ES2619952T3 - Procedimiento de preparación de dipéptidos a partir de cianoficina empleando la CGPASA de Pseudomonas alcaligenes DIP1 CPHEAL aislada - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción enzimática de una composición de ß-dipéptido a partir de una preparación de una cianoficina (CGP) o un polímero de tipo CGP, estando las estructuras peptídicas comprendidas esencialmente por una o más unidades de ß-dipéptido compuestas de dos aminoácidos seleccionados de ácido aspártico, arginina, lisina, ácido glutámico, citrulina, ornitina y carvanina, procedimiento que comprende la degradación de la preparación de CGP o de polímero de tipo CGP con una CGPasa de Pseudomonas alcaligenes en ß-dipéptidos, en el que la CGPasa tiene un peso molecular de aproximadamente 45 kDa, una temperatura óptima de aproximadamente 50 °C y un intervalo de pH óptimo de 7 a 8,5 y degrada CGP en ß-Asp-Arg.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

inmunes entre los pacientes con quemaduras y traumatismos (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)), y la peroxidación de lípidos en pacientes ancianos con demencia senil (Ohtsuka, Y. y Nakaya J., Am. J. Med. 1:108-439 (2000)). Estas numerosas observaciones emparejadas con su uso relativamente seguro han hecho que el uso de arginina sea muy atractivo para el cuidado de pacientes con traumatismos, quemaduras o gravemente enfermos (Witte, M. B. y Barbul. A., Wound Rep. Reg. 11:419-423 (2003)).

Arginina en inmunomodulación y cáncer: la arginina es un potente inmunomodulador y se ha demostrado que tiene efectos beneficiosos en afecciones catabólicas, como sepsis y estrés postoperatorio (Evoy, D. y col. Nutrition 14:611-617 (1998); Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)). La arginina también puede ser beneficiosa en individuos con VIH/SIDA. La combinación de glutamina, arginina y HMB (hidroximetilbutirato) previno la pérdida de masa corporal magra en individuos con SIDA (Swanson, B., Nutrition 18:688-690 (2002)). Los ensayos con animales y seres humanos han demostrado que dosis grandes de arginina pueden interferir en la inducción de tumor y que la suplementación a corto plazo con grandes dosis de arginina ayuda a mantener las funciones inmunes durante quimioterapia (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)). Arginina en diabetes y resistencia a la insulina: se ha observado un menor nivel de arginina en plasma y alteraciones de la relajación dependiente de endotelio en seres humanos y animales con diabetes melitus (DM). Se ha supuesto como una probable razón de esto la deficiencia de NO endotelial. Por lo tanto, se ha señalado la suplementación de arginina para mejorar dichas afecciones; la arginina IV redujo la presión arterial y la agregación de plaquetas en pacientes con DM tipo 1 (Giugliano, D. y col., Am. J. Physiol. 273:E606-E612 (1997)), mientras que dosis bajas de arginina IV mejoraron la sensibilidad a la insulina en pacientes DM tipo 2 y obesos, así como en sujetos sanos (Wascher, T. C. y col., Eur. J. Clin. Invest. 27:690-695 (1997)). La arginina también puede contrarrestar la peroxidación de lípidos y reducir en virtud de ello las complicaciones de DM microangiopáticas a largo plazo. Asimismo, los ensayos doble ciego demostraron que la suplementación de arginina oral mejoraba significativamente la sensibilidad a la insulina periférica y hepática en pacientes con DM tipo 2 (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)).

Arginina en afecciones gastrointestinales: se asoció la acción de arginina sobre NO, gastrina y poliaminas, que ejerce sus efectos de promoción del crecimiento, angiogénicos e hiperémicos, con una aceleración de la cicatrización de úlceras durante los estudios preliminares (Brzozowski, T., J. Gastroenterol. 32:442-452 (1997)). Adicionalmente, NO desempeña un importante papel en la regulación de la motilidad gastrointestinal. La suplementación de arginina oral disminuyó significativamente la frecuencia e intensidad de los ataques de angina de pecho en pacientes con trastornos de motilidad esofágica (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)). De manera similar, la ruta L-Arginina-NO participa en la regulación de la motilidad de la vesícula biliar y la ingestión de L-Arginina aumentó los volúmenes vesiculares en ayunas y residual (Luiking, Y. C. y col., Am. J. Physiol. 274:984991 (1998)).

La arginina en afecciones genitourinarias: una encuesta que se llevó a cabo en Estados Unidos (1999) indicó que un 31% de los hombres y un 43% de las mujeres con edades comprendidas entre los 18 y los 59 años presentaban diversos grados de disfunción sexual (Christianson, D. W., Acc. Chem. Res. 38:191-201 (2005)). Estos problemas pueden deberse tanto a causas fisiológicas como psicológicas, o ambos. En los hombres, la disfunción sexual se describe de forma abreviada como disfunción eréctil (impotencia o DE), mientras que en las mujeres, la disfunción sexual se clasifica en cuatro categorías principales: deseo sexual hipoactivo, trastorno orgásmico, trastorno sexual por dolor y trastorno de excitación sexual (Basson, R. y col., J. Urol. 163:888-893 (2000)). Éste último, definido como la incapacidad de conseguir o mantener una excitación sexual suficiente que incluye erección del clítoris y congestión genital es análogo en el hombre DE en el sentido de que está causada por una deficiencia en la circulación de la sangre genital. Esto puede ser el resultado en ambos géneros de defectos fisiológicos en las reacciones catalizadas por enzimas que rigen el flujo sanguíneo hacia dentro y hacia fuera del cuerpo cavernoso, una cámara muscularizada de tejido expandible que se congestiona con sangre en la erección del pene o el clítoris (Christianson, D. W., Acc. Chem. Res. 38:191-201 (2005)).

La erección del pene, en particular, es un proceso hemodinámico que implica un mayor flujo arterial de entrada y un flujo venoso de salida limitado tras el estímulo sexual central o periférico (Musicki, B. y col., Biol. Reprod. 70:282-289 (2004)). La participación de NO, generado tanto por NO sintasa endotelial (eNOS) como por la NO sintasa penil neuronal (PhNOS) como mediador principal de la erección del pene está muy documentada. NO se difunde hacia el tejido del músculo liso diana adyacente estimulando la guanililciclasa para producir guanosin monofosfato cíclico (cGMP) causando así la relajación del cuerpo cavernoso (Ferrini, M. y col., Biol. Reprod. 64:974-982 (2001)). A la inversa, se termina la erección cuando las fosfodiesterasas (PDEs) específicas de cGMP hidrolizan cGMP en 5’-GMP causando la contracción del músculo liso (Firoozi, F. y col., Br. J. Urol. Int. 96:164-168 (2005)). Por tanto, L-Arginina y los fármacos que actúan sobre la ruta L-Arginina-NO son atractivos como medios terapéuticos para DE. Asimismo, está muy extendido el uso de inhibidores selectivos de PDEs como citrato de Sildenafil ((Viagra®), que inhiben la degradación de cGMP y, en consecuencia, prolongan la erección. No obstante, Sildenafil tiene un efecto vasodilatador e hipotensor sistémico que provoca un amplio abanico de efectos secundarios comenzando por cefaleas y puede incluso ser mortal (Cohen, J. S., Ann. Pharmaco. Ther. 35:337-342 (2001)).

Con frecuencia, se han explorado los “nutracéuticos” de L-Arginina como remedios para la excitación sexual masculina y femenina. Por ejemplo, dosis suprafisiológicas a largo plazo o como suplemento de L-Arginina dietaria potenciaron la presión intracavernosa y la función eréctil en ratas (Moody y col. 1997) y en hombres, respectivamente. Los suplementos de L-Arginina a largo plazo mejoraron la DE en hombres con un metabolismo de

10 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

óxido nítrico anormal (Zorgniotti y Lizza 1994), al mismo tiempo que en otro estudio con mujeres, el suplemento nutricional de L-Arginina mejoró la satisfacción de la vida sexual en general en un 73,5% de los sujetos sometidos al ensayo (Ito, T. Y. y col., J. Sex Marital Ther. 27:541-549 (2001)). Por otra parte, NOS no es la única enzima que afecta a la erección del pene; arginasa comparte su único sustrato arginina y se coexpresa con NOS en el tejido del músculo liso de los genitales masculinos y femeninos. Por lo tanto, la inhibición de arginasa puede potenciar los procesos fisiológicos no dependientes de NO necesarios para la excitación sexual. Dado que muchos inhibidores de arginasa no presentan ningún efecto aparente sobre la presión arterial sistémica, ha pasado a ser otro potencial objetivo para el tratamiento de disfunción sexual (Christianson, D. W., Acc. Chem. Res. 38:191-201 (2005)).

