ES2621285T3

ES2621285T3 - Métodos para identificar anticuerpos con inmunogenicidad reducida

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Publication number: ES2621285T3
Application number: ES13773474.5T
Authority: ES
Inventors: Fiona A. Harding; Olivia Jennifer RAZO
Original assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Current assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: LT2897978T; TW201418469A; HRP20170937T1; US20140227251A1; SG11201502094TA; EP2897978A2; RU2015111671A; JP2015537190A; AU2013318147B2; SI2897978T1; MX2015003541A; US9279016B2; PL2897978T3; PT2897978T; RS56093B1; RU2648141C2; WO2014047222A3; KR20150056788A; IN2015DN01967A; EP3211006A3

Abstract

Una variante de un anticuerpo anti-TNF-α de referencia o un fragmento de unión anti-TNF-α de referencia de un anticuerpo, cuyo anticuerpo o fragmento de unión de referencia comprende seis regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") que tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a los SEQ ID NO:5 (CDRH1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) y SEQ ID NO:10 (CDR-L3), en donde la variante comprende la sustitución Y2K in CDR-H1, en donde las seis CDR juntas tienen hasta 8 sustituciones de aminoácidos en comparación con las secuencias de CDR del anticuerpo de referencia o fragmento original.

Description

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células clasificadas en una subpoblación que tiene reducción de la unión al anti-Id se pueden clasificar en más subpoblaciones basándose en la unión a la diana y los niveles de expresión, produciéndose la clasificación basada en la unión a la diana y en niveles de expresión simultáneamente o sucesivamente. En otras realizaciones, las variantes identificadas durante la clasificación para determinar la unión de anticuerpos anti-idiotípicos (y las células anfitrionas que los expresan)se caracterizan para determinarla unión a la diana utilizando unmétodos devalidación independientes descritos más abajo.

Análisis de las poblaciones clasificadas:

Después de la clasificación en subpoblaciones, la frecuencia de cada variante de anticuerpo en cada subpoblación se puede determinar mediante la secuenciación de los plásmidos que codifican las variantes. Un método de secuenciación de ADN preferido de la descripción es la "secuenciación masiva en paralelo" o la "pirosecuenciación masiva en paralelo" (véanse, p.ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.787.308; 6.833.246; 6.897.023; 6.956.114; 7.057.026; 7.115.400, 7.211.390; y 7.232.656). Este método permite la secuenciación rápida y económica de ADN y acelera la identificación de variantes de anticuerpos específicos con la actividad o características deseadas.

Despuésdelasecuenciación,sepuederealizarelanálisisestadísticodelassecuenciasparaidentificarlas variantes deseadas. Tal análisis puede incluir el análisis mediante ordenador de las secuencias de ADN de partida. Las secuenciasdeADNdepartidasepuedentraducirasecuencias deproteína,alinearycompararconelanticuerpode referencia para identificarlasmutaciones.La frecuenciade cadaaminoácidoobservadoen cadaposición puedeser tabulada para determinar el tipo de categoría (p.ej., disminución de la inmunogenicidad y aumento, disminución, o expresión neutra o afinidad por la molécula diana) y se comparó con el anticuerpo de referencia. La población seleccionada presentará un enriquecimiento de las variantes con la actividad deseada, tales como, p.ej., aquellas que reducen la inmunogenicidad, conservan la expresión, y/o conservan la unión a la molécula diana, mientras que la poblaciónseleccionada presentará unempobrecimiento delas variantes con actividades no deseadas.

