ES2618316T3

ES2618316T3 - Anticuerpo anti EPHA2

Info

Publication number: ES2618316T3
Application number: ES08828482.3T
Authority: ES
Inventors: tiene designado inventor No
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: KR101561416B1; EP2199390A4; BRPI0816094A2; NZ583966A; KR101561403B1; LT2199390T; US20160031987A1; PT2199390T; KR20150041811A; IL204211A; CN101848998A; CO6180469A2; DK2199390T3; JP5688433B2; EP2199390A1; TW200916480A; CA2698146A1; JP5312333B2; KR101521668B1; AU2008292352A1

Abstract

Un anticuerpo que se une de forma específica a un polipéptido EPHA2 que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 426 a 534 de SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias, en el que el anticuerpo no tiene la capacidad de fosforilar restos tirosina de EPHA2; y en el que las regiones determinantes de complementariedad se seleccionan de los siguientes (i) a (iii): (i) las regiones determinantes de complementariedad en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo tienen las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ. ID NO. 59, 61 y 63 o las SEQ. ID NO. 71, 73 y 75, y las regiones determinantes de complementariedad en la región variable de la cadena ligera del anticuerpo tienen las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ. ID NO. 65, 67 y 69 o las SEQ. ID NO. 77, 79 y 81; (ii) el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 109 como CDRH1, 111 como CDRH2 y 113 como CDRH3, y tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ. ID NO. 93 como CDRL1, 95 como CDRL2 y 97 como CDRL3; o (iii) el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 141 como CDRH1, 143 como CDRH2 y 145 como CDRH3, y tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ. ID NO. 125 como CDRL1, 127 como CDRL2 y 129 como CDRL3.

Description

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que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 115 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 91 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias;

(27): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) o 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 107 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 91 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 115 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias;

(28): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) y 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 139 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 147 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 123 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 131 en el listado de secuencias;

(29): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) o 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 139 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 123 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 468 de SEQ ID NO: 147 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 239 de SEQ ID NO: 131 en el listado de secuencias;

(30): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) y 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 107 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 115 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 91 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias;

(31): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) o 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 107 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 91 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 115 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias;

(32): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) y 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 139 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 147 en el listado de secuencias; y

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2) un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 123 en el listado de secuencias o un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 131 en el listado de secuencias;

(33): El anticuerpo de acuerdo con (1), en el que el anticuerpo consiste en los siguientes 1) o 2):

1) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 139 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 123 en el listado de secuencias; y 2) un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 20 a 138 de SEQ ID NO: 147 en el listado de secuencias y un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 21 a 134 de SEQ ID NO: 131 en el listado de secuencias;

(34): Un anticuerpo Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, un diacuerpo, un anticuerpo lineal o un anticuerpo multiespecífico que se puede obtener de cualquiera de los anticuerpos de acuerdo con cualquiera de (21), (22) o (25) a (29);

(35): El hibridoma de ratón SH348-1 (FERM BP-10836);

(36): El hibridoma de ratón SH357-1 (FERM BP-10837);

(37): Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos de acuerdo con (1) a (34);

(38): Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer caracterizada por comprender al menos un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos de acuerdo con (1) a (34);

(39): Un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con (1) a (34), (37) o (38) para su uso en un procedimiento para la inhibición del crecimiento tumoral en un mamífero;

(40): Uso de un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con (1) a (34), (37) o (38) para la fabricación de un medicamento para la inhibición del crecimiento tumoral en un mamífero;

(41): El anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con (39) o el uso o composición farmacéutica de acuerdo con (40), caracterizado porque el tumor es un tumor que expresa EPHA2;

(42): Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (34);

(43): Una célula hospedadora transformada con un polinucleótido de acuerdo con (42);

(44): Un procedimiento de producción de un anticuerpo utilizando una célula hospedadora de acuerdo con (43).

Ventajas de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha obtenido de forma satisfactoria un anticuerpo monoclonal anti EPHA2 nuevo, el cual no tiene actividad de inducción de la fosforilación de restos tirosina de EPHA2 y tiene actividades ADCC y CDC frente a células cancerosas que expresan EPHA2. Además, se ha encontrado que el anticuerpo tiene actividad antitumoral excelente in vivo.

