ES2619324T3 - Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos - Google Patents
Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos Download PDFInfo
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Abstract
Medio para el cultivo de células de mamíferos caracterizado porque, además de los nutrientes habituales de los medios de cultivos basales para cultivo de células de mamíferos, comprende el sobrenadante de la fracción I del método de Cohn.
Description
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DESCRIPCION
Medios para cultivo de celulas de mamlferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de cohn y uso de los mismos
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un suplemento para su uso en medios de cultivo de celulas de mamlferos. Dicho suplemento se obtiene a partir del plasma desfibrinado (sustancialmente libre de fibrinogeno y fibrina) de origen humano y, cuando es adicionado como suplemento de medios de cultivo proporciona los diferentes nutrientes y factores para un adecuado mantenimiento y/o proliferacion de celulas cultivadas.
Antecedentes
Los cultivos celulares se utilizan en la industria biotecnologica principalmente para la produccion de protelnas recombinantes y anticuerpos monoclonales. Recientemente tambien se ha desarrollado una tecnologla para el cultivo de diferentes tipos de celulas troncales para su utilizacion en la terapia celular, en combinacion o no con la terapia genica.
Para poder cultivar y mantener con exito las diferentes llneas celulares se necesita un medio que imite las condiciones del medio interno donde se encontrarlan estas celulas in vivo. Generalmente, el medio de cultivo consta de un medio basal que garantiza el pH, los nutrientes y las sales y se pueden anadir una serie de suplementos que permiten la proliferacion celular. Uno de los suplementos mas utilizados es el suero sangulneo de origen animal. El origen animal de este suero puede implicar serias restricciones para su utilizacion en la obtencion de productos para uso en humanos, ya que al reconocer los residuos de origen animal como antlgenos extranos se pueden originar reacciones adversas en los receptores. Ademas, los sueros animales poseen el inconveniente de que su composition no es definida, pues existe una gran variabilidad entre fabricantes por el uso de diferentes razas animales. Tambien, debido al procedimiento de obtencion, existe una gran variabilidad lote a lote, lo que implica que puedan ocurrir grandes variaciones en la capacidad de crecimiento y en la produccion de un cultivo determinado.
La principal dificultad para el establecimiento de las llneas celulares es obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar el medio natural, como extractos embrionarios, hidrolizados de protelna o sueros. Un primer grupo de medios, tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, H. (1955). "The specific aminoacid requirements of mammalian cells (strain L) in tissue culture". J. Biol. Chem. 214 : 839.) y el mas complejo 199 de Morgan y col. (Morgan, J.G., Morton, J.H. y Parker, R.C. (1950). "Nutrition of animal cells in tissue culture. I Initial studies on a synthetic medium". Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 : 1.) eran medios definidos pero que precisan de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%.
A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios mas complejos como NCTC 109 (Evans, V.J., Bryant, J.C., Fioramonti, M.C., McQuilkin, W.T., Sanford, K.K., y Earle, W.R. (1956), "Studies of nutrient media for tissue C cells in vitro. I A protein-free chemically defined medium for cultivation of strain L cells". Cancer REs. 16 : 77.), 135 (Evans, V.J. y Briant, J.C. (1965). "Advances in tissue culture at the National Cancer Institute in the United States of America". En "Tissue culture", edit. por C.V. Ramakrishnan (ed.). W. Junk. The Hague. pp. 145-167.), Ham F10 y F12 (Ham, R.G. (1963). "An improved nutrient solution for diploid Chinese hamster and human cell lines". Exp. Cell REs. 29 : 515., Ham, R.G. (1965). "Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined synthetic medium". Proc. Natl. Sci. USA 53 : 288.), serie de los MCDB (Ham, R.G. y McKeehan, W.L. (1978). "Development of improved media ans culture conditions for clonal growth of normal diploid cells". In vitro 14 : 11-22.) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes, D. y Sato, G. (1980). "Methods for growth of cultured cells in serum free-medium". Anal. Biochem. 102 : 255-270).
La aproximacion recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentration de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir.
Despues de anos de investigation en la composicion de los medios, la election de estos sigue siendo emplrica.
Los principales medios empleados y sus aplicaciones son:
- Medio Basal de Eagle (EBM): es un medio elemental con solo los aminoacidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacion con suero bovino fetal al 10%. Se utiliza para el crecimiento de fibroblastos de raton y celulas HeLa.
- Medio Mlnimo Esencial de Eagle (MEM): es el medio de uso mas corriente, contiene mas aminoacidos y en mayor concentracion que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicion de suero (10%).
- R.P.M.I. 1640: es un medio disenado para el crecimiento de linfoblastos y llneas celulares leucemicas en suspension. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados.
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- Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM): contiene cuatro veces la concentracion de aminoacidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccion de hibridomas suplementado con HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) o HT (hipoxantina-timidina).
- Modificacion de Iscove del medio DMEM (IMDM): es un medio muy completo que incluye en su formulacion albumina bovina, transferrina, selenito, entre otros elementos. Es muy util para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambien sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.
- McCoy 5a: es un medio disenado para el crecimiento de llneas celulares diploides tanto de rata como humanas.
- Medio L-15 de Leibovitz: es un medio utilizado para el cultivo de virus.
- Medio F-10 de Ham: es un medio utilizado para el crecimiento de llneas celulares humanas, debe ser suplementado con protelnas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es util para el cultivo de celulas amnioticas.
- Medio F-12 de Ham: es un medio util para el crecimiento de llneas celulares con suplementos protelnicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.
- Medio 199: es un medio muy utilizado para el cultivo de celulas no diferenciadas y estudio de cromosomopatlas. Todo medio de cultivo esta formado por los siguientes elementos :
1. Soluciones salinas equilibradas (BSS).
2. Aminoacidos.
3. Vitaminas.
4. Otros suplementos organicos de bajo peso molecular (nucleosidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, llpidos).
5. Hormonas y factores de crecimiento (suero).
6. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibioticos y antifungicos).
En los medios no definidos, las hormonas y factores de crecimiento suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El mas utilizado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en llneas mas exigentes, y el suero humano en llneas humanas.