Se puede calcular una razón de enriquecimiento (RE) para cada variante que proporciona una medida del grado de enriquecimiento o empobrecimiento de la variante en una población en comparación con otras variantes y/o el anticuerpo de referencia. En realizaciones en las que las células se clasifican en función de (a) los niveles de expresión por encima de un cierto umbral y (b) una baja unión a un anticuerpo anti-idiotipo (la población "clasificada"), el número de veces que una mutación se encuentra en una posición dada es normalizado para determinar el número de veces que se secuenció esa posición y se expresa como una frecuencia por 1000 secuencias. A continuación, la frecuencia de la mutación en la población clasificada se divide por la frecuencia en la población expresada para proporcionar la Razón de Enriquecimiento (RE) que indica si la población clasificada ha resultado enriquecida o empobrecida en la mutación en comparación con la población expresada, y en qué grado. Las mutaciones en las que ha resultado enriquecida la población clasificada presentarán una disminución de la unión al anti-idiotipo, mientras que las mutaciones en las que ha resultado empobrecida presentarán un aumento de unión al anti-idiotipo.Delmismo modo,los coeficientes de enriquecimiento puedensercalculados para cada variante clasificada de acuerdocon elaumento de afinidad,la disminución de afinidad osimilarafinidad (neutra)por la diana.

En realizaciones en las que las células se clasifican sólo para determinar la disminución de la unión al anti-idiotipo, p.ej., cuando las células se clasifican de forma no simultánea para determinar los niveles de expresión, se puede determinar una razón de enriquecimiento dividiendo la frecuencia de la mutación en una subpoblación en la que se ha unido el anti-idiotipo por debajo de un valor de referencia determinado a partir de células que expresan el anticuerpo de referencia porla frecuencia de la mutación en unasubpoblación en la quese ha unido el anti-idiotipoa un valorigual al valordereferencia osuperior.

Validación de las variantes individuales:

Las características de unión de los polipéptidos variantes expresados individualmente pueden analizarse utilizando una variedad de técnicas para confirmar su comportamiento en el contexto de una biblioteca. Estas técnicas incluyen BIAcore, FACS, ELISA, AlphaLisa y KinExA. Los análisis BIAcore determinan la unión utilizando resonancia de plasmón superficial (RPS), un fenómeno óptico que permite la detección de interactuantes sin marcar y se pueden utilizar para determinar la afinidad de unión de variantes de anticuerpos individuales (p.ej., Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2008/0274114; y Che et al., 2009, J. Pharm. y Biomed. Analysis 50(2):183-188). AlphaLIS A se puede utilizar para determinar la afinidad de unión de variantes individuales a una molécula diana (véase, por ejemplo, Ullman et al., 1996, Clinical Chemistry, 42(9):1518-1526; y Hideharu et al., 2007, Cancer Science 98(8):1275-80). KinExA (análisis de exclusión cinética) mide la concentración de la molécula de receptor (R) no complejado en una mezcla de receptor, ligando (L), y complejo LR. La concentración de R no complejado se mide mediante la exposición de la mezcla en fase de solución a L inmovilizado en fase sólida durante un período de tiempo muy breve. El "tiempo de contacto" entre la mezcla en fase de solución y L inmovilizado en fase sólida se mantiene lo suficientemente breve para que la disociación del complejo de LR sea insignificante. Cuando se excluye cinéticamente la posibilidad de disociación significativa del complejo LR, solamente puede unirse a la fase sólida R

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■: patologías inmunitarias y autoinmunitarias agudas y crónicas, tales como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, tiroidosis, enfermedad injerto contra anfitrión, escleroderma, diabetes mellitus, enfermedad de Graves, y similares;

■: Infecciones, incluyendo, pero no limitadas a, síndrome de sepsis, caquexia, colapso circulatorio y choque resultante de infección bacteriana aguda o crónica, enfermedades infecciosas parasitarias y/o bacterianas, virales o fúngicas agudas ycrónicas,tales como el SIDA(incluyendo secuelas tales como caquexia,trastornos autoinmunitarios, complejo de demencia e infecciones por SIDA);

■: Enfermedades inflamatorias, tales como patologías inflamatorias crónicas y patologías inflamatorias vasculares, incluyendo patologías inflamatorias crónicas tales como sarcoidosis, enfermedad inflamatoria crónica del intestino, colitis ulcerosa y patología de Crohn y patologías inflamatorias vasculares, tales como, peronolimitadas a,coagulaciónintravasculardiseminada,aterosclerosisypatologíadeKawasaki;

