ES2618655T3

ES2618655T3 - Composición que mejora el rendimiento y uso de la misma

Info

Publication number: ES2618655T3
Application number: ES08712839.3T
Authority: ES
Inventors: Jon Lundberg; Eddie Weitzberg
Original assignee: Heartbeet Ltd
Current assignee: Heartbeet Ltd
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2028-02-26
Also published as: US9180140B2; US10555968B2; CY1118847T1; JP2010519335A; EP2124638A1; EP2124638B1; US20100047344A1; CA2678093A1; DK2124638T3; EP2124638A4; CA2678093C; EP3159000C0; PT2124638T; HUE031982T2; PL2124638T3; EP3159000A1; EP3159000B1; US20150352147A1; HRP20170355T1; WO2008105730A1

Abstract

Un método para la mejora no terapéutica del rendimiento de un mamífero, dicha mejora del rendimiento que se manifiesta como un menor consumo de oxígeno (VO2) durante el ejercicio físico, caracterizado por que se administra nitrato inorgánico, nitrito inorgánico o una combinación de los mismos por vía oral, en el que la dosis de nitrato es de 0,01 a 10 mmol de nitrato de sodio/kg de peso corporal/día, la dosis de nitrito es de 0,001 a 1 mmol/kg de peso corporal/día, y en el que el intervalo de la relación de dosis cuando el nitrato y el nitrito se administran en combinación es de 5:1 a 100:1 (nitrato:nitrito), en el que dicho rendimiento se mejora en comparación con el rendimiento físico de dicho mamífero durante dicho ejercicio físico, en ausencia de dicha administración de nitrato y/o nitrito inorgánico.

Description

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DESCRIPCION

Composicion que mejora el rendimiento y uso de la misma Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de los alimentos nutricionales y suplementos alimentarios, Kquidos y productos comestibles solidos que aumentan el rendimiento, tales como bebidas deportivas, bebidas energeticas y barras energeticas.

Antecedentes

Actualmente se cree que se puede lograr una mejora en el rendimiento deportivo mediante la ingesta de las denominadas bebidas deportivas. Por lo general no tienen gas y con frecuencia contienen fructosa u otros azucares y carbohidratos complejos, que son facilmente absorbidos por el cuerpo, y estan disenados para promover la disponibilidad de energfa y/o prevenir o tratar la deshidratacion leve. Las bebidas deportivas tambien contienen electrolitos (principalmente sales de sodio y potasio) y nutrientes (protemas y aminoacidos). Las bebidas deportivas, bebidas energeticas y otros productos lfquidos, semisolidos y solidos, aunque se comercializan para los atletas, tambien son consumidos por no atletas, como aperitivo, en situaciones donde se desea mas energfa y resistencia.

A veces se hace una distincion entre bebidas deportivas y bebidas energeticas, las primeras que suelen ser mas isotonicas, y las segundas que contienen mas azucar y con frecuencia tambien cafema. En este contexto, no se pretende esta distincion, y el termino "alimento o suplemento alimentario que mejora el rendimiento" incluye bebidas deportivas y bebidas energeticas, asf como cualquier otro lfquido, formas semisolidas o solidas, tales como tabletas, barritas energeticas, etc. como se describe en mas detalle a continuacion.

Sin embargo la adaptacion fisiologica al ejercicio implica grandes cambios cardiovasculares y metabolicos. El consumo de oxfgeno aumenta drasticamente en los musculos activos con un aumento paralelo en el flujo sangumeo muscular. En estos procesos el oxido mtrico gaseoso endogeno (NO) desempena un papel regulador importante. El NO aumenta el flujo sangumeo a los musculos y modula la contraccion muscular y la absorcion de glucosa (para una revision vease Stamler, JS, et al. Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol Rev. 2001, vol. 81, n.° 1, p. 209-37).

Ademas, el NO esta implicado en el control de la respiracion celular mediante la interaccion con enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial (para una revision vease MONCADA, S, et al. Does nitric oxide modulate mitochondrial energy generation and apoptosis?. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002, vol. 3, n.° 3, p. 214-20).

Los estudios in vitro publicados en la decada de 1990 muestran que el NO es un modulador de la respiracion mitocondrial mediante la inhibicion reversible de la oxidasa del citocromo c (CARR, GJ, et al. Nitric oxide formed by nitrite reductase of Paracoccus denitrificans is sufficiently stable to inhibit cytochrome oxidase activity and is reduced by its reductase under aerobic conditions. Biochim Biophys Acta. 15 de mayo de 1990, vol. 1017, n.° 1, p. 57-62; BOLANOS, J P, et al. Nitric oxide-mediated inhibition of the mitochondrial respiratory chain in cultured astrocytes. J Neurochem. 1994, vol. 63, n.° 2, p. 910-6; BROWN, G C, et al. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. FEBS Lett. 19 de Dic de 1994, vol. 356, n.° 2-3, p. 295-8; CLEETER, M W, et al. Reversible inhibition of cytochrome c oxidase, the terminal enzyme of the mitochondrial respiratory chain, by nitric oxide. Implications for neurodegenerative diseases. FEBS Lett. 23 de mayo de 1994, vol. 345, n.° 1, p. 50-4; and SCHWEIZER, M, et al. Nitric oxide potently and reversibly deenergizes mitochondria at low oxygen tension. Biochem Biophys Res Comm. 1994, n.° 204, p. 169-75).

El NO tambien puede interactuar en otros sitios de la cadena respiratoria mitocondrial y en el ciclo de Krebs (para una revision vease Moncada, supra). Aunque esta accion importante del NO se ha caracterizado muy bien en cultivos celulares, se sabe menos acerca de su relevancia fisiologica in vivo y los efectos del NO sobre la respiracion celular durante el ejercicio ffsico. Shen y sus colaboradores demostraron que la administracion de inhibidores in vivo de la NOS durante ejercicio submaximo da lugar a un aumento del consumo de oxfgeno en perros (SHEN, W, et al., Role of NO in the regulation of oxygen consumption in conscious dogs. Circulation Res. 1999, n.° 84, p. 840-5) y Lacerda y sus colaboradores demostraron resultados similares en ratas (LACERDA, A C R, et al. Evidence that brain nitric oxide inhibition increases metabolic cost of exercise, reducing). La mayona de los estudios se han realizado utilizando inhibidores de la NOS, mientras que los efectos de la administracion de NO exogeno sobre el ejercicio son en gran parte desconocidos. Ademas, los estudios en seres humanos sanos son escasos.

El medio clasico por el que se produce la produccion de NO es la via de la L-arginina, donde el NO es sintetizado por enzimas espedficas, las NO-sintasas. Una manera alternativa fundamentalmente diferente de generar NO ha sido descrita mas recientemente (LUNDBERG, J O, et al. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 1994, vol. 35, n.° 11, p. 1543-6; BENJAMIN, N, et al. Stomach NO synthesis. Nature. 7 de abril de 1994, vol. 368, n.° 6471, p. 502; ZWEIER, J L, et al. Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues. Nat Med. 1995, vol. 1, n.° 8, p. 804-9; y WEITZBERG, E, et al. Non-enzymatic nitric oxide

