ES2616917T3 - Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y método para producirlos - Google Patents

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Sander Van Stigt Thans
Suzy BRENEMAN
Jayarama K. Shetty
Sung Ho Lee
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Abstract

Un polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el polipéptido maduro de las SEC ID NÚM: 3 y 6.

Description

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Tal como se emplea en esta memoria, el término "cebadillas " se refiere a los sólidos drenados cuando la molienda ha sido extraída y el mosto se separa del empaste. Las "cebadillas" se pueden usar, p. ej., como pienso.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "recuperación del extracto" en el mosto se refiere a la suma de sustancias solubles extraídas de la molienda (malta y/o auxiliares) expresada en porcentaje en base a la materia seca.
Tal como se emplea en esta memoria, el término "lúpulos" se refiere a su uso en contribuir significativamente a la cantidad de la cerveza, incluido el sabor. En particular, los lúpulos (o constituyentes de lúpulos) añaden sustancias amargas deseables a la cerveza. Además, los lúpulos pueden actuar como precipitantes de proteínas, establecer conservantes y auxiliar en la formación y estabilización de la espuma.
Tal como se emplean en esta memoria, el término "bebida(s)" y la expresión "producto de bebida(s)" incluye cervezas tales como cerveza totalmente malteada, cerveza fabricada bajo "Reinheitsgebot", cerveza inglesa (ale), IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, cerveza sin alcohol, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza de bajas calorías, porter, bock, stout, licor de malta, cerveza no alcohólica, licor de malta no alcohólico y similares. El término "bebida(s)" o la expresión "producto de bebidas" también incluye bebidas de cereal y malta alternativas tales como bebidas de malta saborizadas con frutas, p. ej., bebidas de malta saborizadas con cítricos tales como limón, naranja, lima o fresa, bebidas de malta saborizadas con licores, p. ej., licor de malta saborizado con vodka, ron o tequila, o bebidas de malta saborizadas con café, tales como licor de malta saborizado con cafeína, y similares. En otro aspecto, la bebida o el producto de bebida es una bebida alcohólica o no alcohólica, tal como una bebida a base de cereal o malta como cerveza o whisky, tal como vino, cidra, vinagre, vino de arroz, salsa de soya o jugo.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "bebida de malta" incluye bebidas de malta como cerveza totalmentemalteada, ale, IPA,lager,bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, cerveza sin alcohol, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza de bajas calorías, porter, bock, stout, licor de malta, licor de malta no alcohólico y similares. La expresión "bebidas de malta" también incluye bebidas de malta alternativas tales como bebidas de malta saborizadas con frutas, p. ej., bebidas de malta saborizadas con cítricos tales como limón, naranja, lima o fresas, bebidas de malta saborizadas con licor, p. ej., licor de malta saborizado con vodka, ron o tequila, o bebidas de malta saborizadas con café, tales como licor de malta saborizado con cafeína, y similares.
En el contexto de la presente invención, el término "cerveza" abarca cualquier mosto fermentado, producido por fermentación/proceso de fabricación de cerveza de un material vegetal que contiene almidón, por lo tanto, en particular también cerveza producida exclusivamente a partir de malta o un auxiliar, o cualquier combinación de malta y un auxiliar.
La cerveza se puede elaborar a partir de una variedad de material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, a menudo granos de cereales y/o malta,esencialmente mediante elmismo procedimiento. Se cree que los almidones de granos son homopolímeros de glucosa en donde los residuos de glucosa están enlazados por enlaces o bien alfa-1, 4-o alfa-1,6, siendo el primero el predominante.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión"cerveza Pilsner"serefiere auna cerveza pale lagerfermentada en el fondo (elaborada a partir de malta Pilsner) usualmente con un carácter de lúpulo más pronunciado que las cervezas de tipo pale lager normales (p. ej., helles).
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "cervezas ligeras, cervezas reducidas en calorías o cervezas de bajas calorías", se refiere a la gran popularización reciente de bebidas elaboradas, particularmente en el mercado estadounidense. Como se define en EE.UU., estas cervezas altamente atenuadas tienen aproximadamente 30% menos calorías que la cerveza "normal" de un fabricante".
Tal como se emplean en esta memoria, la expresión "cerveza no alcohólica" o la expresión "cerveza con bajo contenido de alcohol" se refiere a una cerveza que contiene un máximo de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% de alcohol en volumen. La cerveza no alcohólica puede ser elaborada por métodos especiales (fermentación detenida), con “levaduras” especiales que no producen alcohol I por métodos tradicionales, pero en los cuales, durante las etapas finales del proceso de fabricación, el alcohol es extraído, p. ej., por evaporación al vacío, aprovechando los distintos puntos de ebullición del agua y el alcohol.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "cerveza de bajas calorías" o "cerveza con bajo contenido de carbohidratos" se define como una cerveza con un contenido de carbohidratos de 0,75 g/100 g o menos y con un grado de fermentación de alrededor de 90-92%.
