ES2620582T3 - Uso de BUBR1 como un biomarcador de la respuesta de fármacos a furazanobencimidazoles - Google Patents
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Abstract
Uso ex vivo de BUBR1 como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de fórmula general I, **Fórmula** en donde R representa fenilo, tienilo o piridinilo, en donde fenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrógeno forman, junto con el nitrógeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo está opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa un grupo C>=Y, en donde Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior; R1 representa hidrógeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmacéuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, éster o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal éster o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto, o en donde R representa fenilo o piridinilo, en donde fenilo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo está opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa oxígeno; R1 representa hidrógeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmacéuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, éster o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal éster o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto, y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un máximo de 7, especialmente hasta e incluye un máximo de 4 átomos de carbono, y en el que la respuesta es de una enfermedad en un sujeto, y el biomarcador BUBR1 se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo animal, preferiblemente tomadas del cuerpo humano.
Description
DESCRIPCION
Uso de BUBR1 como un biomarcador de la respuesta de farmacos a furazanobencimidazoles
La presente invencion se refiere al uso de BUBR1 como un biomarcador para predecir la respuesta de una enfermedad tal como una enfermedad neoplasica o autoimmune, preferiblemente cancer, a un compuesto de formula 5 general I tal como 3-(4-{1-[2-(4-amino-fenil)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)propionitrilo (BAL27862). En otros aspectos se refiere a metodos y kits, asf como a metodos de tratamiento que implican el uso del biomarcador.
Los microtubulos son uno de los componentes del citoesqueleto de la celula y se componen de heterodfmeros de tubulina alfa y beta. Los agentes que fijan como objetivo los microtubulos se encuentran entre los agentes 10 quimioterapeuticos citotoxicos mas eficaces que tienen un amplio espectro de actividad. Agentes desestabilizantes de microtubulos (p. ej., los alcaloides de la vinca tales como vincristina, vinblastina y vinorelbina) se utilizan, p. ej., en el tratamiento de varios tipos de tumores malignos hematologicos tales como leucemia linfoblastica y linfoma, asf como tumores solidos tales como el cancer de pulmon. Agentes estabilizadores de los microtubulos (p. ej., los taxanos tales como paclitaxel, docetaxel) se utilizan, por ejemplo, en el tratamiento de tumores solidos, incluyendo 15 cancer de mama, de pulmon y cancer de prostata.
Sin embargo puede producirse una resistencia a estos agentes fijadores como objetivo de microtubulos conocidos. La resistencia puede ser inherente o puede ser adquirida despues de la exposicion a estos agentes. Tal resistencia, por lo tanto, impacta sobre las tasas de supervivencia de los pacientes, asf como opciones de regfmenes de tratamiento. Se han identificado varios mecanismos potenciales de resistencia, e incluyen defectos en las dianas de 20 microtubulos tales como concentraciones elevadas de beta-tubulina subtipo III y mutaciones adquiridas en beta- tubulina subtipo I que se sabe reducen la union de taxano. Ademas, se ha sugerido que defectos en otras protemas celulares se asocian con la resistencia a determinados agentes que fijan como objetivo microtubulos tales como la sobre-expresion de glicoprotema P (bomba de P-gp, tambien conocida como protema de resistencia a multiples farmacos 1 o MDR1). Este tipo de factores puede entonces ser utilizado como biomarcadores de resistencia a estos 25 agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales.
Una clase de agentes desestabilizantes de microtubulos descubierta relativamente reciente son compuestos abarcados por la formula dada a continuacion:
en donde
30 R representa fenilo, tienilo o piridinilo
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en 35 donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;
5
10
15
20
25
30
R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos;
o en donde
R representa fenilo o piridinilo
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa oxfgeno;
R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;
y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos;
y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.
Estos compuestos se describen en el documento WO2004/103994 A1. Estos compuestos han demostrado detener la proliferacion de celulas tumorales e inducir la apoptosis.
La smtesis de compuestos de formula I se describe en el documento WO2004/103994 A1, en general, en las paginas 29-35, y en concreto en las paginas 39-55. Se pueden preparar tal como se describe o por un metodo analogo a los procesos descritos en el mismo.
Un compuesto que cae dentro de esta clase, conocido como BAL27862, y mostrado en el documento WO2004/103994 Al como ejemplo 58, tiene la estructura qrnmica y el nombre dado a continuacion:
Nombre qrnmico:
3-(4-{1-[2-(4-amino-fenil)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)-propionitrilo.
O en esta memoria como Compuesto A
Otros compuestos ejemplificados en el documento WO2004/103994 A1 como ejemplos 50 y 79, respectivamente, tienen las estructuras y nombres qmmicos que se indican a continuacion:
5 Nombre qmmico: 2-[2-(4-amino-furazan-3-il)-benzoimidazol-1-il]-1-(4-amino-fenil)-etanona o en esta memoria como Compuesto B y
Nombre qmmico: 3-(4-{1-[2-(6-amino-piridin-3-il)-2-oxo-etil]-1H-benzoimidazol-2-il}-furazan-3-ilamino)-propionitrilo 10 o en esta memoria como Compuesto C.
BAL27862 ha demostrado actividad a lo largo de un amplio panel de modelos experimentales de xenoinjertos de tumores solidos. Ademas de ello, la actividad se mantuvo incluso en contra de modelos de tumores que han sido seleccionados en cuanto a la resistencia a agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales (incluyendo los desestabilizadores de microtubulos de alcaloides de la vinca y los estabilizadores de microtubulos paclitaxel y 15 epotilona B). La actividad de BAL27862 no se vio afectada por la sobre-expresion de la bomba de P-gp en ningun modelos sometido a ensayo in vitro, ni en xenoinjertos de tumores mamarios humanos. Adicionalmente, BAL27862 retuvo su actividad a pesar de las concentraciones elevadas de beta-tubulina subtipo III y mutaciones en tubulina subtipo I (vease el poster "Actividad in vitro del nuevo agente activo tubulina BAL27862 en MDR1(+) y MDR1(-) de variantes de cancer de mama y de ovario humano, seleccionadas en cuanto a la resistencia a taxanos", presentado 20 en la 101a Reunion Anual de 20l0).
Por lo tanto, la actividad de BAL27862 no se ve afectada por un cierto numero de factores que confieren resistencia a los agentes que fijan como objetivo microtubulos convencionales.
Ademas de ello, se sabe que los compuestos de formula general I tienen un efecto diferente en el fenotipo de las celulas en comparacion con otros agentes que fijan como objetivo microtubulos, incluyendo otros desestabilizadores de microtubulos (vease el poster "BAL27862: Un Nuevo Agente Anticancer que Disocia Microtubulos y Crea un Fenotipo Celular Distinto", presentado en el Simposio EORT-NCI-AACR de 2009). La presente solicitud tambien 5 muestra que el tratamiento con un compuesto de formula general I induce un fenotipo de microtubulos consistente en lmeas celulares tumorales derivadas de una diversidad de organos, por ejemplo, pulmon, cuello uterino y mama, como se ve en la Figura 1. La tincion de los microtubulos en estas celulas con un anticuerpo anti-tubulina alfa demuestra que en lugar de las fibras del huso mitotico de celulas no tratadas, solamente son visibles las estructuras en forma de puntos en las celulas tratadas. Este mismo efecto se muestra tambien utilizando compuestos C y B en 10 las Figuras 2A y 2B, respectivamente, en la lmea celular de cancer de pulmon A549. Sin embargo, es muy distinto del observado con los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos vinblastina, colchicina, paclitaxel y nocodazol tal como se ve en las Figuras 3B, 3C, 3D y 4, respectivamente. Los microtubulos se tineron con un anticuerpo anti-tubulina alfa y las celulas se vieron en un aumento de 1000 x (Figuras 3, 4). Para las celulas tratadas con BAL27862, son visibles multiples estructuras en forma de puntos, mientras que, en marcado contraste, los otros 15 farmacos convencionales producen estructuras filamentosas de microtubulos o estructuras agregadas de microtubulos densas. Estas diferencias a nivel fenotfpico, en dosis de compuestos consideradas optimas en terminos de efecto antiproliferativo, indican una diferencia en el modo de accion a nivel molecular.
Ademas, se sabe que BAL27862 provoca un fenotipo dominante de microtubulos en presencia de los otros agentes que fijan como objetivo microtubulos (vease tambien el poster "BAL27862: Un Nuevo Agente contra el Cancer que 20 Disocia Microtubulos y Crea un Fenotipo Celular Distinto"). La presente solicitud tambien muestra que el tratamiento con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol por sf solo induda los fenotipos de microtubulos caractensticos de estos agentes (Figuras 5A, 5D, 5G, 6C-6F, respectivamente). Sin embargo, el tratamiento de combinacion con BAL27862 durante las ultimas 4 horas dio lugar a la interrupcion de estos fenotipos; a pesar de la presencia continua de vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol (Figuras 5B, 5E, 5H, 6G-6J, respectivamente). En contraste, el 25 tratamiento primero con BAL27862 y posteriormente durante 4 horas en combinacion con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol no tuvo impacto alguno en la generacion del fenotipo compatible con el tratamiento con BAL27862 (Figuras 5C, 5F, 5I, 6K-6N, respectivamente).
El documento WO 2005/020794 estudia la determinacion de la quimioselectividad de celulas cancerosas a taxanos, evaluando el efecto del taxano sobre el nivel de expresion o actividad, entre muchos otros, de BUBR1.
30 El documento WO 98/56910 describe una preparacion de anticuerpos que espedficamente se unen a una protema huBUB1.
El poster "BAL27862: Un farmaco unico que fija como objetivo microtubulos suprime la dinamica de los microtubulos, corta los microtubulos y supera la resistencia a farmacos con Bcl-2 y relacionados con el subtipo tubulina", presentado en la 101a Reunion Anual de la Asociacion Americana para la Investigacion del Cancer, describe que 35 BAL27862 produce un fenotipo de microtubulos unico distinto del observado con alcaloides de la vinca.
Todos estos datos demuestran que BAL27862 afecta a la biologfa de los microtubulos de una manera diferente que los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos.
Por lo tanto, a partir de la informacion acerca de los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos, las predicciones no pueden hacerse respecto a si, o como, genes particulares estan implicados en la accion de los 40 compuestos de formula I.
Un objeto de la presente invencion es identificar factores que esten asociados con la respuesta a compuestos de formula I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, por ejemplo, para identificar los factores asociados con la resistencia a los compuestos de formula general I, en particular BAL27862 o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define mas adelante.
45 Sorprendentemente, se ha encontrado que BUBR1 se puede utilizar como un biomarcador de la respuesta al tratamiento con un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define mas adelante.
En una realizacion preferida de la invencion, concentraciones relativamente bajas de BUBR1 en una muestra se asocian con una resistencia inherente y adquirida a BAL27862 tal como se describe mas adelante.
A BUBR1 se le ha asignada por el Comite de Nomenclatura de Genes Humanos el Numero de Identificacion HGNC ID: 1149 y Entrez Gene ID701. Una secuencia correspondiente a BUBR1 humana esta disponible a traves del Centro Nacional para la Informacion Biotecnologica (NCBl) numero de referencia NP_001202 (Figura 18, SEQ ID N° 1, NP_001202.4).
5 BUBR1 es tambien conocida como hBUBR1 y BubR1; brote no inhibido por bencimidazoles 1, S. cerevisiae, homologo, beta; gen de verificacion mitotica BUB1B; BUB1B; BUB1 beta; quinasa de verificacion mitotica Mad3L; MAD3L; protema quinasa similar a MAD3; y SSK1. El nombre BUB1B se asocia habitualmente con la secuencia de acido nucleico, mientras que publicaciones centradas en la protema han utilizado habitualmente el termino BUBR1. Por simplicidad, se utilizara el termino BUBR1 en esta memoria para abarcar todos los sinonimos arriba 10 mencionados y se referira a esta entidad tanto al nivel de acido nucleico como de protema, segun sea apropiado.
El nombre brote no inhibido por bencimidazoles fue asignado al homologo de levadura por Hoyt et al. tras experimentos realizados con benomilo. (Hoyt MA. et al., S. Cerevisiae Genes Required for Cell Cycle Arrest in Response to Loss of Microtubule Function. Cell, Vol. 66, 507-517, 9 de agosto de 1991). Esta publicacion describe mutaciones en el homologo de levadura bub que resulto en una hipersensibilidad a benomilo.
15 El homologo humano esta situado en el cromosoma 15q15. La secuencia del gen BUBR1 humano se publico en el documento US 6.593.098 B1 y se identifica en esta memoria como BUB1A humana. El Ejemplo VI de esa patente describe un experimento realizado en celulas HeLa, en donde la actividad de BUB1A endogena (BUBR1) fue inhibida por microinyeccion de anticuerpos anti-huBUB1A. Las celulas inyectadas fueron luego sometidas a ensayo en cuanto a su capacidad de permanecer detenidas en la mitosis cuando se exponen a novodazol, un 20 desestabilizante de microtubulos. La patente establece que las celulas a las que se inyectaron anticuerpos huBUB1a fracasaron en detener la mitosis en presencia de nocodazol y prosiguieron a sufrir una apoptosis como resultado de una salida prematura de la mitosis.
De manera similar a la publicacion de Hoyt, esto sugiere que la perdida de la funcion de BUBR1 en celulas que luego son tratadas con nocodazol, resulta en una tasa incrementada de la apoptosis.
25 Sin embargo, en contraposicion, los autores de la presente invencion han encontrado que la perdida de la expresion de BUBR1 esta asociada con niveles reducidos de muerte celular en respuesta a compuestos de formula general I, es decir, resistencia a estos compuestos. De nueva se enfatiza que compuestos de formula general I tienen un efecto diferente sobre el fenotipo de celulas en comparacion con otros agentes de microtubulos, incluyendo otros desestabilizadores de microtubulos , tal como se ve en las Figuras 3, 4, 5 y 6. La discrepancia entre los hallazgos, 30 por un lado, del documento US 6.593.098 B1 y Hoyt y, por el otro lado, los autores de la presente invencion confirma que no se pueden hacer predicciones de la informacion concerniente a agentes de microtubulos convencionales si, o de que manera genes particulares estan implicados en la actividad de compuestos de formula general I.
Un aspecto de la presente invencion se refiere al uso ex vivo de BUBR1 como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de formula general I,
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en donde R representa fenilo, tienilo o piridinilo
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, 40 alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en
donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;
5 R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;
y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se 10 seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,
o en donde
R representa fenilo o piridinilo
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre 15 alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son 20 metilendioxi;
y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa oxfgeno;
R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
25 R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior;
o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;
y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,
30 y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.
La respuesta es de una enfermedad en un sujeto. Preferiblemente, la respuesta puede ser para el tratamiento, es decir, para el tratamiento con el compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos.
35 El biomarcador BUBR1 se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo humano o animal, tomadas preferentemente del organismo humano.
En una realizacion preferida, la invencion se refiere al uso de BUBR1 como un biomarcador para predecir la resistencia de una enfermedad en un sujeto a un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos como se define anteriormente.
40 El derivado farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en una sal, solvato, pro-farmaco tal como se define en esta memoria, sal de un pro-farmaco y polimorfo de un compuesto de formula general I tal como se ha definido anteriormente. Los pro-farmacos son esteres y amidas hidrolizables in vivo del compuesto de formula (I), preferiblemente esteres y amidas de aminoacidos de origen natural, pequenos peptidos o hidroxiacidos pegilados. Mas preferiblemente, el pro-farmaco es una amida formada a partir de un grupo amino presente en el 45 grupo R del compuesto de formula general I y el grupo carboxi de glicina, alanina o lisina.