Además, se ha proporcionado una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo para el tratamiento del cáncer.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra los resultados de transferencia de Western que muestran la presencia o ausencia de la actividad de inducción de la fosforilación de restos tirosina de EPHA2 por un anticuerpo anti EPHA2. La Figura 1A) es un diagrama que muestra los resultados obtenidos en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento, en la que la barra superior muestra los resultados para un anticuerpo 4G10, y la barra inferior muestra los resultados para un anticuerpo anti EPHA2 (D7). La Figura 1B) es un diagrama que muestra los resultados obtenidos en presencia de un anticuerpo de entrecruzamiento, en la que la barra superior muestra los resultados de un anticuerpo 4G10 y la barra inferior muestra los resultados de un anticuerpo anti EPHA2 (D7); La Figura 2 es un diagrama que muestra los resultados de transferencia de Western que muestran la presencia o ausencia de actividad de inducción de una disminución del nivel de proteína de EPHA2 por un anticuerpo anti EPHA2. La Figura 2A) es un diagrama que muestra los resultados obtenidos en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento, en la que la barra superior muestra los resultados para un anticuerpo anti EPHA2 (D7) y la barra inferior muestra los resultados para un anticuerpo anti β-actina. La Figura 2B) es un diagrama que muestra los resultados obtenidos en presencia de un anticuerpo de entrecruzamiento, en la que la barra superior muestra

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los resultados para un anticuerpo anti EPHA2 (D7) y la barra inferior muestra los resultados para un anticuerpo anti β-actina; La Figura 3 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de actividad ADCC de un anticuerpo anti EPHA2 frente a diversas líneas celulares. En el diagrama, “**” representa P<0,01, y “***” representa P<0,001. La Figura 3A) es un diagrama que muestra la actividad ADCC frente a células MDA-MB-231. La Figura 3B) es un diagrama que muestra la actividad ADCC frente a células A549. La Figura 3C) es un diagrama que muestra la actividad ADCC frente a células PC-3; La Figura 4 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de la actividad CDC de un anticuerpo anti EPHA2 frente a diversas células. En el diagrama, “***” representa P<0,001. La Figura 4A) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH348-1 frente a células MDA-MB-231. La Figura 4B) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH348-1 frente a células A549. La Figura 4C) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH348-1 frente a células PC-3. La Figura 4D) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH357-1 frente a células MDA-MB-231. La Figura 4E) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH357-1 frente a células A549. La Figura 4F) es un diagrama que muestra la actividad CDC de SH357-1 frente a células PC-3; La Figura 5A) es un diagrama que muestra la predicción de la estructura del dominio EPHA2 y las posiciones, en EPHA2, de EPHA2-ECD, FNIII-NC, FNIII-N y FNIII-C, los cuales son péptidos para la determinación epitópica. En el diagrama, UN-ligando representa un dominio de unión a ligando, FN3 representa un dominio de fibronectina de tipo 3, TM representa una región transmembrana, Trk quinasa representa un dominio de tirosina quinasa y SAM representa un dominio SAM; La Figura 5B) es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de actividad de unión de un anticuerpo anti EPHA2 para EPHA2-ECD, FNIII-NC, FNIII-N y FNIII-C; La Figura 6A) es un diagrama que muestra la actividad antitumoral de SH348-1 frente a ratones trasplantados con células MDA-MB-231; La Figura 6B) es un diagrama que muestra la actividad antitumoral de SH357-1 frente a ratones trasplantados con células MDA-MB-231. En el diagrama, la barra de error representa el error típico (n = 9); La Figura 7A) es un diagrama que muestra la actividad de unión de SH348-1 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 7B) es un diagrama que muestra la actividad de unión de SH357-1 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 7C) es un diagrama que muestra la actividad de unión de Ab96-1 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 8 es un diagrama que muestra las actividades inhibidoras de unión a ligando de SH348-1, SH357-1 y Ab96-1; La Figura 9 es un diagrama que muestra que SH348-1 y SH357-1 tienen una actividad de inhibición de la fosforilación dependiente de efrina A1 de restos tirosina de EPHA2; La Figura 10 es un diagrama que muestra un esquema de los mutantes de deleción de EPHA2 para la identificación de epítopos; La Figura 11A) es un diagrama que muestra la reactividad de SH348-1 con los mutantes de deleción de EPHA2; La Figura 11B) es un diagrama que muestra la detección de los mutantes de deleción de EPHA2 en una membrana de PVDF en la Figura 11A); La Figura 11C) es un diagrama que muestra la reactividad de SH357-1 con mutantes de deleción de EPHA2; La Figura 11D) es un diagrama que muestra la detección de los mutantes de deleción de EPHA2 en una membrana de PVDF en la Figura 11C); La Figura 12A) es un diagrama que muestra la actividad de unión de hSH348-1-T1 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 12B) es un diagrama que muestra la actividad de unión de hSH348-1-T3 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 12C) es un diagrama que muestra la actividad de unión de hSH357-1-T1 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 12D) es un diagrama que muestra la actividad de unión de hSH357-1-T3 a un polipéptido de la región extracelular de EPHA2; La Figura 13A) es un diagrama que muestra las actividades inhibidoras competitivas de hSH348-1-T1 y hSH3481-T3 frente a la unión al antígeno de SH348-1; La Figura 13B) es un diagrama que muestra las actividades inhibitorias competitivas de hSH357-1-T1 y hSH3571-T3 frente a la unión al antígeno de SH357-1; La Figura 14A) es un diagrama que muestra la actividad de inhibición de la fosforilación dependiente de efrina A1 de restos tirosina de EPHA2 por hSH348-1-T1 o hSH348-1-T3; y La Figura 14B) es un diagrama que muestra la actividad de inhibición de la fosforilación dependiente de efrina A1 de restos tirosina de EPHA2 por hSH357-1-T1 o hSH357-1-T3.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

1. Definiciones

En la presente memoria descriptiva, los términos “cáncer” y “tumor” se utilizan en el mismo sentido.