Tal como se emplea en esta memoria, el término "pasteurización" significa inactivar los microorganismos en disolución acuosa por calentamiento. La implementación de la pasteurización en el proceso de elaboración de cerveza se realiza habitualmente a través del uso de un pasteurizador flash o pasteurizador de túnel. Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "unidades de pasteurización o PU" se refiere a una medida cuantitativa de la
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imagen11
mg
miligramos
ml y mL
microlitros
ml y mL
mililitros
mm
milímetros
µm
micrómetro
M
molar
mM
milimolar
µM
micromolar
U
unidades
V
voltios
PM
peso molecular
seg(s) o s(s)
segundo/segundos
min(s) o m(s)
minuto/minutos
hr(s) o h(s)
hora/horas
DO
oxígeno disuelto
ABS
Absorbancia
EtOH
etanol
PSS
disolución salina fisiológica
m/v
masa/volumen
MTP
placa de microtitulación
N
Normal
DP1
monosacáridos
DP2
disacáridos
DP>3
oligosacáridos, azúcares que tienen un grado de polimerización mayor que 3
ppm
partes por millón
SBD
dominio de unión a almidón
CD
dominio catalítico
PCR
reacción en cadena de la polimerasa
WT
tipo silvestre
RDF
Grado real de atenuación
SG
Gravedad específica
PU
Unidades de pasteurización
MkGA I
glucoamilasa I de Monascus kaoliang
MkGA II
glucoamilasa II de Monascus kaoliang
H. jecorina
Hypocrea jecorina
T. reesei
Trichoderma reesei
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En un aspecto, la descripción se refiere a un método para aislar un polipéptido descrito en este documento, en donde el método comprende las etapas de inducir la síntesis del polipéptido en una célula hospedante que tiene expresión heteróloga de dicho polipéptido, recuperando la proteína extracelular segregada por dicha célula hospedante, y opcionalmente purificando el polipéptido.
La actividad y/o actividad específica de cualquier glucoamilasa contemplada en la presente invención se determina con métodos estándar que comprendería el experto en la técnica.
4. Composiciones y usos
La glucoamilasa contemplada en la presente invención se puede utilizar en composiciones que incluyen, aunque sin limitarse a ello, composiciones que hidrolizan y sacarifican almidón, composiciones de limpieza y detergentes (p. ej., detergentes de lavandería, detergentes lavavajillas y composiciones de limpieza de superficies duras), composiciones de fermentación de alcohol y composiciones de pienso para animales, por ejemplo. Además, estas glucoamilasas se pueden utilizar en aplicaciones de panificación, tales como producción de pan y pasteles, cervecería, asistencia sanitaria, textil, procedimientos de conversión de desechos ambientales, procesamiento de biopulpa y aplicaciones de conversión de biomasa.
En algunas realizaciones, una composición que comprende una glucoamilasa contemplada en la presente invención opcionalmente se empleará en combinación con una cualquiera o una combinación de las siguientes enzimas – alfa amilasas, beta-amilasas, peptidasas (proteasas, proteinasas, endopeptidasas, exopeptidasas), pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, endo-glucanasas y enzimas accesorias hidrolíticas de beta-glucano relacionadas, xilanasas y enzimas accesorias de xilanasas, acetolactato descarboxilasas, ciclodextrina glucotransferasas, lipasas, fitasas, laccasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, enzimas que hidrolizan almidón granulary otras glucoamilasas.
En algunas realizaciones, la composición incluirá una o más de otras enzimas. En algunas realizaciones, la composición incluirá una o más de otras enzimas seleccionadas entre alfa-amilasa, beta-amilasa, peptidasa (tal como proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endo-glucanasa y enzimas accesorias hidrolíticas de beta-glucano relacionadas, xilanasa y enzimas accesorias de xilanasa (por ejemplo, arabinofuranosidasa, esterasa de ácido ferúlico, xilan acetil esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluidas cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización, el polipéptido(s) contemplado en este documento y/o una o más de otras enzimas se inactiva por pasteurización, tal como usando menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 unidades de pasteurización (PU) en cerveza, tal como cerveza Pilsner.
En algunas realizaciones, la composición incluirá una alfa amilasa tal como alfa amilasas fúngicas (p. ej., Aspergillus sp.) o alfa amilasas bacterianas (p. ej., Bacillus sp. tal como B. stearothermophilus, (Geobacillus stearothermophilus), B. amyloliquefaciens y B. licheniformis) y sus variantes e híbridos. En algunas realizaciones, la alfa amilasa es una alfa amilasa estable ácida. En algunas realizaciones, la alfa amilasa es alfa amilasa Aspergillus kawachi (AkAA), véase la patente de EE.UU. núm. 7.037.704. Las alfa amilasas comercialmente disponibles contempladas para uso en las composiciones de la descripción se conocen e incluyen GZYME® G-997, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA (Danisco US, Inc, Genencor Division), TERMAMYL 120-l y SUPRA (Novozymes, Biotech.).
En algunas realizaciones, la composición incluirá una proteasa fúngica ácida. En otra realización, la composición incluirá la endo-proteasa (EC 3.4.21.26) proveniente de una variante del microorganismo Aspergillus niger que hidroliza péptidos en el sitio carboxilo de los residuos prolina descritos en el documento WO 2007/101888 publicado el 13 de septiembre de 2007. En otra realización, la proteasa fúngica ácida deriva de un Trichoderma sp y puede ser una cualquiera de las proteasas descritas en el documento US 2006/0154353, publicado el 13 de julio de 2006, incorporado a la presente memoria por referencia. En otra realización, la composición incluirá una fitasa de Buttiauxiella spp. (p. ej., BP-17, véanse también las variantes descritas en la publicación de patente PCT WO 2006/043178). En otra realización, la composición incluirá una acetolactato descarboxilasa (ALDC) EC 4.1.1.5, por ejemplo de Bacillus licheniformis o del gen ALDC de Bacillus brevis expresado en una cepa modificada de Bacillus subtilis como se describe en el documento US 4.617.273 publicado el 14 de octubre 1986.