De manera particularmente preferible el compuesto es
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, preferiblemente una sal hidrocloruro del mismo, lo mas preferiblemente una sal dihidrocloruro del mismo.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para predecir la respuesta de una enfermedad en un sujeto a un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define anteriormente, que comprende las etapas de:
a) medir una concentracion de BUBR1 en una muestra pre-obtenida del sujeto para obtener un valor o valores que representan esta concentracion; y
b) comparar el valor o los valores de la etapa a) con un valor estandar o un conjunto de valores estandar de los sujetos con el mismo tipo de cancer, en donde una concentracion de BUBR1 menor en la muestra en relacion con el valor estandar o un conjunto de valores estandares es predictiva de la resistencia del cancer de los sujetos al compuesto de formula (I).
La respuesta que se predice es la resistencia.
La medicion de una concentracion o concentraciones de BUBR1 se lleva a cabo ex-vivo en una muestra o muestras pre-obtenidas del sujeto. Pre-obtenidas se refiere al hecho de que la muestra se obtiene antes de someterla a cualquier metodo que implique la medicion de la concentracion del biomarcador, y pre-obtenidas no ha de entenderse como en relacion con el tratamiento.
Una concentracion menor de BUBR1 en la muestra del sujeto con relacion al valor estandar o un conjunto de valores estandar predice resistencia.
La enfermedad es cancer. De manera especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer colorrectal (es decir, incluyendo el cancer de colon y cancer rectal), cancer de pancreas, cancer de tngado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas. De manera mas especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de colon y cancer de pulmon. De manera mas particularmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de colon y cancer de pulmon. En otra realizacion particularmente preferida, en donde se determina la resistencia adquirida, el cancer es cancer de pulmon o cancer de ovario. Todavfa en otra realizacion particularmente preferida, en donde se determina la resistencia inherente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer cervical, cancer de mama, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de colon y cancer de pulmon, mas preferiblemente cancer de pulmon o cancer gastrico.
En esta memoria tambien se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende medir una concentracion de BUBR1 en una muestra del sujeto para obtener un valor o valores que representan esta concentracion, y tratar el sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define 5 anteriormente, si la concentracion de BUBR1 en dicha muestra no es menor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares.
BUBR1 se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, en donde una concentracion de BUBR1 en una muestra del sujeto se mide para obtener un valor o valores que representan esta concentracion, y el sujeto es tratado con un compuesto de formula general I o un derivado 10 farmaceuticamente aceptable del mismo como se define anteriormente, si la concentracion de BUBR1 no es menor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares.
La medicion de una concentracion de BUBR1 se lleva a cabo ex-vivo en una muestra pre-obtenida del sujeto.
En esta memoria tambien se describe un metodo de tratar una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, aumentando primero la concentracion de BUBR1 en un sujeto que tiene una muestra con 15 una menor concentracion de BUBRl en comparacion con una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares y, a continuacion, tratar al sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo como se define anteriormente.
En aun otro aspecto, la invencion se refiere a un kit para predecir la respuesta a un compuesto de formula I general o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, que comprende los 20 reactivos necesarios para medir la concentracion de BUBR1 en una muestra. El kit tambien comprende un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares con los que la concentracion de BUBR1 en la muestra se compara como se define en las reivindicaciones.
El kit tambien comprende un compuesto de formula I o derivados farmaceuticamente aceptables del mismo tal como se define en las reivindicaciones o la siguiente formula o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos
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Nombre qmmico: [4-(2-{2-[4-(2-ciano-etilamino)-furazan-3-il]-benzoimidazol-1-il}-acetil)- fenil]-amida del acido S-2,6- diamino-hexanoico
En una realizacion particularmente preferida, la sal farmaceuticamente aceptable es una sal dihidrocloruro.
En una realizacion preferida, los reactivos en el kit comprenden un reactivo de captura que comprende un detector 30 para BUBR1 y un reactivo detector. De manera especialmente preferida el reactivo de captura es un anticuerpo. Tambien preferiblemente, la enfermedad se predice para ser resistente al tratamiento con dicho compuesto cuando BUBR1 es menor en relacion con un valor estandar o un conjunto de valores estandares. En una realizacion preferida, el modulo de comparador esta incluido en las instrucciones de uso del kit. En otra realizacion preferida, el modulo de comparador esta en forma de un dispositivo de visualizacion.
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Realizaciones de la presente invencion se describiran ahora a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas. La invencion, sin embargo, no ha de entenderse limitada a estas formas de realizacion.
Breve Descripcion de las Figuras
Figura 1: Muestra el tratamiento de lmeas celulares de tumores humanos de diferentes histotipos con BAL27862 50 nM. Los microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con BAL27862 50 nM o vehfculo de control
Fig. 1A y 1B: celulas de NSCLC A549;
Fig. 1C y 1D: celulas de cancer cervical HeLa;
Fig. 1E y 1F: celulas de cancer de mama SKBR3 Tratamiento con control de vehuculo: Figuras 1A, 1C y 1E, tratamiento con BAL27862: Figuras 1B, 1D y 1F.
Figura 2: Muestra el tratamiento de celulas de NSCLC A549 con los Compuestos B y C. Los microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con 80 nM o 20 nM de los Compuestos B y C, respectivamente. La barra de escala blanca representa 10 micrometros.
Fig. 2A: tratamiento con 20 nM de Compuesto C Fig. 2B: tratamiento con 80 nM de Compuesto B
Figura 3: Muestra una comparacion del tratamiento de celulas con BAL27862 en comparacion con los agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues de 24 horas de tratamiento con 50 nM de A: BAL27862; B: vinblastina; C: colchicina; D: paclitaxel. Pilas de imagenes tomadas cada 1 pm, se procesaron utilizando el software ImageJ.
Figura 4: Muestra una comparacion del tratamiento de celulas de NSCLC A549 con BAL27862 en comparacion con nocodazol. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M fueron tenidos despues de 24 h de tratamiento con diversas concentraciones de nocodazol (B, C y D) y BAL27862 (E, F y G). A: control, B: Nocodazol 50 nM, C: Nocodazol 100 nM, D: Nocodazol 200 nM, E: BAL27862 20 nM; F: BAL27862 30 nM y G: BAL27862 50 nM. La barra de escala blanca representa 10 micrometros. Se muestran imagenes representativas de los fenotipos de microtubulos observados.
Figura 5: Muestra una combinacion de tratamiento con BAL27862 y agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues del tratamiento durante los tiempos indicados mas adelante. Se utilizaron vinblastina 50 nM, colchicina 50 nM y paclitaxel 25 nM. La barra de escala blanca representa 10 micrometros.
Fig. 5A: Tratamiento con vinblastina durante 24 horas;
Fig. 5B: Tratamiento con vinblastina durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;
Fig. 5C: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales vinblastina;
Fig. 5D: Tratamiento con colchicina durante 24 horas;
Fig. 5E: Tratamiento con colchicina durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;
Fig. 5F: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales colchicina;
Fig. 5G: Tratamiento con paclitaxel durante 24 horas;
Fig. 5H: Tratamiento con paclitaxel durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862;
Fig. 5I: Tratamiento con BAL27862 durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales paclitaxel.
Figura 6: Muestra una combinacion de tratamiento con BAL27862 y nocodazol. Microtubulos de celulas mitoticas o detenidas G2/M de NSCLC A549 fueron tenidos despues del tratamiento durante los tiempos indicados mas adelante. Se utilizaron BAL27862 25 nM y nocodazol a las concentraciones indicadas a continuacion. La barra de escala blanca representa 10 micrometros.
Figo. 6A: Tratamiento con control durante 24 horas;
Figo. 6B: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas;
Figo. 6C: Tratamiento con nocodazol 50 nM durante 24 horas;
Figo. 6D: Tratamiento con nocodazol 100 nM durante 24 horas;
Figo. 6E: Tratamiento con nocodazol 150 nM durante 24 horas;
Figo. 6F: Tratamiento con nocodazol 200 nM durante 24 horas;
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Fig. 6G: Tratamiento con nocodazol 50 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM; Fig. 6H: Tratamiento con nocodazol 100 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM; Fig. 6I: Tratamiento con nocodazol 150 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM; Fig. 6J: Tratamiento con nocodazol 200 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales BAL27862 25 nM; Fig. 6K: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 50 nM; Fig. 6L: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 100 nM; Fig. 6M: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 150 nM; Fig. 6N: Tratamiento con BAL27862 25 nM durante 24 horas incluyendo las 4 horas finales nocodazol 200 nM;
Figura 7: muestra el analisis de inmunotransferencia de la expresion de BUBR1 despues de la transfeccion con una agrupacion de ARNip de BUBR1. Control: celulas no transfectadas tratadas con medio solo; Lipofectamina: celulas tratadas con el reactivo de transfeccion solo; NTC: celulas tratadas ARNip control no fijador de objetivo; BUBR1: celulas tratadas con una agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1.Los niveles de alfa-tubulina actuan como control de carga. Anticuerpos BUBR1 de Senalizacion Celular (CS) o BD Transduction Laboratories (BD) se utilizaron como se indica. Fig. 7A: celulas de cancer cervical HeLa, Fig. 7B: celulas de cancer de pulmon H460.
Figura 8: Efecto de una agrupacion de ARNip de BUBR1 en respuesta a BAL27862 en celulas HeLa. Las celulas HeLa fueron sembradas y tratados con ARNip. Despues de 48 horas de incubacion, las celulas fueron tratadas con DMSO solo o BAL27862 50 nM durante 24 horas antes del analisis. Panel superior: histograma de la fraccion de celulas por pocillo (en %) que exhibe el fenotipo no tratado. Panel inferior: histograma del numero de celulas por pocillo. Barras de error: desviacion estandar. Control negativo: ARNip control no fijador de objetivo. BubR1: celulas tratadas con la agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1.
Figura 9: Muestra el efecto de una agrupacion de ARNip de BUBR1 en respuesta de celulas HeLa a BAL27862. Celulas HeLa en crecimiento exponencial fueron tratadas con medio solo (control), o transfectadas con lipofectamina, ARNip control no fijador de objetivo (NTC) o una agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1. Despues de 24 horas, se anadio BAL27862 a las concentraciones indicadas, con vehfculo DMSO utilizado como control. Despues de tratamiento durante 48 horas, se evaluaron los efectos sobre la proliferacion de celulas HeLa (Fig. 9A) y la viabilidad (Fig. 9B) utilizando el ensayo de proliferacion de YO-PRO, a.u = los datos se expresan como unidades arbitrarias.
Figura 10: Muestra el efecto de una agrupacion de ARNip de BUBR1 en respuesta de celulas H460 a BAL27862. Celulas H460 en crecimiento exponencial fueron transfectadas con ARNip control no fijador de objetivo (NTC) o una agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1. Despues de 24 horas, se anadio BAL27862 a las concentraciones indicadas, con vehfculo DMSO utilizado como control. Despues de tratamiento durante 48 horas, se evaluaron los efectos sobre la proliferacion de celulas H460 (Fig. 10A) y la viabilidad (Fig. 10B) utilizando el ensayo de proliferacion de YO-PRO, a.u = los datos se expresan como unidades arbitrarias.
Figura 11: Muestra el efecto de una agrupacion de ARNip de BUBR1 en respuesta de celulas MCF-7 a BAL27862. Celulas MCF-7 en crecimiento exponencial fueron tratadas con ARNip control no fijador de objetivo (NTC) o una agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1. Despues de 24 horas, se anadio BAL27862 a las concentraciones indicadas, con vehfculo DMSO utilizado como control. Despues de tratamiento durante 48 horas, se evaluaron los efectos sobre la proliferacion de celulas MCF-7 (Fig. 11A) y la viabilidad (Fig. 11B) utilizando el ensayo de proliferacion de YO-PRO, a.u = los datos se expresan como unidades arbitrarias.
Figura 12: Muestra el efecto de una agrupacion de ARNip de BUBR1 en respuesta de celulas HeLa, Panc1 y HCT116 a BAL27862. Celulas en crecimiento exponencial fueron tratadas con ARNip control no fijador de objetivo (NTC) o una agrupacion de ARNip espedfica para BUBR1. Despues de 24 horas, se anadio BAL27862 50 nM (HeLa, HCT116) o 30 nM (Panc1), con vehfculo DMSO utilizado como control. Despues de tratamiento durante 48 horas, se evaluaron los efectos sobre la proliferacion de celulas HeLa (Fig. 12A), Panc1 (Fig. 12B) y HCT116 (Fig 12C) utilizando el ensayo de Cristal Violeta, a.u = datos se expresan como unidades arbitrarias.
Figura 13: Muestra el efecto de ARNip de BUBR1 individuales en la respuesta de celulas HeLa a BAL27862. Celulas en crecimiento exponencial fueron tratadas con ARNip control no fijador de objetivo (NTC) o ARNip espedficos para BUBR1 individuales (ARNip n°s 1, 2, 3 y 4 tal como se define en la seccion de metodologfa experimental que figura mas adelante). Despues de 24 horas, se anadio BAL27862 50 nM, con vehfculo DMSO utilizado como control. Despues de tratamiento durante 48 horas se evaluaron los efectos sobre la proliferacion de celulas HeLa (Fig. 13A)
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utilizando el ensayo de Cristal Violeta y los efectos en la expresion de protemas BUBR1 se evaluaron por inmunotransferencia (Fig 13B). a.u = datos se expresan como unidades arbitrarias.
Figura 14: Muestra que los niveles de protema BUBR1 disminuyen en lmeas tumorales con resistencia adquirida a BAL27862. Se seleccionaron lmeas de celulas tumorales en cuanto a la resistencia a BAL27862 a traves del cultivo in vitro en presencia de BAL27862. Sobre la base de las determinaciones de CI50, los factores de resistencia de BAL27862 frente a lmeas parentales fueron: A549 (3,0 veces); SKOV3 (7,6 veces - lmea resistente 1); H460 (5,3 veces) (vease la Tabla 1). Extractos de protemas de celulas enteras se prepararon a partir de lmeas parentales y resistentes y se analizaron por inmunotransferencia en cuanto a la expresion de BUBR1. Los niveles de actina actuan como control de carga.
Figura 15: Muestra que las concentraciones de protema BUBR1 disminuidos se mantienen en la lmea tumoral SKOV3 durante el desarrollo de la resistencia. Se seleccionaron celulas tumorales SKOV3 para la resistencia a BAL27862 a traves de cultivo in vitro en presencia de BAL27862 durante penodos de tiempo prolongados. Basado en las determinaciones de CI50, los factores de resistencia de BAL27862 frente a lmeas parentales fueron: SKOV3 resistente 1 (7,6 veces), SKOV3 resistente 2 (11,6 veces) (vease la Tabla 1). Se prepararon extractos de protemas de celulas enteras a partir de lmeas parentales y resistentes y se analizaron por inmunotransferencia para la expresion de BUBR1 utilizando el anticuerpo de BUBR1 BD Transduction Laboratories (BD). Concentraciones de alfa-tubulina actuan como un control de carga.
Figura 16: Muestra que las concentraciones de BUBR1 de celulas tumorales estan disminuidos en tumores xenoinjertados derivados de pacientes definidos como resistentes a BAL27862 mediante analisis de crecimiento de colonias ex vivo. Se prepararon xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (mantenidos en ratones inmunodeficientes), se fijaron y se tineron para la expresion de protemas BUBR1 utilizando inmunohistoqmmica. La resistencia a BAL27862, paclitaxel y vinblastina y la sensibilidad es como se define en la Tabla 2.
Figura 17: Muestra que para BUBR1, las concentraciones de protema en las celulas tumorales son reflejados por sus niveles de expresion de ARN. Figura 17A: Se prepararon muestras a partir de lmeas celulares HeLa y H460, y se realizo una rT-PCR cuantitativa en estas para medir las concentraciones de ARN. Los resultados de HeLa se fijaron en 100%, y el grafico muestra los niveles de expresion de ARN en la muestra de H460 con relacion a los valores HeLa. Figura 17B: Extractos de protemas de celulas enteras se prepararon a partir de de los mismos pasajes de las lmeas celulares HeLa y H460 y luego se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos de BUBR1 BD Transduction Laboratories (BD) para la expresion de protemas BUBR1. Las concentraciones de alfa-tubulina actuan como control de carga.
