ES2617626T3 - Casetes de expresión derivados de maíz - Google Patents

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Abstract

Una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión en una célula vegetal, en la que la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 95% idéntica a SEC ID NO: 2.

Description

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Conjunto de sonda
Tejido fuente ZMGLYR_AT ZM052966_S_AT CTRL_ZMU29158-ZM053951_S ZM061586_S (ZmHSP70) 3_AT (ZmUbi158) _AT _AT
mazorca en desarrollo 7 cm grano completo 6 días grano completo 14 días embrión 21 DAP embrión 38 DAP germen día 4 raíz germen día 4 hoja panoja V9 panoja V12 panoja V15 polen tallo V8 seda al desprenderse el polen seda 6 h después del polen endospermo 18 DAP endospermo 34 DAP ARN total de óvulo ARN total de la cáscara mesocarpio de la mazorca óvulos pistilos 1 DAP pistilos 3 DAP pistilos 7 DAP Fortaleza media de la señal Desviación estándar raíz seminal y radical raíces adultas raíces nodales hoja joven hoja senescente mesocarpio V8
607,48 11679,11 13389,77 10643,19 12015,99 10066,62 9941,40 8259,98 10924,53 9274,22 9126,88 10058,22 10802,07 9792,35 13397,68 9289,95 10111,60 14327,61 6503,41 12820,39 12267,82 12158,15 13391,55 76,06 9566,74 8975,52 8800,73 12339,52 8472,70 8751,84 8274,28 10288,79 6979,61 286,29 8371,50 10034,99 8673,96 13009,87 6636,56 10188,94 12774,00 6185,30 13769,27 13199,19 11033,95 13597,54 484,12 8771,16 9415,35 8430,46 11046,12 7819,38 8256,62 7500,03 9028,84 7846,33 7254,20 9367,13 9891,29 8430,56 11099,11 6922,05 10644,03 12605,20 5753,57 12621,25 11425,03 12346,68 12418,38 1281,35 9721,33 9525,77 9243,28 9159,61 8064,94 7591,37 7842,82 10011,80 9202,04 16575,82 9473,01 9913,21 8422,46 9561,22 6703,88 6577,37 7790,93 5856,25 10368,72 11407,76 11409,95 12070,45 73,59 7104,92 9661,14 8011,14 9159,66 9221,40 9020,52 7005,32 9066,98 9211,33 19141,66 9188,67 9687,58 7907,84 9093,59 5729,43 10832,81 13960,66 4865,52 12429,59 6356,14 9136,00 8879,08
10517,91 2624,81 9315,47 10120,03 9811,43 7553,12 7476,21 8188,00
9174,97 3241,63 8555,27 10505,06 9492,46 5037,83 7450,23 7363,40 9121,33 2488,37 7750,42 7667,23 8537,38 6077,48 2994,93 8248,54 9051,33 2525,97 7708,88 7603,02 8394,66 5717,33 3008,72 7856,22 8827,62 3067,59 10177,94 9921,92 9218,59 7487,63 7478,51 6788,14
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quimérico.
Los métodos para transformar monocotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener plantas transgénicas se han publicado para monocotiledóneas (patente U.S. nº 6.037.522), para trigo (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:971-980 (1997), y en particular para maíz (patente U.S. nº 6.051.409). Los métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente mediante uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener se han publicado, entre otros, para algodón (patente U.S. nº 5.004.863, patente U.S. nº 5.159.135); para soja (patente U.S. nº 5.569.834, patente U.S. nº 5.416.011); para Brassica (patente U.S. nº 5.463.174); y para cacahuete (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)). Para un repaso de otros métodos usados habitualmente de transformación vegetal, véase Newell, C. A., Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000).
Hay una variedad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales. El método de regeneración particular dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal particular a regenerar. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos vegetales individuales o a partir de explantes transformados son bien conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach, Eds.; en Methods for Plant Molecular Biology; Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1988). Este procedimiento de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de seleccionar células transformadas, cultivar aquellas células individualizadas mediante el uso de etapas habituales de desarrollo embrionario o mediante la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de forma similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento vegetal apropiado tal como suelo. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De otro modo, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas que se hicieron crecer a partir de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen procedente de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.