En otras realizaciones, las glucoamilasas contempladas en este documento se pueden combinar con otras de dichas glucoamilasas. En algunas realizaciones, dichas glucoamilasas se combinarán con una o más glucoamilasas derivadas de diversas otras cepas o variantes de Monascus kaoliang, o de Aspergillus o sus variantes, tales como A. oryzae, A. niger, A. kawachi y A. awamori; glucoamilasas derivadas de cepas de Humicola o sus variantes; glucoamilasas derivadas de cepas de Talaromyces o sus variantes, tales como T. emersonii; glucoamilasas derivadas de cepas de Athelia, tales como A. rolfsii; o glucoamilasas derivadas de cepas de Penicillium, tales como
P. chrysogenum, por ejemplo.
En particular, las glucoamilasas contempladas en este documento se pueden usar para procesos de conversión de almidón, y particularmente en la producción de dextrosa para jarabe de fructosa, especialmente azúcares en la producción de alcohol y otros productos finales (p. ej., ácido orgánico, ácido ascórbico y aminoácidos) a partir de la
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imagen16
Históricamente, la primera etapa en la producción de cerveza es el malteo –maceración, germinación y secado del grano de cereal (p. ej., cebada). Durante el malteo, las enzimas se producen en la semilla de cereal germinante (p. ej., cebada) y hay ciertos cambios en sus constituyentes químicos (conocidos como modificación) incluida cierta degradación de almidón, proteínas y beta -glucanos.
El cereal malteado se muele para dar una molienda que puede mezclarse con un auxiliar molido (p. ej., grano de cereal no germinado) para dar una molienda mixta. La molienda puede además consistir predominantemente, o exclusivamente, en auxiliar. La molienda se mezcla con agua y se somete a empastado; un auxiliar previamente cocido (gelatinizado y licuado) (el resultado de la "cocción del auxiliar") puede añadirse al empaste. El proceso de empastado se realiza en un periodo de tiempo a diversas temperaturas con el fin de hidrolizar las proteínas del cereal, degradar los beta-glucanos y solubilizar e hidrolizar el almidón. Se cree que la hidrólisis del almidón molido en la malta y el auxiliar en el empastado tradicional es catalizada por dos enzimas principales endógenas a la cebada malteada. La alfa-amilasa escinde enlaces alfa-1,4 en el interior de la molécula de almidón, fragmentándolos en dextrinas más pequeñas. La beta-amilasa escinde secuencialmente enlaces alfa-1,4 del extremo no reductor de estasdextrinas,produciendo principalmentemaltosa. Tanto la alfa comolabetaamilasasonincapaces dehidrolizar los enlaces alfa-1,6 que forman los puntos de ramificación de las cadenas de almidón en la molécula de almidón, lo que resulta en la acumulación de las dextrinas límite en el empaste.La malta contiene una enzima,dextrinasa límite, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1,6 pero muestra solamente actividad débil a temperaturas de empastado debido a su termolabilidad. Después de empastar, el extracto de líquido (mosto) se separa de los sólidos de cebadillas (esdecir,elgrano insoluble yelmaterialde cáscaraque forman parte de una molienda). Los objetivos de separación del mosto incluyen: • obtener buena recuperación del extracto, • obtener buena capacidad de filtración, y
• producir un mosto claro. La recuperación del extracto y la capacidad de filtración del mosto son importantes en la economía del proceso de fabricación de la cerveza.
La composicióndelmostodependedelamateria prima,elproceso de empastadoylosperfiles yotras variables.Un mosto típico comprende 65-80% azúcares fermentables (glucosa, maltosa y maltotriosa, y 20-35% dextrinas límite no fermentables (azúcares con un grado mayor de polimerización que la maltotriosa). Una insuficiencia de enzimas hidrolíticas de almidón durante el empastado puede surgircuando se elabora cerveza con altos niveles de moliendas de cereales no malteados auxiliares. Por lo tanto, se necesita una fuente de enzimas exógenas, capaces de producir azúcares fermentables durante el proceso de empastado. Asimismo, dichas enzimas exógenas también son necesarias para reducir el nivel de azúcares no fermentables en el mosto, con un incremento correspondiente en los azúcares fermentables, con el fin de elaborar cervezas altamente atenuadas con un bajo contenido de carbohidratos. Se describe en este documento una composición enzimática para hidrólisis de almidón que comprende por lo menosuna glucoamilasacontemplada en la presente invención,quepuede añadirse al empasteo emplearse en la etapa de empastado de un proceso de elaboración de cerveza, con el fin de escindir enlaces alfa1,4 y/o alfa-1,6 en moliendas de almidón y aumentar así el contenido de azúcar fermentable del mosto y reducir el residuo de azúcares no fermentables en la cerveza terminada. Además, el mosto así producido puede secarse (por ejemplo por atomización) o concentrarse (p. ej., ebullición y evaporación) para proveer un jarabe o un polvo.
