ES2621919T3 - Nuevos genes de resistencia a herbicidas - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína que degrada enzimáticamente una subestructura química de ariloxialcanoato de un herbicida de ariloxialcanoato, en donde dicho polinucleótido está operativamente unido a un promotor de planta o un promotor de virus de planta, y en donde una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína hibrida en condiciones restrictivas con el complemento entero de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, y en donde la proteína es capaz de degradar herbicidas auxínicos de fenoxiacetato y piridiloxiacetato.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos genes de resistencia a herbicidas Antecedentes de la invencion

Las malas hierbas pueden agotar rapidamente el suelo de nutrientes valiosos necesarios para cultivos y otras plantas deseables. Hay muchos tipos diferentes de herbicidas usados actualmente para el control de las malas hierbas. Un herbicida extremadamente popular es el glifosato.

Se han desarrollado cultivos, tales como ir^z, soja, canola, algodon, remolacha azucarera, trigo, cesped y arroz, que son resistentes al glifosato. Por lo tanto, los campos con, por ejemplo, sojas resistentes al glifosato que crecen activamente, se pueden pulverizar para controlar las malas hierbas sin danar las plantas de soja.

Con la introduccion de cultivos tolerantes al glifosato (GTC) modificados geneticamente a mediados de la decada de 1990, se proporciono a los cultivadores una herramienta sencilla, conveniente, flexible y barata para controlar una amplia variedad de malas hierbas de hoja ancha y maleza incomparable en agricultura. Por consiguiente, los productores adoptaron rapidamente los GTC y en muchos casos abandonaron muchas de las practicas agronomas mejor aceptadas tales como la rotacion de cultivos, rotacion del modo de accion de herbicidas, mezcla en deposito, incorporacion de control de las malas hierbas mecanico con qmmico y de cultivo. Actualmente, la soja, algodon, mafz y canola tolerantes al glifosato estan disponibles en el comercio en Estados Unidos y en cualquier parte del hemisferio occidental. La alfalfa fue el primer GTC perenne introducido, impulsando la oportunidad del uso repetido del glifosato en el mismo cultivo y campos repetidamente a lo largo de un periodo de anos. Muchos GTC (p. ej., trigo, arroz, remolacha azucarera, cesped, etc.) estan listos para la introduccion pendientes de la aceptacion del mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato estan en etapas de desarrollo experimentales (p. ej., cana de azucar, girasol, remolacha, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el alamo y liquidambar; y especies horffcolas como calendula, petunia y begonias; vease el sitio en la red "isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005"). Ademas, el coste del glifosato se ha reducido drasticamente en anos recientes hasta el punto de que pocos programas de control de malas hierbas convencionales pueden competir eficazmente en precio y rendimiento con los sistemas de GTC de glifosato.

El glifosato se ha usado satisfactoriamente en zonas de efecto de quemado y en otras no cultivadas para el control total de la vegetacion durante mas de 15 anos. En muchos casos, como con los GTC, el glifosato se ha usado 1-3 veces al ano durante 3, 5, 10, hasta 15 anos en una lmea de cultivo. Estas circunstancias han conducido a una excesiva dependencia del glifosato y la tecnologfa del GTC y han impuesto una fuerte presion de seleccion sobre las especies nativas de malas hierbas para plantas que son naturalmente mas tolerantes al glifosato o que han desarrollado un mecanismo para resistir la actividad herbicida del glifosato.

El uso extensivo de programas de control de malas hierbas solo con glifosato esta dando como resultado la seleccion de malas hierbas resistentes al glifosato, y esta seleccionando la propagacion de especies de malas hierbas que son inherentemente mas tolerantes al glifosato que la mayona de las especies objetivo (es decir, desplazamiento de malas hierbas).

Aunque el glifosato se ha usado ampliamente globalmente durante mas de 15 anos, solo se ha descrito un punado de malas hierbas que han desarrollado resistencia al glifosato; sin embargo, la mayona de estas se han identificado en los ultimos cinco anos. Las malas hierbas resistentes incluyen tanto especies de hierbas como de hoja ancha, Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Sorghum halepense, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensi, Conyza bonariensis, Plantago lanceolata, Amaranthus palmerii. y Amaranthus rudis. Ademas, malas hierbas que previamente no han sido un problema agncola antes del amplio uso de los GTC ahora se estan convirtiendo en mas prevalentes y diffciles de controlar en el contexto de los GTC, que comprende >80% de los acres de algodon y soja en EE.UU. y >20% de acres de mafz en EE.UU. Estos desplazamientos de malas hierbas se estan produciendo predominantemente con (pero no exclusivamente) malas hierbas de hoja ancha diffciles de controlar. Algunos ejemplos incluyen especies Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum, y Commelina.

En zonas donde los agricultores se enfrentan a malas hierbas resistentes al glifosato o a un desplazamiento a especies de malas hierbas mas diffciles de controlar, los agricultores compensan la debilidad del glifosato con mezclas en tanque o alternando con otros herbicidas que controlaran las malas hierbas que faltaban. Una pareja de mezcla en tanque popular y eficaz para controlar las de hoja ancha que se escapan en muchos casos, es el acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D). El 2,4-D se ha usado en situaciones agncolas y que no son de cultivos para el control de malas hierbas de hoja ancha de amplio espectro, durante mas de 60 anos. Se han descrito casos individuales de especies mas tolerantes, pero el 2,4-D sigue siendo uno de los herbicidas mas ampliamente usado globalmente. Una limitacion para el uso adicional del 2,4-D es que su selectividad en cultivos de dicotiledoneas como la soja y el algodon, es muy mala, y por lo tanto el 2,4-D no se usa ffpicamente (y en general no cerca) de cultivos de dicotiledoneas sensibles. Ademas, el uso de 2,4-D en cultivos de forrajes es algo limitado por la naturaleza del dano que se puede producir al cultivo. El 2,4-D en combinacion con el glifosato se ha usado para proporcionar un tratamiento de efecto quemado robusto antes de plantar soja y algodon en siembra directa; sin embargo, debido a la sensibilidad de estas especies dicotiledoneas al 2,4-D, estos tratamientos de efecto quemado

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deben hacerse al menos 14-30 d^as antes de plantacion.

El 2,4-D es de la clase de herbicidas de acido tipo fenoxi, como el MCPA. El 2,4-D se ha usado en muchos cultivos de monocotiledoneas (tales como ir^z, trigo y arroz) para el control selectivo de las malas hierbas de hoja ancha sin danar gravemente las plantas del cultivo deseado. El 2,4-D es un derivado de auxina sintetica que actua para desregular la homeostasis de hormonas celulares naturales e impide el crecimiento controlado, equilibrado; sin embargo, el modo de accion exacto todavfa no se conoce. Triclopir y fluroxipir son herbicidas de tipo acido piridiloxiacetico cuyo modo de accion es tambien como una auxina sintetica.

Estos herbicidas tienen niveles diferentes de selectividad en algunas plantas (p. ej., las dicotiledoneas son mas sensibles que los forrajes). El diferente mecanismo por plantas diferentes es una explicacion de los variados niveles de selectividad. En general, las plantas metabolizan el 2,4-D lentamente, de modo que la diferente respuesta de las plantas al 2,4-D se puede explicar mas probablemente por la diferente actividad en el o los sitios activos (WSSA, 2002). El metabolismo del 2,4-D de las plantas tipicamente se produce por un mecanismo en dos fases, tipicamente hidroxilacion seguido de conjugacion con aminoacidos o glucosa (WSSA, 2002).

A lo largo del tiempo, las poblaciones microbianas han desarrollado una ruta alternativa y eficaz para la degradacion de este xenobiotico particular, que da como resultado la mineralizacion completa del 2,4-D. Las aplicaciones sucesivas del herbicida seleccionan microbios que pueden usar el herbicida como una fuente de carbono para el crecimiento, dandoles una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razon, el 2,4-D actualmente formulado tiene una semivida en el suelo relativamente corta, y no se han encontrado efectos significativos de transferencia a cultivos posteriores. Esto se suma a la utilidad herbicida del 2,4-D.

Un organismo que se ha investigado extensamente por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha. El gen que codifica la primera etapa enzimatica en la ruta de mineralizacion es tfdA. Vease la patente de EE.UU. n°. 6.153.40l y n° de acceso en GENBANK M16730. TfdA cataliza la conversion del acido 2,4-D en diclorofenol (DCP) por una reaccion de dioxigenasa dependiente de cetoglutarato. El DCP tiene poca actividad herbicida comparado con el 2,4-D. Se ha usado TfdA en plantas transgenicas para impartir resistencia al 2,4-D en plantas dicotiledoneas (p. ej., algodon y tabaco) normalmente sensibles al 2,4-D.

Se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protemas capaces de degradar el 2,4-D del entorno y se han depositado en la base de datos Genbank. Muchos homologos son similares a tfdA (>85% de identidad de aminoacidos) y tienen propiedades enzimaticas similares al tfdA. Sin embargo, hay una serie de homologos que tienen una identidad significativamente menor con el tfdA (25-50%), aunque todavfa tienen los restos caractensticos asociados con la a-cetoglutarato dioxigenasa de las dioxigenasas de Fe2+. Por lo tanto, no es obvio cuales son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes.

Un ejemplo unico de homologfa baja con tfdA (35% de identidad de aminoacidos) es sdpA de Sphingobium herbicidovorans

Se ha mostrado que esta enzima cataliza la primera etapa en (S)-dicloroprop (y otros acidos (S)-fenoxipropionico) asf como en la mineralizacion del 2,4-D (un acido fenoxiacetico).

La transformacion de este gen en plantas no se ha descrito hasta ahora.

El desarrollo de nuevas tecnologfas de cultivos tolerantes a herbicida (HTC) ha tenido un exito limitado debido en gran medida a la eficacia, bajo coste y conveniencia de los GTC. Por consiguiente, se ha producido una tasa muy alta de aceptacion de GTC entre los productores. Esto crea poco incentivo para el desarrollo de nuevas tecnologfas de HTC.

Las subestructuras qmmicas de ariloxialcanoato son una entidad comun de muchos herbicidas comercializados que incluyen auxinas de fenoxiacetato (tales como 2,4-D y diclorprop), auxinas de piridiloxiacetato (tales como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP) inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (tales como haloxifop, quizalofop, y diclofop), y fenoxiacetatos 5-sustituidos inhibidores de protoporfirinogeno oxidasa IX (tales como piraflufen y flumiclorac). Sin embargo, esta clase de herbicidas son todos bastante distintos, y no existen pruebas en la bibliograffa actual de rutas de degradacion comunes entre estas clases de compuestos qmmicos. Recientemente se ha descrito una enzima multifuncional para la degradacion de herbicidas de cubre multiples modos de accion, en el documento WO/2005/107437; presentado el 2 de mayo, 2005). Se describen en lo sucesivo otra enzima multifuncional unica y sus usos potenciales.

Kohler HPE, "Sphingomonas herbicidovorans MH: A versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader", Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, (1999), vol. 23, no. 4-5, paginas 336-340, se refiere a Sphingomonas herbicidovorans MH: un degradador de herbicida de acido fenoxialcanoico versatil, y describe el aislamiento de Sphingomonas herbicidovorans MH de una columna de suelo que se degrada con diclorprop que es capaz de crecer en herbicidas de acido fenoxialcanoico, tales como mecoprop, diclorprop, 2,4-D, MCPA, y 2,4-DB. Se describe ademas que la cepa MH usa ambos enantiomeros de los herbicidas quirales mecoprop y diclorprop como la unica fuente de carbono y energfa. Los sistemas de absorcion espedficos de enantiomero son responsables del transporte de sustratos acido a traves de la membrana celular. El catabolismo es inhibidor por dos dioxigenasas dependientes

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de alfa-cetoglutarato espedficas de enantiomero que catalizan la escision del enlace eter del respectivo enantiomero para dar el correspondiente fenol y piruvato. Por lo tanto, la degradacion selectiva de los enantiomeros de mecoprop y diclorprop por la cepa MH no se debe solamente al catabolismo selectivo sino tambien al transporte enantioselectivo.

Schleinitz et al. "Localization and characterization of two novel genes encoding stereospecific dioxygenases catalyzing 2(2,4-dichlorophenoxy)propionate cleavage in Delftia acidovorans MC1", Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, vol. 70, no. 9, pagina 5357 - 5365, describe la localizacion y caracterizacion de dos nuevos genes, rdpA y sdpA, que codifican dioxigenasas estereoespedficas que catalizan la escision de 2-(2,4-diclorofenoxi)propionato en Delftia acidovorans MC1.

Muller T.A. et al. "Genetic Analysis of Phenoxyalkanoic Acid Degradation in Sphingomonas herbicidovorans MH" Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, vol. 70, no. 10, pagina 6066-6075, se refiere al analisis genetico de la degradacion del acido fenoxialcanoico en Sphingomonas herbicidovorans MH y describe el aislamiento de varios genes implicados en la degradacion de diclor- y mecoprop de la alfaproteobacteria Sphingomonas herbicidovorans MH. Se encontraron dos genes de las dioxigenasas dependientes de a- cetoglutarato, sdpAMH y rdpAMH, los cuales eran ambos adyacentes a secuencias con potenciales elementos de insercion. Ademas, se aislaron un gen para la diclorofenol hidroxilasa (tfdB), un gen regulador putativo (cadR), dos genes para las diclorocatecol 1,2-dioxigenasas (dccAI/II), dos para dienolactona hidrolasas (dccDI/II), parte de un gen para la maleilacetato reductasa (dccE), y un gen para una potencial acido fenoxialcanoico permeasa. El analisis de estos genes sugiere un reservorio diferente y transferencia reducida para los genes de la ruta de escision orto modificada en Alfaprotecobacterias comparado con las Beta y Gammaproteobacterias.

La patente de Estados Unidos 5.925.806 se refiere a la expresion controlada de construcciones transgenicas en plastos de plantas y describe composiciones y metodos utiles para ingeniena genetica de celulas de plantas controlando el patron de tiempo o tejido de la expresion de secuencias de ADN extranas insertadas en el genoma de plastos de plantas. Las construcciones incluyen las de transformacion nuclear que proporcionan expresion de una sola subunidad de ARN polimerasa vmca en tejidos de celulas vegetales, y las de dirigirse a la protema polimerasa expresada en los plastos de celulas vegetales. Ademas, se proporcionan construcciones de expresion de plastos que comprenden una region de promotor de gen vmco que es espedfica para la ARN polimerasa expresada a partir de las construcciones descritas, y una secuencia de ADN de interes que se va a expresar en las celulas de plasto transformadas.

Breve resumen de la invencion

La presente invencion proporciona nuevas plantas que no solo son resistentes al 2,4-D, sino tambien a herbicidas de piridiloxiacetato. Hasta la fecha, no se ha esperado o sugerido que una planta con ambas propiedades ventajosas se pudiera producir mediante la introduccion de un solo gen. La presente invencion tambien incluye plantas que producen una o mas enzimas de la presente invencion “apiladas” junto con uno o mas de otros genes de resistencia a herbicidas, que incluyen, pero no se limitan a genes de resistencia al glifosato, ALS (imidazolinona, sulfonilurea), ariloxialcanoato, HPPD, PPO, y glufosinato, para asf proporcionar plantas tolerantes a herbicidas compatibles con las opciones de control de malas hierbas mas amplio y mas consistente y gestion de la resistencia a herbicidas. La presente invencion incluye ademas metodos y composiciones que usan homologos de los genes y protemas ejemplificados en la presente memoria.

En algunas realizaciones, la invencion proporciona plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas tolerantes al 2,4-D, MCPA, fluoroxipir, y uno o mas herbicidas disponibles en el mercado (p. ej., glifosato, glufosinato, paraquat, inhibidores de ALS (p. ej., sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina sulfonanilidas, y otros), inhibidores de HPPD (p. ej., mesotona, isoxaflutol, y otros), dicamba, bromoxinil, ariloxifenoxipropionatos, y otros). Tambien se describen vectores que comprenden secuencias de acido nucleico responsables de dicha tolerancia a herbicidas, asf como metodos de uso de dichas plantas tolerantes y combinaciones de herbicidas para el control de malas hierbas y la prevencion de desplazamientos de poblacion de malas hierbas. La presente invencion permite nuevas combinaciones de herbicidas para usar de formas nuevas.

La presente invencion permite nuevos usos de nuevas combinaciones de herbicidas y cultivos, que incluyen aplicacion preplantacion en una zona en la que se va a plantar, inmediatamente antes de plantar con semillas, para plantas que de lo contrario senan sensibles a ese herbicida (tal como 2,4-D).

La presente invencion se refiere en parte a la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4- D, sino que sorprendentemente tambien tiene nuevas propiedades, que distinguen la enzima de la presente invencion de protemas de tipo tfdA previamente conocidas, por ejemplo. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere al uso de una enzima que es capaz de degradar tanto el 2,4-D como herbicidas de piridiloxiacetato. No se ha descrito previamente una enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la capacidad de degradar herbicidas auxmicos de fenoxiacetato y piridiloxiacetatos. La enzima y gen preferidos para usar de acuerdo con la presente invencion se denominan en la presente memoria AAD-13 (ariloxialcanoato dioxigenasa). Este descubrimiento muy novedoso es la base del importante rasgo del cultivo tolerante a herbicida (HTC) y oportunidades de marcadores seleccionables. Las plantas de la presente invencion pueden ser resistentes a lo largo

de todo su ciclo de vida.

No hada motivacion previa para producir plantas que comprendieran el gen AAD-13 (preferiblemente un polinucleotidos de AAD-13 que tiene una secuencia optimizada para la expresion en uno o mas tipos de plantas, como se ilustra en la presente memoria), y no se esperaba que dichas plantas pudieran producir eficazmente una 5 enzima AAD-13 para hacer a las plantas resistentes a un herbicida de acido fenoxiacetico (tal como 2,4-D) y/o uno o mas herbicidas de piridiloxiacetatos tales como triclopir y fluroxipir. Por lo tanto, la presente invencion proporciona muchas ventajas que hasta ahora no se pensaba que fueran posibles en la tecnica.

La invencion tambien se refiere en parte a la identificacion y uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa que son capaces de degradar herbicidas auxmicos de fenoxiacetato y/o auxmicos de piridiloxiacetatos.

10 Por lo tanto, la presente invencion incluye la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico y otros herbicidas auxmicos de ariloxialcanoato por la enzima AAD-13 expresada de forma recombinante.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 ilustra la reaccion qmmica general que es catalizada por las enzimas AAD-13 de la presente invencion.

La figura 2 es un alineamiento por ClustalW de a-cetoglutarato dioxigenasas. Los restos conservados en 80% de las 15 secuencias estan marcados. (Estan marcados restos identicos y similares).

La figura 3 ilustra la rotura concomitante del a-cetoglutarato y el sustrato de interes por la AAD-13.