Además de los procedimientos explicados anteriormente, los profesionales están familiarizados con los materiales de fuentes estándar que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), generación de fragmentos de ADN recombinante y constructos de expresión recombinantes, y la identificación y aislamiento de clones (véanse, por ejemplo, Sambrook, J. et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Maliga et al., en Methods in Plant Molecular Biology; Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., en Genome Analysis: Detecting Genes, 1; Cold Spring Harbor: Nueva York, 1998; Birren et al., en Genome Analysis: Analyzing DNA, 2; Cold Spring Harbor: Nueva York, 1998; Clark, Ed., en Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual; Springer: Nueva York, 1997).
El experto también reconocerá que diferentes sucesos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión de los genes quiméricos (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)). De este modo, se deben identificar múltiples sucesos a fin de obtener líneas que presenten el nivel y patrón de expresión deseados. Tal identificación se puede lograr mediante análisis Northern de la expresión del ARNm, análisis Western de la expresión proteica, o mediante análisis fenotípico. También son de interés las semillas obtenidas a partir de plantas transformadas que presentan el perfil de expresión génica deseado.
La transformación y selección se pueden lograr usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos descritos aquí.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: ZmHSP70
La sonda de GeneChip de ZmHSP70, ZM052966_S_AT (SEC ID NO: 14), se usó para identificar los ADNc y los ADNg correspondientes en las bases de datos genómicas. Los ADNc identificados incluyen el acceso de GenBank X73474 (SEC ID NO: 17) y el acceso de TIGR TC279798 (SEC ID NO: 18). Los ADNg incluyen los accesos de GenBank AX099713 (SEC ID NO: 19) y CL315596.1 (SEC ID NO: 20), y el cóntigo MAGI_102343 (SEC ID NO: 21) de la secuencia genómica del maíz. Estas secuencias se usaron para desarrollar una notación a nivel de bases del gen ZmHSP70 (SEC ID NO: 22). El gen ZmHSP70 comprende dos exones separados por un intrón. Los datos de secuencia se usaron para diseñar un casete de expresión siguiendo el método usado para obtener los casetes de expresión de OsMADS como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente US nº US 2007/0006344, incorporada aquí como referencia en su totalidad. En dirección 5’ del gen de interés (GOI), el casete de expresión acabado comprende el promotor de ZmHSP70 que contiene 1104 pb de la secuencia no transcrita de 5’ (SEC ID NO: 39), una secuencia líder no traducida de 5’ de 304 pb (SEC ID NO: 40) que termina en la secuencia de Kozak optimizada para el maíz (gtaaaccatgg, SEC ID NO: 9), y el intrón de ZmHSP70 de 1602 pb (SEC ID NO: 51). La secuencia que codifica la proteína ZmHSP70 se silenció mutando los codones de comienzo de la traducción y alterando otros codones para insertar paradas de traducción en dirección 5’ del sitio del codón del comienzo de la traducción manipulado (en el NcoI). En dirección 3’ del GOI, el casete de expresión comprende una secuencia terminadora (SEC ID NO: 44) derivada del gen ZmHSP70. Comprende una secuencia no traducida de 3’ de 459 pb
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(SEC ID NO: 42) que comienza justo pasado el codón de parada de la traducción más 535 pb de la secuencia de ZmHSP70 no transcrita de 3’ (SEC ID NO: 43). Las SEC ID NOs: 34 y 4 definen los vectores de ensamblaje y binario de ZmHSP70, respectivamente. En ambos casos, el casete de expresión de ZmHSP70 (SEC ID NO: 10) comprende el gen informador de -glucuronidasa (GUS).
El vector de ensamblaje de ZmHSP70 (SEC ID NO: 34) se creó mediante el siguiente método: el término HSP70 (SEC ID NO: 44) se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de maíz y se clonó en pNOV6901 como un fragmento de SacI/XmaI. Para corregir una disparidad de bases, se usó el método QUIKCHANGE® (Stratagene). El promotor de HSP70 (prZmHSP70) se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de maíz, que se clonó subsiguientemente mediante TOPO® (Invitrogen) en pCR2.1 (SEC ID NO: 37). La posterior mutagénesis dirigida al sitio mediada por QUICKCHANGE® suprimió los sitios del codón de comienzo (ATG) en la región de 5’-UTR, inactivó dos sitios de SacI, y corrigió una discrepancia de bases en el intrón. El prZmHSP70 modificado se clonó en GUS:tZmHSP70 recombinante (pNOV6901, SEC ID NO: 38) como un fragmento de XhoI/NcoI.
