal de ToxA (PNAS 2005 Greco y col., Vol. 102: 1837318378; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5): 460-461; PDB códigos: 2F6E, 2G7C y 2QJ6).

Los inventores predijeron que había dos tipos de interacciones importantes entre los restos de la parte C terminal de ToxA y de ToxB. La primera interacción se produce entre restos contenidos en una RL y su anterior RC y es importante para mantener la estructura de tipo solenoide. El segundo tipo de interacción se produce entre los restos

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Las fracciones que contenían las proteínas de fusión se seleccionaron basándose en la pureza por SDS-PAGE y se dializaron frente a un tampón de bicina (Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, con o sin EDTA 5 mM, pH 8,0). La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteínas DC de BioRad. Las proteínas se agruparon así, se filtraron estériles en un filtro de 0,22 mm, se conservaron a -80 ° C.

Como alternativa, la purificación en IMAC fue precedida por una etapa de purificación en DEAE usando tampón de bicina 2 mM (pH 8,0) para carga y lavado, y se eluyó usando un gradiente con el mismo tampón pero con NaCl 1 M añadido.

Ejemplo 3 – Clonación, expresión y purificación de los fragmentos de C. difficile Tox A y Tox B separados

Plásmido de expresión y cepa recombinante:

Los genes que codificaban los fragmentos de proteína de ToxA y ToxB (SEQ ID Nº 8 y SEQ ID Nº 9) y una etiqueta de His se clonaron en el vector de expresión pET24b (+) utilizando los sitios de restricción NdeI/XhoI utilizando procedimientos convencionales. La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa BLR (DE3) de E. coli con el vector de expresión recombinante de acuerdo con el procedimiento estándar con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. «Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).

Cepa huésped:

BLR(DE3). BLR es un derivado recA de BL21. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago A que contiene una ARN polimerasa de T7 inducible por IPTG. Se diseñaron lisógenos DE3 para la expresión de proteínas a partir de vectores pET. Esta cepa es también deficiente en las proteasas Ion y ompT.

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Genotipo: cepa E.coli BLR::DE3, F-ompT hsdSB(rB mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR)

Expresión de las proteínas recombinantes:

Se separó un transformante de E. coli de la placa de agar y se usó para inocular 200 ml de caldo de LBT ± glucosa 1 % (p/v) + kanamicina (50 g/ml) para obtener una D.O.600nm entre 0,1-0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, a 250 rpm.

Este cultivo de una noche se diluyó a 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 g/ml) y se cultivó a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620 alcanzó 0,5/0,6.

A una D.O. a 600 nm de aproximadamente 0,6, el cultivo se enfrió antes de inducir la expresión de la proteína recombinante por adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; EMD Chemicals Inc., catálogo número: 5815) 1 Mm y se incubó durante una noche a 23 °C, a 250 rpm.

Después de la inducción durante la noche (alrededor de 16 horas), la D.O. a 600 nm se evaluó después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos y los sedimentos se congelaron a -20 ºC por separado.

Purificación:

El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM complementado con una mezcla de inhibidor de proteasa (Completa sin EDTA, Roche cat 11873580001) y benzonasa. (Roche cat 1.01695.0001). Las bacterias se lisaron usando un sistema de prensa francesa 2 x 20 000 PSI. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento) se separaron por centrifugación a 34 000 g

o a 48 000 g durante 25-30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se recogió y se filtró en un filtro de 0,22 mm.

La proteína etiquetada con 6 His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE (por ejemplo 15 ml) (cargados en Ni) preequilibrada con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de cargar, la columna se lavó con el mismo tampón.

Para ToxA:

La elución se realizó usando un tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y diferentes concentraciones de imidazol (5-100 mM). Tras el análisis en gel, se seleccionaron más fracciones puras, se concentraron y se cargaron en cromatografía SEC (SUPERDEX ™ 75) para una etapa más de purificación adicional en el mismo tampón sin imidazol.

Para ToxB:

Se realizó un segundo lavado con tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y desoxicolato 0,5 % o el mismo tampón con NaCl 150 mM. La elución se realizó usando un tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y diferentes concentraciones de imidazol (10-500 mM). Después del análisis en gel, se

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seleccionaron más fracciones puras, se complementaron con EDTA 5 mM y se cargaron en cromatografía SEC (SUPERDEX ™ 200) para una etapa de purificación adicional en el mismo tampón con EDTA 5 mM.