Arginina en infertilidad de embarazo: la arginina es necesaria para una espermatogénesis normal en los hombres (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)). Hace más de 50 años, los investigadores observaron que alimentar a un hombre adulto con una dieta deficiente en arginina durante nueve días disminuía el recuento de espermatozoides en un 90% y aumentaba el porcentaje de espermatozoides no mótiles multiplicándose por 10 (Holt,

L. E. Jr. y Albanese, A. A., Trans. Assoc. Am. Physicians 58:143-156 (1944)). La administración oral de 0,5 g de arginina-HCl al día a hombres infértiles durante varias semanas aumentó notablemente el recuento y motilidad de los espermatozoides en la mayoría de los pacientes sometidos a ensayo y tuvo como resultado embarazos exitosos (Tanimura, J., Bull. Osaka Med. School 13:84-89 (1967)). En otros estudios preliminares se registraron efectos similares en los índices de oligospermia y la concepción (Tanimura, J., Bull. Osaka Med. School 13:84-89 (1967); De-Aloysio, D. y col., Acta Eur. Fertil. 13:133-167 (1982)) y una mejor fertilidad. Sin embargo, cuando los recuentos de espermatozoides basales fueron inferiores a 10 millones/ml, la suplementación con arginina no pudo ayudar (Mroueh, A., Fertil. Steril. 21:217-219 (1970); Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)).

La suplementación con arginina oral para mujeres con una escasa respuesta a la fertilización in vitro mejoró la respuesta ovárica, la receptividad endometrial y la tasa de embarazo en un estudio (Battaglia, C. y col., Hum. Reprod. 14:1690-1697 (1999)). Adicionalmente, la infusión de arginina intravenosa (30 g durante 30 minutos) en mujeres con contracciones uterinas prematuras, disminución de la contractilidad uterina transitoria (Facchinetti, F. y col., J. Perinat. Med. 24:283-285 (1996)). Otras pruebas derivadas de estudios con seres humanos y animales indicaron que el óxido nítrico inhibe la contractilidad uterina durante el embarazo y pueden ayudar, y por lo tanto actuar, contra el parto y alumbramiento prematuro (Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)).

En pacientes con cistitis intersticial (CI), la arginina oral durante seis meses disminuyó significativamente las molestias el vaciado urinario, el dolor abdominal y el dolor vaginal/uretral. La frecuencia urinaria durante el día y la noche también se redujo de manera significativa (Smith, S. D. y col., J. Urol. 158:703-708 (1997); Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)).

L-Lisina: L-Lisina es un aminoácido esencial básico; tiene un peso molecular de 146,19 g/mol, y lleva una carga positiva a un pH fisiológico. Aunque el D-estereoisómero de lisina no es biológicamente activo, L-Lisina es un aditivo alimentario conocido para los seres humanos y animales (Cynober, L. A. Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition. 2ª ed. CRC Press LLC, Boca Raton, EE.UU. (2003)). La L-Lisina ingerida es absorbida desde el lumen del intestino delgado hacia los enterocitos por transporte activo. Una porción de la misma se metaboliza dentro de los enterocitos y el resto es transportado a través de la circulación portal al hígado para participar en la biosíntesis de proteína o para ser metabolizada en ácido semialdehído L-alfa-aminoadípico, que se metaboliza posteriormente en acetoacetil-CoA. La L-Lisina que no se metaboliza en el hígado es transportada a diversos tejidos del cuerpo (Cynober, L. A. Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition. 2ª ed. CRC Press LLC, Boca Raton, EE.UU. (2003)).

La Lisina tiene muchas funciones. Sirve como precursor de glucógeno, glucosa y lípidos o sirve directamente para la producción de energía. Se concentra en los músculos, promueve el crecimiento óseo y potencia la formación de colágeno (Voet, D. y Voet, J. G., Biochemistry. 3ª ed. John Wiley and Sons Inc., Nueva York (2004)). El colágeno es la matriz básica de los tejidos conectivos (véase lo anterior), la piel, el cartílago y el hueso. La deficiencia de lisina puede contribuir a un crecimiento y una inmunidad menores, a una salud espérmica alterada, además de a un incremento del calcio urinario. Éste último hecho sugiere que la lisina adecuada puede ayudar a prevenir la osteoporosis a través de una menor absorción y deposición del calcio (Flodin, N. W., J. Am. Coll.Nutr. 16:7-21 (1997)). La L-Lisina se hizo popular como suplemento nutricional cuando algunos estudios demostraron que puede disminuir la tasa de recurrencia de infecciones por herpes simplex y estimular la secreción de la hormona del crecimiento (véase más adelante).

Dosis recomendadas, efectos secundarios y contraindicaciones: Las dosis de los aminoácidos como suplementos que se han explicado pueden variar mucho dependiendo de las afecciones que se vayan a tratar. No obstante, se estima que las necesidades dietarias normales del aminoácido esencial lisina para un ser humano medio oscilan entre 0,75 y 1 g al día para evitar problemas de deficiencia. Las dosis de arginina utilizadas en la investigación clínica han variado considerablemente, desde tan solo 0,5 g al día para oligospermia hasta tanto como 30 g al día para cáncer, preeclampsia y contracciones uterinas prematuras. No se han notificado efectos adversos significativos acerca de la suplementación de los aminoácidos explicados a lo largo del presente artículo. No obstante, muchas de las aplicaciones clínicas mencionadas han de ser confirmadas con estudios más controlados, así como estudios a largo plazo. El presente artículo resume únicamente los informes positivos sobre los efectos de estos aminoácidos, si bien existen contra-informes en los que muchos de estos efectos no se pudieron confirmar (para una revisión

11 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

completa véase Flodin, N. W., J. Am. Coll. Nutr. 16:7-21 (1997); Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002); y Dean, W. and Pryor, K., Growth hormone: amino acids as GH secretagogues -a review of the literature. Vit. Res. News; disponible en at www.vrp.com (2001)).

Dipéptidos y mezclas de aspartato, arginina y lisina en terapia clínica: Se administran favorablemente aspartato y arginina en combinación como dipéptidos o en mezclas para proporcionar una mayor biodisponibilidad para ambos aminoácidos y aumentar así su efectividad en dosis más bajas. Se investigó la administración de ambos aminoácidos durante varios estudios para el tratamiento de diferentes trastornos fisiológicos. En general, ambos aminoácidos se pueden administrar en la forma dipéptido para todas las aplicaciones antes mencionadas para los aminoácidos libres. En la siguiente sección se resumen, no obstante, los resultados de la investigación señalados específicamente para la forma de administración combinada. Dichos informes se derivan de estudios sobre terapia de heridas, sobre enfermedades endocrinas, tales como alteraciones de la secreción de GH y el potenciamiento del rendimiento atlético, o sobre enfermedades genitourinarias, entre las que se incluyen disfunción eréctil e infertilidad masculina y femenina.

En 1965 se sometió a ensayo clínico arginina-aspartato por primera vez contra astenia física y psíquica (Duruy, A. y Baujat, J. P., Vie. Med. Int. 9:1589 (1965)) y más tarde se confirmó su efecto positivo (Duruy, A., Med. Int. 1:203 (1966)). Otros estudios demostraron que la administración a largo plazo de arginina-aspartato mejora el metabolismo aeróbico y el rendimiento (Sellier, J., Rev. Med. Toulouse 5:879 (1979); Schmid, P. y col., Leistungssport 10:486-495 (1980)). La suplementación con arginina-aspartato potenció la cicatrización de heridas y las funciones inmunes de linfocitos T (Barbul, A. y col., Surgery 108:331-336 (1990)). Se han señalado también otros posibles efectos en el rendimiento atlético; por ejemplo en el metabolismo lipídico, de modo que el consumo de arginina durante 2 semanas solamente causó el hundimiento de las concentraciones de colesterol tota l(Hurson, M. y col., J. Parenter. Enteral Nutr. 19:227-230 (1995)). Por tanto el uso de L-Arginina-L-Aspartato (Sargenor®) está muy extendido entre atletas y pacientes para aumentar los efectos del entrenamiento, así como para tolerar el ejercicio. Se han notificado efectos impresionantes en el rendimiento de resistencia en este campo tras un consumo prolongado de L-Arginina-L-Aspartato causando una disminución de las concentraciones de lactato en sangre y el ritmo cardíaco durante ejercicios submáximos y un mayor consumo de oxígeno con aumentos de la carga de trabajo (Schmid, P. y col., Leistungssport 10:486-495 (1980); Sellier, J., Rev. Med. Toulouse 5:879 (1979); Burtscher, M. y col., J. Sports. Sci. Med. 4:314-322 (2005)).