Breve descripcion de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleotidos natural de AAD-13 de Sphingobium herbicidovorans.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de protema traducida codificada por la SEQ ID NO: 1.

20 SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleotidos optimizada para planta de AAD-13 (v1).

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de protema traducida codificada por la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleotidos optimizada para E. coli de AAD-13 (v2).

SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia del cebador "sdpacodF" de AAD-13 (v1).

SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia del cebador "sdpacodR" AAD-13 (v1).

25 SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia del cebador "sucCD".

SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia del cebador "sucCD".

SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia del cebador AAD-13 (v2).

SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia del cebador AAD-13 (v2).

Descripcion detallada de la invencion

30 El presente desarrollo de un gen de resistencia al 2,4-D y los posteriores cultivos resistentes, proporcionan excelentes opciones para controlar especies de malas hierbas de hoja ancha, resistentes al glifosato (o muy tolerantes y desplazadas) para aplicaciones en cultivo. El 2,4-D es un herbicida de hoja ancha de amplio espectro, relativamente barato y fuerte, que proporcionana una excelente utilidad a los agricultores si se pudiera proporcionar mayor tolerancia del cultivo en cultivos de dicotiledoneas y monocotiledoneas igualmente. Los cultivos de 35 dicotiledoneas transgenicas tolerantes al 2,4-D tambien tendnan una mayor flexibilidad en el tiempo y tasa de aplicacion. Una utilidad adicional del presente rasgo de tolerancia al herbicida para el 2,4-D es su utilidad para prevenir el dano a cultivos normalmente sensibles por la deriva del 2,4-D, volatilizacion, inversion (u otro fenomeno de movimiento fuera de sitio), mala aplicacion, vandalismo y similares. Un beneficio adicional del gen AAD-13 es que a diferencia de todos los homologos de tfdA caracterizados hasta la fecha, el AAD-13 es capaz de degradar las 40 auxinas de piridiloxiacetatos (p. ej., fluroxipir) ademas de auxinas de fenoxi aquirales (p. ej., 2,4-D, MCPA, acido 4- clorofenoxiacetico). Vease la tabla 1. Se muestra en la figura 1 una ilustracion general de las reacciones qmmicas catalizadas por la presente enzima AAD-13. (La adicion de O2 es estereoespedfica; la rotura del compuesto intermedio a fenol y glioxilato es espontanea). Debe entenderse que las estructuras qmmicas en la figura 1 ilustran las cadenas principales moleculares y que estan incluidos diferentes grupos R y similares (tales como los mostrados 45 en la tabla 1) pero no se ilustran necesariamente espedficamente en la figura 1. Se han usado globalmente multiples mezclas de diferentes combinaciones de auxinas de fenoxi para abordar espectros de malas hierbas espedficos y condiciones medioambientales en diferentes regiones. El uso del gen AAD-13 en plantas proporciona proteccion a un espectro mucho mas amplio de herbicidas auxmicos, aumentando asf la flexibilidad y el espectro de malas hierbas que se pueden controlar. La presente invencion tambien se puede usar para proteger de la deriva u

otros danos del herbicida auxmico sintetico fuera de sitio para toda la variedad de auxinas de fenoxi disponibles en el mercado. La tabla 1 define auxinas de piridiloxi y fenoxi disponibles en el comercio y proporciona las estructuras qmmicas relevantes.

Tabla 1. Auxinas de fenoxiacetato y piridiloxiacetato. En general la referencia a los herbicidas auxmicos de fenoxi y auxmicos de piridiloxi se hacen del acido activo, pero algunos estan formulados comercialmente como una variedad de las formulaciones del correspondiente ester y estas se consideran igualmente como sustratos para la enzima AAD-13 en la planta, ya que las esterasas de plantas generales convierten estos esteres en acidos activos en la planta. Igualmente, la referencia tambien puede ser para la correspondiente sal organica o inorganica del correspondiente acido. Los intervalos detasa de uso posibles pueden ser tratamientos autonomos o en combinacion con otros herbicidas tanto en usos de cultivos como de no cultivos.

Nombre

qmmico

N° CAS

Posibles intervalos de tasa de uso (g ea/ha)

Intervalos de tasa de uso preferidos (g ea/ha)

Estructura

2,4-D

94-75-7

25-4000

280-1120

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2,4,5-T

93-76-5

25-4000

25-4000

imagen2

4-CPA

122-88-3

25-4000

25-4000

imagen3

3,4-DA

588-22-7

25-4000

25-4000

imagen4

MCPA

94-74-6

25-4000

125-1550

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Triclopir

55335-06-3

50-2000

70 - 840

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Fluroxipir

69377-81-7

25 - 2000

35-560

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Ahora se ha identificado un solo gen (AAD-13) que, cuando esta geneticamente modificado para la expresion en plantas, tiene las propiedades de permitir el uso de herbicidas auxmicos de fenoxi en las plantas donde nunca ha^a existido tolerancia inherente o no era suficientemente alta para permitir el uso de estos herbicidas. Ademas, AAD-13 puede proporcionar proteccion en la planta frente a herbicidas de piridiloxiacetato donde la tolerancia natural tampoco era suficiente para permitir selectividad, expandiendo la potencial utilidad de estos herbicidas. Las plantas que contienen AAD-13 solo ahora se pueden tratar de forma secuencial o mezclados en tanque con uno, dos o una combinacion de varios herbicidas auxmicos de fenoxi. La tasa para cada herbicida auxmico de fenoxi puede estar en el intervalo de 25 a 4000 g ea/ha, y mas tfpicamente de 100 a 2000 g ea/ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledoneas. Igualmente, se puede aplicar uno, dos o una mezcla de varios compuestos auxmicos de piridiloxiacetato a las plantas que expresan AAD-13 con mejor riesgo de dano de dichos herbicidas. La tasa para cada herbicida de piridiloxiacetato puede estar en el intervalo de 25 a 2000 g ea/ha, y mas tfpicamente 35-840 g ea/ha para el control de malas hierbas dicotiledoneas adicionales.

El glifosato se usa extensamente porque controla un espectro muy amplio de especies de malas hierbas de hoja ancha y hierbas. Sin embargo, el uso repetido del glifosato en GTC y en aplicaciones no de cultivo selecciona, y continuara seleccionando por los desplazamientos de malas hierbas a especies mas tolerantes de forma natural o biotipos resistentes al glifosato. Las parejas de herbicidas de las mezclas en tanque usados con tasas eficaces que ofrecen el control de la misma especie, pero tienen diferentes modos de accion, se prescriben para estrategias de gestion de mas resistencia herbicida como un metodo para retrasar la aparicion de malas hierbas resistentes. El apilamiento del AAD-13 con un rasgo de tolerancia al glifosato (y/o con otros rasgos de tolerancia a herbicidas) podna proporcionar un mecanismo que permite el control de especies de malas hierbas dicotiledoneas resistentes al glifosato en GTC, permitiendo el uso de glifosato, auxina(s) de fenoxi (p. ej., 2,4-D) y herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato (p. ej., fluroxipir) de forma selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podna ser simultaneamente en una mezcla en tanque que comprende dos o mas herbicidas de diferentes modos de accion; aplicaciones individuales de una sola composicion herbicida en aplicaciones secuenciales como preplantacion, pre- brotacion o post-brotacion y divididas en el tiempo, en el intervalo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 meses; o alternativamente, se puede aplicar cualquier combinacion de cualquier numero de herbicidas que represente cada uno una clase qmmica en cualquier momento en el plazo de aproximadamente 7 meses de la plantacion del cultivo hasta la recoleccion del cultivo (o el intervalo previo a la recoleccion para el herbicida individual, el que sea mas corto).

Es importante tener flexibilidad en el control de un amplio espectro de hierbas y malas hierbas de hoja ancha en terminos de epoca de aplicacion, tasa de los herbicidas individuales y la capacidad para controlar malas hierbas diffciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo con un apilamiento de gen de resistencia al glifosato/AAD-13 pueden estar en el intervalo de 250-2500 g ea/ha; el o los herbicidas auxmicos de fenoxi (uno o mas) se podnan aplicar desde 25-4000 g ea/ha; y el o los herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato (uno o mas) se podnan aplicar desde 25-2000 g ea/ha. La o las combinaciones optimas y la epoca de esta o estas aplicaciones dependeran de la situacion particular, especie y entorno, y lo determinara mejor un experto en la tecnica de control de malas hierbas y que tiene el beneficio de la presente descripcion.

Los plantones tfpicamente son resistentes durante todo el ciclo de crecimiento. Las plantas transformadas tfpicamente seran resistentes a una nueva aplicacion de herbicida en cualquier momento en que el gen sea expresado. Se muestra tolerancia al 2,4-D en la presente memoria a lo largo del ciclo de vida usando los promotores consecutivos ensayados hasta ahora (principalmente CsVMV y AtUbi 10). Tfpicamente se podna esperar esto, pero es una mejora frente a otras actividades no metabolicas donde puede tener un impacto importante en la tolerancia la expresion reducida de un sitio de mecanismo de accion de resistencia, por ejemplo. Un ejemplo es el algodon Roundup Ready, donde las plantas eran tolerantes si se pulverizaban temprano, pero si se pulverizaban demasiado tarde el glifosato se concentraba en los meristemos (porque no es metabolizado y es translocado); los promotores vmcos que usaba Monsanto no se expresan bien en las flores. La presente invencion proporciona una mejora en relacion con esto.

Las formulaciones herbicidas (p. ej., formulacion de ester, acido o sal; o concentrado soluble, concentrado emulsionable, o lfquido soluble) y aditivos de mezcla en tanque (p. ej., adyuvantes, tensioactivos, retardantes de deriva o agentes de compatibilidad) pueden afectar significativamente al control de las malas hierbas de un herbicida dado o combinacion de uno o mas herbicidas. Cualquier combinacion de estos con cualquiera de los productos qrnmicos herbicidas mencionados antes esta dentro del alcance de esta invencion.

Un experto en la tecnica tambien vera el beneficio de combinar dos o mas modos de accion para aumentar el espectro de las malas hierbas controladas y/o para el control de especies de malas hierbas naturalmente mas tolerantes o resistentes. Esto podna extenderse tambien a las sustancias qrnmicas para las que la tolerancia a los herbicidas es posible en los cultivos a traves de la participacion humana (sea de forma transgenica o no transgenica) mas alla de los GTC. De hecho, los rasgos que codifican la resistencia al glifosato (p. ej., planta resistente o EPSPS bacterianas (incluyendo cepa CP4 de Agro.), glifosato oxidorreductasa (GOX), GAT), resistencia al glufosinato (p. ej., Pat, bar), resistencia a herbicida que inhibe la acetolactato sintasa (ALS) (p. ej., imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, y otras sustancias qrnmicas = AHAS, Csr1, SurA, y otros), resistencia a bromoxinilo (p. ej., Bxn), resistencia a inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato- dioxigenasa), resistencia a inhibidores de la fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas que inhiben el

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fotosistema II (p. ej., psbA), resistencia a herbicidas que inhiben el fotosistema I, resistencia a herbicidas que inhiben la protoporfirinogeno oxidasa IX (PPO) (p. ej., PPO-1), resistencia a herbicidas de fenilurea (p. ej., CYP76B1), enzimas degradadoras de dicamba (vease, p. ej., US 20030135879), y otras se podnan apilar solos o en multiples combinaciones para proporcionar la capacidad de controlar eficazmente o prevenir el cambio de malas hierbas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases mencionadas antes. La EPSPS modificada in vivo se puede usar en algunas realizaciones preferidas, asf como los genes de resistencia al glifosato de clase I, Clase II y Clase III.

En relacion con herbicidas adicionales, algunos inhibidores de ALS preferidos adicionales incluyen, pero no se limitan a sulfonilureas (tales como clorsulfuron, halosulfuron, nicosulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron), imidazoloninonas (tales como imazamox, imazetapir, imazaquin), triazolopirimidina sulfonanilidas (tales como cloransulam-metilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (tales como bispiribac y piritiobac), y flucarbazona. Algunos inhibidores de la HPpD preferidos incluyen, pero no se limitan a mesotriona, isoxaflutol y sulcotriona. Algunos inhibidores de la PPO preferidos incluyen, pero no se limitan a flumiclorac, flumioxazin, flufenpir, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazona, sulfentrazona, y los eteres difemlicos (tales como acifluorfen, fomesafen, lactofen, y oxifluorfen).

Adicionalmente, AAD-13 solo o apilado con uno o mas rasgos de HTC adicionales, se puede apilar con uno o mas rasgos agronomicos adicionales (p. ej., resistencia a insectos, resistencia fungica o tolerancia al estres, y otros) o rasgos de calidad (p. ej., mayor rendimiento, mejor perfil de aceites, mejor calidad de la fibra y otros). Por lo tanto, la presente invencion se puede usar para proporcionar un paquete agronomico completo de mejor calidad del cultivo con la capacidad de control flexible y economico de cualquier numero de plagas agronomicas.

La presente invencion se refiere en parte a la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4- D, sino que tambien tiene sorprendentemente nuevas propiedades, que distinguen la enzima de la presente invencion de protemas tfdA previamente conocidas, por ejemplo. Incluso aunque esta enzima tiene homologfa muy baja con tfdA, los genes de la presente invencion todavfa se pueden clasificar en general en la misma familia global de dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato. Esta familia de protemas se caracteriza portres restos de histidina conservados en un motivo "HX(D/E)X23-26(T/S)Xii4-i83HXio-i3R" que comprende el sitio activo. Las histidinas se coordinan con el ion Fe+2 en el sitio activo que es esencial para la actividad catalftica (Hogan et al., 2000). Los experimentos de expresion in vitro preliminares descritos en la presente memoria se disenaron para ayudar a seleccionar nuevas caractensticas. Estos experimentos tambien indican que la enzima AAD-i3 es unica frente a otra enzima distinta de la misma clase, descrita en la solicitud de patente presentada previamente (WO/2005/i07437; presentada el 2 de mayo, 2005). La enzima AAD-i de esta solicitud comparte solo aproximadamente 25% de identidad de secuencia con la presente protema AAD-i3.

Mas espedficamente, la presente invencion se refiere en parte al uso de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino tambien herbicidas de piridiloxiacetato. No se ha descrito previamente una enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato, aparte de las enzimas identificada previamente AAD-i y AAD-i2 (objeto de las solicitudes de patente PCT US/2005/0i4737 (WO 2005/i07437) y WO 2007/053482, respectivamente), que tenga la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases qmmicas con diferentes modos de accion. Las enzimas y genes preferidos para usar de acuerdo con la presente invencion se denominan en la presente memoria genes y protemas AAD-i3 (ariloxialcanoato dioxigenasa).

Esta invencion tambien se refiere en parte a la identificacion y uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa que son capaces de degradar herbicidas auxmicos de fenoxi y piridiloxiacetato. Por lo tanto, la presente invencion se refiere, en parte, a la degradacion de herbicidas de acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros acidos fenoxiaceticos y acido piridiloxiacetico mediante una enzima AAD-i3 expresada de forma recombinante.

Las presentes protemas dieron ensayo positivo para la conversion del 2,4-D en 2,4-diclorofenol (“DCP”; herbicidamente inactivo) en ensayos analtticos. Protemas parcialmente purificadas de la presente invencion pueden convertir rapidamente el 2,4-D en DCP in vitro. Una ventaja adicional que proporcionan las plantas transformadas con AAD-13 es que el o los herbicidas originales son metabolizados a formas inactivas, reduciendo asf el potencial de recogida de restos herbicidas en el grano o restos de la recoleccion.

A la luz de estos descubrimientos, ahora se proporcionan nuevas plantas que comprenden un polinucleotido que codifica este tipo de enzima. Hasta ahora, no hada motivacion para producir dichas plantas, y no se esperaba que dichas plantas pudieran producir eficazmente esta enzima para hacer a las plantas resistentes no solo a los herbicidas fenoxiacido (tales como el 2,4-D) sino tambien a los herbicidas de piridiloxiacetato. Por lo tanto, la presente invencion proporciona muchas ventajas que hasta ahora no se pensaba que fueran posibles en la tecnica.

Se pueden adquirir y cribar cepas disponibles al publico (depositadas en colecciones de cultivos tales como ATCC o DSMZ), usando tecnicas descritas en la presente memoria para genes nuevos. Las secuencias descritas en la presente memoria se pueden usar para amplificar y clonar los genes homologos en un sistema de expresion recombinante para el posterior cribado y ensayo de acuerdo con la presente invencion.

Como se ha discutido antes en la seccion de antecedentes, un organismo que se ha investigado ampliamente por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha.

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El gen que codifica la primera enzima en la ruta de degradacion es tfdA. Vease la patente de EE.UU. n° 6.153.401 y n° de acceso en GENBANK M16730. TfdA cataliza la conversion del acido 2,4-D en DCP herbicidamente inactivo por una reaccion de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato. TfdA se ha usado en plantas transgenicas para impartir resistencia al 2,4-D en plantas dicotiledoneas (p. ej., algodon y tabaco) normalmente sensibles al 2,4-D.

Se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protemas capaces de degradar el 2,4-D y se han depositado en la base de datos de NCBI. Muchos homologos son bastante similares a tfdA (>85% de identidad de aminoacidos) y tienen propiedades enzimaticas similares al tfdA. Sin embargo, se identifica ahora una pequena coleccion de homologos de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tienen un nivel bajo de homologfa con tfdA.

La presente invencion se refiere en parte a descubrimientos sorprendentes de nuevos usos y funciones de una enzima relacionada vagamente, sdpA, de Sphingobium herbiciaovorans con homologfa baja con tfdA (35% de identidad de aminoacidos) y homologfa baja con la AAD-1 (27% de identidad de aminoacidos) recien identificada. Esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma natural se ha mostrado previamente que degrada el 2,4-D y S-diclorprop. Sin embargo, no se ha descrito previamente una enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la capacidad de degradar un herbicida selectivo de la clase qmmica de piridiloxiacetato. SdpA (de Sphingabium herbicidovorans) no se ha expresado nunca en plantas, ni habfa ninguna motivacion para hacerlo, en parte porque el desarrollo de nuevas tecnologfas de HTC ha estado limitada debido en gran parte a la eficacia, bajo coste y conveniencia de los GTC.

A la luz de la nueva actividad, las protemas y genes de la presente invencion se denominan en la presente memoria protemas y genes AAD-13. Actualmente se ha confirmado que AAD-13 degrada una variedad de herbicidas auxmicos de fenoxiacetato in vitro. Vease la tabla 5.4.4-1 en el ejemplo 5, mas adelante. Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que esta enzima, como se ha descrito por primera vez en la presente memoria, tambien puede degradar sustratos adicionales de la clase de moleculas de ariloxialcanoato. Los sustratos de importancia agronomica significativa incluyen herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato. Este descubrimiento muy novedoso es la base de importantes oportunidades de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) y rasgos de marcadores seleccionables. Esta enzima es unica en su capacidad para suministrar actividad de degradacion herbicida a un amplio espectro de herbicidas de hoja ancha (auxinas de fenoxiacetato y piridiloxiacetato).