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2. Anticuerpo frente a EPHA2

(1) Preparación de antígeno

Los ejemplos de antígenos para obtener el anticuerpo frente a EPHA2 de la presente invención pueden incluir un polipéptido de longitud completa de EPHA2 y polipéptidos parciales del mismo, y pueden incluir de forma más concreta un polipéptido de longitud completa de EPHA2 y preferentemente un polipéptido de la región extracelular de EPHA2 (que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 1 a 534 de SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias), más preferentemente un polipéptido parcial del polipéptido de la región extracelular de EPHA2 que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 426 a 534 de SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias, incluso más preferentemente un polipéptido parcial del polipéptido de la región extracelular de EPHA2 que comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos n.º 439 a 534 de SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias, y derivados obtenidos añadiendo una secuencia de aminoácidos arbitraria o un soporte a estas secuencias. Los ejemplos adicionales de los mismos pueden incluir polipéptidos que consisten en secuencias de aminoácidos parciales consecutivas de al menos 6 aminoácidos y derivados obtenidos añadiendo una secuencia de aminoácidos arbitraria o un soporte de estas secuencias.

En este contexto, el polipéptido de longitud completa EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo utilizados como un antígeno, pueden obtenerse produciendo por ingeniería genética en las células hospedadoras el gen de EPHA2 o los genes de los polipéptidos parciales a expresar.

EPHA2 puede purificarse para su uso de forma directa a partir de tejidos tumorales o de células tumorales humanos. Además, el polipéptido de longitud completa EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo pueden sintetizarse in vitro u obtenerse produciendo células hospedadoras mediante ingeniería genética para producir el polipéptido.

En la ingeniería genética en concreto, los genes que codifican EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo se incorporan en vectores que tienen la capacidad de expresar el EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo y, después, el EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo pueden sintetizarse en una solución que contenga enzimas, sustratos y sustancias energéticas necesarias para la transcripción y la traducción. Como alternativa, las células hospedadoras de otros procariotas o eucariotas pueden transformarse con ellos y se hace expresar el EPHA2 o los polipéptidos parciales del mismo para obtener la proteína deseada.

Puede obtenerse ADNc del polipéptido parcial de EPHA2, por ejemplo, mediante el denominado procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo en el presente documento, denominado como “PCR”), en el cual se realiza la PCR (véase Saiki, R. K., y col. Science 1988) 239, p. 487-489) utilizando bibliotecas de ADNc que expresan EPHA2 como moldes y cebadores que amplifican de forma específica el ADNc de EPHA2 o el ADN que codifica el polipéptido parcial.

Los ejemplos de síntesis de polipéptidos in vitro incluyen, pero sin limitación, el Sistema de Traducción Rápida (STR) fabricado por Roche Diagnostics Corp.

Los ejemplos de células procariotas hospedadoras incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar estas células hospedadoras con el gen de interés, las células hospedadoras se transforman con vectores plasmídicos que comprenden un replicón, es decir, un origen de replicación y una secuencia reguladora obtenida de una especie compatible con los hospedadores. Además, es preferente que los vectores tengan una secuencia que pueda conferir selectividad por carácter fenotípico (fenotipo) a las células transformadas.

Las células eucariotas hospedadoras abarcan células de vertebrados, insectos, levaduras y similares. Por ejemplo, se utilizan a menudo como las células de vertebrado células COS de mono (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de ratón NIH3T3 (ATCC n.º CRL-1658) y cepas de células de ovario de hámster Chino (células CHO, ATCC CCL-61) deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220), aunque las células de vertebrado no se limitan a ellas.

Los transformantes así obtenidos pueden cultivarse de acuerdo con procedimientos convencionales y tienen la capacidad de producir en el cultivo el polipéptido de interés de forma intracelular o de forma extracelular.

Puede seleccionarse de forma apropiada un medio utilizado en cultivo, a partir de diversos medios utilizados de forma rutinaria, de acuerdo con las células hospedadoras adoptadas. Por ejemplo, para Escherichia coli puede utilizarse medio LB complementado de forma opcional con un antibiótico (por ejemplo, ampicilina) o IPTG.

La proteína recombinante producida de forma intracelular o de forma extracelular por los transformantes en el cultivo, puede separarse y purificarse mediante diversos procedimientos de separación conocidos en la técnica que utilizan las propiedades físicas, propiedades químicas o similares de la proteína.

En concreto, los procedimientos pueden ejemplificarse por el tratamiento con precipitantes de proteínas habituales, ultrafiltración, diversas técnicas de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía

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líquida de alto rendimiento (HPLC), diálisis y combinaciones de las mismas.