La utilizacion de suero es problematica pues a pesar de que la composicion del suero es conocida en parte, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables que pueden influir notablemente en el cultivo. Ademas, el suero varla de lote a lote, debido a la variabilidad de la propia tecnica de obtencion de la sangre, del proceso de obtencion del suero (coagulacion de la sangre) y de las condiciones de separacion del suero, as! como la diferencia entre las distintas fuentes de suero. Ademas, cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. Por otra parte, si se deben purificar productos del medio de cultivo, la presencia de componentes variables en el suero dificulta notablemente estos procesos.
Algunos factores sericos, como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF), estimulan la proliferacion de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados, especialmente si se produce una gran variacion en su contenido.
En conjunto, la inclusion de suero en los medios de cultivo supone un gran inconveniente para la estandarizacion de protocolos experimentales y de production de celulas. Por ello se realizan importantes esfuerzos para el establecimiento de medios de composicion definida para el crecimiento celular. Esto, ademas de la reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. La desventaja de estos medios es que en muchos casos el crecimiento de las celulas es menor y las llneas celulares permanecen viables menos generaciones.
Se han realizado diferentes intentos para conseguir suplementos de los medios de cultivo celulares que eviten los problemas que representan los sueros empleados en la actualidad. Entre ellos se han ensayado diferentes fracciones procedentes del plasma humano y existen importantes contradicciones en el estado de la tecnica en cuanto a la utilidad de las diferentes fracciones del plasma humano.
De forma general, se han ensayado diferentes fracciones del plasma humano procedentes del fraccionamiento plasmatico segun el metodo de Cohn (Cohn E.J. et al; J Am Chem Soc, 1946) y variaciones del mismo (Kistler and Friedli, Nischmann; en Curling, JM ed, Methods of plasma fractionation. Academic Press 1980), estando todos estos ensayos dirigidos al uso de los diferentes precipitados obtenidos en el fraccionamiento, especialmente las fracciones II+III, III, IV (IV1 o IV4) y V, o sus equivalentes en las diferentes variaciones del metodo de fraccionamiento.
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El objetivo inicial de la separacion de las mencionadas fracciones (precipitado) es la obtencion de un precipitado enriquecido en una determinada proteina, como punto de partida para la purification de la misma, por ejemplo g-globulinas y a y b-globulinas en el caso de las fracciones II+III o III; a-globulinas y transferrina en la fraction IV y albumina en la fraccion V. Por ello en estas fracciones se presenta de forma mayoritaria un unico tipo de proteina, estando presente otras proteinas como impurezas, generalmente en mucha menor cantidad. El uso de estas fracciones en cultivos celulares implica la adicion al medio de cultivo de un tipo de proteina mayoritaria y de una variedad de proteinas que la acompanan como impurezas, entre las cuales se deben situar las que requieren las celulas en el medio de cultivo para que el uso de dicho material tenga exito. Esta ha sido hasta la actualidad una forma obvia pero ineficiente de suplementar los medios de cultivos celulares. Seguramente esta sea la causa de la disparidad de resultados obtenidos, ya que pequenas variaciones en el metodo de fraccionamiento no variaran significativamente la recuperation de la proteina mayoritaria, pero podran introducir gran variabilidad en la recuperation de las diferentes proteinas acompanantes. Por ejemplo, la obtencion de la fraccion II+III, segun el metodo de Cohn, se realiza a una concentration de etanol de entre 20 y 25% a -5°C y pH 6,9. Segun el metodo de Nitschmann, partiendo de un material equivalente, se precipita a una concentracion de etanol de 19% a -5°C y pH 5,8. Con esta variation de pH se obtienen fracciones con caracteristicas diferentes, especialmente en el contenido de g-globulinas y otras proteinas acompanantes.
Por otra parte la utilization de sobrenadantes, comparada con la utilization de fracciones precipitadas, presenta las ventajas adicionales, entre otras, de que mantiene una elevada concentracion de albumina en el medio y, sobre todo, evita la perdida de componentes (p.ej., hormonas, citoquinas, lipidos...) que son importantes para el crecimiento celular y que podrian no estar presentes en los precipitados o bien perder su funcionalidad (inactivarse) en presencia de concentraciones de alcohol superiores al 20%, como las empleadas para precipitar la fraccion II+III en determinadas condiciones (25%) o las fracciones IV1+IV4 y V (40% de etanol).
El documento EP0143648 (Macleod) describe el uso de las fracciones II+III, III, IV1 y IV4 como suplemento de los medios de cultivo en sustitucion del suero animal. Tambien indica que ni la fraccion II ni la fraccion V presentan utilidad para este uso. En todos los casos, este documento se refiere exclusivamente a las fracciones precipitadas en el fraccionamiento de Cohn o sus variantes. Ademas, este documento da a conocer un proceso para obtener el material adecuado como suplemento de medios de cultivo a partir de las fracciones anteriormente mencionadas. Este proceso consiste basicamente en la suspension del precipitado en agua y homogenization del mismo. Posteriormente, se procede a ajustar el pH para conseguir una mejor disolucion de las proteinas y para llevarlo a las condiciones fisiologicas que permitan el crecimiento de las celulas. Por otro lado, este proceso contempla, ademas, la elimination de la g-globulina presente mediante precipitation con polietilenglicol y la separacion del material de bajo peso molecular mediante cromatografia de exclusion molecular. Por lo tanto, la eficacia del material preparado de esta manera es muy dependiente del proceso especifico de preparation.
En otro documento de Macleod (Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, Vol. 37; 1988) indica que las fracciones II, III y IV producen poco o ningun efecto en el crecimiento celular, debido posiblemente a la presencia de inhibidores del crecimiento y dirige la atencion a la fraccion IV4 como material ideal para suplementar medios de cultivo.
La EP 0 440 509 (Macleod) describe un suplemento para medios de cultivo celulares basado en la fraccion IV o en la fraccion II+III de Cohn, y el proceso para su obtencion. Mediante el proceso descrito se obtiene un producto sustancialmente libre de inmunoglobulinas, inactivado de virus y estable. Se procede a la separacion de la inmunoglobulina por precipitacion con Polietilenglicol y a la inactivation de virus por pasteurization, en presencia de sorbitol como estabilizante. Este proceso es especialmente aplicable a la fraccion IV (IV1 o IV4).
El documento EP 0264748 (Antoniades) describe el sobrenadante de la fraccion V de Cohn como suplemento de medios de cultivo celulares en sustitucion del suero animal. Segun este documento, la ventaja de este material es que no tiene coste y que puede ser calentado a 60°C durante 20 horas.