Por lo tanto, la presente invencion se refiere en parte a la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxmicos fenoxiaceticos y herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato, por una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-13) expresada de forma recombinante. Esta invencion tambien se refiere en parte a la identificacion y usos de genes que codifican una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa degradadora (AAD-13) capaz de degradar herbicidas auxmicos de fenoxi y/o piridiloxi.

La presente enzima permite la expresion transgenica que da como resultado las combinaciones de herbicidas que controlanan practicamente todas las malas hierbas de hoja ancha. AAD-13 puede servir como un excelente rasgo de cultivo tolerante a herbicidas (HTC) para apilar con otros rasgos de HTC [p. ej., resistencia a glifosato, resistencia a glufosinato, resistencia al inhibidor de ALS (p. ej., imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida), resistencia a bromoxinilo, resistencia al inhibidor de HPPD, resistencia al inhibidor de PPO, y otros], y rasgos de resistencia a insectos (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, otras protemas Bt, o protemas insecticidas de origen no Bacillis , y otros) por ejemplo. Adicionalmente, AAD-13 puede servir como un marcador seleccionable para ayudar en la seleccion de transformantes primarios de plantas geneticamente modificadas con un segundo gen o grupo de genes.

Ademas, el gen microbiano objeto se ha redisenado de modo que la protema es codificada por codones que tienen un sesgo hacia el uso de plantas tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas (hemicot). Arabidopsis, ir^z, tabaco, algodon, soja, canola y arroz, se han transformado con construcciones que contienen ADD-13 y han demostrado niveles altos de resistencia a los herbicidas auxmicos tanto de fenoxi como de piridiloxi. Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a genes “de plantas optimizados” que codifican protemas de la presente invencion.

Los grupos oxialcanoato son utiles para introducir un grupo funcional estable en herbicidas. El grupo acido puede impartir movilidad al floema por “captura del acido”, una propiedad deseable para la accion herbicida y por lo tanto se podna incorporar en nuevos herbicidas con fines de movilidad. Aspectos de la presente invencion tambien proporcionan un mecanismo para crear HTC. Existen muchos potenciales herbicidas comerciales y experimentales que pueden servir como sustratos para la ADD-13. Por lo tanto, el uso de los genes objeto puede dar como resultado tambien la tolerancia a herbicida a estos otros herbicidas tambien.

Los rasgos de los HTC de la presente invencion se pueden usar en nuevas combinaciones con otros rasgos de HTC (incluyendo, pero no limitado a la tolerancia al glifosato). Estas combinaciones de rasgos dan lugar a nuevos metodos de control de especies de malas hierbas (y similares) debido a la resistencia nueva adquirida o la tolerancia a herbicidas (p. ej. glifosato). Por lo tanto, ademas de los rasgos del HTC, los nuevos metodos para el control de malas hierbas usando herbicidas, para los cuales se ha creado la tolerancia al herbicida por dicha enzima en cultivos transgenicos, estan dentro del alcance de la invencion.

Esta invencion se puede aplicar en el contexto de la comercializacion de un rasgo de resistencia al 2,4-D apilado con

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los rasgos actuales de resistencia al glifosato en sojas, por ejemplo. Por lo tanto, esta invencion proporciona una herramienta para combatir especies de malas hierbas de hoja ancha y/o seleccion de malas hierbas de hoja ancha resistentes a herbicidas, que da fin a la dependencia extremadamente alta de los cultivadores al glifosato para el control de malas hierbas con diversos cultivos.

La expresion transgenica del presente gen ADD-13 se ilustra, por ejemplo, en Arabidopsis y el tabaco. Las sojas son un cultivo preferido para la transformacion de acuerdo con la presente invencion. Sin embargo, esta invencion se puede usar en multiples otras monocotiledoneas (tales como pastos o cesped) y cultivos de dicotiledoneas tales como alfalfa, trebol, especies de arboles, y otros. Igualmente, el 2,4-D (u otros sustratos de la ADD-13) se pueden usar de forma mas positiva en cultivos de hierbas donde la tolerancia es moderada, y el aumento de tolerancia por este rasgo proporcionana a los cultivadores la oportunidad de usar estos herbicidas con tasas mas eficaces y a lo largo de una temporada de aplicacion mas amplia sin el riesgo de danar el cultivo.

Ademas tambien, la presente invencion proporciona un solo gen que puede proporcionar resistencia a herbicidas que controlan las malas hierbas de hoja ancha. Este gen se puede usar en multiples cultivos para permitir el uso de un amplio espectro de combinaciones de herbicidas. La presente invencion tambien puede controlar la resistencia de las malas hierbas a productos qmmicos actuales, y ayudar en el control del cambio de espectro de malas hierbas que resulta de las practicas agncolas actuales. La presente ADD-13 tambien se puede usar en esfuerzos para detoxificar eficazmente sustratos de herbicidas adicionales a formas no herbicidas. Por lo tanto, la presente invencion proporciona el desarrollo de rasgos de HTC adicionales y/o tecnologfa de marcador seleccionable.

Separadamente, o ademas de, el uso de los presentes genes para producir HTC, los presentes genes tambien se pueden usar como marcadores seleccionables para la seleccion satisfactoria de transformantes en cultivos celulares, invernaderos y en el campo. Hay un valor inherente alto para los presentes genes, simplemente como un marcador seleccionable para proyectos de biotecnologfa. La promiscuidad de ADD-13 por otros herbicidas auxmicos de ariloxialcanoato proporciona muchas oportunidades para usar este gen para HTC y/o con fines de marcadores seleccionables.

Protemas (y aislados de fuentes) de la presente invencion. La presente invencion proporciona protemas funcionales. Por “actividad funcional” (o “activa”) se entiende en la presente memoria que las protemas/enzimas para usar de acuerdo con la presente invencion tienen la capacidad de degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinacion con otras protemas). Las plantas que producen protemas de la presente invencion, preferiblemente produciran una “cantidad eficaz” de la protema, de modo que cuando la planta se trata con un herbicida, el nivel de expresion de protema es suficiente para hacer a la planta completa o parcialmente resistente o tolerante al herbicida (con una tasa tfpica, salvo que se especifique otra cosa; las tasas tfpicas de aplicacion se pueden encontrar en el conocido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, 8a edicion, 2002), por ejemplo). El herbicida se puede aplicar con tasas que normalmente matanan la planta objetivo, con tasas y concentraciones de uso de campo normales. (Debido a la presente invencion, el nivel y/o concentracion puede ser opcionalmente mayor que los que se han usado previamente). Preferiblemente, las celulas de plantas y las plantas de la presente invencion estan protegidas frente a la inhibicion del crecimiento o dano causado por el tratamiento con herbicida. Las plantas y celulas de plantas transformadas de la presente invencion, preferiblemente se hacen resistentes o tolerantes a un herbicida, como se describe en la presente memoria, lo que significa que la planta o celulas de planta transformadas pueden crecer en presencia de cantidades eficaces de uno o mas herbicidas descritos en la presente memoria. Las protemas preferidas de la presente invencion tienen actividad catalftica para metabolizar uno o mas compuestos de ariloxialcanoato.

No se puede discutir facilmente el termino “resistencia” y no usar el verbo “tolerar” o el adjetivo “tolerante”. La industria ha pasado innumerables horas debatiendo los cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) frente a los cultivos resistentes a herbicidas (HRC). HTC es un termino preferido en la industria. Sin embargo, la definicion oficial de la Sociedad americana de malherbologfa (Weed Science Society of America) de resistencia es “la capacidad heredada de una planta a sobrevivir y reproducirse despues de exposicion a una dosis de un herbicida normalmente letal para el tipo natural. En una planta, la resistencia se puede encontrar de forma natural o se puede inducir mediante tecnicas tales como modificacion genetica o seleccion de variantes producidas por cultivo de tejido o mutagenesis”. Como se usa en la presente memoria, salvo que se indique otra cosa, la “resistencia” a herbicida es heredable y permite que una planta crezca y se reproduzca en presencia de un tratamiento herbicida eficaz tfpico por un herbicida para una planta dada, como sugiere la edicion actual de The Herbicide Handbook como la presentacion de la presente descripcion. Como reconocen los expertos en la tecnica, una planta todavfa se puede considerar “resistente” incluso aunque sea evidente algun grado de dano en la planta por la exposicion al herbicida. Como se usa en la presente memoria, el termino “tolerancia” es mas amplio que el termino “resistencia” e incluye “resistencia” como se define en la presente memoria, asf como una capacidad mejorada de una planta particular a aguantar los diferentes grados de danos inducidos por herbicida que tfpicamente resultanan en plantas naturales del mismo genotipo con la misma dosis herbicida.

La transferencia de actividad funcional a sistemas vegetales o bacterianos puede implicar una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para una protema de la presente invencion, integrada en un vector de expresion de protemas adecuado para el hospedante en el que residira el vector. Una forma de obtener una secuencia de acido nucleico que codifica una protema con actividad funcional, es aislar el material genetico

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natural de la especie bacteriana que produce la protema de interes, usando informacion deducida de la secuencia de aminoacidos de la protema, como se describe en la presente memoria. Las secuencias naturales se pueden optimizar para la expresion en plantas, por ejemplo, como se describe con mas detalle mas adelante. Un polinucleotido optimizado tambien se puede disenar basandose en la secuencia de protemas.

La presente invencion describe clases de protemas que tienen actividades nuevas identificadas en la presente memoria. Una forma de caracterizar estas clases de protemas y los polinucleotidos que las codifican, es definiendo un polinucleotido por su capacidad para hibridar, en una variedad de condiciones especificadas, con una secuencia de nucleotidos ejemplificada (su complementaria y/o una sonda o sondas derivadas de cualquier cadena) y/o por su capacidad para la amplificacion por PCR usando cebadores obtenidos de estas secuencias ejemplificadas.

Hay una serie de metodos para obtener protemas para usar de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos contra las protemas descritas en la presente memoria para identificar y aislar otras protemas de una mezcla de protemas. Espedficamente, se pueden generar anticuerpos contra partes de las protemas que son las mas conservadas o mas distintas, comparado con otras protemas relacionadas. Despues, estos anticuerpos se pueden usar para identificar espedficamente protemas equivalentes con la actividad caractenstica por inmunoprecipitacion, inmunoensayo de absorcion ligado a enzimas (ELISA), o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra protemas descritos en la presente memoria, o contra protemas equivalentes, o contra fragmentos de esas protemas, se pueden preparar facilmente usando procedimientos convencionales. Dichos anticuerpos son un aspecto de la presente invencion. Los anticuerpos de la presente invencion incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente producidos en respuesta a una protema ejemplificada o sugerida.

Un experto en la tecnica reconocena facilmente que las protemas (y genes) de la presente invencion se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes. Puesto que se sabe codificar operones de degradacion herbicida enteros en elementos transponibles tales como plasmidos, asf como integrarlos genomicamente, las protemas de la presente invencion se pueden obtener a partir de una variedad de microorganismos que incluyen, por ejemplo, bacterias recombinantes y/o naturales.

Los mutantes de aislados bacterianos se pueden hacer por procedimientos que son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden obtener mutantes asporogenos por mutagenesis con etilmetanosulfonato (EMS) de un aislado. Las cepas mutantes tambien se pueden hacer usando luz ultravioleta y nitrosoguanidina por procedimientos bien conocidos en la tecnica.

Una protema “de” o “que se puede obtener de” cualquiera de los presentes aislados a los que se hace referencia o sugeridos en la presente memoria, significa que la protema (o una protema similar) se puede obtener del aislado o algunas otras fuentes, tales como otra cepa bacteriana o una planta. “Derivado de” tambien tiene esta connotacion, e incluye protemas que se pueden obtener de un tipo dado de bacteria que son modificadas por la expresion en una planta, por ejemplo. Un experto en la tecnica reconocera facilmente que, dada la descripcion de un gen bacteriano y protema, se puede modificar geneticamente una planta para producir la protema. Se puede preparar preparaciones de anticuerpos, sondas de acidos nucleicos (ADN, ARN o PNA, por ejemplo) y similares, usando las secuencias de polinucleotido y/o aminoacidos descritas en la presente memoria y usadas para cribar y recuperar otros genes relacionados de otras fuentes (naturales).

Se pueden usar tecnicas de biologfa molecular convencionales para clonar y secuenciar las protemas y genes descritos en la presente memoria. Se puede encontrar informacion adicional en Sambrook et al., 1989, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

Polinucleotidos y sondas. La presente invencion proporciona ademas secuencias de acidos nucleicos que codifican protemas para usar de acuerdo con la presente invencion.

Se describen metodos de identificacion y caracterizacion de genes que codifican protemas que tienen la actividad herbicida. Se describen secuencias de nucleotidos unicas que son utiles como sondas de hibridacion y/o cebadores para tecnicas de PCR. Los cebadores producen fragmentos de genes caractensticos que se pueden usar en la identificacion, caracterizacion y/o aislamiento de genes espedficos de interes. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion codifican protemas que son distintas de las protemas previamente descritas.

Los polinucleotidos de la presente invencion se pueden usar para formar “genes” completos para codificar protemas o peptidos en una celula hospedante deseada. Por ejemplo, como reconocera facilmente el experto en la tecnica, los presentes polinucleotidos se pueden poner adecuadamente bajo el control de un promotor en un hospedante de interes, como se conoce facilmente en la tecnica. El nivel de expresion de genes y la expresion espedfica temporal/tisular puede tener un impacto grande en la utilidad de la invencion. En general, niveles mayores de expresion de protemas de un gen degradante dara como resultado la degradacion mas rapida y mas completa de un sustrato (en este caso un herbicida objetivo). Sera conveniente que los promotores expresen el gen objetivo con niveles altos salvo que la expresion alta tenga un impacto negativo resultante en la salud de la planta. Tfpicamente, se deseana tener el gen ADD-13 expresado de forma constitutiva para la proteccion completa de la planta en todas las etapas de crecimiento. Sin embargo, se podna usar alternativamente un gen de resistencia expresado de forma

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vegetativa; permitina el uso del herbicida objetivo en cultivos para el control de malas hierbas y posteriormente controlana la reproduccion sexual del cultivo objetivo por aplicacion durante la etapa de floracion. Ademas, los niveles y tiempos de expresion deseados tambien pueden depender del tipo de planta y del nivel de tolerancia deseado. Algunas realizaciones preferidas usan promotores constitutivos fuertes combinados con potenciadores de la transcripcion y similares, para aumentar los niveles de expresion y para potenciar la tolerancia a niveles deseados. Algunas de dichas aplicaciones se describen con mas detalle mas adelante, antes de la seccion de ejemplos.

Como conocen los expertos en la tecnica, el ADN tipicamente existe en forma bicatenaria. En esta disposicion, una cadena es complementaria de la otra cadena y viceversa. Cuando el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen cadenas complementarias de ADN adicionales. La “cadena codificante” se usa a menudo en la tecnica para referirse a la cadena que se une con la cadena de sentido contrario. El ARNm se transcribe desde la cadena de “sentido contrario” del ADN. La cadena de “sentido directo” o “codificante” tiene una serie de codones (un codon son tres nucleotidos que se pueden leer como una unidad de tres restos para especificar un aminoacido particular) que se pueden leer como un marco de lectura abierto (ORF) para formar una protema o peptido de interes. Con el fin de producir una protema in vivo, una cadena de ADN tfpicamente se transcribe en una cadena complementaria de ARNm que se usa como molde par ala protema. Por lo tanto, la presente invencion incluye el uso de los polinucleotidos ejemplificados mostrados en la lista de secuencias adjunta y/o equivalentes que incluyen las cadenas complementarias. Los ARN y APN (acidos peptidonucleicos) que son funcionalmente equivalentes a las moleculas de ADN ejemplificadas estan incluidos en la presente invencion.

En una realizacion de la presente invencion, se pueden cultivar aislados bacterianos en condiciones que producen una alta multiplicacion del microbio. Despues de tratar el microbio para proporcionar acido nucleico genomico monocatenario, el ADN se puede poner en contacto con los cebadores de la invencion y someter a amplificacion por la PCR. Los fragmentos caractensticos de los genes de interes se amplificaran por el procedimiento, identificando asf la presencia del o de los genes de interes.

Aspectos adicionales de la invencion incluyen genes y aislados identificados usando los metodos y secuencias de nucleotidos descritos en la presente memoria. Los genes asf identificados pueden codificar protemas de resistencia a herbicidas de la presente invencion.

Las protemas y genes para usar de acuerdo con la presente invencion se pueden identificar y obtener usando sondas de oligonucleotidos, por ejemplo. Estas sondas son secuencias de nucleotidos detectables, que se pueden detectar en virtud de un marcador adecuado o pueden ser inherentemente fluorescentes, como se describe en la solicitud internacional n°WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleotidos de la presente invencion) pueden ser ADN, ARN o APN. Ademas de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), y uracilo (U; para las moleculas de ARN), las sondas sinteticas (y polinucleotidos) de la presente invencion tambien pueden tener inosina (una base neutra que puede emparejarse con las cuatro bases; usada a veces en lugar de una mezcla de las cuatro bases en sondas sinteticas) y/u otras bases sinteticas (no neutras). Por lo tanto, cuando se menciona un oligonucleotido degenerado, sintetico, en la presente memoria, y se usa “N” o “n” de forma generica, “N” o “n” pueden ser G, A, T, C o inosina. Los codigos ambiguos como se usan en la presente memoria estan de acuerdo con los convenios de nomenclatura convencionales de la IUPAC, como se presenta en la presente solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa Co o T; etc.).

Como se conoce bien en la tecnica, si una molecula de sonda hibrida con una muestra de acido nucleico, se puede suponer razonablemente que la sonda y la muestra tienen homologfa/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente, se lleva a cabo primero la hibridacion del polinucleotido seguido de lavados en condiciones de restriccion baja, moderada o alta, por tecnicas bien conocidas en la materia, como se describe, por ejemplo, en Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pag. 169-170. Por ejemplo, como se expone en el mismo, se pueden lograr condiciones de restriccion bajas lavando primero con 2x sSc (citrato salino estandar)/SDS al 0,1% (dodecilsulfato sodico) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se llevan a cabo tfpicamente dos lavados, Se puede lograr una restriccion mayor disminuyendo la concentracion de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, al lavado descrito antes le pueden seguir dos lavados con 0,1x SSC/SDS al 0,1% durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente, seguido de posteriores lavados con 0,1x SSC/SDS al 0,1% durante 30 minutos cada uno a 55°C. Estas temperaturas se pueden usar con otros protocolos de hibridacion y lavado expuestos en la presente memoria, como conoceran los expertos en la tecnica (se puede usar SSPE como la sal en lugar de SSC, por ejemplo). El 2x SSC/SDS al 0,1% se puede preparar anadiendo 50 ml de 20x SSC y 5 ml de SDS al 10% a 445 ml de agua. El 20x SSC se puede preparar combinando NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato sodico (88,2 g/0,015 M), y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, y despues ajustando el volumen a 1 litro. El SDS al 10% se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua tratada en autoclave, y despues diluyendo a 100 ml.