■: Enfermedades neurodegenerativas, incluyendo, pero no limitadas a, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos tales como lesiones delsistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelosos; trastornos del movimiento hipercinéticos tales como corea de Huntington y corea senil, trastornos del movimiento inducidos por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean el SNC, receptores de dopamina; trastornos del movimiento hipocinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; Parálisis supranucleo progresiva, y Trastornos cerebelosos y espinocerebelosos, tales como lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, y Machado-Joseph), y trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia, y trastorno mitocondrial multisistémico); trastornos desmielinizantes centrales, tales como esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del cuerno anterior, tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; Síndrome de Down en la mediana edad; enfermedad difusa por cuerpos de Lewy; Demencia senil del tipo cuerpos de Lewy, síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, yDemencia pugilística o cualquiera desussubconjuntos;

■: Patologías malignas que implican tumores secretores de TNF-α u otros tumores malignos que implican al TNF-α, tales como, pero sin limitarse a leucemias (aguda, mielocítica crónica, linfocítica crónica y/o síndrome mielodisplásico); linfomas (linfomas de Hodgkin y no Hodgkiniano, como linfomas malignos (linfoma de Burkitt

o micosis fungoide), y

■ Hepatitis inducida por alcohol.

En ciertas realizaciones específicas, los anticuerpos de la descripción se utilizan para tratar cualquier indicación para la que está aprobado Adalimumab, por ejemplo, artritis reumatoide (AR) (incluyendo AR moderada o grave en los adultos), la artritis idiopática juvenil poliarticular (AIJ) (incluyendo AIJ moderada a severa en pacientes de 4 años de edad y mayores), artritis psoriásica (APs) (incluyendo la artritis psoriásica en adultos), espondilitis anquilosante (EA) (incluyendo EA en adultos), enfermedad de Crohn (EC) (incluyendo EC moderada o grave en adultos), psoriasis, p.ej., psoriasis en placas crónica (Ps) (incluyendo psoriasis en placas crónica moderada a severa en adultos), y espondiloartritis axial (EsAax) (incluyendo EsAax grave en pacientes adultos que no tienen evidencia de rayos X de daño estructural).

Por consiguiente, la presente descripción proporciona métodos para tratar cualquiera de las enfermedades anteriores en un paciente que lo necesite, que comprende: administrar al paciente un anticuerpo anti-TNF-α de la descripción. Opcionalmente, dicha administración se repite, por ejemplo, después de un día, dos días, tres días, cinco días, una semana, dos semanas o un mes. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. La administración puede repetirse una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces, o más. Por ejemplo, de acuerdo con ciertos regímenes de dosificación un paciente recibe la terapia anti-TNF-α durante un períododetiempoprolongado,p.ej.,6meses,1 año

o más. La cantidad de anticuerpo anti-TNF-α administrado al paciente es en ciertas realizaciones una cantidad terapéuticamente eficaz. Según se utiliza en la presente memoria, una cantidad "terapéuticamente eficaz" de anticuerpo contra TNF-α se puede administrar como una dosis única o en el transcurso de un régimen terapéutico, p.ej.,en eltranscursode una semana,dossemanas,tressemanas,unmes,tresmeses,seismeses,un año,omás. Una dosis típica dependerá del paciente yla gravedad de la enfermedad,pero típicamente oscila de 10 mg a 160mg (p.ej.,10 mg,15 mg,20 mg,25mg,30mg,35 mg,40 mg,45mg,50mg,60 mg,80 mg,100 mg,120 mg,140 mg,o 160 mg. En realizaciones específicas, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TNF-α, o un método de tratamiento de uno o más de los trastornos descritos en la presentememoria, en un intervalo de dosificación enmarcado por cualquiera de los valores anteriores. El régimen terapéutico en el que

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Los anticuerpos anti-TNF-α de la descripción se pueden incorporar a composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un paciente. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-TNF-α y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p.ej., soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, y polvos. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles. El modo preferido de administración es parenteral (p.ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo anti-TNF-α se administra mediante infusión intravenosa o inyección. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-TNF-a se administra mediante inyección intramuscular osubcutánea.