Figura 18: Muestra la secuencia de protemas preferida de BUBR1 (SEQ ID No. 1)
Figura 19: Muestra la secuencia de acido nucleico preferida de BUBR1 (SEQ ID N°. 2)
Descripcion Detallada
Compuestos de formula I
Los compuestos estan representados por la formula general I:
en donde
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
R representa fenilo, tienilo o piridinilo
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;
R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;
y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de dicho ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,
o en donde
R representa fenilo o piridinilo,
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;
X representa oxfgeno;
R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R2, R3y R6 representan hidrogeno;
R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;
y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de dicho ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto;
y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.
Heterociclilo designa preferiblemente un anillo saturado, parcialmente saturado o insaturado, mono- o bi-ciclico que contiene 4-10 atomos que comprenden uno, dos o tres heteroatomos seleccionados de nitrogeno, oxfgeno y azufre, que puede estar, a menos que se especifique lo contrario, enlazado a carbono o nitrogeno, en el que un atomo de nitrogeno del anillo puede estar opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, amino- alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior y acilo, y un atomo de carbono del anillo puede estar sustituido con alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior, heteroarilo, alcoxi inferior, hidroxi u oxo. Ejemplos de heterociclilo son pirrolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, dioxolanilo y tetrahidropiranilo.
Acilo designa, por ejemplo, alquilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, arilcarbonilo, aril-alquil inferior-carbonilo o heteroarilcarbonilo. Acilo inferior es preferiblemente alquil inferior-carbonilo, en particular propionilo o acetilo.
Preferiblemente, el compuesto de formula general I se define como en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, acetilo, CH2CH2CN y CH2CH2CH2OH.
En una realizacion preferida, el compuesto de formula general I se selecciona del grupo que consiste en:
4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina,
4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima,
N-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-acetamida, 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina 4-[l-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina, 4-[l-(3-amino-4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina 5 4-[l-(3-metoxi-4-metoximetoxi-fenacilo)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina, y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se define arriba.
En otra realizacion preferida, el compuesto de formula general I es:
en donde
10 R, Y y R1 se definen como sigue:
O
NOH
NOMe
NOMe
O
O
Ac
O
O
O
O
CH2CH2CN
O
CH2CH2CN
H
H
H
H
H
H
H
H
O
H
O
O
O
O
O
O
O
CH2CH2CH2OH
H
CH2CH2CN
H
CH2CH2CN
CH2CH2CN
CH2CH2CN
O
H
O
H
O
H
O
O
O
O
H„N.
XT
O
CH2CH2CN
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
O
O
CH2CH2CN
O
O
O
CH2CH2CN
H
H
H
H
o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente.
Aun en una realizacion preferida, el compuesto de formula general I se selecciona del grupo que consiste en: 4-(1-fenoximetil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina,
5 4-[1-(4-fluorofenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina,
4-[l-(3,4-dimetilfenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina y compuestos representados por la formula:
R
R
1
CH2CH2CN
CH2CH2CN
CH2CH2CN
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CH2CH2CN
CH2CH2CH2OH
H
H
y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente. En aun otra realizacion preferida, el compuesto de formula general I es:
5 en donde R, R4y R5son como se definen a continuacion
Me
Me
Me
Me
Me
Me
Me
Me
Me
Me
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente. Mas preferiblemente, el compuesto es un compuesto de formula general I
en donde
R representa fenilo o piridinilo,
en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente de 5 alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogeno y nitro;
y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con amino o halogeno;
X representa un grupo C=O;
R1 representa hidrogeno o ciano- alquilo inferior;
R2, R3, R4, R5y R6representan hidrogeno;
10 y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente,
y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono.
De manera especialmente preferida, el compuesto esta representado por la siguiente formula
15 en donde R, Y y R1 se definen como sigue:
- R
- Y R1
- rr
- O H
- jTY
- O CH2CH2CN
- R
- Y R1
- J HSN
- 0 r O H
- J HSN
- 0 r O CH2CH2CN
o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente.
De manera mas especialmente preferida, el compuesto esta representado por la siguiente formula 5
en donde R, Y y R1 se definen como sigue:
5
o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente. De manera particularmente preferida, el compuesto es
o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente.
El termino derivado o derivados en la frase "derivado farmaceuticamente aceptable" o "derivados farmaceuticamente aceptables" de los compuestos de formula general I se refiere a sales, solvatos y complejos de los mismos y a 5 solvatos y complejos de sales de los mismos, asf como a pro-farmacos tal como se define en esta memoria, y polimorfos y tambien sales de pro-farmacos de los mismos tal como se definen anteriormente.
En una realizacion mas preferida, se refiere a sales y pro-farmacos, asf como a sales de profarmacos de los mismos tal como se definen anteriormente.
Las sales son preferiblemente sales por adicion de acidos. Las sales se forman, preferiblemente con acidos 10 organicos o inorganicos, a partir de compuestos de formula (I) con un atomo de nitrogeno de caracter basico, especialmente las sales farmaceuticamente aceptables. Acidos inorganicos adecuados son, por ejemplo, acidos halogenados tales como acido clorhndrico, acido sulfurico o acido fosforico. Acidos organicos adecuados son, por ejemplo, los acidos carboxflico, fosfonico, sulfonico o sulfamico, por ejemplo, acido acetico, acido propionico, acido octanoico, acido decanoico, acido dodecanoico, acido glicolico, acido lactico, acido fumarico, acido succmico, acido 15 adfpico, pimelico acido, acido suberico, acido azelaico, acido malico, acido tartarico, acido dtrico, aminoacidos tales como acido glutamico o acido aspartico, acido maleico, acido hidroximaleico, acido metilmaleico, acido ciclohexanocarboxflico, acido adamantanocarboxflico, acido benzoico, acido salicnico, acido 4-aminosalidlico, acido ftalico, acido fenilacetico, acido mandelico, acido cinamico, acido metano- o etano-sulfonico, acido 2- hidroxietanosulfonico, acido etano-1,2-disulfonico, acido bencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 1,520 naftaleno-disulfonico, acido 2-, 3- o 4-metilbencenosulfonico, acido metilsulfurico, acido etilsulfurico, acido dodecilsulfurico, acido N-ciclohexilsulfamico, acido N-metil-, N-etil- o N-propil-sulfamico, u otros acidos protonicos organicos tales como acido ascorbico.
El compuesto se puede administrar en forma de un pro-farmaco que se descompone en el cuerpo humano o animal para dar el compuesto de la formula I. Los pro-farmacos son esteres y amidas hidrolizables in vivo de un compuesto 25 de la formula I. Pro-farmacos particulares considerados son esteres y amidas de aminoacidos que se producen de forma natural y esteres o amidas de peptidos pequenos, en particular peptidos pequenos que consisten en hasta cinco, preferiblemente en dos o tres aminoacidos, asf como esteres y amidas de hidroxiacidos pegilados, preferiblemente acido hidroxi-acetico y acido lactico. Esteres de pro-farmacos se forman a partir de la funcion acido del aminoacido o el extremo C del peptido y grupo o grupos hidroxi adecuados en el compuesto de formula I. Amidas 30 de pro-farmacos se forman a partir de la funcion amino del aminoacido o el extremo N del peptido y grupo o grupos carboxi adecuados en el compuesto de formula I, o de la funcion acido del aminoacido o el extremo C del peptido y grupo o grupos amino adecuados en el compuesto de formula I. De manera particularmente preferida, las amidas de pro-farmacos se forman a partir del o de los grupos amino presentes en el grupo R de formula I.
Mas preferiblemente, el pro-farmaco es una amida formada a partir de un grupo amino presente dentro del grupo R 35 del compuesto de formula general I segun se define anteriormente, y el grupo carboxi de glicina, alanina o lisina.
Incluso mas preferiblemente, el compuesto de formula general I esta en forma de un pro-farmaco seleccionado de los compuestos de formulas:
En una realizacion especialmente preferida, el compuesto de formula general I esta en forma de un pro-farmaco que 5 tiene la siguiente formula
En una realizacion mas especialmente preferida, el compuesto es
o una sal farmaceuticamente aceptable, preferiblemente una sal hidrocloruro, lo mas preferiblemente una sal 5 dihidrocloruro.
El metabolito farmaceuticamente activo in vivo en este caso es BAL27862.
Estos pro-farmacos se pueden preparar mediante procedimientos que son conocidos per se, en particular, un procedimiento en el que un compuesto de formula (II)
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en donde R1 se define como para la formula (I) y Z es CH o N, o un derivado de un compuesto de este tipo que comprende grupos funcionales en forma protegida, o una sal del mismo
(1) se acila con un aminoacido de formula (III)
en donde
R10se selecciona de hidrogeno (Gly); metilo (Ala) y aminobutilo protegido (Lys) y R11 es un grupo protector adecuado de amino, y
(2) cualesquiera grupos protectores en un derivado protegido del compuesto resultante se separan para producir un pro-farmaco del compuesto (II) tal como se muestra arriba y, si se desea,
(3) dicho pro-farmaco se convierte en una sal mediante tratamiento con un acido, o una sal de un compuesto de formula (II) se convierte en el correspondiente compuesto libre de formula (II) o en otra sal, y/o una mezcla de compuestos de productos isomericos se separa en los isomeros individuales.
La acilacion de un compuesto de formula (II) con un aminoacido de formula (III) se lleva a cabo de una manera conocida per se, habitualmente en presencia de un disolvente aprotico polar o dipolar adecuado, con enfriamiento o calentamiento segun se requiera, por ejemplo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente menos 80°C a aproximadamente mas 150°C, mas preferiblemente de menos 30°C a mas 120°C, especialmente en un intervalo de aproximadamente alrededor de 0°C a la temperatura de reflujo del disolvente utilizado. Opcionalmente se anade una base adecuada, en particular una base aromatica tal como piridina o colidina o una base de amina terciaria tal como trietilamina o diisopropiletilamina, o una sal inorganica de caracter basico, p. ej., carbonato de potasio o de sodio.
La acilacion puede llevarse a cabo en las condiciones utilizadas para la formacion de amidas conocida per se en la qmmica de los peptidos, p. ej., con agentes activantes para el grupo carboxi tales como carbodiimidas tales como N,N'-dietil-, N,N'-dipropil-, N,N'-diisopropil-, N,N'-diciclohexil-carbodiimida e hidrocloruro de N-(3-
dimetilaminoisopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), o con agentes tales como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de O-(7-aza- benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HATU), tetrafluoroborato de 2-(2-oxo-1-(2H)piridil)-1,1,3,3- tetrametiluronio (TPTU), opcionalmente en presencia de bases, catalizadores o co-reactivos adecuados. El grupo carboxi puede tambien ser activado como haluro de acilo, preferiblemente como cloruro de acilo, p. ej., por reaccion con cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, o como anhfdrido simetrico o asimetrico, p. ej., por reaccion con halogenoformiatos tales como cloroformiato de etilo, opcionalmente en presencia de bases, catalizadores o co- reactivos adecuados.
Si uno o mas de otros grupos funcionales, por ejemplo carboxi, hidroxi o amino, estan o necesitan ser protegidos en un compuesto de formula (II) o (III), debido a que no deben formar parte de la reaccion, estos son grupos protectores tales como los que se emplean normalmente en la smtesis de amidas tales como, en particular compuestos peptfdicos, cefalosporinas, penicilinas, derivados de acidos nucleicos y azucares, que son conocidos por personas expertas. Grupos protectores adecuados para grupos amino son, por ejemplo, carbamato de t-butilo, carbamato de bencilo o carbamato de 9-fluorenilmetilo.
Los grupos protectores pueden estar ya presentes en precursores y deben proteger a los grupos funcionales en cuestion frente a reacciones secundarias no deseadas tales como alquilaciones, acilaciones, eterificaciones, esterificaciones, oxidaciones, solvolisis y reacciones similares. Es una caractenstica de los grupos protectores que
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se prestan facilmente, es dedr, sin reacciones secundarias no deseadas, a la separacion, tfpicamente por solvolisis, reduccion, fotolisis o tambien por actividad enzimatica, por ejemplo bajo condiciones analogas a las condiciones fisiologicas, y que no estan presentes en los productos finales. El especialista conoce, o puede establecer facilmente, que grupos protectores son adecuados con las reacciones mencionadas anteriormente en esta memoria y de aqu en adelante.
La proteccion de grupos funcionales de este tipo mediante tales grupos protectores, los propios grupos protectores, y sus reacciones de separacion se describen, por ejemplo, en libros de referencia estandares para la smtesis de peptidos y en libros especiales sobre grupos protectores tales como
J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y Nueva York 1973, en "Methoden der organischen Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben-Weyl, 4a edicion, Volumen 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, y en T. W. Greene, G. M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, Nueva York, 2006.
Enfermedad
Los compuestos de formula general I han demostrado detener la proliferacion celular e inducir la apoptosis.
La desregulacion de la proliferacion celular, o la falta de una muerte celular apropiada, tiene una amplia gama de implicaciones clmicas. Un cierto numero de enfermedades asociadas con una desregulacion de este tipo implican hiperproliferacion, inflamacion, remodelacion y reparacion de tejidos. Indicaciones familiares en esta categona incluyen canceres, restenosis, hiperplasia neointimal, angiogenesis, endometriosis, trastornos linfoproliferativos, patologfas relacionadas con el trasplante (rechazo del injerto), poliposis, perdida de la funcion neural en el caso de remodelacion de tejidos y similares.
El cancer se asocia con tasas de proliferacion celular y muerte celular anormales. Dado que la apoptosis es inhibida o retrasada en la mayona de los tipos de enfermedades proliferativas, neoplasicas, la induccion de la apoptosis es una opcion para el tratamiento del cancer, especialmente en tipos de cancer que muestran resistencia a la quimioterapia clasica, la radiacion y la inmunoterapia (Apoptosis and Cancer Chemotherapy, Hickman y Dive, comps., Blackwell Publishing, 1999). Tambien en enfermedades y patologfas autoinmunes y relacionadas con el trasplante se puede utilizar compuestos que inducen la apoptosis para restablecer los procesos de muerte celular normal y, por lo tanto, pueden erradicar los smtomas y podnan curar las enfermedades. Otras aplicaciones de compuestos que inducen la apoptosis pueden ser la restenosis, es decir, la acumulacion de celulas de la musculatura lisa vascular en las paredes de las arterias, y en infecciones persistentes provocadas por un fallo de erradicar celulas infectadas por bacterias y virus. Ademas, la apoptosis puede ser inducida o restablecida en celulas epiteliales, en celulas endoteliales, en las celulas de la musculatura y en otras que han perdido contacto con la matriz extracelular.
Un compuesto de acuerdo con la formula general I se puede usar para el tratamiento profilactico o especialmente terapeutico del cuerpo humano o animal, en particular para el tratamiento de una enfermedad neoplasica, enfermedad autoinmune, patologfa relacionada con el trasplante y/o enfermedad degenerativa. Ejemplos de tales enfermedades neoplasicas incluyen, pero no se limitan a neoplasias epiteliales, neoplasias de celulas escamosas, neoplasias de celulas basales, papilomas de celulas de transicion y carcinomas, adenomas y adenocarcinomas, neoplasias anexiales y fanera, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias qrnsticas, neoplasias mucinosas y serosas, neoplasias ducales, lobulares y medulares, neoplasias de celulas acinares, neoplasias epiteliales complejas, neoplasias gonadales especializadas, paragangliomas y tumores del glomus, nevus y melanomas, tumores de tejido blando y sarcomas, neoplasias fibromatosas, neoplasias mixomatosas, neoplasias lipomatosas, neoplasias miomatosas, neoplasias mixtas complejas y estromales, neoplasias fibroepiteliales, neoplasias tipo sinoviales, neoplasias mesoteliales, neoplasias de celulas germinales, neoplasias trofoblasticas, mesonefromas, tumores de los vasos sangumeos, tumores de los vasos linfaticos, neoplasias oseas y condromatosas, tumores de celulas gigantes, tumores oseos miscelaneos, tumores odontogenicos, gliomas, neoplasias neuroepiteliomatosas, meningiomas, tumores de la vaina nerviosa, tumores de celulas granulares y sarcomas de las partes blandas alveolares, linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, otras neoplasias linforreticulares, tumores de celulas plasmaticas, tumores de mastocitos, enfermedades inmunoproliferativas, leucemias, trastornos mieloproliferativos miscelaneos, trastornos linfoproliferativos y smdromes mielodisplasicos.