El vector binario de ZmHSP70 (SEC ID NO: 4) se creó mediante el siguiente método: el vector receptor se linealizó con la enzima de restricción RsrII. El vector del ensamblaje de ZmHSP70 se digirió con las enzimas de restricción RsrII y SanDI, cortando el casete de expresión como se define mediante SEC ID NO: 10. El casete de expresión se clonó entonces en el vector receptor en el sitio de RsrII.
El vector binario de ZmHSP70 (SEC ID NO: 4) se transformó en maíz mediante transformación con Agrobacterium, una técnica bien conocida por los expertos en la técnica. De los 46 sucesos que se produjeron, 17 dieron semillas. La enzima GUS en hojas totalmente expandidas se evaluó mediante localización histoquímica (todos los sucesos) y actividad enzimática (sucesos seleccionados).
Se tomaron muestras de perforaciones de hojas de diecisiete plantas de maíz T0 para el análisis histoquímico de la actividad de GUS conducida por el casete de expresión de ZmHSP70, quince plantas mostraron expresión de GUS positiva, y todas las expresiones positivas mostraron una ligera intensidad de tinción. Para confirmar la expresión de GUS conducida por prZmHSP70, se llevó a cabo el análisis de la actividad de GUS mediante el método de ensayo de 4-metilumbeliferona -D-galactopiranósido (MUG) (Armenta, et al.) de varias muestras de plantas. En este caso, el análisis histoquímico es una medida puramente cualitativa. El ensayo de la actividad enzimática de GUS proporciona información cuantitativa a través de la extracción y análisis de la proteína producida por el transgén. GUS conducida por prZmHSP70 se expresa fuertemente en una estructura superficial de la hoja como “papilas” o “pelos glandulares” o “tricomas” (protuberancias de la superficie epidérmica).
Los sucesos MZAS2007020377A005A y MZAS2007020377A010A tienen una sola copia, son positivos para GUS, y produjeron abundantes semillas. Se seleccionaron para el análisis de T1. La segregación fue consistente con los datos de T0. La Tabla 2 resume el análisis de las plántulas F1. Se llevaron a cabo tres ensayos para examinar la actividad del gen informador GUS en tejido de hoja joven de cada planta: localización histoquímica, ELISA, y actividad enzimática. En base a estos resultados, las plantas se seleccionaron para la evaluación del desarrollo de la expresión de GUS.
Tabla 2. Resumen de la caracterización de la planta prZmHSP70
ID de la planta GUS ELISA1 Actividad de MUG2
{AX5707/MZAS2007020377A005A}2 124 548 {AX5707/MZAS2007020377A005A}3 129 752 {AX5707/MZAS2007020377A005A}8 132 552 {AX5707/MZAS2007020377A005A}10 128 675 {AX5707/MZAS2007020377A005A}12 116 730 {AX5707/MZAS2007020377A005A}16 180 1010 {AX5707/MZAS2007020377A005A}18 207 1167 {AX5707/MZAS2007020377A005A}19 114 644 {AX5707/MZAS2007020377A005A}24 206 1325 {AX5707/MZAS2007020377A010A}1 550 4800 {AX5707/MZAS2007020377A010A}5 608 4892 {AX5707/MZAS2007020377A010A}6 739 7713
imagen10
ID de la Info del ELISA de Actividad de planta suceso GUS MUG
15907-38
005A 601 11052
15907-40
005A 538 9217
15907-42
005A 464 9776
15907-47
010A 648 9960
15907-48
010A 774 11836
Media
612 9165
1 ng/mg de proteína total 2 pmol/min/mg de proteína La Tabla 4 proporciona datos que resumen la localización histoquímica en el tejido reproductivo de la planta ZmHSP70 T1/B1. Tabla 4. Resultados de localización histoquímica de T1/B1 para 15907 sucesos.