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production in humans. NO Biol Chem. 1998, n.° 2, p. 1-7). En esta via independiente de la NOS, los aniones inorganicos de nitrato (NO3") y nitrito (NO2") se reducen in vivo para formar NO. El nitrato dietetico (que se encuentra principalmente en verduras de hoja verde) (MCKNIGHT, G M. Chemical synthesis of nitric oxide in the stomach from dietary nitrate in humans. Gut. 1997, n.° 40, p. 211-214; y Weitzberg, 1998, supra) se absorbe en la circulacion por las glandulas salivales, se secreta en la saliva y se convierte en parte a nitrito en la cavidad oral por bacterias reductoras de nitrato. El nitrito ingerido puede entrar en la circulacion sistemica. De hecho, un estudio reciente muestra que la ingestion de nitrato da lugar a un aumento sostenido de los niveles de nitritos circulantes (LUNDBERG, J O, et al. Inorganic nitrate is a possible source for systemic generation of nitric oxide. Free Rad Bio Med. 2004, vol. 37, n.° 3, p. 395-400). La reduccion adicional del nitrito en NO bioactivo puede producirse espontaneamente en ambientes acidos o reductores (Benjamin et al. 1994, supra, Lundberg et al. 1994, supra) pero tambien mejora en gran medida por diversas protemas y enzimas que incluyen la desoxihemoglobina en la sangre (COSBY, K, et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nat Med. 2003, vol. 9, n.° 12, p. 1498-505), la desoximioglobina (SHIVA, S, et al. Deoxymyoglobin is a Nitrite Reductase That Generates Nitric Oxide and Regulates Mitochondrial Respiration. Circ Res. 9 de Feb de 2007), la xantina oxidasa (MILLAR, T M, et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Lett. 8 de mayo de 1998, vol. 427, n.° 2, p. 225-8) y posiblemente por enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial (para una revision vease LUNDBERG, J O, et al. Nitrate, bacteria and human health. Nat Rev Microbiol. 2004, vol. 2, n.° 7, p. 593-602; LUNDBERG, J O, et al. NO generation from nitrite and its role in vascular control. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005, vol. 25, n.° 5, p. 915-22; y GLADWIN, M T, et al. The emerging biology of the nitrite anion. Nat Chem Biol. 2005, vol. 1, n.° 6, p. 308-14). La produccion de NO independiente de NOS parece complementar la produccion endogena de NO, especialmente durante la isquemia y la acidosis cuando la disponibilidad de oxfgeno es baja y las NO sintasas funcionan mal (Zweier et al. 1995, supra; Weitzberg et al., 1998, supra; DURANSKI, M R, et al. Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia- reperfusion of the heart and liver. J Clin Invest 2005, vol. 115, n.° 5, p. 1232-40; Lundberg et al., 2004, supra). La acidosis tisular y la hipoxia relativa tambien estan presentes durante el ejercicio ffsico y en este estado metabolico, es probable que se mejore la bioactivacion de nitrito.

La informacion disponible sobre el papel del NO en sujetos sanos y en particular en atletas durante el trabajo o el ejercicio es a la vez insuficiente y contradictoria. Curiosamente, la publicidad de algunos suplementos alimentarios disponibles en la actualidad para atletas y culturistas se refiere al efecto vasodilatador del NO. Un ejemplo es "NOX2" (Bodyonics, Ltd., EE. UU.), un producto que dice que contiene alfa-cetoglutarato de arginina (A-AKG) y cetoisocaproato de arginina (A-KIC) y, al parecer es capaz de aumentar los niveles de oxido mtrico a corto plazo. Otros productos contienen L-arginina, a partir de la cual se sintetiza el NO por las enzimas NOS, y a menudo se hace referencia a los efectos beneficiosos del NO sin ofrecer no obstante explicaciones mas detalladas.

Se ha estudiado la relacion entre la tasa maxima de trabajo y los niveles de reposo del nitrato en plasma y orina de sujetos con diferentes niveles de aptitud ffsica (Jungersten et al., Both physical fitness and acute exercise regulate nitric oxide formation in healthy humans. J Appl Physiol 82:760-764, 1997). Se encontro una relacion positiva entre la condicion ffsica y la formacion de NO en reposo y se planteo la hipotesis de que esta relacion positiva ayuda a explicar los efectos beneficiosos del ejercicio ffsico sobre la salud cardiovascular. En el estudio de Jungersten el nitrato se utiliza unicamente como marcador de la produccion de NO y los autores afirman varias veces que el nitrato es un producto final estable e inerte del NO y que es biologicamente inactivo.

Los presentes inventores se propusieron analizar si la administracion de nitrato en la dieta dana lugar a un aumento de las reservas de almacenamiento sistemico de nitrito y si esta estrategia dietetica tendna un impacto en diversos parametros fisiologicos y bioqmmicos durante el ejercicio.

Crawford et al. (Effect of nitrate on determinants of myocardial oxygen consumption during exercise, International Journal of Cardiology, Vol. 1, n.° 3-4, 1 de enero de 1982, pag. 307-314) investigo la demanda de oxfgeno del miocardio despues de la administracion de dinitrato de isosorbida, un nitrato organico.

El documento WO 2006/110601 tiene como objetivo, entre otras cosas, la reduccion de la mortalidad asociada a la insuficiencia cardfaca; y ha investigado los efectos del dinitrato de isosorbida y/o del mononitrato de isosorbida. Al igual que el arffculo anterior de Crawford et al., esta referencia tambien se centra en el corazon, y aunque usa terminos como "mejorar la tolerancia al ejercicio" y "mejorar el consumo de oxfgeno", esta claro que se desea aumentar el consumo de oxfgeno. El documento WO 2006/110601 define la mejora del consumo de oxfgeno de la siguiente manera: "Un aumento en el consumo de oxfgeno de un paciente normalmente resulta en una mayor tolerancia al ejercicio del paciente e implicana que el paciente tendna una mejor calidad de vida".

El documento KR 2002 0057695 se refiere a la produccion de alimentos naturales a base de multivitaminas que utilizan los vegetales.

Cohn et al. (A comparison of enalapril with hydralazine isosorbide dinitrate in the treatment of chronic congestive heart failure, New England Journal of Medicine, Vol. 325, n.° 5, 1 de enero de 1991, pag. 303-310) se refiere a una comparacion entre enelapril y dinitrato de isosorbida en el tratamiento de la insuficiencia cardfaca congestiva cronica, como es evidente a partir del tftulo. Al usar estos nitratos organicos, Cohn et al. observa un efecto

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vasodilatador y el aumento de consumo de ox^geno.

El documento de Estados Unidos 2004/204371 y EE. UU. 4.868.179 desvela una comparacion entre el enelapril y el dinitrato de isosorbida, un nitrato organico, y ensena "que mejora el consumo de oxfgeno", que se manifiesta como un aumento del consumo de oxfgeno. Estos documentos tambien se ocupan del dinitrato de isosorbida, un nitrato organico. Tambien es destacable que en el documento de Estados Unidos 2004/204371 y Estados Unidos 4.868.179 el dinitrato de isosorbida se combina con hidralazina y no se analiza por sf solo lo que hace que la comparacion con el nitrato inorganico sea aun menos relevante.

Peri et al. estudian los efectos de los extractos de manzana en la liberacion de NO por la saliva humana a pH 2 (Peri et al., Apples increase nitric oxide production by human saliva at the acidic pH of the stomach: A new biological function for polyphenols with a catechol group?, Free Radical Biology and Medicine, Vol. 39, n.° 5, 1 de septiembre de 2005, paginas 668-681.

Deng et al. investiga si el nitrito de etilo se podfa detectar in vitro a partir de la reaccion de etanol con peroxinitrito, asf como despues de la administracion de etanol a ratones. (Deng et al., Formation of ethyl nitrite in vivo after ethanol administration, Alcohol, Vol. 34, n.° 2-3, 1 de octubre de 2004, paginas 217-223).

En dos artfculos cientfficos, Shibata et al. investiga el consumo de oxfgeno por las paredes de las arteriolas en el musculo esqueletico de rata (M Shibata et al., Vascular wall energetics in arterioles during nitric oxide-dependent and-independent vasodilation, Journal of Applied Physiology, 100:1793-1798, 2006) y M. Shibata et al., Nitric oxide modulates oxygen consumption by arteriolar walls in rat skeletal muscle, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 289, H2673-H2679, 2005).

Sumario de la invencion

Los inventores sorprendentemente descubrieron que el rendimiento de un mairnfero que se manifiesta como consumo reducido de oxfgeno (VO2) durante el ejercicio se mejoro mediante la administracion a dicho mamffero de una cantidad no toxica de nitrato y/o nitrito. En base a este hallazgo, los inventores poner a disposicion un metodo para mejorar no terapeuticamente el rendimiento de un mamffero, asf como el uso de nitrato o nitrito inorganico o una combinacion de los mismos como se define en las reivindicaciones adjuntas. La siguiente descripcion esta sujeta a esta limitacion.