Además, la proteína recombinante a expresar puede estar ligada a 6 restos de histidina para, de este modo, purificar de forma eficaz la proteína resultante en una columna de afinidad de níquel.

Combinando estos procedimientos, puede producirse el polipéptido de interés de forma fácil, en grandes cantidades, con rendimientos elevados y elevada pureza.

El anticuerpo de la presente invención puede obtenerse inmunizando animales con el antígeno de acuerdo con un procedimiento convencional y recogiendo los anticuerpos producidos in vivo, seguido de la purificación.

Además, las células productoras de anticuerpos que producen el anticuerpo frente a EPHA2 se fusionan con células de mieloma de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497 y Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365 -367, Plenum Press, N. Y. (1980)), para establecer de este modo hibridomas, a partir de los cuales se pueden obtener anticuerpos monoclonales.

(2) Producción de anticuerpo monoclonal anti EPHA2

Los ejemplos de anticuerpos que se unen de forma específica a EPHA2 pueden incluir anticuerpos monoclonales que se unen de forma específica a EPHA2. Un procedimiento para la obtención de anticuerpos es como se describe a continuación.

En general, para la producción de anticuerpo monoclonal se necesita el siguiente procedimiento:

(a): la etapa de purificación de biopolímeros utilizados como antígenos,

(b): la etapa de inmunización de animales con los antígenos a través de inyección, después, de recolección de sangre de los animales, el ensayo del título de anticuerpos de los mismos para determinar el momento de la esplenectomía y, después, la preparación de células productoras de anticuerpos,

(c): la etapa de preparación de células de mieloma (denominadas en lo sucesivo en el presente documento como “mielomas”),

(d): la etapa de realización de la fusión celular entre las células productoras de anticuerpos y los mielomas,

(e): la etapa de selección de un grupo de hibridomas que produce el anticuerpo de interés,

(f): la etapa de separación en clones celulares individuales (clonación),

(g): la etapa de cultivo de los hibridomas para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades o de generación de animales trasplantados con hibridoma, de acuerdo a las circunstancias,

(h): la etapa de estudio de las bioactividades y las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales así producidos, o de ensayo de las propiedades como reactivos de marcaje, etc.

En lo sucesivo en el presente documento, el procedimiento para preparar anticuerpos monoclonales se describirá en detalle en línea con estas etapas, aunque el procedimiento para preparar anticuerpos no se limita a las mismas. Por ejemplo, pueden utilizarse células productoras de anticuerpos que no sean células esplénicas y mielomas.

(a) Purificación de antígenos

Puede utilizarse como antígenos EPHA2 o polipéptidos parciales del mismo preparados mediante el procedimiento como se describe anteriormente.

Además, también pueden utilizarse como antígenos péptidos parciales de la proteína, los cuales se sintetizan de forma química utilizando fracciones de membranas preparadas a partir de células somáticas recombinantes que expresan EPHA2 o las propias células somáticas recombinantes que expresan EPHA2 de acuerdo con un procedimiento bien conocido para los expertos en la materia.

(b) Preparación de células productoras de anticuerpos

Los antígenos obtenidos en la etapa (a) se mezclan con adyuvantes bien conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, los adyuvantes de Freund completo o incompleto, u otros auxiliares tales como sulfato de aluminio y potasio, y se inmunizan animales experimentales con estos inmunógenos. Los animales utilizados en los procedimientos de preparación de hibridomas conocidos en la técnica pueden utilizarse como animales experimentales sin problema. En concreto, por ejemplo, pueden utilizarse ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas y caballos. Sin embargo, como animales a inmunizar se utilizan preferentemente ratones o ratas, desde el punto de vista de la facilidad de disponibilidad de las células de mieloma a fusionar con las células productoras de anticuerpos extraídas, etc.

Además, los linajes de los ratones y ratas realmente utilizados no están particularmente limitados. Por ejemplo, pueden utilizarse linajes de ratón tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB y 129, y linajes de rata tales como Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN y Fischer.

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Estos ratones y ratas pueden obtenerse de, por ejemplo, criadores/distribuidores de animales experimentales como CLEA Japón, Inc. y Laboratorios Charles River Japón, Inc.

De estos linajes, el linaje de ratón BALB/c y el linaje de rata Low son particularmente preferentes como los animales a inmunizar, en consideración de la compatibilidad de fusión con células de mieloma, como se describe más adelante.

Además, también se utilizan preferentemente ratones que tienen un mecanismo biológico para la eliminación de autoanticuerpos reducido, es decir, ratones con enfermedad autoinmunitaria, en consideración de la homología antigénica entre los seres humanos y los ratones.

Preferentemente, en el momento de la inmunización estos ratones o ratas tienen de 5 a 12 semanas, más preferentemente de 6 a 8 semanas.

Para la inmunización de los animales con EPHA2 o los antígenos recombinantes del mismo, pueden utilizarse procedimientos conocidos en la técnica descritos de forma detallada en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987) y Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Immunochemistry Experimental, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964).

