ES2617692T3 - Sistemas de transporte de agentes biológicos de múltiples componentes - Google Patents

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ES2617692T3 ES01963739.6T ES01963739T ES2617692T3 ES 2617692 T3 ES2617692 T3 ES 2617692T3 ES 01963739 T ES01963739 T ES 01963739T ES 2617692 T3 ES2617692 T3 ES 2617692T3
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Jacob M. Waugh
Michael Dake
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Abstract

Una composición que comprende un complejo de asociación no covalente de: (a) una cadena principal polimérica cargada positivamente que tiene unida covalentemente a la misma una pluralidad de secuencias de aminoácidos cargadas positivamente seleccionadas de -(gly)n1 -(arg)n2, en la que n1 es un número entero de 0 a 20 y n2 es un número entero impar de 5 a 25; (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q; (gly)p- YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que los subíndices p y q son cada uno, independientemente, un número entero de 0 a 20; o un dominio peptídico TAT de VIH cargado positivamente; y (b) al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en: i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formación de imágenes unidos; ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de dirección unidos; y iii) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biológicos unidos; en la que cada uno de dichos agentes biológicos es un agente terapéutico o cosmecéutico seleccionado del grupo que consiste en toxina botulínica, EGF, TGF-ß1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF; donde dicho complejo de asociación no covalente lleva una carga neta positiva y al menos uno de dichos dos miembros de (b) se selecciona entre el grupo i) o el grupo iii).

Description

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DESCRIPCION
Sistemas de transporte de agentes biologicos de multiples componentes Antecedentes de la invencion
Los sistemas de liberacion de genes pueden clasificarse, de forma general, en dos grupos: virales y no virales. Los sistemas virales tienen riesgos de toxicidad importantes y han ocasionado serias complicaciones y muertes en ensayos clmicos. Los sistemas no virales son bastante menos eficaces que los enfoques virales, pero ofrecen la posibilidad de adaptar aplicaciones para aumentar la especificidad y posiblemente reducir la toxicidad. Las estrategias no virales pueden clasificarse, en general, como estrategias basadas en lfpidos o estrategias no basadas en lfpidos. La estrategia presentada en esta invencion puede aplicarse a cualquiera de los enfoques no virales existentes, y todo ello se describira en el presente documento.
El sistema no viral mas sencillo es la liberacion directa de ADN. Debido a la carga negativa del ADN, realmente entra muy poco del ADN en la celula y la mayor parte se degrada. Practicamente nada del ADN entra en el nucleo sin una secuencia de direccion nuclear en la estrategia. Convencionalmente, se emplea otro factor para aumentar la eficacia de la liberacion del gen/producto (ADN, ARN o, mas recientemente, agentes terapeuticos proteicos) por efectos mecanicos tales como electroporacion, ultrasonidos, “pistolas genicas” y microinyeccion directa, o por neutralizacion de carga y efectos qmmicos con agentes tales como fosfato calcico, polilisina y preparaciones de liposomas. En estas ultimas estrategias, se ha demostrado que la neutralizacion de carga aumenta las eficacias no espedficas varias veces con respecto incluso a los efectos qmmicos/mecanicos de las preparaciones de liposomas solas. Basandose en estos resultados y en otros resultados similares, muchos autores han concluido que el ADN y el ARN requieren neutralizacion de carga para conseguir eficacia en la captacion celular, ya que la carga negativa del ADN basicamente obstaculiza el transporte excepto cuando se usa endolisis con la posterior fusion de lisosomas (se evita mediante la adicion de otros agentes). La mayona de los agentes de transfeccion en realidad usan un exceso de carga positiva en relaciones de 2-4 veces la carga negativa neta del ADN. El tubrido positivo resultante se une ionicamente a proteoglicanos de la superficie celular cargados negativamente y aumenta de forma espectacular la captacion posterior. Algunos agentes de transfeccion parecen tener un tropismo celular, muy probablemente debido a patrones estericos y de carga que se dirigen de forma mas eficaz a proteoglicanos particulares, que vanan en los patrones espedficos de tipo celular. Incluso con los agentes apropiados (es decir, el tropismo correcto), la neutralizacion de carga sola o en combinacion con liposomas sigue siendo extremadamente ineficaz con respecto a las estrategias virales. De esta manera, la comunidad ha identificado varios peptidos y fragmentos peptfdicos que facilitan la entrada eficaz de un complejo en una celula y superar cualquier etapa en la que esten implicados los endolisosomas. Varios de estos factores de transporte incluso permiten una entrada eficaz en el nucleo. En un proceso, el factor de transporte esta asociado directamente al producto terapeutico de interes (farmaco pequeno, gen, protema, etc.). Este enfoque requiere que se produzca, se purifique y se ensaye un nuevo farmaco unido al factor de transporte. En muchos casos, estos tubridos realmente constituiran nuevos farmacos y requeriran un ensayo completo. Este proceso tiene como resultado un riesgo y gasto adicional significativo. Como alternativa, varias estrategias simplemente emplean la mezcla del agente de forma no espedfica (o incluso de forma espedfica en la superficie) en preparaciones de liposomas como vehmulos para un farmaco/ADN/factor. Aunque suponen una mejora con respecto a las modalidades directas o mas sencillas en terminos de eficacia, estos enfoques siguen siendo ineficaces (en comparacion con los virus) y considerablemente mas toxicos que las estrategias no virales sencillas. Parte de esta ineficacia se debe a la mala traslocacion nuclear. Como resultado, se han desarrollado estrategias para anadir senales de traslocacion nuclear al complejo detallado anteriormente, como parte del tubrido del factor terapeutico o como parte de la mezcla de liposomas. Otros perfeccionamientos han incluido intentos de reducir la degradacion del ADN/ARN/factor.
Quizas los perfeccionamientos mas importantes en las estrategicas basicas presentadas anteriormente han incluido ligandos espedficos u otros agentes de direccion junto con el factor terapeutico. Estas estrategias ofrecen la posibilidad de reducir en gran medida la toxicidad no espedfica y mejorar de forma sustancial la eficacia, particularmente cuando se combinan con agentes de eficacia descritos anteriormente. Sin embargo, las estrategias actuales se basan en enlaces covalentes con un solo vehmulo y, por lo tanto, necesitan una smtesis espedfica (para asegurar que las consideraciones estericas en un grado de esquema de sustitucion no favorecen un solo factor con respecto a los otros, es decir, para asegurar que cada factor de eficacia y cada resto de formacion de imagenes, y cada resto de direccion esta presente en la cadena principal). Esto hace que sea practicamente imposible realizar varias construcciones espedficas (por ejemplo, sialil-lewis X y un fragmento Fab contra un antfgeno de superficie, ya que las limitaciones estericas impedinan la union eficaz del uno o del otro en la mayona de los esquemas y, a su vez, interferinan con los factores de eficacia. Aunque son prometedores en concepto, estos enfoques representan soluciones caras, con un rendimiento muy bajo (en terminos de smtesis) y no demostradas para este problema.
Como sera evidente, con cada etapa del desarrollo en la liberacion de factores y genes usando sistemas no virales han surgido problemas que se han solucionado en la etapa siguiente con un grado de complejidad anadido. Cada mejora representaba un paso incremental con respecto al patron previo. Sin embargo, la complejidad anadida lleva riesgos asociados desde el punto de vista del cuidado del paciente, e ineficacia y aumento del coste desde el punto de vista de la produccion. Estos inconvenientes han hecho que se haya reducido en gran medida el entusiasmo por
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estas posibles terapias que, por lo demas, eran prometedoras.
El documento WO 96/11712 desvela una composicion para la liberacion de genes que comprende multiples moleculas polimericas que tienen una carga neta positiva o una carga neta negativa y que tienen unidos a las mismas, por ejemplo, restos de direccion a las celulas. El documento WO 00/32764 desvela oligolisinas histidiladas y su uso para la liberacion dirigida de genes. Tambien se han usado peptidos basicos derivados del dominio de transduccion de protemas de TAT de VIH para la liberacion dirigida de genes (Schwartz et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2000, 2: 162-167).
Lo que se necesitan son nuevos metodos y composiciones que se puedan aplicar de forma general a composiciones de diversos agentes terapeuticos o cosmeceuticos, que puedan dirigirse o de los que se puedan obtener imagenes para maximizar la liberacion en un sitio particular. Sorprendentemente, la presente invencion proporciona dichas composiciones y metodos.
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas 1-28.
Sumario de la invencion
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende un complejo de asociacion no covalente de:
a) una cadena principal cargada positivamente; y
b) al menos dos miembros seleccionados de entre:
i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos;
iii) al menos un miembro seleccionado entre ARN, ADN, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado;
iv) ADN que codifica al menos un factor de persistencia; y
v) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biologicos unidos;
en la que el complejo de asociacion lleva una carga positiva neta y al menos uno de los dos miembros del grupo b) se selecciona de los grupos i), iii) o v).
Los agentes biologicos pueden ser un agente terapeutico o un agente cosmeceutico. Como alternativa, pueden usarse agentes candidatos para determinar la eficacia in vivo en estos complejos de asociacion no covalente.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende un complejo de asociacion no covalente de una cadena principal cargada positivamente que tiene al menos un grupo de eficacia unido y al menos un miembro de acido nucleico seleccionado el grupo que consiste en ARN, aDn, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para liberar un agente biologico en una superficie celular en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho sujeto una composicion como se ha descrito anteriormente.
En otro aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un metodo para preparar una composicion farmaceutica o cosmeceutica, comprendiendo el metodo combinar un componente de cadena principal cargado positivamente y al menos dos miembros seleccionados de entre:
i) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
ii) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos;
iii) al menos un miembro seleccionado entre aRn, ADN, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado;
iv) ADN que codifica al menos un factor de persistencia; y
v) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes terapeuticos o cosmeceuticos unidos;
con un vehfculo farmaceutica o cosmeceuticamente aceptable para formar un complejo de asociacion no covalente que tiene una carga neta positiva, con la condicion de que al menos uno de dichos dos miembros de los grupos i) a v) se seleccione de entre los grupos i), iii) o v).
En otro aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un kit para formular una composicion de liberacion
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farmaceutica o cosmeceutica, comprendiendo el kit un componente de cadena principal cargado positivamente y al menos dos componentes seleccionados de entre los grupos i) a v) indicados anteriormente, junto con instrucciones para preparar la composicion de liberacion.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 proporciona una representacion esquematica de los componentes usados en la invencion.
La Figura 2 proporciona una representacion esquematica de varias realizaciones de la invencion.
Las Figuras 3-10 proporcionan fotograffas que representan la liberacion transdermica de una formulacion terapeutica como se describe en el Ejemplo 4.
Las Figuras 11-12 proporcionan fotograffas que representan la direccion de una formulacion terapeutica como se describe en el Ejemplo 5.