Breve descripcion de las figuras

La invencion se describira con mas detalle en la siguiente descripcion, ejemplos y reivindicaciones no limitantes, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 muestra un grafico que ilustra numerosas formas en las que la combinacion de nitrato y polifenoles actua sinergicamente para aumentar la biodisponibilidad del oxido mtrico y, al mismo tiempo reduce la formacion de compuestos nocivos tales como los radicales de oxfgeno y nitrosaminas. Para una explicacion mas detallada vease el texto a continuacion.

La Figura 2 ilustra los efectos de un suplemento dietetico con nitrato de sodio o cloruro de sodio (placebo) a las concentraciones plasmaticas de nitrito medidas en reposo e inmediatamente despues del ejercicio en 9 voluntarios varones sanos.

La Figura 3 muestra el consumo de oxfgeno (VO2) y la frecuencia cardfaca (FC) medidos a 6 cargas de trabajo diferentes despues de una suplementacion de la dieta de 3 dfas con nitrato de sodio (0,1 mmol/kg/dfa, NIT) o una cantidad equivalente de cloruro sodico (CON). El estudio tema un diseno aleatorizado, doble ciego cruzado con un penodo de lavado de al menos 10 dfas entre las pruebas. * p <0,05, ** p <0,01.

La Figura 4 muestra el consumo de oxfgeno a un 80 % del VO2pico en 9 voluntarios sanos de sexo masculino. Las mediciones se realizaron despues de una suplementacion de la dieta de 3 dfas con nitrato (0,1 mmol/kg/dfa) o una cantidad igual de cloruro de sodio (placebo). La diferencia entre los penodos de nitrato y de placebo fue significativa (p <0,01).

La Figura 5 muestra la concentracion de lactato en plasma medida a 6 cargas de trabajo diferentes despues de la suplementacion dietetica con nitrato de sodio (0,1 mmol/kg/dfa durante 3 dfas, barras rellenas) o una cantidad equivalente de cloruro sodico (placebo, barras vadas).

Descripcion detallada

Antes de describir la presente invencion, debe entenderse que la terminologfa empleada en el presente documento se utiliza con el proposito de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion estara limitado unicamente por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas.

Hay que senalar que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

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Ademas, el termino "aproximadamente" se utiliza para indicar una desviacion de ± 2 % del valor dado, preferentemente ± 5 %, y lo mas preferentemente ± 10 % de los valores numericos, donde corresponda.

El termino "comestible" en este contexto significa no toxico y que se puede ingerir, sin embargo no se limita a modos de ingestion particulares, tales como beber, mascar, la aplicacion en la cavidad oral en diversas formas, tales como, por ejemplo, un pulverizador o un aerosol.

El termino "alimento funcional" se refiere a cualquier alimento fresco o procesado que se dice que tiene una propiedad que promueve la salud y/o de prevencion de enfermedades mas alla de la funcion nutricional basica de suministro de nutrientes. Los alimentos funcionales a veces se denominan nutraceuticos. La categona general incluye alimentos procesados a base de ingredientes de alimentos funcionales, o suplementados con aditivos promotores de la salud, como productos "enriquecidos con vitaminas", y tambien, por ejemplo, alimentos frescos (verduras) que tienen demandas espedficas asociadas. Los alimentos fermentados con cultivos vivos a menudo tambien se consideran alimentos funcionales con beneficios probioticos.

Los presentes inventores demostraron que la suplementacion dietetica con nitrato inorganico produce en un VO2 reducido durante el ejercicio ffsico y un aumento significativo en la eficiencia muscular. Estos efectos se produjeron sin ningun incremento en el lactato en plasma.

Muchas verduras y frutas son ricas en polifenoles. Los polifenoles son un grupo de sustancias qmmicas que se encuentran en las plantas, caracterizado por la presencia de mas de un grupo fenol por molecula. Los polifenoles generalmente se subdividen en taninos hidrolizables, que son esteres de acido galico de glucosa y otros azucares; y fenilpropanoides, tales como ligninas, flavonoides y taninos condensados. Asf, en una realizacion de la presente invencion, la composicion que comprende el nitrato y/o nitrito se mezcla con un compuesto que contiene altos niveles de polifenoles. La relacion de la composicion que comprende nitrato: compuesto rico en polifenoles se debe seleccionar para obtener un suministro de nitrato suficiente. Por consiguiente, la composicion de nitrato y/o nitrito que comprende debe ser de al menos aproximadamente el 10 %, preferentemente de al menos aproximadamente el 20 %, mas preferentemente de al menos aproximadamente el 30 %, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente el 40 % y lo mas preferentemente de al menos aproximadamente el 50 % o incluso superior. Se contempla que este producto combinado tendra un efecto promotor sinergico de la salud al potenciar la biodisponibilidad del NO. Los polifenoles mejoraran la generacion de NO por varios mecanismos independientes de relieve en la Figura 1. En primer lugar, estos agentes pueden estimular directamente la formacion de NO endogeno a partir de las enzimas de NO sintasa (1 en la Figura 1). En segundo lugar, se contempla que estos compuestos mejoren la reduccion de nitrito a NO bioactivo debido a la presencia de grupos -OH reductores en el anillo de fenol (2 en la Figura 1). En tercer lugar, al actuar como captadores de radicales libres como el superoxido, impiden que estos radicales interaccionen con (y destruyan) el NO y por lo tanto el NO perdura mas tiempo (3 en la Figura 1). Ademas de esto, el nitrito o sus productos de reaccion pueden interactuar con el propio polifenol y modificarlo qmmicamente a traves de reacciones de nitracion o nitrosacion (4a en la Figura 1). El compuesto resultante puede actuar como un donador longevo de NO (4b en la Figura 1). Un efecto adicional es que la presencia de polifenoles alejara las reacciones qmmicas de formacion de nitrosaminas potencialmente cancengenos (5 en la Figura 1). Los productos de reaccion de nitratos, el nitrito, puede reaccionar con aminas para formar nitrosaminas, pero los polifenoles inhibiran esta reaccion por un mecanismo dual. En primer lugar ayudan a reducir rapidamente el HNO2 directamente a NO minimizando asf la formacion de especies nitrosantes (N2O3, HNO2). En segundo lugar, pueden competir directamente por nitrosacion con las aminas al nitrosarse ellos mismos.

Los presentes inventores consideran la presentacion de la composicion al mercado en forma de bebida deportiva, bebida energetica, barrita deportiva, o barrita energetica.

La barrita energetica puede adoptar diversas formas. Por conveniencia, se prefiere que el producto alimentario energetico adopte la forma de una caja, cuadrado, cilindro, cadena, pastel, esfera, triangulo, o cualquier otro formato adecuado para el envasado, transporte, manipulacion e ingesta.

De acuerdo con otra realizacion, la composicion se presenta al mercado como producto alimentario funcional.

Los productos que comprenden el nitrato inorganico, nitrito o una combinacion de los mismos se pueden fabricar facilmente por los expertos en la industria de alimentacion, dulces y bebidas o la industria farmaceutica, y las composiciones existentes suplementadas con nitrato, nitrito y otras combinaciones descritas en este documento en cantidades de acuerdo con esta invencion.

Por ejemplo una barrita energetica de acuerdo con la presente invencion puede incluir, ademas de nitrato y opcionalmente nitrito, tambien una variedad de otros componentes, tales como, por ejemplo, frutos secos, productos crujientes, trozos de fruta, chocolate, semillas, y similares. Los frutos secos preferidos son las almendras, cacahuetes, avellanas, anacardos, nueces, pecanas, nueces de Brasil, y similares. Los productos crujientes incluyen arroz crujiente, mafz crujiente, avena, copos de trigo, y similares. El chocolate puede ser cualquier tipo de chocolate o componente comestible similar al chocolate en diversas formas, tales como, por ejemplo, virutas, trozos, escamas de chocolate y similares. Los ejemplos no limitantes de las semillas incluyen semillas de sesamo, girasol, amapola,

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alcaravea, hinojo y similares.

Ademas, se pueden incluir ingredientes alimentarios tradicionales tales como aromas y similares. Por ejemplo, los ingredientes adicionales pueden incluyen sabores naturales y artificiales, edulcorantes, sal, potenciadores del sabor, colorantes, emulsionantes, estabilizantes, conservantes, grasas, y similares.

