ES2620492T3

ES2620492T3 - Reducción del contenido de ácidos grasos saturados en semillas de plantas

Info

Publication number: ES2620492T3
Application number: ES14191879.7T
Authority: ES
Inventors: Scott Bevan; Daniel J. Gachotte; Ann Owens Merlo; Mark A. Thompson; Terence A. Walsh
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: CL2012003665A1; EP2862930B1; IL244003A0; TW201634695A; NZ700897A; TW201634696A; IL244002A0; UA115302C2; CA2803098A1; DK2585600T3; EP2585600A4; DK2862931T3; EP2585600B1; JP6186462B2; JP2016136957A; WO2011163632A2; CA2999347C; EA201291332A1; CA2803098C; EP2862931B1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una enzima delta-9 desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO:14, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además un elemento regulador de gen que está operativamente unido al polinucleótido.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

III. Términos

Ácidos grasos: como se usa en este documento, el término "ácido graso" se refiere a ácidos alifáticos de cadena larga (ácidos alcanoicos) de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, desde aproximadamente C12 a C22, si bien se conocen tanto ácidos de cadena más larga como de cadena más corta. La estructura de un ácido graso se representa por la notación, x:yΔz, donde "x" es el número total de átomos de carbono (C) en el ácido graso particular, e "y" es el número de doble enlaces en la cadena de carbono en la posición "z," como se cuenta desde el extremo carboxílico del ácido.

Vía metabólica: el término, "vía metabólica," se refiere a una serie de reacciones químicas que ocurren dentro de una célula, catalizadas por enzimas, para lograr ya sea la formación de un producto metabólico, o la iniciación de otra vía metabólica. Una vía metabólica puede implicar varios o muchos pasos, y puede competir con una vía metabólica diferente para sustratos de reacción específicos. Del mismo modo, el producto de una vía metabólica puede ser un sustrato para todavía otra vía metabólica.

Ingeniería metabólica: para los propósitos de la presente invención, "ingeniería metabólica" se refiere al diseño racional de estrategias para alterar una o más vías metabólicas en una célula, de manera que se alcance la modificación paso a paso de una sustancia inicial en un producto que tiene la estructura química exacta deseada dentro del esquema general de todas las vías metabólicas operativas en la célula.

Desaturasa: tal como se usa en este documento, el término "desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar (es decir, introducir un enlace doble) en uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso o precursor de interés. Una enzima desaturasa de ácido graso soluble en la planta puede introducir un doble enlace regioespecíficamente en un sustrato acil-ACP saturado. Las acil-CoA desaturasas introducen un doble enlace regioespecíficamente en un sustrato acil-CoA graso saturado. La reacción implica la activación del oxígeno molecular por un centro de dihierro reducido de dos electrones coordinado por un haz de cuatro hélices que forma el núcleo de la arquitectura de la desaturasa. De particular interés en algunas formas de realización son las acil-CoA delta-9 desaturasas.

La delta-9-18:01-ACP desaturasa es requerida en todas las plantas para el mantenimiento de la fluidez de la membrana. Mientras que esta enzima desatura principalmente estearoil-ACP, también es activa en un grado menor con palmitoil-ACP.

Desaturasa variante: como se usa en este documento, el término "desaturasa variante" abarca aquellas desaturasas que muestran perfiles de actividad específicos consistentes con un papel en la producción de ácidos grasos inusuales. Una desaturasa variante puede ser aislada de un organismo, creada con ingeniería por medio de un programa de evolución dirigida, o creada como una desaturasa sintética incorporando aminoácidos conservados de una o más desaturasas caracterizadas.

Planta de progenie: a los efectos de la presente invención, "planta de progenie", se refiere a cualquier planta, o material de planta obtenido a partir de la misma, que se pueda obtener por métodos de cultivo de plantas. Los métodos de cultivo de plantas son bien conocidos en la técnica, e incluyen la reproducción natural, cría artificial, cría selectiva que implica el análisis de los marcadores moleculares de ADN, transgénicos, y cría comercial.

Material de la planta: como se usa en este documento, el término "material de la planta" se refiere a cualquier célula

o tejido obtenido de una planta.

Molécula de ácido nucleico: una forma polimérica de nucleótidos, que puede incluir tanto cadenas de sentido como cadenas de antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mezclados de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido, o una forma modificada de ambos tipos de nucleótidos. Una "molécula de ácido nucleico" como se usa en este documento es sinónima con "ácido nucleico" y "polinucleótido." El término incluye formas de ADN de cadena sencilla y doble. Una molécula de ácido nucleico puede incluir uno o ambos de nucleótidos naturales y nucleótidos modificados unidos por enlaces de nucleótidos tanto naturales como no naturales.

Las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar químicamente o bioquímicamente, o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o bases de nucleótidos derivatizadas, como será fácilmente apreciado por los expertos en la técnica. Tal modificación incluye, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones de internucleótidos, tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioles, fosforoditiolatos, etc.), restos pendientes (por ejemplo, péptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc). El término "molécula de ácido nucleico" también incluye cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones de cadena sencilla, de cadena doble, parcialmente duplicada, triplicada, en forma de horquilla, circular y de candado.

Operativamente unido: una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico está en una relación funcional con la

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

alineadas por los métodos descritos en los párrafos siguientes. Cuando se alinean, una posición en una secuencia está en "una posición análoga” con una posición en la secuencia alineada si las posiciones son idénticas dentro de la secuencia de consenso.

Métodos para la alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch,

J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, 1992; Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:307-31, 1994; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-50, 1990. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (examen detallado de los métodos de alineación de secuencia y los cálculos de homología).

La herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponible en internet (en blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), en conexión con los programas de análisis de secuencia, por ejemplo, blastp y blastn. Una descripción de como determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en internet a través del NCBI en blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi?CMD=Web&PAGE _TYPE=BlastDocs.

Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, la función "Blast 2 sequences" del programa BLAST (bl2seq) se emplea utilizando los parámetros por defecto. Los parámetros específicos se pueden ajustar a la discreción del experto en la técnica, para por ejemplo, proporcionar una sanción por una falta de coincidencia o recompensa por una coincidencia.

Transformado: como se usa en este documento, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico ajeno, tal como una construcción. La molécula de ácido nucleico introducida puede ser integrada en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de forma que la molécula de polinucleótido introducido es heredada por la progenie posterior. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también incluye la progenie de la célula u organismo y la progenie producida a partir de un programa de cría empleando dicha planta transgénica como padre en, por ejemplo, un cruzado y que presenta un fenotipo alterado como resultado de la presencia de una molécula de ácido nucleico ajeno.

IV.: Enfoques de ingeniería metabólica para disminuir los ácidos grasos saturados en una célula tejido u organismo hospedante

A.: Visión general

La invención presente incluye introducir una delta-9 desaturasa con preferencias específicas de acilCoA (por ejemplo, para ácido palmítico o esteárico) en semillas de plantas. La preferencia específica de acil-CoA de la delta-9 desaturasa permite la orientación de ciertas agrupaciones específicas de ácido graso saturado (por ejemplo, palmitato para la conversión a productos monoinsaturados). Se seleccionaron acil-CoA delta-9 desaturasas para reducir el contenido de ácido graso saturado en plantas, ya que no se producen normalmente en sistemas de plantas de una manera apreciable.

B. Polipéptidos

Los polipéptidos según algunas formas de realización de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que muestra identidades con porcentaje aumentado cuando se alinea con una secuencia que consiste de SEQ ID NO:14. Secuencias de aminoácidos específicos dentro de estas y otras formas de realización pueden comprender secuencias que tienen, por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, o el 100% de identidad con las secuencias antes mencionadas. En muchas formas de realización, la secuencia de aminoácidos que tiene la identidad de secuencia antes mencionada cuando se alinea con las secuencias anteriormente mencionadas codifica un péptido con actividad delta-9-18:0-ACP desaturasa enzimática, o parte de un tal péptido.

C. Ácidos nucleicos

Algunas formas de realización incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido descrito anteriormente. Por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos en algunas formas de realización muestran el aumento de porcentaje de identidad cuando se alinean con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:48, y SEQ ID NO:49. Secuencias de ácido nucleico específicas dentro de esta y otras formas de realización pueden comprender secuencias que tienen, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:48, and SEQ ID NO:49. Se entiende por aquellos con conocimientos normales de la técnica que las moléculas de ácido nucleico pueden ser modificadas sin sustancialmente cambiar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótido permisibles de acuerdo con la degeneración del codón.

En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comprenden un elemento de regulación de genes (es decir, un promotor). Los promotores pueden ser seleccionados sobre la base del tipo de célula en la que se insertará la construcción del vector. Los promotores que funcionan en bacterias, levaduras y plantas son bien conocidos en la técnica. Los promotores también pueden ser seleccionados sobre la base de sus características de regulación. Ejemplos de tales características incluyen la mejora de la actividad de transcripción, la capacidad de inducción, especificidad tisular, y la especificidad de la etapa de desarrollo. En las plantas, han sido descritos promotores que son inducibles, de origen vírico o sintético, constitutivamente activos, temporalmente regulados, espacialmente regulados. Véase, por ejemplo, Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719; Odell et al. (1985) Nature 313:810; y Chau et al. (1989) Science 244:174-81).

Promotores inducibles útiles incluyen, por ejemplo, los promotores inducidos por el ácido salicílico o ácidos poliacrílicos inducidos por la aplicación de antídotos (herbicidas de bencenosulfonamidas sustituidas), promotores de choque térmico, un promotor inducible por nitrato derivado de la secuencia de la molécula de ácido nucleico transcribible por la nitratoreductasa de la espinaca, promotores inducibles por hormonas, y promotores inducibles por la luz asociados con la subunidad pequeña de las familias de RuBP carboxilasa y las familias de LHCP.

Ejemplos de promotores útiles específicos de tejidos regulados por el desarrollo incluyen el promotor 7Sα de βconglicinina y promotores específicos de semillas. Promotores funcionales de plantas útiles para la expresión preferente en plástidos de semilla incluyen aquellos de proteínas implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos en las semillas oleaginosas y de proteínas de almacenamiento de la planta. Ejemplos de tales promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de dichas secuencias de moléculas de ácido nucleico transcribibles tales como faseolina, napina, zeína, el inhibidor de tripsina de soja, ACP, estearoil-ACP desaturasa, y oleosina. Otro promotor específico de tejido como ejemplo es el promotor de lectina, que es específico para el tejido de la semilla.

Otros promotores útiles incluyen los promotores de la nopalina sintasa, manopina sintasa, y octapina sintasa, que se llevan en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens; los promotores del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 19S y 35S; el promotor mejorado CaMV 35S; el promotor del virus del mosaico de Figwort 35S; el promotor inducible por la luz de la pequeña subunidad de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO); el promotor EIF-4A del tabaco (Mandel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004); la sintetasa de la sacarosa de maiz; la alcohol dehidrogenasa del maíz; complejo de antena de maíz; la proteína del shock de calor del maíz; el promotor de quitinasa de Arabidopsis; los promotores de LTP (proteína de transferencia de lípidos); la isomerasa de calcona de petunia; la proteína 1 rica en glicina de la judía; patatina de la patata; el promotor de ubiquitina; y el promotor de actina. Los promotores útiles son preferiblemente selectivos para la semilla, selectivos para el tejido, o inducibles. La regulación específica de semillas se discute en, por ejemplo, el documento de patente europea EP 0 255 378.

Para obtener mayor expresión de uno o más genes heterólogos, se puede preferir rediseñar el o los genes de modo que se expresen más eficientemente en la célula hospedante de expresión (por ejemplo una célula vegetal, por ejemplo, colza, arroz, tabaco, maíz, algodón y soja). Por lo tanto, un paso adicional opcional en el diseño de un gen que codifica una delta-9 desaturasa de expresión de la planta (o sea, además de la provisión de elementos reguladores de uno o más genes) es la reingeniería de una proteína de gen heterólogo que codifica la región para la expresión óptima. Formas de realizaciones particulares incluyen genes rediseñados que han sido optimizados para incrementar el nivel de expresión (es decir, producir más proteína) en una célula vegetal de canola transgénica o una célula vegetal de Arabidopsis en comparación con una célula vegetal de canola o una célula vegetal de Arabidopsis transformada con la secuencia génica heteróloga de origen natural.

Debido a la plasticidad otorgada por la redundancia/degeneración del código genético (es decir, algunos aminoácidos son especificados por más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado el uso diferencial de codones sinónimos. Este "sesgo de codón" se refleja en el promedio de composición de las bases de las regiones codificantes de proteínas. Por ejemplo, los organismos que tienen genomas con contenidos relativamente bajos de G+C utilizan más codones que tienen A o T en la tercera posición de codones sinónimos, mientras que los que tienen mayores contenidos de G+C utilizan más codones que tienen G o C en la tercera posición. Además, se cree que la presencia de codones "menores" dentro de un ARNm puede reducir la tasa de translación absoluta de ese ARNm, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al codón de menor importancia es baja. Una extensión de este razonamiento es que la disminución de la tasa de translación de codones minoritarios individuales seria al menos aditiva para múltiples codones minoritarios. Por lo tanto, ARNms que tienen un contenido alto relativo de codones menores en un hospedante de expresión particular tendrían correspondientemente unas tasas de translación bajas. Estas tasas pueden ser reflejadas por los correspondientes niveles bajos de la proteína codificada.