Descripcion de la invencion
General
La presente invencion proporciona un sistema basado en componentes para la liberacion selectiva y persistente de agentes de formacion de imagenes o agentes terapeuticos. Las caractensticas individuales para las composiciones pueden seleccionarse disenando componentes deseados en las formulaciones que reciben los pacientes. Ademas, se proporcionan restos de formacion de imagenes y de direccion espedfica en cadenas principales cargadas negativamente separadas que formaran una asociacion ionica no covalente con una cadena principal positiva. Al poner estos componentes en una cadena principal cargada negativamente, la invencion evita la necesidad de unir componentes en localizaciones precisas en una cadena principal positiva como la empleada en otras estrategias (aumentando la complejidad y el coste y reduciendo la eficacia a un nivel tal que aun no se ha presentado una combinacion satisfactoria debido a las limitaciones estericas). Se proporciona una comprension adicional de la invencion haciendo referencia a la Figura 1. En esta figura, los componentes se muestran como (1) una cadena principal continua que tiene unidos grupos cargados positivamente (tambien denominados grupos de eficacia que se representan como drculos negros unidos a una barra oscura), por ejemplo (Gly)n1-(Arg)n2 (donde el subrndice n1 es un numero entero de 3 a aproximadamente 5, y el subrndice n2 es un numero entero impar de aproximadamente 7 a aproximadamente 17) o dominios TAT; (2) una cadena principal corta cargada negativamente que tiene unidos restos de formacion de imagenes (triangulos blancos unidos a una barra clara); (3) una cadena principal corta cargada negativamente que tiene unidos agentes de direccion y/o agentes terapeuticos (drculos blancos unidos a una barra clara); (4) un oligonucleotido, ARN, ADN o ADNc (barra sombreada clara); y (5) ADN que codifica factores de persistencia (barra sombreada oscura). La Figura 2 ilustra varios ejemplos de composiciones de multiples componentes en las que los grupos se representan como se indica en la Figura 1. Por ejemplo, en la Figura 2, se ilustra una primera composicion de multiples componentes en la que una cadena principal cargada positivamente tiene asociado un componente de formacion de imagenes, un componente de direccion, un oligonucleotido y un factor de persistencia. Se ilustra una segunda composicion de multiples componentes que esta disenada para la formacion de imagenes de diagnostico/pronostico. En esta composicion, la cadena principal cargada positivamente esta complejada tanto con componentes de formacion de imagenes como con componentes de direccion. Finalmente, se ilustra un tercer sistema de multiples componentes que es util para la liberacion de genes. En este sistema, se forma un complejo de asociacion entre una cadena principal cargada positivamente, un componente de direccion, un gen de interes y un ADN que codifica un factor de persistencia. La presente divulgacion descrita con mas detalle mas adelante proporciona varias composiciones adicionales utiles en programas terapeuticos y de diagnostico.
Descripcion de las realizaciones
Composiciones
En vista de lo anterior, la presente divulgacion proporciona, en un aspecto, una composicion que comprende un complejo de asociacion no covalente de:
a) una cadena principal cargada positivamente; y
b) al menos dos miembros seleccionados de entre:
i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos;
iii) al menos un miembro seleccionado de entre ARN, ADN, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado;
iv) ADN que codifica al menos un factor de persistencia; y
v) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biologicos unidos;
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en la que el complejo de asociacion lleva una carga neta positiva y al menos uno de los dos miembros del grupo b) se selecciona entre los grupos i), iii) o v).
En un grupo de realizaciones, la composicion comprende al menos tres miembros seleccionados de entre los grupos
i) a v). En otro grupo de realizaciones, la composicion comprende al menos un miembro de cada uno de los grupos i), ii), iii) y iv). En otro grupo mas de realizaciones, la composicion comprende al menos un miembro de cada uno de los grupos i) y ii). Y en otro grupo de realizaciones, la composicion comprende al menos un miembro de cada uno de los grupos ii), iii) y iv).
Preferentemente, la cadena principal cargada positivamente tiene una longitud de aproximadamente 1 a 4 veces las longitudes combinadas de los miembros del grupo b). Como alternativa, la cadena principal cargada positivamente tiene una relacion de carga de aproximadamente 1 a 4 veces la carga combinada de los miembros del grupo b). En algunas realizaciones, la densidad de carga es uniforme y las relaciones de longitud y carga son aproximadamente iguales. Las relaciones de tamano a tamano (longitud) pueden determinarse basandose en estudios moleculares de los componentes o pueden determinarse a partir de las masas de los componentes.
Cadena principal cargada positivamente
La cadena principal cargada positivamente tipicamente es una cadena lineal de atomos, llevando ciertos grupos presentes en la cadena una carga positiva a pH fisiologico, o llevando ciertos grupos una carga positiva unida a cadenas laterales que se extienden desde la cadena principal. La cadena principal lineal es una cadena principal de hidrocarburo que, en algunas realizaciones, esta interrumpida por heteroatomos seleccionados de entre nitrogeno, oxfgeno, azufre, silicio y fosforo. La mayor parte de los atomos de la cadena principal normalmente son carbonos. Ademas, la cadena principal con frecuencia sera un polfmero de unidades repetidas (por ejemplo, aminoacidos, poli(oxido de etileno), poli(propilenamina) y similares). En un grupo de realizaciones, la cadena principal cargada positivamente es una polipropilenamina en la que varios de los atomos de nitrogeno de amina estan presentes en forma de grupos amonio (tetra-sustituidos) que llevan una carga positiva. En otro grupo de realizaciones, la cadena principal tiene unida una pluralidad de restos de cadena lateral que incluyen grupos cargados positivamente (por ejemplo, grupos amonio, grupo piridinio, grupos fosfonio, grupos sulfonio, grupos guanidinio o grupos amidinio). Los restos de cadena lateral de este grupo de realizaciones pueden estar situados en localizaciones separadas a lo largo de la cadena principal de forma uniforme o variable. Ademas, la longitud de las cadenas laterales puede ser similar o diferente. Por ejemplo, en un grupo de realizaciones, las cadenas laterales pueden ser cadenas de hidrocarburo lineales o ramificadas que tienen de uno a veinte atomos de carbono y que terminan en el extremo distal (alejado de la cadena principal) en uno de los grupos cargados positivamente indicados anteriormente.
En un grupo de realizaciones, la cadena principal cargada positivamente es un polipeptido que tiene multiples grupos de cadena lateral cargados positivamente (por ejemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina y similares). Un experto en la materia apreciara que cuando se usan aminoacidos en esta parte de la invencion, las cadenas laterales pueden tener la forma D o L (configuracion R o S) en el centro de la union.
Como alternativa, la cadena principal puede ser un analogo de un polipeptido tal como un peptoide. Vease, por ejemplo, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4: 80 (1992); y Simon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 9367 (1992)). En resumen, un peptoide es una poliglicina en la que en la cadena lateral esta unida a los atomos de nitrogeno de la cadena principal en lugar de a los atomos de carbono a. Como se ha indicado anteriormente, una parte de las cadenas laterales tfpicamente terminara en un grupo cargado positivamente para proporcionar un componente de cadena principal cargada positivamente. Se describe la smtesis de peptoides, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.877.278. Como se usa el termino en el presente documento, las cadenas principales cargadas positivamente que tienen una construccion de cadena principal de peptoide se consideran “no peptidos”, ya que no estan compuestas de aminoacidos que tienen cadenas laterales naturales en las localizaciones de carbono a.
Puede usarse una diversidad de cadenas principales distintas empleando, por ejemplo, mimeticos estericos o electronicos de polipeptidos en los que los enlaces amida del peptido se han reemplazado por sustitutos tales como enlaces ester, tioamidas (-CSNH-), tioamida inversa (-NHCS-), aminometileno (-NHCH2-) o grupos metilenamino inverso (-CH2NH-), grupos cetometileno (-COCH2-), fosfinato (-PO2RCH2-), fosfonamidato y ester de fosfonamidato (- PO2RNH-), peptido inverso (-NHCO-), trans-alqueno (-CR=Ch-), fluoroalqueno (-CF=CH-), dimetileno (-CH2CH2-), tioeter (-CH2S-), hidroxietileno (-cH(OH)CH2-), metilenoxi (-CH2O-), tetrazol (CN4), sulfonamido (-SO2NH-), metilenosulfonamido (-CHRSO2NH-), sulfonamida inversa (-NHSO2-), y cadenas principales con subunidades malonato y/o gem-diaminoalquilo, por ejemplo, como se revisa por Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev. 98: 763) y se detalla por referencias citadas en el presente documento. Muchas de las sustituciones anteriores dan como resultado cadenas principales polimericas aproximadamente isostericas con respecto a las cadenas principales formadas a partir de a-aminoacidos.
En cada una de las cadenas principales proporcionadas anteriormente, pueden colgarse grupos de cadena lateral que llevan un grupo cargado positivamente. Por ejemplo, las cadenas principales unidas a sulfonamida (-SO2NH- y - NHSO2-) pueden tener grupos de cadena lateral unidos a los atomos de nitrogeno. De manera similar, el enlace de
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hidroxietileno (-CH(OH)CH2-) puede llevar un grupo de cadena lateral unido al sustituyente hidroxi. Un experto en la materia puede adaptar facilmente las otras qmmicas de enlace para proporcionar grupos de cadena lateral cargados positivamente usando metodos de smtesis convencionales.
En una realizacion particularmente preferida, la cadena principal cargada positivamente es un polipeptido que tiene grupos de ramificacion (tambien denominados grupos de eficacia) que comprenden - (gly)ni-(arg)n2 (SEQ ID NO: 818), TAT de VIH en el que el subrndice n1 es un numero entero de 0 a 20, mas preferentemente de 0 a 8, aun mas preferentemente de 2 a 5, y el subrndice n2 es un numero entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, mas preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, mas preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. Tambien se prefieren las realizaciones en las que el fragmento TAT de VIH tiene la formula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q (SEQ ID NO: 19) o (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q (SEQ ID NO: 20) en la que los subrndices p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20 y el fragmento esta unido a la cadena principal a traves del extremo C o el extremo N del fragmento. Son fragmentos TAT de VIH preferidos aquellos en los que los subrndices p y q son cada uno, independientemente, numeros enteros del 0 a 8, mas preferentemente de 2 a 5.
En otra realizacion particularmente preferida, la parte de la cadena principal es una polilisina y los grupos de ramificacion cargados positivamente estan unidos a los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La polilisina usada en esta realizacion particularmente preferida puede ser cualquiera de las polilisinas disponibles en el mercado (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) tales como, por ejemplo, polilisina que tiene PM > 70.000, polilisina que tiene PM de 70.000 a 150.000, polilisina que tiene PM de 150.000 a 300.000 y polilisina que tiene PM > 300.000. La seleccion apropiada de una polilisina dependera de los demas componentes de la composicion y sera suficiente para proporcionar una carga neta positiva global a la composicion y proporcionar una longitud que preferentemente sea de una a cuatro veces la longitud combinada de los componentes cargados negativamente. Los grupos de ramificacion cargados positivamente o grupos de eficacia preferidos incluyen, por ejemplo, -gly-gly- gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7) (SEQ ID NO: 1) o TAT de VIH.
Otros componentes
Ademas del componente de cadena principal cargada positivamente, las composiciones de la presente invencion comprenden al menos dos componentes de los siguientes:
i) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
ii) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de direccion unidos;
iii) una cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biologicos unidos;
en las que cada uno de dichos agentes biologicos es un agente terapeutico o cosmetico seleccionado del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF-beta 1, insulina, VEGf, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF.