La deteccion de la sonda proporciona un medio para determinar de una forma conocida si la hibridacion se ha mantenido. Dicho analisis con sonda proporciona un metodo rapido para identificar genes de la presente invencion. Los segmentos de nucleotidos usados como sondas de acuerdo con la invencion, se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleotidos tambien se pueden usar como cebadores de la PCR para amplificar genes de la presente invencion.

Las caractensticas de hibridacion de una molecula se pueden usar para definir polinucleotidos de la presente invencion. Por lo tanto, la presente invencion incluye polinucleotidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus complementos enteros) que hibridan con un polinucleotido ejemplificado en la presente memoria. Es decir, una forma de definir un gen (y la protema que codifica), por ejemplo, es por su capacidad para hibridar (en cualquiera de 5 las condiciones descritas espedficamente en la presente memoria) con un gen conocido o ejemplificado espedficamente.

Como se usa en la presente memoria, condiciones “restrictivas” para la hibridacion, se refieren a condiciones que logran el mismo, o aproximadamente el mismo, grado de especificidad de hibridacion que las condiciones usadas por los actuales autores de la invencion. Espedficamente, la hibridacion de ADN inmovilizado en transferencias 10 Southern con sondas espedficas de genes marcadas con 32P, se puede llevar a cabo por metodos convencionales. En general, la hibridacion y posteriores lavados se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la deteccion de secuencias objetivo. Para las sondas de genes de ADN bicatenario, la hibridacion se puede llevar a cabo durante la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del hforido de ADN en 6x SSPE, 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusion se describe por la siguiente 15 formula:

Tm = 81,5°C + 16,6Log[Na+] + 0,41(%G+C) - 0,61(% formamida) - 600/longitud del duplex en pares de bases.

Los lavados tfpicamente se pueden llevar a cabo como sigue:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 min en 1xSSPE, SDS al 0,1% (lavado de restriccion baja).

(2) Una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en 0,2x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de restriccion moderada).

20 Para las sondas de oligonucleotidos, la hibridacion se puede llevar a cabo durante la noche a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del hfbrido en 6x SSPE, 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm para las sondas de oligonucleotidos se puede determinar con la siguiente formula:

Tm (°C) = 2(numero de pares de bases T/A) + 4(numero de pares de bases G/C)

(Suggs et al., 1981).

25 Los lavados tfpicamente se pueden llevar a cabo como sigue:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 min en 1xSSPE, SDS al 0,1% (lavado de restriccion baja).

(2) Una vez a la temperatura de hibridacion durante 15 minutos en 1x SSPE, SDS al 0,1% (lavado de restriccion moderada).

En general, la sal y/o temperatura se pueden alterar para cambiar la restriccion. Con un fragmento de ADN marcado 30 de >70 o similar, bases de longitud, se pueden usar las siguientes condiciones:

Baja: 1 o 2x SSPE, temperatura ambiente

Baja: 1 o 2x SSPE, 42°C

Moderada: 0,2 o 1x SSPE, 65°C

Alta: 0,1x SSPE, 65°C.

35 La formacion de duplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un hfbrido, y como se ha indicado antes, se puede tolerar un cierto grado de apareamiento erroneo. Por lo tanto, las secuencias de sondas de la presente invencion incluyen mutaciones (tanto individuales como multiples), eliminaciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en donde dichas mutaciones, inserciones y eliminaciones permiten la formacion de hfbridos estables con el polinucleotido objetivo de 40 interes. Las mutaciones, inserciones y eliminaciones se pueden producir en una secuencia de polinucleotido dada de muchas formas, y estos metodos son conocidos para el experto en la tecnica. Otros metodos pueden hacerse conocidos en el futuro.

Tecnologfa de PCR. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una smtesis cebada, enzimatica, repetitiva, de una secuencia de acido nucleico. Este procedimiento es bien conocido y usado habitualmente por los expertos en 45 esta tecnica (vease, Mullis, patentes de eE.UU. n° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159.

La PCR se basa en la amplificacion enzimatica de un fragmento de ADN de interes que esta flanqueado por dos cebadores oligonucleotidos que hibridan cadenas opuestas de la secuencia objetivo. Los cebadores se obtienen preferiblemente con los extremos 3' dirigiendose uno hacia otro. Los ciclos repetidos de desnaturalizacion termica del molde, reasociacion de los cebadores a sus secuencias complementarias, y extension de los cebadores 50 reasociados con una ADN polimerasa, da como resultado la amplificacion del segmento definido por los extremos 5'

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de los cebadores de la PCR. El producto de extension de cada cebador puede servir como un molde para el otro cebador, de modo que cada ciclo esencialmente duplica la cantidad del fragmento de ADN producido en el ciclo previo. Esto produce la acumulacion exponencial del fragmento objetivo espedfico, hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Usando una ADN polimerasa termoestable tal como la polimerasa Taq, aislada de la bacteria termofila, Thermus aquaticus, el procedimiento de amplificacion puede ser completamente automatico. Los expertos en la tecnica conocen otras enzimas que se pueden usar.

Las secuencias de ADN ejemplificadas, o segmentos de las mismas, se pueden usar como cebadores para la amplificacion por la PCR. Cuando se lleva a cabo la amplificacion por PCR, se puede tolerar un cierto grado de apareamiento erroneo entre el cebador y el molde. Por lo tanto, las mutaciones, eliminaciones e inserciones (en especial adiciones de los nucleotidos al extremo 5') de los cebadores ejemplificados, estan dentro del alcance de la presente invencion. Las mutaciones, eliminaciones e inserciones se pueden producir en un cebador dado por metodos conocidos para el experto en la tecnica.

Modificacion de genes y protemas. Los presentes genes y protemas se pueden fusionar con otros genes y protemas para producir protemas quimericas o de fusion. Los genes y protemas utiles de acuerdo con la presente invencion, incluyen no solo las secuencias de longitud entera ejemplificadas espedficamente, sino tambien partes, segmentos y/o fragmentos (que incluyen fragmentos contiguos y eliminaciones internas y/o terminales, comparado con las moleculas de longitud entera) de esas secuencias, variantes, mutantes, quimericas y fusiones de los mismos. Las protemas de la presente invencion pueden tener aminoacidos sustituidos con la condicion de que retengan la actividad funcional deseada. Los genes “variantes” tienen secuencias de nucleotidos que codifican las mismas protemas o protemas equivalentes que tienen actividad equivalente o similar a una protema ejemplificada.

Las expresiones “protemas variantes” y “protemas equivalentes” se refieren a protemas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biologica/funcional contra los sustratos objetivo y secuencias equivalentes como las protemas ejemplificadas. Como se usa en la presente memoria, la referencia a una secuencia “equivalente” se refiere a secuencias que tienen sustituciones, eliminaciones, adiciones o inserciones de aminoacidos que mejoran o no tiene una actividad que afecte de forma adversa en una extension significativa. Los fragmentos que retienen la actividad tambien estan incluidos en esta definicion. Los fragmentos y otros equivalentes que retienen la misma o similar funcion o actividad que un fragmento correspondiente de una protema ejemplificada, estan dentro del alcance de la presente invencion. Los cambios, tales como sustituciones o adiciones de aminoacidos, se pueden hacer para una variedad de fines, tales como aumentar (o disminuir) la estabilidad de proteasa de la protema (sin disminuir material/sustancialmente la actividad funcional de la protema), eliminar o anadir un sitio de restriccion, y similares. Las variaciones de genes se pueden construir facilmente usando tecnicas convencionales para hacer mutaciones puntuales, porejemplo.

Ademas, la patente de EE.UU. n° 5.605.793, por ejemplo, describe metodos para generar diversidad molecular adicional usando reasociacion de ADN despues de fragmentacion aleatoria o enfocada. Esto se puede denominar como “barajado”, que tfpicamente implica la mezcla de fragmentos (de un tamano deseado) de dos o mas moleculas de ADN diferentes, seguido de ciclos repetidos de renaturalizacion. Esto puede mejorar la actividad de una protema codificada por un gen de partida. El resultado es una protema quimerica que tiene actividad mejorada, especificidad de sustrato alterada, estabilidad enzimatica mayor, estereoespecificidad alterada, u otras caractensticas.

El “barajado” se puede disenar y dirigir despues de obtener y examinar las coordenadas atomicas 3D (tridimensionales) y la estructura cristalina de una protema de interes. Por lo tanto, el “barajado enfocado” se puede dirigir a determinados segmentos de una protema que son ideales para la modificacion, tales como segmentos expuestos en la superficie, y preferiblemente no segmentos internos que estan implicados en el plegado de la protema y la integridad estructuras 3D esencial.

Los cambios espedficos para el “sitio activo” de la enzima se pueden hacer para afectar a la funcionalidad inherente con respecto a la actividad o estereoespecificidad (vease el alineamiento en la figura 2).

La estructura cristalina de tauD conocida se uso como un modelo de dioxigenasa para determinar los restos del sitio activo mientras estan unidos a su sustrato inherente la taurina. Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates," Biochemistry 41(16):5185-5192. En relacion con la optimizacion de secuencias y designacion de sitios activos de enzimas, vease Chakrabarti et al., PNAS, (Aug. 23, 2005), 102(34):12035-12040.

Los genes variantes se pueden usar para producir protemas variantes; se pueden usar hospedantes recombinantes para producir las protemas variantes. Usando estas tecnicas de “barajado de genes”, se pueden construir genes y protemas equivalentes que comprende cualquiera de 5, 10 o 20 restos contiguos (aminoacidos o nucleotidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente memoria. Como conoce un experto en la tecnica, las tecnicas de barajado de genes, por ejemplo, se pueden ajustar para obtener equivalentes que tienen, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, G8, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,

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146,

147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168,

169,

170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,

192,

193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214,

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216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,

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239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,

261,

262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283,

284,

285, 286 , 287 o 288 restos contiguos (aminoacidos o nucleotidos), que corresponden a un segmento (del

mismo tamano) en cualquiera de las secuencias ejemplificadas o sugeridas (o los complemented (complemented enteros) de las mismas). Tambien se pueden usar segmentos de tamanos similares, en especial aquellos para las regiones conservadas, como sondas y/o cebadores.

Se pueden hacer fragmentos de genes de longitud entera usando exonucleasas o endonucleasas de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como Bal31 o mutagenesis dirigida, para cortar sistematicamente nucleotidos de los extremos de estos genes. Ademas, se pueden obtener genes que codifican fragmentos activos usando una variedad de enzimas de restriccion. Se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas protemas.

Esta dentro del alcance de la invencion, como se describe en la presente memoria, que las protemas se pueden truncar y todavfa retener actividad funcional. Por “protema truncada” se entiende que una parte de una protema se puede escindir mientras que la protema truncada que queda retiene y presenta la actividad deseada despues de la escision. La escision se puede lograr por diferentes proteasas. Ademas, se pueden producir protemas escindidas eficazmente usando tecnicas de biologfa molecular, en donde las bases de ADN que codifican dicha protema se eliminan por digestion con endonucleasas de restriccion u otras tecnicas disponibles para el experto en la tecnica. Despues de truncado, dichas protemas se pueden expresar en sistemas heterologos tales como E. coli, baculovirus, sistemas vmcos basados en plantas, levaduras, y similares, y despues ponerlos en ensayos de insectos como se describe en la presente memoria, para determinar la actividad. Es bien conocido en la tecnica que se pueden producir con exito protemas truncadas de modo que retienen la actividad funcional, mientras tienen menos de la secuencia entera de longitud completa. Por ejemplo, se pueden usar protemas B.t. en una forma truncada (protema nucleo).

Como se usa en la presente memoria, el termino “protema” puede incluirtruncados funcionalmente activos.

En algunos casos, en especial para la expresion en plantas, puede ser ventajoso usar genes truncados que expresan protemas truncadas. Los genes truncados preferidos tipicamente codificaran 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6I, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,

79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la protema de longitud entera.

Algunas protemas de la presente invencion se han ejemplificado espedficamente en la presente memoria. Puesto que estas protemas son simplemente de ejemplo de las protemas de la presente invencion, sera facilmente evidente que la presente invencion comprende protemas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleotidos que codifican los equivalentes de las mismas) que tienen la misma o similar actividad que las protemas ejemplificadas. Las protemas equivalentes tendran similitud de aminoacidos (y/o homologfa) con una protema ejemplificada. La identidad de aminoacidos tipicamente sera al menos 60%, preferiblemente al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, incluso mas preferiblemente al menos 90%, y puede ser al menos 95%. Las protemas preferidas de la presente invencion tambien se pueden definir en terminos de intervalos de identidad y/o similitud mas particulares. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98 o 99%, comparado con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente memoria. Cualquier numero citado antes se puede usar para definir los lfmites superior e inferior.

Salvo que se especifique de otra forma, como se usa en la presente memoria, el porcentaje de identidad y/o similitud de secuencia de dos acidos nucleicos, se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado en Karlin y Altschul 1993. Dicho algoritmo esta incorporado en los programas NBLAST y XBLAST. Las busquedas de nucleotidos con BLAST se llevan a cabo con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12. Se puede usar BLAST con huecos como describen Altschul et al., 1997. Cuando se usan los programas BLAST y BLAST con huecos, se usan los parametros por defecto de los respectivos programas (NBLAST y XBLAST). Vease el sitio en la red NCBI/NIH. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion, se usa la funcion AlignX de Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, MD, EE.UU.), usando los parametros por defecto. Estos eran: una penalizacion por apertura de huevo de 15, una penalizacion por extension de hueco de 6,66, y un intervalo de penalizacion por separacion de huecos de 8.

Tambien se pueden cambiar varias propiedades y caractensticas tridimensionales de la protema, sin afectar de forma adversa a la actividad/funcionalidad de la protema. Las sustituciones de aminoacidos conservativas se pueden tolerar/hacer que no afecten de forma adversa a la actividad y/o configuracion tridimensional de la molecula. Los aminoacidos se pueden poner en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, basicos y acidos. Las sustituciones conservativas por las cuales un aminoacido de una clase se sustituye por otro aminoacido de la misma

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clase, estan dentro del alcance de la presente invencion, siempre que la sustitucion no sea adversa para la actividad biologica del compuesto. La tabla 2 proporciona una lista de ejemplos de aminoacidos que pertenecen a cada clase. Tabla 2

Clase de aminoacido

Ejemplos de aminoacidos

No polar

Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

Polar no cargado

Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

Acido

Asp, Glu

Basico

Lys, Arg, His

En algunos casos, tambien se pueden hacer sustituciones no conservativas. Sin embargo, las sustituciones preferidas no disminuyen significativamente la actividad funcional/biologica de la protema.

Como se usa en la presente memoria, la referencia a polinucleotidos “aislados” y/o protemas “purificadas” se refiere a esas moleculas, cuando no estan asociadas con las otras moleculas con las que se encontranan en la naturaleza. Por lo tanto, la referencia a “aislado” y/o “purificado” significa la implicacion de la “mano del hombre” como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un “gen” bacteriano de la presente invencion puesto en una planta para la expresion, es un “polinucleotido aislado”. Igualmente, una protema derivada de una protema bacteriana y producida por una planta es una “protema aislada”.

Debido a la degeneracion/redundancia del codigo genetico, una variedad de secuencias de ADN diferentes puede codificar las secuencias de aminoacidos descritas en la presente memoria. Esta dentro de la experiencia del experto en la tecnica, el crear secuencias de ADN alternativas que codifican la misma o esencialmente la misma protema. Estas secuencias de ADN variantes estan dentro del alcance de la presente invencion. Esto tambien se describe con mas detalle mas adelante en la seccion titulada “Optimizacion de secuencia para la expresion en plantas”.

Optimizacion de secuencia para la expresion en plantas. Para obtener la expresion alta de genes heterologos en plantas, en general se prefiere modificar geneticamente los genes, de modo que sean expresados mas eficazmente en (el citoplasma de) las celulas de plantas. El mafz es una de dichas plantas, donde se puede preferir redisenar el o los genes heterologos antes de transformacion para aumentar el nivel de expresion de los mismos en dicha planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseno de genes que codifican una protema bacteriana es volver a modificar geneticamente un gen heterologo para la expresion optima, usando la tendencia de codones alineados mas cercanos con la secuencia de la planta objetivo, sea una especie dicotiledonea o monocotiledonea. Las secuencias tambien se pueden optimizar para la expresion en uno de los tipos de plantas mas particulares descritos en otra parte en la presente memoria.

Hospedantes transgenicos. Los genes que codifican protemas de la presente invencion se pueden introducir en una amplia variedad de hospedantes microbianos o plantas. La presente invencion incluye celulas de plantas transgenicas y plantas transgenicas. Las plantas preferidas (y celulas de plantas) son mafz, Arabidopsis, tabaco, sojas, algodon, canola, arroz, trigo, cesped, leguminosas, forrajes (p. ej., alfalfa y trebol), pastos, y similares. Tambien se pueden hacer otros tipos de plantas transgenicas de acuerdo con la presente invencion, tales como frutas, verduras, plantas ornamentales y arboles. Mas en general, se pueden usar dicotiledoneas y/o monocotiledoneas, en diferentes aspectos de la presente invencion.

En realizaciones preferidas, la expresion de genes da, directa o indirectamente la produccion intracelular (y mantenimiento) de la o las protemas de interes. Las plantas se pueden hacer resistentes a herbicidas de esta forma. Dichos hospedantes se pueden denominar hospedantes y/o celulas transgenicos, recombinantes, transformados y/o transfectados. En algunos aspectos de esta invencion (cuando se clona y prepara el gen de interes, por ejemplo), se pueden producir celulas microbianas (preferiblemente bacterianas) y usar de acuerdo con tecnicas convencionales, con el beneficio de la presente descripcion.

Las celulas de plantas transfectadas con un polinucleotido de la presente invencion, se pueden regenerar en plantas completas. La presente invencion incluye cultivos celulares que incluyen cultivos de celulas de tejidos, cultivos lfquidos y cultivos en placa. Las semillas producidas por y/o usadas para generar plantas de la presente invencion tambien estan incluidas dentro del alcance de la presente invencion. Otros tejidos y partes de plantas tambien estan incluidos en la presente invencion. La presente invencion incluye igualmente, metodos de produccion de plantas o celulas que comprenden un polinucleotido de la presente invencion. Un metodo preferido de produccion de dichas plantas es plantando una semilla de la presente invencion.