ID de la planta
Tiempo de la Seda Grano Vaina de Mesocarpio Tallo de la Panoja
muestra
la de la mazorca mazorca
mazorca
MZAS2007020377A005A-día de 0 3 2 4 4 ND 24a polinización
MZAS2007020377A005A-10 MZAS2007020377A005A-2 MZAS2007020377A005A-3
MZAS2007020377A005A24b
MZAS2007020377A005A-16
MZAS2007020377A005A-18
MZAS2007020377A010A-16
MZAS2007020377A010A-21
MZAS2007020377A010A-5
MZAS2007020377A010A-20 día de polinización
día de polinización
6 días después de la polinización
6 días después de la polinización
10 días después de la polinización
10 días después de la polinización
5 días antes de la polinización
5 días antes de la polinización
día de polinización
6 días después de la polinización 0
0
0
0
0
0
ND
ND
0
0 3
3
3*
3
3*
3*
ND
ND
2
3* 2
2
2
2
2
2
3
ND
2
2
4
4
0
4
4
0
3
ND ND
4
4
ND
3
ND ND
3
ND ND
4
3 2
4
3 0
3
3
0
4
ND ND
MZAS2007020377A010A-6 6 días 0 2* 2 3 4 ND después de la
imagen11
imagen12
ID de la planta T0 ELlSA1 ELISA2 Ensayo histoquímico de GUS3 1 GUS como ng/mg de proteína soluble de tejido de hoja V6. 2 GUS como ng/mg de proteína soluble de tejido de hoja V12. 3 El tejido de hoja se incubó en reactivo de tinción histoquímica toda la noche a 37C, después se aclaró y se puntuó
como positivo o negativo.
La Tabla 6 resume los datos del ensayo de GUS de T1/B1 para tejido de plantas que contienen el casete de expresión de ZmUbi158-GUS.
Tabla 6. Datos del ensayo de GUS de T1/B1 para tejido de plantas que contienen el casete de expresión de ZmUbi158-GUS.
Tejido fuente
ID de la planta
Cigosidad Etapa del muestreo raíz tallo nodo de nodo por Tratamiento
T1/F1
de GUS justo la debajo tisular en
por encima
mazorca del nodo de la reactivo de GUS1
de la
mazorca
raíz
A042A-16
Het 5 días pre-polinización 5 4 4 4 A
A042A-10
Hom 6 días pre-polinización 4 4 4 4 B
A053A-23
Het 5 días pre-polinización 4 4 4 4 C
A053A-12
Het 5 días pre-polinización 5 4 4 4 B
A072A-8
Hom 3 días pre-polinización 4 4 3 4 B
A072A-23
Het 5 días pre-polinización 4 4 4 4 B
A072A-1
Het en el día de la polinización 4 4 4 4 B
A042A-11
Hom 6 días después de la polinización 5 4 4 4 D
A042A-15
Het 7 días después de la polinización 4 4 3 4 C
A053A-18
Het 7 días después de la polinización 4 4 4 4 E
A053A-21
Het 7 días después de la polinización 4 4 4 4 B
A072A-18
Het 5 días después de la polinización 5 4 4 4 B
A072A-25
Het 5 días después de la polinización 5 4 4 4 B
A042A-18
Het 12 días después de la polinización 5 4 3 4 B
A042A-22
Hom 16 días después de la polinización 4 4 5 4 F
A042A-25
Het 17 días después de la polinización 4 4 4 4 B
A053A-20
Hom 16 días después de la polinización 4 3 3 4 G
imagen13
Tejido fuente
ID de la planta
Cigosidad Etapa del muestreo Tallo por Hoja de Hoja Cáscara Tratamiento
T1/F1
de GUS debajo de la de la de la tisular en
la rama de la panoja
mazorca panoja mazorca reactivo de GUS1
A042A-18
Het 12 días después de la polinización 3 1 1 5 B
A042A-22
Hom 16 días después de la polinización 3 3 2 5 F
A042A-25
Het 17 días después de la polinización 4 1 1 5 B
A053A-20
Hom 16 días después de la polinización 3 1 1 5 G
A053A-15
Het 15 días después de la polinización 3 2 1 5 B
A053A-28
Het 19 días después de la polinización 3 2 2 5 B
A072A-27
Hom 15 días después de la polinización 3 1 1 4 B
A072A-6
Het 17 días después de la polinización 3 1 1 5 B
A072A-26
Het 23 días después de la polinización 3 1 1 5 B
Tabla 6, continuación.