Cuando se producen por ingeniería genética genes optimizados que codifican una delta-9 desaturasa para la expresión en canola o Arabidopsis (u otras plantas, tal como arroz, tabaco, maíz, algodón o soja), es útil haber determinado el sesgo de codones de la planta(s) hospedante(s) prospectiva(s). Existen varias bases de datos de

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

inyección directa en los órganos reproductores de la planta. Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology 101:433; Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165; Pena et al. (1987) Nature

325:274. Otros métodos de transformación incluyen, por ejemplo, la transformación de protoplastos como se ilustra en el documento de patente de Estados Unidos 5.508.184. Las moléculas de ácido nucleico pueden también injectarse en embriones inmaduros. Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30.

Los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de células de plantas son: el proceso de transferencia de ADN mediado porAgrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803) (como se ilustra en el documento de patente de Estados Unidos 5.824.877; documento de patente de Estados Unidos 5.591.616; documento de patente de Estados Unidos 5.981.840; y documento de patente de Estados Unidos 6.384.301) y el proceso mediado por bombardeo de biolísticos o microproyectiles (por ejemplo, la pistola de genes) (tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos 5.550.318; documento de patente de Estados Unidos 5.538.880; documento de patente de Estados Unidos 6.160.208; documento de patente de Estados Unidos 6.399.861; y documento de patente de Estados Unidos 6.403.865). Típicamente, se desea una transformación nuclear, pero cuando es deseable específicamente transformar plástidos, tales como cloroplastos o amiloplastos, pueden transformarse plástidos de plantas utilizando una entrega mediada por un microproyectil de la molécula deseada de ácido nucleico a ciertas especies de plantas, tales como por ejemplo, especies de Arabidopsis, tabaco, patata, y Brassica .

La transformación mediada porAgrobacterium se consigue mediante el uso de una bacteria del suelo modificada genéticamente que pertenece al género Agrobacterium. Varias especies de Agrobacterium median la transferencia de un ADN específico conocido como "ADN-T", que puede ser modificado genéticamente para llevar cualquier pieza deseada de ADN a muchas especies de plantas. Los principales acontecimientos que marcan el proceso de patogénesis mediada por ADN-T son: inducción de genes de virulencia, y el procesamiento y transferencia de ADN-

T. Este proceso es el tema de muchas revisiones. Véase, por ejemplo, Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583618; Howard y Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8; Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32; Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-90; Gelvin (1993) en Transgenic Plants, Kung y Wu editores, Academic Press, San Diego, CA, páginas 49-87; Binns y Howitz (1994) en Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, editor, Berlin: Springer Verlag., páginas 119-38; Hooykaas y Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79; Lessl y Lanka (1994) Cell 77:321-4; y Zupan y Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618.

Para seleccionar o puntuar las células vegetales transformadas independientemente de la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula puede contener un gen que funciona en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que confiere al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otro modo tóxico. Genes de interés para uso como un marcador seleccionable, rastreable, o puntuable incluyen, pero no se limitan a, β-glucuronidasa (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa, y genes tolerantes a los antibióticos

o herbicidas. Ejemplos de genes resistentes a los antibióticos incluyen genes que confieren resistencia a las penicilllinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloranfenicol; y tetraciclina. Por ejemplo, puede conferirse resistencia al glifosato por un gen resistente al herbicida. Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-84. También se pueden implementar otros dispositivos de selección, incluyendo por ejemplo y sin limitación, tolerancia a la fosfinotricina, bialafos, y mecanismos positivos de selección (Joersbro et al. (1998) Mol. Breed. 4:111-7), y son considerados dentro del alcance de las formas de realización de la presente invención.

Las células transformadas, identificadas por selección o cribado y cultivadas en un medio apropiado que apoya la regeneración, pueden entonces dejarse madurar como plantas.

Los métodos divulgados en el presente documento pueden usarse con cualquier célula o tejido vegetal transformable. Las células y tejidos transformables, como se usan en el presente documento, incluyen pero no están limitados a aquellas células o tejidos que son capaces de propagación adicional para dar lugar a una planta. Los expertos en la técnica reconocerán que hay un número de células o tejidos vegetales que son transformables en los que después de la inserción del ADN exógeno y condiciones de cultivo apropiadas las células o tejidos vegetales se pueden convertir en una planta diferenciada. Los tejidos adecuados para estos propósitos pueden incluir pero no están limitados a embriones inmaduros, tejido escutelar, cultivos celulares en suspensión, inflorescencias inmaduras, brotes de meristemo, explantes nodales, tejido de callo, tejido de hipocótilo, cotiledones, raíces, y hojas.

La regeneración, desarrollo, y cultivo de plantas a partir de protoplastos de planta o explantes de planta transformados se conocen en la técnica. Weissbach y Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, (editores) Academic Press, Inc., San Diego, CA; Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31. Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye las etapas de selección de las células transformadas y cultivo de esas células a través de las etapas habituales de desarrollo embriónico a través de la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicas se regeneran de manera similar. En este método, los transformantes son generalmente cultivados en presencia de un medio selectivo que selecciona las células exitosamente transformadas e induce la regeneración de los brotes de planta. Fraley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803. Estos brotes se obtienen típicamente de dos a cuatro meses. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento de plantas adecuado tal como tierra. Las células que sobreviven a la exposición a un agente selectivo, o las células que han puntuado como positivas en un ensayo de cribado, pueden

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

Cepas complementadas de S. cerevisiae que contenían uno de los genes MgD9DS, LnD9DS-2 y HzD9DS se cultivaron en medio Drop Out Broth SC-URA. Una cepa de control, pDAB467EV-1 (pDAB467B/N transformada en OFY093 por metodología de transformación de levaduras descrita anteriormente), se cultivó en DOB SC-URA + Tween® 80, y la cepa madre OFY093 deficiente en delta-9 desaturasa de S. cerevisiae, se cultivó en DOB scAA + Tween® 80. Los cultivos se inocularon con un asa de células de una placa recientemente sembrada en el mismo medio que contenía 1,5% de agar. Las cepas se cultivaron a 30° C durante 24 horas. Los cultivos se centrifugaron a

6.000 rpm durante 10 minutos. Los sedimentos se lavaron con agua, se centrifugaron de nuevo a 6.000 rpm durante 10 minutos, y después se congelaron a -20° C hasta que se realizó el análisis de FAME. Se analizaron tres conjuntos de cultivos de expresión.

Los sedimentos de levadura liofilizados se saponificaron en metanol que contenía 10% (p/v) de NaOH. Se eliminaron los contaminantes lípidos no saponificables (esteroles) con hexano. La fracción de metanol se acidificó por adición de H2SO4, y los ácidos grasos protonados se extrajeron con hexano. La fracción de hexano aislada se secó, y los ácidos grasos se metilaron con MeOHCl 0,5 N a 80° C durante 30 minutos. Los FAMEs resultantes se extrajeron con hexano que contenía el éster de metilo de undecanoato como un estándar interno. Los extractos de FAME se analizaron con un cromatógrafo de gases HP6890 con detector de ionización de llama (Santa Clara, CA) equipado con una columna capilar BPX 70 (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm) de SGE (Austin, TX). Se separaron los FAMEs con un gradiente de temperatura usando helio como el vehículo gaseoso. Cada especie de FAME se identificó por el tiempo de retención, y se cuantificó mediante la inyección de una mezcla de referencia de FAMEs de aceite de colza de Matreya, LLC (Pleasant Gap, PA), como patrón de calibración.

La Tabla 2 muestra la composición de ácidos grasos (como % de FAMEs) de células de levadura OFY093 deficientes de ole1 que expresan varias acil Co-A delta-9 desaturasas de ejemplo. Todas las cepas crecieron bien y fueron totalmente complementadas por las desaturasas introducidas sin ningún requerimiento de MUFAs (ácidos grasos monoinsaturados) exógenos.

Tabla 2: Composición de ácidos grasos (como % de FAMEs totales) de la cepa de levadura OFY093 deficiente en ole1 que expresa acil Co-A delta-9 desaturasas. (La desviación estándar se indica entre paréntesis).

Desaturasa: n C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1

LnD9DS-2: 7 1,4 (0,7) 1,4 (1,0) 26,6 (4,5) 38,8 (2,8) 6,0 (1,3) 25,4 (4,4)

HzD9DS: 6 2,6 (1,3) 0,9 (0,5) 34,7 (6,8) 37,5 (4,2) 6,0 (1,1) 18,4 (4,1)

ole1: 6 1,1 (0,4) 0,6 (0,4) 14,4 (2,6) 49,2 (1,6) 5,6 (1,1) 24,0 (1,1)

AnD9DS: 8 0,5 (0,3) 0,2 (0,2) 23,5 (2,2) 9,3 (3,0) 2,1 (0,5) 64,6 (3,2)

MgD9DS: 2 0,9 (0,0) 0,1 (0,0) 21,2 (0,2) 12,1 (0,1) 1,6 (0,1) 64,2 (0,3)

Estos datos muestran que la composición de ácidos grasos de las cepas de levadura complementadas varía según el gen introducido. LnD9DS-2 produce cantidades relativamente altas de C16:1, al igual que HzD9DS y ole1, mientras que AnD9DS y MgD9DS producen cantidades relativamente altas de C18:1.

La diferencia de nivel de conversión basado en la longitud de cadena se puede demostrar aún más mediante el cálculo de la proporción de ácidos grasos monoinsaturados con respecto a los ácidos grasos totales para cada longitud de la cadena de ácidos grasos; C14, C16, o C18. Estos datos muestran la relativa alta conversión a C16:1 para LnD9DS-2 y HzD9DS, y a C18:1 para AnD9DS y MgD9DS. Tabla 3. Las cuatro filas inferiores representan las muestras de control complementadas con tergitol añadido, ácidos grasos insaturados, o Tween®. Las muestras con letras diferentes son significativamente diferentes, tal como se determina mediante la prueba de Tukey-Kramer realizada con el paquete de software estadístico JMP (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Tabla 3: Proporción de MUFA de los ácidos grasos totales para cada longitud de cadena (Cxx:1/(Cxx:0 + Cxx:1).

Desaturasa: C14 C16* C18

LnD9DS-2: 0,49 0,60 (b) 0,81 (b)

HzD9DS: 0,30 0,52 (b) 0,75 (c)

Desaturasa: C14 C16* C18

ole1: 0,34 0,79 (a) 0,81 (b)

AnD9DS: 0,25 0,28 (c) 0,97 (a)

MgD9DS: 0,07 0,36 (c) 0,98 (a)

Ninguna + tergitol: 0,06 0 0

Ninguna + tergitol + ricinoleico: 0,07 0 0,01

Ninguna + tergitol + linoleico: 0 0 0,04

Ninguna + tween: 0,65 0,23 0,87

* C16 MUFA incluye ácido cis-vacénico (C18:1 Δ11), ya que se deriva del alargamiento del ácido palmitoleico (C16:1 Δ9).

Filogenia de acil-CoA desaturasas de hongos

El ánalisis filogenético de múltiples secuencias de aminoácido de acil-CoA delta-9 desaturasa de hongos sugiere que LnD9DS-2 es distinta de las delta-9 desaturasas que prefieren 18:0. Por lo tanto, presentamos la hipótesis de 5 que la caracterización de otras delta-9 desaturasas de hongos estrechamente asociadas ya sea con las delta-9 desaturasas, que prefieren 18:0 o con LnD9DS-2, puede identificar desaturasas con una gama de actividades 18:0 o

16:0. Nuestra hipótesis predice que una delta-9 desaturasa de hongos que está más estrechamente asociada con LnD9DS-2 tendra actividad 16:0 aumentada.

Una búsqueda en las bases de datos de secuencias de ADN públicas (Broad Institute, NCBI, etc.) no identificó

10 ninguna secuencias de genes anotados específicamente como de delta-9 desaturasas en Magnaporthe grisea o Leptosphaeria nodorum. El análisis Pfam de las secuencias del instituto Broad que fueron identificadas dentro de esta descripción indica que estas proteínas contienen citocromo B5 y motivos de desaturasa que se encuentran también en otras acil-CoA delta-9 desaturasas de hongos. Sin embargo, las proteínas no habían sido identificadas previamente como acil-CoA delta-9 desaturasas. Hemos demostrado esta función de estas proteínas por

15 complementación en levaduras, estudios inversos, y análisis de secuencia del ADN.

Las relaciones de varias secuencias de genes de desaturasas fúngicas se analizaron filogenéticamente utilizando el método de unión al vecino a través del paquete de software MEGA. Tamura et al. (2007) Mol. Biol. and Evolution 24:1596-9. La Fig. 1 ilustra este análisis filogenético de las secuencias de desaturasas fúngicas. Estas secuencias se recuperaron mediante búsquedas BlastN de las bases de datos de secuencias NCBI usando las secuencias de

20 aminoácidos AnD9DS (sdeA). LnD9DS-1 y MgD9DS comparten altos niveles de identidad de secuencia entre si, comparados con LnD9DS-2. Además, una alineación ClustalW de LnD9DS-1, LnD9DS-2, y MgD9DS muestra la divergencia de LnD9DS-2 de LnD9DS-1 y MgD9DS. Figura 2. Las secuencias de nucleótidos de LnD9DS-1 y MgD9DS comparten un mayor número de pares de bases en común.