Los compuestos de formula I general o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen anteriormente se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunes. Ejemplos de tales enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a lupus eritematoso cutaneo sistemico, discoide o subagudo, artritis reumatoide, smdrome antifosfolfpido, CREST, esclerosis sistemica progresiva, enfermedad mixta del tejido
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conjuntivo (smdrome de Sharp), smdrome de Reiter, artritis juvenil, enfermedad de aglutinina fna, crioglobulinemia mixta esencial, fiebre reumatica, espondilitis anquilosante, poliartritis cronica, miastenia grave, esclerosis multiple, polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, smdrome de Guillan-Barre, dermatomiositis/polimiositis, anemia hemolttica autoinmune, purpura trompocitopenica, neutropenia, diabetes mellitus tipo I, tiroiditis (incluida la enfermedad de Hashimoto y de Grave), enfermedad de Addison, smdrome poliglandular, penfigo (vulgar, foliaceo, sebaceo y vegetante), penfigoide ampolloso y cicatricial, penfigoide gestacional, epidermolisis ampollosa adquirida, enfermedad de IgA lineal, liquen escleroso y atrofico, enfermedad de Duhring, psoriasis vulgar, guttata, psoriasis pustular generalizada y pustular localizada, vitiligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, todas las formas de glomerulonefritis, hemorragia pulmonar (smdrome de Goodpasture), nefropatfa por IgA, anemia perniciosa y gastritis autoinmune, enfermedades inflamatorias del intestino (incluyendo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), enfermedad de Behcet, enfermedad celiaca-bebedero, uveitis autoinmune, miocarditis autoinmune, orquitis granulomatosa, aspermatogenesis sin orquitis, fibrosis pulmonar idiopatica y secundaria, enfermedades inflamatorias con una posibilidad de patogenesis autoinmune tal como pioderma gangrenoso, liquen ruber, sarcoidosis (incluyendo Lofgren y de tipo cutanea/subcutanea), granuloma anular, reaccion inmunologica alergica tipo I y tipo IV, asma bronquial, polinosis, dermatitis atopica, de contacto y por el aire, vasculitis de grandes vasos (arteritis de celulas gigantes y de Takayasu), vasculitis de vasos de tamano mediano (poliarteritis nodosa, enfermedad de Kawasaki), vasculitis de vasos pequenos (granulomatosis de Wegener, smdrome de Churg Strauss, polangiitis microscopica, purpura de Henoch Schoenlein, vasculitis crioglobulinemica esencial, angiitis cutanea leucoclastica), smdromes de hipersensibilidad, necrolisis epidermica toxica (smdrome de Stevens-Johnson, eritema multiforme), enfermedades debidas a los efectos secundarios de los farmacos, todas las formas de efectos cutaneos, espedficos para organos y sistemicos debidos al tipo I-vu (clasificacion de Coombs) formas inmunologicas de reaccion, patologfas relacionadas con el trasplante tales como enfermedad de injerto aguda y cronica frente a huesped e injerto frente a huesped, que implican todos los organos (piel, corazon, rinon, medula osea, ojo, hngado, bazo, pulmon, musculo, sistema nervioso central y periferico, tejido conjuntivo, hueso, vasos sangumeos y linfaticos, sistema genito-urinario, ofdos, cartflago , sistema linfatico primario y secundario incluyendo medula osea, ganglios linfaticos, timo, tracto gastrointestinal, incluyendo oro-faringe, esofago, estomago, intestino delgado, colon y recto, incluidas partes de los organos anteriormente mencionados hasta la concentracion y subestructuras de celulas individuales, p. ej., celulas madre).
De manera particularmente preferible, la enfermedad es una enfermedad neoplasica o autoinmune. En una realizacion especialmente preferida, la enfermedad es cancer.
Ejemplos de canceres en terminos de los organos y partes del cuerpo afectadas incluyen, pero no se limitan al cancer de mama, cuello uterino, ovario, colon, recto, (incluyendo colon y recto es decir, cancer colorrectal), pulmon (incluyendo cancer de pulmon de celulas pequenas cancer, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas grandes y mesotelioma), hueso, sistema endocrino, glandula adrenal, timo, tngado, estomago, intestino (incluyendo el cancer gastrico), pancreas, medula osea, tumores malignos hematologicos, (tales como linfoma, leucemia, mieloma o tumores malignos linfoides), vejiga, tracto urinario, rinones, piel, tiroides, cerebro, cabeza, cuello, prostata y testmulos. Preferiblemente, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de hngado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas. De manera especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de colon y cancer de pulmon. De manera mas especialmente preferida, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer cervical, cancer gastrico, cancer de ovario, cancer pancreatico, cancer de colon y cancer de pulmon.
Muestras
La medicion de la concentracion de BUBR1 se puede realizar in vitro, en una muestra de tejido biologico derivada del sujeto. La muestra puede ser cualquier material biologico separado del cuerpo tal como, por ejemplo, tejido normal, tejido tumoral, lmeas celulares, sangre entera, suero, plasma, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido linfatico, celulas tumorales circulantes, lisado celular, lisado tisular, orina y aspirados. Preferiblemente, la muestra se deriva de tejido normal, tejido tumoral, lmeas celulares, celulas tumorales circulantes p sangre. Mas preferiblemente, la muestra se deriva de tejido tumoral o celulas tumorales circulantes. En una realizacion particularmente preferida, la muestra se deriva de tejido tumoral. Por ejemplo, la concentracion de BUBR1 se puede medir en una muestra de tejido tumoral reciente, congelada o fijada en formalina/embebida en parafina.
La muestra se pre-obtiene del sujeto antes de que la muestra sea sometida a las etapas del metodo que implican medir la concentracion del biomarcador. Los metodos para la separacion de la muestra son bien conocidos en la tecnica, y puede ser separada, por ejemplo, del sujeto por biopsia, por ejemplo, mediante biopsia por puncion,
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biopsia de nucleo o biopsia con aguja fina de aspiracion, biopsia endoscopica o biopsia superficial. Una muestra de sangre puede ser recogida por puncion venosa y puede ser procesada adicionalmente de acuerdo con tecnicas estandares. Las celulas tumorales circulantes tambien pueden obtenerse a partir de sangre sobre la base de, por ejemplo, el tamano (p. ej., ISET - Aislamiento por Tamano de las Celulas Tumorales del Epitelio) o el enriquecimiento celular inmunomagnetico (p. ej., Cellsearch®, Veridex, Raritan, NJ)
Comparacion de la muestra
El sujeto puede ser humano o animal. Preferiblemente, el sujeto es humano.
El biomarcador BUBR1 se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo humano o animal, tomada preferentemente del cuerpo humano. La muestra o muestras se pre-obtienen del cuerpo humano o animal, preferiblemente se pre-obtienen del cuerpo humano antes de que la muestra se someta a las etapas del metodo que implica medir la concentracion del biomarcador.
Un biomarcador es, en general, una sustancia que se utiliza como un indicador de una respuesta biologica, preferiblemente como un indicador de la susceptibilidad a un tratamiento dado, que en la presente solicitud es el tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo.
En una realizacion particularmente preferida, concentraciones reducidas de BUBR1 en la muestra con respecto a un valor estandar o conjunto de valores estandar predice resistencia. Tal como se utiliza en esta memoria, una disminucion o concentraciones relativamente bajas o bajas o menores en relacion con una concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares significa la cantidad o concentracion del biomarcador en una muestra es detectablemente mayor en la muestra con relacion a la concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares. Esto abarca al menos una disminucion de, o una concentracion menor que, aproximadamente 1% con relacion al estandar, preferiblemente una disminucion de aproximadamente 5% con relacion al estandar. Mas preferiblemente, es una disminucion de, o una concentracion menor que, al menos aproximadamente 10% con relacion al estandar. De manera mas particularmente preferida, es una disminucion de, o una concentracion menor que, al menos aproximadamente 20% con relacion al estandar. Por ejemplo, una disminucion de, o una concentracion menor que, puede incluir, pero no se limita a, al menos aproximadamente 1%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 50%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 100% con respecto a la norma. Por lo tanto, una disminucion incluye tambien la ausencia de BUBR1 detectable en la muestra.
Preferiblemente, concentraciones mas bajas de BUBR1 en una muestra o muestras
i) con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor; o
ii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento; o
iii) con relacion a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de celulas o tejidos normales;
son predictivas de resistencia.
La medicion de una concentracion de BUBR1 se lleva a cabo ex-vivo en una muestra pre-obtenida del sujeto. Ademas, preferiblemente la respuesta que ha de ser predicha es la resistencia.
Mas preferiblemente, concentraciones mas bajas de BUBR1 en una muestra o muestras
i) con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor; o
ii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento;
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son predictivas de resistencia.
De manera especialmente preferida, concentraciones mas bajas de BUBR1 en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor son predictivas de resistencia.
En una realizacion preferida, para el caso i) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de muestras de sujetos con el mismo histotipo de tumor que la muestra a la que se ha de comparar, el valor estandar o conjunto de valores estandares se establece a partir de muestras de una poblacion de sujetos con ese tipo de cancer. Las muestras de estos sujetos estandares pueden derivarse, por ejemplo, del tejido tumoral o de celulas tumorales circulantes, siempre que el origen de la muestra sea consistente entre el patron y la muestra a comparar.
En otra realizacion preferida, para el caso ii) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes del inicio del tratamiento, se mide preferentemente para predecir la resistencia adquirida. Las muestras se comparan con celulas o tejido del mismo origen biologico. La prediccion de la resistencia adquirida indicana entonces que el tratamiento con el compuesto debena ser interrumpido. El biomarcador es asf utilizado para controlar si es probable que el tratamiento adicional con el compuesto de la respuesta requerida (p. ej., reduccion de celulas anormales), o si las celulas se han convertido en no sensibles o resistentes a dicho tratamiento.
En aun otra realizacion preferida, para el caso iii) en el que la medicion se compara en una muestra o muestras con respecto a un valor estandar o conjunto de valores estandares a partir de celulas normales, tejido o fluido corporal, el valor estandar o un conjunto de valores estandares puede ser establecido a partir de una muestra de celulas normales (p. ej., no tumorales) o tejido o fluido corporal. Tales datos pueden ser recogidos de una poblacion de sujetos con el fin de desarrollar el valor estandar o conjunto de valores estandares.
El valor estandar o conjunto de valores estandares se establece ex-vivo de las muestras pre-obtenidas, que puede ser de lmeas celulares o, preferiblemente, de material biologico de al menos un sujeto y mas preferiblemente de una media de sujetos (p. ej., n = 2 hasta 1000 o mas).
El valor estandar o conjunto de valores estandares puede entonces ser correlacionado con los datos de respuesta de las mismas lmeas celulares, o mismos sujetos, al tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. A partir de esta correlacion, se puede establecer un modulo de comparador, por ejemplo, en forma de una escala o sistema de puntuacion relativo, incluyendo opcionalmente los valores de corte o umbrales, que indique las concentraciones de biomarcador asociadas con un espectro de niveles de respuesta para el compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. El espectro de niveles de respuesta puede comprender la sensibilidad relativa con la actividad terapeutica del compuesto, (p. ej., alta sensibilidad a baja sensibilidad), asf como la resistencia a la actividad terapeutica. En una realizacion preferida, este modulo de comparador comprende un valor de corte o conjunto de valores que predice resistencia al tratamiento.
Por ejemplo, si se utiliza un metodo inmunohistoqmmico para medir la concentracion de BUBR1 en una muestra, los valores estandares pueden estar en forma de un sistema de puntuacion. Un sistema de este tipo podna tener en cuenta el porcentaje de celulas en las que esta presente la tincion para la BUBR1. El sistema tambien puede tener en cuenta la intensidad relativa de la tincion en las celulas individuales. Los valores estandares o el conjunto de valores estandares de la concentracion de BUBR1 pueden entonces correlacionarse con datos que indican la respuesta, especialmente la resistencia del sujeto o tejido o lmea celular a la actividad terapeutica de un compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. Tales datos pueden entonces formar parte de un modulo de comparador.
La respuesta es la reaccion de las lmeas celulares o, preferiblemente, del sujeto, o mas preferiblemente de la enfermedad en un sujeto, a la actividad, preferiblemente la actividad terapeutica de un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. El espectro de niveles de respuesta puede comprender la sensibilidad con respecto a la actividad, preferiblemente la actividad terapeutica del compuesto (p. ej., alta sensibilidad a baja sensibilidad), asf como la resistencia a la actividad, preferiblemente la actividad terapeutica. Los datos de respuesta pueden ser monitoreados, por ejemplo, en terminos de: tasas de respuesta objetiva, tiempo hasta la progresion de la enfermedad, progresion de la supervivencia libre y la supervivencia global.
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La respuesta de una enfermedad cancerosa se puede evaluar utilizando criterios bien conocidos por una persona en el campo del tratamiento del cancer, por ejemplo, pero no restringido a,
directrices de criterios de evaluacion de respuesta en tumores solidos (RECIST), Fuente: Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, Dancey J, Arbuck S, Gwyther S, Mooney M, Rubinstein L, Shankar L, Dodd L, Kaplan R, Lacombe D, Verweij J. New response evaluation criteria in solid tumours: directriz RECIST revisada (version 1.1). Eur J Cancer.2009; 45:228-47;
RANO Criteria for High-Grade Gliomas, Fuente: Wen PY, Macdonald DR, Reardon DA, Cloughesy TF, Sorensen AG, Galanis E, Degroot J, Wick W, Gilbert MR, Lassman AB, Tsien C, Mikkelsen T, Wong ET, Chamberlain MC, Stupp R, Lamborn KR, Vogelbaum MA, van den Bent MJ, Chang SM. Updated response assessment criteria for high-grade gliomas: response assessment in neuro-oncology working group. J Clin Oncol. 2010;28(11):1963-72;
CA-125 Rustin Criteria for Ovarian Cancer Response, Fuente: Rustin GJ, Quinn M, Thigpen T, du Bois A, Pujade- Lauraine E, Jakobsen A, Eisenhauer E, Sagae S, Greven K, Vergote I, Cervantes A, Vermorken J. Re: New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors (ovarian cancer). J Natl Cancer Inst. 2004; 96(6):487-8;
y
PSA Working Group 2 Criteria for Prostate Cancer Response, Source: Scher HI, Halabi S, Tannock I, Morris M, Sternberg CN, Carducci MA, Eisenberger MA, Higano C, Bubley GJ, Dreicer R, Petrylak D, Kantoff P, Basch E, Kelly WK, Figg WD, Small EJ, Beer TM, Wilding G, Martin A, Hussain M; Prostate Cancer Clinical Trials Working Group. Design and end points of clinical trials for patients with progressive prostate cancer and castrate levels of testosterone: recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group. J Clin Oncol. 2008;26(7):1148- 59.
La resistencia se asocia con que no existe una reduccion observable y/o medible en, o en ausencia de uno o mas de los siguientes: reduccion en el numero de celulas anormales, preferiblemente celulas cancerosas; o ausencia de las celulas anormales, preferiblemente celulas cancerosas; para enfermedades cancerosas: reduccion en el tamano del tumor; inhibicion (es decir, reducido a cierto grado y preferiblemente detenido) de un crecimiento ulterior del tumor; reduccion en las concentraciones de los marcadores tumorales tales como PSA y CA-125, inhibicion (es decir, se redujo hasta cierto punto y preferiblemente se detuvo) de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos (incluyendo la extension del cancer en el tejido blando y los huesos); inhibicion (es decir, se redujo hasta cierto punto y preferiblemente se detuvo) de la metastasis tumoral; alivio de uno o mas de los smtomas asociados con el cancer espedfico; y morbilidad y mortalidad reducidas.