Aunque se prefieren plantas, la presente invencion tambien incluye la produccion de ADD-13 recombinante muy activo en una cepa hospedante de Pseudomonas fluorescens (Pf), por ejemplo. La presente invencion incluye

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temperatures de crecimiento preferidas para mantener la ADD-13 activa soluble en este hospedante y un procedimiento de formulacion que puede almacenar y restablecer la actividad de ADD-13 en solucion; y un procedimiento de liofilizacion que puede retener la actividad de ADD-13 durante el almacenamiento y vida en anaquel a largo plazo.

Insercion de genes para formar hospedantes transgenicos. Un aspecto de la presente invencion es la transformacion/transfeccion de plantas, celulas de plantas y otras celulas hospedantes con polinucleotidos de la presente invencion, que expresan proternas de la presente invencion. Las plantas transformadas de esta forma se pueden hacer resistentes a una variedad de herbicidas con diferentes modos de accion.

Esta disponible una amplia variedad de metodos para introducir un gen que codifica una protema deseada en el hospedante objetivo, en condiciones que permitan el mantenimiento y expresion estables del gen. Estos metodos son bien conocidos para los expertos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 5.135.867.

Los vectores que comprenden un polinucleotido de ADD-13 estan incluidos en el alcance de la presente invencion. Por ejemplo, esta disponible un gran numero de vectores de clonacion que comprenden un sistema de replicacion en E. coli y un marcador que permite la seleccion de las celulas transformadas, para la preparacion para la insercion de genes extranos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la protema se puede insertar en el vector en un sitio de restriccion adecuado. El plasmido resultante se usa para la transformacion en E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, despues se recogen y se lleva a cabo la lisis. El plasmido se recupera purificandolo del ADN genomico. Se llevan a cabo el analisis de secuencia, analisis de restriccion, electroforesis y otros metodos de bioqmmica-biologfa molecular, en general como metodos de analisis. Despues de cada manipulacion, la secuencia de ADN usada se puede digerir por restriccion y juntar con la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plasmido se puede clonar en el mismo u otros plasmidos. Dependiendo del metodo de insercion de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plasmido Ti o Ri para la transformacion de la celula de planta, entonces al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el borde izquierdo del ADN-T del plasmido Ti o Ri, debe unirse como la region flanqueadora de los genes que se van a insertar. El uso del ADN-T para la transformacion de celulas de plantas se ha investigado intensivamente y se ha descrito en el documento EP 120516.

Esta disponible un gran numero de tecnica para insertar ADN en una celula hospedante de planta. Estas tecnicas incluyen la transformacion con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformacion, fusion, inyeccion, biolfstica (bombardeo con micropartmulas), filamentos de carburo de silicio, haces de aerosol, PEG o electroporacion, asf como otros metodos posibles. Si se usan Agrobacteria para la transformacion, el ADN que se va a insertar se debe clonar en plasmido especiales, en concreto en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri por recombinacion homologa debido a secuencias que son homologas a las secuencias en el ADN-T. El plasmido Ti o Ri tambien comprende la region vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios pueden replicarse ellos mismos en Agrobacteria. El vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens mediante un plasmido auxiliar (conjugacion). Los vectores binarios se pueden replicar ellos mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de seleccion y un conector o policonector que estan enmarcados por las regiones borde derecho e izquierdo del ARN-T. Se pueden transformar directamente en Agrobacteria.

La Agrobacterium usada como celula hospedante comprende un plasmido que lleva una region vir. La region vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la celula de la planta. Puede tener contenido ADN-T adicional. La bacteria asf transferida se usa para la transformacion de celulas de plantas. Los explantes de plantas se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciena o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la celula de planta. Se pueden regenerar entonces plantas enteras a partir del material de planta infectado (por ejemplo, trozos de hojas, segmentos de tallos, rames, pero tambien protoplastos o celulas cultivadas en suspension) en un medio adecuado, que puede contener antibioticos o biocidas para la seleccion. Despues se puede ensayar en las plantas asf obtenidas la presencia del ADN insertado. No hay demandas especiales de los plasmidos en el caso de inyeccion y electroporacion. Se pueden usar plasmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las celulas transformadas crecen dentro de la plata de la forma habitual. Pueden formar celulas germinales y transmitir el o los rasgos transformados a las plantas progenie. Estas plantas se pueden desarrollar de la forma habitual y cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos hfbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotfpicas.

En algunas realizaciones preferidas de la invencion, los genes que codifican protema bacteriana son expresados a partir de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de integracion estable en el genoma de la planta y permiten la seleccion de lmeas de plantas transformadas que expresan ARNm que codifica las proternas.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable en el (y no vuelve a salir).

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Normalmente contiene un marcador de seleccion que confiere a las celulas de la planta transformadas resistencia a un biocida o un antibiotico, tal como la kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. Los marcadores seleccionables de plantas tambien pueden proporcionar tipicamente resistencia a diferentes herbicidas tales como el glufosinato (p. ej., PAT/bar), glifosato (EPSPS), inhibidores de ALS (p. ej., imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, y otros), bromoxinil, resistencia a inhibidor de HPPD, inhibidores de PPO, inhibidores de ACC-asa, y muchos otros. El marcador usado individualmente debena permitir, en consecuencia, la seleccion de las celulas transformadas en lugar de las celulas que no contienen el ADN insertado. El o los genes de interes son expresados preferiblemente por promotores constitutivos o inducibles en la celula de planta. Una vez expresado, el ARNm se traduce en protemas, incorporando asf aminoacidos de interes en la protema. Los genes que codifican una protema expresada en las celulas de plantas pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor espedfico de tejido o un promotor inducible.

Existen varias tecnicas para introducir vectores recombinantes extranos en celulas de plantas y para obtener plantas que mantienen y expresan establemente el gen introducido. Dichas tecnicas incluyen la introduccion de material genetico como recubrimiento sobre micropartmulas directamente en las celulas (patentes de EE.UU. n° 4.945.050 de Cornell y 5.141.131 de DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Ademas, las plantas se pueden transformar usando Agrobacterium technology, vease las patentes de EE.UU. n° 5.177.010 de la University of Toledo; 5.104.310 de Texas A&M; solicitud de patente europea 0131624B1; solicitudes de patente europea 120516, 159418B1 y 176.112 de Schilperoot; patentes de EE.UU. n° 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 de Schilperoot; solicitudes de patente europea 116718, 290799, 320500, todas de Max Planck; solicitudes de patente europea 604662 y 627752, y patente de EE.UU. n° 5.591.616, de Japan Tobacco; solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435, y patente de EE.UU. n° 5.231.019, todas de Ciba Geigy, ahora Syngenta; patentes de EE.UU. n° 5.463.174 y 4.762.785, ambas de Calgene; y patentes de EE.UU. n° 5.004.863 y 5.159.135, ambas de Agracetus. Otra tecnologfa incluye la tecnologfa de filamentos. Veanse las patentes de EE.UU. n° 5.302.523 y 5.464.765, ambas de Zeneca, ahora Syngenta. Otra tecnologfa de transformacion de suministro de ADN directo incluye la tecnologfa de haz de aerosol. Vease la patente de EE.UU. n° 6.809.232. Tambien se ha usado la tecnologfa de electroporacion para transformar plantas. Vease el documento WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute; patentes de EE.UU. n° 5.472.869 y 5.384.253, ambas de Dekalb; y WO 92/09696 y WO 93/21335, ambas de Plant Genetic Systems. Ademas, tambien se pueden usar vectores vmcos para producir plantas transgenicas que expresan la protema de interes. Por ejemplo, las plantas monocotiledoneas se pueden transformar con un vector vmco usando los metodos descritos en la patente de EE.UU. n° 5.569.597 de Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), asf como las patentes de EE.UU. n° 5.589.367 y 5.316.931, ambas de Biosource, ahora Large Scale Biology.

Como se ha mencionado previamente, la forma en la que se introduce la construccion de ADN en el hospedante de planta no es cntico en esta invencion. Se puede usar cualquier metodo que proporcione la transformacion eficaz. Por ejemplo, se describen diferentes metodos para la transformacion de celulas de plantas en la presente memoria, e incluyen el uso de plasmidos Ti o Ri, y similares para llevar a cabo la transformacion mediada por Agrobacterium. En muchos, sera conveniente tener la construccion usada para la transformacion bordeada por uno o ambos lados por bordes de ADN-T, mas espedficamente el borde derecho. Esto es particularmente util cuando la construccion usa Agrobacterium tumefaciena o Agrobacterium rhizogenes como un modo para la transformacion, aunque los bordes de ATN-T pueden tener utilidad con otros modos de transformacion. Cuando se usa Agrobacterium para la transformacion de las celulas de plantas, se puede usar un vector que se puede introducir en el hospedante para la recombinacion homologa con ADN-T o el plasmido Ti o Ri presente en el hospedante. La introduccion del vector se puede realizar por electroporacion, conjugacion triparental y otras tecnicas para transformar bacterias Gram negativas que son conocidas para los expertos en la tecnica. La forma de la transformacion del vector en el hospedante Agrobacterium no es cntico en esta invencion. El plasmido Ti o Ri que contiene el ADN-T para la recombinacion puede ser capaz o no ser capaz de causar la formacion de agalla, y no es cntico para dicha invencion, siempre que los genes vir esten presentes en dicho hospedante.

En algunos casos, donde se usa Agrobacterium para la transformacion, la construccion de la expresion que esta dentro de los bordes del ADN-T se insertara en un vector de amplio espectro tal como pRK2 o derivados del mismo, como se describe en el documento EPO 0120515. Incluidos dentro de la construccion de expresion y el ADN-T habra uno o mas marcadores como se describen en la presente memoria, que permiten la seleccion del Agrobacterium transformado y celulas de planta transformadas. El marcador particular usado no es esencial para esta invencion, dependiendo el marcador preferido del hospedante y construccion usados.

Para la transformacion de las celulas de planta usando Agrobacterium, se pueden combinar explantes e incubarlos con Agrobacterium transformada durante suficiente tiempo para permitir la transformacion de los mismos. Despues de la transformacion, se matan las Agrobacteria por seleccion con el antibiotico adecuado y las celulas de planta se cultivan con el medio selectivo adecuado. Una vez formados los callos, se puede estimular la formacion de brotes usando las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica del cultivo de tejidos vegetales y regeneracion de plantas. Sin embargo, no siempre es necesaria una etapa intermedia de callo. Despues de la formacion del brote, dichas celulas vegetales se pueden transferir a medio que estimula la formacion de rames completando asf la regeneracion de la planta. Las plantas despues se pueden desarrollar en semillas y dichas semillas se pueden usar para establecer generaciones futuras. Independientemente de la tecnica de transformacion, el gen que codifica una protema bacteriana se incorpora preferiblemente en un vector de

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transferencia de genes adaptado para expresar dicho gen en una celula vegetal, por inclusion en el vector de un elemento regulador del promotor de planta, asf como regiones de terminacion de la transcripcion 3' no traducidas tales como Nos y similares.

Ademas de numerosas tecnolog^as para la transformacion de plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extranos tambien puede variar. Dicho tejido incluina, pero no estana limitado a tejido embriogenico, tipos de tejido de callo I, II y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular, tejidos para la expresion en floema, y similares. Practicamente todos los tejidos de plantas se pueden transformar durante la desdiferenciacion usando tecnicas adecuadas descritas en la presente memoria.

Como se ha mencionado antes, se puede usar una variedad de marcadores seleccionables, si se desea. La preferencia de un marcador particular depende del experto, pero se puede usar cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables junto con cualquier otro gen no citado en los mismos, que funcionana como un marcador seleccionable. Dichos marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan al gen de la aminoglucosido fosfotransferasa del transposon Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibioticos kanamicina, neomicina y G41; resistencia a higromicina; resistencia a metotrexato, asf como a aquellos genes que codifican la resistencia o tolerancia al glifosato; fosfinotricina (bialafos o glufosinato); herbicidas que inhiben ALS (herbicidas de imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina), inhibidores de ACC-asa (p. ej., ariloxipropionatos o ciclohexanodionas), y otros tales como bromoxinil, e inhibidores de HPPD (p. ej., mesotriona) y similares.

Ademas de un marcador seleccionable, puede ser conveniente usar un gen indicador. En algunos casos, se puede usar un gen indicador con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que tfpicamente no estan presentes en el organismo o tejido receptor y tfpicamente codifican protemas que producen algun cambio fenotfpico o propiedad enzimatica.

Los genes indicadores preferidos incluyen el de la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de la cloranfenicol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la protema fluorescente verde de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, y los genes de la luciferasa de la luciernaga Photinus pyralis. Se puede llevar a cabo despues un ensayo para detectar la expresion de un gen indicador en un momento adecuado despues de haber introducido dicho gen en las celulas receptoras. Un ensayo de estos preferidos implica el uso de un gen que codifica la beta- glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli para identificar celulas transformadas.

Ademas de los elementos reguladores de promotores de la planta, se pueden usar eficazmente elementos reguladores de promotores de una variedad de fuentes para expresar genes extranos. Por ejemplo, se pueden usar elementos reguladores de promotores de origen bacteriano, tales como el promotor de la octopina sintasa; promotor de la manopina; promotores de origen vmco, tales como promotor del virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un promotor 35S remodificado, vease la patente de EE.UU. n° 6.166.302, en especial el ejemplo 7E) y similares. Los elementos reguladores de promotores de plantas incluyen, pero no se limitan a la subunidad pequena de la ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa (ssu), promotor de la beta-conglicinina, promotor de la beta- faseolina, promotor de ADH, promotores de choque termico, y promotores espedficos de tejido. Pueden estar presentes otros elementos tales como regiones de union a la matriz, regiones de union al armazon, intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilacion y similares, y asf pueden mejorar la eficacia de la transcripcion o integracion del ADN. Dichos elementos pueden ser necesarios o no para la funcion del ADN, aunque pueden proporcionar mejor expresion o funcionamiento del ADN afectando a la transcripcion, estabilidad del ARNm y similares. Dichos elementos se pueden incluir en el ADN como se desee, para obtener el rendimiento optimo del ADN transformado en la planta. Los elementos tfpicos incluyen, pero no se limitan a intron de Adh-1, intron de Adh- 6, secuencia lfder de la protema de recubrimiento del virus del mosaico de la alfalfa, secuencias UTR de osmotina, secuencia lfder de la protema de recubrimiento del virus del rayado del mafz, asf como otros disponibles para un experto en la tecnica. Tambien se pueden usar elementos reguladores de promotores constitutivos, dirigiendo asf la expresion de gen constitutiva en todos los tipos de celulas y en todos los tiempos (p. ej., actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Los elementos reguladores de promotores espedficos de tejidos son responsables de la expresion de genes en tipos de celulas o tejidos espedficos, tales como las hojas o semillas (p. ej., zema, oleosina, napina, ACP, globulina y similares), y tambien se pueden usar.

Los elementos reguladores de promotores tambien pueden estar activos (o inactivos) durante una fase determinada del desarrollo de la planta, asf como activos en tejidos y organos de la planta. Los ejemplos de estos incluyen, pero no se limitan a elementos reguladores de promotores espedficos del polen, espedficos embrionarios, espedficos de la seda del mafz, espedficos de la fibra de algodon, espedficos de rafces, espedficos del endosperma de la semilla o espedficos de la fase vegetativa, y similares. En determinadas circunstancias puede ser conveniente usar un elemento regulador del promotor inducible, que es responsable de la expresion de genes en respuesta a una senal espedfica, tal como: estfmulo ffsico (genes de choque termico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, compuestos qrnmicos (sensible a tetraciclina) y estres. Se pueden usar otros elementos de la transcripcion y traduccion convenientes que funcionan en las plantas. Se conocen numerosos vectores de genes espedficos de plantas en la tecnica.

Tambien se pueden usar sistemas basados en ARN vmco de planta para expresar la protema bacteriana. Al hacer esto, el gen que codifica una protema se puede insertar en la region promotora del recubrimiento de un virus de

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planta adecuado que afectara a la planta hospedante de interes. Despues se puede expresar la protema proporcionando as^ proteccion a la planta para el dano por el herbicida. Los sistemas basados en ARN vmico de planta se describen en la patente de EE.UU. n° 5.500.360 de Mycogen Plant Sciences, Inc. y patentes de EE.UU. n° 5.316.931 y 5.589.367 de Biosource, ahora Large Scale Biology.

Medios para aumentar mas los niveles de tolerancia o resistencia. Se muestra en la presente memoria que se puede dotar a las plantas de la presente invencion de nuevos rasgos de resistencia a herbicidas sin efectos adversos observables en el fenotipo, incluyendo el rendimiento. Dichas plantas estan dentro del alcance de la presente invencion. Las plantas ejemplificadas y sugeridas en la presente memoria pueden aguantar 2X, 3X, 4X, y 5X los niveles de aplicacion tfpicos, por ejemplo, de al menos un herbicida presente. Las mejoras en estos niveles de tolerancia estan dentro del alcance de esta invencion. Por ejemplo, se conocen diferentes tecnicas en la materia, y previsiblemente se pueden optimizar y desarrollar mas, para aumentar la expresion de un gen dado.

Uno de dichos metodos incluye aumentar el numero de copias de los presentes genes ADD-13 (en casetes de expresion y similares). Tambien se pueden seleccionar sucesos de transformacion para los que tienen multiples copias de genes.

Se pueden usar promotores y potenciadores fuertes para la expresion de “supercarga”. Los ejemplos de dichos promotores incluyen el promotor 35T preferido que usa potenciadores 35S. Los promotores de 35S, ubiquitina de mafz, ubiquitina de Arabidopsis, A.t. actina, y CSMV, estan incluidos para dichos usos. Tambien se prefieren otros promotores vmcos fuertes. Los potenciadores incluyen potenciador 4 OCS y 35S doble. Las regiones de union a la matriz (MARS) tambien se pueden usar para aumentar las eficacias de transformacion y la expresion transgenica, por ejemplo.

Tambien se pueden usar el barajado (evolucion dirigida) y factores de transcripcion para realizaciones de acuerdo con la presente invencion.

Tambien se pueden disenar diferentes protemas que difieren en el nivel de secuencia, pero retienen algo o similar estructura tridimensional esencial general, distribucion de carga superficial, y similares. Vease, p. ej. patente de EE.UU. n° 7.058.515; Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 2804-2813, "Thoroughly sampling sequence space: Large- scale protein design of structural ensembles."; Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436 - 438 (1997), "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling."; Stemmer, W.P.C.1994. “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074710751; Stemmer, W.P.C.1994. “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”. Nature 370: 389-391; Stemmer, W.P.C.1995. “Searching sequence space”. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A., Cwirla, S. y Stemmer, W.P.C.1996. “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”. Nature Medicine 2: 100-103; y Crameri, A., Whitehorn, E.A., Tate, E. y Stemmer, W.P.C. 1996. “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”. Nature Biotechnology 14: 315-319.