El sobrenadante de la fraccion V es el material final de desecho del fraccionamiento de Cohn, por lo que su uso obviamente no presenta un coste economico como detrimento en el rendimiento de dicho fraccionamiento. Este material presenta un alto contenido de etanol (40%), que es altamente toxico, y que en este documento no se menciona como debe ser eliminado. Por otra parte, para el tratamiento descrito a 60°C deberia ser necesaria la estabilizacion de la proteina presente, pero tambien se obvia este detalle en el documento, con lo que la invention es dificilmente realizable tal y como esta descrita. Tampoco debe despreciarse el efecto desnaturalizante del etanol a una concentracion tan elevada como este caso.
La solicitud de Patente PCT WO 94/18310 (Mankarious) describe un metodo para producir un suplemento de los medios de cultivo celulares a partir de la fraccion IV4 de Cohn. Este metodo contempla la suspension de la fraccion IV4 y posterior clarification y tambien la inactivacion o eliminacion de virus, por pasteurizacion y/o filtration.
La patente GB 2 166 756 A describe un metodo para el cultivo de celulas de bazo para la production de interferon. Este metodo se basa en un medio de cultivo RPMI que es suplementado con una fraccion serica obtenida a partir suero o plasma al que se ha eliminado el fibrinogeno y que se caracteriza por que se le ha extraido la prealbumina y
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las gammaglobulinas (pag. 1, ilneas 30-34). En una realizacion preferente, esta fraccion se purifica por precipitacion con alcohol entre el 10 y el 20 %, a un pH de 5.85 (pag. 1, llneas 37-38). En una realizacion particular (obtencion de la fraccion EPF), el sobrenadante usado como medio de cultivo se obtiene a una concentracion de etanol del 19 % a un pH de 5.85 (pag. 2, llneas 44-45). El sobrenadante obtenido se dializa con objeto de eliminar el etanol, siendo posteriormente liofilizado para su conservacion. Opcionalmente se liofiliza sin dialisis previa, con lo que tambien se elimina el etanol. Segun los inventores, con un medio de cultivo (RPMI) suplementado con dicha fraccion se obtiene una excelente produccion de interferon. En la precipitacion alcoholica del plasma, las condiciones de proceso (concentracion de etanol, pH, fuerza ionica del medio, temperatura y concentracion de protelna) deben fijarse cuidadosamente para mantener en solucion determinadas protelnas e insolubilizar otras con objeto de que precipiten y as! proceder a su separacion. Variaciones en alguna o algunas de las mencionadas condiciones produciran diferencias importantes en el producto obtenido, siendo la concentracion de etanol y el pH, los factores determinantes de la composicion del precipitado y sobrenadante obtenidos.
Se han realizado otros intentos de suplementar medios de cultivo celulares a partir de suero o fracciones sericas de origen humano, en sustitucion del suero fetal bovino, como muestran los documentos WO 2004/055174, EP 1820852 o CA 1177424. El suero obtenido a partir de sangre total, o a partir de plasma, no puede equipararse a una fraccion plasmatica concretamente definida y caracterizada y presenta el inconveniente de la falta de reproducibilidad lote a lote. Ademas, ninguno de estos documentos consigue definir y caracterizar la composition exacta del material utilizado. De esta manera, se siguen presentando gran parte de los problemas asociados al uso del suero de origen animal.
Kwok y otros dieron a conocer el uso de plasma de embarazadas en sustitucion del suero fetal bovino para el cultivo de un tipo especlfico de celulas, atribuyendo su efecto a la presencia de factores desconocidos. De igual manera, postula un efecto sinergico de la albumina humana en ese tipo de cultivo. Es evidente para un experto en la materia que con el uso de plasma de embarazadas se busca la presencia de factores de crecimiento celular equiparables a los del suero fetal, pero la homogeneidad de este material no es comparable a las mezclas de plasma de miles de donantes, segun se describe mas adelante.
Como se ha descrito anteriormente, se han realizado numerosos intentos para sustituir el suero animal como suplemento de medios para el cultivo celular. Una parte de estos intentos se ha realizado a partir de fracciones de plasma humano, especialmente de fracciones del metodo de Cohn. A pesar de ello, en la actualidad se sigue utilizando comunmente el suero animal como suplemento de medios de cultivo de celulas de mamlferos y se ha fracasado en los intentos de sustituirlo por un derivado del plasma humano.
Por todo lo anteriormente mencionado, se deduce que en el estado de la tecnica actual no se dispone de un material de origen humano que sea util como suplemento de medios de cultivo celulares, que sea, ademas, seguro frente a la trasmision de agentes patogenos, que pueda ser obtenido a escala industrial con un coste y un rendimiento aceptable, que presente una adecuada uniformidad lote a lote y que tenga una calidad de grado farmaceutico.
Description de la invention
Los inventores han realizado investigaciones encaminadas a la sustitucion del suero de origen animal como suplemento de medios de cultivo por fracciones del plasma humano y han encontrado, de manera sorprendente, que partiendo de un sobrenadante del fraccionamiento de Cohn, especlficamente el sobrenadante de la fraccion I, es posible suplementar medios de cultivo celulares, obteniendo excelentes resultados en cuanto a crecimiento celular. El uso de este material soluciona los problemas antes mencionados, ya que es de origen humano, se obtiene de forma industrial bajo normas de correcta fabrication (GMPs), con un coste y rendimiento aceptables, presenta una adecuada uniformidad y reproducibilidad lote a lote y posee una calidad de grado farmaceutico. Ademas, este material puede ser tratado con metodos que eviten la transmision de patogenos.
Para la preparacion de estos derivados se procede segun se describe a continuacion.
En primer lugar, se obtiene plasma humano de donantes sanos al que se anade una solucion anticoagulante conteniendo, en una utilization preferente de la invencion, solamente citrato sodico en cantidad suficiente para evitar la coagulation del plasma. La adicion de sustancias (p.ej.: carbohidratos como la glucosa) destinadas a la mejor conservacion de las celulas sangulneas no es imprescindible, puesto que el plasma empleado en la invencion esta sustancialmente libre de celulas, al poderse haber obtenido por plasmaferesis en presencia de anticoagulante, en lugar de por donation de sangre total.