La tabla 4 y la figura 3 ilustran adicionalmente la relación filogenética de las proteínas identificadas nuevamente,

25 LnD9DS-1, LnD9DS-2, y MgD9DS, así como AnD9DS y la desaturasa de levadura, ScOLE1. Las secuencias de aminoácidos de LnD9DS-1, MgD9DS, y AnD9DS (sdeA) comparten un mayor porcentaje de identidad entre si en comparación con LnD9DS-2. La conservación de la identidad de los aminoácidos nos permite predecir que la especificidad del sustrato de 18:0 acil-CoA es dependiente de la secuencia conservada compartida entre LnD9DS-1, MgD9DS, y AnD9DS (sdeA). En comparación, la especificidad del sustrato de la acil-CoA de LnD9DS-2 es

30 preferente para 16:0 como resultado de su secuencia de aminoácidos divergentes.

Tabla 4: Identidad de aminoácidos de varias secuencias de desaturasas fúngicas alineadas utilizando ClustalW.

imagen12

Ejemplo 2: Diseño y síntesis de genes delta-9 desaturasa optimizados de Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea, y Leptosphaeria nodorum

5 Para obtener una mayor expresión de genes de delta-9 desaturasa de hongos en canola, hemos diseñado estos genes de modo que se expresan de manera más eficiente en las células de canola transgénica que contienen el gen heterólogo. Análisis extensivos de la secuencia de ADN de las regiones de codificación de la delta-9 desaturasa de Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea y Leptosphaeria nodorum nativas descritas en este documento como SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, respectivamente, reveló la presencia de varios motivos de secuencia que se

10 piensan que son perjudiciales para la expresión óptima en la plantas, así como una composición de codón no óptima para dicha expresión en la planta. Para diseñar genes optimizados que codifican una proteina delta-9 desaturasa, generamos secuencias de ADN in silico que son más "como-la planta" (y específicamente, más "como-canola") en la naturaleza, en las que las modificaciones de las secuencias no obstaculizan la traducción o crean inestabilidad del ARNm.

15 Para diseñar genes optimizados de plantas que codifican una delta-9 desaturasa, se diseñaron secuencias de ADN para codificar las secuencias de aminoácidos de las desaturasas de proteínas, utilizando un código genético redundante establecido a partir de una tabla de sesgo de codones compilada a partir de las secuencias de codificación de la proteína para las plantas hospedantes particulares (es decir, canola). Los usos preferidos del codón para la canola se muestran en la tabla 5. Las columnas C y G de la Tabla 5 presentan las distribuciones (en

20 % de uso para todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentra en las regiones de codificación de Brassica napus. Es evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos se encuentran solamente raramente en genes de plantas (por ejemplo, CGG en canola). Se consideró que un codón rara vez se usaba si estaba representado aproximadamente 10% o menos de las veces para codificar el aminoácido relevante en los genes de cualquier tipo de planta (indicado por "DNU" en las columnas

25 D y H de la tabla 5). Para equilibrar la distribución de las opciones de los codones restantes para un aminoácido, se calculó una representación media ponderada para cada codón, usando la fórmula:

Promedio ponderado % de C1 = 1/(%C1+%C2+%C3+ etc) x %C1x100,

donde C1 es el codón en cuestión y %C2, %C3, etc. representa el promedio de los valores de % para Brassica napus de los codones sinónimo remanentes (valores de % promedio para codones relevantes se toman de las

30 columnas C y G) de la tabla 5.

El valor % del promedio ponderado para cada codón se da en las columnas D y H de la tabla 5.

Tabla 5: Representación de los codones sinónimo en las regiones de codificación de los genes de la canola (B. napus) (Columnas C y G). Valores para una representación de sesgo equilibrado de codones establecida para un diseño de genes sintéticos optimizado para las plantas están en las columnas D y H.

A: B C D E F G H

Aminoácido: Codón Canola % Promedio ponderado Aminoácido Codón Canola % Promedio ponderado

ALA (A): GCA 23,3 23,3 LEU (L) CTA 10,1 DNU

GCC: 21,2 21,2 CTC 22,8 28,5

GCG: 14,2 14,2 CTG 11,6 14,6

GCT: 41,3 41,3 CTT 25,2 31,6

ARG (R): AGA 31,8 43,8 TTA 10,1 DNU

AGG: 22,1 30,5 TTG 20,2 25,3

CGA: 9,9 DNU LYS (K) AAA 44,6 44,6

CGC: 8,9 DNU AAG 55,4 55,4

CGG: 8,6 DNU MET (M) ATG 100,0 100,0

CGT: 18,6 25,7 PHE (F) TTC 58,6 58,6

ASN (N): AAC 62,6 62,6 TTT 41,4 41,4

AAT: 37,4 37,4 PRO (P) CCA 29,6 29,6

ASP (D): GAC 42,5 42,5 CCC 14,6 14,6

GAT: 57,5 57,5 CCG 18,4 18,4

CYS (C): TGC 49,2 49,2 CCT 37,3 37,3

TGT: 50,8 50,8 SER (S) AGC 16,0 17,9

END: TAA 38,5 DNU AGT 14,1 15,8

TAG: 22,1 DNU TCA 18,2 20,4

TGA: 39,4 100,0 TCC 16,7 18,7

GLN (Q): CAA 50,0 50,0 TCG 10,7 DNU

CAG: 50,0 50,0 TCT 24,3 27,2

GLU (E): GAA 43,6 43,6 THR (T) ACA 26,3 26,3

GAG: 56,4 56,4 ACC 26,9 26,9

5

10

15

20

25

30

A: B C D E F G H

GLY (G): GGA 36,4 36,4 ACG 16,9 16,9

GGC: 16,2 16,2 ACT 30,0 30,0

GGG: 15,2 15,2 TRP (W) TGG 100,0 100,0

GGT: 32,1 32,1 TYR (Y) TAC 59,4 59,4

HIS (H): CAC 49,6 49,6 TAT 40,6 40,6

CAT: 50,4 50,4 VAL (V) GTA 10,8 DNU

ILE (I): ATA 21,1 21,1 GTC 24,1 27,0

imagen13: ATC 42,7 42,7 imagen14 GTG 28,3 31,7

imagen15: ATT 36,2 36,2 imagen16 GTT 36,8 41,3

**NA = No Aplicable ***DNU = No utilizar

Se diseñaron nuevas secuencias de ADN que codifican esencialmente la secuencia de aminoácidos de las delta-9 desaturasas de la SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, de Magnaporthe grisea, Helicoverpa zea, y Leptosphaeria nodorum respectivamente, para la expresión óptima en canola utilizando una distribución de codones de primera y segunda elección de los codones frecuentemente usados encontrados en los genes de canola. Las nuevas secuencias de ADN se diferencian de las secuencias de ADN nativas que codifican las proteínas de delta-9 desaturasas por la sustitución de codones preferidos de la planta (o sea, el primer preferido, segundo preferido, tercer preferido, o cuarto preferido) para especificar un aminoácido apropiado en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína.

El diseño de las secuencias de ADN optimizadas para la planta se inició por traducción inversa de las secuencias de proteínas de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, usando una tabla de sesgo de codón de canola construida desde la tabla 5 columnas D y H. Las secuencias iniciales fueron después modificadas compensando los cambios de codón (mientras que se retiene la representación total del promedio ponderado del codón) para eliminar los lugares de reconocimiento de las enzima de restricción, eliminar las estructuras secundarias intrahebra altamente estables, y eliminar otras secuencias que pudieran ser perjudiciales para las manipulaciones de la clonación o expresión del gen construido por ingeniería en las plantas. Las secuencias de ADN fueron entonces reanalizadas para lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción que podrían haber sido creados por las modificaciones. Los lugares identificados fueron después adicionalmente modificados por reemplazamiento de los codones relevante con codones preferidos de primera, segunda, tercera, o cuarta elección. Las secuencias modificadas fueron analizadas adicionalmente y modificadas adicionalmente para reducir la frecuencia de los dobletes TA y CG, y aumentar la frecuencia de dobletes TG y CT. Además de estos dobletes, bloques de secuencias que tenían más de alrededor de seis residuos consecutivos de [G+C] o [A+T] fueron modificados mediante la sustitución de los codones de primera elección o segunda elección, etc. con otros codones preferidos de elección. Codones utilizados raramente no se incluyeron en un grado sustancial en el diseño de genes, y se utilizaron solo cuando fue necesario para dar cabida a un criterio de diseño diferente de la composición del codón per se (por ejemplo, adición o delección de los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción). Las secuencias del ADN de las desaturasas sintéticas optimizadas de canola de ejemplo diseñadas por este procedimiento se listan en la SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, y SEQ ID NO:17.

Las secuencias resultantes de ADN, tal como se representan por la SEQ ID NOs: 15-17, tienen un mayor grado de diversidad de codones y una composición de bases deseable. Además, estas secuencias contienen estratégicamente colocados lugares de reconocimiento de enzimas de restricción y no tienen secuencias que puedan interferir con la transcripción del gen, o la traducción de ARNm del producto. Las tablas 6-8 presentan una

imagen17

Tabla 6: Composiciones de codones de las regiones de codificación para una proteína de MgD9DS. La región de codificación de la desaturasa de M. grisa nativa se compara a una versión optimizada para plantas.

Aminoácido: Codón Número de gen nativo % Gen nati vo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. Optim. planta de Aminoácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. Optim. de planta

ALA (A): GCA 4 10,5 10 26,3 23,3 imagen18 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0,0 0,0

imagen19: GCC 18 47,4 8 21,1 21,2 imagen20 imagen21 CTC 11 28,9 11 28,9 28,5

imagen22: GCG 3 7,9 4 10,5 14,2 imagen23 imagen24 CTG 11 28,9 5 13,2 14,6

imagen25: GCT 13 34,2 16 42,1 41,3 imagen26 imagen27 CTT 12 31,6 12 31,6 31,6

ARG (R): AGA 2 9,5 10 47,6 43,8 imagen28 imagen29 TTA 0 0,0 0 0,0 0,0

imagen30: AGG 1 4,8 6 28,6 30,5 imagen31 imagen32 TTG 4 10,5 10 26,3 25,3

imagen33: CGA 2 9,5 0 0,0 0,0 imagen34 LYS (K) AAA 1 3,4 13 44,8 44,6

imagen35: CGC 12 57,1 0 0,0 0,0 imagen36 imagen37 AAG 28 96,6 16 55,2 55,4

imagen38: CGG 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen39 MET (M) ATG 7 100 7 100 100,0

imagen40: CGT 4 19,0 5 23,8 25,7 imagen41 PHE (F) TTC 17 89,5 11 57,9 58,6

ASN (N): AAC 23 100,0 14 60,9 62,6 imagen42 imagen43 TTT 2 10,5 8 42,1 41,4

imagen44: AAT 0 0,0 9 39,1 37,4 imagen45 PRO (P) CCA 0 0,0 6 28,6 29,6

ASP (D): GAC 17 68,0 11 44,0 42,5 imagen46 imagen47 CCC 9 42,9 3 14,3 14,6

imagen48: GAT 8 32,0 14 56,0 57,5 imagen49 imagen50 CCG 5 23,8 4 19,0 18,4

23 24 25

CYS (C): TGC 2 66,7 1 33,3 49,2 imagen51 imagen52 CCT 7 33,3 8 38,1 37,3

imagen53: TGT 1 33,3 2 66,7 50,8 imagen54 SER (S) AGC 3 10,7 5 17,9 17,9

END: TAA 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen55 imagen56 AGT 0 0,0 4 14,3 15,8

imagen57: TAG 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen58 imagen59 TCA 5 17,9 7 25,0 20,4

imagen60: TGA 1 100,0 1 100,0 100,0 imagen61 imagen62 TCC 9 32,1 4 14,3 18,7

GLN (Q): CAA 2 9,5 11 52,4 50,0 imagen63 imagen64 TCG 9 32,1 0 0,0 0,0

imagen65: CAG 19 90,5 10 47,6 50,0 imagen66 imagen67 TCT 2 7,1 8 28,6 27,2

GLU (E) 16: GAA 1 6,7 7 46,7 43,6 imagen68 THR (T) ACA 4 16,7 6 25,0 26,3

GAG: 14 93,3 8 53,3 56,4 imagen69 imagen70 ACC 15 62,5 7 29,2 26,9

GLY (G): GGA 8 19,5 15 36,6 36,4 imagen71 imagen72 ACG 1 4,2 4 16,7 16,9

imagen73: GGC 13 31,7 7 17,1 16,2 imagen74 imagen75 ACT 4 16,7 7 29,2 30,0

imagen76: GGG 1 2,4 6 14,6 15,2 imagen77 TRP (W) TGG 21 100 21 100 100,0

imagen78: GGT 19 46,3 13 31,7 32,1 imagen79 TYR (Y) TAC 16 94,1 10 58,8 59,4

HIS (H): CAC 19 95,0 10 50,0 49,6 imagen80 imagen81 TAT 1 5,9 7 41,2 40,6

imagen82: CAT 1 5,0 10 50,0 50,4 imagen83 VAL (V) GTA 1 2,5 0 0,0 0,0

Aminoácido: Codón Número de gen nativo % Gen nati vo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. Optim. de planta Aminoácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. Optim. de planta

ILE (I): ATA 1 4,2 5 20,8 21,1 imagen84 GTC 21 52,5 11 27,5 27,0

imagen85: ATC 15 62,5 10 41,7 42,7 imagen86 GTG 4 10,0 13 32,5 31,7

imagen87: ATT 8 33,3 9 37,5 36,2 imagen88 GTT 14 35,0 16 40,0 41,3

imagen89: Totales 232 imagen90 232 imagen91 imagen92 imagen93 Totales 244 imagen94 244 imagen95 imagen96

Tabla 7: Composiciones de codones de las regiones de codificación para la proteína HzD9DS. La región codificante de la desaturasa nativa H. zea se compara con una versión optimizada para la planta.