En una realizacion preferida, resistencia significa que no hay reduccion observable y/o medible en, o ausencia de, uno o mas de los siguientes criterios: reduccion del tamano del tumor; inhibicion del crecimiento ulterior del tumor, inhibicion de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos; e inhibicion de la metastasis tumoral.
En una realizacion mas preferida, resistencia se refiere a uno o mas de los siguientes criterios: ninguna reduccion en el tamano del tumor; ninguna inhibicion del crecimiento ulterior del tumor, ninguna inhibicion de la infiltracion de celulas cancerosas en otros organos; y ninguna inhibicion de la metastasis tumoral.
La medicion de los criterios de resistencia anteriormente mencionados es de acuerdo con las directrices clmicas bien conocidas por una persona en el campo del tratamiento del cancer tales como las enumeradas anteriormente para la medicion de la respuesta de una enfermedad cancerosa.
La respuesta tambien puede ser establecida mediante la evaluacion in vitro de la proliferacion celular y/o la muerte
celular. Por ejemplo, los efectos sobre la muerte o la proliferacion celular pueden ser evaluados in vitro por uno o mas de los siguientes ensayos bien establecidos: A) tincion nuclear con colorante Hoechst 33342 que proporciona informacion sobre la morfologfa nuclear y la fragmentacion de ADN que son distintivos de la apoptosis. B) Ensayo de union a anexina V que refleja el contenido de fosfatidilserina de la bicapa lipidica externa de la membrana plasmatica. Este evento se considera un distintivo temprano de la apoptosis. C) Ensayo TUNEL (ensayo de marcaje de extremo de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal), un metodo de fluorescencia para evaluar las celulas sometidas a apoptosis o necrosis mediante la medicion de la fragmentacion del ADN marcando el extremo terminal de acidos nucleicos. D) ensayo de proliferacion MTS que mide la actividad metabolica de las
celulas. Las celulas viables son metabolicamente activas, mientras que las celulas con una cadena respiratoria comprometida muestran una actividad reducida en esta prueba. E) ensayo de tincion con cristal violeta, en donde los
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efectos sobre el numero de celulas se controlan mediante la tincion directa de los componentes celulares. F) ensayo de proliferacion que monitorea la smtesis de ADN a traves de la incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU). Pueden determinarse directamente efectos inhibitorios sobre el crecimiento/la proliferacion. G) Ensayo YO-PRO que implica un colorante de acidos nucleicos de cianina monomerica, fluorescente e impermeable a la membrana, que permite el analisis de la muerte (p. ej., apoptosis) de las celulas sin interferir en la viabilidad celular. Tambien se pueden analizar efectos globales sobre el numero de celulas despues de la permeabilizacion celular. H) Tincion con yoduro de propidio para la distribucion del ciclo celular que muestra alteraciones en la distribucion entre las diferentes fases del ciclo celular. Se pueden determinar puntos que detienen el ciclo celular. I) Ensayos de crecimiento independiente del anclaje tales como ensayos del brote de colonias que evaluan la capacidad de las suspensiones de celulas individuales para crecer en colonias en agar blando.
En una realizacion preferida en relacion con la determinacion de la resistencia in vitro, resistencia significa que no hay disminucion en la tasa de proliferacion de celulas anormales y/o reduccion en el numero de celulas anormales. Mas preferiblemente, resistencia significa que no hay disminucion de la tasa de proliferacion de celulas cancerosas y/o ninguna reduccion en el numero de celulas cancerosas. La reduccion en el numero de celulas anormales, preferiblemente cancerosas, se puede producir a traves de una diversidad de mecanismos de muerte celular programados y no programados. La apoptosis, la muerte celular programada independiente de caspasas y la muerte celular autofagica son ejemplos de la muerte celular programada. Sin embargo los criterios de muerte celular implicados en formas de realizacion de la invencion no se han de tomar como limitados a ningun mecanismo de la muerte celular.
BUBR1
Tal como se describe arriba, el termino BUBR1 se utiliza para abarcar todos los sinonimos previamente mencionados y se refiere a esta entidad, tanto a las concentraciones de acido nucleico como de protemas, segun sea apropiado. Concentraciones de acidos nucleicos se refieren, por ejemplo, a ARNm, ADNc o ADN, y el termino protema incluye la secuencia de polipeptidos o protemas traducida y las formas modificadas post-traduccion de las mismas.
Un ejemplo preferido de la secuencia de protemas de BUBR1 (BUBR1 humana) aparece en la SEQ. ID NO. 1, Figura 18. Sin embargo, el termino BUBR1 tambien abarca homologos, formas mutantes, variantes alelicas, variantes de corte y empalme, isotipos y equivalentes de esta secuencia. Preferiblemente, tambien abarca homologos humanos, formas mutantes, variantes alelicas, isotipos, variantes de corte y empalme y equivalentes de esta secuencia. Mas preferiblemente abarca secuencias que tienen al menos aproximadamente 75% de identidad, en especial preferiblemente al menos una identidad de aproximadamente 85%, con particular preferencia al menos aproximadamente 95% de identidad, y de manera mas particularmente preferida de aproximadamente 99% de identidad, con dicha secuencia.
En una realizacion especialmente preferida, BUBR1 es la entidad en los niveles de acido nucleico o protemas, que se representa en la concentracion de protemas por la SEQ ID NO. 1 o secuencias que tienen una identidad de al menos el 95% con esta secuencia, preferentemente una identidad de al menos 99%. En una realizacion particularmente preferida, BUBR1 esta representada por SEQ. ID NO.1.
Un ejemplo preferido de la secuencia de acidos nucleicos de BUBR1 (BUBR1 humana) es accesible a traves de la Secuencia de Referencia NM_001211 de NCBI, y aparece en SEQ. ID NO 2 (NM_001211.5), Figura 19. El termino BUBR1 tambien abarca modificaciones, variantes mas degeneradas de dicha secuencia, complementos de dicha secuencia y oligonucleotidos que se hibridan a una de dichas secuencias. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a mutaciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o mas nucleotidos. Mas preferiblemente, abarca secuencias que tienen al menos aproximadamente 75% de identidad con dicha secuencia, de manera especialmente preferida al menos una identidad de aproximadamente 85%, de manera particularmente preferible al menos una identidad de aproximadamente 95% y de manera mas particularmente preferida una identidad de aproximadamente 99%.
En aun otra realizacion preferida, BUBR1 es la entidad en los niveles de acido nucleicos o protemas, que esta representado en la concentracion de acido nucleico por SEQ ID NO. 2 o secuencias que tienen una identidad de al menos el 95% con esta secuencia, preferentemente una identidad de al menos 99%. En una realizacion particularmente preferida, BUBR1 esta representado por SEQ. ID. NO. 2.
Concentracion de BUBR1
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La concentracion de BUBR1 puede someterse a ensayo en la muestra mediante tecnicas de analisis de protemas bien conocidas para una persona experta. Puede someterse a ensayo al nivel de la transcripcion o la traduccion.
En una realizacion preferida, se mide el nivel de acidos nucleicos de BUBR1, preferiblemente ARNm de BUBR1 en una muestra. Ejemplos de metodos del analisis de la expresion genica, conocidos en la tecnica, que son adecuados para medir la concentracion de BUBR1 al nivel de acido nucleico incluyen, pero no se limitan a i) utilizar una sonda marcada que es capaz de hibridarse a ARNm; ii) utilizar PCR que implica uno o mas cebadores basados en la secuencia genica de BUBR1, por ejemplo utilizando metodos cuantitativos de PCR con sondas marcadas, p. ej., sondas fluorogenicas tal como PCR cuantitativa en tiempo real; iii) micro-matrices; IV) transferencia northern; V) analisis en serie de la expresion genica (SAGE), READS (amplificacion de enzimas de restriccion de ADNcs digeridos), muestra diferencial y medicion de microARN.
En una realizacion preferida, se mide la concentracion de BUBR1 al nivel de protemas. Ejemplos de metodos del analisis de la expresion de protemas conocidos en la tecnica que son adecuados para medir la concentracion de BUBR1 al nivel de protemas incluyen, pero no se limitan a i) analisis de inmunohistoqmmica (IHC), ii) transferencia western iii) inmunoprecipitacion, iv) ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELlSA) v) radioinmunoensayo, vi) clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) vii) espectrometna de masas, incluyendo desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz (MALDI, p. ej., MALDI-TOF) y desorcion/ionizacion potenciada por laser de superficie (SELDI, p. ej., SELDI-TOF).
Los anticuerpos implicados en algunos de los metodos anteriores pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de anticuerpos y/o diversos tipos de anticuerpos sinteticos, incluidos anticuerpos quimericos. El anticuerpo puede estar marcado para permitir que sea detectado o sea susceptible de deteccion tras la reaccion con una o mas especies adicionales, por ejemplo, utilizando un anticuerpo secundario que esta marcado o es capaz de producir un resultado detectable. Anticuerpos espedficos para BUBR1 estan disponibles comercialmente de BD Transduction Laboratories y Cell Signaling Technology, Inc., o se pueden preparar a traves de metodos convencionales de generacion de anticuerpos, bien conocidos para una persona experta.
Metodos preferidos de analisis de protemas son ELISA, tecnicas de espectrometna de masas, inmunohistoqmmica y transferencia western, mas preferiblemente transferencia western e inmunohistoqmmica. En la transferencia western, tambien conocida como inmunotransferencia, se pueden utilizar anticuerpos marcados para evaluar las concentraciones de protema, en donde la intensidad de la senal procedente del marcador detectable corresponde a la cantidad de protema, y se puede cuantificar, por ejemplo, mediante densitometna.
La inmunohistoqmmica utiliza de nuevo anticuerpos marcados para detectar la presencia y cantidad relativa del biomarcador. Se puede utilizar para evaluar el porcentaje de celulas para las cuales el biomarcador esta presente. Tambien se puede utilizar para evaluar la localizacion o la cantidad relativa del biomarcador en celulas individuales, esto ultimo se ve como una funcion de la intensidad de tincion.
ELISA significa ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas, ya que utiliza una enzima enlazada a un anticuerpo o antfgeno para la deteccion de una protema espedfica. El ELISA se realiza tfpicamente como sigue (aunque existen otras variaciones en la metodologfa): un sustrato solido tal como una placa de 96 pocillos se recubre con un anticuerpo primario, que reconoce el biomarcador. El biomarcador unido es reconocido a continuacion por un anticuerpo secundario espedfico para el biomarcador. Esto puede estar unido directamente a una enzima o se puede utilizar un tercer anticuerpo anti-inmunoglobulina que se une a una enzima. Se anade un sustrato y la enzima cataliza una reaccion, produciendo un color espedfico. Mediante la medicion de la densidad optica de este color, se puede determinar la presencia y cantidad del biomarcador.
Usos de biomarcador
En una realizacion preferida, el biomarcador se utiliza para predecir la resistencia inherente de la enfermedad en un sujeto al compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.
En otra realizacion preferida, el biomarcador se utiliza para predecir la resistencia adquirida de la enfermedad en un sujeto al compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.
El biomarcador puede ser utilizado para seleccionar sujetos que padecen o estan predispuestos a padecer una enfermedad, preferiblemente cancer, para el tratamiento con un compuesto de formula general I o un derivado
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farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente. Las concentraciones de un biomarcador de este tipo se pueden utilizar para identificar a los sujetos susceptibles a responder o a no responder o a continuar respondiendo o a no continuar respondiendo al tratamiento con dichos agentes. La estratificacion de los sujetos se puede hacer con el fin de evitar regfmenes de tratamiento innecesarios. En particular, el biomarcador se puede utilizar para identificar a sujetos de los que una muestra o muestras no exhiben una menor concentracion de BUBR1, con relacion a una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares, despues de lo cual esos sujetos pueden entonces ser seleccionados para el tratamiento con el compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente.
El biomarcador tambien se puede utilizar para ayudar en la determinacion de los regfmenes de tratamiento, en relacion con cantidades y programas de dosificacion. Adicionalmente, el biomarcador puede ser utilizado para ayudar en la seleccion de una combinacion de farmacos a ser administrados a un sujeto, incluyendo un compuesto o compuestos de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable de los mismos, y otro agente o agentes quimioterapeuticos (citotoxicos). Ademas, el biomarcador puede ser utilizado para ayudar en la determinacion de estrategias de terapia en un sujeto, incluyendo si un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo se ha de administrar en combinacion con una terapia dirigida, terapia endocrina, radioterapia, inmunoterapia o intervencion quirurgica, o una combinacion de estos.
BUBR1 tambien se puede utilizar en combinacion con otros biomarcadores para predecir la respuesta a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo y para determinar los regfmenes de tratamiento. Ademas, se puede utilizar en combinacion con pruebas de quimio-sensibilidad para predecir la resistencia y para determinar los regfmenes de tratamiento. Pruebas de quimio-sensibilidad consisten en aplicar directamente un compuesto de formula general I de celulas tomadas del sujeto, por ejemplo, de un sujeto con tumores malignos hematologicos o tumores solidos accesibles, por ejemplo, canceres de mama, de cabeza y cuello o melanomas, para determinar la respuesta de las celulas al compuesto.
Metodo de tratamiento
En un metodo de tratamiento y en BUBR1 para uso en un metodo de tratamiento, la concentracion de BUBR1 se establece primero en relacion con una concentracion estandar o conjunto de concentraciones estandares o concentraciones de inicio de pre-tratamiento y luego se administra un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, si la concentracion de BUBR1 en dicha muestra no es menor que un valor estandar o un conjunto de valores estandares o no ha disminuido en relacion con las concentraciones de inicio del pre-tratamiento, respectivamente. El compuesto de formula I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede administrarse en una composicion farmaceutica, como es bien conocido por una persona experta en la tecnica. Composiciones y dosificaciones adecuadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2004/103994 A1, paginas 35-39. Las composiciones para administracion enteral, tal como administracion nasal, bucal, rectal o, especialmente, oral, y para la administracion parenteral tal como administracion intravenosa, intramuscular o subcutanea a seres humanos, son especialmente preferidas. Mas particularmente, se prefieren las composiciones para administracion intravenosa.
Las composiciones comprenden el ingrediente activo y un soporte farmaceuticamente aceptable. Un ejemplo de una composicion incluye, pero no se limita a lo siguientes: 5000 capsulas de gelatina blanda, comprendiendo cada una como ingrediente activo 0.05 g de uno de los compuestos de formula general (I), se preparan como sigue: 250 g de ingrediente activo pulverizado se suspenden en 2 litros de Lauroglykol® (laurato de propilenglicol, Gattefosse S.A., Saint Priest, Francia) y se muelen en un pulverizador humedo para producir un tamano de partfcula de aproximadamente 1 a 3 pm. Porciones de 0,419 g de la mezcla se introducen luego en capsulas de gelatina blanda utilizando una maquina de llenado de capsulas.
En esta memoria tambien se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune, preferiblemente cancer, disminuyendo primero la concentracion de BUBR1 en un sujeto que tiene una muestra con una menor concentracion de BUBR1 en comparacion con una concentracion estandar o un conjunto de concentraciones estandares o concentraciones de inicio del pre-tratamiento, a continuacion, tratando al sujeto con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable tal como se define anteriormente. La concentracion de BUBR1 puede ser incrementada por medios qmmicos o geneticos directos o indirectos. Ejemplos de tales metodos son el tratamiento con un farmaco que resulta en una expresion incrementada de BUBR1, la administracion dirigida de construcciones virales, de plasmidos o de peptidos, o anticuerpo o ARNip o anti-sentido para regular al alza la concentracion de BUBR1. Por ejemplo, construcciones virales o de plasmidos se pueden utilizar para incrementar la expresion de BUBR1 en la celula El sujeto puede entonces ser tratado con un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo.