De estos procedimientos de inmunización, en concreto se ilustra un procedimiento preferente como se describe a continuación.

En concreto, en primer lugar se administran a los animales por vía intradérmica o vía intraperitoneal las fracciones de proteínas de membrana utilizadas como antígenos o las células que expresan antígeno.

Sin embargo, es preferente el uso combinado de las dos vías de administración para potenciar la eficacia de inmunización. En particular, puede potenciarse la eficacia de inmunización realizando administración intradérmica en las primeras inmunizaciones y realizando administración intraperitoneal en las inmunizaciones posteriores o solo en la última inmunización.

El programa de administración de los antígenos difiere dependiendo del tipo de animales a inmunizar, de las diferencias individuales de los mismos, etc. En general, los antígenos se administran en 3 a 6 dosis, preferentemente a intervalos de 2 a 6 semanas, más preferentemente en 3 a 4 dosis a intervalos de 2 a 4 semanas.

Además, la dosis de los antígenos difiere dependiendo del tipo de animales, de las diferencias individuales de los mismos, etc., y en general es del orden de 0,05 a 5 mg, preferentemente de 0,1 a 0,5 mg.

De 1 a 6 semanas más tarde se realiza un refuerzo, preferentemente 2 a 4 semanas más tarde, más preferentemente 2 a 3 semanas más tarde, desde tal administración de antígeno.

En este contexto, la dosis de los antígenos en los refuerzos difiere dependiendo del tipo de animales, del tamaño de los mismos, etc., y en general son del orden de 0,05 a 5 mg, preferentemente 0,1 a 0,5 mg, más preferentemente 0,1 a 0,2 mg, por ejemplo, para ratones.

De 1 a 10 días más tarde, preferentemente 2 a 5 días más tarde, más preferentemente 2 a 3 días más tarde, desde el refuerzo, se extraen de forma aséptica de los animales a inmunizar células esplénicas o linfocitos que contienen células productoras de anticuerpos.

En este procedimiento se miden sus títulos de anticuerpos y los animales que tienen un título de anticuerpos aumentado de forma suficiente pueden utilizarse como fuentes de células productoras de anticuerpos para, de este modo, potenciar la eficacia de los procedimientos posteriores.

Los ejemplos de procedimientos para la medición de los títulos de anticuerpos utilizados en el presente documento pueden incluir, pero sin limitación, RIA y ELISA.

La medición del título de anticuerpos puede realizarse por procedimientos como se describe a continuación, por ejemplo, de acuerdo con ELISA.

En primer lugar, se adsorben los antígenos purificados o parcialmente purificados en la superficie de una fase sólida, tal como placas de 96 pocillos para ELISA. Además, se cubre la superficie de la fase sólida a la que no se adsorbió antígeno con proteínas no relacionadas con los antígenos, por ejemplo, seroalbúmina bovina (en lo sucesivo en el presente documento denominada como “BSA”). Las superficies se lavan y después se ponen en contacto con muestras diluidas en serie (por ejemplo, suero de ratón) como anticuerpos primarios, de forma que los anticuerpos en las muestras se unen a los antígenos

Además, como anticuerpos secundarios se añaden a la misma anticuerpos frente a anticuerpos de ratón marcados con enzima, de forma que los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos de ratón. Después del lavado, se añaden a la misma sustratos para la enzima y, por ejemplo, se mide el cambio de absorbancia que provoca el desarrollo de color a base de la degradación de sustrato, para calcular de este modo los títulos de anticuerpo.

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En este procedimiento, se inoculan en una microplaca alimentadores tales como cepas de fibroblastos obtenidos de feto de rata o células esplénicas, de timo o de ascitis de ratón normal.

Por otro lado, los hibridomas se diluyen con anterioridad en un medio de 0,2 a 0,5 individuos/0,2 ml. Esta solución que contiene los hibridomas diluidos flotando en ella se añade a una concentración de 0,1 ml/pocillo, y los hibridomas se pueden cultivar de forma continua durante aproximadamente 2 semanas, mientras se reemplaza aproximadamente 1/3 del medio por uno nuevo a intervalos regulares (por ejemplo, intervalos de 3 días), para, de este modo, cultivar clones de hibridoma.

Para los pocillos que tienen un título de anticuerpo observable, por ejemplo la clonación mediante el procedimiento de dilución límite se repite 2 a 4 veces, y los clones cuyo título de anticuerpos se observa de forma estable pueden seleccionarse como cepas de hibridoma que producen anticuerpo monoclonal anti EPHA2.

Los ejemplos de las cepas de hibridoma así clonadas pueden incluir el hibridoma SH348-1 y el hibridoma SH357-1. El hibridoma SH348-1 y el hibridoma SH357-1 se han depositado el 8 de junio de 2007 en el Organismo Depositario de Patentes Internacionales, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas, (dirección: Central Tsukuba 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón). El hibridoma SH348-1 se ha designado como SH348-1, con el n.º de referencia FERM BP-10836, y el hibridoma SH357-1 se ha designado como SH357-1, con el n.º de referencia FERM BP-10837.