Las cantidades de anticoagulante, as! como otras normativas que debe cumplir el procedimiento de obtencion, almacenamiento y manipulation de plasma humano estan descritas en normativas internacionales de caracter publico que afectan a la industria fraccionadora del plasma humano, como son, por ejemplo, el “Code of Federal Regulations” de los EE.UU. de America, las directrices y normativas de la Administration Federal de los Farmacos y Alimentos de los EE.UU. de America (Food and Drug Administration, FDA) y de la Agencia Europea de Evaluation de Medicamentos (European Medicines Evaluation Agency, EMEA), as! como en las directrices y normativas de la Conferencia Internacional de Armonizacion farmaceutica (International Conference of Harmonization, ICH) y de las
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farmacopeas internacionales, por ejemplo, las Farmacopeas Europea, japonesa o de los EE.UU. de America, e incluyen tambien las normas conocidas como Normas de Correcta Fabrication actuales (current Good Manufacturing Practices, cGMP). En adelante este conjunto de normativas se referiran como “el conjunto de normativas que afectan al fraccionamiento del plasma humano con fines farmaceuticos”. Dicho conjunto de normativas tambien son de aplicacion en las etapas de la invention que se describen a continuation.
Una vez obtenido el plasma humano, se congela, almacena y transporta de acuerdo con el conjunto de normativas que afectan al fraccionamiento del plasma humano con fines farmaceuticos y, en una utilization preferente de la invencion, especlficamente de acuerdo con los requerimientos de la monografla 0853 de la Farmacopea Europea. Cada unidad (donation) de plasma se analiza para descartar la presencia de marcadores de infection vlrica en los donantes, que previamente han sido sometidos a cuestionarios y examenes flsicos de acuerdo con las normativas mencionadas anteriormente. En aplicacion preferente de la invencion, el plasma de un posible donante no se emplea hasta que el donante ha sido sometido al procedimiento de evaluation dos veces en un intervalo de tiempo inferior a 6 meses, momento en el que el donante pasa a estar “cualificado” (“qualified donor”).
En una aplicacion preferente de la invencion, muestras obtenidas de cada donacion se analizan para descartar la presencia de marcadores de infeccion como, por ejemplo, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), los virus de hepatitis B y C (VHB y VHC) y otros virus patogenos para el hombre. Forma parte de la invencion un almacenamiento controlado de las donaciones de plasma durante un periodo no inferior a 60 dlas, preferentemente no inferior a 90 dlas, que permitirla retirar donaciones previas si un donante, previamente sano, diese indicios, con posterioridad a la donacion, de infeccion por agentes patogenos u otros factores de riesgo sanitario. En una aplicacion preferente de la invencion, los analisis de las muestras de cada donacion se repiten una o varias veces tras preparar mezclas piloto (“minipools” o “pilot pools”) de un numero variable de donaciones que, por ejemplo, pueden oscilar entre l0 y 10000, preferentemente entre 90 y 2000 y mas preferentemente entre 100 y 1000. Para estas repeticiones de analisis se pueden emplear metodos de amplification del material genetico de los virus como, por ejemplo, la reaction en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain reaction, PCR) u otros metodos incluidos genericamente dentro de los conocidos como analisis de acidos nucleicos (Nucleic Acid Testing, NAT).
Una vez completados todos los analisis y el periodo de almacenamiento controlado (inventory hold), tras descartar las unidades no aptas segun los analisis, el plasma puede ser utilizado en las etapas siguientes de la invencion.
La siguiente etapa consiste en descongelar donaciones, en numero no inferior a 100 unidades, preferentemente superior a 1000 unidades y mas preferentemente superior a 4000 unidades. La descongelacion se puede realizar, en una aplicacion preferente de la invencion, entre 0 y 4 °C de temperatura. Las donaciones se mezclan durante el proceso de descongelacion dando lugar a una mezcla plasmatica (“plasma pool”). Opcionalmente, se puede separar un material que precipita, ya que es inestable debido al proceso de descongelacion y que suele describirse como “crioprecipitado” y es rico en factor von Willebrand (FVW), factor VIII (FVIII), fibrinogeno (FBN), fibronectina (FNC) y otras protelnas.
A continuacion, en una utilizacion preferente de la invencion, se anade al plasma etanol (96 %) de grado farmaceutico hasta alcanzar una concentration de aproximadamente el 8 % (volumen/volumen). Para evitar la desnaturalizacion de protelnas debida al proceso exotermico de disolucion del etanol en el plasma, la adicion se realiza con un caudal de adicion controlado. Simultaneamente y con el mismo objetivo, la temperatura del pool de plasma se hace descender gradualmente hasta aproximadamente -2 °C. La presencia de etanol evita la congelation del plasma. En estas condiciones precipita una fraction de protelnas muy rica en Fibrinogeno y que incluirla la mayor parte de las protelnas presentes en el crioprecipitado si este, en una aplicacion de la invencion, no se hubiese separado con anterioridad a la adicion de alcohol. Esta fraccion se denomina genericamente como fraccion I (Fr-I) de Cohn, ya que se obtiene por un procedimiento esencialmente correspondiente al descrito por Edwin J. Cohn (Cohn E.J. et al; J Am Chem Soc, 1946). Cuando se separa el precipitado obtenido en esta etapa, la fraccion sobrenadante se encuentra sustancialmente libre de fibrinogeno, y por tanto libre de cualquier interferencia que pudiera causar el fibrinogeno en los cultivos celulares, siendo adecuada para el objeto de la invencion, como suplemento para medios de cultivo de celulas, una vez se elimina el alcohol anadido, por su toxicidad para las celulas.
Durante las etapas descritas se aplican controles del proceso de production de los materiales derivados del plasma, para garantizar que los procesos se realizan dentro de las especificaciones requeridas en cuanto a concentracion de protelna, pH, contaje de microorganismos, etc.
Este sobrenadante se obtiene por un procedimiento esencialmente correspondiente al descrito por Edwin J. Cohn, si bien pueden existir diferencias de composition, tanto debidas a los cambios de escala de produccion (numero de donaciones y volumen de los pooles de plasma), como a variaciones entre el procedimiento de la invencion y el procedimiento aplicado en aquella epoca.