La actividad de los polinucleotidos recombinantes insertados en las celulas vegetales puede depender de la influencia del ADN endogeno de la planta adyacente al inserto. Por lo tanto, otra opcion es aprovechar la ventaja de los sucesos que se sabe que son localizaciones excelentes en un genoma de planta para las inserciones. Vease, p. ej. el documento WO 2005/103266 A1, relativo a sucesos en el algodon en cry1F y cry1Ac; el presente gen AAD-13 se puede sustituir en estos locus genomicos en lugar de los insertos de cry1F y/o cry1Ac. Por lo tanto, la recombinacion homologa dirigida, por ejemplo, se puede usar de acuerdo con la presente invencion. Este tipo de tecnologfa es el objeto, por ejemplo, del documento WO 03/080809 A2 y la correspondiente solicitud de EE.UU. publicada (USPA 20030232410), relativa al uso de dedos de zinc para la recombinacion dirigida. Tambien se conoce en la tecnica el uso de recombinasas (cre-lox y flp-frt por ejemplo).

La detoxificacion por ADD-13 se cree que se produce en el citoplasma. Por lo tanto, se incluyen medios para estabilizar mas esta protema y ARNm (que incluyen la degradacion del ARNm de bloqueo) en los aspectos de la presente invencion, y se pueden aplicar tecnicas acordes conocidas en la materia. Las presentes protemas se pueden disenar para resistir la degradacion por proteasas y similares (se pueden eliminar eficazmente sitios de escision de proteasas remodificando la secuencia de aminoacidos de la protema). Dichas realizaciones incluyen el uso de estructuras de tallo-bucle como las UTR de la osmotina, y per5 (secuencias 5' no traducidas ricas en AU). Tambien se pueden usar caperuzas en 5' como grupos 7-metilo o 2'-O-metilo, p. ej., resto de acido metilguamlico). Vease, p. ej.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 74, No. 7, pag. 2734-2738 (Julio 1977) “Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesis”. Tambien se pueden usar complejos de protemas o grupos de bloqueo de ligando.

Tambien se puede llevar a cabo el diseno computacional de las 5' o 3' UTR mas adecuadas para ADD-13 (horquillas sinteticas) dentro del alcance de la presente invencion. La modelizacion por ordenador, en general, asf como el barajado de genes y la evolucion dirigida, se describen en otra parte en la presente memoria. Mas espedficamente, en relacion con la modelizacion por ordenador y las UTR, las tecnicas de modelizacion por ordenador para usar para predecir/evaluar derivados 5' y 3' UTR de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a: MFold version 3.1 disponible en Genetics Corporation Group, Madison, WI (vease, Zucker et al., “Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide”. En RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J.

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Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., “Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure”. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., “RNA Secondary Structure Prediction”. En Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, y R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)), COVE (RNA structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)) v.2.4.2 (Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088) que se distribuye libremente como codigo fuente y que se puede descargar accediendo a la pagina de internet genetics.wustl.edu/eddy/software/, y FOLDALIGN, tambien distribuido libremente y disponible para descarga en la pagina de internet bioinf.au.dk. FOLDALIGN/ (vease “Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences”. J. Gorodkin, L. J. Heyer y G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pag 3724-3732, 1997; “Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences”. J. Gorodkin, L. J. Heyer, y G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997).

Se pueden usar realizaciones de la presente invencion junto con mutantes que han evolucionado de forma natural o inducidos qmmicamente (los mutantes se pueden seleccionar por tecnicas de cribado, despues transformar con ADD-13 y posiblemente otros genes). Las plantas de la presente invencion se pueden combinar con resistencia a ALS y/o resistencia a glifosato desarrollada. Tambien se puede combinar o “apilar” la resistencia a aminopiralida con un gen ADD-13.

Las tecnicas de reproduccion tradicionales tambien se pueden combinar con la presente invencion para la combinacion, introgresion y mejora potentes de los rasgos deseados.

Las mejoras adicionales tambien incluyen el uso de protectores adecuados para proteger ademas a las plantas y/o anadir resistencia cruzada a mas herbicidas. (Los protectores tfpicamente actuan para aumentar el sistema inmunitario de plantas por activacion/expresion de cP450. Los protectores son agentes qrnmicos que reducen la fitotoxicidad de herbicidas a las plantas de cultivo por un mecanismo fisiologico o molecular, sin comprometer la eficacia del control de las malas hierbas).

Los protectores herbicidas incluyen benoxacor, cloquintocet, ciometrinilo, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen, mefenpir, mefenato, anhfdrido naftalico y oxabetrinilo. Los activadores de plantas (una nueva clase de compuestos que protegen a las plantas activando sus mecanismos de defensa) tambien se pueden usar en realizaciones de la presente invencion. Estos incluyen acibenzolar y probenazol.

Los protectores comercializados se pueden usar para la proteccion de cultivos herbaceos de siembra grande, tales como mafz, sorgo de grano y arroz sembrado en humedo, frente a herbicidas incorporados en pre-plantacion o aplicados pre-brotacion de las familias de tiocarbamato y cloroacetanilida. Tambien se han desarrollado protectores para proteger cultivos de cereales de invierno tales como el trigo frente a aplicaciones pre-brotacion o herbicidas de ariloxifenoxipropionato y sulfonilurea. El uso de protectores para la proteccion del mafz y el arroz frente a herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona, ciclohexanodiona, isoxazol y tricetona tambien esta bien establecido. Una potenciacion inducida por el protector de la detoxificacion de herbicida en las plantas protegidas, esta ampliamente aceptado como el mecanismo principal implicado en la accion protectora. Los protectores inducen cofactores tales como enzimas de glutation y detoxificadoras de herbicidas tales como glutation S-transferasas, citocromo P450 monooxigenasas, y glucosil transferasas. Hatzios KK, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners," Weed Science: Vol. 52, No. 3 pag. 454-467.

El uso de un gen de citocromo p450 monooxigenasa apilado con ADD-13 es una realizacion preferida. Hay P450 implicados en el metabolismo herbicida; cP450 puede proceder de mairnfero o de planta, por ejemplo. En las plantas superiores la citocromo p450 monooxigenasa (P450) se sabe que lleva a cabo un metabolismo secundario. Tambien tiene una funcion importante en el metabolismo oxidativo de xenobioticos en cooperacion con la NADPH-citocromo P450 oxidorreductasa (reductasa). La resistencia a algunos herbicidas se ha descrito como resultado del metabolismo de la P450 asf como de la glutation S-transferasa. Se ha caracterizado una serie de especies de P450 microsomales implicadas en el metabolismo xenobiotico en mamfferos por clonacion molecular. Se ha descrito que algunos de ellos metabolizan varios herbicidas de forma eficaz. Por lo tanto, las plantas transgenicas con P450 de planta o mamffero pueden mostrar resistencia a varios herbicidas.

Una realizacion preferida de lo anterior, es el uso de cP450 para la resistencia al acetoclor (los productos basados en acetoclor incluyen los herbicidas Surpass®, Keystone®, Keystone LA, FulTime® y TopNotch®) y/o trifluralina (tal como Treflan®). Dicha resistencia en las sojas y/o mafz esta incluida en algunas realizaciones preferidas. Para una grna adicional en relacion con dichas realizaciones, vease, p. ej. Inui et al., "A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation," Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005) (en relacion con un sistema de seleccion para la transformacion de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium tumefaciens que usa las citocromo P450 monooxigenasas que metabolizan herbicidas; plantones tolerantes a herbicidas se transformaron y seleccionaron con los herbicidas acetoclor, amiprofos-metilo, clorprofam, clorsulfuron, norflurazon y pendimetalina); Siminszky et al., "Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides," PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, 16 de Febrero, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol. 48, No. 3, pp. 291-295, "A cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71A10) confers

resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum"; y "Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19," J Agric Food Chem. 19 de abril de 2006; 54(8):2985-91 (en relacion con el ensayo de una citocromo p450 monooxigenasa en arroz, donde las plantas de arroz mostraron repetidamente alta tolerancia a las cloroacetomidas (acetoclor, alaclor, metoaclor, 5 pretilaclor, y tenilclor), oxiacetamidas (mefenacet), piridazinonas (norflurazon), 2,6-dinitroanalines (trifluralina y pendimetalina), fosfamidatos (amiprofos-metil, tiocarbamatos (piributicarb), y ureas (clortoluron)).

Tambien hay la posibilidad de alterar o usar diferentes productos de 2,4-D para hacer al gen ADD-13 mas eficaz. Dichos posibles cambios incluyen crear mejores sustratos y mejores grupos labiles (mayor electronegatividad).

Los inhibidores de transporte de auxinas (p. ej., diflufenzopyr) tambien se pueden usar para aumentar la actividad 10 herbicida con el 2,4-D.

Salvo que se indique o este implfcita espedficamente otra cosa, “un”, “una” y “el”, “la” significan “al menos uno” como se usa en la presente memoria.

A continuacion se dan ejemplos que ilustran procedimientos para la practica de la invencion. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la invencion que se indica solo por las reivindicaciones adjuntas. 15 Todos los porcentajes estan en peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en volumen salvo que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 - Metodo para identificar genes que imparten resistencia a herbicida en la planta

Una forma de identificar genes que tienen actividades de degradacion de herbicidas en la planta, es buscar en bases de datos publicas actuales tales como NCBI (National Center for Biotechnology Information). Para empezar el 20 procedimiento, es necesario tener una secuencia de gen funcional ya identificada que codifique una protema con las caractensticas deseadas (es decir, actividad de a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia de protema despues se usa como la entrada para el algoritmo de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) para comparar frente a las secuencias de protemas del NCBI depositadas. Usando los parametros por defecto, esta busqueda devuelve mas de 100 secuencias de protemas homologas a diferentes niveles. Estas vanan desde 25 identidad alta (85-98%) hasta identidad muy baja (23-35%) a nivel de aminoacidos. Tradicionalmente se esperana que solo secuencias con alta homologfa retuvieran propiedades similares a la secuencia de introducida. En este caso, se eleginan solo secuencias con < 50% de homologfa. Como se ha ilustrado antes, se puede usar la clonacion y expresion recombinante de homologos con tan poco como 35% de conservacion de aminoacidos (con respecto a tfdA de Ralstonia eutropha) para impartir niveles comerciales de resistencia no solo al herbicida previsto, sino 30 tambien a sustratos no ensayados nunca previamente con estas enzimas.

Se identifico un solo gen (sdpA) de la base de datos de NCBI (vease la pagina de internet ncbi.nlm.nih.gov; n° de acceso AJ628860) como un homologo con solo 35% de identidad de aminoacidos con tfdA. El porcentaje de identidad se determino primero traduciendo las secuencias de ADN tanto de sdpA como tfdA depositadas en la base de datos de protemas, y despues usando ClustalW en el paquete de programas VectorNTI, para llevar a cabo 35 multiples alineamientos de secuencias.

Ejemplo 2 - Optimizacion de secuencia para la expresion en plantas y bacterias

2.1 - Antecedentes

Para obtener niveles mas altos de expresion de genes heterologos en plantas, se puede preferir remodificar la secuencia de los genes que codifican la protema, de forma que sean expresados mas eficazmente en celulas 40 vegetales. El mafz es una de dichas plantas donde se puede preferir remodificar la region que codifica la protema heterologa antes de transformacion para aumentar el nivel de expresion del gen y el nivel de la protema codificada en la planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseno de genes que codifican una protema bacteriana es remodificar un gen heterologo para la expresion optima.

Una razon para la remodificacion de un gen bacteriano para la expresion en el mafz es por el contenido de G+C no 45 optimo en el gen natural. Por ejemplo, el contenido muy bajo de G+C de muchos genes bacterianos naturales (y el consiguiente sesgo hacia el contenido alto de A+T) da como resultado la generacion de secuencias que implican o duplican las secuencias de control de genes de la planta que se sabe que son muy ricas en A+T. La presencia de algunas secuencias ricas en A+T dentro del ADN del gen o genes introducidos en las plantas (p. ej., regiones de caja TATA encontradas habitualmente en promotores de genes) puede dar como resultado la transcripcion aberrante 50 del gen o genes. Por otra parte, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en al ARNm transcrito (p. ej., secuencias de senal de poliadenilacion tales como AAUAAA, o secuencias complementarias a ARN nucleares pequenos implicados en el corte y empalme pre-ARNm) puede conducir a la inestabilidad del ARN. Por lo tanto, un objetivo en el diseno de genes que codifican una protema bacteriana para la expresion en el mafz, mas preferiblemente denominado gen o genes optimizados para planta, es generar una secuencia de ARN que tiene un 55 contenido de G+C preferiblemente cercano al de los genes del mafz que codifican enzimas metabolicas. Otro objetivo en el diseno del gen o genes optimizados para la planta que codifican una protema bacteriana es generar una secuencia de ADN en la que las modificaciones de la secuencia no impiden la traduccion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La tabla Ej2-1 presenta el contenido de G+C de genes del mafz. Para los datos en la tabla Ej2-1, las regiones codificantes de los genes se extrajeron de las entradas en GenBank (version 71), y las composiciones de bases se calcularon usando el programa MacVector™ (Accelerys, San Diego, California). Se ignoraron las secuencias de intrones en los calculos.

Tabla Ej2-1: Recopilacion de los contenidos de G + C de regiones que codifican protemas de genes del mafz

Clase de protema3

Intervalo de % de G + C % medio deG + CD

Enzimas metabolicas (76)

44,4-75,3 59,0 (± 8,0)

Protemas estructurales (18)

48,6-70,5 63,6 (± 6,7)

Protemas reguladoras (5)

57,2-68,8 62,0 (± 4,9)

Protemas no caracterizadas (9)

41,5-70,3 64,3 (± 7,2)

Todas las protemas (108)

44,4-75,3 60,8 (± 5,2)c

a Numero de genes en la clase dado entre parentesis.

b Desviaciones estandar dadas entre parentesis.

c Media de grupos combinados ignorados en el calculo medio

Existen multiples bases de datos de secuencias de ADN disponibles al publico en donde se puede encontrar informacion sobre los contenidos de G+C de los genomas de las plantas o las regiones que codifican protemas de los diferentes genes de plantas. Una de dichas bases de datos esta en internet en la URL
http://www.kazusa.or.jp/codon/. En este sitio, se puede encontrar que el contenido medio de G+C de, por ejemplo, secuencias que codifican protemas del tabaco (Nicotiana tabacum) es 43,3% (analisis de 1268 secuencias que comprenden 453.797 codones). Se puede encontrar que el contenido medio de G+C de secuencias que codifican protemas el mafz (Zea mays) es 54,9% (analisis de 2280 que comprenden 973.578 codones). En comparacion, el contenido de G+C de la secuencia que codifica la protema AAD-13 de Sphingobium herbicidovorans descrita en la SEQ ID NO: 2 es 67,2%. Por lo tanto, puede ser ventajoso cuando se disena un gen AAD-13 para la expresion en el mafz o dicotiledoneas disminuir el contenido de G+C de la region que codifica la protema a un intervalo de 40-55%. Por lo tanto, un objetivo en el diseno de genes que codifican una protema bacteriana para la expresion en plantas, mas preferiblemente denominados gen o genes optimizados para la planta, es generar una secuencia de ADN que tenga un contenido de G+C preferiblemente cercano al de los genes de la planta hospedante natural que codifican enzimas metabolicas.

Debido a la plasticidad proporcionada por la redundancia/degeneracion del codigo genetico (es decir, algunos aminoacidos son especificados por mas de un codon), la evolucion de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado en uso diferencial de codones redundantes. Este “sesgo de codones” se refleja en la composicion de bases media de regiones que codifican protemas. Por ejemplo, organismos con contenidos relativamente bajos de G+C usan codones que tienen A o T en la tercera posicion de los codones redundantes, mientras que los que tienen contendidos de G+C mayores usan codones que tienen G o C en la tercera posicion. Se cree que la presencia de codones “minoritarios” dentro de un ARNm puede reducir la relacion de traduccion absoluta de ese ARNm, en especial cuando la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codon minoritario es baja. Una extension de esto es que la disminucion de la tasa de traduccion por codones minoritarios individuales sena al menos una suma para los codones minoritarios multiples. Por lo tanto, los ARNm que tienen contenidos relativos altos de codones minoritarios tendnan tasas de traduccion correspondientemente bajas. Esta tasa se reflejana por los posteriores niveles bajos de la protema codificada.

En genes modificados que codifican una protema bacteriana para la expresion en el mafz (u otras plantas, tales como el algodon o la soja), es util si se ha determinado el sesgo de codones de la posible planta o plantas hospedantes. El sesgo de codones se puede calcular como la frecuencia con la que se usa un solo codon con respecto a los codones para todos los aminoacidos. Alternativamente, como se describe en la tabla Ej2-2, columnas C, D, I y J, el sesgo de codones se puede calcular como la frecuencia con la que se usa un codon individual para codificar un aminoacido particular, con respecto a todos los demas codones para ese aminoacido (codones sinonimos). El sesgo de codones para el mafz es la distribucion estadfstica de codones que usa la planta para codificar sus protemas, y el uso de codones calculado a partir de 706 genes del mafz se muestra en la tabla Ej2-2, columnas C e I. Cuando se disenan regiones codificantes para genes que codifican protemas bacterianas dirigidos a la expresion en plantas, deben determinarse los primeros codones (“primera eleccion”) preferidos por la planta, asf como la segunda, tercera, cuarta, etc. elecciones de codones preferidos cuando existen multiples elecciones. Despues se puede disenar una secuencia de ADN nueva que codifica la secuencia de aminoacidos de la protema bacteriana, pero la nueva secuencia de ADN difiere de la secuencia de ADN bacteriana natural (que codifica la protema) por la sustitucion de codones de la planta (primeros preferidos, segundos preferidos, terceros preferidos o cuartos preferidos, etc.) para especificar el aminoacido en cada posicion dentro de la secuencia de aminoacidos de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

la protema. Despues se analiza en la nueva secuencia los sitios de enzimas de restriccion que se pueden haber creado por la modificacion. Los sitios identificados se modifican ademas sustituyendo los codones por los codones preferidos de primera, segunda, tercera o cuarta eleccion. Otros sitios en la secuencia que podnan afectar a la transcripcion o traduccion del gen de interes son las uniones ex6n:intron (5' o 3'), senales de adicion poli A, o senales de terminacion de ARN polimerasa. La secuencia se analiza y modifica ademas para reducir la frecuencia de dobletes TA o CG. Ademas de los dobletes, los bloques de secuencias de G o C que tienen mas de aproximadamente seis restos que son iguales, pueden afectar a la transcripcion o traduccion de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques se ventajosamente se modifican para sustituir los codones de la primera o segunda eleccion, etc., por el siguiente codon de eleccion preferido.