Las cadenas principales cargadas negativamente usadas para llevar los restos de formacion de imagenes, restos de direccion y agentes terapeuticos pueden ser una diversidad de cadenas principales (similares a las descritas anteriormente) que tienen multiples grupos que llevan una carga negativa a pH fisiologico. Son grupos cargados negativamente adecuados acidos carboxflicos, acidos fosfmico, fosfonico o fosforico, acidos sulfmico o sulfonico y similares. En algunas realizaciones, la cadena principal cargada negativamente sera un acido oligonucleico. En otras realizaciones, la cadena principal cargada negativamente es un oligosacarido (por ejemplo, dextrano). En otras realizaciones, la cadena principal cargada negativamente es un polipeptido (por ejemplo, poli(acido glutamico), poli(acido aspartico) o un polipeptido en el que los restos de acido glutamico o acido aspartico estan interrumpidos por aminoacidos no cargados). Los restos descritos con mas detalle mas adelante (restos de formacion de imagenes, agentes de direccion y agentes terapeuticos) pueden unirse a una cadena principal que tiene estos grupos colgantes, tipicamente a traves de enlaces ester. Como alternativa, pueden usarse aminoacidos que interrumpen los aminoacidos cargados negativamente o estan colgando del extremo de la cadena principal cargada negativamente, para unir restos de formacion de imagenes y restos de direccion mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro (a traves de un resto de cistema), enlaces amida, enlaces eter (a traves de grupos hidroxilo de serina o treonina) y similares.
Restos de formacion de imagenes
En la presente invencion son utiles una diversidad de restos de diagnostico o de formacion de imagenes y estan presentes en una cantidad eficaz que dependera de la afeccion a diagnosticar o de la que se deseen obtener imagenes, la via de administracion, la sensibilidad del agente y el dispositivo usado para la deteccion del agente, y similares.
Los ejemplos de agentes de formacion de imagenes o de diagnostico adecuados incluyen agentes de contraste radiopacos, agentes de contraste paramagneticos, agentes de contraste superparamagneticos, agentes de contraste CT y otros agentes de contraste. Por ejemplo, los agentes de contraste radiopacos (para la obtencion de imagenes
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de rayos X) incluiran compuestos de yodo inorganicos y organicos (por ejemplo, diatrizoato), metales radiopacos y sus sales (por ejemplo, plata, oro, platino y similares) y otros compuestos radiopacos (por ejemplo, sales de calcio, sales de bario tales como sulfato de bario, tantalo y oxido de tantalo). Los agentes de contraste paramagneticos adecuados (para la obtencion de imagenes por MR (siglas de resonancia magnetica)) incluyen gadolinio-acido dietilentriaminopentaacetico (Gd-DTPA) y sus derivados, y otros complejos con gadolinio, manganeso, hierro, disprosio, cobre, europio, erbio, cromo, mquel y cobalto, incluyendo complejos con acido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-N,N',N”,N'”-tetraacetico (DOTA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano -N,N',N”-triacetico (DO3A), acido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N”-triacetico (NOTA), acido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N”,N'”-tetraacetico (TETA), acido hidroxibenciletilen-diamino diacetico (HBED) y similares. Los agentes de contraste superparamagneticos adecuados (para la formacion de imagenes por MR) incluyen magnetitas, oxidos de hierro superparamagnetico, oxidos de hierro monocristalino, particularmente formas complejadas de cada uno de estos agentes que pueden unirse a una cadena principal cargada negativamente. Otros agentes de formacion de imagenes adecuados adicionales son los agentes de contraste CT que incluyen agentes de contraste CT yodados y no yodados e ionicos y no ionicos, asf como agentes de contraste tales como marcadores de spin u otros agentes eficaces desde el punto de vista del diagnostico.
Otros ejemplos de agentes de diagnostico incluyen genes marcadores que codifican protemas que se pueden detectar facilmente cuando se expresan en una celula, incluyendo, pero sin limitacion, p-galactosidasa, protema fluorescente verde, protema azul fluorescente, luciferasa y similares. Puede emplearse una amplia diversidad de marcadores, tales como radionuclidos, fluor, enzimas, sustratos enzimaticos, cofactores enzimaticos, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos) y similares. Otras sustancias utiles son las marcadas con especies o componentes radiactivos tales como 99mTc glucoheptonato.
Agentes de direccion
En las composiciones descritas en el presente documento son utiles una diversidad de agentes de direccion. Tfpicamente, los agentes de direccion estan unidos a una cadena principal cargada negativamente como se ha descrito anteriormente para los restos de formacion de imagenes. Los agentes de direccion pueden ser cualquier elemento que haga posible dirigir la transferencia de un acido nucleico, agente terapeutico u otro componente de la composicion a un sitio particular. El agente de direccion puede ser un agente de direccion extracelular que permite, por ejemplo, transferir un acido nucleico a dirigir hacia ciertos tipos de celulas o ciertos tejidos deseados (celulas tumorales, celulas hepaticas, celulas hematopoyeticas y similares). Dicho agente tambien puede ser un agente de direccion intracelular que permite dirigir un agente terapeutico hacia compartimentos celulares particulares (por ejemplo, mitocondrias, nucleo y similares).
El agente o agentes de direccion preferentemente se unen, de forma covalente o no covalente, a una cadena principal cargada negativamente de acuerdo con la invencion. De acuerdo con un modo preferido de la invencion, el agente de direccion se une covalentemente a un oligonucleotido que sirve como componente de la cadena principal cargada negativamente, preferentemente a traves de un grupo de enlace. Los expertos en la materia conoceran bien metodos para unir agentes de direccion (asf como otros agentes biologicos) a acidos nucleicos usando, por ejemplo, grupos de union heterobifuncionales (vease Pierce Chemical Catalog). En un grupo de realizaciones, el agente de direccion es un peptido fusogenico para promover la transfeccion celular, es decir para favorecer el paso de la composicion o sus diversos elementos a traves de las membranas, o para ayudar en la salida de los endosomas o para atravesar la membrana nuclear. El agente de direccion tambien puede ser un ligando de un receptor celular para un receptor que este presente en la superficie del tipo celular, tal como, por ejemplo, un azucar, transferrina, insulina o protema asialo-orosomucoide. Dicho ligando tambien puede ser uno de tipo intracelular, tal como una secuencia senal de localizacion nuclear (nls) que promueve la acumulacion de ADN transfectado dentro del nucleo.
Otros agentes de direccion utiles en el contexto de la invencion incluyen azucares, peptidos, hormonas, vitaminas, citocinas, oligonucleotidos, lfpidos o secuencias o fracciones derivadas de estos elementos y que permiten la union espedfica a sus receptores correspondientes. Preferentemente, los agentes de direccion son azucares y/o peptidos tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, ligandos de receptores celulares o fragmentos de los mismos, receptores o fragmentos de receptores y similares. Mas preferentemente, los agentes de direccion son ligandos de receptores de factores de crecimiento, de receptores de citocinas o de receptores celulares de lectina o de receptores de protemas de adhesion. El agente de direccion tambien puede ser un azucar que hace que sea posible fijar como diana lectinas tales como los receptores de asialoglicoprotema o, como alternativa, un fragmento Fab de anticuerpo que hace que sea posible fijar como diana el receptor del fragmento Fc de inmunoglobulinas.
Acidos nucleicos
En las composiciones de la presente divulgacion, el acido nucleico puede ser un acido desoxirribonucleico o un acido ribonucleico, y puede comprender secuencias de origen natural o artificial. Mas particularmente, los acidos nucleicos usados en la presente invencion pueden incluir ADN genomico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, secuencias tubridas o secuencias sinteticas o semi-sinteticas. Estos acidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, vmco, etc. Ademas, los acidos nucleicos pueden obtenerse por cualquier tecnica conocida por los expertos en la materia y, en particular, mediante la exploracion de bancos, por smtesis qrnmica o por metodos
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mixtos que incluyen la modificacion qmmica o enzimatica de secuencias obtenidas mediante la exploracion de bancos. Ademas, los acidos nucleicos pueden incorporarse en vectores, tales como vectores plasirndicos.
Los acidos desoxirribonucleicos usados en la presente divulgacion pueden ser mono- o bicatenarios. Estos acidos desoxirribonucleicos tambien pueden codificar genes terapeuticos, secuencias para regular la transcripcion o replicacion, secuencias anti-sentido, regiones para la union a otros componentes celulares, etc. Los genes terapeuticos adecuados son esencialmente cualquier gen que codifique un producto proteico que tiene un efecto terapeutico. El producto proteico codificado de esta manera puede ser una protema, polipeptido, peptido o similar. El producto proteico, en algunos casos, puede ser homologo con respecto a la celula diana (es decir, un producto que normalmente se expresa en la celula diana cuando esta ultima no presenta patologfa). De esta manera, el uso de acidos nucleicos adecuados puede aumentar la expresion de una protema, haciendo posible, por ejemplo, solucionar una expresion insuficiente en la celula. Como alternativa, la presente divulgacion proporciona composiciones y metodos para la expresion de una protema que es inactiva o debilmente activa debido a una modificacion o, como alternativa, de la sobreexpresion de la protema. De esta manera, el gen terapeutico puede codificar un mutante de una protema celular, que tiene mayor estabilidad, actividad modificada, etc. El producto proteico tambien puede ser heterologo con respecto a la celula diana. En este caso, una protema expresada puede constituir o proporcionar, por ejemplo, una actividad que es deficiente en la celula, lo cual permite combatir una patologfa o estimular una respuesta inmunitaria.
Mas particularmente, son acidos nucleicos utiles en la presente divulgacion los que codifican enzimas, derivados sangumeos, hormonas, linfocinas, interleucinas, interferones, TNF, factores de crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas sinteticas, o factores troficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina; las protemas implicadas en el metabolismo de lfpidos, de tipos de apolipoprotemas seleccionados de entre apolipoprotemas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J y apo(a), enzimas metabolicas tales como, por ejemplo, lipoprotema lipasa, lipasa hepatica, lecitin colesterol aciltransferasa, 7-a-colesterol hidroxilasa, acido fosfatfdico fosfatasa, o protemas de transferencia de lfpidos tales como la protema de transferencia de ester de colesterol y protema de transferencia de fosfolfpidos, una protema para la union a HDL o un receptor seleccionado, por ejemplo, entre receptores de LDL, receptores de remanentes de quilomicrones, y receptores escoba (scavenger), distrofina o minidistrofina, protema GAX, protema CFTR asociada con mucoviscidosis, genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev; factores de protema implicados en la coagulacion: factores VII, VIII, IX; o los acidos nucleicos pueden ser los genes implicados en la reparacion del ADN, genes suicidas (timidina quinasa, citosina desaminasa), genes que codifican trombomodulina; a1-antitripsina, activador de plasminogeno tisular, superoxido dismutasa, elastasa, metaloproteinasa de matriz y similares.
Los genes terapeuticos utiles en la presente divulgacion tambien pueden ser una secuencia antisentido o un gen cuya expresion en la celula diana hace posible controlar la expresion de genes o la transcripcion del ARNm celular. Dichas secuencias pueden transcribirse, por ejemplo, en la celula diana dando un ARN complementario al ARNm celular y de esta manera bloquear su traduccion en protemas, de acuerdo con la tecnica descrita en la patente EP 140.308. Las secuencias antisentido tambien comprenden las secuencias que codifican ribozimas que son capaces de destruir de forma selectiva el ARN diana (vease el documento EP 321.201).
Como se ha indicado anteriormente, el acido nucleico tambien puede contener uno o mas genes que codifican un peptido antigenico, capaz de generar una respuesta inmunitaria en seres humanos o animales. En esta realizacion particular, la divulgacion de esta manera hace posible producir vacunas o tratamientos inmunoterapeuticos aplicados a seres humanos o a animales, en particular contra microorganismos, virus o canceres. Particularmente pueden ser peptidos antigenicos espedficos para el virus Epstein Barr, para el virus VIH, para el virus de la hepatitis B (vease el documento EP 185.573), para el virus de la pseudorrabia o, como alternativa, espedficos para tumores (vease el documento EP 259.212).