Este sobrenadante obtenido directamente del fraccionamiento industrial del plasma humano (basado en el metodo de Cohn), aparte de la elimination del etanol que contienen (aproximadamente 8% en el sobrenadante de la fraccion I y 20-25% aproximadamente en el sobrenadante de la fraccion II+III), no requieren tratamientos posteriores de
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purificacion.
La eliminacion del etanol contenido en estos sobrenadantes puede realizarse por cualquiera de los metodos conocidos en el estado de la tecnica. Preferentemente puede realizarse mediante dialisis o diafiltracion o directamente mediante liofilizacion, evaporacion o desecacion (p. ej. Spray drying) siendo estos metodos facilmente industrializables.
Una forma de preparacion valida para obtener un producto totalmente estable consiste en partir de cualquiera de los sobrenadantes descritos y, opcionalmente, diluirlos convenientemente con agua para inyeccion, solucion salina fisiologica o tampon, a pH 7-8 y temperatura entre 2-8°C. La solucion se clarifica por placas de celulosa o de profundidad, que sean inertes en cuanto a adsorcion de protelna, y finalmente se clarifica hasta aproximadamente 0,5 micras de poro. Posteriormente se somete el producto a diafiltracion, utilizando membranas de aproximadamente 10 kDa de corte molecular nominal, frente 2 volumenes o mas de agua para inyeccion, solucion salina fisiologica o tampon, a un pH preferente de 7 aproximadamente. Preferentemente, el numero de volumenes de intercambio en la diafiltracion es aproximadamente de 5.
La solucion diafiltrada es clarificada por filtracion absoluta con gradiente de filtros de 0,2 micras hasta 0,1 micras de tamano de poro. Posteriormente el producto puede ser nanofiltrado por aproximadamente 35 nm y 20 nm de tamano de poro, a una temperatura preferente de 2-8°C y a una presion transmembrana inferior o igual a 1 bar. La carga aplicada es preferentemente alrededor de 70 Litros/m2 de area para el filtro de menor tamano de poro.
El producto obtenido puede concentrarse por ultrafiltracion hasta el mismo valor de concentracion de protelna total del material de partida (sobrenadante), o mas concentrado si se prefiere.
En cualquier caso, el material obtenido se dosifica en viales o botellas de vidrio y se guarda almacenado preferentemente a -30°C o temperatura inferior hasta el momento de su uso. Como paso previo a la dosificacion del sobrenadante en viales, se puede proceder a realizar una filtracion esterilizante, por un tamano de poro entre 0,1 y 0,2 micras.
Este producto congelado puede asimismo liofilizarse, o someterse a otros tratamientos, para disponer de un producto desecado. El producto puede someterse a radiacion gamma y, en estado desecado, puede conservarse preferentemente entre 2 y 8°C hasta su uso.
En el caso de no realizar la diafiltracion del material de partida (S/Fr-I) y optar por la eliminacion del alcohol directamente por liofilizacion, se dosifica a viales o botellas de vidrio. Previamente a la dosificacion del sobrenadante en viales, se puede proceder a realizar una filtracion esterilizante, por un tamano de poro entre 0,1 y 0,2 micras. El material dosificado se congela preferentemente a temperatura menor o igual a -30°C, y se somete a liofilizacion y radiacion gamma tal y como se conocen estas tecnicas.
De manera opcional, este material puede ser tratado con metodos de eliminacion/inactivacion de agentes patogenos. De forma preferente se puede proceder a la irradiacion del material, congelado o liofilizado con radiacion gamma, entre 15 y 35 kilo-greys, obteniendose con 25 kilo-greys el optimo entre estabilidad de la composicion y eliminacion de virus.
El producto liofilizado puede almacenarse, preferentemente entre 2-8°C, durante largo perlodo de tiempo.
Una forma de conservacion preferente del material hasta su uso es como liofilizado en su envase final. De esta manera, puede procederse a su dosificacion directa y se puede eliminar el etanol en el propio proceso de liofilizacion.
Este sobrenadante se anade a medios de cultivo convencionales libres de suero, que contienen sales inorganicas, aminoacidos, vitaminas, entre otros componentes necesarios para el crecimiento celular, como por ejemplo el medio F12 de Ham o el medio de Dulbecco modificado (DMEM).
El medio resultante puede ser utilizado para cultivar una gran variedad de celulas de mamlferos. Para ello son utilizadas tecnicas y condiciones de cultivo convencionales, que son conocidas por un experto en la materia.
El sobrenadante liofilizado puede reconstituirse en medio de cultivo base, por ejemplo el medio F12 de Ham o en el medio mlnimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM), en agua destilada o desionizada y apirogena, o en soluciones salinas o tampones habituales de cultivo celular.
El sobrenadante reconstituido en medio de cultivo puede utilizarse para suplementar el medio de cultivo base anadiendo desde un 2% a un 50 %(v/v) de sobrenadante reconstituido, por ejemplo: 2 ml de Sobrenadante de fraccion I reconstituido en medio a 98 ml de medio base (2%) otro ejemplo serla anadir 50 ml de sobrenadante de Fraccion I reconstituido en medio a 50 ml de medio base (50 %).
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El sobrenadante reconstituido en agua, soluciones salinas o tampones aptos para cultivo celular se recomienda adicionarlo al medio de cultivo base entre un 2% y un 20% (v/v) por ejemplo 20 ml de sobrenadante reconstituido en 80 ml de medio (20%). En el caso de ser necesario llegar a concentraciones del 50% (v/v) seria necesario adicionar el sobrenadante reconstituido a medio base doble concentrado (2X) por ejemplo anadir 50 ml de sobrenadante de fraccion I en agua a 50 ml de medio base 2X.
El medio de cultivo suplementado puede utilizarse para las tecnicas habituales de cultivo, este medio suplementado puede utilizarse directamente o filtrarse previamente por 0,22 pm.
En caso de material (sobrenadante) conservado congelado, previa a la adicion al medio base, debe descongelarse. Una vez descongelado se recomienda adicionarlo al medio de cultivo base entre un 2% y un 20% (v/v). En el caso de ser necesario llegar a concentraciones del 50% (v/v) en la suplementacion del medio seria necesario adicionar el sobrenadante de fraccion I doble concentrado (2X).
El medio de cultivo suplementado puede utilizarse para las tecnicas habituales de cultivo, este medio suplementado puede utilizarse directamente o filtrarse previamente por 0,22 pm.