Las fracciones que contenían fragmentos ToxA o ToxB se seleccionaron basándose en la pureza por SDS-PAGE y se dializaron contra tampón de bicina (Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0), la concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteínas RCDC de BioRad. Las proteínas se agruparon así, se filtraron estériles en un filtro de 0,22 mm, se conservaron a -80 °C.

Ejemplo 4 – Evaluación del peso molecular de las cinco fusiones ToxA ToxB de C. difficile

La ultracentrifugación analítica se utiliza para determinar la homogeneidad y distribución por tamaño en solución de las diferentes especies dentro de una muestra de proteína midiendo la velocidad a la cual las moléculas se desplazan en respuesta a una fuerza centrífuga. Esto se basa en el cálculo de los coeficientes de sedimentación de las diferentes especies que se obtienen mediante el experimento de velocidad de sedimentación, que depende de su forma y masa moleculares.

1. Las muestras de proteína se centrifugan en una ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter PROTEOMELAB ™ XL-1 a 42.000 rpm después de haber equilibrado el rotor AN-60Ti a 15 °C.

a.: proteína de fusión F1, 500 g/ml, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0

b.: proteína de fusión F2, 500 g/ml, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0

c.: proteína de fusión F3, 500 g/ml, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0

d.: proteína de fusión F4, 500 g/ml, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0

e.: proteína de fusión F5, 500 mg/ml, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0

2.: Para la recogida de datos, se registraron 160 escáneres a 280 nm cada 5 minutos.

3.: El análisis de los datos se realizó utilizando el programa SEDFIT para la determinación de la distribución C(S). La determinación del volumen específico parcial de las proteínas se realizó con el programa informático SEDNTERP desde su secuencia de aminoácidos. También se usó SEDNTERP para determinar la viscosidad y la densidad del tampón.

4.: El peso molecular de las diferentes especies se determinó a partir del gráfico de distribución C(S) (concentración frente a coeficiente de sedimentación), considerando que es una mejor representación de los datos sin procesar que la distribución C(M) (concentración frente a peso molecular) para caracterizar la distribución por tamaño de una mezcla.

La Figura 8 describe la distribución de las fusiones ToxA-ToxB según se determina por ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación.

El peso molecular de las principales especies detectadas a partir de la distribución C(S) de las cinco proteínas de Fusión ToxA-ToxB, corresponde a su forma monomérica. Las relaciones de fricción mejor ajustadas determinadas para las cinco fusiones están entre 2 y 2,2. Esto puede indicar que las proteínas están presentes en la solución como una forma alargada, lo que sería coherente con la estructura de la proteína.

Ejemplo 5 -Evaluación de las estructuras secundarias y terciarias de fusiones ToxA-ToxB de C. difficile pordicroísmo circular y espectroscopia de fluorescencia

El dicroísmo circular se utiliza para determinar la composición de la estructura secundaria de una proteína midiendo la diferencia en la absorción de la luz polarizada a la izquierda frente a la luz polarizada a la derecha, que se debe a la asimetría estructural. La forma y la magnitud del espectro de DC en la región UV lejana (190-250 nm) son diferentes si una proteína presenta una estructura beta laminar, alfa helicoidal o espiral aleatoria. La abundancia relativa de cada tipo de estructura secundaria en una muestra de proteína dada se puede calcular por comparación con espectros de referencia.

La estructura terciaria de una muestra de proteína puede estimarse evaluando la inmovilización de los aminoácidos aromáticos. La observación de una señal de DC en la región UV cercana (250-50 nm) puede atribuirse a la polarización de restos de fenilalanina, tirosina y triptófano y es una buena indicación de que la proteína se pliega en una estructura bien definida.

Se utilizó el siguiente protocolo:

1. Los espectros en la región UV lejana se miden usando una trayectoria óptica de 0,01 cm de 178 a 250 nm, con una resolución de 1 nm y ancho de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720. La temperatura de la célula se mantiene a 23 °C mediante un bloque de células RTE-111 regulado con un termostato Peltier. Durante las

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mediciones se mantiene un flujo de nitrógeno de 10 l/min.