La molienda contemplada en la presente invención puede comprender cualquier material vegetal que contenga almidón y/o azúcar derivable de cualquier planta o parte de planta, incluidos, p. ej., tubérculos, raíces, tallos, hojas y semillas previamente descritos. Preferiblemente, la molienda comprende grano, tal como el grano de cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo, y más preferiblemente, por lo menos 10%, o más preferiblemente por lo menos 15%, incluso más preferiblemente por lo menos 25% o lo más preferiblemente por lo menos 35%, tal como por lo menos50%,porlo menos 75%,por lo menos90% oincluso100% (p/p) de la molienda delmosto deriva del grano. Lo más preferiblemente, la molienda comprende grano malteado, tal como malta de cebada. Preferiblemente, por lo menos 10%, o más preferiblemente por lo menos 15%, incluso más preferiblemente por lo menos 25% o lo más preferiblemente por lo menos 35%, tal como por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90% o incluso 100% (p/p) de la molienda del mosto deriva de grano malteado. Preferiblemente, la molienda comprende auxiliar, tal como grano no malteado de cebada, trigo, centeno, maíz, arroz, milo, mijo y sorgo, y más preferiblemente por lo menos 10%, o más preferiblemente por lo menos 15%, incluso más preferiblemente por lo menos 25%, o lo más preferiblemente por lo menos 35%, tal como por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90% o incluso 100% (p/p) de la molienda del mosto deriva de grano no malteado u otro auxiliar. El auxiliar que comprende carbohidratos fácilmente fermentables tales como azúcares o jarabes se puede añadir al empaste de malta antes, durante o después del procedimiento de empastado de la invención pero preferiblemente se añade después del procedimiento de empastado. Una parte del auxiliar se puede tratar con alfa-amilasa y/o endopeptidasa (proteasa) y/o una endoglucanasa, y/o puede tratarse con calor antes de añadirse al empaste. La composición enzimática para hidrólisis de almidón, contemplada en la presente invención, puede incluir enzima(s) adicional, preferiblemente una enzima seleccionada entre una alfa-amilasa, beta-amilasa, peptidasa (proteasa, proteinasa, endopeptidasa, exopeptidasa), pululanasa, isoamilasa, celulasa, endo-glucanasa y enzimas accesorias de betaglucano relacionadas, xilanasa y enzimas accesorias de xilanasa (por ejemplo, arabinofuranosidasa, esterasa de ácido ferúlico, xilano acetil esterasa), acetolactato descarboxilasa y glucoamilasa, incluidas cualquiera de sus combinaciones. Durante el procedimiento de empastado, el almidón extraído de la molienda se hidroliza gradualmente en azúcares fermentables y dextrinas más pequeñas. Preferiblemente, el empaste es almidón negativo a pruebas de yodo, antes de la separación del mosto.
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durante 10 minutos y luego se centrifugó (Caliente). El sobrenadante decantó, se dejó enfriar en hielo durante 10 minutos y después se calentó hasta temperatura ambiente. Se añadió luego una muestra de 1,0 ml del sobrenadante a 14 ml de H2O destilada en un tubo de ensayo volumétrico de 15 ml,y el residuo de almidón insoluble se dejó reposar durante la noche. El volumen de almidón sedimentado se evaluó visualmente.
Tabla 4
Datos de HPLC promedio
Matraz
Descripción h % P/V DP>3 % P/V DP-3 % P/V DP-2 % P/V DP-1 % P/V Láctico % P/V Glicerol % P/V Acético % V/V Etanol
1,2
AnGA 17 7,68 0,10 4,08 2,98 0,12 1,22 0,04 7,91
24
6,19 0,15 1,48 2,89 0,12 1,35 0,05 10,21
40
1,21 0,16 0,26 2,07 0,08 1,45 0,08 13,70
48
0,78 0,13 0,35 1,05 0,06 1,48 0,09 14,41
3,4
MGA @ 0,325 17 8,55 0,09 4,21 0,46 0,15 1,20 0,04 8,88
24
7,50 0,11 1,77 0,19 0,14 1,26 0,05 10,85
40
3,51 0,17 0,12 0,05 0,09 1,30 0,08 14,00
48
2,74 0,16 0,11 0,03 0,07 1,31 0,09 14,29
5,6
MGA @ 0,40 17 8,18 0,08 3,16 1,09 0,13 1,23 0,05 9,48
24
6,68 0,15 0,58 0,25 0,12 1,29 0,07 11,99
40
2,48 0,15 0,12 0,04 0,06 1,32 0,09 14,46
48
2,07 0,14 0,11 0,03 0,05 1,31 0,09 14,36
Como se observa en la Tabla 1 y en la Figura 5, se obtuvo una velocidad más rápida de la fermentación de etanol usando glucoamilasa de M. kaoliang (MkGA) que con glucoamilasa de A. niger, cuando se compararon en base a un número equivalente de unidades de glucoamilasa (GAU)/g sólidos secos (DS) de dosis de almidón licuado, indicando una mejor eficiencia de la conversión de carbono. Los resultados finales del alcohol producido usando las
10 dos glucoamilasas fueron comparables, a aproximadamente 14,3%.
La cantidad de almidón residual insoluble (IRS) remanente después de la fermentación de etanol del almidón licuado en presencia de glucoamilasa fue mayor para la glucoamilasa de M. kaoliang (MkGA) que para la glucoamilasa de A. niger cuando se compararon en base a 0,325 GAU/g DS. No obstante, un incremento de 25% en la dosis de MkGA (0,4 GAU/g DS) dejó niveles similares de IRS a 0,325 GAU/g DS de AnGA (Figura 6).