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Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede administrarse solo o en combinacion con uno o mas de otros agentes terapeuticos. Una terapia de combinacion posible puede adoptar la forma de combinaciones fijas, o la administracion de un compuesto de la invencion y uno o mas de otros agentes terapeuticos que se administran escalonada o independientemente uno de otro, o la administracion combinada de combinaciones fijas y uno o mas de otros agentes terapeuticos.
Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo puede, aparte de o ademas de, ser administrado especialmente para la terapia de tumores en combinacion con quimioterapia (terapia citotoxica), terapia dirigida, terapia endocrina, radioterapia, inmunoterapia, intervencion quirurgica, o una combinacion de estos. La terapia a largo plazo es igualmente posible como lo es la terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, tal como se describio anteriormente. Otros tratamientos posibles son terapia para mantener el estado del paciente despues de la regresion del tumor, o incluso terapia quimio-preventiva, por ejemplo, en pacientes en riesgo.
Kit
En un aspecto, la invencion se refiere a un kit para predecir la respuesta, preferiblemente de una enfermedad en un sujeto, a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define anteriormente, que comprende los reactivos necesarios para medir la concentracion de BUBR1 en una muestra. Preferiblemente, los reactivos comprenden un reactivo de captura que comprende un detector para BUBR1 y un reactivo detector.
El kit tambien comprende un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares con los que se compara la concentracion de BUBR1 en la muestra. En una realizacion preferida, el modulo de comparador esta incluido en las instrucciones de uso del kit. En otra realizacion preferida, el modulo de comparador esta en forma de un dispositivo de visualizacion, por ejemplo una tira de color o de material numericamente codificado que esta disenado para ser colocado junto a la lectura de la medicion de la muestra para indicar los niveles de resistencia. El valor estandar o un conjunto de valores estandares se puede determinar tal como se describe anteriormente.
Los reactivos son preferiblemente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen selectivamente a BUBR1. Estos pueden estar, por ejemplo, en forma de un anticuerpo primario espedfico que se une a BUBR1 y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario, y que es en sf mismo marcado para la deteccion. El anticuerpo primario tambien puede marcarse para la deteccion directa. Los kits pueden contener tambien, opcionalmente, una disolucion o disoluciones de lavado que permiten selectivamente la retencion del biomarcador unido al reactivo de captura en comparacion con otros biomarcadores despues del lavado. Tales kits se pueden utilizar en ELISA, transferencia western, citometna de flujo, inmunohistoqmmica u otros metodos inmunoqmmicos para detectar la concentracion del biomarcador.
En otra realizacion preferida, los reactivos tambien pueden ser los que son capaces de medir el nivel de acidos nucleicos de BUBR1 en una muestra. Muestras adecuadas son muestras de tejidos o de tejidos tumorales, secciones de muestras de tejidos o de tejidos tumorales embebidas en parafina o congeladas, celulas tumorales circulantes y muestras de sangre y derivadas de fluidos corporales. Preferiblemente, los reactivos comprenden una sonda o cebadores marcados para la hibridacion al acido nucleico de BUBR1 en la muestra. Sistemas de deteccion adecuados, ya sea basadas en tecnicas de amplificacion por PCR o deteccion de sondas marcadas, permiten la cuantificacion de acido nucleico de BUBR1 en la muestra. Esto se puede hacer i) in-situ en la propia muestra, preferiblemente en secciones de muestras embebidas en parafina o congeladas, ii) en extractos de muestras de tumores, tejidos o derivadas de la sangre, en donde los reactivos adecuados enriquecen selectivamente los acidos nucleicos. Los kits permiten la medicion y cuantificacion de i) la cantidad de sondas marcadas hibridadas a las muestras in situ o ii) la cantidad de amplificacion basada en cebadores por metodos basados en propiedades ffsico- qmmicas espedficas de las propias sondas o los informadores fijados a los cebadores.
El kit de acuerdo con la invencion se puede utilizar en el metodo de tratamiento tal como se define anteriormente. Comprende un compuesto de la siguiente formula o una sal farmaceuticamente aceptable
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En una realizacion particularmente preferida del kit la sal es una sal dihidrocloruro. En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit de este tipo tal como se describio anteriormente.
En la presente memoria descriptiva las palabras "comprenden" o "comprende" o "que comprende" han de entenderse como que implican la inclusion de un elemento indicado o grupo de elementos, pero no la exclusion de cualquier otro elemento o grupo de elementos.
Metodologia experimental
Tincion inmunofluorescente de celulas cultivadas
Celulas de cancer de pulmon de celulas no pequenas humanas A549 (NSCLC, numero de referencia ATCC CCL- 185), celulas de cancer cervical HeLa (numero de referencia ATCC CCL-2) y celulas de carcinoma de mama SKBR3 (ATCC numero de referencia HTB-30) se sembraron a densidades de 50% en cubreobjetos de microscopio redondos y se cultivaron durante 24 horas en RPMI-1640 que contiene FCS al 10% (al que tambien se alude como FBS) a 37°C, 5% de CO2. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO. El medio de cultivo celular se remplazo por medio que contiene el o los compuestos diluidos (paclitaxel, vinblastina, colchicina y nocodazol se adquirieron de Sigma-Aldrich) o vetuculo. Despues del tratamiento, los cubreobjetos se lavaron y las celulas se fijaron en metanol/acetona (1:1) durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron en tampon de bloqueo (BSA al 0,5% y TX -100 al 0,1% en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron incubadas luego con anti-tubulina alfa (Sigma, 1:2000) durante 1 hora a temperatura ambiente en tampon de bloqueo. Despues de varias etapas de lavado, las celulas se incubaron con IgG anti-raton de cabra AlexaFluor-488 (Molecular Probes, 1:3000) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de varias etapas de lavado con tampon de bloqueo. Las muestras fueron montadas despues con el agente anti-decoloracion ProLong Gold (Molecular Probes), sellado con esmalte de unas y examinado con un microscopio Leica de inmunofluorescencia. Las imagenes fueron capturadas con una camara CCD enfriada y procesadas por el software ImageJ.
Transfeccion de ARNip
Con el fin de mostrar que BUBR1 es un biomarcador de resistencia, se realizaron experimentos de ARNip. Para los experimentos de ARNip para evaluar los efectos sobre el fenotipo de las celulas tumorales y los numeros (Figura 8), celulas de cancer cervical HeLa (ATCC referencia CCL-2) se cultivaron a 37°C y 5% de CO2 en DMEM con FCS al 10% (Invitrogen). 1000 celulas HeLa por pocillo fueron sembradas en placas de multi-titulacion negras de 384 pocillos (BD Falcon). Las celulas fueron transfectadas inversamente con ARNip control no fijador de objetivo 20 nM (agrupacion no fijadora de objetivo ON-Target-plus D001810, Dharmacon) o una mezcla de cuatro ARNip de BUBR1 (ON-Target-plus Smartpool L-004101, Dharmacon, vease la informacion de la secuencia mas adelante) utilizando reactivo de transfeccion Dharmafect1 (Dharmacon, Thermo). 48 horas despues de la siembra de celulas y de la transfeccion de ARNip, un par duplicado de clones de ARNip fue tratado con BAL27862 (50 nM, DMSO al 0,1%) y otro par duplicado con disolucion control (DMSO al 0,1%) durante 24 horas. El experimento se termino mediante la fijacion basada en metanol (-20°C, 5 min) y posterior inmunotincion (1 hora, temperatura ambiente) utilizando
anticuerpos de alfa-tubulina (marcados con FITC, 1:500, F2168, Sigma) y actina (TRITC-faloidina, 1:3000, P1951, Sigma), as^ como tincion con ADN de Hoe33342 (1:8000, Sigma). Basado en la inmunotincion, se analizo la morfolog^a de las celulas tratadas utilizando un enfoque multiparametrico (microscopio de fluorescencia BD Pathway 855; objetivo 20x) con el software apropiado. El numero de celulas por pocillo tambien se calculo basandose en la 5 tincion de los nucleos con Hoe33342. Esto permitio el calculo de la fraccion de celulas que muestran un fenotipo sin tratar (normal) (en %).
Para los experimentos de ARNip para evaluar los efectos sobre los niveles de expresion de BUBR1 mediante inmunotransferencia y efectos sobre la proliferacion de celulas tumorales y la viabilidad utilizando el ensayo de YO- PRO (Figuras 7, 9, l0 y 11), y el Ensayo de Cristal Violeta (Figuras 12 y 13), las celulas se sembraron en placas de 10 6 pocillos a una densidad apropiada: HeLa (celulas de cancer cervical; ATCC referencia CCL-2) 2.5E + 04 (para YO-
pRo) o 4,0E+04 (para Cristal Violeta) celulas por pocillo, H460 (celulas NSCLC; ATCC referencia HtB-177)
5,0E+04 celulas por pocillo, MCF-7 (celulas de carcinoma de mama; ATCC referencia HTB-22) 2,4E+05 celulas por pocillo, Panc1 (celulas de cancer pancreatico, ATCC referencia CRL-1469) y HCT116 (celulas de cancer de colon, ATCC referencia CCI-247) 8E+04 celulas por pocillo, y se cultivaron a 37°C y 5% de Co2en RPMI-1640 o DMEM 15 que contiene FCS al 10% (medio completo). Las celulas fueron transfectadas al dfa siguiente con una mezcla de cuatro ARNip de BUBR1 (ON-Target-plus Smartpool L-004101, Dharmacon, vease la informacion de la secuencia mas adelante), los cuatro ARNip individuales de BUBR1 (Conjunto ON-Target-plus de cuatro LU-004101 mejorados) o ARNip de control no fijadores de objetivo (agrupacion no fijadora de objetivo ON-Target-plus D001810, Dharmacon), utilizando Hiperfect (Qiagen) para H460, Panc1 y HCT116 o Lipofectamine2000 (Invitrogen) para HeLa 20 y MCF-7 segun las instrucciones del fabricante. La concentracion final de ARNip era 10 nM (H460) o 20-30 nM
(HeLa) o 20 nM (MCF-7, Panc1, HCT116). Las celulas se mantuvieron a 37°C y 5% de CO2durante 24 horas antes
de tratamiento con compuesto durante 48 horas, seguido de analisis YO-PRO, Ensayo de Cristal Violeta o extraccion para el ensayo de inmunotransferencia. Los ARNip ON-Target-plus son ARNip de doble cadena, modificados qmmicamente para mejorar la especificidad para la diana deseada.
25 Las secuencias de los cuatro ARNip de BUBR1 utilizados eran:
ARNip de BUBR1 ON-TARGETplus n° 1 SEQ ID. NO 3
5' GAUGGUGAAUUGUGGAAUA
ARNip de BUBR1 ON-TARGETplus n° 2 SEQ ID. NO 4
5' GAAACGGGCAUUUGAAUAU
30 ARNip de BUBR1 ON-TARGETplus n° 3 SEQ ID. NO 5
5' GCAAUGAGCCUUUGGAUAU
ARNip de BUBR1 ON-TARGETplus n° 4 SEQ ID. NO 6
5' CAAUACAGCUUCACUGAUA
Ensayo YO-PRO de Celulas tratadas con ARNip
35 BAL27862, disuelto en DMSO, se diluyo en medio completo antes de la adicion a las celulas a las concentraciones
indicadas (concentracion final de DMSO 0,5%). Las celulas se incubaron durante 48 horas, seguido de analisis de YO-PRO.
Yoduro de YO-PRO®-1 es un colorante de acido nucleico, de cianina monomerica, fluorescente, impermeable de la membrana, que permite el analisis de celulas moribundas (p. ej., apoptoticas) sin interferir en la viabilidad celular.
40 12,5 pi de yoduro de YO-PRO®-1 (491/509) (lnvitrogen/Molecular Probes, n° Y-3603; 1 mM en DMSO) se anadieron
a 1 ml de tampon YO-PRO 5 veces concentrado (citrato de Na 100 mM, pH 4,0; NaCl 134 mM) para producir la YO- PRO Mix. Para la determinacion de la citotoxicidad/apoptosis, se anadieron 500 pi de YO-PRO Mix por pocillo en placas de 6 pocillos (dilucion 1:5), y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La
absorcion de colorante YO-PRO en celulas se evaluo mediante el uso de un lector de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices) utilizando excitacion a 485 nm y emision a 538 nm en un punto de corte de 530 nm. Para la determinacion de los efectos globales sobre el crecimiento celular/numero total de celulas, 500 pi de tampon de lisis (EDTA 30 mM, EGTA 30 mM; NP-40 al 0,6%, en 0,33 veces de tampon YO-PRO) se anadieron por pocillo y se 5 incubo durante 30 min a la temperatura ambiente en la oscuridad. La lectura fluorescente se realizo en un lector de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices) utilizando a 485 nm y emision a 538 nm en un punto de corte de 530 nm. El % de celulas muertas se calculo como un porcentaje del numero total de celulas restante.
Ensayo de Cristal Violeta de Celulas tratadas con ARNip
Celulas se incubaron durante 48 horas con DMSO o BAL27862 diluidas en medio completo (concentracion final de 10 DMSO 0,5%). Despues de separar medio, las celulas se fijaron y tineron mediante la adicion de 1 ml de Tincion de Cristal Violeta (0,2% de Cristal Violeta en Metanol al 50%) por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. Posteriormente, el colorante se decanto y las placas se lavaron 4 veces con agua bidestilada. Las placas se secaron al aire durante varias horas. El colorante se disolvio mediante la adicion de 2 ml de tampon (Tris 0,1 M pH 7,5, SDS al 0,2%, Etanol al 20%) por pocillo y agitando las placas. La absorbancia a 590 nm se midio 15 utilizando un lector de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices). Con el fin de restar el numero de celulas de partida, se fijo una placa de control y se tino el mismo dfa que se anadio el compuesto. Los resultados finales se calcularon restando la absorbancia de celulas a partir de la del control (DMSO) o celulas tratadas con compuestos. Los valores inferiores a cero indican la muerte celular.
Ensayo del Brote de Colonias:
20 Se prepararon suspensiones de celulas individuales de xenoinjertos tumorales derivados de pacientes (mantenidos en ratones inmunodeficientes). Para los ensayos del brote de colonias, las celulas se extendieron en agar blando en placas de 24 pocillos de acuerdo con el ensayo introducido por Hamburger y Salmon (bioensayo primario de celulas madre tumorales humana, Science, 1977, 197: 461-463). 2,0e+04-6.0E+04 celulas en 0,2 mL de medio que contiene 0,4% de agar se extendieron sobre una capa inferior de 0,75% de agar. Los compuestos de ensayo se aplicaron en 25 0,2 mL de medio de cultivo. Cada una de las placas de 24 pocillos contema controles sin tratar y muestras por
triplicado. Los cultivos se incubaron a 37°C y 7,5% de CO2 durante 5 - 28 dfas. 24 horas antes del analisis, las colonias vitales se tineron con una disolucion de sal de tetrazolio metabolizable (Alley MC et al, Life Sci. 1982, 31:3071-3078) y se contaron con un sistema de analisis de imagenes automatico (Omnicon 3600, Biosys GmbH).
Los efectos de los farmacos relativos se expresaron por la relacion del numero medio de colonias en los pocillos 30 tratados y los pocillos control. Los valores CI70 fueron determinados mediante la representacion de las concentraciones de compuestos frente a los recuentos de colonias relativos.
PCR en Tiempo real Cuantitativa
Celulas HeLa de cancer cervical y H460 NSCLC (numero de referencia ATCC HTB-177) fueron cultivadas en placas de 10 cm hasta que alcanzaron un 80% de confluencia, seguido de tripsinizacion, granulacion y resuspension en 1 35 ml de reactivo Trizol (Invitrogen). El ARN total se aislo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR en tiempo real se realizo utilizando el kit de 1 paso RNA-to-Ct TaqMan (Applied Biosystems, numero de referencia 4392938) y ensayos de expresion de genes (Applied Biosystems) con 100 ng de ARN por reaccion utilizando el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI Prism 7000. Se utilizaron los siguientes ensayos de expresion de genes: Ensayo ID Hs01084828_m1 para la cuantificacion de BUBR1 o ensayo ID HS99999901_s1 para la cuantificacion de 40 ARN 18S. Todas las muestras se analizaron por triplicado. El analisis de los datos se realizo utilizando el software SDS (Applied Biosystems). Los niveles de expresion de BUBR1 se normalizaron a ARN 18S.