Por lo tanto, con el fin de disenar genes optimizados para plantas que codifican una protema bacteriana, se disena una secuencia de ADN para codificar la secuencia de aminoacidos de dicha protema usando un codigo genetico redundante establecido a partir de una tabla de sesgo de codones compilada a partir de las secuencias de genes para la planta o plantas particulares. La secuencia de ADN resultante tiene un grado mayor de diversidad de codones, una composicion de base deseable, puede contener sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion colocados estrategicamente, y carece de secuencias que pueden interferir con la transcripcion del gen o traduccion del ARNm producto. Dichos genes sinteticos que son funcionalmente equivalentes a los genes/protemas de la presente invencion se pueden usar para transformar hospedantes, que incluyen plantas. Se puede encontrar una grna adicional en relacion con la produccion de genes sinteticos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 5.380.831 y solicitud PCT WO 97/13402.

Para modificar un gen optimizado para planta que codifica una protema ADD-13, se diseno una secuencia de ADN para codificar la secuencia de aminoacidos de ADD-13, usando el codigo genetico redundante establecido a partir de tablas de sesgo de codones compiladas a partir de secuencias codificantes de protemas para las plantas hospedantes particulares (mafz y dicotiledoneas). En la tabla Ej2-2, columnas C, D, I y J, se presentan las distribuciones (en % de uso para todos los codones para esos aminoacidos) de codones sinonimos para cada aminoacido, encontrados en 706 regiones codificantes de Zea mays (mafz) y 154 genes de dicotiledoneas [REF: Murray, E. E., Lotzer, J., Eberle, M. (1989) “Codon usage in plant genes”. Nucl. Acids Res. 17:477-497]. Los codones mas preferidos para cada tipo de planta se indican en negrilla, y se pueden identificar la segunda, tercera y cuarta elecciones de codones cuando existen multiples elecciones. Es evidente que algunos codones sinonimos para algunos aminoacidos se encuentran solo raramente en genes de plantas (p. ej. AGT en mafz y CCG en dicotiledoneas). Ademas, el mafz y las plantas dicotiledoneas difieren en el uso de codones individuales (p. ej. el codon de alanina GCG se encuentra con mas frecuencia en genes del mafz que en genes de dicotiledoneas, mientras que el codon de arginina AGA es usado con mas frecuencia en genes de dicotiledoneas que en genes del mafz). Por lo tanto, es obvio que una region que codifica una protema disenada para reflejar la composicion de codones optima de genes de una especie de planta puede tener una composicion de codones suboptima para la expresion en otra especie de planta. En el procedimiento de diseno para crear una secuencia de ADN que codifica protema que se aproxima a una distribucion de codones media de genes tanto del mafz como de dicotiledoneas, se excluyo cualquier codon que se usa con poca frecuencia con respecto a los otros codones sinonimos para ese aminoacido en otro tipo de planta (indicado por DNU en las columnas F y L de la tabla Ej2-2). Normalmente, se considera que un codon se usa raramente cuando esta representado aproximadamente 10% o menos veces para codificar el aminoacido relevante en genes de cualquier tipo de planta (indicado por NA en las columnas E y K de la tala Ej2-2). Para equilibrar la distribucion de las elecciones de codones que quedan para un aminoacido, se calculo una representacion media ponderada para cada codon, usando la formula:

% medio ponderado de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 donde C1 es el codon en cuestion y %C2, %C3, etc. representan los valores medios en % para el mafz y dicotiledoneas de los demas codones sinonimos (los valores medios de % para los codones relevantes se toman de las columnas E y K) de la tabla Ej2-2.

El valor del % medio ponderado para cada codon se da en las columnas F y L de la tabla Ej2-2.

Tabla Ej2-2. Representacion de codones sinonimos en regiones codificantes de 706 genes de Zea mays (mafz) genes (Columnas C y I), y 154 genes de dicotiledoneas (Columnas D y J). Los valores para una representacion de codones equilibrada-sesgada establecidos para un diseno de gen sintetico optimizado para planta, estan en las columnas F y L.

A

B C D E F G H I J K L

Amino acido

Codon Mafz % Dicot. % Media Mafz- Dicot. Media ponderada Amino acido Codon Mafz % Dicot. % Media Mafz- Dicot. Media ponderada

ALA (A)

GCA 18 25 21,7 25,5 LEU (L) CTA 8 8 NA DNU

GCC

34 27 30,3 35,6 CTC 26 19 22,5 34,3

GCG

24 6 NA DNU CTG 29 9 NA DNU

GCT 24 42 33,2 39,0 CTT 17 28 22,5 34,3

ARG (R)

AGA 15 30 22,4 27,4 TTA 5 10 NA DNU

AGG

26 25 25,7 31,5 TTG 15 26 20,6 31,4

CGA

9 8 NA DNU LYS (K) AAA 22 39 30,6 30,6

CGC

24 11 17,7 21,7 AAG 78 61 69,4 69,4

CGG

15 4 NA DNU MET (M) ATG 100 100 100 100

CGT

11 21 15,8 19,4 PHE (F) TTC 71 55 63,2 63,2

ASN (N)

AAC 68 55 61,4 61,4 TTT 29 45 36,8 36,8

AAT

32 45 38,6 38,6 PRO (P) CCA 26 42 33,8 41,4

ASP (D)

GAC 63 42 52,6 52,6 CCC 24 17 20,7 25,3

GAT

37 58 47,4 47,4 CCG 28 9 NA DNU

CYS (C)

TGC 68 56 61,8 61,8 CCT 22 32 27,2 33,3

TGT

32 44 38,2 38,2 SER (S) AGC 23 18 20,4 26,0

END

TAA 20 48 33,8 AGT 9 14 NA DNU

TAG

21 19 20,1 TCA 16 19 17,5 22,4

TGA

59 33 46,1 TCC 23 18 20,6 26,3

GLN (Q)

CAA 38 59 48,4 48,4 TCG 14 6 NA DNU

CAG

62 41 51,6 51,6 TCT 15 25 19,9 25,4

GLU (E)

GAA 29 49 38,8 38,8 THR (T) ACA 21 27 23,8 28,0

GAG

71 51 61,2 61,2 ACC 37 30 33,6 39,5

GLY (G)

GGA 19 38 28,5 28,5 ACG 22 8 NA DNU

GGC

42 16 29,1 29,0 ACT 20 35 27,7 32,5

GGG

20 12 16,1 16,0 TRP (W) TGG 100 100 100 100

GGT

20 33 26,7 26,6 TYR (Y) TAC 73 57 65,0 65,0

HIS (H)

CAC 62 46 54,1 54,1 TAT 27 43 35,0 35,0

CAT

38 54 45,9 45,9 VAL (V) GTA 8 12 NA DNU

ILE (I)

ATA 14 18 15,9 15,9 GTC 32 20 25,8 28,7

ATC

58 37 47,6 47,9 GTG 39 29 34,1 38,0

ATT

28 45 36,4 36,4 GTT 21 39 29,9 33,3

Se diseno una nueva secuencia de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoacidos de la protema AAD-13 de Sphingobium herbicidovorans de SEQ ID NO: 2 para la expresion optima tanto en celulas de mafz como de dicotiledoneas usando una distribucion de codones equilibrada de codones usados con frecuencia, encontrada en 5 los genes del mafz y dicotiledoneas.

2.2 - Analisis de reconstruccion de AAD-13 para planta

El analisis extenso de los 861 pares de bases (pb) de la region que codifica la secuencia de ADN natural de AAD-13 (SEQ ID NO: 1) puso de manifiesto la presencia de varios motivos de secuencias que se cree que son perjudiciales para la expresion optima en la planta, asf como la composicion de codones no optima. La protema codificada por la 5 SEQ ID NO: 1 (AAD-13) se presenta como la SEQ ID NO: 2. Para mejorar la produccion de la protema recombinante en el mafz, asf como en dicotiledoneas, se desarrollo una secuencia de ADN “optimizada para la planta” (AAD-13 v1) (SEQ ID NO: 3) que codifica una protema (SEQ ID NO: 4) que es la misma que la protema natural descrita en la SEQ ID NO: 2 excepto por la adicion de un resto de alanina en la segunda posicion (subrayado en la SEQ ID NO: 4). El codon de alanina adicional (GCT; subrayado en la SEQ ID NO: 3) codifica parte de un sitio de reconocimiento de 10 la enzima de restriccion Nco I (CCATGG) que abarca el codon de inicio de la traduccion ATG. Por lo tanto, sirve para el doble proposito de facilitar las posteriores operaciones de clonacion a la vez que se mejora el contexto de la secuencia del codon de inicio ATG para optimizar el inicio de la traduccion. Las protemas codificadas por las regiones codificantes naturales y optimizadas para la planta (v1) son 99,3% identicas, y difieren solo en el aminoacido numero 2. En cambio, las secuencias de ADN naturales y optimizadas para la planta (v1) de las 15 regiones codificantes son solo 77,3% identicas. La tabla Ej2-3 muestra las diferencias en las composiciones de codones de las secuencias natural (columnas A y D) y optimizada para la planta (columnas B y E), y permite la comparacion con una secuencia optimizada para la planta teorica (columnas C y F) que tendna precisamente la composicion de codones dictada por las columnas F y L de la tabla Ej2-2.

Tabla Ej2-3. Comparaciones de composiciones de codones de regiones codificantes de AAD-13 natural, version 20 optimizada para la planta (v1) y version optimizada para la planta teorica.

A B C D E F

Amino acido

Codon Natural Opt. planta v1 n° Opt. planta teorico n° Amino acido Codon Natural Opt. planta v1 n° Opt. planta teorico n°

ALA (A)

GCA 1 10 9 LEU (L) CTA 0 0 0

GCC 24 11 13 CTC 11 11 10

GCG 10 0 0 CTG 17 0 0

GCT 1 16 14 CTT 0 10 10

ARG (R)

AGA 0 4 4 TTA 0 0 0

AGG 0 5 5 TTG 2 9 9

CGA 1 0 0 LYS (K) AAA 0 3 3

CGC 10 4 3 AAG 10 7 7

CGG 4 0 0 MET(M) ATG 9 9 9

CGT 1 3 3 PHE (F) TTC 8 6 6

ASN (N)

AAC 3 2 2 TTT 1 3 3

AAT 1 2 2 PRO (P) CCA 2 7 7

ASP (D)

GAC 19 13 13 CCC 5 5 5

GAT 5 11 11 CCG 10 0 0

CYS (C)

TGC 2 1 1 CCT 1 6 6

TGT 0 1 1 SER (S) AGC 9 4 4

END

TAA 0 0 AGT 1 0 0

TAG 0 0 TCA 1 3 3

TGA 1 1 1 TCC 1 4 4

GLN (Q)

CAA 0 7 7 TCG 3 0 0

CAG 14 7 7 TCT 0 4 4

5

10

15

20

25

30

35

GLU (E)

GAA 3 5 5 THR (T) ACA 0 3 3

GAG

11 9 9 ACC 7 4 4

GLY (G)

GGA 1 6 6 ACG 4 0 0

GGC

16 6 6 ACT 0 4 4

GGG

3 3 3 TRP (W) TGG 7 7 7

GGT

1 6 6 TYR (Y) TAC 5 4 5

HIS (H)

CAC 7 7 8 TAT 2 3 2

CAT

7 7 6 VAL (V) GTA 0 0 0

ILE (I)

ATA 0 2 2 GTC 6 4 4

ATC

10 5 5 GTG 7 6 6

ATT

1 4 4 GTT 2 5 5

Totales 157 158 158 Totales 131 131 131

Esta claro a partir del examen de la tabla Ej2-3 que las regiones codificantes naturales y optimizadas para la planta, aunque codifican protemas casi identicas, son sustancialmente diferentes unas de otras. La version optimizada para la planta (v1) imita estrechamente la composicion de codones de una region codificante optimizada para la planta teorica que codifica la protema de ADD-13.

2.3 Reconstruccion para la expresion en E. coli

Las cepas modificadas especialmente de Escherichia coli y sistemas de vectores asociados, se usan a menudo para producir cantidades relativamente grandes de protemas para estudios bioqmmicos y analfticos. A veces se encuentra que un gen natural que codifica la protema deseada no es adecuado para la expresion con alto nivel en E. coli, incluso aunque el organismo fuente para el gen puede ser otro organismo bacteriano. En dichos casos se puede y es conveniente remodificar la region codificante de la protema del gen para hacerlo mas adecuado para la expresion en E. coli. Los genes de clase II de E. coli se definen como aquellos que son expresados en gran cantidad y de forma continua durante la fase de crecimiento exponencial de celulas de E. coli. [REF: Henaut, A. y Danchin, A. (1996) en “Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology”, vol. 2, pag. 2047-2066. Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingraham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M., Schaechter, M. y Umbarger, H. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, DC]. Mediante el examen de las composiciones de codones de las regiones codificantes de los genes de clase II de E. coli, se puede idear una composicion de codones media para esas regiones codificantes de genes de clase II de E. coli. Se cree que una region codificante de protema que tiene una composicion de codones media que imita la de los genes de clase II sera favorecida para la expresion durante la fase de crecimiento exponencial de E. coli. Usando esta grna, se diseno una nueva secuencia de ADN que codifica la protema de AAD-13 (SEQ ID NO: 4; que incluye la alanina adicional de la segunda posicion, mencionada antes), de acuerdo con la composicion media de codones de las regiones codificantes de genes de clase II de E. coli. La secuencia inicial, cuyo diseno se baso solo en la composicion de codones, se modifico ademas para incluir algunas secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion para la clonacion en vectores de expresion de E. coli. Se evitaron caractensticas de secuencia perjudiciales tales como estructuras de tallo-bucle muy estables, como eran las secuencias intragenicas homologas al extremo 3' del ARN ribosomico 16S (es decir, secuencias de Shine Dalgarno). La secuencia optimizada para E. coli (v2) se describe como la SEQ ID NO: 5 y codifica la protema descrita en la SEQ ID NO: 4.

Las secuencias de ADN natural y optimizada para E. coli (v2) son 80,2% identicas, mientras que las secuencias de ADN optimizadas para planta (v1) y optimizadas para E. coli (v2) son 84,4% identicas. La tabla Ej2-4 presenta las composiciones de codones de la region codificante de AAD-13 natural (columnas A y D), la region codificante de AAD-13 optimizada para la expresion en E. coli (v2; columnas B y E) y la composicion de codones de una region codificante teorica para la protema AAD-13 que tiene una composicion de codones optima de genes de clase II de E. coli (columnas C y F).

Tabla Ej2-4. Comparaciones de composicion de codones de regiones codificantes de AAD-13 natural, version optimizada para E. coli (v2) y version optimizada para clase II de E. coli teorica.

A B C D E F

Amino- acido

Codon Natural Opt. E. coli v2 n° Clase II teorico n° Amino- acido Codon Natural Opt. E. coli v2 n° Clase II teorico n°

ALA (A)

GCA 1 11 11 LEU (L) CTA 0 0 0

GCC

24 0 0 CTC 11 0 0

GCG

10 14 14 CTG 17 30 30

GCT

1 12 12 CTT 0 0 0

ARG (R)

AGA 0 0 0 TTA 0 0 0

AGG

0 0 0 TTG 2 0 0

CGA

1 0 0 LYS (K) AAA 0 8 8

CGC

10 7 5 AAG 10 2 2

CGG

4 0 0 MET(M) ATG 9 9 9

CGT

1 9 11 PHE (F) TTC 8 6 6

ASN (N)

AAC 3 4 4 TTT 1 3 3

AAT

1 0 0 PRO (P) CCA 2 3 3

ASP (D)

GAC 19 13 13 CCC 5 0 0

GAT

5 11 11 CCG 10 15 15

CYS (C)

TGC 2 1 1 CCT 1 0 0

TGT

0 1 1 SER (S) AGC 9 4 4

END

TAA 0 1 1 AGT 1 0 0

TAG

0 0 0 TCA 1 0 0

TGA

1 0 0 TCC 1 5 5

GLN (Q)

CAA 0 3 3 TCG 3 0 0

CAG

14 11 11 TCT 0 6 6

GLU (E)

GAA 3 10 11 THR (T) ACA 0 0 0

GAG

11 4 3 ACC 7 7 7

GLY (G)

GGA 1 0 0 ACG 4 0 0

GGC

16 10 10 ACT 0 4 4

GGG

3 0 0 TRP (W) TGG 7 7 7

GGT

1 11 11 TYR (Y) TAC 5 5 5

HIS (H)

CAC 7 10 10 TAT 2 2 2

CAT

7 4 4 VAL (V) GTA 0 3 3

ILE (I)

ATA 0 0 0 GTC 6 0 0

ATC

10 7 7 GTG 7 5 5

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ATT 1 4 4 GTT 2 7 7

Totales 157 158 158 Totales 131 131 131

Esta claro a partir del examen de la tabla Ej2-4, que las regiones codificantes optimizadas para E. coli, aunque codifican protemas casi identicas, son sustancialmente diferentes unas de otras. La version optimizada para E. coli (v2) imita estrechamente la composicion de codones de una region codificante optimizada para E. coli teorica que codifica la protema AAD-13.

Ejemplo 3 - Clonacion de vectores de expresion y transformacion

3.1 Construccion de vector de expresion pET, de E. coli

Usando las correspondientes enzimas de restriccion para los sitios anadidos con los conectores de clonacion (Xba 1, Xho 1), se corto AAD-13 (v2) del vector de Picoscript, y se ligo a un vector de resistencia a estreptomicina/espectinomicina PET280. Los productos ligados despues se transformaron en E. coli TOP10F', y se cultivaron en placas de agar con caldo Luria + estreptomicina y espectinomicina 50 pg/ml (LB S/S).

Para diferenciar entre los ligados de AAD-13 (v2):pET280 y pCR2.1:pET280, se anadieron aproximadamente 20 colonias aisladas en 6 ml de LB-S/S, y se cultivaron a 37°C durante 4 horas con agitacion. Despues cada cultivo se aplico en manchas en placas de LB + Kanamicina 50 pg/ml, que se incubaron a 37°C durante la noche. Se dio por supuesto que las colonias que crecieron en el LB-K teman ligado el vector pCR2.1 y se descartaron. Se aislaron los plasmidos de los cultivos restantes como antes, y se comprobo la correccion con digestion con Fsp1. La construccion de expresion final se denomino pDAB4115.

3.3 - Terminaciones de vectores binarios

El gen optimizado para planta AAD-13 (v1) se recibio de Picoscript (el diseno de la reconstruccion del gen se habfa completado (vease antes) y se externalizo a Picoscript para la construccion. El gen AAD-13 (v1) se clono en pDAB4055 como un fragmento Nco I - Sac I. La construccion resultante se denomino pDAB4113, y contema: [promotor AtUbi10: AAD-13 (v1): AtuORFI 3'UTR] (verificado con digestiones con enzimas de restriccion Nco I y Sac I). Despues se clono un fragmento Not I-Not I que contema el casete descrito en el sitio de Not I del vector binario pDAB3038. El vector binario resultante, pDAB4l14, que contema el siguiente casete [promotor AtUbi10: AAD-13 (v1): AtuORFI 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] se digirio con enzimas de restriccion (con SacI) para verificar la orientacion correcta. La construccion completada verificada (pDAB4114) se uso para la transformacion en Agrobacterium (vease el ejemplo 6).