15 Ejemplo 4
Uso de glucoamilasa de Monascus kaoliang a partir del caldo de fermentación en la etapa de fermentación de elaboración de cerveza
El uso de glucoamilasa de M. kaoliang para sacarificar carbohidratos de mosto y dar soporte a la fermentación de etanolse comparó con DIAZYME® X4, que comprende una glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA). Los ensayos
20 de fermentación se realizaron usando mosto con lúpulo preparado con el kit Bitter Home Brew de Munton’s, que tiene una gravedad específica inicial de 1056,7 (es decir, 13,92 °Plato).Se añadieron 200 ml del mosto a cada matraz de 500 ml (recipiente de fermentación; FV), que luego se sometió a una autoclave a 99°C durante 10 minutos y después se enfrió. Se realizaron las siguientes adiciones a los matraces:
-Los matraces de control negativo recibieron 1 ml de agua estéril;
25 -Los matraces de control positivos recibieron 1 ml de una dilución de 100 veces de DIAZYME® X4 (glucoamilasa concentrada derivada de una cepa de Aspergillus niger) provista por Genencor International, equivalente a una velocidad de adición de 5 g DIAZYME® X4 por hl de adición de mosto;
31
-Los matraces de ensayo recibieron 1 ml de 2,9 g → 5 ml de dilución de la glucoamilasa de Monascus kaoliang, equivalente a la misma velocidad de adición, en términos de unidades de actividad de glucoamilasa añadida por hl de adición de mosto, que aquella utilizada para DIAZYME® X4 en el control positivo.
Cada matraz se dosificó con levadura W34/70 (Weihenstephan) a una velocidad de 10,106 por ml por °Plato, la
5 fermentación se dejó proceder bajo condiciones de ensayo de laboratorio estandarizadas (una temperatura elevada de 22,5 °C, con agitación moderada de 100 rpm, en un incubador orbital por hasta 165 horas). Cada matraz se analizó en intervalos programados con respecto a pérdida de peso y gravedad específica, mientras que el grado real de fermentación (RDF, que es la atenuación real expresada en forma de porcentaje) se calculó para el mosto fermentado final (cerveza), y una muestra se sometió a análisis HPLC de la composición de carbohidratos y los
10 productos de fermentación, empleando los métodos expuestos en el Ejemplo 3.La gravedad específica del mosto antes, durante y después de la fermentación se midió usando un hidrómetro de gravedad específica o un medidor de densidad Anton-Paar (p. ej., DMA 4100 M) y la atenuación real se calculó y expresó en forma de porcentaje como RDF de acuerdo con las fórmulas enumeradas por Ensminger (véase http://hbd.org/ensmingr/ "Beer data: Alcohol, Calorie, and Attenuation Levels of Beer"). El control de la pérdida de peso durante la fermentación proporciona una
15 medida indirecta de la evolución de CO2y en consecuenciade la formación de etanol.
Tabla 5
Ensayo de fermentación : Adición de MkGA o DIAZYME® X4 al FV
Enzima(s) añadida
Velocidad de dosis S.G. inicial Sólidos RDF S.G. final Extracto real Glicerol final Etanol final
(g/hl)
(% Plato) (%) (%) (% p/v) (% v/v)
Control (sin enzima)
1,057 13,923 63,280 1,012 5,112 0,243 5,452
1,057
13,923 63,132 1,013 5,133 0,247 5,326
1,057
13,923 63,429 1,012 5,092 0,239 5,349
1,057
13,923 63,280 1,012 5,112 0,242 5,380
promedio
1,057 13,923 63,280 1,012 5,112 0,243 5,377
Desv. estándar
0,000 0,000 0,122 0,000 0,017 0,003 0,055
UL
1,057 13,923 63,474 1,013 5,139 0,248 5,464
LL
1,057 13,923 63,087 1,012 5,085 0,237 5,290
DIAZYME® X4 (Lote # 1681046910) 409,9 GAU/g
5 1,057 13,923 79,948 1,001 2,792 0,256 6,612
1,057
13,923 80,403 1,001 2,728 0,267 6,742
1,057
13,923 79,797 1,001 2,813 0,283 6,783
1,057
13,923 79,645 1,002 2,834 0,272 6,806
promedio
1,057 13,923 79,948 1,001 2,792 0,270 6,736
Desv. estándar
0,000 0,000 0,327 0,000 0,046 0,011 0,087
UL
1,057 13,923 80,469 1,002 2,864 0,287 6,874
LL
1,057 13,923 79,428 1,001 2,719 0,252 6,598
MkGA 409,9 GAU equiv.
5 1,057 13,923 77,376 1,003 3,150 0,278 6,250
1,057
13,923 77,679 1,003 3,108 0,260 6,207
1,057
13,923 77,830 1,003 3,087 0,271 6,616
1,057
13,923 78,435 1,002 3,002 0,258 6,673
promedio
1,057 13,923 77,830 1,003 3,087 0,267 6,437
Desv. estándar
0,000 0,000 0,445 0,000 0,062 0,009 0,242
UL
1,057 13,923 78,538 1,003 3,185 0,282 6,821
LL
1,057 13,923 77,122 1,002 2,988 0,251 6,052
El análisis de la cerveza final, producido por fermentación en presencia de un número equivalente de unidades de glucoamilasa de MkGA en comparación con DIAZYME® X4, reveló que la glucoamilasa MkGA produjo un rendimiento ligeramente inferior con respecto a la producción de etanol, pérdida de peso (producción de CO2) y RDF 20 (véanse las Tablas 5-7 y la Fig. 7). De manera correspondiente, el contenido de oligosacáridos que tienen una polimerización de DP4 y superior se elevó en la cerveza final producida con glucoamilasa MkGA. Estos resultados demuestran claramente que DIAZYME® X4 puede sustituirse con glucoamilasa MkGA para generar carbohidratos fermentables en el mosto para dar soporte a la fermentación de etanol. Es probable que un incremento de la dosis de glucoamilasa MkGA en el recipiente de fermentación resista velocidades de producción de etanol similares o
32
mayores que aquella de DIAZYME® X4, en función de la producción mejorada de etanol observada con las velocidades de dosis mayores de MkGA expuestas en el Ejemplo 3.