Aminoácido: Codón Núme-ro de gennativo % Gen nati vo Número de gen optim.para planta %Gen optim. para planta Recom. optim.planta de Aminoácido Codón Número gen nati vo de % Gen nativo Número de gen optim.para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. de planta

ALA (A): GCA 4 11,4 9 25,7 23,3 imagen97 LEU (L) CTA 2 imagen98 5,9 0 0,0 0,0

imagen99: GCC 7 20,0 7 20,0 21,2 imagen100 imagen101 CTC 8 imagen102 23,5 10 29,4 28,5

imagen103: GCG 8 22,9 4 11,4 14,2 imagen104 imagen105 CTG 14 imagen106 41,2 6 17,6 14,6

imagen107: GCT 16 45,7 15 42,9 41,3 imagen108 imagen109 CTT 6 imagen110 17,6 10 29,4 31,6

ARG (R): AGA 1 7,7 6 46,2 43,8 imagen111 imagen112 TTA 2 imagen113 5,9 0 0,0 0,0

imagen114: AGG 5 38,5 4 30,8 30,5 imagen115 imagen116 TTG 2 imagen117 5,9 8 23,5 25,3

imagen118: CGA 2 15,4 0 0,0 0,0 imagen119 LYS (K) AAA 11 imagen120 44,0 10 40,0 44,6

imagen121: CGC 5 38,5 0 0,0 0,0 imagen122 imagen123 AAG 14 imagen124 56,0 15 60,0 55,4

imagen125: CGG 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen126 MET (M) ATG 8 imagen127 100 8 100 100,0

imagen128: CGT 0 0,0 3 23,1 25,7 imagen129 PHE (F) TTC 20 imagen130 83,3 14 58,3 58,6

ASN (N): AAC 13 72,2 11 61,1 62,6 imagen131 imagen132 TTT 4 imagen133 16,7 10 41,7 41,4

imagen134: AAT 5 27,8 7 38,9 37,4 imagen135 PRO (P) CCA 1 imagen136 6,3 5 31,3 29,6

ASP (D): GAC 16 64,0 12 48,0 42,5 imagen137 imagen138 CCC 5 imagen139 31,3 3 18,8 14,6

imagen140: GAT 9 36,0 13 52,0 57,5 imagen141 imagen142 CCG 2 imagen143 12,5 2 12,5 18,4

CYS (C): TGC 1 100,0 0 0,0 49,2 imagen144 imagen145 CCT 8 imagen146 50,0 6 37,5 37,3

26 27 28

Aminoácido: Codón Núme-ro de gen nativo % Gen nati vo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. planta de Aminoácido Codón Número gen nati vo de % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. de planta

imagen147: TGT 0 0,0 1 100,0 50,8 imagen148 SER (S) AGC 2 imagen149 12,5 3 18,8 17,9

END: TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 imagen150 imagen151 AGT 1 imagen152 6,3 3 18,8 15,8

imagen153: TAG 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen154 imagen155 TCA 1 imagen156 6,3 3 18,8 20,4

imagen157: TGA 0 0,0 1 100,0 100,0 imagen158 imagen159 TCC 6 imagen160 37,5 3 18,8 18,7

GLN (Q): CAA 2 33,3 3 50,0 50,0 imagen161 imagen162 TCG 3 imagen163 18,8 0 0,0 0,0

imagen164: CAG 4 66,7 3 50,0 50,0 imagen165 imagen166 TCT 3 imagen167 18,8 4 25,0 27,2

GLU (E) 16: GAA 7 63,6 5 45,5 43,6 imagen168 THR (T) ACA 3 imagen169 16,7 5 27,8 26,3

imagen170: GAG 4 36,4 6 54,5 56,4 imagen171 imagen172 ACC 7 imagen173 38,9 5 27,8 26,9

GLY (G): GGA 8 40,0 9 45,0 36,4 imagen174 imagen175 ACG 4 imagen176 22,2 3 16,7 16,9

imagen177: GGC 6 30,0 4 20,0 16,2 imagen178 imagen179 ACT 4 imagen180 22,2 5 27,8 30,0

imagen181: GGG 2 10,0 3 15,0 15,2 imagen182 TRP (W) TGG 14 imagen183 100 14 100 100,0

imagen184: GGT 4 20,0 4 20,0 32,1 imagen185 TYR (Y) TAC 12 imagen186 80,0 9 60,0 59,4

HIS (H): CAC 11 73,3 8 53,3 49,6 imagen187 imagen188 TAT 3 imagen189 20,0 6 40,0 40,6

imagen190: CAT 4 26,7 7 46,7 50,4 imagen191 VAL (V) GTA 0 imagen192 0,0 0 0,0 0,0

ILE (I): ATA 3 15,0 4 20,0 21,1 imagen193 imagen194 GTC 5 imagen195 26,3 5 26,3 27,0

imagen196: ATC 10 50,0 9 45,0 42,7 imagen197 imagen198 GTG 13 imagen199 68,4 6 31,6 31,7

Aminoácido: Codón Núme-ro de gen nativo % Gen nati vo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. de planta Aminoácido Codón Número gen nati vo de % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. de planta

imagen200: ATT 7 35,0 7 35,0 36,2 imagen201 GTT 1 imagen202 5,3 8 42,1 41,3

imagen203: Totales 165 imagen204 165 imagen205 imagen206 imagen207 Totales 189 imagen208 imagen209 189 imagen210 imagen211

Tabla 8: Composiciones de codones de las regiones de codificación para una proteína LnD9DS-2. La región de codificación de la L. nodorum desaturasa nativa se compara con una versión optimizada para plantas.

Aminoácido: Codón Número de gen nativo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. planta Optim. de Aminoácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. optim. de planta

ALA (A): GCA 3 9,4 7 21,9 23,3 imagen212 LEU (L) CTA 7 15,6 0 0,0 0,0

imagen213: GCC 9 28,1 7 21,9 21,2 imagen214 imagen215 CTC 14 31,1 13 28,9 28,5

imagen216: GCG 12 37,5 5 15,6 14,2 imagen217 imagen218 CTG 7 15,6 7 15,6 14,6

imagen219: GCT 8 25,0 13 40,6 41,3 imagen220 imagen221 CTT 5 11,1 14 31,1 31,6

ARG (R): AGA 4 13,8 13 44,8 43,8 imagen222 imagen223 TTA 3 6,7 0 0,0 0,0

imagen224: AGG 3 10,3 9 31,0 30,5 imagen225 imagen226 TTG 9 20,0 11 24,4 25,3

imagen227: CGA 7 24,1 0 0,0 0,0 imagen228 LYS (K) AAA 9 45,0 9 45,0 44,6

imagen229: CGC 8 27,6 0 0,0 0,0 imagen230 imagen231 AAG 11 55,0 11 55,0 55,4

imagen232: CGG 5 17,2 0 0,0 0,0 imagen233 MET (M) ATG 9 100 9 100 100,0

imagen234: CGT 2 6,9 7 24,1 25,7 imagen235 PHE (F) TTC 16 80,0 12 60,0 58,6

ASN (N): AAC 6 50,0 8 66,7 62,6 imagen236 imagen237 TTT 4 20,0 8 40,0 41,4

imagen238: AAT 6 50,0 4 33,3 37,4 imagen239 PRO (P) CCA 3 16,7 5 27,8 29,6

ASP (D): GAC 16 66,7 10 41,7 42,5 imagen240 imagen241 CCC 8 44,4 3 16,7 14,6

imagen242: GAT 8 33,3 14 58,3 57,5 imagen243 imagen244 CCG 2 11,1 3 16,7 18,4

CYS (C): TGC 4 80,0 2 40,0 49,2 imagen245 imagen246 CCT 5 27,8 7 38,9 37,3

29 30 31

imagen247: TGT 1 20,0 3 60,0 50,8 imagen248 SER (S) AGC 8 27,6 5 17,2 17,9

END: TAA 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen249 imagen250 AGT 6 20,7 5 17,2 15,8

imagen251: TAG 1 100,0 0 0,0 0,0 imagen252 imagen253 TCA 1 3,4 6 20,7 20,4

imagen254: TGA 0 0,0 1 100,0 100,0 imagen255 imagen256 TCC 6 20,7 5 17,2 18,7

GLN (Q): CAA 10 55,6 10 55,6 50,0 imagen257 imagen258 TCG 7 24,1 0 0,0 0,0

imagen259: CAG 8 44,4 8 44,4 50,0 imagen260 imagen261 TCT 1 3,4 8 27,6 27,2

GLU (E) 16: GAA 5 33,3 7 46,7 43,6 imagen262 THR (T) ACA 11 44,0 7 28,0 26,3

imagen263: GAG 10 66,7 8 53,3 56,4 imagen264 imagen265 ACC 5 20,0 7 28,0 26,9

GLY (G): GGA 13 34,2 14 36,8 36,4 imagen266 imagen267 ACG 7 28,0 4 16,0 16,9

imagen268: GGC 16 42,1 6 15,8 16,2 imagen269 imagen270 ACT 2 8,0 7 28,0 30,0

imagen271: GGG 6 15,8 6 15,8 15,2 imagen272 TRP (W) TGG 19 100 19 100 100,0 I

imagen273: GGT 3 7,9 12 31,6 32,1 imagen274 TYR (Y) TAC 11 64,7 10 58,8 59,4

HIS (H): CAC 12 66,7 9 50,0 49,6 imagen275 imagen276 TAT 6 35,3 7 41,2 40,6

imagen277: CAT 6 33,3 9 50,0 50,4 imagen278 VAL (V) GTA 6 17,6 0 0,0 0,0

ILE (I): ATA 4 18,2 5 22,7 21,1 imagen279 imagen280 GTC 10 29,4 9 26,5 27,0

imagen281: ATC 9 40,9 10 45,5 42,7 imagen282 imagen283 GTG 12 35,3 11 32,4 31,7

Aminoácido: Codón Número de gen nativo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. planta Optim. de Aminoácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Número de gen optim. para planta %Gen optim. para planta Recom. planta optim. de

imagen284: ATT 9 40,9 7 31,8 36,2 imagen285 imagen286 GTT 6 17,6 14 41,2 41,3 imagen287

imagen288: Totales 214 imagen289 214 imagen290 imagen291 imagen292 Totales 236 imagen293 236 imagen294 imagen295

imagen296

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Invitrogen para facilitar su transferencia a un plásmido de transformación de Agrobacterium. Adicionalmente, el plásmido contiene un origen de replicación y un marcador seleccionable de kanamicina.

Descripción de pDAB7324: pDAB7324 (Fig.11; SEQ ID NO:62) fue construido por medio de recombinación por Gateway® entre pDAB7323 y pDAB7309. Este plásmido contiene las dos secuencias de PTU desaturasa establecidas en el epígrafe precedente "Descripción de pDAB7323". Estas PTUs se orientaron en una orientación cabeza a cola dentro de las regiones de borde de la hebra T de ADN del vector binario de transformación de plantas, pDAB7309. Este vector binario contiene la PTU fosfinotricina acetiltransferasa: promotor CsVMV v2; PAT v5; y 3' UTR de AtuORF1 v4, además de otros elementos reguladores tales como Overdrive y secuencias de borde de hebra T (T-ADN Border A y T-ADN Border B). Los plásmidos que contenían las PTUs descritas anteriormente fueron aislados y confirmados por medio de la digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.

Descripción de pDAB7325: pDAB7325 (Fig.12; SEQ ID NO: 57) se construyó usando técnicas estándar de biología molecular. Este plásmido contiene una secuencia de PTU desaturasa. Esta PTU desaturasa contiene el promotor PvPhas v2, 5' UTR de PvPhas, HzD9DS v2 (SEQ ID NO:16), y 3' UTR de AtuORF23. Los elementos en la PTU desaturasa están conectados por secuencias intervinientes cortas adicionales, y la secuencia PTU desaturasa está flanqueada por lugares de recombinación por Gateway® de Invitrogen para facilitar su transferencia a un plásmido de transformación de Agrobacterium. Adicionalmente, el plásmido contiene un origen de replicación y un marcador seleccionable de kanamicina.