Preferentemente, el acido nucleico tambien comprende secuencias que permiten la expresion del gen terapeutico y/o del gen que codifica el peptido antigenico en la celula u organo deseado. Estas pueden ser secuencias que son responsables de forma natural de la expresion del gen considerado cuando estas secuencias son capaces de funcionar en la celula infectada. Los acidos nucleicos tambien pueden ser secuencias de diferente origen (responsables de la expresion de otras protemas, o incluso protemas sinteticas). En particular, los acidos nucleicos pueden contener secuencias promotoras para genes eucariotas o virales. Por ejemplo, las secuencias promotoras pueden ser las derivadas del genoma de la celula que se desea infectar. De forma similar, las secuencias promotoras pueden proceder del genoma de un virus, por ejemplo, los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Ademas, estas secuencias de expresion pueden modificarse por la adicion de secuencias de activacion, secuencias de regulacion, etc.
Ademas, el acido nucleico tambien puede contener, en particular cadena arriba del gen terapeutico, una secuencia senal que dirige el producto terapeutico sintetizado a rutas de secrecion de la celula diana. Esta secuencia senal puede ser la secuencia senal natural del producto terapeutico, pero tambien puede ser cualquier otra secuencia senal funcional, o una secuencia senal artificial.
ADN que codifica al menos un factor de persistencia
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En algunas realizaciones, la composicion tambien comprendera ADN que codifica al menos un factor de persistencia. Es un ejemplo de dicho ADN el ADN que codifica la protema 1 preterminal de adenovirus (vease, Lieber, et al. Nature Biotechnology 15(13): 1383-1387 (1997)).
Agentes biologicos
En la presente divulgacion son utiles una diversidad de agentes biologicos, incluyendo tanto agentes terapeuticos como agentes cosmeceuticos y estan presentes en una cantidad eficaz que dependera de la afeccion a tratar, desde el punto de vista profilactico o de otra manera, la via de administracion, la eficacia del agente y las dimensiones y la susceptibilidad del paciente al regimen de tratamiento.
Los agentes terapeuticos adecuados que pueden unirse a una cadena principal cargada negativamente pueden encontrarse esencialmente en cualquier clase de agentes, incluyendo, por ejemplo, agentes analgesicos, agentes anti-asmaticos, antibioticos, agentes antidepresivos, agentes antidiabeticos, agentes antifungicos, antiemeticos, antihipertensivos, agentes contra la impotencia, agentes antiinflamatorios, agentes antineoplasicos, agentes anti- VIH, agentes antivirales, agentes ansiolfticos, agentes anticonceptivos, agentes de fertilidad, agentes antitromboticos, agentes protromboticos, hormonas, vacunas, agentes inmunosupresores, vitaminas y similares.
Los agentes cosmeceuticos adecuados incluyen, por ejemplo, el factor de crecimiento epidermico (EGF), asf como la hormona de crecimiento humana, antioxidantes y BOTOX.
Mas particularmente, los agentes terapeuticos utiles en la presente divulgacion incluyen analgesicos tales como lidocama, novacama, bupivacama, procama, tetracama, benzocama, cocama, mepivacama, etidocama, proparacama ropivacama, prilocama y similares; agentes anti-asmaticos tales como azelastina, ketotifeno, traxanox, corticosteroides, cromolyn, nedocromil, albuterol, mesilato de bitolterol, pirbuterol, salmeterol, terbutilina, teofilina y similares; agentes antibioticos tales como neomicina, estreptomicina, cloranfenicol, norfloxacina, ciprofloxacina, trimetoprim, sulfametiloxazol, los antibioticos p-lactamicos, tetraciclina, y similares; agentes antidepresivos tales como nefopam, oxipertina, imipramina, trazadona y similares; agentes antidiabeticos tales como biguanidinas, sulfonilureas, y similares; antiemeticos y antipsicoticos tales como cloropromazina, flufenazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, tietilperazina, triflupromazina, haloperidol, escopolamina, difenidol, trimetobenzamida y similares; agentes neuromusculares tales como atracurio mivacurio, rocuronio, succinilcolina, doxacurio, tubocurarina y toxina botulmica (BOTOX); agentes antifungicos tales como anfotericina B, nistatina, candicidina, itraconazol, ketoconazol, miconazol, clotrimazol, fluconazol, ciclopirox, econazol, naftifina, terbinafina, griseofulvina y similares; agentes antihipertensivos tales como propanolol, propafenona, oxiprenolol, nifedipina, reserpina y similares; agentes contra la impotencia tales como donadores de oxido nftrico y similares; agentes antiinflamatorios incluyendo antiinflamatorios esteroideos tales como cortisona, hidrocortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, fluazacort y similares, asf como agentes antiinflamatorios no estereoideos tales como indometacina, ibuprofeno, ramifenizona, prioxicam y similares; agentes antineoplasicos tales como adriamicina, ciclofosfamida, actinomicina, bleomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina, rapamicina, metotrexato, fluorouracilo, carboplatino, carmustina (BCNU), cisplatino, etoposido, interferones, fenesterina, taxol (incluyendo analogos y derivados), camptotecina y derivados de la misma, vinblastina, vincristina y similares; agentes anti-VIH (por ejemplo, antiproteolfticos); agentes antivirales tales como amantadina, metisazona, idoxuridina, citarabina, aciclovir, famciclovir, ganciclovir, foscarnet, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, cidofovir, didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, ribavirina, rimantatina y similares; agentes ansiolfticos tales como dantroleno, diazepam y similares; inhibidores de COX-2; agentes anticonceptivos tales como progestogenos y similares; agentes antitromboticos tales como inhibidores de GPIIb/IIIa, activadores de plasminogeno tisular, estreptoquinasa, uroquinasa, heparina y similares; agentes protromboticos tales como trombina, factores V, VII, VIII y similares; hormonas tales como insulina, hormona de crecimiento, prolactina, EGF (factor de crecimiento epidermico) y similares; agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, azatioprina, mizorobina, FK506, prednisona y similares; agentes angiogenicos tales como VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular); vitaminas tales como A, D, E, K y similares; y otros agentes activos desde el punto de vista terapeutico o medico. Vease, por ejemplo, GOODMAN & GILMAN'S THE FARMACOLOGICAL BASIS OF TERAPEUTICS, Nint Ed. Hardman, et al., eds. McGraw-Hill, (1996).
En la presente invencion, el agente biologico se selecciona entre insulina, toxina botulmica (BOTOX), VEGF, EGF, anticuerpos contra VEGF y TGF-p1.
Cadenas principales cargadas negativamente que tienen restos de formacion imagenes unidos, agentes de direccion o agentes terapeuticos
Para los tres grupos anteriores de componentes (restos de formacion de imagenes, agentes de direccion y agentes terapeuticos), los compuestos individuales se unen a una cadena principal cargada negativamente. Tfpicamente, la union es a traves de un grupo de enlace usado para unir covalentemente el agente particular a la cadena principal a traves de grupos funcionales presentes en el agente, asf como en la cadena principal. En este aspecto de la invencion son utiles una diversidad de grupos de union. Vease, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996); Wong, S.S., Ed., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC
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Press, Inc., Boca Raton, FL (1991); Senter, et al., J. Org. Chem. 55: 2975-78 (1990); y Koneko, et al., Bioconjugate Chem. 2: 133-141 (1991).
En algunas realizaciones, los agentes terapeuticos, de diagnostico o de direccion no tendran un grupo funcional disponible para unirse a un grupo de union, y pueden modificarse primero para incorporar, por ejemplo, un sustituyente hidroxi, amino o tiol. Preferentemente, el sustituyente se proporciona en una parte no interferente del agente, y puede usarse para unir un grupo de union, y no afectara de forma adversa a la funcion del agente.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona composiciones que comprenden un complejo de asociacion no covalente de una cadena principal cargada positivamente que tiene al menos un grupo de eficacia unido y al menos un miembro de acido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ARN, aDn, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado. En este aspecto de la divulgacion, la cadena principal cargada positivamente puede ser esencialmente cualquiera de las cadenas principales cargadas positivamente descritas anteriormente, y tambien comprendera (como ocurre con las cadenas principales seleccionadas anteriores) al menos un grupo de eficacia unido. Los grupos de eficacia adecuados incluyen, por ejemplo, (Gly)n1-(Arg)n2 (donde el subrndice n1 es un numero entero de 3 a aproximadamente 5, y el subrndice n2 es un numero impar de aproximadamente 7 a aproximadamente 17) o dominios TAT. Ademas, los acidos nucleicos utiles en este aspecto de la divulgacion son los mismos que se han descrito anteriormente.
Metodos para preparar las composiciones
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para preparar una composicion farmaceutica, comprendiendo el metodo combinar un componente de cadena principal cargado positivamente y al menos dos miembros seleccionados de entre:
i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos;
iii) al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ARN, ADN, ribozimas, oligonucleotidos modificados y ADNc que codifica un transgen seleccionado;
iv) ADN que codifica al menos un factor de persistencia; y
v) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes terapeuticos unidos; con un vetuculo farmaceuticamente aceptable para formar un complejo de asociacion no covalente que tiene una carga neta positiva, con la condicion de que al menos uno de los dos miembros de los grupos i) a v) se seleccione entre los grupos i), iii) o v).
La amplia aplicabilidad de la presente divulgacion se ilustra por la facilidad con la que pueden formularse una diversidad de composiciones farmaceuticas. Tfpicamente, las composiciones se preparan mezclando el componente de cadena principal cargada positivamente con los componentes deseados de interes (por ejemplo, ADN o componentes de direccion, de formacion de imagenes o terapeuticos) en relaciones y en una secuencia adecuados para obtener composiciones con una carga neta positiva variable. En muchas realizaciones, las composiciones pueden prepararse, por ejemplo, justo antes de administrarse al paciente usando vehfculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables para la administracion de la composicion. Como alternativa, las composiciones pueden prepararse mezclando de manera adecuada los componentes y despues liofilizando y almacenando (tfpicamente a temperatura ambiente o a una temperatura inferior) la composicion obtenida hasta que se use o se formule en un vetuculo de liberacion adecuado.
Las composiciones pueden formularse para proporcionar mezclas adecuadas para administracion topica, cutanea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraocular, transdermica, etc. Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion preferentemente contienen un vetuculo que es farmaceuticamente aceptable para una formulacion inyectable, en particular para la inyeccion directa en el organo deseado, o para administracion topica (en la piel y/o membrana mucosa). En particular, pueden ser soluciones isotonicas esteriles o composiciones deshidratadas, en particular composiciones liofilizadas que, mediante la adicion, dependiendo el caso, de agua esterilizada o de solucion fisiologica salina, permiten preparar soluciones inyectables. Por ejemplo, las dosis de acido nucleico usadas para la inyeccion y el numero de administraciones pueden adaptarse de acuerdo con diversos parametros y, en particular, de acuerdo con el modo de administracion usado, la patologfa relacionada, el gen a expresar o, como alternativa, la duracion deseada del tratamiento.