La suplementación de la dieta con 30 g/d de arginina aspartato durante 2 semanas a voluntarios humanos ancianos sanos potenció la acumulación de colágeno en las heridas significativamente (Witte, M. B. and Barbul. A., Wound Rep. Reg. 11:419-423 (2003)). Cuando se administraron 250 mg/kg/día de arginina aspartato oral a cinco sujetos sanos con edades comprendidas entre 20 y 35 años durante siete días, se produjo un aumento del 60% de GH durante el sueño de onda lenta (Besset, A. y col., Acta Endocrinol. 99:18-23 (1982)). Otro grupo de investigadores consiguió resultados prometedores después de tratar a 12 adultos normales con una dosis grande (37,5 g) de arginina aspartato oral, que causó una liberación reducida pero significativa de hGH en suero (Elsair 1987). Esto ha hecho que arginina-aspartato sea interesante para los culturistas que desean aprovechar las propiedades anabólicas de hGH (Macintyre, J. G., Sports Med. 4:129-142 (1987)).

Asimismo se ha señalado que L-Arginina-L-Aspartato administrado por vía oral induce efectos positivos en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Por ejemplo, indujo efectos antimetastáticos en carcinoma quístico adenoide de glándula salivar en ratones acompañados de inhibición de la formación de focos metastáticos pulmonares y una supervivencia prolongada. Los experimentos posteriores in vitro e in vivo confirmaron estos resultados (Li, F. y col., Chin. J. Stomatol. 36:464-466 (2001); Li, F. y col., Chin. J. Stomatol. 37:87-89 (2002); Appleton, J., Altern. Med. Rev. 7:512-522 (2002)).

En el campo de la salud dental, se observó que la placa, el material orgánico esponjoso que se adhiere fuertemente a las superficies del diente, aceptaba péptidos de determinado tamaño y forma dentro de su matriz. Además, se demostró que se almacenaban en la placa péptidos de 2 a 4 unidades de aminoácido, siendo una o más de ellas arginina, protegidas de la dilución para restaurar de forma eficiente el pH de la boca a un nivel no carioso (6,1 o más). Se demostró además que estos oligómeros son eficaces incluso cuando se proporcionan de forma simultánea a carbohidratos. Esto sugirió la inclusión de dichos péptidos en productos dentales comunes, tales como pastas dentífricas y chicles (Kleinberg, I., Solicitud de patente EE.UU 4225579 (1980)).

También se ha aplicado L-Arginina-L-Aspartato para el tratamiento de trastornos genitourinarios. DE es común en un 25% de hombres con edades comprendidas entre 45 y 70 años de edad con disfunción eréctil moderada y en un 10% con disfunción eréctil severa (Kernohan, A.F. B. y col., Br. J. Clin. Pharmacol. 59:85-93 (2004)). Recientemente, se ha utilizado “L-arginil aspartato” como componente de varios productos farmacéuticos para el tratamiento de DE en los hombres, como Prelox® (Lamm, S. y col., Eur. Bull. Drug Res. 11:29-37 (2003)). Los estudios clínicos sobre los componentes de Prelox® demostraron una mejora en la función eréctil en un 5% y 92% de los cuarenta hombres con DE que recibieron 3 dosis de 1 g de “L-arginil aspartato” (Sargenor®) (1,7 g de arginina al día) en solitario, o en combinación con Pycnogenol® (estimula la secreción de NOS), respectivamente (Stanislavov, R. y Nikolova, V., J. Sex Marit. Ther. 29:207-213 (2003)). Durante el estudio a largo plazo, se trató primero solo con Sargenor® a cincuenta hombres con edades comprendidas entre 45 y 60 años que presentaban DE, una disminución del volumen de semen, una reducción de la motilidad de espermatozoides y anormalidades morfológicas de los espermatozoides

12 5

15

25

35

45

55

en solitario durante 1 mes. El 10% de estos hombres experimentó una erección normal. Tras la adición de Pycnogenol® al tratamiento durante el segundo mes, el porcentaje de hombres con erección normal aumentó a un 80%. Se continuó el tratamiento durante un período de un año, tras el cual la calidad del esperma mejoró significativamente y 42% de las parejas lograron el embarazo (Stanislavov, R. y Nikolova, V., Int. J. Impot. Res. 14(4):S65 (2002); Lamm, S. y col., Eur. Bull. Drug Res. 11:29-37 (2003)). Esta última observación confirmó los estudios sobre el uso de arginina-aspartato, en los que aumentó el recuento y calidad espermática tras varios meses de suplementación (Tanimura, J., Bull. Osaka Med. School 13:84-89 (1967); Schellen, T. M. and Declerq, J. A., Dermatol. Monatsschr. 164:578-80 (1978); De-Aloysio, D. y col., Acta Eur. Fertil. 13:133-167 (1982)) y mejoró la fertilidad (Schacter, A. y col., J. Urol. 110:311-13 (1973); Schacter, A. y col., Int. J. Gynaecol. Obstet. 11:206-209 (1973)).

Apenas existen informes clínicos sobre dipéptidos que consiste en aspartato y lisina ya que este dipéptido no está disponible en grandes cantidades. No obstante, esta forma de dipéptido de lisina podría ser eficaz en los campos de aplicación conocidos para lisina libre y sus sales (véase lo anterior), en personas con deficiencia genética en los transportadores de lisina o, simplemente, como aditivo alimentario, con una mayor biodisponibilidad que la lisina libre, para seres humanos y animales. La arginina y la lisina funcionan sinérgicamente para liberar hormona del crecimiento (GH) (Suminski, R. R. y col., Int. J. Sport Nutr. 7:48-60 (1997)) y sus concentraciones son muy importantes en la nutrición del ser humano y animal (Armed, I. y Khan, M. A., Aquacult. Nutr. 10:217-225 (2004)). Las relaciones lisina:arginina bajas tienen un efecto hipocolesterolémico (Sánchez, A. y col., Nutr. 38:229-238 (1998)), de modo que se han hecho patentes para mezclas de proteína con una relación Arg: Lys de al menos 5,5 : 1 para su utilización con enfermedades cardiovasculares (Radha, C. y col., Solicitud de patente 7091001 (2006)). En contraposición, y dado que las proteínas del virus herpes simplex son ricas en L-Arginina, se sabe que una dieta con una relación alta de lisina con respecto a arginina en la dieta ayuda a reducir la replicación viral, los períodos de cicatrización y la citopatogenicidad durante los brotes (Griffith, R. S. y col., Dermatologica 156(5): 257-267 (1978)). Por lo tanto, en la prevención y el tratamiento de herpes, se sugiere la utilidad de evitar los alimentos ricos en arginina y consumir más alimentos ricos en lisina.

Las investigaciones recientes han señalado que la terapia en la que se utiliza L-lisina y L-arginina en combinación es útil, y posiblemente incluso mejor, que la combinación arginina/orinitina para estimular hGH y, en virtud de ello, mejorar la construcción de músculo, la ganancia de peso y el soporte inmunológico. En 15 sujetos de sexo masculino sanos con edades comprendidas entre 15 y 20 años, 1,2 g de arginina piroglutamato combinado con hidrocloruro de L-lisina elevó significativamente los niveles de GH desde el doble a ocho veces más el valor inicial tras consumir la mezcla de aminoácido (Isidori, A. y col., Curr. Med. Res. Opin. 7:475-481 (1981)). Otro estudio indicó que la ingestión de 1,5 g de arginina y 1,5 g de lisina consumidos en condiciones de reposo provoca un agudo aumento de la secreción de GH (Suminski, R. R. y col., Int. J. Sport Nutr. 7:48-60 (1997)).