Descripción de pDAB7326: pDAB7326 (Fig.13; SEQ ID NO:63) se contruyó por medio de recombinación Gateway® entre pDAB7325 y pDAB7309. Este plásmido contiene la secuencia de PTU desaturasa establecida en el epígrafe precedente "Descripción de pDAB7325". La PTU fue orientada en la orientación cabeza cola dentro de las regiones de borde de la hebra T del ADN del vector binario de transformación, pDAB7309. Este vector binario contiene la PTU fosfinotricina acetiltransferasa: promotor CsVMV v2; PAT v5; y 3' UTR de AtuORF1 v4, además de otros elementos reguladores tales como Overdrive y secuencias de borde de hebra T (T-ADN Border A y T-ADN Border B). Los plásmidos que contenían la PTU descrita anteriormente fueron aislados y confirmados por medio de la digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.

Descripción de pDAB7327: pDAB7327 (Fig. 14; SEQ ID NO: 58) se construyó utilizando técnicas de biología molecular estándar. Este plásmido contiene una secuencia de PTU desaturasa. La PTU desaturasa contiene el promotor PvPhas v2, 5' UTR de PvPhas, gen AnD9DS v3 (SEQ ID NO:49), y 3' UTR de AtuORF23. Los elementos en la PTU desaturasa están conectados por secuencias intervinientes cortas adicionales. La secuencia de PTU desaturasa también está flanqueada por lugares de recombinación de Gateway® de Invitrogen para facilitar su transferencia a un plásmido de transformación Agrobacterium. Adicionalmente, el plásmido contiene un origen de replicación y un marcador seleccionable de kanamicina.

Descripción de pDAB7328: pDAB7328 (Fig.15; SEQ ID NO: 64) fue construido por medio de recombinación Gateway® de pDAB7327 y pDAB7309. Este plásmido contiene la secuencia de la PTU desaturasa establecida en el epígrafe precedente "Description de pDAB7327". La PTU fue orientada en la orientación cabeza cola dentro de las regiones de borde de la hebra T del ADN del vector binario de transformación, pDAB7309. Este vector binario contiene la PTU de fosfinotricina acetiltransfera: promotor CsVMV v2; PAT v5; y 3' UTR de AtuORF1 v4, además de otros elementos reguladores tales como Overdrive y secuencias de borde de hebra T (T-ADN Border A y T-ADN Border B). Los plásmidos que contenían la PTU descrita anteriormente fueron aislados y confirmados por medio de la digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.

Descripción de pDAB7329: pDAB7329 (Fig.16; SEQ ID NO: 59) fue construido usando técnicas estándar de biología molecular. Este plásmido contiene una secuencia de PTU desaturasa, que contiene el promotor PvPhas v2, 5' UTR de PvPhas, MgD9DS v2 (SEQ ID NO:15), y 3' UTR de AtuORF23. Los elementos en esta PTU desaturasa están conectados por secuencias intervinientes cortas adicionales. La secuencia de PTU desaturasa está flanqueada por lugares de recombinación de Gateway® de Invitrogen para facilitar su transferencia a un plásmido de transformación de Agrobacterium. Adicionalmente, el plásmido contiene un origen de replicación y un marcador seleccionable de kanamicina.

Descripción de pDAB7330: pDAB7330 (Fig.17; SEQ ID NO: 65) fue construido por medio de Gateway® por recombinación entre pDAB7329 y pDAB7309. Este plásmido contiene la secuencia de PTU desaturasa establecida en el epígrafe precedente "Descripción de pDAB7325". Esta PTU fue orientada en la orientación cabeza cola dentro de las regiones de borde de la hebra T del ADN del vector binario de transformación, pDAB7309. Este vector binario contiene la PTU de fosfinotricina acetiltransfera: promotor CsVMV v2; PAT v5; y 3' UTR de AtuORF1 v4, además de otros elementos reguladores tales como Overdrive y secuencias de borde de hebra T (T-ADN Border A y T-ADN Border B). Los plásmidos que contenían la PTU descrita anteriormente fueron aislados y confirmados por medio de la digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.

Descripción de pDAB7331: además de los anteriores, se construyó un plásmido de control que no contenía una PTU desaturasa (SEQ ID NO: 66). Fig.18. Esta construcción sólo contenía una PTU de fosfotricina acetil transferasa, además de los otros elementos reguladores descritos en pDAB7309.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 4: Transformación de Agrobacterium

Se prepararon células de Agrobacterium tumefaciens electrocompetentes (tabla 9) usando un protocolo de Weigel y Glazebrook (2002) "How to Transform Arabidopsis", capítulo 5, en Arabidopsis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 50 µl de células competentes de Agrobacterium fueron descongeladas sobre hielo, y fueron transformadas usando de 300 a 400 ng de ADN del vector plásmido binario. La mezcla de células se sometió a electoporación en presencia de ADN, utilizando cubetas de electroporación anteriormente refrigeradas (0,2 cm), y un electroporador Bio-Rad Gene Pulser® (Hercules, California) en las siguientes condiciones: voltaje: 2,5 kV, longitud del pulso: 5 milisegundos, salida de la capacitancia 25 µF, resistencia 200 Ω. Después de la electroporación, se añadió a cada cubeta 1 ml de caldo YEP (estracto de levadura (10 g/l), peptona (10 g/l), y NaCl (5 g/l)), y la suspensión de células YEP se transfirió a un tubo de cultivo de15 ml. Las células fueron incubadas a 28° C con agitación suave durante 4 horas, después de ello el cultivo se sembró en placas de agar + YEP con la selección apropiada según la tabla 9. Las placas se incubaron durante de 2-4 días a 28° C, y las colonias fueron seleccionadas y sembradas en placas de YEP + agar con selección de antibióticos e incubadas a 28º C durante de 1-3 días. Las colonias fueron verificadas como de Agrobacterium usando el test de cetolactosa, y las colonias positivas a cetolactosa fueron aisladas a continuación usando dos pases de aislamiento de una única colonia. Se hizo una placa de parche final de las colonias después de que el aislamiento de la colonia única se completara.

Tabla 9.Cepas de Agrobacterium y selección de antibióticos.

Cepa: Selección genómica Selección de AyudanteTi Selección del vector binario

Z707S: Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina

DA2569: Eritromicina Kanamicina Espectinomicina

EHA105: Estreptomicina no disponible Espectinomicina

DA2552: Eritromicina ninguno Espectinomicina

Validación de la colonia de Agrobacterium: se usó análisis de digestión por restricción para verificar la presencia del plásmido intacto utilizando enzimas de digestión por restricción específicas para el vector. Se usó el kit de ADN de plásmidos de Macherey-Nagel NucleoBond® según las recomendaciones del protocolo recomendado por el fabricante para purificar el ADN del plásmido de las colonias de Agrobacterium transformadas seleccionadas. El ADN del plásmido del vector binario usado en la transformación del Agrobacterium fue incluido como control. Se realizaron cuatro reacciones separadas de digestión utilizando de 0,75-1 µg de ADN. La reacción se dejó funcionar durante de 1-2 horas, y luego se analizó por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Se seleccionaron las colonias para las que los productos de digestión de todas las enzimas fueran idénticas al plásmido de control y coincidían con los tamaños de las bandas esperados.

Se usó A. tumefaciens cepa LBA404 (Invitrogen Carlsbad, California) para la transformación de Arabidopsis, y A. tumefaciens cepa Z707S (Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-9) para la transformación de canola.

Ejemplo 5: Transformación de Arabidopsis thaliana mediada por Agrobacterium

Transformación de Arabidopsis: Arabidopsis se transformó usando un método de inmersión floral basado en el método de Clough y Bent (1998) Plant J. 16:735-743. Se usó una colonia seleccionada de Agrobacterium para inocular uno o más de precultivos de 30 ml de caldo YEP que contenían los antibióticos apropiados para la selección. El (los) cultivo(s) se incubaron durante la noche a 28° C con agitación constante a 220 rpm. Cada precultivo se usó para inocular dos cultivos de 500 ml de caldo YEP que contenían los antibióticos para la selección, y los cultivos se incubaron durante la noche a 28° C con agitación constante. Después las células se colocaron en placas a aproximadamente 8700 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante resultante se desechó. El sedimento celular se resuspendió suavemente en 500 ml de medio de infiltración que contenía: 1/2 de sales de Murashige y Skoog/vitaminas B5 de Gamborg´s, 10% (p/v) de sacarosa, 0,044 µM de bencilaminopurina (10 µl/litro de solución madre de 1 mg/ml en DMSO), y 300 µl/litro Silwet® L-77. Se sumergieron plantas de aproximadamente 1 mes de edad en el medio durante 15 segundos, teniendo cuidado de sumergir la inflorescencia más nueva. Las plantas se colocaron entonces de lado en posición horizontal, y se cubrieron (cubierta transparente u opaca) durante 24 horas, después se lavaron con agua, y se colocaron en posición vertical. Las plantas se cultivaron a 22° C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente 4 semanas después de la inmersión, se recogieron las semillas de las plantas.

Condiciones de cultivo de Arabidopsis thaliana: las semillas recién recogidas se secaron durante 7 días a temperatura ambiente en presencia de un desecante. Depués del secado, las semillas se suspendieron en una

imagen297

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tratados se cultivaron conjuntamente con Agrobacterium durante 3 días.

Inducción de callo en medio de selección: después de 3 días de cultivo conjunto, los segmentos de hipocótilo se transfirieron individualmente con unas pinzas sobre medio de inducción de callo, MSK1D1H1 (MS; kinetina 1 mg/l; 2,4-D 1 mg/l; MES 0,5 g/l; AgNO3 5 mg/l; Timentina 300 mg/l; Carbenicilina 200 mg/l; Herbiace1 mg/l; 3% sacarosa; 0,7% Phytagar). Los segmentos de hipocótilos fueron anclados sobre el medio, pero no fueron embebidos en el medio.

Selección y regeneración de brotes: después de 7 días en medio de inducción de callos, los segmentos de hipocótilos de formación de callos se transfirieron al medio de regeneración Shoot 1 con selección, MSB3Z1H1 (MS; BAP 3 mg/l; Zeatina 1 mg/l; MES 0,5 g/l; AgNO3 5 mg/l; Timentina 300 mg/l; Carbenicilina 200 mg/l; Herbiace 1 mg/l; 3% sacarosa; 0,7% Phytagar). Después de 14 días, los hipocótilos con brotes se transfirieron al medio de regeneración 2 con un aumento de la selección, MSB3Z1H3 (MS; BAP 3 mg/l; Zeatina 1 mg/l; MES 0,5 g/l; AgNO3 5 mg/l; Timentina 300 mg/l; Carbenicilina 200 mg/l; Herbiace® 3 mg/l; 3% sacarosa; 0,7% Phytagar).

Alargamiento del brote: Después de 14 días, los segmentos con brotes se transfirieron al medio de alargamiento de brotes, MSMESH5 (MS; Timentina 300 mg/l; Herbiace® 5 mg/l; 2% sacarosa; 0,7% TC Agar). Los brotes que ya se habían alargado fueron aislados y transferidos a MSMESH5. Después de 14 días, los brotes remanentes que no se habían alargado en la primera vuelta fueron colocados en MSMESH5, y transferidos a un medio de selección fresco de la misma composición. En este estado, todos los segmentos de hipocótilo remanentes fueron descartados.

Los brotes que se alargaron en medio MSB3Z1H3 después de 2 semanas fueron aislados y transferidos a medio MSMESH5. Los brotes remanentes que no se habían alargado en la primera vuelta en MSMESH5 fueron aislados, y transferidos a medio fresco de selección de la misma composición. En este estado todos los segmentos de hipocótilo remanentes fueron descartados.

Inducción de raíces: Después de 14 días, los brotes fueron transferidos a medio MSMEST (MS; MES 0,5 g/l; Timentina 300 mg/l; 2% sacarosa; 0,7% TC Agar) para inducción de las raíces. Los brotes que no formaron raíces en la primera transferencia en medio MSMEST fueron transferidos para un segundo o tercer ciclo en medio MSMEST hasta que se obtuvieron las plantas enraizadas. Los brotes que no elongaron/enraizaron en la primera transferencia en medio MSMEST fueron transferidos para un segundo o tercer ciclo en medio MSMEST hasta que se obtuvieron plantas enraizadas. Las plantas que enraizaron en MSMESH5 o MSMEST y fueron PCR-positivas fueron enviadas para transplante en suelo. Despues de la cosecha, las plantas de canola T0 fueron posteriormente analizadas para eventos que contuvieran casetes de PTU transgénicas. Las plantas fueron después transferidas a un invernadero, cultivadas hasta madurez, y la semilla fue recogida para análisis adicionales.

Ejemplo 8: Análisis de ADN de tejido de hoja de Arabidopsis T1 y de tejido de hoja de canola T0

Las plantas de canola T0 y Arabidopsis T1 se analizaron para identificar plantas que contenían casetes de expresión de PTU. Se realizaron ensayos de Invader® para cribar inicialmente muestras de plantas supuestamente transformadas, e identificar eventos que contenían una sola copia de la PTU de pat. Eventos que se identificaron como eventos de copia única se mantuvieron y se analizaron adicionalmente para la presencia de PTU(s) desaturasa(s) a través de PCR. Eventos que fueron positivos en la PCR para la casete de expresión de las PTU(s) desaturasas se analizaron adicionalmente mediante análisis de transferencia Southern. El análisis de transferencia Southern se completó para confirmar que las plantas contenían la expresión de PTU del gen del vector binario usado para tranformar las plantas. Se seleccionaron para seguimiento los eventos de copia única que contenían todo de los PTUs.