Tabla 6
Análisis HPLC de carbohidratos de los mostos fermentados
Enzima(s) añadidas
Índice de dosis DP1 Fructosa DP1 Glucosa DP2 DP3 DP4+ Total
(g/hl)
(% p/v) (% p/v) (% p/v) (% p/v) (% p/v) (% p/v)
Control (sin enzima)
0,055 0,044 0,191 0,360 2,783 3,432
0,066
0,042 0,189 0,366 2,830 3,493
0,070
0,045 0,169 0,360 2,750 3,394
0,065
0,041 0,173 0,347 2,761 3,387
Promedio
0,064 0,043 0,180 0,358 2,781 3,426
Desv. estándar
0,006 0,002 0,011 0,008 0,035 0,049
UL
0,074 0,046 0,198 0,371 2,837 3,504
LL
0,054 0,040 0,162 0,346 2,725 3,349
DIAZYME® X4 (Lote # 1681046910) 409,9 GAU/g
5 0,048 0,033 0,200 0,289 0,637 1,208
0,047
0,032 0,183 0,284 0,633 1,179
0,049
0,031 0,186 0,291 0,655 1,212
0,050
0,031 0,202 0,302 0,652 1,237
Promedio
0,048 0,032 0,193 0,291 0,644 1,209
Desv. estándar
0,001 0,001 0,010 0,008 0,011 0,024
UL
0,050 0,034 0,208 0,304 0,662 1,246
LL
0,047 0,030 0,177 0,279 0,627 1,171
MkGA 409,9 GAU equiv.
5 0,058 0,037 0,220 0,318 0,835 1,467
0,058
0,037 0,224 0,323 0,830 1,472
0,059
0,037 0,217 0,338 0,885 1,535
0,057
0,035 0,159 0,287 0,808 1,346
Promedio
0,058 0,036 0,205 0,316 0,840 1,455
Desv. estándar
0,001 0,001 0,031 0,021 0,032 0,079
UL
0,059 0,038 0,254 0,350 0,891 1,581
LL
0,056 0,034 0,156 0,282 0,788 1,329
33
Tabla 7A
Datos de pérdida de peso
Matraz
Enzima Peso del matraz (g)
Vacío
Comienzo 24 h 48 h 117 h 144 h 165 h
1
Control (sin enzima) 178,06 389,1 383,7 380,9 380,4 380,3 380,37
2
171,82 383,1 376,7 374,8 374,4 374,3 374,38
3
171,88 385,2 377 376,6 376,2 376,2 376,27
4
172,92 384,5 378 376,2 375,8 375,7 375,74
5
DIAZYME® X4 (Lote # 1681046910) 409,9 GAU/g 171,3 383,4 376,2 373,8 372,6 372,3 372,32
6
179,29 391,4 383,3 381,6 380,4 380,2 380,22
7
160,74 372,4 365,4 362,9 361,7 361,5 361,45
8
178,86 390,2 383,9 380,8 379,6 379,3 379,26
9
MkGA 409,9 GAU equiv. 162,03 374 368,5 364,6 363,5 363,3 363,26
10
173,02 384,5 378,5 375,1 374 373,8 373,76
11
177,48 388,8 382,5 379,4 378,3 378,1 378,05
12
175,28 387,7 379,5 377,9 377 376,7 376,74
Tabla 7B
Datos de pérdida de peso (% del peso inicial)
Enzima(s) añadidas
Velocidad de dosis Pérdida de peso (%) a:
(g/hl)
0 24 48 117 144 165
Control (sin enzima)
0.00% 2.56% 3.89% 4.12% 4.17% 4.14%
0.00%
3.03% 3.93% 4.12% 4.17% 4.13%
0.00%
3.84% 4.03% 4.22% 4.22% 4.19%
0.00%
3.07% 3.92% 4.11% 4.16% 4.14%
Promedio
0.00% 3.13% 3.94% 4.14% 4.18% 4.15%
Desv. estándar
0.00000 0.00532 0.00063 0.00051 0.00028 0.00026
UL
0.00% 3.97% 4.04% 4.22% 4.22% 4.19%
LL
0.00% 2.28% 3.84% 4.06% 4.13% 4.11%
DIAZYME® X4 (Lote # 1681046910) 409,9 GAU/g
5 0.00% 3.39% 4.53% 5.09% 5.23% 5.22%
0.00%
3.82% 4.62% 5.19% 5.28% 5.27%
0.00%
3.31% 4.49% 5.06% 5.15% 5.17%
0.00%
2.98% 4.45% 5.02% 5.16% 5.18%
34 5
Datos de pérdida de peso (% del peso inicial)
Enzima(s) añadidas
Velocidad de dosis Pérdida de peso (%) a:
Promedio
0.00% 3.38% 4.52% 5.09% 5.21% 5.21%
Desv. estándar
0.00000 0.00345 0.00074 0.00073 0.00063 0.00046
UL
0.00% 3.92% 4.64% 5.20% 5.30% 5.28%
LL
0.00% 2.83% 4.40% 4.97% 5.11% 5.14%
MkGA 409.9 GAU equiv.