Ejemplo 1
Preparacion del sobrenadante de las fracciones I y II+III.
Se procede a la mezcla y descongelacion de donaciones individuales de plasma procedente de plasmaferesis, la descongelacion se realiza en un reactor a una temperatura controlada entre 0 y 4 °C. Se obtienen finalmente 3783 kg. de plasma.
Para la separacion del crioprecipitado se procede a la centrifugacion del plasma, entre 9000 y 12000 xg, manteniendo la temperatura de la centrifugacion entre 0 y 4 °C.
Para proceder a la separacion de la fraccion I, se comprueba la concentracion de protelna del sobrenadante de crioprecipitado (S/C), que debe ser del 5 % aproximadamente. Si es superior se diluye con agua para inyeccion. Asimismo se ajusta el pH a 7 aproximadamente.
Partiendo del S/C, se le adiciona etanol hasta una concentracion del 8 % (volumen/volumen). La_velocidad de adicion del etanol debe ser lenta (menor o igual a 2 kg/min) y con agitacion moderada para evitar la desnaturalizacion. Durante la adicion del etanol se disminuye gradualmente la temperatura del sobrenadante, en el reactor de precipitacion, hasta llegar a una temperatura final de -2 °C. El pH final debe situarse aproximadamente en 7.
Despues de aproximadamente 2 horas de reaccion se procede a la centrifugacion para la separacion de la Fraccion I. Esta centrifugacion se realiza entre 9000 y 12000 xg. El sobrenadante obtenido (S/Fr-I) se mantiene a una temperatura de entre 0 y -4 °C.
En este punto, o bien en el S/C, podrla haberse extraldo opcionalmente el Complejo de Protrombina, por cromatografla de intercambio ionico (Curling, JM ed, Methods of plasma fractionation. Academic Press 1980).
Para la separacion de la fraccion II+III, se procede al ajuste de pH del S/Fr-I a aproximadamente 7 y seguidamente se adiciona etanol para llevarlo al 20 % (volumen/volumen). La velocidad de adicion del etanol debe ser lenta (menor o igual a 2 kg/min) y con agitacion moderada para evitar la desnaturalizacion. Durante la adicion del etanol se disminuye gradualmente la temperatura del sobrenadante, en el reactor de precipitacion, hasta llegar a una temperatura final de aproximadamente -5 °C. El pH final debe situarse cercano a 7.
En este ejemplo, despues de aproximadamente 6 horas de reaccion se procede a la separacion de la fraccion II+III.
En este punto (sobrenadante de la fraccion II+III), o en el S/C, o en el S/FrI puede procederse a la extraccion opcional de la Antitrombina, por cromatografla de afinidad a heparina (Fernandez J. et al. Sangre 41(supl. 3) 42 (1996).
Ejemplo 2
Dosificacion y Liofilizacion
Un sobrenadante de fraccion II+III obtenido segun el ejemplo 1, se diluye con agua para inyeccion a pH 7-8 y temperatura entre 2-8°C hasta una concentracion de etanol del 8 %. La solucion se clarifica por placas de celulosa hasta 0,5 micras de poro. Posteriormente se somete opcionalmente el producto a diafiltracion para eliminar el etanol, utilizando membranas de polisulfona de 10 kDa de corte molecular nominal, frente a agua para_inyeccion, a un pH de 7. El numero de volumenes de intercambio en la diafiltracion es de 5.
La solucion es clarificada por filtracion absoluta con gradiente de filtros de 0,2 micras hasta 0,1 micras de tamano de poro. Posteriormente el producto opcionalmente se nanofiltra por 35 nm y 20 nm de tamano de poro, con filtros de celulosa cupra-amonio, a una temperatura entre 2 y 8 °C y a una presion transmembrana inferior a 1 bar, hasta el 5 bloqueo de los filtros como maximo.
El producto se concentra por ultrafiltracion hasta el mismo valor de concentracion de protelna total del material de partida y previa filtracion esterilizante, por un tamano de poro de 0.2 micras, se dosifica en viales de vidrio y se guarda almacenado a -30 °C hasta el momento de su uso.
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Este producto congelado puede liofilizarse para disponer de un producto desecado que se somete a radiacion gamma y puede conservarse entre 2 y 8°C hasta su uso.
Ejemplo 3:
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La composicion mayoritaria de diferentes lotes de material obtenido segun el ejemplo 2 (sobrenadantes liofilizados y reconstituidos en H2O), comparada con la de un suero fetal Bovino, se muestra en las Tablas siguientes:
- Suero Fetal Bovino Sobrenadante de fraccion I
- LOTE
- n=3 (x±DT) n= (1-4) *
- Protefna total (BIORAD) (mg/ml)
- 32,13 ± 2,07 38,39
- Electroforesis (Albumina %)
- 46,86 ± 1,22 62,35
- Electroforesis (Alfaglobulina 1 %)
- 44,93 ± 1,49 3,41
- Electroforesis (Alfaglobulina 2 %)