Para simular las condiciones naturales dentro del tracto digestivo, se utilizó el “jugo” intestinal preparado como inóculo y como suplemento nutricional en tubos de Hungate anaeróbicos que contenían CGP. La degradación completa de CGP en todos los tubos indica que se puede degradar fácilmente CGP en dicho entorno anaeróbico similar al de los tractos digestivos. Esto se confirmó también por los cortos períodos de degradación, que son análogos a los observados previamente para bacterias degradadoras de CGP anaeróbicas estrictas y facultativas (Obst, M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:3642-3652 (2005); Sallam, A. y col., Presentado para publicación (2008)).

Durante este estudio y por primera vez se ha demostrado que las bacterias degradadoras de CGP están muy extendidas en los tractos digestivos de animales, aves y peces (Tablas 1, 2). Estudios anteriores sobre muestras del entorno demostraron también la diversidad morfológica entre las colonias degradadoras de CGP observadas durante los procedimientos de purificación y después entre los cultivos axénicos resultantes, lo que demostró la amplia extensión de degradadores de CGP entre procariotas (Tabla 2). Por otra parte, la capacidad de degradar CGP parece estar más extendida entre especies de géneros concretos; las investigaciones sobre la degradación de CGP extracelular hasta la fecha demuestran que los degradadores de CGP están muy extendidos entre los géneros Pseudomonas y Bacillus (Obst, M. y col., J. Biol. Chem. 277:25096-25105 (2002); Obst, M. y col., Biomacromolecules 5:153-161 (2004); Sallam, A. y col., este estudio ha sido presentado para publicación (2008)). No obstante, esto podría estar asociado a las condiciones de laboratorio aplicadas, que podrían haber favorecido estas bacterias, o simplemente debido al predominio de este género de bacterias en la naturaleza. Por otra parte, en contraposición con las cepas de los géneros Pseudomonas y Bacillus, es enormemente difícil traer a cultivos axénicos muchas bacterias degradadoras de CGP sin perder su capacidad de degradar CGP (Obst, M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:3642-3652 (2005); Krug, A., Diplom thesis, Institut fur Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfälische Wilhelms-Universität, Münster, Alemania (2001)) y normalmente se descartan.

Se observó la degradación parcial de CGP en cultivos axénicos únicamente en condiciones anaeróbicas, y solamente para 8 cepas de las 46 cepas que degradaron CGP anaeróbicamente. Una posible razón de ello es la falta de interacciones naturales entre estas cepas y las demás como en su entorno natural, que suele causar a menudo la acumulación o agotamiento de sustancias limitantes o necesarias, respectivamente. Esto se corresponde con las observaciones anteriores sobre el formador de endosporas anaeróbicas estrictas cepa Kl de S. hongkongensis, en las que se potenciaron en gran medida el crecimiento y la utilización de CGP en presencia de su coaislado cepa G de Citrobacter amalonaticus (Obst, M. y col., Appl. Environ.. Microbiol. 71:3642-3652 (2005)).

13 5

15

25

35

45

55

Entre los ocho aislados identificados, varias cepas presentaron capacidad de degradación de CGP anaeróbica, si bien pertenecen a géneros conocidos como aeróbicos, tales como Bacillus o Pseudomonas. Sin embargo, se sabe que las cepas de B. subtilis y B. megaterium crecen anaeróbicamente y se sabe que algunas reducen nitrato (Glaser, P. y col., J. Bacteriol. 177:1112-1115 (1995)). De manera similar, se ha investigado en profundidad el crecimiento anaeróbico y la reducción de nitrato de los miembros del género Pseudomonas (Sallam, A. y col., Presentado para publicación (2008)). Se sabe asimismo que especies de Micromonospora, Streptomyces y Brevibacillus son anaeróbicas facultativas (Cochrane, V. W., Annu. Rev. Microbiol. 15:1-26 (1961); Borodina, I. y col.,Genome Res. 15:820-829 (2005); Baek, S. H. y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:2665-2669 (2006)). En general, las investigaciones recientes acerca de la degradación de CGP apuntan hacia una amplia extensión de bacterias degradadoras de CGP entre las anaerobias facultativas.

Si bien CGP y sus dipéptidos son sustancias proteináceas simples de origen natural, se necesitan estudios clínicos para llevar estas sustancias al mercado. La extensión de bacterias de bacterias degradadoras de CGP en la flora intestinal de mamíferos, aves o peces sometida a ensayo durante el presente trabajo proporciona la primera evidencia de que CGP administrada por vía oral podría ser degradada de forma rápida y fácil al menos microbianamente. El aislamiento de dichas bacterias desde el tracto digestivo inferior de diferentes animales y aves (Tabla 1) indica que, si la digestión de CGP no se completó en el tracto digestivo superior, posiblemente continuaría en la parte inferior.

Los análisis de HPLC pusieron de manifiesto que los dipéptidos eran los productos de degradación de CGP de los 62 aislados. No se produjo ningún oligómero de dipéptido de orden superior, como tetrapéptidos (β-Asp-Arg)2, desde CGP. Esto está de acuerdo con el efecto de las CGPasas de la cepa Bl de P. anguilliseptica (Obst, M. y col.,

J. Biol. Chem. 277:25096-25105 (2002), cepa Kl de S. hongkongensis (Obst, M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:3642-3652 (2005)) y cepa DlP1 de P. alcaligenes (Sallam, A. y col., Presentado para publicación (2008)). Únicamente en el caso de la cepa BAC 19 de Bacillus megaterium, se detectaron dichos oligómeros de orden superior (Obst, M. y col., Biomacromolecules 5:153-161 (2004)). La Espirulina se conoce desde hace siglos por sus efectos nutricionales y terapéuticos y se sigue consumiendo como alimento en muchos países todavía hoy. Se sabe que el contenido en proteínas de la Espirulina alcanza más de 60% (Narasimha, D. L. R. y col., J. Sci. Food Agric. 33:456-460 (1982)). La presencia de CGP en los productos comerciales de Spirulina platensis indica que CGP podría participar en el efecto de bienestar del consumo regular de Espirulina. No obstante, el contenido de CGP determinado en las muestras analizadas varió en gran medida y fue relativamente bajo. Esto concuerda con los estudios anteriores sobre la acumulación de CGP en cianobacterias, según los cuales se sabe que hay muchos factores que afectan a la acumulación de CGP en cianobacterias, sabiéndose que la acumulación de CGP es afectada por muchos factores y que varía en consecuencia (Elbahloul, Y. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:77597767 (2005)). Por otra parte, seguramente, los productos de Espirulina comercializados han pasado por numerosas pruebas clínicas y toxicológicas antes de obtener su licencia para su comercialización. Esto indica que la CGP y los dipéptidos de CGP extraídos no deberían inducir ningún efecto tóxico al consumirlos por vía oral. Por otra parte, los dipéptidos de CGP se consumen y utilizan normalmente para el crecimiento en bacterias, y no presentaron ningún efecto bacteriostático ni bactericida durante las investigaciones dirigidas (no se muestran los datos). En general, los efectos y aplicaciones conocidos de Espirulina son muy similares a los demostrados para la arginina, hecho que señala que una parte de dichos efectos pueda deberse realmente al contenido en arginina (aproximadamente 6%) que incluye el de CGP.

Las bacterias poseen tres tipos de sistemas de transporte de péptidos, dos, oligopéptido permeasa (Opp) y dipéptido permeasas (Dpp), que pertenecen a la gran familia de transportadores ABC (cartucho de unión a ATP) y una para diy tripéptidos que pertenecen a la familia (de transportadores de péptido) PTR. Únicamente este último sistema se conserva en los organismos eucarióticos superiores, empezando por levaduras (Daniel, H. y col., Physiology 21:93102 (2006)). En los mamíferos, el sistema portador de di-y tripéptidos PEPT (familia SLC15) incluye 2 variantes: PEPT1 (SLC15A1) intestinal y la isoforma renal PEPT2 (SLC15A2). Transportan prácticamente todos los di-y tripéptidos posibles de manera estereoselectiva con preferencia de L-α-aminoácidos y sus derivados. Los péptidos que contienen solamente D-o cuatro o más aminoácidos no son aceptados. Dado que PEPT1 tiene una expresión prominente en todo el intestino delgado y debido a su alta capacidad de transporte, todos los sustratos de fármaco de PEPT1 presentan una excelente disponibilidad oral y, por tanto, PEPT1 ha pasado a ser un objetivo principal para la liberación de fármaco (Daniel, H. y col., Physiology 21:93-102 (2006)). Los L-aminoácidos constituyentes de los dipéptidos CGP, Asp-Arg y Asp-Lys (CGP recombinante) se unen a través de enlaces peptídicos α-β. Este tipo de unión y la estéreo-estructura de dipéptidos hace suponer sólidamente que podrían actuar como sustratos para el sistema PEPT y que pueden ser transportados desde el lumen del intestino de mamífero cuando se consumen. Por lo tanto, el uso de CGP y/o sus dipéptidos sería un enfoque ideal para la administración oral de los aminoácidos constituyentes como agentes terapéuticos y/o nutricionales.