5 0.00% 2.59% 4.43% 4.95% 5.05% 5.07%
0.00%
2.84% 4.44% 4.97% 5.06% 5.08%
0.00%
2.98% 4.45% 4.97% 5.06% 5.09%
0.00%
3.86% 4.61% 5.04% 5.18% 5.16%
Promedio
0.00% 3.07% 4.49% 4.98% 5.09% 5.10%
Desv. estándar
0.00000 0.00552 0.00086 0.00038 0.00061 0.00042
UL
0.00% 3.95% 4.62% 5.04% 5.18% 5.16%
LL
0.00% 2.19% 4.35% 4.92% 4.99% 5.03%
10
15
20
25
30
Ejemplo 5
Purificación de MkGA I y MkGA II y su uso en la etapa de fermentación de la elaboración de cerveza
Purificación:
Se desarrolló CBS302.78 de Monascus kaoliang en placas de agar PDA. Para iniciar la fermentación del pre-cultivo se usa una pieza (~1 cm2) de una placa PDA con CBS302.78 de M. kaoliang para inocular 50 ml de medio LDmaltosa en un matraz de agitación desviador estéril de 250 ml. El cultivo se desarrolló durante 2 días a 28°C y se cosechó. Se transfirieron 50ml de este cultivo a 1000 ml de medio LD-maltosa en un Fernbac desviador de 2,8 l y se incubó 4 días a 28°C con pH fijado a 5,0 o 5,5. El cultivo celular se cosechó y se aclaró el medio por centrifugación (4000 rpm a 15 min.)y filtración (VacuCap 90, 0,2 mm).Después, el fermento se concentró y conservó a -20°C.
Se purificaron MkGA I y MkGA II de la siguiente manera: el caldo de fermentación clarificado se trató con carbono activo para eliminar el exceso de pigmentos de Monascus kaoliang segregados tales como: Monascina, ankaflavina y monascorubrina. Por lo tanto, al caldo de fermento se le añadió 2% (p/v) Norit SA Plus y se dejó agitar a TA durante 20 min. Esta suspensión se centrifugó a 4000 rpm durante 20 min. y se filtró (0,2 mm) antes de diluirla 1:4 con tampón A (Na-Acetato 25 mM pH 4,3) utilizado para la primera columna. La cromatografía se llevó a cabo manualmente en un sistema de FPLC BioRAD. Se efectuó una columna de 15 ml de β-ciclodextrina inmovilizando βciclodextrina (Sigma-Aldrich; CAS nr:68168-23-0) en Sepharose™ 6B activada con epoxi (GE Healthcare; Lote: 10021987).Esta columna de β-CD se equilibró con tampón A a un caudal de 2 ml/min. Este caudal se mantuvo durante toda la purificación. La muestra que contenía 500 M-GAU se cargó en una columna a través del tubo de entrada y las fracciones de 10 ml se recogieron durante la purificación. Se pudo recoger MkGA I en el flujo y el tampón se intercambió a 100% tampón B (α-ciclodextrina 10 mM en Na-acetato 25 mM pH 4,3) después de la estabilización de la situación inicial por lavado extensor con el tampón A.La MkGA IIligada se eluyó de la columna y el tampón se volvió a intercambiar finalmente a A después de eluir toda la proteína. La proteína en el flujo y la elución se analizaron para actividad de glucoamilasa y porSDS-page.
Todos los geles SDS-page se efectuaron con el gel Invitrogen NuPage® Novex 10% Bis-Tris 1,0 mm, 10 pocillos (Cat#NP0321 caja), véanse estándar pre-teñido Blue® Plus2 (Cat# LC5925) y tampón de corrida NuPAGE® MES SDS (Cat# NP0002) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tinción con azul de Coomasie brillante.
Las fracciones que contenían MkGA I y MkGA II se mezclaron por separado y se eliminó la α-ciclodextrina pasando la muestra por columnas PD10. Las fracciones que contenían GA se concentraron en tubos centrífugos de ultrafiltración Vivaspin™hasta aproximadamente 20mg/ml (25 ml, 10K MWCO, Sartorius).
El flujo de la columna de β-ciclodextrina con MkGA I contuvo cantidades pequeñas de MkGA II (<10%) y se purificó adicionalmente. La muestra de MkGA I se cambió a tampón C (tampón de citrato 20 mM pH3,5) por diálisis extensiva. Se cargaron 4 ml de muestra (correspondientes a 100 GAU) en una columna SPFF HiTrap de 1 ml
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Tabla 9
Actividad de glucoamilasa residual en cerveza después de la pasteurización a 72°C
Unidades de pasteurización [PU]
ID muestra MkGA I M. kaoliang (purifcada) MkGA II M. kaoliang (purificada) MkGA I+MkGA II M. kaoliang (fermento) AnGA (DIAZYME ®X4) A. niger (producto) TrGA T. reesei (fermento)
0,000
1 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
0,020
2 0,840 0.895 0,910 0,974 0,956
0,180
3 0,122 0,700 0,375 0,857 0,945
2,190
4 0,036 0,547 0,144 0,774 0,898
6,770
5 0,021 0,230 0,074 0,561 0,612
13,16
6 0,004 0,110 0,020 0,474 0,471
26,81
7 0,000 0,031 0,002 0,349 0,271
48,69
8 0,000 0,015 0,002 0,225 0,202
75,20
9 0,000 0,002 0,000 0,164 0,153
102,2
10 0,000 0,000 0,000 0,125 0,114
Tabla 9. Actividad de glucoamilasa residual después de incrementar la pasteurización a 72°C en cerveza de MkGA I, MkGA II, MkGA I+MkGA II (MkGA), AnGA ((DIAZYME® X4) y TrGA. La actividad residual se calcula como la actividad real dividida con la actividad inicial (0 PU) y los resultadosson un promedio de 3 determinaciones.