- 10,24
- Electroforesis (Betaglobulina %)
- 6,13 ± 0,32 11,33
- Electroforesis (Gammaglobulinas %)
- 1,02 ± 0,16 12,37
- Electroforesis (restos %)
- 0 - 0,26 0,31
- Albumina (g/l)
- ND 27,500
- a-ANTITRIPSINA (g/l)
- ND 1,270 ± 0,09
- Alfa-1-glicoprotefna acida (g/l)
- ND 0,760 ± 0,05
- Apo-AI (g/L)
- ND 0,804 ± 0,07
- Haptoglobina (g/l)
- ND 1,173
- a2-Macroglobulina (g/l)
- ND 1,529 ± 0,16
- ATIII (g/l)
- ND 0,228 ± 0,02
- Apo-AII (g/L)
- ND 0,233 ± 0,01
- Ceruloplasmina (g/l)
- ND 0,269 ± 0,03
- Transferrina (g/l)
- ND 1,883
- Hemopexina (g/l)
- ND 0,662 ± 0,03
- Plasminogeno (g/l)
- ND 0,092
- Apo-B (g/L)
- ND 0,570 ± 0,03
- Fibrinogeno (g/l)
- ND 0,285
- IgG (g/l)
- ND 6,370
- IgA (g/l)
- ND 1,807
- IgM (g/l)
- ND 1,125 ± 0,37
- Osmolalidad (mOsm/kg)
- 302,00 ± 12,29 632,5
- Turbidez (NTU)
- 21,52 ± 2,20 2753
- pH (1%)
- 7,39 ± 0,03 9,44
- Bicarbonato (mmol/L)
- 13,00 ± 1,73 18 ± 9
- Cloruros (mmol/l)
- 106,00 ± 1,00 182
- Potasio (mmol/l)
- 10,67 ± 0,58 6
- Sodio (mmol/l)
- 137,33 ± 3,21 252
- Calcio (mg/L)
- 139,90 ± 8,03 65,70 ± 0,87
- Fosforo (mg/dL)
- 9,37 ± 1,08 2,97 ± 0,06
- Zinc (pg/L)
- 3162,67 ± 523,64 1318
- Plomo (pg/L)
- <5 <5
- * = 3 de los lotes se analizan antes de su liofilizacion. ND = No Determinado
- Suero Fetal Sobrenadante de
- Bovino fraccion I
- LOTE
- n=3 (x±DT) n=(1-4) * (x±DT)
- Distribucion molecular (%)
- Pollmeros y agregados
- 7,26 - 16,83 9,57
- Formas intermedias
- 9,84 ± 3,08 31,30
- Monomero
- 78,34 ± 1,83 59,12
- PM < Monomero
- 0 - 0,17 0,00
- GLUCOSA (mg/dL)
- 46 -77 82,67 ± 2,08
- UREA (mg/dL)
- 34,67 ± 1,53 23,75 ± 0,50
- ACIDO URICO (mg/dL)
- 1,83 ± 0,15 4,30 ± 0,08
- BUN-NITROGENO UREICO (mg/dL)
- 16,29 ± 0,72 11,16 ± 0,23
- CREATININA (mg/dL)
- 2,95 ± 0,40 0,84 ± 0,08
- BUN/Creatinina Ratio
- 5,62 ± 1,02 13,16 ± 1,12
- BILIRRUBINA TOTAL (mg/dL)
- 0,20 ± 0,03 0,31 ± 0,03
- Fosfatasa alcalina (U/g protefna)
- 0,03 - 1,14 1,06 ± 0,19
- Gamma glutamil transpeptidasa (GGT) (U/L)
- 9,67 ± 0,58 16
- Serum Glutamyl oxalacetate transaminase (SGOT) (U/L)
- 24,00 ± 3,46 8
- Lactato deshidrogenasa (LDH) (U/L)
- 433,67 ± 38,18 <50
- INSULINA BASAL (pU/mL)
- 76,97 ± 12,45 12,23 ± 1,78
- 17 - BETA ESTRADIOL (pg/mL)
- 30,77 ± 7,45 46,78 ± 5,07
- PROGESTERONA (ng/mL)
- <0,20 - 0,20 0,80 ± 0,13
- TESTOSTERONA TOTAL (ng/mL)
- 0,14 ± 0,02 2,52 ± 0,14
- TESTOSTERONA LIBRE (pg/mL)
- <0,03 - 0,17 3,98
- TIROXINA (T4) TOTAL (pg/dL)
- 13,07 ± 0,47 6,51 ± 0,38
- T4 LIBRE (ng/dL)
- 3,00 - >6 1,17 ± 0,10
- TRIGLICERIDOS (mg/dL)
- 59 ± 6,56 117,25 ± 8,54
- COLESTEROL (mg/dL)
- 34 ± 4,36 137,50 ± 4,12
- HDL-COLESTEROL (mg/dL)
- 9,67 ± 1,53 6 - 14
- LDL-COLESTEROL (mg/dL)
- 10 - 17 105,25 ± 2,22
- VLDL-COLESTEROL (mg/dL)
- 11,67 ± 1,53 23,50 ± 1,73
- ACIDOS GRASOS LIBRES (mEq/L)
- <0,10 0,30 ± 0,1
- FOSFOLlPIDOS TOTALES (mg/dL)
- 44,33 ± 4,04 152,50 ±38,39
- * = 3 LOTES SE ANALIZAN ANTES DE SU LIOFILIZACION.
- Suero Fetal Sobrenadante de
- Bovino fraccion I
- LOTE
- n=3 (x±DT) n= (1-4) * (x±DT)
- ACIDOS GRASOS SATURADOS (%)
- Tetradecanoico (Miristico, C14:0)
- 0,30 - 0,90 0,10 - 0,90
- Hexadecanoico (Palmftico C16:0)
- 25,80 ± 0,66 28,40 ± 3,67
- Octadecanoico (estearico C18:0)
- 21,03 ± 2,40 9,40 ± 2,09
- Eicosanoico (Araqufdico C20:0)
- 0,20 - 0,40 0,20
- Docosanoico (Behenico C22:0)
- 0,23 ± 0,06 <0,10
- ACIDOS GRASOS MONOINSATURADOS (%)
- Hexadecenoico (Palmitoleico C16:1)
- 1,10 - 2,10 1,83 ± 0,36
- Cis-9-octadecenoico (Oleico C18:1)
- 19,43 ± 3,48 11,90 - 27,10
5
10
15
20
25
30
35
- Suero Fetal Bovino Sobrenadante de fraccion I
- LOTE
- n=3 (x±DT) n= (1-4) * (x±DT)
- Cis-11-octadecenoico (Cis-Vaccenico C18:1)
- 0,20 - 6,60 <0,10 - 1,20
- 11-eicosenoico (Gondoico C20:1)
- 0,23 ± 0,06 <0,10
- ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS (w3 w6) (%)
- Cis, cis, cis-9,12,15-octadecatrienoico (alfa- Linolenico C18:3)
- 0,23 ± 0,06 0,20 - 0,50
- Cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA C20:5)
- 0,30 - 1,20 <0,10 - 0,50
- Cis-4,7,10,13,16,19-decosahexaenoico (DHA C22:6)
- 3,93 ± 0,93 0,40 - 1,2
- Cis, cis-9,12-octadecadienoico (Linoleico C18:2)
- 2,63 ± 0,29 27,23 ± 4,15
- Cis, cis, cis-6,9,12-octadecatrienoico (gamma- Linolenico C18:3)
- 0,23 ±0,06 <0,10 - 0,40
- Cis-11, 14-eicosadienoico (C20:2)
- 0,23 ±0,06 <0,10
- Dihomo-gamma-Linolenico (C20:3)
- 2,27 ± 0,31 0,30 - 1,60
- Cis, cis, cis, cis-5,8,11,14-eicosatretraenoico (Araquidonico C20:4)
- 4,60 - 7,80 7,00 ± 0,80
- All-cis-7,10, 13, 16, 19-Docosapentaenoico (C22:5)
- 3,83 ± 0,68 0,55 ± 0,07
- * = 3 LOTES SE ANALIZAN ANTES DE SU LIOFILIZACION.