Tejido fuente
ID de T1/F1
la planta Cigosidad de GUS Etapa del muestreo seda panoja mazorca Tratamiento tisular en reactivo de GUS1
A042A-16
Het 5 días pre-polinización 3 1 4 A
A042A-10
Hom 6 días pre-polinización 2 1 3 B
A053A-23
Het 5 días pre-polinización 2 1 3 C
A053A-12
Het 5 días pre-polinización 3 1 4 B
A072A-8
Hom 3 días pre-polinización 3 2 3 B
A072A-23
Het 5 días pre-polinización 3 2 4 B
A072A-1
Het en el día de la polinización 2 1 3 B
A042A-11
Hom 6 días después de la 2 2 4 D
polinización
A042A-15
Het 7 días después de la 2 2 5 C
polinización
A053A-18
Het 7 días después de la 3 2 5 E
polinización
A053A-21
Het 7 días después de la 3 2 4 B
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
ID de la muestra Media de GUS mediante qRT-ELISA (ng de GUS/mg de proteína PCR soluble)
MZDT080370A019A-25 hoja de raíz 1116 74705
MZDT080370A019A-25 hoja de 744 76802 mazorca MZDT080370A019A-25 hoja de 1051 46546
panoja MZDT080370A019A-25 raíz 104 29022
MZDT080370A037A-10 hoja de raíz 252 21606 MZDT080370A037A-10 completa 374 35817 MZDT080370A037A-10 adulta 567 61477 MZDT080370A037A-10 raíz 78 6514
MZDT080370A037A-26 hoja de raíz 527 33135
MZDT080370A037A-26 hoja de 500 56219 mazorca MZDT080370A037A-26 hoja de 432 26537
panoja MZDT080370A037A-26 raíz 135 2202
Tabla 9B. Plantas en la etapa de prepolinización.
ID de la muestra
Media de GUS mediante qRT- ELISA (ng de GUS/mg de proteína
PCR
soluble)
MZDT080370A004A-17 hoja de raíz
1540 88938
MZDT080370A004A-17
hoja de 1147 64255
mazorca
MZDT080370A004A-17
hoja de 1351 69176
panoja
MZDT080370A004A-17 raíz
1471 41086
MZDT080370A004A-19 hoja de raíz
758 94022
MZDT080370A004A-19
hoja de 2083 131137
mazorca
MZDT080370A004A-19
hoja de 1921 106673
panoja
MZDT080370A004A-19 raíz
1583 50402
MZDT080370A019A-1 hoja de raíz 813 118209 MZDT080370A019A-1 hoja de 1006 102875
ID de la muestra Media de GUS mediante qRT-ELISA (ng de GUS/mg de proteína PCR soluble)
mazorca MZDT080370A019A-1 hoja de panoja 980 109279 MZDT080370A019A-1 raíz 479 32582
MZDT080370A019A-8 hoja de raíz 1484 121832
MZDT080370A019A-8 hoja de 1143 93884 mazorca MZDT080370A019A-8 hoja de panoja 179 14178 MZDT080370A019A-8 raíz 842 51992
MZDT080370A037A-8 hoja de raíz 335 44419
MZDT080370A037A-8 hoja de 398 46079 mazorca MZDT080370A037A-8 hoja de panoja 747 41610 MZDT080370A037A-8 raíz 811 20363
MZDT080370A037A-9 hoja de raíz 877 30356
MZDT080370A037A-9 hoja de 224 37169 mazorca MZDT080370A037A-9 hoja de panoja 1021 50858 MZDT080370A037A-9 raíz 640 20298
Tabla 9C. Plantas a los 9 días después de la polinización.