Los anticuerpos anti-TNF-α deladescripciónsepuedenproporcionarenkitsfarmacéuticos.Elkitfarmacéuticoes un paquete que comprende el anticuerpo anti-TNF-α de la descripción (p.ej., ya sea en forma liofilizada o como una disolución acuosa) y opcionalmente uno o más de los siguientes: un segundo agente terapéutico, por ejemplo como se describe anteriormente; un dispositivo para administrar el anticuerpo anti-TNF-a, por ejemplo una pluma, aguja y/o la jeringa; y agua o tampón de calidad farmacéutica para resuspender el anticuerpo si el anticuerpo está en forma liofilizada.

En ciertos aspectos, cada dosis unitaria del anticuerpo anti-TNF-α se empaqueta por separado, y un kit puede contener una o más dosis unitarias (p.ej., dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitarias, diez dosis unitarias, o más). En una realización específica, la una o más dosis unitarias están cada uno alojadas en una jeringa o pluma. Una dosis unitaria típica comprende de 10 mg a 160 mg de un anticuerpo anti-TNF-α (p.ej., 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 60 mg , 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg, o 160 mg). En realizaciones específicas la presente descripción proporciona una dosis unitaria que comprende un anticuerpo anti-TNF-α en un intervalo enmarcado por cualquiera de los valores anteriores.

Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (p.ej., un tampón de bloqueo o tampón de lisis), y similares. En una realización específica, el anticuerpo y uno o más aditivos pueden ser proporcionados (individualmente o combinados) como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución que tiene la concentración apropiada.

7. Ejemplos

7.1. Ejemplo 1: Vectores para su expresión y presentación en la superficie celular.

Los dominios ligeros variables (VL) y pesados variables (VH) para D2E7 (Adalimumab) fueron construidos por un proveedor comercial de síntesis de genes (DNA 2.0 Inc., Menlo Park, CA). Las FIG. 1A-1C muestran las secuencias de ADN, las secuencias de aminoácidos traducidas, los sitios de restricción flanqueantes, y las CDR de los fragmentos VH y VL sintéticos de D2E7. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican mediante texto subrayado en negrita. Los VH y VL de D2E7 sintéticos se clonaron en el vector pYA206, un vector episomal derivado del virus de Epstein-Barr para la expresión y la presentación de anticuerpos en la superficie de células de mamífero. pYA206 es un derivado del plásmido pYA104 (Akamatsu et al., J. Immunol Methods, 31 de octubre de 2007; 327(1-2):40-52) con las siguientes modificaciones: 1) el dominio constante C lambda humano ha sido sustituido por el dominio constante de C kappa humano, 2) la señal de conexión de glicosidilfosfatidilinositol (ancla de GPI) ha sido reemplazada por el dominio transmembrana del receptor del factor crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R), 3) los sitios NotI y XhoI únicos están aguas arriba del dominio C kappa para la clonación de los dominios VL en marco con C kappa, y 4) los sitios NgoMIV y SacI únicos están aguas arriba de IgG1 para la clonación de los dominios VH en marco con las regiones constantes de IgG1.

pCW600 es un derivado del plásmido pYA206, con el gen CH sustituido por Fab.

ElfragmentoVHdeD2E7sedigirióconNgoMIVySacI,yelfragmentoVLdeD2E7sedigirióconNotIyXhoI. Ambos

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fragmentos se clonaron en el plásmido pYA206 para crear el plásmido pYA206-D2E7. La FIG. 4 muestra la estructura de pYA206-D2E7. Este plásmido contiene el gen EBNA-1 y oriP del virus de Epstein Barr que permite la replicación en células de mamífero como un episoma. El origen de replicación de pUC y gen de resistencia a ampicilina permiten que el plásmido se pueda propagar en E. coli. Los transformantes de células de mamífero se seleccionan con el gen de resistencia a puromicina bajo el control del promotor de SV40. El promotor de CMV y el sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) permiten la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo presentado. El anticuerpo expresado se ancla a la membrana celular a través del dominio transmembrana PDGF-R fusionado al extremo del dominio constante de IgG1.