La presente invencion tambien pone a disposicion un segundo uso no medico del nitrato y/o nitrito inorganico, es decir, para la fabricacion de una composicion para mejorar el rendimiento de un mairnfero en el que el efecto de mejora del rendimiento se manifiesta como una reduccion de VO2 durante el ejercicio ffsico.

Preferentemente, el efecto de mejora del rendimiento se manifiesta tanto como por una reduccion del VO2 durante el ejercicio ffsico como por un aumento significativo en la eficiencia muscular.

De acuerdo con una realizacion de uso anterior, el nitrato y el nitrito se utilizan en un intervalo de relacion de dosis de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1 (nitrato:nitrito), tal como 5:1, 10:1, 30:1, 50:1, 70:1 y 100:1. Preferentemente, la relacion de dosis es de aproximadamente 10:1.

De acuerdo con una realizacion particular, dicho nitrito inorganico se utiliza solo, sin la presencia de nitrato.

De acuerdo con una realizacion de la invencion, la fuente de nitrato/nitrito inorganico se selecciona entre un concentrado o un extracto de verduras que contienen nitrato, o un nitrato inorganico o sal de nitrito. Ejemplos de sales de nitrato y nitrito incluyen, pero no se limitan a sodio, potasio, calcio, zinc, arginina, y amonio. Ejemplos de vegetales ricos en nitratos son verduras de hoja verde, espinaca, remolacha, hinojo, lechuga, col y similares. Como fuentes adecuadas de nitrato se contemplan zumos, pastas, concentrados, etc. de dichos vegetales.

Tambien se pueden utilizar combinaciones de sales de nitrato y nitrito. De acuerdo con una realizacion, el nitrato y el nitrito se administran por via oral en un intervalo de relacion de dosis de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1 (nitrato:nitrito), tal como 5:1, 10:1, 30:1, 50:1, 70:1 y 100:1. Preferentemente, la relacion de dosis es de aproximadamente 10:1. Esto proporcionara los efectos agudos del nitrito tan pronto como se absorba, y a continuacion proporciona un efecto sostenido del nitrato despues de su byconversion en nitrito.

En otra realizacion mas, se utiliza nitrato y/o nitrito inorganico junto con polifenoles. Las caractensticas y efectos promotores de la salud de los polifenoles se han descrito anteriormente. La relacion de la composicion de nitrato y/o nitrito inorganico:compuesto rico en polifenoles se debe seleccionar para obtener suficiente suministro de nitrato/nitrito. Por tanto, la composicion que comprende nitrato/nitrito debe ser de al menos aproximadamente el 10 %, preferentemente de al menos aproximadamente el 20 %, mas preferentemente de al menos aproximadamente el 30 %, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente el 40 % y lo mas preferentemente de al menos aproximadamente el 50 % o incluso mas.

Ejemplos de frutas y zumos de frutas ricos en polifenoles que se pueden utilizar son, pero no estan limitados a, manzana, pera, uva, limon, naranja, lima, melocoton, granada, pomelo, kiwi, pina y jengibre. Tambien se pueden

utilizar bayas y zumo de bayas tales como, pero no limitados a, moras, frambuesas negras, arandanos, arandanos

agrios, frambuesas rojas, cerezas, berenjenas, arandanos rojos, sauco negro, cornijuelo negro, grosella negra, arandanos, moras y fresas. Otras fuentes naturales de polifenoles incluyen, pero no se limitan a, verduras tales como zanahorias, chile, ruibarbo, cebolla. Ademas, los productos de cacao (ricos en flavonoides), te verde o negro, nueces, yerba mate y el cafe son todos ricos en polifenoles. En una forma de realizacion preferida se utiliza remolacha (tal como zumo de remolacha) como fuente de nitrato inorganico junto con uno o varios productos ricos en polifenoles. La relacion de zumo de remolacha: compuesto rico en polifenoles se debe seleccionar para obtener suficiente suministro de nitrato y, por tanto, la parte de zumo de remolacha debe ser de al menos aproximadamente el 10%, preferentemente de al menos aproximadamente el 20%, mas preferentemente de al menos

aproximadamente el 30 %, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente el 40 % y lo mas

preferentemente de al menos aproximadamente el 50 %.

En otra realizacion de la presente invencion se utilizan bacterias no patogenas en combinacion con nitrato y/o nitrito inorganico o la composicion que contiene una mezcla de nitrato y/o nitrito inorganico y compuestos ricos en polifenoles. La combinacion con las bacterias puede estar en forma de bebida tal como un zumo, un yogur, una bebida a base de leche o cualquier otro producto alimentario fermentado. La combinacion con bacterias tambien se puede incluir en diferentes tipos de productos alimentarios funcionales. Las bacterias adecuadas son las denominadas bacterias probioticas, incluidas pero no limitadas a las especies de lactobacilos (por ejemplo l. acidophilus, l. delbrueckii, l. helveticus, l. salivarius, l. casei, l. curvatus, l. plantarum, l. sakei, l. brevis, l. buchneri, l. fermentum, l. reuteri) y bifidobacterias, por ejemplo, pero no limitado a, B. breve, B. bifidum, B. lactis y levaduras probioticas tales como Saccharomyces boulardii. Las bacterias no patogenas adecuadas son, por ejemplo, pero no se limitan a, especies de Staphylococcus, especies de Actinomyces y especies de Rothia. Estos microorganismos se pueden usar tambien en "forma seca".

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La contaminacion de un alimento o bebida que contiene nitrato con bacterias puede resultar en una gran acumulacion de nitrito, debido a las enzimas bacterianas reductoras de nitrato. La ingestion de altos niveles de nitrito puede causar metahemoglobinemia potencialmente grave. En una realizacion se utiliza una composicion rica en nitrato junto con un compuesto que inhibe el crecimiento bacteriano. Dicho compuesto se debe seleccionar a fin de no afectar negativamente al sabor del producto. Idealmente, debe mejorar el sabor y al mismo tiempo aumentar la bioactividad del producto. Una opcion es acidificar el zumo de manera que el pH final sea inferior a aproximadamente 5, y mas preferentemente entre aproximadamente pH 2-4. Esto inhibe y/o suprime el crecimiento bacteriano. Los agentes acidificantes adecuados pueden ser cualquier agente que reduzca el pH e incluyen compuestos artificiales, asf como zumos naturales de, por ejemplo, pero no limitado a, limon o lima, acido ascorbico, acido acetico o vinagre (de manzana, uvas u otras frutas). Se contempla que con el uso de productos naturales se consiga un doble efecto. Ademas de tener un efecto antibacteriano, son ricos en polifenoles, lo que mejora la generacion de NO bioactivo a partir de nitrato/nitrito en la bebida de vegetales. En una realizacion particular, se utiliza un zumo vegetal rico en nitrato (por ejemplo, el zumo de remolacha) junto con un compuesto que inhibe el crecimiento bacteriano.

En otra realizacion de la presente invencion se utiliza una baja concentracion de etanol junto con nitrato y/o nitrito inorganico. Por ejemplo, si la composicion de la invencion esta en forma de lfquido, el contenido de etanol debe estar por debajo de aproximadamente el 5 % (v/v), mas preferentemente por debajo de aproximadamente el 2 % (v/v), y lo mas preferentemente entre aproximadamente el 0,5 y el 1 % (v/v).

En otra realizacion mas de la presente invencion, se utiliza una sal de nitrato y/o nitrito (por ejemplo nitrato de potasio o nitrato de amonio) o una fuente de nitrato natural, incluyendo un polvo vegetal seco, en combinacion con regaliz, por ejemplo regaliz salado (cloruro de amonio). Tambien se prefiere el uso de los polifenoles a esta combinacion. En particular, se puede usar una sal tal como nitrato de potasio, nitrato de sodio o nitrato de amonio para reemplazar en parte o en su totalidad el contenido de sal (tales como cloruro de sodio o cloruro de amonio) del producto de regaliz.