Metodos de uso de las composiciones
Metodos de liberacion
Las composiciones de la presente invencion pueden administrarse a un sujeto, celula o sitio diana, in vivo o ex vivo usando una diversidad de metodos. De hecho, puede usarse cualquiera de las vfas usadas normalmente para introducir una composicion en contacto ultimo con el tejido a tratar. Preferentemente, las composiciones se
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administraran con vehnculos farmaceuticamente aceptables. Estan disponibles metodos adecuados de administracion de dichos compuestos y seran bien conocidos para los expertos en la materia y, aunque puede usarse mas de una via para administrar una composicion particular, una via particular a menudo puede proporcionar una reaccion mas inmediata y mas eficaz que otra via. Los vehnculos farmaceuticamente aceptables se determinan en parte por la composicion particular a administrar, asf como por el metodo particular usado para administrar la composicion. Por consiguiente, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmaceuticas de la presente invencion (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985).
La administracion puede ser, por ejemplo, intravenosa, topica, intraperitoneal, subdermica, subcutanea, transcutanea, intramuscular, oral, intraarticular, parenteral, intranasal o por inhalacion. De esta manera, los sitios de administracion adecuados incluyen, pero sin limitacion, la piel, bronquios, tracto gastrointestinal, ojo y ofdo. Las composiciones tfpicamente incluyen un vehnculo o excipiente farmaceutico convencional y ademas pueden incluir otros agentes medicinales, vehnculos, adyuvantes y similares. Preferentemente, la formulacion constituira de aproximadamente un 5 % a un 75 % en peso de una composicion de la invencion, consistiendo el resto en excipientes farmaceuticos adecuados. Los excipientes apropiados pueden adaptarse a la composicion y via de administracion particular por metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).
Las formulaciones pueden tomar la forma de formas farmaceuticas solidas, semi-solidas, en polvo liofilizado o lfquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retencion, cremas, pomadas, lociones, aerosoles o similares. En realizaciones en las que la composicion farmaceutica toma la forma de una pfldora, comprimido o capsula, la formulacion puede contener, junto con la composicion biologicamente activa, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicalcico y similares; un disgregante tal como almidon o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como almidon, goma arabiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de los mismos. Las composiciones pueden presentarse en recipientes sellados de una sola dosis o de multiples dosis, tales como ampollas o viales. Las dosis administradas a un paciente deben ser suficientes para producir una respuesta terapeutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo.
En algunas realizaciones, puede administrarse una formulacion de liberacion sostenida a un organismo o a celulas en cultivo y pueden llevar las composiciones deseadas. La composicion de liberacion sostenida puede administrarse al tejido de un organismo, por ejemplo, por inyeccion. Por “liberacion sostenida” se entiende que la composicion, preferentemente una que codifica un transgen de interes o un agente terapeutico, esta disponible para la captacion por el tejido circundante o las celulas en cultivo durante un periodo de tiempo mayor que el que se conseguina mediante la administracion de la composicion en un medio menos viscoso, por ejemplo, una solucion salina.
Las composiciones, solas o en combinacion con otros componentes adecuados, pueden transformarse en formulaciones de aerosol (es decir, pueden “nebulizarse”) para administrarse por inhalacion. Las formulaciones de aerosol pueden ponerse en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno y similares. Para la liberacion por inhalacion, las composiciones tambien pueden suministrarse como polvo seco (por ejemplo, Inhale Therapeutics).
Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral, tal como, por ejemplo, por via intravenosa, intramuscular, intradermica y subcutanea, incluyen soluciones de inyeccion esteriles isotonicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes.
Otros metodos de administracion incluyen, pero sin limitacion, la administracion usando balones de angioplastia, cateteres y formaciones de gel. En la tecnica se conocen bien metodos para la liberacion mediante balones de angioplastia, cateteres y formacion de gel.
Metodos de formacion de imagenes
Un experto en la materia comprendera que las composiciones de la presente invencion pueden adaptarse a una diversidad de usos de formacion de imagenes. En una realizacion, puede realizarse una colonoscopia virtual usando el sistema basado en componentes para obtener las imagenes. En el momento actual, la colonoscopia virtual implica esencialmente infundir contraste en un colon y visualizar las imagenes en CT, reconstruyendose despues una imagen 3-D. Podnan emplearse tecnicas similares para MR. Sin embargo, las heces, la mucosa y el aire actuan como barreras de contraste y pueden proporcionar una superficie artificial en la reconstruccion de la pared del colon. La adicion de un contraste que se dirigiera a las celulas ayudana a superar estas barreras proporcionando una reconstruccion de la pared real y ayudando a evitar tanto falsos positivos como falsos negativos. Hay varias formas en las que el sistema basado en componentes podna aplicarse en esta situacion. Lo mas sencillo es que la cadena principal de eficacia cationica pudiera aplicarse con un solo agente de contraste (CT o MR). De esta manera, la capa de superficie celular podna visualizarse y podna detectarse cualquier irregularidad u obstruccion en la reconstruccion de la imagen. Sin embargo, el sistema basado en componentes ofrece la opcion adicional de anadir
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un segundo agente espedfico. Este agente podna consistir en una cadena principal de eficacia cationica, un resto de formacion de imagenes diferente y componentes de direccion (por ejemplo, direccion a dos antigenos caractensticos del cancer de colon). Los restos de formacion de imagenes (desde el sencillo hasta el de diagnostico) podnan seleccionarse de manera que uno fuera el contraste para CT y el otro el contraste para MR, o de tal forma que los dos fueran contraste para MR siendo uno un agente T2 y siendo el otro un agente T1. De esta manera, la superficie podna reconstruirse como se ha indicado anteriormente, y podna visualizarse cualquier region espedfica para un antfgeno tumoral y superponerse sobre la reconstruccion original. Ademas, tambien podnan incorporarse agentes terapeuticos en el sistema de diagnostico dirigido. Podnan aplicarse estrategias similares en la enteritis regional y en la colitis ulcerosa (y de nuevo combinarse con la terapia).
Ejemplos
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la preparacion y evaluacion de una composicion que tiene una cadena principal cargada positivamente, una cadena principal cargada negativamente con restos de formacion de imagenes unidos, y un ADNc que codifica un transgen. La evaluacion es in vitro.
Se preparan los siguientes componentes:
1. una cadena principal cargada positivamente compuesta de polilisina con Gly3Arg7 unida a traves del extremo amino de la cadena lateral de Lys con el extremo carboxi de Gly3Arg7 a un grado de saturacion del 20 %. Se prepara una solucion del resto de la cadena principal a una concentracion de 1,5 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
2. se prepara un ADNc que expresa protema fluorescente verde bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) y se usa a una concentracion de 0,5 mg/ml en PBS.
3. se usa un complejo de dextrano-DOTA-gadolinio (vease, Casali, et al., Acad. Radiol. 5: S214-S218 (1998)) a una dilucion 1:2 en PBS.
La siguiente mezcla (a) se prepara por triplicado: se mezclan 100 |il de “2” anterior con 60 |il de “3” anterior y la mezcla se diluye con 140 |il de PBS, y despues se somete a agitacion vorticial durante 45 segundos.
Se preparan tres tubos diferentes con lo siguiente:
(b) 400 |il de “1” anterior, (c) 200 |il de “1” anterior, diluido con 200 |il de PBS y (d) 100 |il de “1” anterior diluido con 300 |il de PBS.
Los tres tubos se someten a agitacion vorticial durante 45 segundos. Un tubo de “a” se combina con cada uno de los tubos “b”, “c” y “d” y se somete a agitacion vorticial durante 90 segundos. Una parte de 200 |il de cada una de estas mezclas combinadas se pone en un pocillo distinto (por triplicado) en una placa de cultivo celular de seis pocillos que contiene celulas HA-VSMc (ATCC, Rockville, MD). Cada pocillo se prelava una vez con medio M-199 sin colorante y sin suero antes de la transfeccion. Las mezclas de celula/agente de transfeccion se incuban a 37 °C en una camara humidificada con un 10 % de CO2 durante 4,5 horas, se lavan con medio M-199 y despues se incuban con FBS al 10%. Inmediatamente se obtienen imagenes en espectroscopia MR para la distribucion inicial. Despues de 24 horas, se repite la espectroscopia, despues se retiran las celulas de la placa y se emplean para el analisis FACS con protema azul fluorescente para determinar la eficacia de la transfeccion.
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra la preparacion de una composicion de la invencion que es un complejo espedfico de tumor para realizar imagenes que lleva un gen citotoxico.
Se preparan los siguientes componentes:
1. una cadena principal cargada positivamente compuesta de polilisina con Gly3Arg7 (SEQ ID NO: 1) unida a traves del extremo amino de la cadena lateral de Lys con el extremo carboxi de Gly3Arg7 (SEQ ID NO: 1) a un grado de saturacion del 20 %. Se prepara una solucion del resto de la cadena principal a una concentracion de 1,5 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
2. se usa ADNc que expresa la timidina quinasa del virus del herpes simple bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) a una concentracion de 0,5 mg/ml en PBS.
3. se usa complejo de dextrano-DOTA-gadolinio a una dilucion 1:2 en PBS.
4. se conjuga el fragmento Fab espedfico para el antfgeno tumoral deseado a un porcentaje de saturacion del 5 % con dextrano de un intervalo de tamanos y se selecciona la concentracion en PBS para producir una relacion de carga negativa 1:2 con respecto al componente “2” anterior.
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Se prepara la siguiente mezcla (a) por triplicado: 100 |il de “2” anterior mezclados con 60 |il de “3” anterior y 100 |il de “4” anterior y se diluye con 40 |il de PBS y se somete a agitacion con vortice durante 45 segundos. Se preparan tres tubos diferentes: (b) 400 |il de “1” anterior, (c) 200 |il de “1” anterior diluido con 200 |il de PBS y (d) 100 |il de “1” anterior diluido con 300 |il de PBS. Se agitan con vortice los tres tubos durante 45 segundos. Se combina un tubo de “a” con “b” y se agita con vortice durante 90 segundos para formar la mezcla B. Se combina un tubo de “a” con “c” y se agita con vortice durante 90 segundos para formar la mezcla C. Se combina un tubo de “a” con “d” y se agita con vortice durante 90 segundos para formar la mezcla D. Se usan 200 |il de cada mezcla junto con 200 |il de pluronic F- 127 (BASF) al 30% frio. Se inyecta la solucion combinada en un espacio potencial creado mediante biopsia de escision del supuesto tumor in vivo. Se obtienen imagenes en MR despues de la implantacion, despues de 1 dfa y despues de 3 dfas. Inmediatamente despues de la implantacion, se inicia la administracion sistemica de gancyclovir de acuerdo con las directrices de la fDa. Este sistema compuesto proporciona imagenes de diagnostico de las celulas tumorales deseadas, asf como una terapia citotoxica para estas mismas celulas. La distribucion del gel (pluronic) se representa en imagenes a tiempo cero. Despues de 24 horas, el gel se degrada y la senal de contraste se concentra en sitios de microinvasion tumoral residual, asf como en sitios seminales a lo largo de las rutas de drenaje.
De esta manera se proporcionan imagenes del tumor residual. La actividad de gancyclovir se concentrara en areas de captacion de HSV-Tk, de forma que en este sistema tambien se produce la terapia dirigida. De forma similar, tambien se proporciona la supervision de la respuesta a la terapia mediante la obtencion de imagenes.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el uso de la estrategia de multiples componentes para la transfeccion en un cultivo celular.