El fragmento VHde D2E7se digirió con NgoMIVySacl, el fragmento VL de D2E7 se digirió con NotIyXhoI, ylos dos fragmentos se clonaron en el plásmido pCW600 para crear el plásmido pCW600-D2E7. La FIG. 4 muestra la estructura de pCW600-D2E7. Este plásmido contiene el gen EBNA-1 y oriP del virus de Epstein Barr que permiten la replicación en células de mamífero como un episoma. El origen de replicación de pUC y el gen de resistencia a ampicilina permiten que el plásmido se pueda propagar en E. coli. Los transformantes de células de mamífero se seleccionan con el gen de resistencia a puromicina bajo el control del promotor de SV40. El promotor de CMV y el sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) permiten la expresión de las cadenas pesadas y ligeras de Fab presentadas. El Fab expresado se ancla a la membrana celular a través del dominio transmembrana de PDGF-R fusionado al extremo del dominio constante de IgG1.

7.2.Ejemplo 2:Presentación en superficies yanálisis de titulaciónFACSde D2E7

Las células 293c18 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA), que expresan la proteína EBNA-1, se transformaron con pYA206-D2E7. Las células 293c18 se cultivaron en medio DMEM con un suplemento de suero bovino fetal (FBS) al 10% y 0,25 mg/ml de G418. Se mezclaron 0,125 µg de plásmido pYA206-D2E7 o pCW600-D2E7 1:200 con 25 µg pUC19 como un plásmido portador más 60 μl de lipofectamina (Invitrogen, CA) y se añadieron a 2x107 células 293c18. El plásmido portador en exceso de 200 veces fue para garantizar que cada célula era transformada a lo sumo por un solo plásmido que contenía D2E7. Después de 48 horas, las células transformadas se seleccionaron mediante la adición de puromicina, y después se cultivaron durante 18 días adicionales antes del análisis FACS.

El TNF-α humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) se marcó con Alexa Fluor 647 (Invitrogen, CA). Se hizo reaccionar 1 mg de TNF-α humano con 84 µg de reactivo Alexa Flour 647 durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se purificó del reactivo que no había reaccionado utilizando una columna de filtración en gel. Las células 293c18 transfectadas con pCW600-D2E7 se tiñeron doblemente con anti-IgG humana marcado con PE (Southern Biotech) a una dilución de 1/200 y diversas concentraciones de TNF-α marcado con Alexa Fluor 647 en hielo durante una hora, se lavaron con tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato (PBS) más albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5%) y se analizaron en un FACSCalibur (BD). Se realizó una curva de titulación con concentraciones de TNF-α marcadoconAlexaFluor647queoscilabande20nMa0,26nM.El puntomediodecada curva, en el que se produce la unión semimáxima, se definió como CE50 para el complejo anticuerpo/antígeno. Los resultados para D2E7 de tipo salvaje se muestran en la FIG. 5. El Fab de D2E7 presentado en la superficie se une a TNF-α con una CE500,15 nMen este análisis.

Los anticuerposanti-D2E71H11,5A1,y10F8(anti-idiotipos,anti-Id)seconjugaronconbiotina.Sehizoreaccionar1 mg de cada anti-Id con 43 µg de reactivo Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce) durante dos horas a temperatura ambiente. El exceso de biotina se eliminó mediante centrifugación en un filtro de microcentrífuga Amicon. Las células 293c18 transfectadas conpCW600-D2E7 setiñerondoblemente con anti-IgGhumanamarcado conPE(Southern Biotech)a una dilución 1/200 y anti-Id biotinilados durante 1 hora, se lavaron con tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato (PBS) más albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5%), a continuación se tiñeron con una dilución 1/200 de estreptavidina-APC. Se realizó una curva de titulación con concentraciones de anti-Id que oscilaban de 20 nM a 0,26 nM. El punto medio de cada curva, en el que se produce la unión semimáxima, se define como EC50 para el complejo anti-Id/D2E7.El resultado para cada anti-idiotiposemuestra enla FIG. 6.El Fab de D2E7presentadoen la superficieseunealos anti-Id1H11,5A1,y10F8conunaCE50de0,77nM,0,37nM,y1,28nM,respectivamente,en este análisis.