ID de la muestra Media de GUS mediante qRT-ELISA (ng de GUS/mg de proteína PCR soluble)
MZDT080370A004A-2 hoja de raíz 865 182913
MZDT080370A004A-2 hoja de 635 99395 mazorca MZDT080370A004A-2 hoja de panoja 232 113087 MZDT080370A004A-2 raíz 178 37983
MZDT080370A004A-14 hoja de raíz 306 87502
MZDT080370A004A-14 hoja de 497 126152 mazorca
MZDT080370A004A-14 hoja de 387 68053 panoja
MZDT080370A004A-14 raíz 310 58438
imagen18
ID de la muestra Media de GUS mediante qRT-ELISA (ng de GUS/mg de proteína PCR soluble)
MZDT080370A004A-25 hoja de 1583 48255 mazorca MZDT080370A004A-25 hoja de raíz 1283 52271 MZDT080370A004A-25 raíz 714 24261
MZDT080370A019A-32 hoja de 568 39362
panoja MZDT080370A019A-32 hoja de 1318 27806 mazorca
MZDT080370A019A-32 hoja de raíz 769 47079 MZDT080370A019A-32 raíz 473 40498
MZDT080370A019A-38 hoja de 664 39359
panoja MZDT080370A019A-38 hoja de 1171 40362 mazorca
MZDT080370A019A-38 hoja de raíz 807 34531 MZDT080370A019A-38 raíz 197 22722
MZDT080370A037A-1 hoja de panoja 409 23226
MZDT080370A037A-1 hoja de 622 17211 mazorca MZDT080370A037A-1 hoja de raíz 691 28706 MZDT080370A037A-1 raíz 104 27698
MZDT080370A037A-39 hoja de 444 27268
panoja MZDT080370A037A-39 hoja de 943 23569 mazorca
MZDT080370A037A-39 hoja de raíz 600 36720 MZDT080370A037A-39 raíz 421 17805
Ejemplo 5. Funcionalidad del promotor en una dicotiledónea
Las SEC ID NOs: 2 y 3 se ensayaron en plantas de tabaco para determinar si estos promotores, que se diseñaron a partir de genes de monocotiledóneas, podrían funcionar como promotores en dicotiledóneas. El tabaco es un 5 organismo modelo y es útil como un agente de predicción de cómo se comportarán los casetes de expresión en otras plantas dicotiledóneas, tal como haba.
El casete de expresión de prZmUbi158-GUS (SEC ID NO: 11) del plásmido 17222 (SEC ID NO: 35) se digirió con las enzimas de restricción SanDI y RsrII y se clonó subsiguientemente en el sitio RsrII del vector binario 17680 (SEC ID NO: 59) para crear el vector 18271 (SEC ID NO: 60). SEC ID NO: 60 se transformó en tabaco vía transformación 10 mediada por Agrobacterium. El comportamiento de prZmUbi158 en plantas de tabaco T0 se registra en la Tabla 10, a continuación. Como indican los datos, prZmUbi158, aunque retiene cierta función, no fue un promotor muy activo
en tabaco.
Tabla 10. Funcionalidad de prZmUbi158 en plantas de tabaco T0.
ID de la planta T0
Media de GUS mediante qRT-PCR1 Media de GUS mediante ELISA2
TBUK095101A003A
393,6 ND
TBUK095101A004A
778,3 ND
TBUK095101A005A
1191,3 ND
TBUK095101A009A
490,6 ND
TBUK095101A010A
659,0 ND
TBUK095101A011A
789,9 ND
TBUK095101A012A
432,1 ND
TBUK095101A013A
618,5 41,1
TBUK095101A014A
572,5 ND
TBUK095101A015A
1161,9 10,3
TBUK095101A016A
328,1 ND
TBUK095101A019A
502,0 65,4
TBUK095101A020A
444,8 ND
TBUK095101A029A
1504,7 49,0
TBUK095101A030A
479,4 24,9
TBUK095101A031A
826,2 ND
TBUK095101A032A
399,4 ND
TBUK095101A035A
910,9 ND
TBUK095101A036A
502,1 23,9
TBUK095101A038A
2375,3 108,8
TBUK095101A040A
633,9 ND
TBUK095101A042A
328,4 ND
TBUK095101A043A
0,0 ND
TBUK095101A044A
423,5 ND