En este ejemplo, se uso una placa de 6 pocillos para evaluar una repeticion de la estrategia basada en componentes. La cadena principal cargada positivamente se ensamblo conjugando -GlyaArgz (SEQ ID NO: 1) con polilisina 150.000 a traves del carboxilo de la glicina terminal con la amina libre de la cadena lateral de lisina a un grado de saturacion del 18 % (es decir, 18 de cada 100 restos de lisina se conjugan con una -GlyaArgz (SEQ ID NO:
1). La cadena principal resultante se denomino NUNU-01.
Se prepararon las siguientes mezclas:
1) polilisina (150.000) a una relacion de carga de 4:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
2) NUNU-01 a una relacion de 15:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
3) NUNU-01 a una relacion de 10:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
4) NUNU-01 a una relacion de 4:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
5) NUNU-01 a una relacion de carga de 1,25:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
6) Superfect (Qiagen) de acuerdo con la recomendacion del fabricante a una relacion de carga de 5:1 con una solucion de 0,5 mg/ml de un plasmido que expresa protema azul fluorescente dirigida por un promotor de CMV.
Se anadieron aproximadamente 1,0 ml de cada solucion a celulas de musculo liso aortico humano primario HA- VSMC confluentes al 70 % (pase 21; ATCC, Rocville, MD) en una placa de seis pocillos y se cultivaron en M-199 con suero al 10 % durante 48 horas. Se obtuvieron fotograffas de pocos aumentos (10X en total) a 60 grados, 180 grados y 200 grados desde la parte superior de cada pocillo usando un microscopio de epi-fluorescencia Nikon E- 600 con un filtro de protema azul fluorescente y lentes Plan-Apochromat. Se empleo el equipo de analisis de imagenes Image Pro Plus 3.0 para determinar el porcentaje de area celular total que era positiva, y se presento como la eficacia de la liberacion de genes. Los pocillos posteriormente se evaluaron en un ensayo de exclusion de colorante (las celulas viables excluyen el colorante, mientras que las no viables no lo hacen), seguido de solubilizacion en SDS al 0,4 % en solucion salina tamponada con fosfato. Las muestras se evaluaron en un espectrofotometro UV/VIS Spectronic Genesys 5 a una longitud de onda de 595 nm (azul) para cuantificar las celulas no viables como una medida directa de la toxicidad del agente de transfeccion.
Los resultados para las eficacias se muestran a continuacion (media +/- Desviacion Tfpica):
1) 0,163 +/-0,106 %
2) 10,642 +/-2,195 %
3) 8,797 +/- 3,839 %
4) 15,035 +/- 1,098 %
5) 17,574 +/-6,807 %
6) 1,199 +/-0,573 %
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Los ensayos n.° 4 y n.° 5 muestran una mejora estad^sticamente significativa (P<0,05 mediante ANOVA de un factor con medidas repetidas con ensayo PLSD de Fisher y posthoc de TUKEY-A) de la eficacia de liberacion de genes con respecto tanto a la polilisina solo como a Superfect. Los datos de toxicidad media son los siguientes:
Solucion salina - 0,057 A; 1) 3,460 A; 2) 0,251 A; 3) 0,291 A; 4) 0,243 A 5) 0,297 A; y 6) 0,337 A
Como resultado, puede realizarse una liberacion de genes menos toxica y mas eficaz con una relacion de 1,25 a 4,0 entre NUNU-01 y ADN.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra la liberacion transdermica de agentes terapeuticos usando composiciones de la presente invencion.
Biotinilacion de K y KNR:
Se biotinilaron cadenas principales de polilisina (K) y polilisina que tema grupos de eficacia unidos (KNR) con esteres de sulfo-NHS de biotina.
Materiales: se usaron protema K y KNR, que teman un PM aproximado = 112.000, con Sulfo-NHS-LC Biotina, PM = 556 (Pierce Scientific, Rockford, IL).
Metodos: se usaron el mismo metodo y los mismos calculos para K y KNR, ya que las dos tienen pesos moleculares similares. El metodo para KNR se detalla a continuacion.
1. Se preparo solucion madre de KNR a una concentracion de 1 mg/ml (8,9 x 10'6 mmol/ml) en solucion salina tamponada con fosfato.
2. Se preparo solucion madre de Sulfo-NHS-LC-Biotina a una concentracion de 10 mg/ml en agua desionizada inmediatamente antes del uso. Se calculo la cantidad de reactivo de biotina a anadir para generar un exceso molar de 40 veces de reactivo de biotina para una solucion de protema de 1 mg/ml.
Calculo:
• Mol de protema * exceso molar de 40 veces = mmol de Sulfo-NHS-LC-Biotina 8,9 x 10'6 mmol de Dextrano * 40 veces = 3,57 x 10'3 4mmol de reactivo Sulfo-NHS-LC-Biotina a anadir
=> 3,57 x 10-4 mmol de Sulfo-NHS-LC-Biotina * 556 PM de Sulfo-NHS-LC Biotina = 1,98 mg de reactivo Sulfo- NHS-LC-Biotina a anadir. Por lo tanto, se anadieron 200 ml de solucion madre de Sulfo-NHS-LC Biotina (total de 2,0 mg) a 1,0 ml de solucion madre de KNR.
3. Se incubo el tubo de ensayo que contema protema y reactivo de biotina a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Se anadio la mezcla de reaccion a un microdializador (lfmite de peso molecular de 30 KD, Pierce, Scientific, Rockford, IL) y se centrifugo a 4.000 x g para retirar la biotina que no habfa reaccionado. Se lavo y se volvio a dializar con 2,0 volumenes de PBS. Se etiqueto el producto como “KNR-B”.
Biotinilacion de insulina:
Tambien se biotinilo insulina con esteres sulfo-NHS de biotina.
Materiales: insulina, PM = 5733,5 (Sigma Chemical, St Louis, MO) y Sulfo-NHS-LC Biotina, PM = 556 (Pierce Scientific, Rockford, IL).
Metodos:
1. Se preparo solucion madre de insulina a una concentracion de 10 mg/ml (1,74 x 10-3 mmol/ml de insulina) en solucion salina tamponada con fosfato.
2. Se preparo solucion madre de Sulfo-NHS-LC-Biotina a una concentracion de 10 mg/ml en agua desionizada inmediatamente antes del uso. Se calculo la cantidad de reactivo de biotina a anadir para generar un exceso molar de 12 veces de reactivo de biotina a una solucion de protema de 1 mg/ml.
Calculo:
• Se calcularon los mmoles de reactivo de biotina a anadir:
mol de protema * exceso molar de 12 veces = mmol de reactivo 1,74 x 10-3 mmol de insulina * 12 veces = 2,09 x 10-2 mmol de reactivo de Sulfo-NHS-LC-Biotina a anadir
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=> 2,09 x 10-2 mmol * 556 PM de Sulfo-NHS-LC Biotina = 11,64 mg de reactivo de Sulfo-NHS-LC-Biotina a anadir.
Por lo tanto, se anadieron 1,164 ml de solucion madre de Sulfo-NHS-LC-Biotina (total de 11,64 mg) a 1,0 ml de solucion madre de insulina.
3. Se incubo el tubo de ensayo que contema insulina y reactivo de biotina a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se etiqueto el producto como “insulina B”.
Recoleccion de piel:
Se recogio la piel del lomo de un raton C57BL hembra de 8 semanas de edad para tratamiento transdermico para observar si la cadena principal biotinilada y/o la insulina atravesaban la piel.
Metodo:
1. Despues de sacrificar un raton C57BL6 en una camara con CO2, se recogieron aproximadamente 6 cm2 3 4 * * * * de piel dorsal del raton usando unas tijeras quirurgicas.
2. La piel se dividio en seis piezas uniformes y se puso cada una en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
3. Se anadio medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) a cada pocillo de la placa.
4. Se preparo una placa de 24 pocillos para sujetar la piel recogida. Se pusieron piezas pequenas de esponja en cada pocillo.
5. Se cortaron las muestras de piel recogidas en cinco secciones mas pequenas y se puso cada seccion sobre la esponja.
6. Se sujetaron los bordes de la piel recogida con cuatro agujas.
7. Se anadio DMEM a cada pocillo, pero con cuidado de no sumergir la piel recogida en el medio.
8. Se incubo la placa en hielo hasta que los tratamientos estuvieran listos para aplicarse.
Preparacion de tratamientos transdermicos:
1. Se prepararon los seis siguientes tratamientos en 2 ml de locion de Cetaphil (Galderma):
TUBOS
AGENTE CADENA PRINCIPAL BIOTINILADA (+/-) AGENTE DE PROTEINA (INSULINA) PROTEINA BIOTINILADA (+/-)
A.
KNR + 1:1 -
B.
KNR + 1:3 -
C.
K + 1:1 -
D.
K + 1:3 -
E.
K - 1:3 +
F.
KNR - 1:3 +
2. Para los tubos A a D, se anadieron 200 |jg de KNR o K en 2 ml de locion Cetaphil a cada tubo y se mezclo uniformemente. Se anadio 1 ml de poli-L-lisina (K) sin biotina a cada tubo y se mezclo uniformemente.
3. Para el tubo E, se anadieron 200 jg de KNR en 2 ml de locion Cetaphil y se mezclo uniformemente.
4. Se realizo una dilucion de 200 veces de insulina biotinilada anadiendo 5,11 jl en aproximadamente 995 jl de
PBS.
Protema calculada disuelta en PBS:
KNR = 8,9 x 10'9 mol/ml K = 8,9 x 10'9 mol/ml Insulina = 1,74 x 10-9 mol/ml
Protema calculada en los tubos:
KNR = 8,9 x 10'9 mol/ml K = 8,9 x 10'9 mol/ml
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5. Para los tubos E y F, se anadieron 33 |jl de solucion de insulina biotinilada diluida y 70 |jl de PBS y se mezclo uniformemente.
6. Para los tubos A y C, se anadieron 100 jl de insulina regular y se mezclo uniformemente.
7. Para los tubos B y D, se anadieron 33 jl de insulina regular y 70 jl de PBS y se mezclo uniformemente.
Puntos de tiempo de tratamientos:
1. Se retiro la placa de piel recogida de la incubacion con hielo.
2. Se aplico cada tubo a la columna apropiada de muestras de piel sujetas.
3. Se transfirio la piel recogida a un congelador a -35 °C al final de cada punto de tiempo de 15, 30, 60 minutos y
17 horas. Se mantuvo la piel recogida congelada durante una noche.
4. Se cogieron las muestras de piel recogida congeladas y se pusieron en incubacion con hielo.
5. Se cortaron las muestras de piel recogida que se habfan congelado en los puntos de tiempo indicados en tres
secciones mas pequenas.
6. Se transfirio una seccion a un tubo con formaldelddo.
7. Se transfirio una segunda seccion a un tubo vado y se puso en el congelador para el almacenamiento.
8. Se congelo una tercera seccion en compuesto O.C.T. en acetona lfquida y solucion de hielo seco. Se pusieron las muestras congeladas en el congelador para congelar las secciones.
Material: fosfato alcalino conjugado NeutraAvidin™ (Pierce Scientific, Rockford, IL), tampon Tris-HCl, pH = 7,2 (Pierce Scientific, Rockford, IL); solucion de NBT/BCIP (Pierce Scientific, Rockford, IL).