5 Además, las pasteurizaciones a 72°C se realizaron en cervezas con gravedad específica ampliamente distinta (es decir, °Plato): Budweiser Pilsner pH (4.5), Newcastle Brown Ale pH(4,3), Thisted bryghus Porter pH(4,6) y Na-Acetato 0,1M pH (4,7) utilizados en los estudios previos de termoestabilidad de MkGA I y MkGA II (1). Es claro a partir de los resultados que se exponen en la Figura 9 que MkGA I y MkGA II son más termolábiles en cerveza que el tampón de Na-Acetato, mientras que la termoestabilidad de DIAZYME® X4 (AnGA) no cambia significativamente
10 entre el tampón y la cerveza. Sorprendentemente, la actividad residual de MkGA I, que posee la termoestabilidad más baja, se reduce más rápido en cerveza, y la glucoamilasa puede inactivarse completamente en todas las cervezas con menos de 25PU en comparación con el tampón, que mantiene una actividad residual pequeña pero significativa (2%) después de la pasteurización con 42PU. Thisted bryghus porter es la cerveza en la que MkGA I y MkGA II demuestran la más baja termoestabilidad.
15 Ejemplo 7
Para expresar ambas formas de glucoamilasa de M. kaoliang, MkGA I y MkGA II, en el hospedante heterólogo Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei anamorfo), ambas secuencias genómicas y de ADNc de los dos genes correspondientes se ampliaron por PCR o bien de ADN genómico de M. kaoliang o de una biblioteca de ADNc combinada preparada como se describió en los ejemplos anteriores con los cebadores en dirección 5’ y en dirección
20 3’que se indican a continuación(SEC ID NÚM: 13-15)
directa -5'GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACCATGGTGAAGATCAGCATAAATCCCATC 3'(SEC ID NÚM:13),
inversa I (para MkGA II) -5’ ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTTCCAGCTGTCGTTGACGGTC 3’ (SEC ID NÚM: 14) and
25 inversa II (para MkGA I) -5’ ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACCGTCCCGTGCCATAGGGGCGTG 3’(SEC ID NÚM: 15).
Además, un fragmento adicional que codifica glucoamilasa MkGA I pero que comienza en otro codón ATG encontrado en elmarco en dirección 5’ del comienzo putativo de la traducción (SEC ID NÚM:17)se amplió utilizando un cebador en dirección 5’:
38
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Actividad residual de glucoamilasa después de la pasteurización a 72°C
Unidades de pasteurización [PU]
ID muestra MkGA I M. Kaoliang (purificada) MkGA II M. Kaoliang (purificada) gMkGAI T. Reesei (fermento) gMkGA II T. Reesei (fermento)
0,000
1 1,000 1,000 1,000 1,000
0,001
2 0,830 0,954 0,810 0,990
0,005
3 0,470 0,892 0,530 0,920
0,167
4 0,063 0,849 0,155 0,840
1,557
5 0,040 0,407 0,042 0,610
3,990
6 0,024 0,225 0,031 0,330
16,70
7 0,001 0,101 0,020 0,150
42,60
8 0,000 0,058 0,000 0,070
66,58
9 0,000 0,010 0,000 0,040
99,98
10 0,000 0,000 0,000 0,010
239,6
11 0,000 0,000 0,000 0,000
563,7
12 0,000 0,000 0,000 0,000
MkGA I y MkGA II expresadas tanto en H. jecorina como en M. kaoliang se ensayaron en experimentos de elaboración de cerveza. Se preparó un mosto usando extracto de malta Munton’s. Se disolvieron 340 g de extracto de malta Munton’sen 1500 ml de agua caliente. Aesta suspensión seañadieron 5 gránulos de lúpulos, se ajustó el
5 pH a 5,2 con H2SO4.y se sometió a ebullición por 1 hora antes de someter a autoclave a 121°C por 15 minutos. Luego a 0,6 g de levadura Weihenstephan recién producida se le añadieron 100 g de mosto enfriado junto con las distintas enzimas (como se describió en el ejemplo 5).
Los mostos (normalmente 100 ml) se fermentaron a 18°C y 150 rpm en matraces cónicos de 500 ml. La actividad residual se midió antes y después de la fermentación. La producción de etanol se midió indirectamente por la
10 pérdida de peso de los fermentos. El alcohol se midió en un analizador de alcohol Anton Paar Alcoanalyzer y se calculó el RDF en función de la gravedad específica de la cerveza y la concentración de alcohol del analizador.
El desempeño en la aplicación FV de cerveza de gMkGA I y gMkGA II de T. reesei demostró ser alto pero se redujo (en términos de valores RDF) en comparación con las proteínas purificadas de M. kaoliang (véase la Fig. 14). Las enzimas se dosificaron en actividad (GAU/ml) y la reducción del desempeño puede deberse a actividades
15 secundarias en el fermento bruto de T. reesei en lugar de deberse a un desempeño real en el FV, ya que tienen secuencias de aminoácidos similares.
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