Desde hace siglos se conocen los valores nutricionales y clínicos de los aminoácidos, incluyendo los que constituyen CGP como aspartato, arginina y lisina, y los que pueden integrarse todavía en su estructura como citrulina, ornitina, canavanina o glutamato. Se ha demostrado que las combinaciones de oligómero sintéticas de estos aminoácidos tienen una biodisponibilidad más alta que los aminoácidos libres y, por lo tanto, han sido frecuentemente objeto de investigación y se han aplicado en nutrición y terapia (véase lo anterior). CGP representa una fuente natural ideal para dichos oligómeros y, es de esperar, que sean más eficaces a dosis más bajas que los aminoácidos que los constituyen en su forma libre. Por consiguiente, actualmente, sigue investigándose la absorción, seguridad y efecto

14 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de CGP y sus dipéptidos. Por otra parte, los estudios sobre otros aminoácidos que integran CGP presentaron unos resultados prometedores (no se muestran los resultados). Los dipéptidos resultantes pudieron aplicarse en diversos campos terapéuticos; por ejemplo, aspartato-ornitina en el tratamiento de enfermedades hepáticas (Kircheis, G. y col., Hepatology 25:1351-1360 (1997)). En consecuencia, todas las futuras alteraciones de la estructura de CGP aumentarían la gama de dipéptidos de CGP y, por consiguiente, extenderían su alance de aplicación como productos terapéuticos y/o suplementos nutricionales.

Se estableció un proceso trifásico para una producción a gran escala de β-dipéptidos de cianoficina (CGP). La fase I se basa en un procedimiento de extracción de ácido optimizado para el aislamiento técnico de CGP desde biomasa; se obtuvo un total de 704 g de CGP pura, que contenía estructuralmente aspartato, arginina y un poco de lisina. La Fase II representa la producción fermentativa de una CGPasa extracelular (CphE); se produjo la enzima desde la cepa DlP1 de Pseudomonas alcaligenes, a escala 500 l y utilizando 1 g/l de citrato como único sustrato; se obtuvieron 17,5 g de polvo de proteína en bruto y presentó una alta actividad de degradación sobre CGP. La fase III comprende la degradación de CGP vía cphE; se degradaron 250 g de CGP en dipéptidos β-aspartato-arginina y βaspartato-lisina con un grado de pureza de más de 99% (CCF, HPLC). La eficiencia global de la fase II fue 91%, al tiempo que se recuperó un 78% (p/p) de la CphE utilizada y presentó una actividad sostenida sobre CGP. El proceso establecido depende de los materiales y equipos con las normas industriales y aplicables al respecto para cada escala deseada.

Se sabe que las cepas de P. alcaligenes, incluyendo la cepa DlP1, desarrollan una amplia gama de sustratos y que requieren cantidades mínimas de éstos. La alta productividad enzimática de dichas cepas constituye asimismo una de las principales razones para su aplicación en la producción fermentativa de lipasas extracelulares (WO 95/30744; Gerritse, G. y col., Appl. Environ. Microbiol. 64:2644-2651 (1998); Moore, E. R. B. y col. Mai 1999. Pseudomonas: Nonmedical. In Moore y col. (ed.), The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, 3ª edición, release 3.0, Springer-Verlag, Nueva York)). Estas características, sumadas a la alta estabilidad y actividad de la CGPasa desde la cepa DlP1 (Sallam, A., y A. Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 74(11):3434-3443 (2008)), fueron los factores principales para considerar esta cepa ideal para el proceso técnico diseñado.

Antes de crear el proceso trifásico final, se llevaron a cabo varias pruebas para alcanzar la misma meta cultivando la cepa DlP1 directamente sobre CGP; sin embargo, esa estrategia resultó menos eficiente debido al rápido consumo de dipéptidos CGP de las células en crecimiento; durante los procedimientos del proceso trifásico redefinidos se evitó el problema, excluyéndose las células de la cepa DlP1. Por otra parte, las soluciones de dipéptido obtenidas por cultivo directo presentaron grandes volúmenes y, por lo tanto, resultaron enormemente difíciles de manejar; asimismo, la presencia de pequeñas proteínas y sales en las soluciones de dipéptido resultantes representaron otra desventaja más de esa estrategia. En contraposición, son totalmente controlables las concentraciones de CGP degradada a través del proceso trifásico, así como el tiempo para la degradación. Siendo así, las soluciones de dipéptido resultantes se restringen a volúmenes pequeños y fáciles de manejar. La concentración más alta ensayada (50 g/l) es uno de los aspectos que aún se pueden optimizar para aplicaciones futuras haciendo así que el proceso sea más eficiente desde el punto de vista económico.

Los factores económicos son por lo general de gran importancia para los procesos técnicos, de manera que los resultados obtenidos durante la optimización del medio y la utilización del sustrato se consideraron satisfactorios; el citrato, que es un sustrato económico en cantidades técnicas, y que fue ideal para la cepa aplicada como único sustrato, había sido aplicado anteriormente para la producción fermentativa de lipasas extracelulares (Gerritse, G. y col., Appl. Environ. Microbiol. 64:2644-2651 (1998)), sin embargo, la necesidad de un medio optimizado para la fase de producción de CphE en bruto (Fase II) se materializó en la necesidad de un control preciso del grado de turbiedad durante la fermentación, especialmente durante la fase de inducción y degradación. Las experiencias previas con la degradación de CGP experimental demostraron que medios turbios, así como un fuerte crecimiento de células pueden ser engañosos; además, un mejor crecimiento de células no significó esencialmente una mayor producción de CGPasa extracelular (datos sin publicar).

Se optimizó el procedimiento de extracción de ácido de CGP de Frey, K. M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 68: 3377-3384 (2002), que se había aplicado con éxito durante estudios previos, para que fuera adecuado para el aislamiento de CGP pura a partir de cualquier cantidad técnica de biomasa. El cambio más efectivo con respecto al procedimiento original fue la etapa de filtración estéril de la CGP en solución; este procedimiento garantizó la completa eliminación de cualquier residuo celular insoluble en el HCl diluido. En contraposición, las etapas de mayor purificación con ácido diluido y agua, pueden conllevar innecesariamente una mayor pérdida de CGP, hecho que explica la diferencia entre la CGP obtenida y la cantidad esperada. La pérdida de CGP, así como el tiempo necesario para su extracción, se pueden minimizar centrifugando CGP en lugar de dejarlo sedimentarse a 4 ºC.

Alternativamente, se puede aumentar drásticamente la productividad global de este procedimiento de extracción si se aplica un instrumento efectivo, como por ejemplo, un flujo cruzado; en este caso, se necesitan 2 cartuchos con 2 puntos de corte diferentes: uno más grande y el otro más pequeño que el tamaño molecular de la CGP que se va aislar; los 2 cartuchos se han de aplicar para la filtración alterna de CGP en los estados de CGP, disuelto y precipitado, respectivamente. No obstante, los precios relativamente altos y la vida aún limitada de dichos cartuchos de ultrafiltración hacen que su aplicación sea cuestión de costes.

15 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Durante la producción fermentativa de la CphE en bruto (Fase II), se empleó la inducción con la CGP dentro de la fase estacionaria para garantizar una producción máxima de CphE, y para achacar los cambios de turbiedad exclusivamente a la cantidad de CGP en el medio.