7.3.Ejemplo 3:Construcción de bibliotecas demutantes en unsolo aminoácidode D2E7

Cada posición de aminoácido de CDR de D2E7 (subrayada en la FIG 1A) -un total de 34 posiciones VH y 27 posiciones VL -se eligió como diana para la aleatorización NNK. Se utilizó el esquema de codificación NNK (en el que N = A, C, G o T y K = G o T) porque: 1) sólo son necesarios 32 codones para codificar los 20 aminoácidos de origen natural, 2) sólo se incluye un único codón de parada (TAG) en los 32, y 3) la máxima degeneración (número dediferentescodonesquecodificanunúnicoaminoácido)es 3,enlugardelamáximadegeneraciónde6vecesque se produce en el código genético de 64 codones completo.

Los 61 diferentes fragmentos de ADN, cada uno con degeneración NNK en una posición CDR diferente, fueron

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sintetizados por un proveedor comercial de genes sintéticos (DNA 2.0, Menlo Park, CA). Estos fragmentos se amplificaron mediante PCR con cebadores D2E7reampFwd (5'-CTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG-3') (SEQ ID NO:11)yD2E7reampRev(5'-TGGTAGTGTGGGGACTC-3')(SEQID NO:12).LosproductosdePCRsepurificaron, a continuación los fragmentos VH se digirieron con NgoMIV y SacI, y los fragmentos VL se digirieron con NotI y XhoI. Todos los fragmentos se sometieron a ciclos de cromatografía en un gel de agarosa, se purificaron, y se subclonaron en el plásmido pCW600-D2E7 que portaba el fragmento de la región variable de tipo salvaje opuesto. Los plásmidos resultantessetransformaronporseparadoencélulasE.coliTop10(Invitrogen,CA)paraformaruna sub-biblioteca de transformantes para cada uno de los 61 fragmentos de ADN diferentes. Las transformaciones se llevaron a cabo de tal manera que se obtuvieron al menos 10 veces más transformantes de E. coli que el número total de posibles codones en cada sub-biblioteca. Los sub-bibliotecas resultantes para VH y VL se reunieron para crear dos bibliotecas finales -una biblioteca VH de D2E7 que comprende 34 posiciones y 1088 codones diferentes, y una biblioteca VLde D2E7quecomprende27 posiciones y864codones totales diferentes.

7.4. Ejemplo 4: Tinción FACS y clasificación de 4 vías de bibliotecas de Fab mutantes puntuales de VH y VL de D2E7 para determinar la unión de TNF-α

Las bibliotecas de VH y VL de D2E7 se transfectaron en células 293c18 con 0,5 µg de plásmido de la biblioteca, 100 µg de plásmido portador de pUC19 y 250 μl de lipofectamina, se seleccionaron con 0,8 µg/ml de puromicina después de 2 días, y se cultivaron durante 18 días adicionales antes de la clasificación mediante FACS. Las células se tiñeron con TNF-α con Alexa Fluor 647 0,15 nanomolar y anti-IgG marcado con PE 1: 200 (Southern Biotech) y se clasificaron en una máquina FACS MoFlo (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Los perfiles de la clasificación FACS para las bibliotecas de D2E7 de tipo salvaje y mutación puntual de VH se muestran en las FIG. 7A-7B. El panel A muestra el perfil de FACS para células transformadas con el plásmido de expresión de Fab de D2E7 de tipo salvaje pCW600; el eje x muestra la tinción con anti-IgG-PE y el eje y muestra la tinción con TNF-α con Alexa Fluor

647. Debido a que la expresión de los anticuerpos es heterogénea en la población celular, el perfil de FACS muestra datos individuales dispuestos aproximadamente a lo largo de una línea diagonal que apunta hacia el cuadrante superior derecho.