La composicion de la presente invencion se puede fabricar en lfquidos, pastas, barras, polvos, granulados, tabletas efervescentes, comprimidos, capsulas, pastillas, goma de mascar, pastillas u obleas de fusion rapida, comprimidos sublinguales, un aerosol o similares, utilizando metodos convencionales puestos en practica en la industria alimentaria, de dulces y farmaceutica.

Ademas, la composicion tambien se puede fabricar en forma de o como parte de un producto alimentario, tal como un lfquido, una pasta, una barra, una torta, un polvo o un granulado. Por ejemplo, puede estar en forma de producto de alimento fermentado, un alimento funcional, o una bebida deportiva o similar, como se ha mencionado anteriormente. Otra composicion es un tabaco sin humo libre de nicotina y/o rape humedo. Dichos productos deben fabricarse usando metodos convencionales puestos en practica en la industria de alimentos y bebidas, o en la industria farmaceutica.

En una realizacion de la presente invencion se utiliza un nitrato y/o nitrito inorganico en combinacion con un producto de cacao tal como chocolate negro que es rico en flavonoides. Un compuesto rico en nitrato preferido en esta realizacion es el ruibarbo.

En otra realizacion adicional se utiliza de nitrato y/o nitrito inorganico en combinacion con un compuesto que inhibe el crecimiento bacteriano. Una opcion es acidificar el zumo de manera que el pH final sea inferior a aproximadamente 5, y mas preferentemente entre aproximadamente pH 2-4. Esto inhibe y/o suprime el crecimiento bacteriano. Los agentes acidificantes adecuados pueden ser cualquier agente que reduzca el pH e incluyen compuestos artificiales, asf como zumos naturales de, por ejemplo, pero no limitado a, limon o lima, acido ascorbico, acido acetico o vinagre (de manzana, uvas u otras frutas). Se contempla que con el uso de productos naturales se consiga un doble efecto. En una realizacion particular, se utiliza un zumo vegetal rico en nitrato (por ejemplo, zumo de remolacha) en combinacion con un compuesto que inhibe el crecimiento bacteriano.

Los inventores tambien ponen a disposicion un metodo para mejorar no terapeuticamente el rendimiento de un mairnfero, en el que el nitrato y/o nitrito inorganico se administra a dicho mairnfero. Dicho marnffero se selecciona entre un ser humano, un caballo, o un perro, preferentemente un ser humano. Preferentemente, la dosis de nitrato es de aproximadamente 1-1000 pmol de nitrato de sodio /kg de peso corporal/dfa. Correspondientemente, la dosis de nitrito preferentemente es de aproximadamente 0,1 a 100 pmol/kg de peso corporal/dfa.

Mas espedficamente, para el uso de una sal de nitrato por via oral, la dosis es de 0,01 a 10 mmol/kg/24 h, incluso mas preferentemente 0,1 a 1 mmol/kg/24 h. Correspondientemente, la dosis de nitrito es de 0,001-1 mmol/kg/24 h y mas preferentemente de aproximadamente 0,0001-0,1 mmol/kg/24 h.

De acuerdo con una realizacion de la invencion, el nitrato y el nitrito se administran en un intervalo de relacion de dosis de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1 (nitrato:nitrito), tal como 5:1, 10:1, 30:1, 50:1, 70:1 y 100:1. Preferentemente, la relacion de dosis es de aproximadamente 10:1.

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De acuerdo con una realizacion particular, solamente se administra nitrito.

En aun otra realizacion del metodo de la invencion el nitrato y/o nitrito inorganico se administra junto con polifenoles. Las caractensticas y los efectos promotores de la salud de los polifenoles se han descrito anteriormente. La relacion de la composicion de nitrato y/o nitrito inorganico: compuesto rico en polifenoles se debe seleccionar para obtener un suministro de nitrato suficiente. Por tanto, la composicion que comprende nitrato/nitrito debe ser de al menos aproximadamente el 10%, preferentemente de al menos aproximadamente el 20%, mas preferentemente de al menos aproximadamente el 30 %, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente el 40 % y lo mas preferentemente de al menos aproximadamente el 50 % o incluso mas. Ejemplos de productos ricos en polifenoles que se pueden administrar se han descrito anteriormente.

En otra realizacion de la presente invencion se administran bacterias no patogenas en combinacion con nitrato y/o nitrito inorganico o la composicion que contiene una mezcla de nitrato y/o nitrito inorganico y compuestos ricos en polifenoles. Los ejemplos no limitantes de bacterias adecuadas para la administracion se han descrito anteriormente.

En otra realizacion del metodo de la invencion el nitrato y/o nitrito inorganico se administra junto con una baja concentracion de etanol. Por ejemplo, si la composicion de nitrato y/o nitrito inorganico de la invencion esta en forma lfquida, el contenido de etanol debe estar por debajo de aproximadamente el 5 % (v/v), mas preferentemente por debajo de aproximadamente el 2 % (v/v), y lo mas preferentemente entre aproximadamente el 0,5 y el 1 % (v/v).

En aun otra realizacion de la presente invencion, se administra una sal de nitrato o nitrito (por ejemplo nitrato de potasio o nitrato de amonio) o una fuente de nitrato natural, incluyendo un polvo vegetal seco, en combinacion con regaliz, por ejemplo, regaliz salado (cloruro de amonio). Tambien se prefiere la administracion de los polifenoles a esta combinacion. En particular, se puede usar una sal tal como nitrato de potasio, nitrato de sodio o nitrato de amonio para reemplazar en parte o en su totalidad el contenido de sal (tal como cloruro de sodio o cloruro de amonio) del producto de regaliz.

En una realizacion de la presente invencion se administra un nitrato y/o nitrito inorganico en combinacion con un producto de cacao tal como chocolate negro que es rico en flavonoides. Un compuesto rico en nitrato preferido en esta realizacion es el ruibarbo.

Hay razones para creer que los efectos observados del nitrato sobre el rendimiento ffsico implican una reduccion inicial de nitrato a nitrito. Se cree que el propio nitrato es biologicamente inerte y no puede ser metabolizado por las celulas de mairnferos. Sin embargo, despues de la ingestion el nitrato vuelve a entrar en la boca a traves de las glandulas salivales y se reduce con eficacia por bacterias comensales, formando de ese modo el nitrito. En contraste con el nitrato recientemente se ha demostrado que el ion nitrito posee una amplia gama de actividades biologicas.

Los inventores observaron un aumento de nitrito de plasma despues del penodo de tratamiento de nitrato confirmando de ese modo la reduccion in vivo de nitrato como se ha descrito previamente (Lundberg y Govoni 2004, LARSEN, FJ, et al. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. N Engl J Med. 2006, vol. 255, n.° 26, p. 2792-3). Otro hallazgo en apoyo de que el nitrito es bioactivo fue su consumo efectivo durante el ejercicio en contraste con los niveles inalterados del nitrato de plasma. En ultima instancia la bioactividad del nitrito esta probablemente relacionada con su reduccion posterior a NO y, posiblemente, a otros intermedios de nitrogeno estrechamente relacionados. Ademas, recientemente se ha sugerido que el propio nitrito puede afectar directamente a las vfas de senalizacion celulares (Bryan, NS, et al. Nitrite is a signaling molecule and regulator of gene expression in mammalian tissues. Nat Chem Biol. 2006, vol. 1, n.° 5, p. 290-7). Aunque poco probable, en esta primera etapa no se pueden excluir los efectos del propio ion nitrato. Hay varias maneras principales por las que los efectos biologicos de los oxidos de nitrogeno se pueden propagar, incluyendo la alteracion de la funcion de protemas por nitrosilacion, nitracion o la union directa a los restos de protema heme como en la activacion prototfpica de la guanilil ciclasa por el NO.