Metodo:
1. Se anadieron 50 jl de NeutraAvidin™ y se enraso el volumen a 50 ml con tampon Tris-HCl.
2. Se anadio 1 ml de NeutraAvidin™ y solucion tampon a cada tubo de muestras de piel recogida.
3. Se procesaron los tubos de muestras de piel recogida durante 1 hora en la mezcla de NeutraAvidin™ y solucion tampon.
4. Se anadio 1 ml de NBT/BCIP a cada nuevo tubo vado y se etiqueto cada tubo.
5. Se retiro la piel de la mezcla de NeutraAvidin™ y solucion tampon. Se aclaro la piel en PBS cuatro veces y se puso en tubos apropiados de NBT/BCIP.
6. Se procesaron los tubos de muestras de piel recogida durante 1 hora en la solucion de NBT/BCIP.
7. Se aclaro la piel de nuevo en 1 ml de PBS frio.
8. Se almacenaron las muestras de piel recogida en los tubos etiquetados.
9. Se dividieron en dos partes las muestras de piel y se fotograffo la cara por la que se habfan dividido. Resultados:
Formulacion
Punto de tiempo Figura Notas
A
15 minutos 3 A1 - alto nivel de liberacion de cadena principal de KNR a traves de todas las capas
A
17 horas 4 A4 - alto nivel de liberacion de cadena principal de KNR a traves de todas las capas
C
15 minutos 5 C1 - liberacion pasiva de cadena principal de K en folfculos y capa externa de la epidermis
C
17 horas 6 C4 - nivel muy bajo de liberacion de cadena principal de K
E
15 minutos 7 E1- nivel muy bajo de liberacion de factor terapeutico por K
E
17 horas 8 E4 - nivel muy bajo de liberacion de factor terapeutico por K
F
15 minutos 9 F1 - alto nivel de liberacion de factor terapeutico a traves de todas las capas por KNR
F
17 horas 10 F4 - alto nivel de liberacion de factor terapeutico a traves de todas las capas por KNR
Las Figuras 3-10 representan fotomicrograffas representativas de resultados obtenidos 15 minutos (Figuras 3, 5, 7, 9) y 17 horas (Figuras 4, 6, 8, 10) despues de la liberacion de la formulacion A (Figuras 3 y 4), formulacion C (Figuras 5 y 6), formulacion E (Figuras 7 y 8) y formulacion F (Figuras 9 y 10). Los grupos de control que recibieron complejos con K como cadena principal cargada positivamente muestran una transferencia pasiva de bajo nivel de la cadena principal principalmente a los folfculos (Figuras 5 y 6), pero practicamente no muestran ninguna liberacion de agente terapeutico (Figuras 7 y 8). Por el contrario, los grupos tratados con complejos que conteman KNR presentaban una liberacion de alto nivel tanto de la cadena principal (Figuras 3 y 4) como del agente terapeutico (Figuras 9 y 10) a todos los niveles de la epidermis y la dermis. De esta manera, la formulacion proporcionada en este ejemplo permite una liberacion transdermica eficaz de un agente terapeutico.
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Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra la liberacion dirigida de una composicion usando fragmentos F(ab)2 unidos.
General:
Se escindio un anticuerpo IgG para generar un fragmento F(ab)2, y despues se purifico para retirar la parte Fc y la IgG intacta. El fragmento F(ab)2 despues se condenso con un dextrano activado con aldetudo (oxidado). El exceso de aldetudo se inactivo con tris y los hidroxilos libres se fosforilaron para generar un dextrano-fosfato con una alta carga negativa con fragmentos F(ab)2 unidos covalentemente (denominado colectivamente “componente de direccion"). Despues se formo un complejo de autoensamblaje entre este componente de direccion, insulina y la cadena principal cargada positivamente que tema un componente de eficacia (“KNR”). Despues se evaluo la capacidad del complejo autoensamblado de aumentar la liberacion del complejo en celulas que llevaban el antfgeno diana.
Escision de F(ab)?:
Se generaron fragmentos F(ab)2 que reconodan celulas de musculo liso mediante un producto de digestion por pepsina inmovilizada (Pierce Chemical, Rockford, IL) de IgG para la a-actina de musculo liso (clon 1A9, DAKo, Carpinteria, CA).
Metodo:
1. Se dializo el clon 1A9 a 1 mg/ml frente a un tampon acetato sodico 20 mM a pH 4,5.
2. La pepsina inmovilizada se suministro como una suspension acuosa al 50 % (v/v) que contema glicerol al 50 % en acetato sodico 0,1 M, pH 4,5, mas azida sodica al 0,05 %. Se mezclo la suspension de gel de Pepsina- glicerol-agua por inversion.
3. Se anadieron 0,25 ml de suspension al 50 % de Pepsina inmovilizada a un tubo de ensayo de vidrio (0,125 ml de gel de Pepsina inmovilizada).
4. Se anadieron 4,0 ml de acetato sodico 20 mM (pH 4,0) en agua desionizada (“tampon de digestion”). Se mezclo bien por inversion. Se separo el gel del tampon usando un separador de suero o centrifugacion a aproximadamente 1000 x g durante cinco minutos. Se desecho el tampon y se repitio este procedimiento de lavado con otros 4,0 ml de tampon.
5. Se resuspendio la Pepsina inmovilizada en 0,5 ml de tampon de digestion.
6. Generacion de Fragmentos: se anadio 1,0 ml de IgG de 1A9 dializada al tubo que contema Pepsina Inmovilizada. Se incubo el tubo en un bano de agua con agitacion a 37 °C a alta velocidad durante cuatro horas. Se mantuvo la mezcla constante de gel durante la incubacion.
7. Se anadieron 1,5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 al tubo de ensayo. Se separaron los fragmentos Fc y F(ab')2 solubilizados y la IgG no digerida del gel de Pepsina Inmovilizada usando un tubo separador de suero. Se centrifugo a 1000 x g durante cinco minutos y se retiro el sobrenadante que contema los fragmentos.
Purificacion de F(ab)?:
La separacion de fragmentos F(ab)2 de la IgG no digerida y de los fragmentos Fc se realizo usando una columna de Protema A Inmovilizada.
Materiales: muestra de protema constituida por Pepsina + Tris-HCl; Tampon A (NaH2PO4 0,2 M (2,4 g usados), NaCl
0. 15.M (8,8 g usados) y volumen ajustado con la cantidad suficiente de H2O desionizada hasta 1 litro y pH ensayado de 8,0); Tampon B (Na2HPO4 0,2 M (0,676 g), acido cttrico 0,1 M (22,5 ml), H2O desionizada (46,3 ml), pH ajustado a 4,5).
Metodo: (Nota: Uso de tampon A).
1. Se relleno una micropipeta con algodon de la manera mas uniforme posible.
2. Se realizo una suspension 1:1 de resina en tampon A. (Se anadieron 1000 pl de tampon A en resina). Se vertio 1 ml de suspension en la columna, se dejo que la columna fluyera hasta que se asento. Una vez asentada, la columna se lavo con 10 ml de Tampon A).
3. Se anadio lentamente muestra de protema a la columna.
4. Se eluyo el fragmento F(ab)2 con 12 ml de tampon A. De esta manera, el volumen total de eluato de F(ab)2 (incluyendo la carga de la columna) fue de 14,4 ml.
5. Se retiraron la IgG sin reaccionar y los fragmentos Fc de la columna con 1,5 ml de tampon B.
6. Se midio y se registro la absorbancia usando un espectrofotometro (Spectronic Genesys 5) para confirmar la protema en los eluatos. A continuacion, se proporcionan los valores espectronicos registrados:
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FRACCIONES DE COLUMNA
VALORES
H2O
- 0,032
H2O y A
+ 0,009
H2O y B
+ 0,012
Concentracion de F(ab)?:
El eluato de F(ab)2 se purifico y concentro usando Precipitacion de Protema con Acido Tricloroacetico (TCA).
Metodo:
1. Se anadio un volumen igual de TCA al 20% (p/v, en agua desionizada, Sigma Chemical, St Louis, MO) al eluato de la columna de F(ab)2.
2. Se incubo la muestra durante 30 minutos en hielo.
3. Se centrifugo la muestra en una microcentnfuga a 4000 x g durante 15 minutos a 4 °C.
4. Se retiro cuidadosamente todo el sobrenadante.
5. Se anadieron 300 pl de acetona fna a cada tubo y se centrifugo de nuevo a 4000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
6. Se retiro el sobrenadante y se dejo secar el F(ab)2.
7. Se suspendio el sedimento de protema F(ab)2 en 1,0 ml de solucion salina tamponada con fosfato.
Acoplamiento de F(ab)? a dextrano activado con aldehido:
Materiales: kit de acoplamiento de dextrano activado con aldehfdo (Pierce, Rockford, IL).
[Nota: el dextrano activado con aldehfdo tambien puede generarse por tratamiento de dextrano con peryodato.]
Metodos:
1. Se puso el kit de acoplamiento de dextrano activado con aldehfdo a temperatura ambiente.
2. Se prepararon 0,5 ml de una solucion madre de 64 mg/ml de cianoborohidruro sodico en solucion salina tamponada con fosfato (32 mg en 0,5 ml).
3. Se preparo 1,0 ml de una solucion madre de dextrano activado con aldehfdo de 5 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato.
4. Se anadio 1,0 ml de F(ab)2 concentrado purificado de lo anterior a 1,0 ml de solucion madre de dextrano activado con aldehfdo.
5. Se anadieron 0,2 ml de solucion madre de cianoborohidruro sodico a la mezcla de aldelddo-F(ab)2. Se mezclo por agitacion vorticial y se incubo durante una noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
6. Despues de la incubacion durante una noche, se bloquearon todos los grupos aldehfdo restantes anadiendo
0. 5.ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 7,2 a la mezcla de reaccion. Se incubo la solucion a temperatura ambiente durante 1 hora.
7. El producto se etiqueto como “F(ab)2(aact)-d-t” con un volumen total de 2,7 ml.
8. Se realizo un procedimiento identico usando 1,0 ml de agua desionizada en lugar de mezcla de F(ab)2. El producto se etiqueto como “d-t” y representa un control que no se dirige a un antfgeno espedfico.
Fosforilacion de F(ab)?(aact)-d-t:
1. Se preparo solucion madre de acido polifosforico a 50 mg/ml (Acros Organics, Pittsburgh, PA) en agua desionizada.
2. Se anadieron 100 pl de solucion madre de acido polifosforico a 1,0 ml de F(ab)2(aact)-d-t, y se incubo durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3. Se anadio mezcla de reaccion a un microdializador (lfmite de peso molecular de 30 KD, Pierce, Scientific, Rockford, IL) y se centrifugo a 4.000 x g para retirar el acido polifosforico que no habfa reaccionado. Se lavo y se volvio a dializar con 2,0 volumenes de PBS pH 7,4. El producto se etiqueto como “F(ab)2(aact)-d-t-p” y representa un polfmero cargado negativamente con un fragmento F(ab)2 unido para proporcionar la direccion.
4. Se realizo un procedimiento identico usando 1,0 ml de d-t en lugar de F(ab)2(aact)-d-t. El producto se etiqueto como “d-t-p” y representa un polfmero cargado negativamente de control que no se dirige a un antfgeno espedfico.
Direccion de la liberacion del complejo terapeutico a celulas que llevan un antigeno particular (a-actina de celulas de musculo liso):
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1. Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda macho (3,0-3,5 kg) de acuerdo con las directrices de los NIH e institucionales (n = 3 animales). Con anestesia general (induccion con ketamina/xilazina y mantenimiento con halotano), se aislo la arteria femoral comun derecha y se expuso la adventicia circunferencialmente. Se introdujo un balon de angioplastia SAVVY de 2 mm x 2 cm (Cordis, Miami, FL) mediante arteriotoiTHa en la arteria femoral superficial y se hizo avanzar hasta la arteria femoral comun. El balon se inflo a 6 atmosferas en dos ciclos de 1 minuto y despues se extrajo.