Aislamiento del ADN: el ADN genómico total (gADN) fue extraído del tejido de hoja liofilizado utilizando el kit DNeasy® de Qiagen de 96 plantas (Qiagen, Valencia, California). Este ADNg se diluyó después a 10 ng/µl (canola) o 0,7 ng/µl (Arabidopsis) para uso en ensayos de PCR y Invader® para número de copia.

Análisis de Invader®: el análisis del número de copia del marcador seleccionable, pat, fue completado usando el ensayo de Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI). El ADN genómico fue desnaturalizado a 95° C durante 10 minutos, congelado en hielo, y mezclado con una mezcla maestra de los reactivos que contenía sondas de oligonucleótido, moléculas de tinte capaz de la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), y la enzima cleavase, según el protocolo recomendado por el fabricante. Las reacciones contenían sondas para los genes de referencia internos. El gen 1-desoxixilulosa-5 fosfato reductoisomerasa (DXR1) se usó como gen de referencia interna para las reacciones de ensayo Invader® de Arabidopsis, y el gen de la proteína del grupo de alta movilidad (HMGa) se usó como gen de referencia interna para las reacciones de ensayo Invader® de canola. Además, las placas contenían 1 copia, 2 copias, y 4 copias de estándar, así como muestras de control de tipo silvestre y pocillos en blanco que no contenían muestras. Toda la reacción se cubrió con aceite mineral antes de la incubación en un termociclador a 63° C durante 1,5 horas. La reacción resultante se leyó en un lector de placas fluorométrico (Synergy™ 2, BioTek Instruments, Winooski, VT). Se recogieron las lecturas tanto en el canal FAM (λ 485-528 nm) como el RED (λ 560-620 nm). A partir de éstas, se determinó el cero de pliegue (es decir, el fondo) para cada canal para cada muestra dividiendo la señal en bruto de la muestra por la señal sin ninguna plantilla. A partir de estos datos, se construyó una curva estándar, y se determinó el mejor ajuste por análisis de regresión

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

lineal. Usando estos parámetros identificados del ajuste, se determinó el número de copia pat aparente para cada muestra.

Análisis de PCR: el análisis de PCR se completó usando cebadores que amplificaban cada unidad de transcripción de la planta. Estos cebadores estaban situados en el promotor (Faseolina) y el 3' UTR (Faseolina u ORF23). Estos mismos grupos de cebadores se usaron para el análisis de PCR de ambos, canola y Arabidopsis. Para el análisis de PCR de los eventos pDAB7319 y pDAB7324, se utilizaron los cebadors MAS414 (SEQ ID NO: 18) y MAS415 (SEQ ID NO: 19) para amplificar la primera PTU. Esta PTU consistía en el promotor de Faseolina, un equivalente funcional de un gen acil-CoA delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans (AnD9DS v3; SEQ ID NO:49), y el terminador de 3' UTR de faseolina. Para la amplificación por PCR de la segundo PTU en el constructo pDAB7319, se usaron los cebadores MAS415 y MAS413 (SEQ ID NO: 20). Esta PTU consiste en el promotor de faseolina, un equivalente funcional de un gen acil-CoA delta-9 desaturasa de Leptosphaeria nodorum (LnD9DS-2 v2; SEQ ID NO:17), y la 3' UTR de ORF23. Los pares de cebadores MAS415 y MAS413 también se utilizaron para amplificar la segunda PTU de eventos generados por la transformación con pDAB7324 (promotor de faseolina, un equivalente funcional de un gen de acil-CoA delta-9 desaturasa v2 de Helicoverpa zea (HzD9DS v2; SEQ ID NO:16), y la 3' UTR de ORF23). Además, los pares de cebadores MAS415 y MAS413 se usaron para amplificar las PTUs en los constructos pDAB7321 y pDAB7326.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en volúmenes de 25 µl usando 20 ng de ADN genómico, 5 unidades Ex Taq (Takara), tampón de reacción 1x, 0,2 µM de cada dNTP, y 0,8 µM de cada cebador. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un ciclador térmico DNA Engine Tetrad® 2 (BioRad, Hercules, CA). Se usaron las siguientes condiciones de ciclación para los cebadores MAS413 y MAS415: 3 minutos a 94° C; seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94° C, 30 segundos a 63° C, y 3 minutos a 72° C; y una extensión final de 10 minutos a 72° C. Las condiciones de ciclación usadas para los cebadores MAS414 y MAS415 fueron las mismas con la única diferencia de que la temperatura de hibridación se redujo de 63° C a 60° C. Los productos de reacción se desarrollaron en un gel de 1% agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron en un Gel-Doc™.

Análisis de la transferencia Southern: se usó el análisis de transferencia Southern para establecer el patrón de integración de los eventos de canola. Estos experimentos generaron datos que demostraron la integración e integridad del transgén de desaturasa dentro del genoma de canola. Eventos seleccionados se caracterizaron como un evento simple de integración de larga duración, que contenía una sola copia del transgén de desaturasa a partir del vector binario usado para la transformación de la planta.

Se llevó a cabo un análisis detallado de transferencia Southern usando sondas específicas para los genes de desaturasa y enzimas de restricción descriptivas, que escinden en sitios localizados dentro del plásmido. Estos productos de digestión producen fragmentos de hibridación internos al plásmido, o fragmentos que puentean la unión del plásmido con ADN genómico de canola (fragmentos de borde). Los tamaños moleculares indicados de la hibridización Southern para la combinación de los enzimas de restricción y las sondas fueron únicos para cada evento. Estos análisis también mostraron que el fragmento de plásmido se había insertado en el ADN genómico de canola sin reordenamientos de la hebra T del ADN.

Para el análisis de transferencia Southern, se extrajeron 100 mg de tejido de hoja de canola usando el Plant Mini Kit (Qiagen). Se digerioron cinco micrograms (5 µg) de ADNg por muestra simultáneamente con endonucleasas de restricción SpeI y PacI (New England Biolabs, Ipswich, MA) para obtener fragmentos que contenían ya sea las PTUs de interés, y/o el marcador seleccionable (PAT), para determinar el número de copia. El ADN digerido se separó en un gel de agarosa al 0,8%.

En pocas palabras, después de la separación electroforética y visualización de los fragmentos de ADN, los geles se despurinaron con HCl 0,25 N durante aproximadamente 20 minutos, y después fueron expuestos a una solución desnaturalizante durante aproximadamente 30 minutos, seguido de una solución neutralizante durante al menos 30 minutos. Se realizó la transferencia Southern durante la noche sobre membranas de nylon (Millipore, Billerica, MA) usando un sistema de mecha con 10× SSC. Después de la transferencia, se lavaron las membranas con una solución 2x SSC, y el ADN se unió a la membrana mediante reticulación con UV. Este proceso produjo membranas de transferencia Southern listas para la hibridación.

Se generaron las sondas y se amplificaron los fragmentos de PCR a partir de ADN plásmido y se purificaron por medio de extracción por gel usando el kit QIAquick® Gel Extraction kit (Qiagen). Los cebadores usados para crear la sonda LnD9DS fueron arw008 (SEQ ID NO:21) y arw009 (SEQ ID NO:22). Los cebadores usados para crear la sonda HzD9 fueron arw010 (SEQ ID NO:23) y arw011 (SEQ ID NO:24). Las condiciones de PCR para todas las tres reacciones consistieron en 35 ciclos con una temperatura de hibridación de 63° C y un tiempo de extensión de 1 minuto. Los fragmentos de PCR fueron marcados con 32P usando el kit de marcar Prime-It® RmT Random Primer Labeling kit (Stratagene, La Jolla, CA).

La etapa de hibridación se condujo a aproximadamente 65° C durante la noche en el horno de hibridación. Las transferencias en membrana de nylon se enjuagaron, y la transferencia se expuso en una pantalla de imagen de fósforo durante la noche, y se escaneó en un escaneador Storm™ 860 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 9: Composición de ácidos grasos de las semillas de Arabidopsis transgénico que contenía una acil-CoA delta-9 desaturasa

Se transformaron plantas de Arabidopsis con vectores de Agrobacterium que contenían genes para LnD9DS-2 v2 (pDAB7321; SEQ ID NO:61), HzD9DS v2 (pDAB7326; SEQ ID NO:63) o MgD9DS v2 (pDAB7330; SEQ ID NO:65). Las plantas fueron también transformadas con un vector que contenía un gen AnD9DS (pDAB7328; SEQ ID NO:64). Un vector vacío que contenía solo el gen del marcador seleccionable pat (pDAB7331; SEQ ID NO:66) se usó como control negativo. Las transformaciones se realizaron también usando dos desaturasas en combinación, a fin de combinar una desaturasa que prefería estearoilo (AnD9DS) con una desaturasa que prefería palmitoilo, o LnD9DS-2 (pDAB7319; SEQ ID NO:60), o HzD9DS (pDAB7324; SEQ ID NO:62). En todos los casos, los genes de desaturasa fueron conducidos por el promotor específico para las semillas PvPhas (documento de patente de Estados Unidos Nº 5.504.200). Semillas a granel T2 fueron cosechadas de plantas resistentes a los herbicidas T1 en las que se confirmó que contenían el gen pat por análisis de ensayo Invader® y la PTU de desaturasa por análisis de PCR.

Las muestras de semillas se homogeneizaron en triheptadecanoína que contenía heptano (Nu-Chek prep, Elysian, MN) como sustituto usando una bola de acero y molino de bolas. Antes de la homogeneización, se añadió una solución de MeONa (Sigma) en MeOH 0,25 M recientemente preparada a la muestra. La reacción se condujo bajo calor suave (40° C) y agitación constante. La reacción se verificó por la recuperación del sustituto metilado. La extracción de FAMEs se repitió tres veces, y todas las capas de heptano se combinaron antes del análisis. La integridad de la extracción se verificó mediante la comprobación de la presencia de FAMEs en una cuarta extracción/derivatización. Las FAMEs resultantes se analizaron por GC-FID usando una columna capilar BPX 70 de SGE (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Cada FAME se identificó por su tiempo de retención, y se cuantificó por la inyección de una muestra de referencia de aceite de colza de Matreya, LLC (Pleasant Gap, PA), como estándar de calibración.

Análisis FAME de las semillas T2 de los eventos transgénicos mostraron que la expresión de cada una de las desaturasas tuvo un efecto significativo en la reducción del contenido total de ácidos grasos en las semillas, como se determina por el promedio del contenido de cada conjunto de eventos. Tabla 10 y Fig. 19. En esta tabla y las tablas siguientes, los valores no conectados por la misma letra son significativamente diferentes, como se determina usando la prueba de Tukey-Kramer HSD realizada en el paquete de software estadístico JMP® (SAS Institute Inc., Cary, NC). Las combinaciones de AnD9DS con LnD9DS-2 o HzD9DS produjeron el promedio de contenido total de ácidos grasos saturados más bajo.

Tabla 10: Contenido total de ácidos grasos saturados de semillas T2 de Arabidopsis

Gen: Número de muestras T2 imagen298 imagen299 imagen300 Promedio de ácidos grasos saturados totales

Control: 204 A imagen301 imagen302 13,49

WT: 60 A imagen303 imagen304 13,16

MgD9DS v2: 42 imagen305 B imagen306 10,26

LnD9DS-2 v2: 49 imagen307 B imagen308 10,00

HzD9DS v2: 70 imagen309 B imagen310 9,58

AnD9DS v3: 32 imagen311 imagen312 C 8,73

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: 39 imagen313 imagen314 C 8,23

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: 51 imagen315 imagen316 C 8,09

Aunque todas las desaturasas redujeron el contenido total de ácidos grasos saturados en las semillas de Arabidopsis, tuvieron efectos diferentes en el contenido de los ácidos grasos palmítico y esteárico, como se predijo a partir de los experimentos de levadura. La Tabla 11 y Fig. 20 muestran el promedio de contenido de ácido palmítico para cada conjunto de eventos. La Tabla 12 y la Fig. 21 muestran el promedio de contenido de ácido esteárico de semillas T2 para cada conjunto de eventos.