Estudios anteriores utilizando inhibidores de la NOS para bloquear la produccion de NO endogeno dan algunas indicaciones. Se ha demostrado que la inhibicion de la NOS aumenta el VO2 submaximo en los perros durante el ejercicio, con independencia de la reduccion del flujo sangumeo (SHEN, W, et al., An important signaling mechanism between vascular endothelium and parenchymal cells in the regulation of oxygen consumption. Circulation. 15 de dic de 1995, vol. 92, n.° 12, p. 3505-12, ISHIbAsHI, Y, et al. ATP-sensitive K+-channels, adenosine and NO-mediated mechanisms account for coronary vasodilation during exercise. Circulation Res. 1998, n.° 82, p. 346-359; Shen et al. 1999, supra). El aumento de VO2 durante el bloqueo de la NOS se ha explicado por el hecho de que el NO afecta a la respiracion tisular por la inhibicion reversible de la enzima respiratoria citocromo c oxidasa (Carr & Ferguson 1990, supra; Bolanos et al. 1994, supra; Brown & Cooper 1994, Cleeter et al. 1994, Schweizer y Richter 1994). Otros han relacionado el aumento de VO2 durante el bloqueo de la NOS con un efecto inhibidor del NO sobre la fuga de protones a traves de la membrana mitocondrial interna (BOHUSLAVS'KYI, A, et al. Effect of nitric oxide on the efficiency of oxygen consumption by the working skeletal muscle in fatigue. FiziolZh. 2005, vol. 51, n.° 1, p. 33-42; NAVET, R, et al. Proton leak induced by reactive oxygen species produced during in vitro anoxia/reoxygenation in rat skeletal muscle mitochondria. J Bioenerg Biomembr. 2006, vol.38, n.° 1, p. 23-32; WANG, G, et al. Nitric oxide donors protect murine myocardium against infarction via modulation of mitochondrial permeability transition. Am J

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Physiol Heart Circ Physiol. 2005, vol. 288, n.° 3, p. 1290-5). Si los efectos del nitrato se debieron exclusivamente a la inhibicion de la citocromo c oxidasa, cabna esperar un aumento en el metabolismo anaerobico durante el ejercicio ffsico y una mayor acumulacion de lactato. Sin embargo, a juzgar por los resultados este no era el caso, ya que la concentracion de lactato en plasma era casi identica despues de la suplementacion de nitrato en comparacion con placebo. Los inventores consideran que esto es muy sorprendente.

Los estudios citados que utilizan inhibidores de la NOS todos implican que el NO endogeno esta relacionado en la regulacion del consumo de oxfgeno, pero ha habido pocos intentos de estudiar el efecto de la administracion de NO exogeno. Los estudios con donadores de NO, tales como nitroprusiato y nitroglicerina han mostrado resultados algo divergentes, con una disminucion en el VO2 en algunos casos (RECCHIA, FA, et al., Nitric oxide controls cardiac substrate utilization in; LOKE, K E, et al. Nitric oxide modulates mitochondrial respiration in failing human heart. Circulation. 21 de Sept de 1999, vol. 100, n.° 12, p. 1291-7), sin efecto en un estudio (NUNEZ, C, et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 11 de nov de 2005, vol. 97, n.° 10, p.1063-9) y aumentos en otras configuraciones (DE BACKER, D, et al. Effects of dobutamine on the relationship between oxygen consumption and delivery in healthy volunteers: comparison with sodium nitroprusside. Clin Sci (Lond). 1996, vol.90, no.2, p.105-11).

Varios de los mecanismos propuestos para la reduccion del nitrito a NO descritos anteriormente teoricamente podnan entrar en juego durante el ejercicio ffsico. Por lo tanto, todas estas vfas mejoran en gran medida durante la hipoxia y cuando el pH disminuye, tal como en un musculo activo. Shiva y sus colaboradores demostraron muy recientemente la reduccion de nitrito a NO dependiente de desoximioglobina en homogeneizados de corazon de rata con una inhibicion concomitante de la respiracion mitocondrial (Shiva et al. 2007, supra). Otra via posible incluye la formacion de NO por las propias mitocondrias (KOZLOV, AV, et al. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS Lett. 2 de jul de 1999, vol. 454, n.° 1-2, p. 127-30) o incluso una simple reduccion acida de nitrito en el musculo activo (Zweier et al. 1995, supra, MODIN, A, et al. Nitrite-derived nitric oxide: a possible mediator of 'acidic-metabolic' vasodilation. Acta Physiol Scand. 2001, vol. 171, n.° 1, p. 9-16). Cosby y sus colaboradores describieron la formacion de NO y la vasodilatacion por la reaccion de iones nitrito en circulacion con desoxihemoglobina en la sangre (COSBY, K, et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nat Med. 2003, vol. 9, n.° 12, p. 1498-505). Aunque esta ultima via, y posiblemente tambien la reduccion de nitrito tisular, muy bien podna explicar la reduccion inducida por nitrato descrita recientemente en la presion arterial en reposo (Larsen et al. 2006), todavfa no es evidente como este NO tambien disminuina el consumo de oxfgeno en el musculo activo. Por lo tanto, una inhibicion eficaz de la respiracion mitocondrial, por ejemplo, por NO derivado de la desoximioglobina, de nuevo cabna esperar que produjese la acumulacion de lactato en plasma, que no era el caso.

La eficiencia de los musculos para producir trabajo se ha relacionado con el porcentaje de fibras musculares de tipo I (COYLE, E F, et al. Cycling efficiency is related to the percentage of type I muscle fibers. Med Sci Sports Exerc. 1992, vol. 24, n.° 7, p. 782-8) y el contenido de la protema 3 de desacoplamiento (UCP3) de las fibras musculares (MOGENSEN, M, et al. Cycling efficiency in humans is related to low UCP3 content and to type I fibers but not to mithochondrial efficiency. J Physiol. 2006, vol. 571, n. 3, p. 669-681). Otros factores que podnan contribuir a la eficiencia del movimiento son las caractensticas anatomicas, bioqmmicas y biomecanicas (WILLIAMS, K R. The relationship between mechanical and physiological energy estimates. Med Sci Sports Exerc. 1985, n.° 17, p. 317-25). Por lo tanto, la simple medicion de las diferencias en el VO2 a diferentes cargas de trabajo no es una estimacion optima de la eficiencia muscular debido a que la produccion de energfa para una determinada VO2 depende de la utilizacion de sustratos. Los calculos de eficiencia bruta (GE) incluyen posibles cambios en la relacion de intercambio respiratorio y por lo tanto tienen en cuenta la utilizacion de sustratos. La mejora de la GE despues de la suplementacion con nitrato indica una mayor eficiencia, pero aun asf, no se puede excluir que esta mejora de la eficiencia se origine en un gasto energetico basal reducido (EE). Los calculos de la eficiencia delta (DE) no dependen del EE basal y tambien se basan en todas las cargas de trabajo en conjunto en lugar de una unica carga de trabajo a la vez como en los calculos de la GE. Por lo tanto es plausible esperar que DE sea la estimacion mas valida de la eficiencia muscular en este caso. De hecho, incluso DE mejoro significativamente despues de la administracion de suplementos de nitrato. Es poco probable que la mejora en la eficiencia por el nitrato provenga de factores mecanicos. Los sujetos de este estudio eran todos ciclistas con muchos anos de experiencia de entrenamiento y de competicion. Es improbable que un par de visitas al laboratorio cambiaran su eficiencia de pedaleo en ningun grado significativo. Sobre todo, dado que los sujetos usaron las mismas zapatillas de ciclismo, pedales automaticos y la misma posicion de pedaleo a la que estaban acostumbrados durante el entrenamiento, lo hace aun mas improbable. Mas importante, el procedimiento de asignacion al azar utilizado en este estudio excluye cualquier de dichas diferencias. Marcheal y Gailly (MARCHEAL, G, et al. Effects of nitric oxide on the contraction of skeletal muscle. CellMolLife Sci. 1999, no.55, p.1088-1102) demostro una velocidad de relajacion de las fibras musculares mas rapida en experimentos in situ durante la administracion de un donador de NO, implicando asf un efecto modulador neuromuscular del NO. Queda por demostrar si esto puede mejorar la eficiencia muscular durante el pedaleo.

El hallazgo de que el pulso de oxfgeno a una carga de trabajo determinada disminuye con la administracion de suplementos de nitrato es un efecto directo de la menor demanda de oxfgeno a esa carga de trabajo. Sin embargo, no hay ninguna diferencia en el pulso de oxfgeno a una absorcion de oxfgeno absoluto determinada. La falta de

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efecto del nitrato sobre el VE/VO2 o el pulso de oxfgeno indica que la mejora de la eficiencia tiene su origen en adaptaciones musculares o mitocondriales mas que en adaptaciones centrales en el corazon o los pulmones.