El pH del medio aumentó para exceder el intervalo tolerado (pH 6,9 a 7,5) y se controló mediante la adición de HCl; lo más probable es que esto se deba a que las células de la cepa DlP1 de P. alcaligenes liberan amoníaco. Durante las investigaciones sobre la degradación de CGP, se documentó un comportamiento fisiológico similar para esta cepa (Sallam, A., y A. Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 74(11):3434-3443 (2008)).

El idéntico grado de pureza de los dipéptidos de CGP resultantes antes y después de los diferentes sistemas de filtración probados se debe claramente a la inicial falta de impurezas en la solución de dipéptido original. Esto representa otra ventaja para la aplicación de un proceso enzimático definido en comparación con las estrategias de cultivo directo con células bacterianas. Por otra parte, fue de esperar, y lamentablemente inevitable, la pérdida cuantitativa de dipéptidos debido a la filtración; se sabe que dichas pérdidas son causadas por diversos factores generales: el material de filtro, los puntos de corte y/o las características de la propia sustancia filtrada. Esto explica también la pérdida de un 9% de CGP y un 22% de CphE en bruto durante la fase de degradación (Fase III). Además, solamente se sometieron a ensayo membranas de filtro nuevas (COPs de 0,5-10 kDa), por tanto, lo más probablemente es que las cantidades perdidas de dipéptidos de CGP estén unidas a las superficies de membrana hasta la saturación.

Aunque la efectividad del proceso global de un 91% es bastante alta, se pueden mejorar aún más varios aspectos y, por lo tanto, están en vías de optimización; dichos aspectos incluyen una mayor productividad de CphE en bruto, posibles estrategias de purificación técnica para CphE y condiciones más eficaces para la fase de degradación (datos sin publicar). El valor comercial de los dipéptidos de CGP está directamente relacionado con los costes de producción de la propia CGP, si bien, durante los últimos años, se ha investigado intensamente la producción de CGP y se ha optimizado mediante el uso de diversas cepas bacterianas, en virtud de lo cual, se están consiguiendo cada vez más cantidades de CGP utilizando sustratos nuevos más adecuados y económicos; parece ser que estos avances van rápido en la dirección de la producción de CGP comercial (véase lo anterior); así pues, ha sido necesario que se comercialicen otros poliaminoácidos bacterianos como poli(ácido glutámico) y poly(ε-lysine), tanto para aplicaciones técnicas como alimentarias (revisado por Oppermann-Sanio F. B. y col., Naturwissenschaften 89:11-22 (2002); Obst, M. y col., Biomacromolecules 5:1166-1176(2004)). Hasta entonces, el valor biomédico de los dipéptidos de CGP puede de hecho mantener una relación de equilibrio con los costes de producción de CGP actuales. Por lo tanto, los efectos biomédicos de los dipéptidos de CGP se están investigando actualmente (Sallam, A., y A. Steinbüchel. 2007c. Potential of cyanophycin and its β-dipéptidos as possible additives in therapy, food and feed industries).

Se optimizó un proceso biotecnológico aplicado anteriormente para la producción a gran escala de β-dipéptidos a partir de cianoficina (CGP); el proceso original consistía en tres fases; Fase I: extracción a gran escala de CGP pura desde biomoasa; Fase II: producción a gran escala de cianoficinasa en bruto (CphEa1) desde la cepa DlP1 de Pseudomonas alcaligenes; Fase III: degradación de CGP en sus péptidos. Se determinaron las condiciones de cultivo óptimas para la segunda fase: 2 g l-1 de citrato, pH 6,5 y temperatura de cultivo 37 ºC. La concentración óptima para CGP como inductor de CphEal fue 50 g l-1, lo que representa 1/5 de la concentración aplicada previamente. Se obtuvieron concentraciones de enzima máximas tras 5 h de inducción. La misma concentración de dipéptidos de CGP demostró una eficiencia de inducción similar al cabo de 3 h solamente. Asimismo, una cantidad óptima de 4 g l-1 de L-aspartato indujo CphEal, si bien con un 1/3 de eficiencia en comparación con CGP. Se purificó CphEal a través de la unión específica de sustrato sobre CGP. Se caracterizó la enzima purificada y resultó ser una serina proteasa con una actividad máxima a 50 ºC y un pH 7-8,5. Se pudieron optimizar las condiciones para la Fase III del proceso original (degradación de CGP): pasando de 50 g l-1 de CGP, 10 g l-1 de CphEal en bruto e incubación durante 10 h a 30 °C a 100 g l-1 de CGP, 10 g l-1 de CphEal en bruto e incubación durante solamente 4 h a 50 °C. Se degradó CGP en los dipéptidos β-aspartato-arginina y β-aspartato-lisina, con un grado de pureza de más de 99% (HPLC). Estas optimizaciones supusieron que el proceso técnico fuera más eficiente en lo relativo al coste, el tiempo y el esfuerzo. Antes de la producción de CGP sobre protamilasa a una escala de fermentación de 500 l, los ensayos previos acerca de la carga disponible de protamilasa pusieron de manifiesto que 7% (vol/vol) era óptimo para la producción de CGP, si bien, durante el estudio previo de Elbahloul, Y. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:7759-7767 (2005) sobre la carga anterior de protamilasa, se observó que la concentración óptima era 6% (vol/vol). Esto se debe a que la protamilasa, que es un compuesto residual de la producción industrial de almidón, es un medio complejo con una composición que puede variar de una carga a otra y, por tanto, ha de ajustarse antes de la aplicación como medio de cultivo.

Durante la fermentación, y después de las primeras 6 h, se elevó la temperatura a 37 ºC con el fin de inactivar la λrepresor (cl857) sensible a la temperatura dando cabida así a la inducción del gen (CphA) de CGP-sintasa. En este punto, las células de la cepa E. coli recombinante estuvieron todavía dos horas en la fase de crecimiento exponencial. Se demostró que este curso de fermentación era óptimo para la inducción de CGP-sintetasa, así como para una máxima acumulación intracelular de CGP (Frey, K. M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 68:3377-3384 (2002)).

16

imagen9

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

el mantenimiento de cultivos viables.

Para el aislamiento de la cepa DlP1 de P. alcaligenes se utilizó un medio mineral modificado de Dufresne, A. y col., Macromolecules 31:6426-6433 (1998) (Medio SM): 1,0 g NH4Cl , 5,0 g KH2PO4, 1 g MgSO4 · 7H2O (esterilizado y añadido por separado) y 10 ml de solución de reserva de elementos traza por l de agua del grifo. La solución de reserva de elementos traza contenía ácido nitrilotriacético (70 mM, pH 6,5), FeSO4 · 7H20 (5 g/l), MnCl2 · 4H2O (0,85 g/l), CoCl2 · 6H2O (0,14 g/l), CuCl2 · 2H2O (0,085 g/l), H3BO3 (0,17 g/l), ZnSO4 · 7H2O (0,9 g/l), y Na2MoO4 · 2H2O (0,09 g/l). Se ajustó el pH del medio a 7,0 y posteriormente se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 minutos.

Se pusieron en matraces Erlenmeyer con deflectores los cultivos líquidos y se incubaron en un agitador horizontal Pilotshake RC-4/6-W (Kühner AG, Birsfelden, Suiza) a 150 rpm. Para preparar las placas agar con recubrimiento superpuesto de CGP, se añadió un 1,2% (p/vol) de bacto-agar a una suspensión de CGP (1-2 g/l); posteriormente, se esterilizó esta mezcla en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos y después del enfriamiento a 45 ºC, se vertió como capas finas sobre las placas de agar SM preparadas anteriormente.

Para preparar las capas de agar con recubrimiento superpuesto de CGP, se añadió un 1,2% (p/vol) de bacto-agar a una suspensión de CGP (1-2 g/l); posteriormente, se esterilizó esta mezcla en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos y después del enfriamiento a 45 ºC, se vertió como capas finas sobre las placas de agar SM preparadas anteriormente.

Fuente y aislamiento de CGP: Se aisló CGP “recombinante” de células liofilizadas de Ralstonia eutropha H16-PHB4-∆eda (pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16) (Voss, I. y col., Metabol. Eng. 8:66-78 (2006)) y se purificó con arreglo a un procedimiento de extracción de ácido modificado (Frey, K. M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 68:3377-3384 (2002)). Se aisló CGP de productos comerciales de Espirulina de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente para cianobacterias (Simon, R. D. y col., Biochim. Biophys. Acta 420:165-176 (1976)).