2. Los espectros en la región UV cercana se miden usando una trayectoria óptica de 0,01 cm de 250 a 300 nm, con una resolución de 1 nm y ancho de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720. La temperatura de la célula se mantiene a 23 °C mediante un bloque de células RTE-111 regulado con un termostato Peltier. Durante las mediciones se mantiene un flujo de nitrógeno de 6 l/min.

La observación de los espectros de UV lejana (figura 9) para las cinco proteínas de Fusión ToxA-ToxB sugiere un contenido débil de estructuras alfa helicoidales y un alto contenido de estructuras beta laminares. Además, todas las proteínas presentaban un máximo a 230 nm, lo que es inusual para las proteínas globulares solubles. Esta particularidad se ha caracterizado bien en la bibliografía y está asociada a un pequeño grupo de proteínas conocidas por su ausencia de hélices alfa y su alto contenido en láminas beta y aminoácidos aromáticos (Zsila, Analytical Biochemistry, 391(2009) 154-156). Esas particularidades son coherentes con la estructura que se espera para las proteínas de Fusión ToxA-ToxB. Se compararon las estructuras cristalinas de 13 proteínas que presentaban los espectros de DC característicos con una señal positiva a 230 nm (Protein Data Bank). El contenido medio de estructura secundaria de esas proteínas es 42 % en láminas beta ±9 % y 7 % en hélices alfa ±6 %. Esto indica contundentemente que la firma espectral de las proteínas de fusión ToxA-ToxB es el diagnóstico de una proteína que contiene una lámina beta alta y una hélice alfa baja.

La observación de la forma del espectro de UV cercana (figura 10) para las cinco proteínas de fusión indica que al menos algunos de los aminoácidos aromáticos están inmovilizados, lo que es una fuerte indicación de una estructura terciaria compacta y específica. Además, el tratamiento de la proteína con una concentración desnaturalizante de urea causó la desaparición de la señal UV cercana, lo cual es una indicación adicional de que este espectro característico se debió al plegamiento de las proteínas.

Ejemplo 6 -Inmunización de ratones con fragmentos ToxA o ToxB y fusiones ToxA-ToxB

Se inmunizaron ratones Balb/C con las construcciones descritas en los ejemplos 2 y 3.

Inmunización de ratones

Se inmunizaron por vía IM grupos de 15 ratones hembra Balb/c los días 0, 14 y 28 con 3 g o 10 g de los fragmentos de toxA y toxB distintos (véase el ejemplo 2) así como con proteínas de fusiones ToxA-ToxB (ver ejemplo 3) con adjuvante AS03B. Se vacunó un grupo control de 10 ratones solo con AS03B.

Los títulos de ensayo ELISA anti-ToxA y anti-ToxB se determinaron en sueros individuales recogidos al día 42 (post III).

Los títulos de inhibición de la hemaglutinación se determinaron en sueros Post III agrupados.

Respuesta Elisa anti-ToxA y anti-ToxB: Protocolo

Se recubrieron muestras de los fragmentos toxA o toxB a 1 g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de alta unión (Nunc MAXISORP ™), durante una noche a 4 ºC. Las placas se bloquearon con PBS-BSA al 1 % durante 30 min a TA con agitación. Los sueros anti ratón se diluyeron previamente a 1/500 en PBS-BSA 0,2 % -TWEEN ™ 0,05 % y después, se realizaron dos diluciones adicionales en microplacas y se incubaron a TA durante 30 min con agitación. Después de lavar, se detectó el anticuerpo murino unido usando anti IgG de ratón (H+L) de cabra affiniPure conjugado con peroxidasa, Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115035-003) diluido a 1:5000 en PBS-BSA 0,2 %-Tween 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) con agitación. El color se reveló usando 4 mg de O-fenilendiamina (OPD) + 5 l de H2O2 por 10 ml a un pH 4,5 de tampón de citrato 0,1 M durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 l de HCl, y se leyó la densidad óptica (DO) a 490 nm con respecto a 620 nm.

El nivel de anticuerpos anti-ToxA o anti-ToxB presentes en los sueros se expresó en títulos de punto medio. Se calculó una GMT para las 15 muestras en cada grupo de tratamiento (10 para el grupo de control).

Ensayo de inhibición de la hemaglutinación: Protocolo

Se realizaron dos diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones (25 l) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en microplacas de 96 pocillos de fondo en U.