Las células teñidas con TNF-α de la biblioteca de mutación puntual de VH se clasificaron en 4 subpoblaciones basándose en las ventanas de análisis de FACS (FIG. 7A-7B, panel B). El comportamiento del anticuerpo de tipo salvaje en condiciones de FACS similares se utiliza para establecer ventanas de análisis para clasificar las células en una población de afinidad más alta (H) (R4), una población de afinidad neutra o 'media' (M) (R5), una población de afinidad inferior (L) (R6), y una población que no expresa IgG (Z) (R3). El eje x muestra la tinción anti-IgG-PE y el eje ymuestra la tinción con TNF-α-AF647 humano.

7.5. Ejemplo 5: Tinción FACS y clasificación de dos vías de bibliotecas de Fab mutantes puntuales de VH y VL de D2E7 para determinar la unión de anti-Id

Las células que expresan D2E7 se tiñeron concurrentemente con TNF-a con Alexa Fluor 647 0,15 nanomolar y mAbs anti-idiotípicos biotinilados a CE50 (1H11 a 0,77 nM, 5A1 a 0,37 nM, y 10F8 a 1,28 nM), después se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron y se incubaron con estreptavidina-APC y anti-IgG kappa humano-FITC durante una hora a 4°C. Las células se lavaron, a continuación, se clasificaron en una máquina FACS MoFlo (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Los perfiles de clasificación FACS para D2E7detiposalvajeylabibliotecadeVHteñidacon1H11semuestranenlas FIG.8A-8B.Latinciónanti-IgG-PEse muestra en el eje x y la tinción anti-IdlH11-APC se muestra en el eje y. Se realizó una clasificación de 2 vías, recogiendo un mínimo de dos millones de células en las ventanas de análisis de "clasificación" (células con baja unión al anticuerpo anti-idiotipo)y "expresión"(células positivas para anti IgGKappa humanos-FITC).

Debido a que la expresión del anticuerpo es heterogénea en la población celular, el perfil de FACS muestra datos individuales dispuestos aproximadamente a lo largo de una línea diagonal que apunta hacia el cuadrante superior derecho. Los perfiles de FACS para la biblioteca de mutación puntual WT y VH de D2E7 se muestran en la FIG. 8, paneles A y B, respectivamente. Con el fin de recoger una población de células de referencia para cada biblioteca quecontienetodaslasmutacionespuntualesexpresadasensus frecuenciascorrectasenlabiblioteca,lasventanas de análisis se dibujaron con el borde izquierdo paralelo al eje y; la clasificación con estas ventanas de análisis recoge todas las células que expresan IgG por encima de un cierto nivel, independientemente de lo bien que se unan a anti-Id los anticuerpos presentados. Éstas se denominaron "ventanas de análisis de expresión" y "poblaciones expresadas" (panel B "R4"). Se realizaron otras clasificaciones con la parte superior de la ventana de análisis dibujada aproximadamente paralela a y directamente por debajo de la diagonal principal de la población de tipo salvaje; estas ventanas de análisis se diseñaron para recoger las células que expresaban anticuerpos con disminución de la afinidad de unión por el anti-idiotipo, independientemente de su nivel global de expresión de IgG. Estas ventanas de análisis y poblaciones fueron referidas "ventanas de análisis de clasificación" y "poblaciones clasificadas" (panel B "R3"). Se recogieron aproximadamente 2.000.000 células en la puerta tanto de "clasificación" como de "expresión".

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continuación. Los ADAb de los donantes seleccionados fueron específicos para el fragmento Fab de D2E7.

Se escrutaron los anticuerpos variantes identificados por tener reducción de la unión a anticuerpos murino antiidiotipo, en comparación con D2E7 para determinar la inhibición del análisis de formación de puentes de D2E7. La inhibición del análisis de formación de puentes por un anticuerpo variante muestra que la variante es todavía susceptibles de unirse a los ADAb del suero del paciente. Por lo tanto, las variantes que no interfieren en el análisis de formación de puentes no presentan reacción cruzada con el ADAb y por lo tanto representan mutaciones dentro del epítopo de unión al anticuerpo de D2E7.