2. 28 dfas despues de la dilatacion mecanica, las arterias se fijaron por perfusion y se recogieron. Las arterias recogidas (de aproximadamente 1,5 cm de longitud) se fijaron posteriormente en formalina tamponada neutra al 10 % durante 12-16 horas y se dividieron en tres segmentos iguales antes de incluirse en parafina. Se obtuvieron secciones transversales en serie (5 mm) desde la cara proximal (craneal) de cada segmento.
3. Se desparafinaron y se rehidrataron las secciones (n = 9 por grupo). Los sitios de union no espedficos se bloquearon con BLOTTO (Pierce Scientific, Rockford, IL) y se aclararon con solucion salina tamponada con fosfato.
4. Los tratamientos etiquetados como “1p” y “2p” corresponden a las siguientes composiciones de tratamiento: [NOTA: “KNR-B” preparado como se ha indicado anteriormente]
Agente de eficacia (E) Agente de direccion (T) Protema (P) Relacion E:T:P
1p
KNR - B F(ab)2(aact)-d-t-p Insulina 2:1:1
2p
KNR - B d-t-p Insulina 2:1:1
Se mezclaron 180 pl de solucion salina tamponada con fosfato, 5 pl de agente terapeutico de protema y 5 pl de agente de direccion (ambos con carga neta negativa en la superficie) en un tubo de microcentnfuga y la mezcla se sometio a agitacion vorticial durante 15 segundos. Se anadieron 10 pl de agente de direccion (cargado positivamente) y el conjunto se sometio a agitacion vorticial inmediatamente durante 60 segundos. Usando metodos de atraccion capilar, se incubaron 9 secciones, cada una con 1p o 2p, a temperatura ambiente durante una noche.
5. Los portaobjetos se aclararon y se incubaron durante una noche en una dilucion 1:100 de Neutravidina-fosfatasa alcalina (Pierce Scientific, Rockford, IL).
6. Los portaobjetos se aclararon y se incubaron en NBT/BCIP (Pierce Scientific, Rockford, IL; sustrato para fosfatasa alcalina) durante 15 minutos. Se aclaro con solucion salina y se fotografio.
Como se muestra en la Figura 11, las secciones de los tratamientos con 1P revelan un aumento en la tincion positiva (azul-morado) en el medio de las secciones transversales (principalmente compuestas de celulas de musculo liso que llevan altos niveles de a-actina) con respecto a las secciones con 2P que muestran una tincion mas intensa en la adventicia, y no revelan un aumento espedfico de la direccion para las celulas del musculo liso, como se representa en la Figura 12. De esta manera, los complejos que llevan F(ab)2(aact)-dtp presentan aumentos relativos en la liberacion espedfica en las celulas del musculo liso y, por lo tanto, la liberacion de los agentes terapeuticos puede tener las mejoras en eficacia deseadas para celulas que llevan antfgenos particulares.

Claims (27)

  1. 5
    10
    15
    20
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un complejo de asociacion no covalente de:
    (a) una cadena principal polimerica cargada positivamente que tiene unida covalentemente a la misma una pluralidad de secuencias de aminoacidos cargadas positivamente seleccionadas de -(gly)ni -(arg)n2, en la que n1 es un numero entero de 0 a 20 y n2 es un numero entero impar de 5 a 25; (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q; (gly)p- YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que los submdices p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20; o un dominio peptfdico TAT de VIH cargado positivamente; y
    (b) al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en:
    i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
    ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos; y
    iii) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biologicos unidos; en la que cada uno de dichos agentes biologicos es un agente terapeutico o cosmeceutico seleccionado del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF-p1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF;
    donde dicho complejo de asociacion no covalente lleva una carga neta positiva y al menos uno de dichos dos miembros de (b) se selecciona entre el grupo i) o el grupo iii).
  2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende al menos tres miembros seleccionados de los grupos i) a iii).
  3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que al menos un miembro de (b) es del grupo ii).
  4. 4. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende al menos un miembro de cada uno de los grupos (i) y (ii).
  5. 5. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende al menos un miembro de cada uno de los grupos (ii) o (iii).
  6. 6. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha cadena principal cargada positivamente tiene una longitud de aproximadamente 1 a 4 veces las longitudes combinadas de dichos miembros de (b).
  7. 7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha cadena principal polimerica cargada positivamente es polilisina.
  8. 8. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dicha secuencia de aminoacidos cargada positivamente es (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, en la que los submdices p y q son cada uno, independientemente, numeros enteros de 0 a 20 y donde dicha secuencia de aminoacidos cargada positivamente esta unida a dicha cadena principal polimerica cargada positivamente a traves del extremo C o el extremo N de la secuencia de aminoacidos.
  9. 9. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que los submdices p y q son cada uno, independientemente, numeros enteros de 0 a 8.
  10. 10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que los submdices p y q son cada uno, independientemente, numeros enteros de 2 a 5.
  11. 11. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dicha secuencia de aminoacidos cargada positivamente es -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (SEQ ID NO: 1), que esta unida covalentemente a la cadena principal polimerica de polilisina.
  12. 12. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la cadena principal polimerica cargada positivamente es polilisina que tiene unida covalentemente a la misma una pluralidad de grupos de eficacia cargados positivamente que tienen la secuencia de aminoacidos -(gly)n1-(arg)n2, en la que n1 es un numero entero de 2 a 5 y n2 es un numero entero impar de 7 a 17.
  13. 13. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que dicha cadena principal de polilisina cargada positivamente que tiene al menos un grupo de eficacia unido tiene un peso molecular de 150.000 a 300.000 y tiene una pluralidad de grupos de eficacia Gly3Arg7 (SEQ ID NO: 1) unidos, en la que el grado de saturacion de lisina es de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 %.
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  14. 14. Una composicion para uso en un metodo de liberacion de un agente biologico en una superficie celular en un sujeto, donde la composicion comprende un complejo de asociacion no covalente de:
    (a) una cadena principal polimerica cargada positivamente que tiene unidos covalentemente a la misma uno o mas grupos de eficacia seleccionados de entre secuencias de aminoacidos -(gly)ni -(arg)n2, en la que n1 es un numero entero de 0 a 20 y n2 es un numero entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25; (gly)p- RGRDDRRQRRR-(gly)q; (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20; o un dominio peptfdico TAT de VIH cargado positivamente; y
    (b) al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en:
    i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
    ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos; y
    iii) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes biologicos terapeuticos o cosmeceuticos unidos seleccionados del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF- p1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF;
    en la que dicho complejo de asociacion no covalente lleva una carga neta positiva y al menos uno de los dos miembros del grupo (b) es el grupo (iii).
  15. 15. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicho metodo de liberacion es la administracion intravenosa.
  16. 16. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicho metodo de liberacion es la administracion transdermica o topica.
  17. 17. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicho metodo de liberacion es una administracion que usa un balon de angioplastia.
  18. 18. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicho metodo de liberacion es una administracion que usa un cateter.
  19. 19. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicho metodo de liberacion es la administracion intraperitoneal.
  20. 20. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicha composicion esta en una formulacion de gel.
  21. 21. Un metodo para preparar una composicion farmaceutica, comprendiendo dicho metodo combinar un componente de cadena principal polimerica cargada positivamente que tiene unida covalentemente a la misma una pluralidad de secuencias de aminoacidos cargadas positivamente seleccionadas de entre -(gly)n1 -(arg)n2, en la que n1 es un numero entero de 0 a 20 y n2 es un numero entero impar de 5 a 25; (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q; o (gly)p- YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que los subrndices p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20; o un dominio peptfdico TAT de VIH cargado positivamente; y al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en:
    i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
    ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos; y
    iii) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes terapeuticos o agentes cosmeceuticos unidos seleccionados del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF-p1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF;
    con un vehmulo farmaceuticamente aceptable para formar un complejo de asociacion no covalente que tiene una carga neta positiva, con la condicion de que al menos uno de dichos dos miembros de los grupos (i) a (iii) se seleccione del grupo i) o grupo iii).
  22. 22. Un kit para formular una composicion de liberacion farmaceutica, comprendiendo dicho kit un componente de cadena principal polimerica cargada positivamente que tiene unida covalentemente al mismo una pluralidad de secuencias de aminoacidos cargadas positivamente seleccionadas de entre -(gly)n1 -(arg)n2, en la que n1 es un numero entero de 0 a 20 y n2 es un numero entero impar de 5 a 25; (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)p; o (gly)p- YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que los subrndices p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20; o un dominio peptfdico TAT de VIH cargado positivamente; y al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en:
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    25
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    40
    i) una primera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de restos de formacion de imagenes unidos;
    ii) una segunda cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de direccion unidos; y
    iii) una tercera cadena principal cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes terapeuticos o agentes cosmeceuticos unidos seleccionados del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF-p1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF;
    e instrucciones para preparar dicha composicion de liberacion farmaceutica.
  23. 23. Una cadena principal cargada positivamente que comprende:
    (a) una cadena polipeptfdica lineal cargada positivamente que comprende un polfmero de aminoacidos; y
    (b) grupos de ramificacion cargados positivamente unidos covalentemente a dicha cadena polipeptfdica lineal cargada positivamente, donde dichos grupos de ramificacion comprenden
    i) -(gly)ni-(arg)n2, donde n1 es un numero entero de 0 a 20 y n2 es un numero entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25; o
    ii) un dominio peptfdico TAT de VIH cargado positivamente o
    al menos un fragmento de TAT de VIH que tiene la secuencia de aminoacidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q o (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, en la que p y q son, independientemente, un numero entero de 0 a 20, y la secuencia de aminoacidos del fragmento de TAT de VIH esta unida a la cadena polipeptfdica lineal cargada positivamente a traves del extremo C o el extremo N de la secuencia de aminoacidos.
  24. 24. La cadena principal cargada positivamente de acuerdo con la reivindicacion 23, en la que dicha cadena polipeptfdica lineal cargada positivamente comprende polilisina que tiene un peso molecular de 70.000 a 300.000.
  25. 25. Una cadena principal cargada positivamente como se define en la reivindicacion 23 o 24, que es capaz de asociarse con una cadena principal cargada negativamente que tiene unidos a la misma uno o mas agentes biologicos; donde cada uno de dichos agentes biologicos es un agente terapeutico o cosmeceutico seleccionado del grupo que consiste en toxina botulmica, EGF, TGF-p1, insulina, VEGF, un bloqueante de VEGF y anticuerpos contra VEGF, para usarse en un metodo de liberacion del agente biologico a un tejido o una celula.
  26. 26. La cadena principal cargada positivamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en la que dichos grupos de ramificacion unidos a dicha cadena polipeptfdica cargada positivamente comprenden el fragmento de tAt de VIH que tiene la secuencia de aminoacidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, en la que p y q son independientemente un numero entero de 0 a 20.
  27. 27. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14, o 15 a 20, en la que la cadena principal polimerica cargada positivamente tiene unidos covalentemente a la misma uno o mas grupos de eficacia de secuencia de aminoacidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q; en la que p y q son cada uno, independientemente, un numero entero de 0 a 20.
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