Generacion y Ensayo de Cristal Violeta de Lineas Celulares Resistentes a BAL27862
Sub-lmeas resistentes a BAL27862 de lineas de cancer de pulmon de celulas no pequenas humano (H460 referencia ATCC HTB-177; A549 referencia ATCC CCL-185), de cancer de ovario (SKOV3 referencia ATCC HTB- 45 77) fueron generadas mediante seleccion a largo plazo en medio de cultivo celular completa (RPMI-1640 que
contiene FCS al 10%; Sigma-Aldrich) mediante concentraciones crecientes de BAL27862. Dependiendo de la lmea celular, el proceso de seleccion se llevo a cabo durante 8-12 meses con el fin de lograr factores de resistencia (relacion de CI50 de la lmea celular resistente y la lmea celular de tipo salvaje correspondiente) entre 3 y 11,6. Las sub-lmeas resistentes se expandieron a la concentracion mas alta tolerada de BAL27862 y posteriormente se 50 congelaron y almacenaron en nitrogeno lfquido.
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Las celulas se sembraron en placas de 96 pociMos a las siguientes densidades: A549: 2000, H460: 1000, SKOV3: 2000 y, despues de 24 horas de incubacion, se incubaron durante 72 horas con DMSO, BAL27862, colchicina, nocodazol, paclitaxel o vinblastina diluidos en medio completo (concentracion final de DMSO max. 0,5%). Despues se retiro el medio, las celulas se fijaron y tineron mediante la adicion de 50 pl de Tincion de Cristal Violeta (0,2% de Cristal Violeta en metanol al 50%) por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la mancha se decanto y las placas se lavaron 4 veces con agua bidestilada. Las placas se secaron al aire durante varias horas. La mancha se disolvio mediante la adicion de 100 pl de tampon (Tris 0,1 M pH 7,5, SDS al 0,2%, etanol al 20%) por pocillo y agitando las placas. La absorbancia a 590 nm se midio utilizando un lector de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices). Valores CI50 anti-proliferativos se calcularon a partir de curvas de concentracion-respuesta utilizando el software GraphPad Prism. Los factores de resistencia se calcularon como una relacion de BAL27862 CI50 en la variante de la lmea resistente frente a la CI50 en la lmea parental.
Extraccion de Protemas
Extraccion de celulas tumorales: Las celulas se lavaron con PBS enfriado con hielo que contema fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y con tampon de lisis enfriado en hielo que contema HEPEs 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, p-glicerofosfato25 mM, NaF 25 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, pirofosfato 15 mM, ortovanadato de sodio 2 mM, molibdato de sodio 10 mM, leupeptina (10 pg/mL), aprotinina (10 pg/mL) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Las celulas se extrajeron en el mismo tampon que contema NP-40 al 1%. Despues de la homogeneizacion, los lisados se clarificaron por centrifugacion y se congelaron a -80°C.
Inmunotransferencia/Transferencia Western
La inmunotransferencia se realizo utilizando 20 pg de protema total por pista. La concentracion total de protema se determino con el ensayo de proteinas BCA (Pierce). La protema se separo en un gel de SDS al 10% y se transfirio a una membrana de PVDF utilizando la transferencia semi-seca (90 min, 50 mA/gel). Los anticuerpos primarios utilizados para la inmunotransferencia eran como sigue:
Ac. BUBR1 N° 1: BUBR1 cs (disponible de Cell Signaling Techmology, Inc, numero de referencia 4116) origen: conejo, policlonal, dilucion 1:1000, condiciones del tampon: 5% de leche en PBS/Tween al 0,1%
Ac. BUBR1 N° 2: BUBR1 bd (disponible de BD Transduction Laboratories, numero de referencia 612502) origen: conejo, monoclonal, dilucion 1:5000, condiciones del tampon: BSA al 3% en PBS/Tween al 0,1%
Alfa-tubulina: (disponible de Sigma, numero de referencia T5168) origen: raton, monoclonal, dilucion 1:10000, condiciones del tampon: leche al 5% en PBS/Tween al 0,1%
Actina: (disponible de Chemicon, numero de referencia MAB1501) origen: raton, monoclonal, dilucion 1:5000, condiciones del tampon: leche al 5% o BSA al 3% en PBS/Tween al 0,1%
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Los anticuerpos secundarios utilizados para la inmunotransferencia eran anti-conejo de cabra o anti-raton de cabra conjugados con peroxidasa (disponibles de Jackson ImmunoResearch Laboratories INC: numero de referencia 111035-144 JIR y 115-035-146 JIR), dilucion 1:5000, condiciones del tampon: 0,5% de leche en PBS/Tween al 0,1%. Las bandas marcadas fueron reveladas utilizando un sistema de formacion de imagenes de alto rendimiento Raytest Stella 3200.
Inmunohistoquimica
La fijacion de xenoinjertos de tumores derivados del paciente (mantenido en ratones inmunodeficientes) se realizo en formalina neutra tamponada al 10% que contema formaldehudo al 4% durante 20 - 28 horas a temperatura ambiente. Muestras fijadas se mantuvieron en una disolucion de etanol al 70% durante un maximo de una semana antes de la deshidratacion e inclusion en parafina de acuerdo con un procedimiento estandar, utilizando las condiciones enumeradas a continuacion:
- Tratamiento Secuencial
- tiempo (horas)
- EtOH al 70%
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- EtOH al 80%
- 2
- EtOH al 99%
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- Isopropanol al 100%
- 0,5
- Isopropanol al 100%
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- Xilol
- 0,5
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- Parafina
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- Parafina
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- Parafina
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Secciones de parafina de aproximadamente 2 pm se cortaron y se procesaron utilizando el aparato de inmunotincion automatizado Benchmark XT® (Roche) ejecutando las etapas de procesamiento estandares. La visualizacion de la tincion de anticuerpos espedficos se realizo con DAB (3,3-diaminobencidina) como sustrato cromogenico a una concentracion de 5 mg/ml. Para la tincion se utilizaron las siguientes condiciones de anticuerpos primarios y de procesamiento:
- Especificacion de anticuerpos
- Procesamiento
- Anti-BubR1, BD Transduction Lab, n° 612503, Amc de raton
- Acondicionamiento celular 1 tampon de Roche durante 30 minutos, incubacion de anticuerpos a 37°C durante 32 minutos, a una dilucion de 1:200
Ejemplos detallados
Ejemplo 1: Un Fenotipo Mitotico Distinto Inducido por compuestos de formula general I
El tratamiento con el compuesto A (BAL27862) o con el compuesto B o el compuesto C induda un fenotipo de microtubulos altamente reproducible y distinto en todas las lmeas celulares tumorales ensayadas (mostradas para el compuesto A en A549, celulas HeLa y SKBR3 en la Figura 1 y para el compuesto B y el compuesto C en celulas A549 en la Figura 2). En celulas en division, se produjo una fragmentacion aparente del huso mitotico, lo que resulta en la formacion de estructuras a modo de puntos (Figura 1). Se demostro que este fenotipo era distinto del observado con agentes convencionales que fijan como objetivo microtubulos tales como el estabilizador de microtubulos paclitaxel y los desestabilizadores de microtubulos vinblastina y colchicina (Figura 3) y nocodazol (Figura 4).
Ejemplo 2: BAL27862 Supera el Fenotipo de Microtubulos Inducido por Farmacos Convencionales que fijan como objetivo Microtubulos de una Manera Dominante
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Con el fin de mostrar la singularidad de su actividad sobre los microtubulos, BAL27862 fue sometido a ensayo en combinacion con vinblastina, colchicina y paclitaxel (Figura 5) y nocodazol (Figura 6) utilizando celulas A549. El tratamiento con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol por sf solo induda los fenotipos de los microtubulos mitoticos caractensticos de estos agentes. Sin embargo, el tratamiento de combinacion con BAL27862 durante las ultimas 4 horas dio lugar a la interrupcion de las estructuras de microtubulos; creando un fenotipo compatible con el tratamiento de BAL27862 solo, a pesar de la presencia continua de vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol. En contraposicion, el tratamiento primero con BAL27862 y posteriormente durante 4 horas en combinacion con vinblastina, colchicina, paclitaxel o nocodazol no tuvo impacto en el fenotipo de microtubulos observado que era consistente con el tratamiento con BAL27862.
Estos datos demuestran que los compuestos de formula I afectan a la biologfa de los microtubulos consistentemente, pero de una manera diferente que los agentes convencionales de fijacion como objetivo de microtubulos.
Ejemplos detallados de acuerdo con la invencion
Ejemplo 3: Regulacion a la Baja mediada por ARNip de la Expresion de BUBR1 Suprime la Expresion del Efecto Antiproliferativo y la Muerte de Celulas Tumorales Inducida por tratamiento con BAL27862
A traves del analisis de inmunotransferencia (utilizando tanto los Ac BUBR1 N° 1 y 2.) la regulacion a la baja de la expresion de BUBR1 utilizando una agrupacion de cuatro ARNip de BUBR1 ha demostrado ser muy eficaz en lmeas de celulas HeLa de tumor cervical como H460 de NSCLC (Figura 7).
Sorprendentemente, el analisis de los efectos de tratamiento de ARNip de BUBR1 agrupado en el numero de celulas HeLa y la fraccion de celulas HeLa con un fenotipo normal en presencia de BAL27862 indico que se requena BULBRl para efectos optimos (Figura 8). Un analisis mas detallado de los efectos de la expresion reducida de BUBR1 sobre la proliferacion de celulas HeLa y la viabilidad utilizando el ensayo YO-PRO, indico que, a pesar de la perdida de expresion de BUBR1, sf provoco una ligera reduccion en la tasa de proliferacion, el efecto antiproliferativo de BAL27862 se redujo drasticamente (Figura 9, panel superior). Ademas, no se observo un aumento en la muerte de celulas tumorales, en comparacion con un cierto numero de controles tratados con BAL27862 (Figura 9, panel inferior).
Este efecto ha demostrado no ser espedfico para la lmea celular o para el tipo de tumor, ya que se hizo la misma observacion despues de tratamiento de celulas H460 (Figura 10) y las celulas de cancer de mama MCF7 (Figura 11). Ademas, utilizando un metodo alternativo para analizar la proliferacion celular (ensayo de Cristal Violeta), los mismos efectos se observaron de nuevo en celulas HeLa, asf como de cancer pancreatico (Panc1) y de colon (HCT116) (Figura 12).
Con el fin de controlar la especificidad de la agrupacion de ARNip de BUBR1 utilizado para los experimentos presentados en las Figs. 7-12, tambien se evaluaron los ARNip individuales contenidos dentro de la agrupacion. El tratamiento con todos los ARNip individuales disminuyo el efecto de BAL27862 sobre la proliferacion celular (tal como se evaluo mediante el ensayo de Cristal Violeta) (Figura 13A). Es importante destacar que el grado de reduccion se correlacionaba con la eficiencia de la regulacion a la baja de la protema BUBR1 provocada por cada uno de los ARNip individuales (comparese la Figura 13A con 13B).
Ejemplo 4: Regulacion a la baja de la Expresion de BUBR1 se Observa en Lmeas Tumorales Seleccionadas para la Resistencia a BAL27862
La seleccion in vitro para la resistencia a BAL27862 resulto en la generacion de 3 lmeas celulares de tumor relativamente resistentes, con los siguientes factores de resistencia frente a las lmeas parentales (basado en las determinaciones de CI50 utilizando el ensayo de Cristal Violeta): A549 (3,0 veces); SKOV3 resistente 1 (7,6 veces); SKOV3 resistente 2 (11,6 veces); H460 (5,3 veces) (Tabla 1).
Tabla 1:
- Compuesto de tratamiento
- Factores de resistencia (relacion de CI50 de la variante de lmea celular resistente a BAL27862 y la CI50 de la lmea celular parental
- A549
- H460 SKOV3 resistente 1 SKOV3 resistente 2
- BAL27862
- 3,0 5,3 7,6 11,6
- Colchicina
- 0,9 1,6 2,0 2,8
- Nocodazol
- 1,6 1,3 3,6 3,9
- Vinblastina
- 2,3 4,6 15,7 17,8
- Paclitaxel
- 0,06 0,3 0,4 0,5
En general estas celulas resistentes a BAL27862 exhibieron un nivel diferente de respuesta a otros agentes desestabilizantes de microtubulos tales como colchicina, nocodazol y vinblastina, en comparacion con BAL27862; y, de hecho, se observo una sensibilidad incrementada al estabilizador de microtubulos paclitaxel en todas las lmeas 5 (Tabla 1).
La extraccion y el analisis de inmunotransferencia de estas lmeas (con Ac de BUBR1 N° 2, monoclonal de raton) indicaron una expresion reducida de la protema BUBR1 en comparacion con la lmea parental (Figura 14). Esto se mantuvo durante todo el desarrollo de resistencia en las celulas SKOV3 (Figura 15). Estos datos demuestran la asociacion de la reduccion de los niveles de expresion de BUBR1 con resistencia adquirida a BAL27862.
10 Ejemplo 5: Asociacion de bajos niveles de expresion de BUBR1 con celulas tumorales derivadas de pacientes resistentes al tratamiento con BAL27862.
Sobre la base de ensayos del brote de colonias, el uso de celulas tumorales derivadas de tumores derivados de pacientes mantenidos como xenoinjertos en ratones, las celulas tumorales sensibles o relativamente resistentes a BAL27862 se identificaron a partir de cancer gastrico y de pulmon (vease la Tabla 2). Concentraciones a las que se 15 observo una inhibicion del crecimiento del 70% frente a los controles (CI70) se muestran en la Tabla 2. En esta tabla, las celulas tumorales sensibles a BAL27862 tienen valores CI70 en el intervalo nanomolar bajo, mientras que las celulas tumorales resistentes a BAL27862 se definen por valores de CI70 > 600 nanomolar. Los datos de paclitaxel y vinblastina, utilizando el mismo ensayo ex vivo, tambien estaban disponibles para todos los modelos de tumores. Todos eran resistentes al tratamiento con paclitaxel, mientras que todos eran sensibles al tratamiento con 20 vinblastina.
Tabla 2:
- Tipo de tumor
- Sensible (S) / Resistente (R)
- BAL27862
- Paclitaxel Vinblastina
- Gastrico
- GXF251 S R S
- GXF97
- R R S
- Pulmon
- LXFL529 S R S
- LXFA629
- R R S
El analisis de la inmunohistoqmmica se realizo con el fin de medir la expresion de protemas BUBR1 en celulas tumorales en los mismos tumores mantenidos como xenoinjertos. Analisis de las concentraciones de BUBR1 en 25 tumores enteros indico que las concentraciones de BUBR1 variaron entre los diferentes tumores (Figura 16).
Basado en el ensayo del brote de colonias y los mismos criterios de CI70, no hubo asociacion entre resistencia a paclitaxel o vinblastina y los bajos niveles de expresion de BUBR1. Esto es evidente, ya que para el tipo de tumor gastrico, ambos modelos eran resistentes a paclitaxel y, sin embargo, para GXF 97 los niveles de BubR1 eran mucho mas bajos que en GXF 251. La misma falta de asociacion era cierta para el alcaloide de la vinca, vinblastina 30 en el modelo gastrico, ya que estos dos tumores eran sensibles a vinblastina. Esta falta de asociacion se repitio en los modelos de tumores de pulmon. Por lo tanto, los niveles de BUBR1 demostraron ser inadecuados como un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
biomarcador fiable de la resistencia a los agentes de microtubulos convencionales paclitaxel y vinblastina en modelos de tumores derivados del paciente.