Ejemplo 4:
Ensayo de proliferation celular de la ilnea CHO con medio suplementado con sobrenadante de fraction I.
La llnea celular CHO corresponde a celulas de ovario de hamster chino, estas celulas presentan morfologla epitelial y crecen en modo adherente. El cultivo utilizado proviene de “European Collection of Cell Cultures” ECACC con n° de catalogo 85050302.
Se reconstituye el sobrenadante de fraction I con medio de cultivo F12 de Ham's como se ha indicado anteriormente.
Se preparan diferentes concentraciones (volumen/volumen) de Fraction I en medio de cultivo (20%; 40%; 60%; 80% y 100%) as! como medio suplementado con un 20% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) y medio sin suplementar.
Se siembra en una placa de 96 pocillos 50 pl por pocillo de una suspension de celulas CHO a una concentration entre 5 x 105 y 1 x 106 celulas/ml en medio de cultivo sin suplementar.
Se anade a cada columna de la placa 50 pl por pocillo del medio que deseamos testar de forma que la dilution final proporcionara medio sin suplementar, suplementado con un 10% FBS y suplementado con un 10; un 20; un 30; un 40 y un 50 % de sobrenadante de fraction I.
La placa de 96 pocillos se incuba a 37 °C; en una atmosfera con un 8% CO2 y alta humedad relativa (incubador para cultivos celulares) durante 48 horas.
Se anaden 100 pl de medio sin suplementar a una columna para tener un blanco de la tecnica.
Tras 48 horas de incubation se anade a cada pocillo 10 pl del reactivo WST-1/ECS del equipo comercial “Cell proliferation assay kit” de Millipore con n° de catalogo 2210.
Tras una incubation de 2 a 4 horas en condiciones de cultivo habituales para la llnea (37°C; 8% CO2) se agita una placa durante un minuto y se mide la absorbancia en un lector de microplacas a una longitud de onda de 420-480 nm, siendo la lectura de longitud de onda de referencia superior a 600 nm (generalmente las placas se leen en un lector SUNRISE de Tecan a una longitud de onda de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 620 nm utilizando para el control del equipo, la lectura y analisis de datos el software Magellan V 6.3).
5
10
15
20
25
30
Los valores de absorbancia superiores al blanco mas dos veces la desviacion estandar de este se consideran positivos para la tecnica.
En el proximo paso se resta el valor promedio del blanco al resto de pocillos de la placa.
Se calculan los valores promedio de los pocillos de cada columna (una vez restado el blanco de la tecnica) correspondiendo el valor promedio de cada columna el valor promedio para el medio sin suplementar y el medio suplementado con FBS o diferentes concentraciones de sobrenadante de fraccion I respectivamente.
Se considera que las celulas en medio sin suplementar practicamente no proliferan (0%) por lo que el valor de absorbancia promedio en esta columna se resta a todos los valores promedios de todas las columnas.
El valor de absorbancia del medio de referencia (medio F12 de Ham suplementado con un 10% de FBS) se considera el valor 100% de proliferacion por lo que se dividen todos los valores promedio del punto anterior (una vez se les ha restado el valor del medio sin suplementar) por este valor para obtener el porcentaje de proliferacion respecto al medio de referencia.
Con los medios suplementados entre un 20 y un 50% de sobrenadante de fraccion I como norma general se obtienen porcentajes de proliferacion similares al medio de referencia (medio con 10% de Suero Fetal Bovino) o muy superiores (medio con 50% de sobrenadante de fraccion I).
A continuacion se muestran los resultados de proliferacion en porcentaje.
Proliferacion celular (%) CHO en medio Ham's F12 suplementado con FBS o S/Fr I
- S/S
- 10% FBS (2,5 mg (mg/ml alb) 10% S/Fr.I (6 mg/ml alb) 20% S/Fr.I (12 mg/ml alb) 30% S/Fr.I (17 mg/ml alb) 40% S/Fr.I (23 mg/ml alb) 50% S/Fr.I (29 mg/ml alb)
- 0
- 100 70 120 168 206 233
S/S sin suplemento; FBS: suero fetal bovino; alb: abumina
Claims (8)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Medio para el cultivo de celulas de mamlferos caracterizado porque, ademas de los nutrientes habituales de los medios de cultivos basales para cultivo de celulas de mamlferos, comprende el sobrenadante de la fraccion I del metodo de Cohn.
- 2. Medio de cultivo, segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el sobrenadante de la fraccion de Cohn se obtiene a partir de mezclas (“pooles”) de, como mlnimo, 1000 donantes humanos.
- 3. Medio de cultivo, segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque el sobrenadante de la fraccion I de Cohn se encuentra en forma desecada.
- 4. Medio de cultivo, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sobrenadante de la fraccion I de Cohn se encuentra en forma congelada.
- 5. Procedimiento de preparacion de un medio de cultivo de celulas de mamlferos, segun las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la preparacion del sobrenadante de la fraccion I del fraccionamiento del plasma humano segun el metodo de Cohn comprende las etapas de- precipitacion con etanol- separation del sobrenadante- congelation o desecacion y opcionalmente las etapas de- dilution y/o- dialisis o diafiltracion y/o- elimination de agentes patogenos;y la posterior adicion del sobrenadante de la fraccion I preparado de esta manera al medio
- 6. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el sobrenadante de reconstituye en el medio de cultivo basal, en agua destilada o desionizada y apirogena, tampones habituales de cultivo celular.
- 7. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el sobrenadante de reconstituye en el medio de cultivo basal.
- 8. Procedimiento, segun las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el plasma humano es obtenido a partir de mezclas (“pooles”) de, como mlnimo, 1000 donantes humanos.de cultivo basal.la fraccion I desecado se o en soluciones salinas ola fraccion I desecado se
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