TBUK095101A048A
533,2 ND
TBUK095101A052A
561,1 ND
TBUK095101A053A
802,3 ND
TBUK095101A054A
0,0 ND
TBUK095101A055A
414,0 ND
TBUK095101A056A
1015,8 ND
TBUK095101A057A
773,5 ND
TBUK095101A058A
516,6 47,3
TBUK095101A061A
507,4 ND
ID de la planta T0 Media de GUS mediante qRT-PCR1 Media de GUS mediante ELISA2
TBUK095101A062A 478,8 79,5 TBUK095101A073A 335,5 ND TBUK095101A074A 152,6 ND TBUK095101A077A 665,6 777,9 TBUK095101A078A 374,5 ND TBUK095101A080A 802,1 78,5 TBUK095101A083A 1063,9 14,9 TBUK095101A085A ND ND TBUK095101A093A 604,1 ND TBUK095101A097A 878,3 30,1 TBUK095101A105A 1410,2 90,2 TBUK095101A106A 448,7 ND TBUK095101A107A 1101,8 ND 1 unidades relativas 2 ng de GUS/mg de proteína soluble
El casete de expresión de prZmUbi361-GUS (SEC ID NO: 12) del plásmido 17267 (SEC ID NO: 36) se digirió con enzimas de restricción SanDI y RsrII y se clonó subsiguientemente en el sitio RsrII del vector binario 17680 (SEC ID NO: 59) para crear el vector 18272 (SEC ID NO: 61). SEC ID NO: 61 se transformó en tabaco vía transformación mediada por Agrobacterium. El comportamiento de prZmUbi361 en plantas de tabaco T0 se registra en la Tabla 11, a continuación. Como indican los datos, prZmUbi361 fue muy activo en tabaco. Estos datos muestran que prZmUbi361 es un promotor deseable para uso en plantas dicotiledóneas así como también en plantas monocotiledóneas.

Tabla 11. Funcionalidad de prZmUbi361 en tabaco T0.
ID de la planta T0
Media de GUS mediante qRT-PCR1 Media de GUS mediante ELISA2
TBUK094700A001A
5856,2 10842,2
TBUK094700A002A
6881,8 7207,2
TBUK094700A005A
12766,1 12169,3
TBUK094700A006A
9091,4 8875,0
TBUK094700A007A
5113,1 9564,3
TBUK094700A008A
5522,6 11472,5
TBUK094700A013A
11268,9 5118,4
TBUK094700A015A
4844,7 4285,6
TBUK094700A018A
4786,9 2226,1
TBUK094700A029A
8553,3 7242,9
TBUK094700A030A
3914,4 7201,3
TBUK094700A031A
5015,4 7552,5
TBUK094700A032A
4346,7 8058,6
ID de la planta T0 Media de GUS mediante qRT-PCR1 Media de GUS mediante ELISA2
TBUK094700A033A 5864,9 7257,5 TBUK094700A034A 10132,3 4906,8 TBUK094700A036A 3564,0 5246,3 TBUK094700A037A 342,1 321,4 TBUK094700A040A 1433,7 1445,2 TBUK094700A041A 6469,6 8130,8 TBUK094700A042A 7879,8 6893,7 TBUK094700A044A 8446,7 8175,6 TBUK094700A045A 2213,9 7705,1 TBUK094700A046A 6353,3 11685,4 TBUK094700A047A 4208,4 7426,4 TBUK094700A049A 3256,9 8271,0 TBUK094700A051A 5179,8 5079,5 TBUK094700A054A 3143,6 11610,8 TBUK094700A057A 1190,2 4514,2 TBUK094700A060A 7388,2 9830,9 TBUK094700A064A 15573,6 15832,6 TBUK094700A065A 1604,9 7166,2 TBUK094700A072A 3554,8 7492,6 TBUK094700A073A 5245,1 7534,7 TBUK094700A074A 3974,3 8657,1 TBUK094700A079A 3035,4 7916,9 TBUK094700A081A 3110,6 5416,6 TBUK094700A082A 5251,6 9757,1 TBUK094700A084A 4574,1 8151,2 TBUK094700A088A 4382,5 8554,8 TBUK094700A089A 2358,4 11864,6 TBUK094700A090A 3696,9 8756,8 TBUK094700A091A 4549,6 8392,9 TBUK094700A092A 2043,6 712,4 TBUK094700A096A 186,8 ND TBUK094700A097A 3204,9 13351,1 TBUK094700A104A 1182,5 1390,8 1 unidades relativas 2 ng de GUS/mg de proteína soluble
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