Sorprendentemente, por el contrario, cuando los datos de resistencia a BAL27862, tal como se define por el ensayo del brote de colonias, se compararon con el nivel de BUBR1, la expresion de BUBR1 ha demostrado ser inferior solo en los tumores resistentes y no en los tumores sensibles derivados del mismo histotipo de tumor (comparese la Figura 16 con la Tabla 2). Niveles bajos de BUBR1 eran, por lo tanto, consistentemente indicativos de resistencia a BAL2786. Por lo tanto, se demostro que los niveles de BUBR1 eran un biomarcador de la resistencia para el compuesto BAL27862.
Ejemplo 6: ARN de BUBR1 frente a los niveles de expresion de protemas.
Con el fin de demostrar que los niveles de expresion de ARN de BUBR1 reflejan los niveles de expresion de protemas y, por lo tanto, que los niveles de expresion de ARN se pueden utilizar en la prediccion de la resistencia a BAL27862, los niveles de expresion se midieron en los niveles tanto del ARN como de protemas de la siguiente manera. Extractos de protemas de celulas enteras se prepararon a partir de lmeas celulares HeLa y H460 y se analizaron por inmunotransferencia en cuanto a la expresion de protemas BUBR1 (Figura 17B). Muestras de ARN se prepararon a partir del mismo pasaje de celulas y se llevo a cabo una RT-PCR cuantitativa (Figura 17A). La comparacion de los datos de inmunotransferencia (Figura 17B) y los datos de RT-PCR (Figura 17A) indico que habfa una buena correlacion entre los niveles de protema y de expresion de ARN para BUBR1 en estas lmeas.
Lista de abreviaturas
A549 lmea celular de cancer de pulmon de celulas no pequenas humana
BCA acido bicinconmico
Bcl-2
BRCA1
BrdU
BSA
CCD
ADNc
CA-125
CREST
DAB
DMSO
DMEM
ADN
dUTP
EDTA/EGTA
ELISA
ErbB-2
EtOH
FACS
FCS/FBS
G2/M
GXF 251
GXF 97
HCT116
linfoma de celulas B de protema 2
protema de susceptibilidad al cancer de mama tipo 1
bromodesoxiuridina
albumina de suero bovino
dispositivo cargado-acoplado
acido desoxirribonucleico complementario
antfgeno de cancer 125
smdrome de esclerodermia limitada
3,3-diaminobencidina
dimetilsulfoxido
medio esencial modificado por Dulbeco acido desoxirribonucleico 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato
tetraacetato de etilendiamina/bis(p-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacetato de etilenglicol
ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas
receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano
Etanol
exploracion/clasificacion de celulas activadas por fluorescencia
suero de ternera fetal / bovino fetal
transicion de G2 a la fase mitotica del ciclo celular
cancer gastrico derivado del paciente
cancer gastrico derivado del paciente
lmea celular de carcinoma colorrectal humana
HeLa
lmea celular de cancer de celulas escamosas humana
HEPES
Hoe33342
H460
IgA
IgG
IHC
ISET
LXFA 629 LXFL 529 MALDI
acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfonico
trihidrocloruro de 2'-(4-etoxifenil)-5-(4-metil-piperazin-1-il)-2,5-bis-1H-bencimidazol trihidrato
lmea celular de cancer de pulmon de celulas no pequenas humana
inmunoglobulina A
inmunoglobulina G
inmunohistoqmmica
aislamiento por tamano de celulas tumorales epiteliales celulas de carcinoma de pulmon derivadas del paciente celulas de carcinoma de pulmon derivadas del paciente
espectrometna de masas de desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz
5
10
15
20
25
30
35
40
45
MALDI-TOF
MCF-7
ARNm
MTS
NaCI
NaF
NCBI
NSCLC
NP40
NTC
PBS
PCR
P-gp
PMSF
PSA
PVDF
RANO
RECIST
READS
RPMI-1640
RT-PCR
SAGE
SDS
SELDI
SELDI-TOF
SEQ. ID NO
ARNip
SKBR3
SKOV3
TUNEL
TX-100
YO-PRO
espectrometna de masas de desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz-tiempo-de- vuelo
lmea celular de carcinoma de mama humana acido ribonucleico mensajero
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio cloruro sodico fluoruro de sodio
Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa cancer de pulmon de celulas no pequenas Nonidet p4o control sin molde
solucion salina tamponada con fosfato reaccion en cadena de la polimerasa glicoprotema P fluoruro de fenilmetilsulfonilo antfgeno espedfico de la prostata poli(fluoruro de vinilideno)
evaluacion de la respuesta para gliomas de alto grado criterios de evaluacion de respuesta en tumores solidos amplificacion por enzima de restriccion de ADNc digeridos
medio de cultivo celular utilizado para el cultivo de celulas eucarioticas y lmeas celulares
transformadas y no transformadas
reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real
analisis en serie de la expresion genica
dodecilsulfato de sodio
desorcion/ionizacion potenciada por laser de superficie
desorcion/ionizacion potenciada por laser de superficie-tiempo de vuelo
numero de identificacion de la secuencia
acido ribonucleico inhibidor pequeno
lmea celular de carcinoma mamario humana
lmea celular de carcinoma de ovario humana
ensayo de marcaje de extremo de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil-transferasa
terminal
Triton-X100
colorante de acidos nucleicos de cianina monomerica, fluorescente
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Basilea Pharmaceutica AG
<120> Uso de BUBR1 como un biomarcador de respuesta a farmacos <130> P50415EP00
<160> 6
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1050
<212> PRT
<213> Homo sapiens
Claims (19)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Uso ex vivo de BUBR1 como un biomarcador para predecir la respuesta a un compuesto, en el que el compuesto es un compuesto de formula general I,
imagen1 en dondeR representa fenilo, tienilo o piridinilo,en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman, junto con el nitrogeno, heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;X representa un grupo C=Y, en donde Y representa oxfgeno o nitrogeno sustituido con hidroxi o alcoxi inferior;R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;R2, R3y R6 representan hidrogeno;R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o una amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,o en dondeR representa fenilo o piridinilo,en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquil inferior-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi inferior-carbonilamino, alquil inferior-carbonilamino, amino sustituido, en donde los dos sustituyentes en nitrogeno forman junto con el nitrogeno un heterociclilo, alquil inferior-carbonilo, carboxi, alcoxi inferior-carbonilo, formilo, ciano, halogeno y nitro; y en donde dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con alcoxi inferior, amino o halogeno;X representa oxfgeno;R1 representa hidrogeno, alquil inferior-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;R2, R3v R6 representan hidrogeno;R4 y R5, independientemente uno de otro, representan hidrogeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi;y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, en donde los derivados farmaceuticamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amida hidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto,y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e incluye un maximo de 4 atomos de carbono,y en el que la respuesta es de una enfermedad en un sujeto, y el biomarcador BUBR1 se mide ex vivo en una muestra o muestras tomadas del cuerpo animal, preferiblemente tomadas del cuerpo humano.5 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde en el compuesto de formula general I,R representa fenilo o piridinilo;en donde fenilo esta opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogeno y nitro; y en donde piridinilo esta opcionalmente sustituido con amino o halogeno;10 X representa un grupo C=O;R1 representa hidrogeno o ciano-alquilo inferior;R2, R3, R4, R5 y R6 representan hidrogeno;y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos segun se define en la reivindicacion 1, y en donde el prefijo inferior designa un radical que tiene hasta e incluye un maximo de 7, especialmente hasta e 15 incluye un maximo de 4 atomos de carbono. - 3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto se representa por la siguiente formula
imagen2 en donde R, Y y R1 se definen como sigue:imagen3 o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en la reivindicacion 1. - 4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto es
imagen4 o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en la reivindicacion 1. - 5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el derivado es un pro-farmaco farmaceuticamente aceptable, que es una amida formada a partir de un grupo amino presente dentro del grupo R del5 compuesto de formula general I segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y el grupo carboxi de glicina, alanina o lisina.
- 6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto es
imagen5 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, preferiblemente una sal hidrocloruro del mismo, lo mas 10 preferiblemente una sal dihidrocloruro del mismo. - 7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para predecir la resistencia de una enfermedad en un sujeto a dicho compuesto.
- 8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad es una enfermedad neoplasica o un enfermedad autoinmune.15 9. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la enfermedad es un cancer.
- 10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer cervical, cancer de ovario, cancer gastrico,510152025303540cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de hngado, cancer de cerebro, cancer neuroendocrino, cancer de pulmon, cancer de rinon, tumores malignos hematologicos, melanoma y sarcomas.
- 11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de ovario, cancer de mama, cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de colon, cancer de pulmon y cancer cervical.
- 12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon y cancer gastrico.
- 13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde una concentracion elevada de BUBR1 en la muestra del sujeto con relacion a un valor estandar o conjunto de valores estandares predice resistencia.
- 14. Uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde concentraciones mas bajas de BUBR1 en una muestra o muestrasi) con respecto a un valor estandar o un conjunto de valores estandares de sujetos con el mismo histotipo del tumor; oii) tomadas despues del inicio del tratamiento y en comparacion con una muestra o muestras tomadas del mismo sujeto antes de iniciar el tratamiento; oiii) con relacion a un valor estandar o un conjunto de valores estandares a partir de celulas o tejidos normales o fluido corporal;son predictivas de resistencia.
- 15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el biomarcador se utiliza para seleccionar sujetos que padecen o estan predispuestos a padecer una enfermedad, preferiblemente cancer, para el tratamiento con un compuesto de formula general I o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra se deriva de tejido tumoral, tejido normal, lmeas celulares o celulas tumorales circulantes, preferiblemente en donde se deriva de tejido tumoral.
- 17. Un metodo para predecir en un sujeto que padece cancer la respuesta de ese cancer a un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:a) medir una concentracion ex vivo de BUBR1 en una muestra pre-obtenida del tejido tumoral o celulas tumorales circulantes del sujeto para obtener un valor o valores que representan esta ° concentracion; yb) comparar el valor o los valores de la etapa a) con un valor estandar o un conjunto de valores estandares de los sujetos con el mismo tipo de cancer,en donde una concentracion menor de BUBR1 en la muestra en relacion con el valor estandar o el conjunto de valores estandares es predictiva de la resistencia del cancer del sujeto al compuesto de formula (I), y preferiblemente en donde el cancer es un cancer tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 o 12.
- 18. Un compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de una enfermedad neoplasica o autoinmune en un sujeto humano que padece dicha enfermedad, caracterizado por que el sujeto humano tiene una concentracion de BUBR1, medida ex vivo en una muestra de un sujeto humano que no es menor que un valor estandar o conjunto de valores estandares, en donde una concentracion menor de BUBR1 en la muestra obtenidadel sujeto con relacion al valor estandar o conjunto de valores estandares es predictiva de resistencia al compuesto de formula (I).
- 19. El compuesto de formula general I o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 18, en donde la enfermedad neoplasica es un cancer, preferiblemente un cancer tal como se define en5 una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 o 12.
- 20. Un kit para predecir la respuesta a un compuesto de formula I general o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende reactivos necesarios para medir una concentracion de BUBR1 en una muestra tomada de un sujeto con un cancer, que comprende un compuesto de formula (I) o un derivado farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde el10 derivado farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en una sal, solvato, ester o amidahidrolizable in vivo de dicho compuesto, sal de tal ester o amida hidrolizable in vivo, y polimorfo de dicho compuesto; y que comprende, ademas, un modulo de comparador que comprende un valor estandar o un conjunto de valores estandares de una concentracion de BUBR1 tomada de muestras de tejido tumoral o celulas tumorales circulantes de sujetos con un cancer del mismo histotipo con el que se compara la concentracion de BUBR1, en donde una 15 concentracion menor de BUBR1 en la muestra obtenida del sujeto con relacion al valor estandar o conjunto devalores estandares es predictiva de resistencia al compuesto de formula (I).
- 21. El kit de acuerdo con la reivindicacion 20, en donde los reactivos comprenden un reactivo de captura que comprende un detector para BUBR1 y un reactivo detector, preferiblemente, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo.20 22. El kit de acuerdo con la reivindicacion 20 o la reivindicacion 21, en donde el compuesto es un compuesto de lasiguiente formula
imagen6 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en particular la sal dihidrocloruro del mismo.imagen7 imagen8 imagen9 imagen10 imagen11 imagen12 O)-vlCD CDC CCD CDa n<=■ ift>- 1
- 1
- Control
- (
- j Lipofectamina
- I
- ! WTC
- BUBR1
(ItI-0)imagen13 CDimagen14 Figura 7recuentc de celulasimagen15 1600 r■16 DO - 1400 L 1200 - 1000 - BOO - 6 DO - 400 - 200 - 0 -imagen16 \controlnegativeimagen17 50nM% celulas rnuertas- —k. ro Ui 03
- o
- Q ______1_____ o _____i_____ o _____i_____ O ______1_____ Q _____1_____ O _____1
imagen18 imagen19 % celulas rmuertasimagen20 imagen21 imagen22 neimagen23 4^imagen24 incQiOrsensibleresistente 1resistente 2(/)7sO5imagen25 actina- sensible
- £ &
- resistente
- CO
- sensible
- CO o
- resistente
- £
- sensible
- £
- resistente
- Q
Figura 14:imagen26 imagen27 CDH460BUBR1HeLa H460imagen28 Secuencia deprotemas BUBR1 [Homo sapiens] (SEQ. ID. NO: 1)- 1
- maavkkegga Isearnslegd ewelskenvq pluqgiims~ lqgalaqesa cimtlqqqkr
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- 241
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- Ml
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- 361
- sinhilstck pgkeegdplq Evqs hqqase ekkekmmyck ekn yagvgef sfeeicaevf
- 421
- rkklkscrea elltsaekua emqkqieeme kklkeiq^tq qertgdqqee truptket.tkl
- i—1 CO TT
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- 541
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- SOI
- iqpnpftdtcd laiLiarfvaL pfhqimalkd 1 p edp l: .!■ 11 p «edldvktse dqqLiiuqLiy
- 661
- sqtltikkla pi ieds rea t haaqisqssa sviEtssikc lqipeklal t QGtEGnptqs
- 721
- pwcsqyrrql 1 kslpelsss sel ei-edrpri pkl e=: ekai g 1gnedyqjk r ey 1 i efidykl
- V31
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- 041
- cf ^.lqdlLqh seyitheitv li iyr.il "iv emlh.kaeivh gdlsprcLil rncihdpydc
- 501
- nknnqalkiv df sysvdlrv qldvftlsgf rtvqileqqk ilancssayq vdlfgiadla
- 561
- hlllfkeblq vfwdgsfwkl aqfjinqlkdq elwnkffv£i lr.andeat vs vlqelaaemn
- 1021
- q vidtLfqirh lnkaiwkvgk lLfipgallfg
Secuencia de acido nucleico [Homo sapiens] (SEQ. ID. NO. 2)- 1
- aggggcgtgg ccacgtcgac egegeggqac egttaaaitt gaaacttyge ggataggggt
- 6L
- gz gggcttga ggtggccggt ttgttaggga gtcgtgta eg tgccttggtc gcttctgtsg
- 121
- ctccqagggc a g g t t.g c g qa aqaaaqcDia gqeggtctgt gqccraqagg aaaggcctgc
- 1SI
- aycaggacga ggacctgagc cfiggauLgca ggatggcggc qqlgaaqaay gaagggggtg
- 241
- ctctgagtga agccatgtcc ctggagggag atgaatggg ?, actgagtaaa gaaaatgtac
- 301
- aacrtt.caaq g c a a gg g t qg a tea tgtcca rqetr.raggg aqcactqgca caagaat.cr.g
- 3c L
- cc Lq Luucaa tacL-^LLcqg c^q-jagaaa " q g q fa L L L qa atatigaaatt cgattLtaca
- 421
- ctggaaatga ccctctggat gtttgggata ggtatatcag ctggaeagag cagaactatc
- 181
- Ct caaggtgg gaaggagagt. aatatgtcag cgt.tattaga aagagct.gt.a gaageactac
- S4L
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