En la presente memoria descriptiva, un anticuerpo que produce el hibridoma SH348-1 se denomina como “SH348-1” y un anticuerpo que produce el hibridoma SH357-1 se denomina como “SH357-1”.

(g) Preparación de anticuerpos monoclonales mediante el cultivo de hibridomas

Los hibridomas así seleccionados pueden cultivarse para, de este modo, obtener anticuerpos monoclonales de forma eficaz. Antes del cultivo, es preferente explorar los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal de interés.

Para esta exploración, se pueden adoptar los procedimientos conocidos de por sí en la técnica.

La medición del título de anticuerpo se puede realizar, por ejemplo, por ELISA, como se describe en el párrafo (b).

Los hibridomas obtenidos mediante el procedimiento como se describe anteriormente se pueden ser crioconservar en nitrógeno líquido o en un congelador a -80 ºC o menos.

Además, los hibridomas clonados de forma completa pueden pasarse varias veces en medio HT (medio HAT excepto para aminopterina) y, después, cultivarse en un medio normal que se ha cambiado allí.

El cultivo a gran escala se realiza por cultivo de rotación utilizando frascos de cultivo grandes o cultivo rotativo.

El sobrenadante obtenido en este cultivo a gran escala puede purificarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, tales como filtración en gel, para obtener anticuerpos monoclonales que se unen de forma específica a la proteína.

Además, los hibridomas pueden inyectarse por vía intraperitoneal a ratones del mismo linaje que los mismos (por ejemplo, BALB/c) o ratones Nu/Nu y crecerse para obtener ascitis que contenga el anticuerpo monoclonal de la presente invención en grandes cantidades.

Para la administración intraperitoneal, para obtener ascitis en grandes cantidades se administra de antemano (3 a 7 días antes de la administración) aceite mineral, tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano).

Por ejemplo, para inactivar los linfocitos T se inyecta con anterioridad un agente inmunosupresor por vía intraperitoneal a los ratones del mismo linaje que los hibridomas. 20 días más tarde, se dejan flotar 106 a 107 células del clon de hibridoma (0,5 ml) en un medio sin suero, y esta solución se administra por vía intraperitoneal a los ratones. Habitualmente, se recoge ascitis de los ratones cuando se produce distensión abdominal por la ascitis acumulada.

Por este procedimiento, se obtienen anticuerpos monoclonales a una concentración aproximadamente 100 veces superior a la de la solución de cultivo.

Los anticuerpos monoclonales obtenidos por este procedimiento pueden purificarse por procedimientos descritos en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).

Los ejemplos concretos de los mismos incluyen precipitación por sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

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Para la purificación, pueden utilizarse como procedimientos convenientes kits de purificación de anticuerpos monoclonales disponibles de forma comercial (por ejemplo, el kit MAbTrap GII, fabricado por Pharmacia Inc.) y similares.

Los anticuerpos monoclonales así obtenidos tienen una elevada especificidad de antígeno para EPHA2.

(h) Ensayo de anticuerpos monoclonales

El isotipo y la subclase de los anticuerpos monoclonales así obtenidos pueden determinarse como se describe a continuación.

En primer lugar, los ejemplos de procedimientos de identificación incluyen el procedimiento de Ouchterlony, ELISA y RIA.

El procedimiento Ouchterlony es conveniente pero, para una concentración de anticuerpos monoclonales baja, requiere un procedimiento de concentración.

Por otro lado, cuando se utiliza ELISA o RIA, el sobrenadante del cultivo se hace reaccionar de forma directa con una fase sólida con antígeno adsorbido y, adicionalmente, pueden utilizarse como anticuerpos secundarios anticuerpos compatibles con diversos isotipos y subclases de inmunoglobulina para, de este modo, identificar el isotipo o la subclase de los anticuerpos monoclonales.

Además, pueden utilizarse también como procedimientos más convenientes kits para la identificación disponibles de forma comercial (por ejemplo, el kit Mouse Typer; fabricado por BioRad Laboratories, Inc.), y similares.

Además, las proteínas pueden cuantificarse de acuerdo con el procedimiento de Folin-Lowry y un procedimiento de cálculo utilizando la absorbancia a 280 nm [1,4 (DO280) = 1 mg/ml de inmunoglobulina.

(3) Otros anticuerpos

El anticuerpo de la presente invención abarca el anticuerpo monoclonal frente a EPHA2 así como los anticuerpos recombinantes genéticos modificados de forma artificial con el fin de, por ejemplo, reducir la xenoantigenicidad frente a seres humanos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos. Estos anticuerpos pueden producirse de acuerdo con procedimientos conocidos.