Para aislar y purificar CGP a mayor escala, se optimizó el procedimiento de extracción de ácido (Frey, K. M. y col., Appl. Environ. Microbiol. 68:3377-3384 (2002)) del siguiente modo: se suspendió la masa seca con contenido en CGP en agua del grifo para dar una concentración final de 0,1 g/ml. Se redujo el pH a 1 con HCl concentrado (32%) y se agitó durante toda la noche. Se centrifugó la suspensión a 17000 rpm con una centrífuga continua CEPA Z61 (CEPA, Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Alemania), se volvió a suspender el sedimento en 20 l de HCl 0,1 N, se agitó durante 1 h, se volvió a centrifugar y se añadió el sobrenadante a la primera carga, al tiempo que se descartaba el sedimento. Se neutralizó el sobrenadante que contenía CGP (pH 7,3) con NaOH (50%) en botellas de vidrio de 30 I para que precipitara CGP. Se dejó sedimentar la suspensión lechosa durante toda la noche a 4 ºC antes de descartar el sobrenadante. Se disolvió CGP repetidamente y se neutralizó 3 veces más para eliminar todas las impurezas insolubles en HCl diluido. Se volvió a disolver la CGP resultante en 30 l de HCl 0,1 N y se pasó a través de una unidad de filtro Sartobran-P de 0,2 µm tipo 00 (Sartorius AG, Göttingen, Alemania). Se volvió a neutralizar la solución (pH 7,3) con NaOH, se dejó reposar toda la noche, se descartó el sobrenadante. Para eliminar cualquier impureza hidrosoluble y desalar CGP, se lavó el sedimento 3 veces sucesivas con 5 volúmenes de lecho de agua destilada. Finalmente, se centrifugó el sedimento de CGP a 20000 rpm (centrífuga continua CEPA Z41), se congeló a -30 ºC y se liofilizó en un liofilizador BETA tipo 1-16 (Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode, Alemania).

Esterilización de CGP: Para preparar suspensiones de reserva de CGP estériles, se añadió éter dietílico a CGP en una relación 3:1 (vol/p). Al cabo de 15 minutos, se descartó el disolvente y después de completar la evaporación, se obtuvo una suspensión fina disolviendo CGP en HCl 0,1 N estéril y haciendo precipitar después el polímero a un pH 7,3 por adición de un volumen igual de NaOH 0,1 N estéril. Alternativamente, se disolvió CGP primero en HCl 0,1 N, se pasó a través de un filtro (tamaño de poro 0,2 µm, Millipore GmbH, Eschborn, Alemania) y finalmente se volvió a precipitar tal como se ha descrito antes. Se ajustaron las concentraciones de CGP en las soluciones de reserva por sedimentación de CGP con una centrifugación breve (3500 x g durante 2 minutos) o dejando sedimentar CGP simplemente durante toda la noche a 4 ºC. En ambos casos, se descartó después parcialmente el sobrenadante para obtener finalmente la concentración de CGP deseada. Se llevaron a cabo los experimentos para determinar la degradación de CGP anaeróbica en tubos Hungate preparados anaeróbicamente que contenían 10 ml de BM con y sin 0,5 g l-1 de extracto de levadura. Se inyectaron suspensiones de CGP estériles directamente en los tubos Hungate con BM preparados anaeróbicamente hasta concentraciones finales de 1 g l-1. La desaparición a simple vista de CGP en los tubos indicó su degradación. Para preparar placas agar con recubrimiento superpuesto de CGP, se añadió un 1,2% (p/vol) de bacto-agar a una suspensión de CGP; posteriormente, se esterilizó esta mezcla en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos y después del enfriamiento a 45 ºC, se vertió como capas finas sobre las placas de agar SM preparadas anteriormente.

Degradación anaeróbica de CGP con muestras de flora intestinal de mamífero, aves y peces: Para simular las condiciones naturales de los hábitats en los que se obtuvieron las muestras, se utilizaron las muestras preparadas como inóculo y como suplemento nutricional al mismo tiempo. Se inocularon tubos Hungate anaeróbicos estériles que contenían 1 g l-1 CGP en medio BM (sin extracto de levadura) hasta una concentración final de 10% y se incubaron a 37 ºC hasta que tuvo lugar la degradación.

19 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Reconocimiento de bacterias degradadoras de CGP en la flora intestinal: Para aislar bacterias degradadoras de CGP, se extendieron partes alícuotas de 100 µl de las muestras de flora preparadas sobre placas de agar BM preparadas aeróbicamente con recubrimientos superpuestos de CGP. Durante la incubación durante varios días a 37 ºC, se inspeccionaron las capas para determinar la aparición de halos causada por las colonias de bacterias degradadoras de CGP. Asimismo, durante la incubación, se aplicó un procedimiento de recuento de colonia para determinar las relaciones entre las colonias degradadoras de bacterias y las no degradadoras.

Aislamiento de cultivos axénicos degradadores de CGP: Se seleccionaron colonias bacterianas degradadoras de CGP morfológicamente diferenciadas y se purificaron posteriormente transfiriendo el material desde las colonias que presentaban halos de degradación a placas agar con recubrimiento superpuesto de CGP nuevas durante tres generaciones sucesivas. A continuación, se aplicaron tres etapas de purificación en las placas agar LB antes de someter a ensayo el cultivo axénico sobre las placas agar con recubrimiento superpuesto de CGP para confirmar que retenían la capacidad de degradar CGP.

Control de pureza: Se confirmó periódicamente la pureza de los cultivos axénicos aislados con microscopio y también mediante el cultivo en diferentes medios en condiciones tanto anaeróbicas como aeróbicas.

Técnicas de análisis: Se detectaron aminoácidos libres y pequeños péptidos (dipéptidos de CGP) por HPLC en fase inversa (Kontron Instruments, Neufahrn, Alemania) tras la derivación pre-columna de sus grupos amino libres con reactivo o-ftaldialdehído (OPA), tal como se ha descrito anteriormente (Aboulmagd, E. y col., Arch. Microbiol. 174:297-306 (2000)). Para el análisis de muestras de CGP, se sometió el polímero con antelación a hidrólisis ácida HCl 6 N, 95 ºC, durante toda la noche). De manera similar, se aplicó hidrólisis ácida para la confirmación cualitativa y cuantitativa de los aminoácidos que constituían el dipéptido. Se equipó el sistema de HPLC con una columna B801 (Prep Nova-Pak HR 3,9 x 300) (Knauer GmbH, Berlin, Alemania), y se equilibró con eluyente de partida (81%, vol/vol, Na-acetato (50 mM): 19%, vol/vol, metanol). Se eluyeron los derivados OPA de los aminoácidos con un gradiente de metanol (19-75%, vol/vol) a 40 ºC y con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min y después se detectaron fluorométricamente a 330/40 nm (excitación/emisión) empleando un detector de fluorescencia modelo 1046A (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania). Para la calibración, se utilizaron aminoácidos cromatográficamente puros (Kollection AS-10 de Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Alemania) o dipéptidos producidos por la hidrólisis enzimática total de CGP empleando la CGPasa extracelular de P. alcaligenes DIP1 (CphEal) (Sallam, A. y col., Presentado para publicación (2008)).

Se controló el crecimiento bacteriano midiendo el aumento de la turbiedad a 578 nm tras la inserción de los matraces Klett en un espectrofotómetro Eppendorf 1101M (Eppendorf, Hamburg, Alemania).

Se aplicó el análisis de cromatografía de capa fina (CCF) sobre placas de gel de sílice 60 (Merck, Darmstadt, Alemania); se utilizó el eluyente de partida de la HPLC como tampón de corrida también para la CCF, para la tinción, se aplicó una solución de ninhidrina al 20% (p/vol) en acetona. Se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en geles al 11,5% (p/vol) según Laemmli, R.U., Nature 227:680-685 (1970). Se mancharon las proteínas y la cianoficina con el método de tinción Coomassie (Weber, K. y col., J. Biol. Chem. 244:4406-4412 (1969)) y a continuación el método de tinción de plata (Heukeshoven, J. y col., Electrophoresis 6:103-112 (1985)) para producir proteínas con concentraciones visibles menores.