Se recubrieron durantelanoche placas de ELISAImmobiloncon0,5 µg/mldeD2E7detiposalvaje,selavaron yse bloquearon. En una placa de 96 pocillos separada, se diluyeron anticuerpos variantes D2E7 en huAb/PBS a 10 µg/ml. Cada variante se sometió a ensayo por duplicado. Se utilizaron anticuerpos IgG1 herceptina y DP10, no relacionados con D2E7, como controles negativos para determinar la unión de anticuerpos anti-Adalimumab. El anticuerpo D2E7 de tipo salvaje se utilizó como control positivo para determinar la inhibición. Los fragmentos Fab de DP10 yD2E7 tambiénseutilizaron como controles negativos ypositivos,respectivamente.Elsuerodelosdonantes que exhibían una respuesta inmunitaria a Adalimumab se diluyó 1:25 en huAB/PBS, y se añadieron 100 μl a los pocillos que contenían las variantes y los controles. La concentración final de suero del donante fue de 1:50. Se transfirieron 100 μl del suero diluido con variantes y controles agregados a las placas recubiertas con D2E7. Se añadieron inmediatamente a las placas 100 μl de D2E7 biotinilado a 30 ng/ml en huAB/PBS. Las placas se incubaron a 4°C durante la noche. El día siguiente las placas se lavaron, y se añadió estreptavidina-HRPO diluida. Las placasselavaronunavezconPBS/Tween-40,yseañadióTMBOneComponent(BioFXLaboratories)yelcolor se desarrolló durante 15 minutos. Las placas se leyeron a 650 nm.

El anticuerpo DP10 no relacionadoseincluyó como un control en todas las pruebas yno tuvo impacto enla unión de ADAb a D2E7 en las placas. El porcentaje de inhibición de ADAb a DP10 promedió 88 +/-12%. El análisis de inhibición se llevó a cabo con muestras de suero positivas para ADAb de cuatro donantes comerciales. Los resultados se superpusieron en gran medida para los cuatro donantes, con cambios en CDR3 de VH que tenía el mayor impacto en unión de ADAb (FIG. 20A-20B). Las variantes preferidas se seleccionaron de dos maneras: la FIG. 21A muestra una lista de todas las variantes que tenían el porcentaje de inhibición mayor que 2 desviaciones típicas por encima de la media de todas las variantes sometidas a ensayo. La FIG. 21B muestra todas las variantes que tenían actividad significativa en cualquiera de los cuatro donantes. La mejor mutación puntual identificada fue T100V con un porcentaje de inhibición de 53 +/-10%. La segunda mejor fue V95W con un promedio de 47%. La mejor variante fuera de la CDR3 de VH fue R30 de VL con dos sustituciones de aminoácidos variantes con un porcentajemedio de 23%.

Se crearon variantes de combinación basándose en los datos correspondientes a las variantes individuales. Se construyeron combinaciones que contenían cambios tanto en VH como en VL, incorporando en algunos casos las sustituciones en una VL variante que tenía las sustituciones G28S y A34S en CDR-L1 (numeración de Kabat), correspondiente a la combinación G5 + A11S en CDR-L1 como se describe inicialmente en el documento WO 2010/121140. La cadena principal de VL variante con las sustituciones G5 + A11S se denomina en la presente memoriaVL-SS.Los anticuerpos variantesse expresaron yse purificaron ysesometieron a ensayo enel análisis de inhibición ADAb, y en los análisis de afinidad de unión de TNF-α. Los resultados para determinar la unión de ADAb se promediaron para más de 2 donantes. La unión se evaluó a través de las pruebas de resonancia de plasmón superficial (Biacore). Los resultados se muestran en la Figura 22. Las variantes Y32K/SS-R30T y Y32K/SS-R30I mostraron lamejorcombinaciónde reducciónde unión de ADAyconservaron la afinidad anti-TNFalfa.

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Claims

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