Tabla 11: Contenido de ácido palmítico de las semillas T2 de Arabidopsis

Gen: imagen317 imagen318 imagen319 imagen320 Promedio de ácido palmítico

Control: A imagen321 imagen322 imagen323 7,72

WT: A imagen324 imagen325 imagen326 7,54

MgD9DS v2: imagen327 B imagen328 imagen329 7,19

AnD9DS v3: imagen330 imagen331 C imagen332 6,02

LnD9DS-2 v2: imagen333 imagen334 C imagen335 5,98

HzD9DS v2: imagen336 imagen337 imagen338 D 5,57

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: imagen339 imagen340 imagen341 D 5,54

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: imagen342 imagen343 imagen344 D 5,41

Tabla 12: Contenido de ácido esteárico de las semillas T2 de Arabidopsis

Gen: imagen345 imagen346 imagen347 Promedio de ácido esteárico

Control: A imagen348 imagen349 2,96

WT: A imagen350 imagen351 2,94

LnD9DS-2 v2: imagen352 B imagen353 2,09

HzD9DS v2: imagen354 B imagen355 2,04

MgD9DS v2: imagen356 imagen357 C 1,53

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: imagen358 imagen359 C 1,42

AnD9DS v3: imagen360 imagen361 C 1,35

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: imagen362 imagen363 C 1,28

5 AnD9DS y MgD9DS tuvieron mayor efecto en el contenido de ácido esteárico que LnD9DS-2 y HzD9DS. Por el contrario, LnD9DS-2 y HzD9DS tuvieron mayor efecto en el contenido de ácido palmítico que AnD9DS y MgD9DS. Las combinaciones de las desaturasas tienen el mayor efecto en ambos ácidos grasos. Estos resultados se observaron también en el efecto de las desaturasas enel aumento del contenido en las semillas del ácido palmitoleico, que es el producto primario de la delta-9 desaturación del ácido palmítico. Tabla 13 y Fig. 22.

10

Tabla 13: Contenido de ácido palmitoleico de las semillas T2 de Arabidopsis

Gen: imagen364 imagen365 imagen366 imagen367 imagen368 Promedio de ácido palmitoleico

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: A imagen369 imagen370 imagen371 imagen372 3,32

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: A imagen373 imagen374 imagen375 imagen376 2,93

HzD9DS v2: imagen377 B imagen378 imagen379 imagen380 2,48

AnD9DS v3: imagen381 B C imagen382 imagen383 2,10

LnD9DS-2 v2: imagen384 imagen385 C imagen386 imagen387 1,91

MgD9DS v2: imagen388 imagen389 imagen390 D imagen391 1,40

Control: imagen392 imagen393 imagen394 imagen395 E 0,31

WT: imagen396 imagen397 imagen398 imagen399 E 0,30

Hubo una variación esperada en el efecto de las desaturasas en el contenido de ácidos grasos saturados en todos los eventos analizados, debido a los efectos de posición y número de copias. Una comparación del perfil completo de ácidos grasos de los eventos con el contenido total más bajo de ácidos grasos saturados (promedio de los cinco eventos más bajos) se muestra en la Tabla 14 junto con el perfil de las semillas de tipo silvestre y plantas de control transformadas.

Tabla 14: perfil de ácidos grasos de Arabidopsis T2 transgénica con el contenido total de ácidos grasos saturados más bajo. Las desviaciones estándar están en paréntesis.

C14:0: C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 Vacc.*

WT: 0,08 (0,02) 7,54 (0,41) 0,31 (0,05) 2,94 (0,19) 14,91 (1,44) 1,47 (0,10)

Control: 0,08 (0,02) 7,72 (0,05) 0,32 (0,04) 2,96 (0,34) 14,20 (2,04) 1,46 (0,11)

AnD9DS v3: 0,07 (0,01) 5,10 (0,38) 2,92 0,55) 0,72 (0,03) 20,52 (2,12) 1,72 (0,26)

HzD9DS v2: 0,06 (0,00) 4,13 (0,23) 4,11 (0,47) 1,26 (0,08) 19,34 (1,01) 1,94 (0,25)

LnD9DS-2 v2: 0,05 (0,00) 4,68 (0,30) 3,49 (0,69) 1,53 (0,12) 19,35 (0,81) 2,05 (0,21)

MgD9DS v2: 0,08 (0,02) 6,64 (0,26) 1,60 (0,54) 1,05 (0,20) 18,01 (1,86) 1,60 (0,16)

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: 0,06 (0,00) 4,41 (0,17) 3,71 (0,35) 0,97 (0,33) 19,60 (0,88) 2,03 (0,21)

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: 0,08 (0,02) 4,86 (0,35) 4,09 (0,65) 1,01 (0,22) 18,10 (2,40) 2,03 (0,31)

* Vacc = ácido cis-vaccénico (18:1 n = 7)

C18:2: C18:3 C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0

WT: 28,72 (0,97) 17,85 (0,81) 2,06 (0,16) 20,11 (0,90) 1,78 (0,15) 0,34 (0,10) 1,68 (0,19) 0,21 (0,10)

Control: 29,28 (1,29) 18,07 (1,35) 2,08 (0,16) 19,62 (1,23) 1,85 (0,17) 0,39 (0,13) 1,70 (0,04) 0,27 0,14)

AnD9DS v3: 29,64 (1,34) 17,59 (1,28) 0,44 0,04) 18,26 (0,83) 1,42 (0,15) 0,24 (0,16) 1,26 (0,09) 0,10 (0,05)

HzD9DS v2: 29,31 (0,94) 17,26 (0,39) 0,81 (0,06) 18,39 (0,66) 1,47 (0,10) 0,18 (0,05) 1,50 (0,04) 0,23 (0,03)

LnD9DS-2 v2: 27,72 (0,18) 17,46 (0,55) 1,00 (0,11) 19,33 (0,46) 1,45 (0,11) 0,32 (0,14) 1,48 (0,10) 0,10 (0,09)

MgD9DS v2: 29,76 (1,10) 17,98 (0,84) 0,63 (0,63) 19,19 (0,86) 1,60 (0,09) 0,26 (0,20) 1,44 (0,09) 0,16 (0,03)

AnD9DS v3 + LnD9DS-2 v2: 29,17 (0,31) 18,84 (0,41) 0,59 (0,27) 17,65 (0,23) 1,40 (0,04) 0,39 (0,03) 1,13 (0,06) 0,03 (0,02)

AnD9DS v3 + HzD9DS v2: 29,28 (1,78) 18,83 (1,69) 0,65 (0,21) 17,88 (1,90) 1,55 (0,20) 0,20 (0,12) 1,33 (0,24) 0,11 (0,08)

Además de reducir el contenido de los ácidos grasos saturados palmítico y esteárico, y aumentar el contenido de ácidos grasos monoinsaturados (palmitoleico y oleico), la presencia de las desaturasas también redujo la cantidad

5 de ácido araquídico (C20:0) en las semillas. Esto es presumiblemente porque este ácido graso se deriva del alargamiento de los ácidos esteárico y palmítico. No pareció haber ninguna desaturación directa de C20:0 por las desaturasas introducidas, como no hay un aumento concomitante en el ácido eicosenoico (C20:1) como C20:1Δ9.

Ejemplo 10: Preparación de anticuerpos a delta-9 desaturasa

Herramientas de diagnóstico tales como los anticuerpos son deseables en la caracterización de la expresión de la

10 proteína transgénica delta-9 desaturasa en las plantas. Debido a que las acil-CoA delta-9 desaturasas son proteínas unidas a la membrana, la sobreexpresión rutinaria en Escherichia coli es difícil. Sin embargo, se generaron anticuerpos con éxito por sobreexpresión de un fragmento C-terminal de cada proteína delta-9 desaturasa que no incluye ninguno de los dominios transmembrana de la proteína.

Reacciones en cadena de polimerasa: se diseñaron cebadores de PCR para amplificar un fragmento C-terminal

15 equivalente para cada desaturasa. El 3' cebador fue diseñado para codificar un fragmento de proteína con una etiqueta C-terminal 6x His. Se incorporaron lugares de restricción Ndel y BamHI en los 5' y 3' cebadores, respectivamente, para facilitar la clonación. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación en la Tabla 15. Los productos de amplificación esperados eran 659 pb para LnD9DS-2, 683 pb para MgD9DS, y 335 pb para HzD9DS. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el kit Takara Ex Taq™ PCR (Clontech, Mountain View,

20 CA) usando las condiciones del proveedor. El volumen total de reacción de PCR fue de 50 µl. Cada reacción contenía 200 ng de plásmido de ADN y 50 pmoles de cada cebador. El ADN fue desnaturalizado a 94° C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de 94° C durante 30 segundos, 60° C durante 1 minuto, y 72° C durante 30 segundos.

Se llevó a cabo una extensión final a 72° C durante 10 minutos. Cada producto de PCR se llevó a cabo en dos pocillos de un gel de 0,75% de agarosa estéril, y el ADN se purificó en un gel usando columnas de giro de Montage y se eluyó en 15 µl de tampón TE.

Tabla 15: Secuencias de los cebadores de oligonucleótidos usados en las amplificaciones de PCR de fragmentos Cterminal procedentes de LnD9DS-2, MgD9DS, y HzD9DS.

Cebador: Secuencia imagen400

AntiLnD9DS2F: SEQ ID NO:25 Propósito

imagen401: CATATGTTCGACGACAGACGCACGCCTCGAGAC Directo

AntiLnD9DS2Rh: SEQ ID NO:26 Cebador inverso para el C-terminal de LnD9DS2

imagen402: GGATCCGCAGCCACAGCCCCCTCAACCAACCTCTC

AntiMgD9DSF: SEQ ID NO:27 Cebador directo para el C-terminal de MgD9DS

imagen403: CATATGTTCGACGATCGCAACTCGCCGCGTGATCAC

AntiMgD9DSRh: SEQ ID NO:28 Cebador inverso para el C-terminal de MgD9DS

imagen404: GGATCCGCGGCCTGAGCACCCGGAACAGGCTG

AntiHzD9DSF: SEQ ID NO:29 Cebador directo para el C-terminal de HzD9DS

imagen405: CATATGTATGACAAGTCCATCAAGCCTTCC

AntiHzD9DSRh: SEQ ID NO:30 Cebador inverso para el C-terminal de HzD9DS

GGATCCTCGTCTTTAGGGTTGATCCTAATGGCTGC

Clonación de TOPO: Los fragmentos C-terminal purificados fueron clonados en TA con vectores TOPO® pCR®2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), y transformados en células Top 10 de E. coli siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se seleccionaron las transformaciones, y se purificó el ADN plásmido usando columnas NucleoSpin® 10 (Macherey-Nagel GmbH & Co, Duren, Alemania). Se digerieron tres microlitros (3 µl) de ADN con NdeI y BamHI en un volumen total de 20 µl durante 90 minutos a 37° C, y se desarrollaron en un gel de 0,8% de agarosa. En cada caso, un fragmento específico del gen (más una banda de vector TOPO® de 3,9 kb) fue visible. Se eligieron tres clones positivos para cada gen clonado y se secuenciaron para confirmar que el fragmento amplificado por PCR estaba libre de errores. Cada uno de los clones de MgD9DS contenía una mutación puntual silenciosa en el par de

15 bases 45, indicando o bien un solo polimorfismo de nucleótido entre la secuencia publicada y la plantilla de PCR, o un error de PCR silencioso. Dado que la mutación fue silenciosa, ninguna corrección fue necesaria, y se escogió un clon para la subclonación.

Preparación de los plásmidos de expresión del fragmento C-terminal de la delta-9 desaturasa: los fragmentos de delta-9 desaturasa amplificados por PCR se digerieron con enzimas de restricción NdeI y BamHI y se ligaron en los

20 lugares de restricción correspondientes dentro del vector de expresión pET30b(+). La etapa de clonación dio como resultado la adición de 15 aminoácidos C-terminales, constituyendo una etiqueta C-terminal 6x His para facilitar la purificación de la proteína de longitud completa. No se esperaba que estos aminoácidos adicionales afectaran la expresión de la proteína. Se obtuvieron y confirmaron los clones positivos por medio de digestión con enzimas de restricción y reacciones de secuenciación.

25 Expresión de fragmentos peptídicos C-terminales de delta-9 desaturasa en E. coli: los plásmidos de expresión de delta-9 desaturasa/pET30b(+) se transformaron en células BL21(DE3) de E. coli según el protocolo recomendado por el fabricante (Novagen, Madison, WI). Las células se sembraron en placas LA que contenían kanamicina (50 µg/ml) y glucosa (1,25 M). Las placas se incubaron durante la noche a 37° C. Se raspó de las placas un bucle completo de células, y se inocularon en frascos de 500 ml que contenían 250 ml de LB y kanamicina (50 µg/ml) con

30 el inductor isopropil-P-D-tiogalactósido (0,75 mM). Se probaron tres condiciones de inducción. Los cultivos se

imagen406

imagen407

imagen408

5

10

15

20

25

30

35

40

desaturasa incluyen la sustitución de la secuencia de Kozak existente con cualquiera de las secuencias descritas en la Tabla 17. La ingeniería de secuencias alternativas de Kozak aguas arriba del sitio de inicio de una delta-9 desaturasa se completa usando técnicas de biología molecular estándar. Los fragmentos de polinucleótidos sintéticos se sintetizan y se clonan aguas arriba de una secuencia codificante de una delta-9 desaturasa usando técnicas conocidas en el campo. El contexto del codón de inicio tiene un fuerte efecto sobre el nivel de expresión de un transgén. La modificación de la secuencia de Kozak a una de las enumeradas en la Tabla 17 aumenta los niveles de expresión de la delta-9 desaturasa heteróloga.

Tabla 17: secuencias de Kozak que se incorporan aguas arriba de un gen de una delta-9 desaturasa heteróloga para aumentar la expresión.