Los ejemplos del anticuerpo quimérico incluyen un anticuerpo que tiene regiones variables y constantes obtenidas de especies distintas entre sí y, en concreto, incluyen un anticuerpo quimérico que comprenden unidas regiones variables obtenidas de ratón y regiones constantes obtenidas de ser humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851-6855, (1984)).

Los ejemplos del anticuerpo humanizado pueden incluir un anticuerpo que comprende un anticuerpo obtenido de ser humano, con regiones determinantes de complementariedad (las CDR) reemplazadas por las de otra especie (véase Nature (1986) 321, p. 522-525) y un anticuerpo que comprende un anticuerpo de ser humano con secuencias CDR y algunos restos de aminoácido del armazón reemplazados por los de otra especie por injerto de CDR (véase el documento WO 90/07861 y el documento US6972323).

Los ejemplos adicionales del anticuerpo de la presente invención pueden incluir un anticuerpo anti humano. El anticuerpo humano anti EPHA2 significa un anticuerpo humano que tiene solo la secuencia génica de un anticuerpo obtenido de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti EPHA2 puede obtenerse mediante procedimientos que utilizan ratones que producen anticuerpos humanos que tienen genes que contienen un fragmento de cromosoma humano que contiene genes de las cadenas H y L de anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids. Res. (1998) 26, p. 34473448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. y Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999 y Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727).

En concreto, para tales animales transgénicos pueden crearse animales recombinantes genéticos en los cuales se rompen los locus endógenos de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en mamíferos no humanos, y se introducen en su lugar los locus de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana a través de vectores de cromosoma artificial de levadura (YAC) o similar, preparando animales genosuprimidos y animales transgénicos y cruzando estos animales.

Además, se transforman células eucariotas con ADNc que codifica cada una de tales cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano, preferentemente vectores que contienen el ADNc, mediante técnicas de recombinación génica, y, también, pueden cultivarse células transformadas que producen anticuerpos monoclonales humanos recombinantes genéticos para, de este modo, obtener estos anticuerpos a partir del sobrenadante del cultivo.

En este contexto, por ejemplo, pueden utilizarse como hospedadores células eucariotas, preferentemente células de mamífero tales como células CHO, linfocitos y mielomas.

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fusionadas que producen anticuerpos biespecíficos (Milstein y col., Nature 1983) 305, p. 537-539).

El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monocatenario (también denominado scFv). El anticuerpo monocatenario se obtiene ligando las regiones V de la cadena pesada y ligera del anticuerpo a través de un conector polipeptídico (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg y Moore ed., Springer Verlag, Nueva York, p. 269-315 (1994)) y Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136).

Los procedimientos para preparar los anticuerpos monocatenarios son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513 y 5.455.030). En este scFv, las regiones V de la cadena pesada y ligera se ligan a través de un conector que no forma un conjugado, preferentemente un conector polipeptídico (Huston, J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, p. 5879-5883). Las regiones V de la cadena pesada y ligera en el scFv pueden obtenerse de los mismos anticuerpos o pueden obtenerse de anticuerpos distintos.

Por ejemplo, para ligar las regiones V se utiliza como conector peptídico un péptido monocatenario arbitrario de 12 a 19 restos.

El ADN que codifica el scFv se obtiene: amplificando, como moldes, las secuencias de longitud completa o las secuencias parciales (que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas) del ADN que codifica la cadena pesada o la región V de la cadena pesada del anticuerpo y el ADN que codifica la cadena ligera o la región V de la cadena ligera del mismo, mediante un procedimiento de PCR que utiliza parejas de cebadores diseñados para ambos extremos del mismo; y posteriormente amplificando adicionalmente ADN que codifica la porción del conector peptídico, en combinación con una pareja de cebadores diseñados para ligar respectivamente ambos extremos de la secuencia del conector a las secuencias de cadena pesada y ligera.

Además, una vez que el ADN que codifica el scFv está preparado, pueden obtenerse de acuerdo con procedimientos convencionales los vectores de expresión que contienen el ADN y los hospedadores transformados con los vectores de expresión. Además, mediante el uso de estos hospedadores, puede obtenerse el scFv de acuerdo con procedimientos convencionales.

Para estos fragmentos de anticuerpo, sus genes se obtienen y expresan del mismo modo que anteriormente, y puede permitirse que los hospedadores produzcan los fragmentos de anticuerpo.

El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal, el cual es una mezcla de una pluralidad de anticuerpos anti EPHA2 que difieren en sus secuencias de aminoácidos. Un ejemplo del anticuerpo policlonal puede incluir una mezcla de una pluralidad de anticuerpos que difieren en las CDR. Se cultiva una mezcla de células productoras de anticuerpos distintos entre sí y los anticuerpos purificados del cultivo pueden utilizarse como tales anticuerpos policlonales (véase el documento WO 2004/061104).

También pueden utilizarse como la forma modificada del anticuerpo los anticuerpos obtenidos uniendo el anticuerpo de la presente invención con diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG).