A continuación se añadieron 25 l de Toxina A nativa (0,2 g/pocillo) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de la incubación, se añadieron a cada pocillo 50 l de eritrocitos de conejo purificados, diluidos al 2 %. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 2 horas.

Las placas se analizaron visualmente, presentándose la hemaglutinación como eritrocitos difusos en el pocillo y la inhibición de la hemaglutinación se observó como punto rojo sedimentado en el pocillo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Los títulos de inhibición se definieron como el recíproco de la dilución más alta del suero que inhibía la hemaglutinación.

Ensayo de citotoxicidad:

Se cultivaron células de fibroblastos IMR90 a 37 ºC con CO2 al 5 %, en EMEM + suero bovino fetal 10 % + glutamina 1 % + antibióticos 1 % (penicilina-estreptomicina-anfotericina) y se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con una densidad de 5.104 células/pocillo.

Después de 24 horas, los medios celulares se retiraron de los pocillos.

Se realizaron dos diluciones en serie de antisueros agrupados de ratones (50 l) en medio celular.

A continuación se añadieron 50 l de toxina B nativa (0,5 ng/ml) y las placas se incubaron a 37 ºC con CO2 al 5 % durante 24 horas.

Las células se observaron después de 24 horas, y se determinó la proporción de células redondeadas.

Los títulos de inhibición se definieron como el recíproco de la dilución más alta del suero que inhibía un 50 % el redondeo celular.

Resultados:

En la figura 11 se describen los resultados del Elisa, usando los anticuerpos Tox A. Los anticuerpos anti Tox A se indujeron después de la inmunización solo con ToxA, pero también con cada una de las 5 fusiones.

Las propiedades funcionales de estos anticuerpos se analizaron en el ensayo de hemaglutinación. Este ensayo se adapta solo para la evaluación de Tox A, ya que no se observa hemaglutinación con ToxB.

En la figura 12 se describen los títulos de la inhibición de la hemaglutinación. La inhibición de la hemaglutinación se observó con los sueros de los fragmentos de anti Tox A o con sueros dirigidos contra cada una de las fusiones ToxA-ToxB.

También se realizó un ensayo ELISA usando anticuerpos ToxB; los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 13. Se indujeron anticuerpos anti Tox B después de la inmunización solo con el fragmento ToxB, pero también con las fusiones F2, F3 y F4.

En la figura 14 se describen los títulos de la inhibición de la citotoxicidad. Los títulos de inhibición obtenidos utilizando sueros de ratones inmunizados con el fragmento ToxB o con las fusiones ToxA-ToxB fueron mayores que los obtenidos usando sueros de control.

Ejemplo 7 -Diseño, clonación, expresión y purificación de 4 proteínas de fusión adicionales

Utilizando los principios de diseño descritos en el ejemplo 1 se diseñaron cuatro proteínas de fusión adicionales que se denominaron F54 Gly (SEQ ID Nº 21), F54 New (SEQ ID Nº 23), F5 ToxB y F52 New (SEQ ID Nº 27).

Estas proteínas de Fusión se expresaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 2.

Ejemplo 8 -Evaluación del peso molecular de las fusiones ToxA-ToxB de C. difficile descritas en SEQ ID Nº 21, SEQ IDNº 23, SEQ IDNº 25 ySEQ IDNº 27

El peso molecular de las fusiones descritas en SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25, y SEQ ID Nº 27 se determinó como se describe en el ejemplo 4.

La Figura 15 describe la distribución de estas cuatro proteínas de fusión adicionales determinada por ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación.

El peso molecular de la especie principal, determinado a partir de la distribución C(S) de las cuatro fusiones de proteínas descritas en SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25 y SEQ ID Nº 27 corresponde a su forma monomérica y todas las proteínas exhiben propiedades de sedimentación similares a las de las fusiones F1 a F5.

Ejemplo 9 -Evaluación de las estructuras secundaria y terciaria de las fusiones ToxA -ToxB de C. difficile descritas en SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25 y SEQ ID Nº 27

Las estructuras secundaria y terciaria de las fusiones descritas en la SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25 y SEQ ID Nº 27 se evaluaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. El DC de la región UV lejana para estas proteínas de fusión se puede encontrar en la figura 16, y los espectros de UV cercana de estas fusiones se pueden encontrar en la figura 17.

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Claims

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