En resumen, los presentes resultados demuestran un coste de oxfgeno mas bajo durante el trabajo submaximo despues de la suplementacion dietetica con nitrato, en cantidades alcanzables a traves de la ingesta de una cantidad no toxica de nitrito. Esto ocurrio sin un aumento acompanante en el lactato en plasma, lo que indica que la produccion de energfa se habfa vuelto mas eficiente. El mecanismo de accion y las dianas principales deben ser aclaradas, pero el proceso implica probablemente la reduccion in vivo de nitrato en oxidos de nitrogeno bioactivos, incluyendo el nitrito y el NO.

Ejemplos

Metodos

Sujetos

Nueve hombres (28 ± 6 anos) sanos bien entrenados (VO2pico 55 ± 3,7 ml x kg-1 x min-1) se ofrecieron como voluntarios para el estudio. Todos los sujetos eran ciclistas o triatletas entrenados y muy acostumbrados a los procedimientos de ensayo. Los inventores en este estudio optaron por utilizar sujetos bien entrenados para evitar los efectos del entrenamiento en las pruebas tales como un mayor vO2pico o una mejor eficiencia mecanica durante el ejercicio submaximo. El protocolo fue aprobado por el comite de etica regional en Estocolmo y todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito antes de la participacion.

Suplementacion dietetica con nitrato

El objetivo del presente estudio era investigar los efectos de dos patrones dieteticos distintos, uno con una ingesta de nitrato mas alta, y uno con una ingesta de nitrato mas baja de lo normal. El estudio presentaba un diseno cruzado doble ciego controlado con placebo. Durante dos penodos de tres dfas, separados por un intervalo de lavado de diez dfas, los sujetos fueron instruidos para evitar todos los alimentos con un contenido de nitrato moderado o alto (todos los vegetales, embutidos, fresas, uvas y te). Ademas, se les pidio que se abstuviesen de alcohol y tabaco. Por lo demas, eran libres de comer cualquier alimento que quisiesen durante los tres dfas de dieta restringida. Los sujetos se asignaron al azar para empezar con la ingestion de 0,1 mmol de nitrato de sodio/kg de peso corporal/dfa disuelto en agua o una cantidad igual de cloruro de sodio (placebo). La dosis diaria se dividio y se ingiere tres veces al dfa. Las diferentes soluciones no se podfan distinguir por el sabor o la apariencia. La dosis diaria de nitrato correspondfa a la cantidad que se normalmente encuentra en 150 a 250 gramos de un vegetal rico en nitrato tales como la espinaca, la lechuga o la remolacha (Lundberg et al., 2004, supra). La ultima dosis de nitrato o placebo fue ingerida por la manana el dfa de la medicion (veanse las principales pruebas a continuacion). El orden entre el penodo de suplementacion con nitrato (NIT) y el penodo de placebo (CON) se equilibro. Durante el penodo de lavado los sujetos no se adhieren a ningun regimen dietetico espedfico.

Protocolo experimental

Las mediciones se llevaron a cabo en un cicloergometro con freno electromagnetico (Monark 839E, Varberg, Suecia) que se modifico con un sillm de carreras y el sistema de pedales a los que los sujetos estaban acostumbrados en los entrenamientos. La bicicleta ergometrica estaba controlada por ordenador, lo que permite una carga de trabajo constante, independientemente de la cadencia para pedalear que eligiese el sujeto. La cadencia de pedaleo fue seleccionada individualmente en el rango de 70-90 rpm, pero se mantuvo constante durante el ensayo para minimizar las diferencias en la produccion de trabajo debido a cambios en los patrones de reclutamiento muscular.

Se midieron la ventilacion pulmonar (Ve), el consumo de oxfgeno (VO2), las emisiones de CO2 (VCO2) y la relacion de intercambio respiratorio (RER) a intervalos de 10 segundos por un analizador de gases computarizado (SIMA 2001, Odense, Dinamarca) conectados a un caudalfmetro mediante el cual respiraban los sujetos a traves de una boquilla y un tubo de plastico. La frecuencia cardfaca (FC) se registro continuamente durante las pruebas con un monitor de ritmo cardfaco portatil Polar (S610, Polar, Kempele, Finlandia). Se recogieron muestras de sangre capilar (20 |jl) de la yema del dedo y se analizaron para el lactato ([Hla]) utilizando un Biosen C-Sport Line Analyser (EKF diagnostics, Magdeburgo, Alemania). Se determino la concentracion de hemoglobina ([Hb]) en reposo con sangre capilar tomada de la yema del dedo y se analizo con un dispositivo de medicion de Hb (Hemocue, Angelholm, Suecia). El hematocrito (Hct) se determino mediante la centrifugacion de sangre capilar a 12.000 rpm durante tres minutos.

Pruebas preliminares:

Cada sujeto acudio al laboratorio dos veces en un penodo de dos semanas antes de las primeras pruebas principales. La primera prueba preliminar se realizo para que el sujeto se familiarizase con el ergometro de la bicicleta y el procedimiento de prueba. Los sujetos realizaron una prueba preliminar a cinco niveles submaximos con cada nivel que dura cinco minutos. No hubo descanso entre los diferentes niveles submaximos. Se midio el VO2 de

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forma continua con la AMIS 2001. Al final de cada nivel submaximo se tomo sangre capilar de la yema del dedo y posteriormente se analizo para [Hla]. A cada carga de trabajo los sujetos calificaron su esfuerzo percibido en la escala RPE de Borg (Borg, G. Perceived exertion as an indicator of somatic stress. Scand J Rehabil Med. 1970, vol. 2, n.° 2, p. 92-8), se calificaron tanto el esfuerzo central como muscular. Despues de ocho minutos de recuperacion, se pidio al sujeto que pedalease durante el mayor tiempo posible a una carga de trabajo correspondiente a su absorcion maxima de oxfgeno calculada (Astrand, PO, et al. Textbook in work physiology. New York: McGraw-Hill Book Company, 1970. P.619). Durante esta prueba, se midio el VO2pico real del sujeto y si el sujeto era capaz de pedalear durante mas de siete minutos, se anadio una potencia extra de 20-30 vatios cada minuto hasta el agotamiento. Uno y tres minutos despues de la prueba maxima se tomaron muestras de sangre capilar de la punta del dedo para el analisis de [Hla].

Antes de la segunda prueba preliminar, los niveles submaximos se ajustaron de manera que correspondiesen a 45, 60, 70, 80 y 85 % del VO2pico. La tasa maxima de trabajo tambien se ajusto, en caso necesario, de modo que el tiempo hasta el agotamiento se mantuvo entre cuatro y siete minutos.

Pruebas principales:

Los sujetos se abstuvieron de hacer mucho ejercicio tres dfas antes de las pruebas principales y evitaron todo ejercicio el dfa antes de las pruebas. Tambien se les pidio que comiesen su ultima comida ligera al menos 3 horas antes del comienzo de las pruebas. Cuando los sujetos llegaron al laboratorio recibieron su ultima dosis de placebo o nitrato y se les permitio descansar en la posicion supina durante 60 minutos antes del comienzo de la prueba.

Todos los sujetos utilizaron un procedimiento de calentamiento normalizado de cinco minutos de pedaleo a 100 vatios, seguido de cinco minutos de descanso. Las pruebas submaximas y maximas se realizaron de la misma manera que la segunda prueba preliminar con cinco cargas de trabajo submaximas de cinco minutos de duracion cada una, sin descanso entre los diferentes niveles. Se utilizaron cargas de trabajo identicas en las dos pruebas principales. Se extrajo sangre venosa (9 ml) en el descanso de 45 minutos despues de que se hubo ingerido ultima dosis de nitrato/placebo y de nuevo inmediatamente despues de la prueba de VO2pico. La sangre se puso en un bano de hielo y se centrifugo en los siguientes cinco minutos a 1300 rpm y 4 °C. El plasma se separo y se mantuvo a - 80 °C hasta que se analizo para determinar sus concentraciones de nitrato y nitrito mediante un ensayo de quimioluminiscencia como se ha descrito previamente (Lundberg 2004, supra).