Secuencia de Kozak: SEQ ID NO: Secuencia

Kozak número 1: SEQ ID NO:40 GGATCCAACAATG

Kozak número 2: SEQ ID NO:41 ACAACCAAAAATG

Kozak número 33: SEQ ID NO:42 ACAACCAACCTACCATGG

Kozak número 4: SEQ ID NO:43 ACAACCAAAAAATG

Ejemplo 14: Diseño y síntesis de genes de delta-9 desaturasa a partir de Helicoverpa zea y Leptosphaeria nodorum

Para obtener mayores niveles de expresión de genes heterólogos en las plantas, la estrategia de optimización de codones que se ha descrito en el ejemplo 2 fue modificada, y las regiones codificadoras de la proteína de los genes heterólogos HzD9DS y LnD9DS-2 fueron rehechas por ingeniería genética usando nuevos protocolos de diseño.

La selección de los codones se hizo utilizando una tabla en la que se había calculado el sesgo de codón de la planta hospedante prospectiva, que en este caso fue la canola. En el diseño de las regiones de codificación para la expresión en plantas de los genes de delta-9 desaturasa, se determinaron los codones primarios ("de primera elección") preferidos por la planta, y se usaron aproximadamente el 95% del tiempo. Los codones de "segunda elección" se usaron con moderación, a una frecuencia de aproximadamente 5%. En consecuencia, se diseño una nueva secuencia de ADN, que codifica la secuencia de amino de cada delta-9 desaturasa, en la que la nueva secuencia de ADN difería del gen de la delta-9 desaturasa nativa mediante la sustitución de los codones preferidos de primera y segunda elección de la planta para especificar un aminoácido apropiado en cada posición en la secuencia de aminoácidos. La nueva secuencia fue analizada después para los lugares de las enzimas de restricción que podrían haberse creados por las modificaciones. Los lugares de las enzimas de restricción identificados fueron eliminados después reemplazando los codones con los codones preferidos de primera y segunda elección. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar la transcripción o traducción del gen de interés, específicamente las estructuras de bucle muy estables, también se eliminaron.

Las selecciones de opciones de codones preferidos (primera y segunda elección) del código genético de canola se determinaron a partir de una tabla de sesgo de codón compilada a partir de las secuencias de codificación de la proteína para canola. En las Tabla 18 y 19, las columnas etiquetadas como "% Gen nativo" presentan las distribuciones (en % de uso para todos los codones para el aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentra en las regiones codificantes de Brassica napus (canola). Las nuevas secuencias de ADN que codifican esencialmente la secuencia de aminoácidos de las delta-9 desaturasas de M. grisea, H. zea y L. nodorum fueron diseñadas para la expresión óptima en canola usando la distribución de codón preferida de los codones de primera y segunda elección encontrada en los genes de canola. El diseño de las secuencias de ADN optimizadas en plantas se inició por traducción inversa de las secuencias de proteínas de SEQ ID NO:12 (M. grisea), SEQ ID NO:13 (H. zea), y SEQ ID NO:14 (L. nodorum) usando la tabla de sesgo de codón de canola construida. Las columnas etiquetadas como "% Gen opt de planta" indica los codones preferidos y la frecuencia con la que se incorporaron en el diseño del gen de la delta-9 desaturasa. SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 establecen las secuencias de nucleótido de las nuevas desaturasas optimizadas de canola LnD9DS-2 y HzD9DS, respectivamente. Estas secuencias optimizadas de canola nuevas fueron etiquetadas como LnD9DS-2 v3 y HzD9DS v3.

Tabla 18. Composiciones de codones de las regiones de codificación para la proteína HzD9DS. La región de codificación de la H. zea desaturasa nativa se compara con una versión optimizada para la planta.

Aminoácid o: Codón Numero de gen nati vo % Gen nativo Númer o de gen opt de planta % Gen opt de planta Optrecomendado de planta Amino ácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Númer o de gen opt de planta % Gen opt de planta Opt recomen dado de planta

ALA (A): GCA 4 11,4 1 2,9 0,0 LEU (L) CTA 2 5,9 0 0,0 0,0

imagen409: GCC 7 20,0 0 0,0 0,0 imagen410 CTC 8 23,5 0 0,0 0,0

imagen411: GCG 8 22,9 0 0,0 0,0 imagen412 CTG 14 41,2 0 0,0 0,0

imagen413: GCT 16 45,7 34 97,1 100,0 imagen414 CTT 6 17,6 34 100,0 100,0

ARG (R): AGA 1 7,7 0 0,0 0,0 imagen415 TTA 2 5,9 0 0,0 0,0

imagen416: AGG 5 38,5 13 100,0 100,0 imagen417 TTG 2 5,9 0 0,0 0,0

imagen418: CGA 2 15,4 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 11 44,0 0 0,0 0,0

imagen419: CGC 5 38,5 0 0,0 0,0 imagen420 AAG 14 56,0 25 100,0 100,0

imagen421: CGG 0 0,0 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 8 100 8 100 100,0

imagen422: CGT 0 0,0 0 0,0 0,0 PHE (F) TTC 20 83,3 24 100,0 100,0

ASN (N): AAC 13 72,2 18 100,0 100,0 imagen423 TTT 4 16,7 0 0,0 0,0

imagen424: AAT 5 27,8 0 0,0 0,0 PRO (P) CCA 1 6,3 16 100,0 100,0

ASP (D): GAC 16 64,0 2 8,0 0,0 imagen425 CCC 5 31,3 0 0,0 0,0

imagen426: GAT 9 36,0 23 92,0 100,0 imagen427 CCG 2 12,5 0 0,0 0,0

47 48 49 50 51 52

Aminoácid o: Codón Numero de gen nati vo % Gen nativo Númer o de gen opt de planta % Gen opt de planta Opt recomendado de planta Amino ácido Codón Número de gen nati vo % Gen nativo Númer o de gen opt de planta % Gen opt de planta Opt recomen dado de planta

CYS (C): TGC 1 100,0 1 100,0 100,0 imagen428 CCT 8 50,0 0 0,0 0,0

imagen429: TGT 0 0,0 0 0,0 0,0 SER (S) AGC 2 12,5 0 0,0 0,0

END: TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 imagen430 AGT 1 6,3 0 0,0 0,0

imagen431: TAG 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen432 TCA 1 6,3 1 6,3 0,0

imagen433: TGA 0 0,0 1 100,0 100,0 imagen434 TCC 6 37,5 0 0,0 0,0

GLN (Q): CAA 2 33,3 6 100,0 100,0 imagen435 TCG 3 18,8 0 0,0 0,0

imagen436: CAG 4 66,7 0 0,0 0,0 imagen437 TCT 3 18,8 15 93,8 100,0

GLU (E): GAA 7 63,6 0 0,0 0,0 THR (T) ACA 3 16,7 0 0,0 0,0

16: GAG 4 36,4 11 100,0 100,0 imagen438 ACC 7 38,9 18 100,0 100,0

GLY (G): GGA 8 40,0 20 100,0 100,0 imagen439 ACG 4 22,2 0 0,0 0,0

imagen440: GGC 6 30,0 0 0,0 0,0 imagen441 ACT 4 22,2 0 0,0 0,0

imagen442: GGG 2 10,0 0 0,0 0,0 ITRP (W) TGG 14 100 14 100 0,0

imagen443: GGT 4 20,0 0 0,0 0,0 TYR (Y) TAC 12 80,0 15 100,0 100,0

HIS (H): CAC 11 73,3 15 100,0 100,0 imagen444 TAT 3 20,0 0 0,0 0,0

imagen445: CAT 4 26,7 0 0,0 0,0 VAL (V) GTA 0 0,0 0 0,0 0,0

ILE (I): ATA 3 15,0 1 5,0 0,0 imagen446 GTC 5 26,3 0 0,0 0,0

imagen447: ATC 10 50,0 19 95,0 100,0 imagen448 GTG 13 68,4 0 0,0 0,0

imagen449: ATT 7 35,0 0 0,0 0,0 imagen450 GTT 1 5,3 19 100,0 100,0

imagen451: Total 165 imagen452 165 imagen453 imagen454 imagen455 Total 189 imagen456 189 imagen457 imagen458

Tabla 19. Composiciones de codones de las regiones de codificación para la proteína LnD9DS-2. La región de codificación de la L. nodorum desaturasa nativa se compara con una versión optimizada para la planta.

Amino ácido: Codón Núm. de gen nativo % Gen nativo Núm. de gen optde planta % Gen opt de planta Opt de recomendado planta Amino ácido Codon Núm. gen nativo % Gen nativo Núm-de gen opt deplanta % Gen opt de planta Recomendado opt de planta

ALA (A): GCA 3 9,4 0 0,0 0,0 imagen459 LEU (L) CTA 7 15,6 0 0,0 0,0

imagen460: GCC 9 28,1 0 0,0 0,0 imagen461 imagen462 CTC 14 31,1 0 0,0 0,0

imagen463: GCG 12 37,5 0 0,0 0,0 imagen464 imagen465 CTG 7 15,6 0 0,0 0,0

imagen466: GCT 8 25,0 32 100,0 100,0 imagen467 imagen468 CTT 5 11,1 45 100,0 100,0

ARG (R): AGA 4 13,8 1 3,4 0,0 imagen469 imagen470 TTA 3 6,7 0 0,0 0,0

imagen471: AGG 3 10,3 28 96,6 100,0 imagen472 imagen473 TTG 9 20,0 0 0,0 0,0

imagen474: CGA 7 24,1 0 0,0 0,0 imagen475 LYS (K) AAA 9 45,0 0 0,0 0,0

imagen476: CGC 8 27,6 0 0,0 0,0 imagen477 imagen478 AAG 11 55,0 20 100,0 100,0

imagen479: CGG 5 17,2 0 0,0 0,0 imagen480 MET (M) ATG 9 100 9 100 100,0

imagen481: CGT 2 6,9 0 0,0 0,0 imagen482 PHE (F) TTC 16 80,0 20 100,0 100,0

ASN (N): AAC 6 50,0 12 100,0 100,0 imagen483 imagen484 TTT 4 20,0 0 0,0 0,0

imagen485: AAT 6 50,0 0 0,0 0,0 imagen486 PRO (P) CCA 3 16,7 18 100,0 100,0

ASP (D): GAC 16 66,7 2 8,3 0,0 imagen487 imagen488 CCC 8 44,4 0 0,0 0,0

imagen489: GAT 8 33,3 22 91,7 100,0 imagen490 imagen491 CCG 2 11,1 0 0,0 0,0

CYS (C): TGC 4 80,0 5 100,0 100,0 imagen492 imagen493 CCT 5 27,8 0 0,0 0,0

Amino ácido: Codón Núm. de gen nativo % Gen nativo Núm. de gen optde planta % Gen opt de planta Opt de recomendado planta Amino ácido Codon Núm. gennativo % Gen nativo Núm-de gen opt deplanta % Gen opt de planta Recomendado opt de planta

imagen494: TGT 1 20,0 0 0,0 0,0 imagen495 SER (S) AGC 8 27,6 0 0,0 0,0

END: TAA 0 0,0 0 0,0 0,0 imagen496 imagen497 AGT 6 20,7 0 0,0 0,0

imagen498: TAG 1 100,0 0 0,0 0,0 imagen499 imagen500 TCA 1 3,4 1 3,4 0,0

imagen501: TGA 0 0,0 1 100,0 100,0 imagen502 imagen503 TCC 6 20,7 0 0,0 0,0

GLN (Q): CAA 10 55,6 18 100,0 100,0 imagen504 imagen505 TCG 7 24,1 0 0,0 0,0

imagen506: CAG 8 44,4 0 0,0 0,0 imagen507 imagen508 TCT 1 3,4 28 96,6 100,0

GLU (E): GAA 5 33,3 1 6,7 0,0 imagen509 THR (T) ACA 11 44,0 0 0,0 0,0

16: GAG 10 66,7 14 93,3 100,0 imagen510 imagen511 ACC 5 20,0 25 100,0 100,0

GLY (G): GGA 13 34,2 38 100,0 100,0 imagen512 imagen513 ACG 7 28,0 0 0,0 0,0

imagen514: GGC 16 42,1 0 0,0 0,0 imagen515 imagen516 ACT 2 8,0 0 0,0 0,0

imagen517: GGG 6 15,8 0 0,0 0,0 imagen518 TRP (W) TGG 19 100 19 100 0,0

imagen519: GGT 3 7,9 0 0,0 0,0 imagen520 TYR (Y) TAC 11 64,7 17 100,0 100,0

HIS (H): CAC 12 66,7 18 100,0 100,0 imagen521 imagen522 TAT 6 35,3 0 0,0 0,0

imagen523: CAT 6 33,3 0 0,0 0,0 imagen524 VAL (V) GTA 6 17,6 0 0,0 0,0

ILE (I): ATA 4 18,2 1 4.5 0,0 imagen525 imagen526 GTC 10 29,4 0 0,0 0,0

imagen527: ATC 9 40,9 21 95,5 100,0 imagen528 imagen529 GTG 12 35,3 0 0,0 0,0

imagen530: ATT 9 40,9 0 0,0 0,0 imagen531 imagen532 GTT 6 17,6 34 100,0 100,0

imagen533: Total 214 imagen534 214 imagen535 imagen536 imagen537 Total 236 imagen538 236 imagen539 imagen540

imagen541

imagen542

Claims

imagen1

imagen2