Además, el anticuerpo de la presente invención puede ser un conjugado de estos anticuerpos formado con otros fármacos (inmunoconjugado). Los ejemplos de tal anticuerpo pueden incluir conjugados obtenidos uniendo estos anticuerpos a materiales o compuestos radiactivos que tengan un efecto farmacológico (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).

Los anticuerpos obtenidos pueden purificarse hasta que sean homogéneos. En la separación y purificación del anticuerpo puede utilizarse cualquier procedimiento habitual de separación/purificación para proteínas.

Los anticuerpos pueden separarse y purificarse seleccionando y combinando de forma apropiada, por ejemplo, el uso columnas de cromatografía, filtros, ultrafiltración, desalado, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida preparativa e isoelectroenfoque (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak y col. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); y Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), aunque los procedimientos de separación/purificación no se limitan a estos.

Los ejemplos de cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.

Estas técnicas de cromatografía pueden realizarse utilizando cromatografía de fase líquida tal como HPLC o FPLC.

Los ejemplos de columnas utilizadas en la cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y proteína G.

Los ejemplos de columnas a base de columna de proteína A incluyen Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia Inc.).

Además, los anticuerpos también pueden purificarse a través de su afinidad por antígenos, utilizando un soporte de antígeno inmovilizado.

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[Tabla 1] Tabla 1

Anticuerpo: Actividad de unión al antígeno Efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral (in vivo)

rEPHA2-ECD: rFnlll-NC rFnlll-N rFnlll-C

SH 348-1: + + - + +

SH 357-1: + + - + +

Ab 57-1: + + + - -

Ab 65-1: + - - - -

Ab 96-1: + - - - -

Ab 100-1: + - - - -

Ab 105-1: + - - - -

Ab 106-13: + - - - -

Ab 136-1: + - - - -

Ab 148-1: + - - - -

Ab 151-4: + - - - -

Ab230-1: + + + - -

Ab 373-1: + - - - -

Ab 382-1: + - - - -

(Ejemplo 5) Identificación de los genes de los anticuerpos SH348-1 y SH357-1

Para determinar las secuencias de aminoácidos N terminales de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de ratón anti EPHA2 humana SH348-1 y SH357-1, se separó por SDS-PAGE una alícuota de una solución que contenía el SH348-1 o SH357-1 purificado en el párrafo 2)-8. Las proteínas así separadas en el gel se transfirieron del gel a una membrana de PVDF (de tamaño de poro de 0,45 μm; fabricada por Invitrogen Corp.). La membrana de PVDF se lavó con un tampón de lavado (NaCl 25 mM, tampón de borato de sodio 10 mM, pH 8,0), después se tiñó empapando en una solución de tinción (metanol al 50 %, ácido acético al 20 %, Azul Brillante de Coomassie al 0,05 %) durante 5 minutos y después se destiñó con metanol al 90 %. Las porciones de las bandas que correspondían a las cadenas pesada y ligera (cadena pesada: la banda con menor movilidad, cadena ligera: la banda con mayor movilidad) se visualizaron en las membranas de PVDF y se hizo un intento por identificar sus respectivas secuencias de aminoácidos N terminales mediante el procedimiento automático de Edman (véase, Edman, P., y col. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80) utilizando Procise (marca registrada) cLC Protein Sequencer Model 492cLC (Applied Biosystems). No pudo identificarse mediante este procedimiento la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de SH348-1. Por lo tanto, el ácido piroglutámico N terminal se eliminó utilizando piroglutamato aminopeptidasa de Pfu (fabricado por TAKARA BIO INC.) y después se realizó el mismo procedimiento que anteriormente para identificar una secuencia de aminoácidos que se iniciaba en el segundo aminoácido desde el extremo N terminal.

Como resultado, la secuencia de aminoácidos (comenzando en el segundo aminoácido desde el extremo N) de la banda que correspondía a la cadena pesada de SH348-1 era

I-Q-L-V-Q-S-G-P (SEQ ID NO: 26 en el listado de secuencias).

La secuencia de aminoácidos N terminal de la banda que corresponde a la cadena ligera de SH348-1 era

D-V-L-M-T-Q-S-P-L-S-L (SEQ ID NO: 27 en el listado de secuencias).

La secuencia de aminoácidos N terminal de la banda que corresponde a la cadena pesada de SH357-1 era

Q-I-Q-L-V-Q-S-G-P (SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias).

La secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda que corresponde a la cadena ligera de SH357-1 era

D-V-L-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-S-L-G-D-Q-A (SEQ ID NO: 29 en el listado de secuencias).

Estas secuencias de aminoácidos se compararon con la base de datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos preparada por Kabat y col. (véase Kabat, E. A. y col., (1991) en Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I y II, U.S. Department of Health and Human Services). Como resultado, el subtipo de la cadena pesada de SH348-1 (cadena γ2a) era heterogéneo y el subtipo de la cadena ligera era ligera kappa II. Además, el subtipo de

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