Estadfstica y calculos:

Los resultados se expresan como medias ± desviacion tfpica (media ± SD). Se utilizaron pruebas t pareadas para evaluar la diferencia entre los ensayos con nitrato y con placebo. El nivel de significacion se establecio como p = <0,05.

La eficiencia bruta (GE) se define como la carga de trabajo dividido por el gasto de energfa real (EE). El EE a su vez se calcula con la ecuacion de Brouwer (Brouwer, E. On simple formulae for calculating the heat expenditure and the quantities of carbohydrate and fat oxidized in metabolism of men and animals, from gaseous exchange (Oxygen intake and carbonic acid output) and urine-N. Acta Physiol Pharmacol Neerl. 1957, n.° 6, p. 795-802). La eficiencia Delta (DE) se define como el aumento de la frecuencia de trabajo dividido por el aumento de EE (Gaesser, GA, et al.). La DE se baso en las cuatro cargas de trabajo mas bajas y se analizo mediante regresion lineal. El pulso de oxfgeno se define como el VO2/FC.

Resultados:

Presion arterial en reposo:

La presion arterial sistolica media en reposo era mas baja despues de la administracion de suplementos de nitrato (112 ± 8 mmHg) en comparacion con el placebo (120 ± 5,9, p <0,01). La presion arterial diastolica tambien fue mas baja despues de la administracion de nitrato (68 ± 5,5 mm Hg) en comparacion con el placebo (74 ± 6,8 mmHg, p <0,01). Partes de estos hallazgos se han publicado como comunicacion separada (Larsen et al. 2006).

Valores sangumeos:

No se observo ningun cambio en [Hb] en reposo (NIT 152 ± 11, CON 153 ± 11 g x I-1, p = 0,87) o inmediatamente despues de la prueba de VO2pico (NlT 163 ± 13, cOn 161 ± 13 g x I-1, p = 0,27). Tampoco hubo ningun cambio en el valor del hematocrito en reposo (Nit 42 ± 4, CON 43 ± 3 %, p = 0,19) o despues de la prueba de VO2pico (NIT 46 ± 4, CON 47 ±4 %, p = 0,6).

Los niveles plasmaticos de nitrato en reposo fueron 27 ± 6,9 pM en Con y 182 ± 55 en NIT (p = <0,01). Los niveles de nitrato inmediatamente despues de la prueba de trabajo maximo fueron de 29 ± 6,1 en CON y 175 ± 61 pM en NIT (p = <0,01). El nitrato en plasma no cambio durante el ejercicio, ya sea en NIT o CON (p = 0,8). Los niveles de nitrito en reposo fueron 124 ± 28 en CON y 226 ± 87 nM en NIT (p = <0,01). Inmediatamente despues de la prueba

de trabajo maximo los niveles de nitrito fueron 111 ± 29 en CON y 137 ± 48 en NIT (p = 0,17). La disminucion de las concentraciones de nitrito durante el ejercicio fue mas pronunciada en NIT que en cOn (Vease Figura 2).

Parametros de trabajo:

5

Despues de la administracion de nitratos el VO2 fue significativamente menor durante las cinco cargas de trabajo correspondientes al 45-80 % del VO2pico en comparacion con el penodo de placebo (Fig. 3). La diferencia mas significativa se observo en el 80 % del VO2pico (NlT 3,44 ± 0,31 I x min-1 vs CON 3,61 ± 0,31 I x min-1, p = 0,003, Fig 4). En promedio el VO2 fue de 0,15 I x min-1 mas bajo en los ensayos NIT sobre las cinco cargas de trabajo 10 submaximas. No hubo diferencias en la frecuencia cardfaca (FC) entre los ensayos NIT y CON (vease Fig. 3). El pulso de oxfgeno tiende a disminuir a partir de 21,0 ± 2,0 durante CON a 20,3 ± 1,9 ml x latido-1 (p = 0,08). No se encontraron diferencias entre el NIT y CON en [Hla] (Fig 5), Ve, Ve/VO2 o la relacion de intercambio respiratorio (RER) durante cualquiera de las cargas de trabajo submaximas. La eficiencia bruta promedio mejoro del 19,7% durante CON al 21,1 % durante el NIT (p = 0,02). La eficiencia Delta (DE) aumento significativamente del 22,1 ± 15 1,6 % durante CON en comparacion con el 22,9 ± 1,9 % durante NIT (p = 0,04).

A la carga de trabajo maxima valores de los VO2pico para los ensayos NIT y Con fue de 4,49 ± 0,44 y 4,61 ± 0,28 l x min-1, respectivamente. No se observaron diferencias significativas ni en VEmax (NIT 182 ± 21,4 vs 21,7 ± CON 186 l x min-1, p = 0,5), FCmax (NIT 189,8 ± 7,0 vs CON 190,3 ± 7,5 latidos x min-1, p = 0,94) o la carga maxima de trabajo 20 (NIT 360,6 ± 32,8 vs 358,9 CON ± 32,3 vatios, p = 0,35). No hubo diferencias entre NIT y CON en el mdice de esfuerzo percibido (escala RPE de Borg) a cualquier carga de trabajo (submaxima o maxima).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la mejora no terapeutica del rendimiento de un mai^ero, dicha mejora del rendimiento que se manifiesta como un menor consumo de oxfgeno (VO2) durante el ejercicio ffsico, caracterizado por que se administra nitrato inorganico, nitrito inorganico o una combinacion de los mismos por via oral, en el que la dosis de nitrato es de 0,01 a 10 mmol de nitrato de sodio/kg de peso corporalMa, la dosis de nitrito es de 0,001 a 1 mmol/kg de peso corporalMa, y en el que el intervalo de la relacion de dosis cuando el nitrato y el nitrito se administran en combinacion es de 5:1 a 100:1 (nitrato:nitrito), en el que dicho rendimiento se mejora en comparacion con el rendimiento ffsico de dicho mairnfero durante dicho ejercicio ffsico, en ausencia de dicha administracion de nitrato y/o nitrito inorganico.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho nitrato y/o nitrito se administra junto con polifenoles.
3. El uso de nitrato o nitrito inorganico o una combinacion de los mismos para mejorar no terapeuticamente el rendimiento de un mai^ero, dicha mejora del rendimiento que se manifiesta como un menor consumo de oxfgeno (VO2) durante el ejercicio ffsico, caracterizado por que el nitrato, nitrito inorganico o una combinacion de los mismos se administra por via oral, en el que la dosis de nitrato es de 0,01 a 10 mmol de nitrato de sodio/kg de peso corporal/dfa, la dosis de es nitrito de 0,001 a 1 mmol/kg de peso corporal/dfa, y en el que el intervalo de relacion de dosis cuando el nitrato y el nitrito se administran en combinacion es de 5:1 a 100:1 (nitrato:nitrito), en el que dicho rendimiento se mejora en comparacion con el rendimiento ffsico de dicho marnffero durante dicho ejercicio ffsico, en ausencia de dicha administracion de nitrato y/o nitrito inorganico.
4. El uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que dicha composicion tiene forma de ffquido, pasta, barra, torta, polvo, granulado, comprimido efervescente, comprimido, capsula, gragea, goma de mascar, comprimido u oblea de fusion rapida, comprimido sublingual o aerosol.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que dicha composicion tiene forma de bebida deportiva, bebida energetica, barrita deportiva o barrita energetica.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la fuente de nitrato inorganico se selecciona entre un concentrado, un extracto o un zumo de verduras que contienen nitrato o una sal de nitrato inorganico.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que dicho nitrato inorganico se utiliza en combinacion con polifenoles.
8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que dicho nitrato inorganico se utiliza en combinacion con bacterias vivas capaces de mejorar la reduccion de nitrato o nitrito.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que dicho nitrato inorganico se utiliza en combinacion con etanol en una cantidad por debajo del 5 % (v/v), preferentemente por debajo del 2 % (v/v), mas preferentemente entre el 0,5-1 % (v/v).