Extracción de ADN y análisis de genes ARNr 16s: Se llevó a cabo el aislamiento del total de ADN genómico desde los cultivos axénicos tal como se ha descrito anteriormente (Rao, R. N. y col., Methods Enzymol. 153:166-198 (1987)). Se amplificaron los genes ARNr 16S por PCR desde el total de ADN utilizando cebadores de oligonucleótido habituales (MWG-BIOTECH AG, Ebersberg, Alemania). Se purificaron los productos de la PCR utilizando un kit Nucleo-trap CR (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y después se secuenciaron directamente. Se realizó la secuenciación de ADN adaptada en el instituto para química clínica y medicina de laboratorio (W.W.U. Münster, Alemania) en un secuenciador capilar (analizador de AND ABI Prism 3730) y se analizaron las secuencias con el software de recogida de datos v3.0 (ambos de Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se prepararon las reacciones de secuencia utilizando un equipo secuenciador de ciclo v3.1 BigDyeq terminator (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con los procedimientos indicados por el fabricante y los siguientes cebadores de secuencia:

27f (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’; SEQ ID NO:1),

343r (5’-CTGCTGCCTCCCGTA-3’; SEQ ID NO:2),

357f (5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’; SEQ ID NO:3),

519r (5’-G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3’; SEQ ID NO:4),

536f (5’-CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C-3’; SEQ ID NO:5),

803f (5’-ATTAGATACCCTGGTAG-3’; SEQ ID NO:6),

907r (5’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’; SEQ ID NO:7),

1114f (5’-GCAACGAGCGCAACCC-3’; SEQ ID NO:8),

1385r (5’-CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3’; SEQ ID NO:9) y

1525r (5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’; SEQ ID NO:10)

20

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

combinación con el paquete de software MFCS/win (B. Braun Biotech International).

Se cargó el biorreactor con 400 l de medio de protamilasa al 7% (pH 7,5) y 75 ml de solución antiespumante, se esterilizó in situ y después de la refrigeración a 30 ºC, se inoculó con un 4% (vol/vol) de precultivo tras la adición de 100 mg l-1 de solución de ampicilina estéril. Se puso en marcha el cultivo a 30 ºC durante las 6 primeras horas, se mantuvo el pH del medio a 7,5 por adición de NaOH 6M o HCl 6M. Se mantuvo la pO2 constante a 20% y se mantuvo estable a 0,17 vvm (volumen por volumen x minuto). Se controló la formación de espuma automáticamente con un destructor mecánico de espuma o mediante la adición de una solución antiespumante estéril (50%, vol/vol). Al cabo de 6 h de incubación, se elevó la temperatura a 37 ºC hasta que terminó la fermentación. Se cosecharon las células por centrifugado con una centrífuga continua CEPA tipo Z61 (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Alemania).

Extracción y purificación de CGP a gran escala: Para obtener CGP puro desde la biomasa húmeda resultante, se aplicó el procedimiento de extracción de ácido previamente optimizado para la extracción y purificación de CGP a gran escala (Sallam, A., y A. Steinbüchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of βdipéptidos from cyanophycin. En preparación). Finalmente se congeló la CGP extraída a -30 ºC y se liofilizó en un liofilizador BETA tipo 1-16 (Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode, Alemania).

Esterilización de CGP: Se esterilizó CGP con éter dietílico o por disolución en HCl 0,1 N y filtración estéril tal como se ha descrito anteriormente (Sallam, A., y A. Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 74(11):3434-3443 (2008)). Se ajustaron las concentraciones de CGP deseadas en soluciones de reserva por sedimentación de CGP con un breve centrifugado (2800 x g durante 2 min) o dejando sedimentar la CGP durante toda la noche a 4 °C; a continuación, se descartó parcialmente el sobrenadante para obtener la concentración de CGP deseada.

Técnicas de análisis: Se controló el crecimiento bacteriano y la degradación de CGP midiendo el cambio de turbiedad tras la inserción de los matraces Klett en un fotómetro Klett (Manostat Corporation, Nueva York, EE.UU.),

o midiendo la DO en muestras de 1 ml a 600 nm con un fotómetro Libra S5 (Biochrom Ltd., Cambridge, RU). Se llevó a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en geles al 11,5% (p/vol) según Laemmli, R.U., Nature 227:680-685 (1970). A continuación, se aplicó renaturalización en gel de las proteínas (Lacks, S. A. y col., J. Biol. Chem. 225:7467-7473 (1980)). Se mancharon las proteínas y la cianoficina con el método de tinción Coomassie (Weber, K. y col., J. Biol. Chem. 244:4406-4412 (1969)) o con métodos de tinción de plata (sólo para proteínas) (Nesterenko, M. V. y col., J. Biochem. Biophys. Methods 3:239-242 (1994)). Se determinaron las concentraciones del total de proteínas y CGP utilizando un reactivo Bradford tal como describe (Elbahloul, Y. y col., Appl. Environ. Microbiol. 71:7759-7767 (2005)). Se concentraron, desalaron y separaron de dipéptidos de CGP las proteínas de tamaño grande de las muestras de cultivo por ultrafiltración utilizando tubos Vivaspin con membrana de 10 kDa (Vivascience AG, Hannover, Alemania),o utilizando una cámara Amicon (Amicon, Beverly, EE.UU) con membranas de 10 kDa (Millipore Corporation, Bedford, EE.UU.) para volúmenes más grandes. Se detectaron aminoácidos libres y dipéptidos por HPLC en fase inversa (Kontron Instruments, Neufahrn, Alemania) tras la derivación precolumna de sus grupos aminoácido libre con reactivo ortoftaldialdehído (OPA) tal como se ha descrito antes (Aboulmagd, E. y col., Arch. Microbiol. 174:297-306 (2000)). Para el análisis de los aminoácidos constituyentes de CGP o dipéptidos de CGP, se sometieron las muestras con antelación a hidrólisis ácida (HCl 6 N, 95 ºC durante toda la noche). El sistema de HPLC estaba equipado con una columna B801 (Prep Nova-Pak HR 3.9 x 300) (Knauer GmbH, Berlin, Alemania) y equilibrado con un eluyente de partida (81%, vol/vol, Na-acetato (50 mM): 19%, vol/vol, metanol). Se eluyeron los derivados de OPA de aminoácidos con un gradiente de metanol (19-75% vol/vol) a 40 ºC con una velocidad de flujo de 1,0 ml min-1 y, a continuación, se detectaron fluorométricamente a 330/450 nm (excitación/emisión) empleando un detector de fluorescencia modelo 1046A (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania).

Determinación de la actividad y concentración de CnhEal: Se examinó la actividad de cianoficinasa (CphEal) en virtud de la formación de halos de degradación en las placas de agar con recubrimiento superpuesto de CGP con pequeñas partes alícuotas de soluciones de enzima concentradas; para ello, se centrifugaron 5 ml de muestras de cultivo a 2800 x g durante 30 min (Megafuge 1.0 R, Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, Alemania) y se concentraron 4 ml del sobrenadante resultante 100 veces por ultrafiltración. Para la determinación cuantitativa de la enzima en las muestras de cultivo, se desarrolló un método fotométrico del siguiente modo: se añadieron 2 µl del sobrenadante de cultivo concentrado a 1 ml de suspensión de CGP (100 mg l-1) y se incubó a 30 ºC durante 30 minutos en un rotador de tubos (3 rpm, tipo 502 S, Watson-Marlow GmbH, Rommerskirchen, Alemania). Finalmente, se midió el OD600nm de las muestras, que indicó la disminución de la cantidad de CGP como consecuencia de la degradación; esto a su vez se utilizó para indicar la concentración de CphEal en las soluciones en la curva de calibración correspondiente.

Concentraciones y condiciones óptimas para la degradación de CGP: Utilizando polvo de CphEal en bruto obtenido de la fermentación de 500 l anterior con cepa DlP1 de P. alcaligenes (Sallam, A., and A. Steinbüchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of β-dipéptidos from cyanophycin. En preparación.), y para determinar la relación óptima entre la concentración de CGP y CphEal en bruto con respecto al tiempo de degradación necesario, se prepararon diluciones en serie (50-100 g l-1) de suspensiones de CGP pura (en agua, pH 7,3) en tubos Eppendorf con un volumen total de 1 ml cada uno; se añadieron diferentes cantidades de polvo de CphEal en bruto [contenido de CphEal 4,6% (p/p)] a cada concentración de CGP preparada, se incubaron los tubos

22

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

Claims (1)

1. imagen1