Ejemplo 4 - Expresion y purificacion de AAD-13 recombinante en Pseudomonas fluorescens

4.1 - Fermentacion de Pseudomonas fluorescens

Para el experimento en matraz de agitacion, se usaran 200 pl de la solucion madre en glicerol de la cepa Pseudomonas fluorescens que llevaba la construccion AAD-13 (v1) (sec 3.2), para inocular 50 ml de medio LB de nueva aportacion complementado con tetraciclina/HCl 30 pg/ml. El cultivo (en un matraz Erlenmeyer con deflectores der 250 ml) se incubara en un agitador (New Brunswick Scientific Modelo Innova 44) a 300 rpm y 30°C durante 16 h. Se transferiran 20 ml de cultivo de siembra a 1 litro de medio de cultivo de Pseudomonas fluorescens (extracto de levadura, 5 g/l; K2HPO4, 5 g/l; (NH4)2PO4, 7,5 g/l; (NH4)2SO4; MgSO4-7H2O, 1 g/l; KCl, 0,5 g/l; CaCh-2H2O, 0,5 g/l; citratoNa-2H2O, 15 g/l; glicerol, 95 g/l; solucion de oligoelementos, 10 ml/l; solucion de oligoelementos: FeCl3-6H2O,

5.4 g/l; MnCl2-4H2O, 1 g/l; ZnSO4-7H2O, 1,45 g/l; CuSO4-5H2O, 0,25 g/l; H3BO3, 0,1 g/l; (NH4^MOyO24, 0,1 g/l; HCl concentrado, 13 ml/l) complementado con tetraciclina/HCl 20 pg/ml y 250 pl de Pluronic L61 (antiespumante) en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 2,8 litros. Los cultivos se van a incubar a 30°C y 300 rpm durante 24 h. Se anadira p-D-1-tiogalacto-piranosido de isopropilo (IPTG) hasta 1 mM final en los cultivos y se continuara incubando durante aproximadamente 48 h a 25°C. Las celulas se recogen por centrifugacion a 7 krpm a 4°C durante 15 min, y la pasta celular se almacena a -80°C o se procesa inmediatamente para la purificacion.

Para los experimentos en tanque, se inoculara 1 ml de cada solucion madre en glicerol en un matraz con deflectores de 1 litro que contiene 200 ml de medio LB complementado con tetraciclina/HCl 30 pl/ml a 300 rpm y 32°C durante 16-24 h. Despues, los cultivos combinados de tres matraces (600 ml) se transfirieron asepticamente a un fermentador de 20 litros (B. Braun Bioreactor Systems) que contema 10 litros de medio definido patentado por Dow (por Teknova, Hollister, CA) disenado para soportar crecimiento de alta densidad celular. La temperatura del crecimiento se mantiene a 32°C hasta que el pH se controla al punto fijado deseado por la adicion de amoniaco acuoso. El oxfgeno disuelto se mantendra a un nivel positivo en el cultivo lfquido, regulando el flujo de aire burbujeado y las velocidades de agitacion. El procedimiento de fermentacion discontinuo alimentado se lleva a cabo durante aproximadamente 24 h hasta que la densidad celular alcanza DO575170-200. Despues se anade IPTG hasta 1 mM para inducir la expresion de protema recombinante y la temperatura se reduce y se mantiene a 25°C usando circulacion de suministro de agua fria. La fase de induccion de la fermentacion se dejara continuar durante otras 24

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h. Se recogen muestras (30 ml) para diferentes analisis para determinar la densidad celular y el nivel de expresion de protemas en los puntos de medicion de 6, 12 y 18 h despues de induccion. Al final de un experimento de fermentacion, se recogen las celulas por centrifugacion a 10 krpm durante 30 min. Los sedimentos celulares despues se congelan a -80°C para el procesamiento posterior.

4.2 - Purificacion de AAD-13 para la caracterizacion bioqmmica y produccion de anticuerpos.

Aproximadamente 100-200 g de celulas de Pseudomonas congeladas (o frescas) se descongelan y se vuelven a suspender en 1-2 litros de tampon de extraccion que contiene Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, y 25 ml de coctel inhibidor de proteasa (Sigma n° de cat. P8465). Las celulas se rompen con un microfluidizador (modelo M110L o 110Y) (Microfluidics, Newton, MA) sobre hielo con un paso a 773,4-843,7 kg/cm2 (11.000-12.000 psi). El lisato se centrifuga a 24.000 rpm durante 20 min. El lfquido sobrenadante se transferira y dializara frente a 10 volumenes de Tris-HCl 20 mM, a pH 8,5 durante la noche a 4°C, o se diafiltrara con este tampon y se filtrara a traves de una membrana de 0,45 pm antes de aplicar a las separaciones por columna. Todas las posteriores separaciones de protemas se llevaran a cabo usando Pharmacia AKTA Explorer 100 y realizadas a 4°C. Antes de la carga, se equilibra una columna de flujo rapido Q Sepharose (Pharmacia XK 50/00, tamano del lecho de 500 ml) con tampon de Tris-HCl 20 mM, pH 8,5. La muestra se aplica a la columna a 15 ml/min y despues se lava con este tampon hasta que la DO280 del eluato vuelve a su valor base. Las protemas se eluyen con 2 litros de gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,3 M con un caudal de 15 ml/min, mientras se recogen fracciones de 45 ml. Se van a juntar las fracciones que contienen actividad de AAD-13, determinado por ensayo enzimatico colorimetrico, y tambien que corresponden al peso molecular previsto de la protema AAD-13 (banda de aproximadamente 32 kDa en SDS-PAGE). Se anade sulfato amonico solido hasta 0,5 M final a la muestra y despues se aplica a una columna Phenyl HP (Pharmacia XK 50/20, tamano de lecho 250 ml) equilibrada en sulfato amonico 0,5 M en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Esta columna se laca con el tampon de union a 10 ml/min hasta que la DO280 del eluato vuelve a su valor base, las protemas se eluyen en 2 volumenes de columna a 10 ml/min mediante un gradiente lineal de sulfato amonico de 0,5 M a 0 en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, y se recogen fracciones de 12,5 ml. Las fracciones de los picos principales que contienen AAD-13 se juntaran, y si es necesario, se concentraran usando un dispositivo de filtro centnfugo de membrana de corte de exclusion de peso molecular 10 kDa (Millipore). En algunos casos, la muestra se aplica ademas a una columna de filtracion en gel Superdex 75 (Pharmacia Xk 16/60, tamano del lecho 110 ml) con tampon PBS con un caudal de 1 ml/min. Las fracciones de los picos que contienen ADD-13 pura se juntan y almacenan a -80°C para el uso futuro.

Ejemplo 5 - Ensayos in vitro de la actividad de AAD-13

5.1 - Ensayo por deteccion colorimetrica de fenol

La actividad enzimatica se medira por deteccion colorimetrica del producto fenolico usando un protocolo modificado del de Fukumori y Hausinger (1993) (J Biol. Chem. 268: 24311-24317) para permitir el desarrollo en un formato de microplaca de 96 pocillos. El ensayo colorimetrico se ha descrito para usar en la medicion de la actividad de dioxigenasas en la escision de 2,4-D y diclorprop para usar el producto 2,4-diclorofenol. La intensidad del color de varios fenoles se comparo con la del 2,4-diclorofenol usando el metodo de deteccion descrito previamente para evaluar que productos fenolicos se podnan detectar facilmente. Los fenoles y analogos de fenol se ensayaron con una concentracion final 100 pM en 0,15 ml de MOPS 20 mM pH 6,75 que contiene NH4(FeSO4)2 200 pM, ascorbato sodico 200 pM. Los piridinoles derivados de fluroxipir y triclopir no produjeron color significativo. La intensidad del color del 2,4-diclorofenol era lineal y proporcionar a la concentracion de fenol en el ensayo hasta ~500 pM. Una curva de calibracion realizada en condiciones de ensayo convencionales (volumen final de ensayo 160 pl) indicaban que se habfa obtenido una absorbancia a 510 nm de 0,1 a partir de fenol 17,2 pM.

Los ensayos enzimaticos se llevan a cabo en un volumen total de 0,16 ml de MOPS 20 mM a pH 6,75 que contiene NH4FeSO4 200 pM, ascorbato sodico 200 pM, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato adecuado (anadido de una disolucion madre 100 mM hecha en DMSO), y enzima. Los ensayos se inicial por adicion del sustrato de ariloxialcanoato, enzima o a-cetoglutarato en el tiempo cero. Despues de 5 minutos de incubacion a 25°C, la reaccion se termina por adicion de 30 pl de una mezcla 1:1:1 de Na EDTA 50 mM; tampon a pH 10 (acido borico 3,09 g + KCl 3,73 g + 44 ml de KOH 1 N) y 4-aminoantipirina al 0,2%. Despues se anaden 10 pl de ferricianuro potasico al 0,8% y despues de 5 o 10 min, se registra la absorbancia a 510 nm en un lector de microplaca espectrofotometrico. Los blancos conteman todos los reactivos excepto la enzima, para explicar la ligera contaminacion ocasional de algunos de los sustratos por pequenas cantidades de fenoles.

5.2 - Ensayo por deteccion de cloropiridinol

La accion de la AAD-13 sobre potenciales sustratos tales como el herbicida triclopir que contiene una piridina sustituida (en lugar de anillos de benceno) liberara un piridinol en la escision del enlace de ariloxialcanoato. Los piridinoles no se detectaban usando la deteccion de fenoles de aminoantipirina/ferricianuro descrito en la seccion precedente. Sin embargo, se encontro que los productos cloropiridinoles absorbfan fuertemente en el UV cercano con Amax de 325 nm a pH 7 (coeficiente de extincion -8.400 M'1.cm'1). Esto se uso para crear un ensayo espectrofotometrico basado en microplaca continuo. Los ensayos se llevan a cabo en un volumen total de 0,2 ml de mOpS 20 mM a pH 6,75 que contiene NH4FeSO4 200 pM, ascorbato sodico 200 pM, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato adecuado (anadido de una disolucion madre 100 mM hecha en DMSO), y enzima. Los ensayos se inician

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por adicion del sustrato ariloxialcanoato, enzima o a-cetoglutarato en el tiempo cero, y se sigue el aumento de absorbancia durante 10 minutos a 325 nm en un lector de microplaca. Los primeros 2 minutos de la reaccion se usaran para determinar las velocidades iniciales.

5.3 - Ensayo colorimetrico usando 2-(2-cloro,4-nitrofenoxi)propionato

Se ideo un ensayo conveniente de la AAD-13 usando 2-(2-cloro,4-nitrofenoxi)propionato (CNPP) como sustrato. La escision del CNpP por la AAD-13 liberara 2-cloro-4-nitrofenol. Este fenol tiene una absorbancia amarillo brillante a 410 nm a un pH que permite seguir la reaccion de forma continua en por analisis en puntos finales. La presencia de la actividad de AAD-13 se puede seguir visualmente sin necesidad de la adicion de reactivos adicionales. Se llevaron a cabo ensayos espectrofotometricos basados en microplaca en un volumen total de 0,2 ml de MOPS 20 mM a pH 6,75 que contiene NH4FeSO4 200 jM, ascorbato sodico 200 jM, a-cetoglutarato 1 mM, la cantidad adecuada de CNpP (anadido de una disolucion madre 100 mM hecha en DMSO), y enzima. Los ensayos se inician por adicion de CNPP, enzima o a-cetoglutarato en el tiempo cero, y se sigue el aumento de absorbancia durante 10 minutos a 410 nm en un lector de microplaca. Los primeros 2 minutos de la reaccion se usaran para determinar las velocidades iniciales. Una curva de calibracion realizada en condiciones de ensayo convencionales (volumen final del ensayo 200 jl) indicaba que se obtema una absorbancia a 410 nm de 0,1 a partir de 2-cloro-4-nitrofenol 25,1 jM. Usando este ensayo, se determino que las constantes cineticas para el CNPP como sustrato eran Km = 31 ±5,5 jM y kcat = 16,2 ± 0,79 mini-1.

5.4 - Ensayo de acoplamiento

Con el fin de ensayar una amplia variedad de sustratos, se detecto la produccion de succinato a partir de la rotura del a-cetoglutarato espectrofotometricamente usando un protocolo basado en el metodo de Luo et. al. (2006) (Anal. Biochem. 353: 69-74). Como se representa en la figura 3, la rotura concomitante del a-cetoglutarato y el sustrato de interes por la AAD-13, da como resultado la produccion de succinato. El succinato despues es modificado a succinil- CoA por la succinil-CoA sintetasa que consume ATP y produce ADP. Despues el ADP es consumido por el sistema de acoplamiento enzimatico de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa usado habitualmente (Sigma P0294). La conversion resultante del NADH en NAD se sigue espectrofotometricamente a 340 nm.

5.4.1. - Clonacion y expresion de succinil-CoA sintetasa y AAD-13 (v2) marcadas con His

Los dos genes de E. coli que codifican la sintetasa, sucC y sucD, se amplificaron fuera de la cepa Top10 de E. coli de Invitrogen como un amplicon individual. El ADN genomico se obtuvo hirviendo una parte alfcuota de las celulas durante 10 min, despues centrifugando y reteniendo el lfquido sobrenadante que contiene el ADN. Como molde para la AAD-13 (v2), se uso el clon en pET pDAB4115 previamente creado. Para amplificar los genes sucCD, se usaron los siguientes cebadores: suc-Nde (SEQ ID NO: 8) 5' CATATGAACTTACATGAATATCAGGCAAAAC 3' y suc-Xho (SEQ ID NO: 9) 5' CTCGAGTTTCAGAACAGTTTTCAGTGCTTC 3'. Para AAD-13 (v2), se usaron los siguientes cebadores: aad-13F (SEQ ID NO: 10) 5' CATATGGCGAGCCCGGCG 3' y aad-13R (SEQ ID NO: 11) 5' CTCGAGGTGTGCCAGTGCGGTCTC 3'. Estos anaden sitios de restriccion adecuados para la clonacion en direccion 3' y eliminan el codon de parada para permitir el marcaje con His. Para la reaccion, las condiciones del ciclador termico eran: 96°C 2 min, despues 35 ciclos a 96°C 30 s, 53°C 30 s, 72°C 1,5 min, seguido de un ciclo final a 72°C 5 min. Los amplicones resultantes se subclonaron para verificar la secuencia correcta. Cada uno de los clones que contema el inserto correcto se digirio con Nde1/Xbo1 y los insertos despues se clonaron en el vector de expresion pET-26b(+). Para la expresion, se raspo un cesped de E. coli BL-21 en 50 ml de LB + Kan (50 jg/ml) y se cultivo a 37°C durante 2 h. Se transfirieron 2 ml de este cultivo a 100 ml de LB + Kan. Estos matraces se cultivaron a 37°C durante 4 h. Las celulas se indujeron con IPTG 50 jM, y se cultivaron durante la noche a 25°C. Los cultivos se centrifugaron y el sedimento celular se uso para la purificacion de protemas.

5.4.2 - Purificacion de AAD-13 y succinil-CoA sintetasa marcada con His

La AAD-13 marcada con His se purifico usando protocolos de cromatograffa de afinidad de metales basandose en las indicaciones del fabricante de la columna. Los sedimentos celulares se recogieron de 1 litro de cultivo y se almacenaron a -80°C, se descongelaron y se volvieron a suspender en 20 ml de tampon de extraccion (Tris-HCl 100 mM, a pH 8; 200-300 jl de coctel de inhibidor de proteasa (Sigma P8849), lisozima 1 mg/ml y MgCh 1 mM). Las celulas resuspendidas se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 min antes de tratar con DNasa para reducir la viscosidad. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4°C. El extracto se centrifugo durante 20 min a 20.000 x g para clarificar. Usando un caudal de 1 ml/min, se aplico el lfquido sobrenadante resultante a 2 cartuchos consecutivos de 1 ml de Co-MAC™ (EMD/Novagen 71650) previamente equilibrados con tampon A (Tris 25 mM a pH 8,0, NaCl 0,5 M). Despues de cargar el extracto, la columna se lavo con imidazol 5 mM en tampon A hasta que la DO280 volvio al valor base. La protema se eluyo con imidazol 50 mM en tampon A. Las fracciones que conteman AAD-13 predominantemente, indicado por una banda a aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE, se intercambiaron en tampon C (Tris 20 mM a pH 8,0, NaCl 100 mM, DTT 2 mM) usando columnas de desalacion BG- 10 (Bio-Rad). Despues se realizo el ensayo espectrofotometrico de AAD-13 en tampon C de acuerdo con el ensayo acoplado in vitro.

La succinil-CoA sintetasa marcada con His se purifico usando cartuchos consecutivos de 1 ml de Co-MAC™

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(EMD/Novagen 71650) y protocolos basados en las instrucciones del fabricante. Los sedimentos celulares que se habfan almacenado a -80°C se descongelaron y se volvieron a suspender en 50 ml de tampon de extraccion (Tris- HCl 100 mM, a pH 7,2; 200-300 |jl de coctel de inhibidor de proteasa (Sigma P8849), lisozima 1 mg/ml y MgCh 1 mM) por litro de cultivo celular. Las celulas resuspendidas se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 min antes de tratar con DNasa para reducir la viscosidad. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4°C, salvo que se indique otra cosa. El extracto se centrifugo durante 20 min a 20.000 x g para clarificar. En este punto el lfquido sobrenadante se puede aplicar directamente a cartuchos Co-MAC™ previamente equilibrados con tampon de union (NaCl 0,5 M, Tris-Hcl 20 mM a pH 7,9 e imidazol 5 mM) o llevar a sulfato amonico al 80%. La muestra tratada con sulfato amonico se centrifugo durante 20 min a 20.000 x g para sedimentar la protema. El sedimento se volvio a suspender en tampon A (Tris 25 mM a pH 8,0, NaCl 0,5 M) y se separo el sulfato amonico residual usando columnas de salacion BG-10 (Bio-Rad) preequilibradas con tampon A. Las muestras resultantes se aplicaron a cartuchos Co- MAC™ previamente equilibrados con tampon de union y un caudal de 1 ml/min. Despues de la aplicacion de la protema extrafda, la columna se aclaro con 10 volumenes de columna de tampon B al 0,5% (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, e imidazol 1 M). A esto le siguio un gradiente por etapas con 5 volumenes de columna de tampon B al 6% y un gradiente por etapas de 10 volumenes de columna adicionales de tampon B al 50%. La mayona de las protemas deseadas eluyeron con el gradiente de tampon B al 6%. Las fracciones que conteman succinil-CoA sintetasa se identificaron por la presencia de dos bandas correspondientes a las subunidades de la succinil-CoA sintetasa (~40 y 33 kDa) por SDS PAGE y la deteccion de la correspondiente actividad in vitro. La actividad de la succinil-CoA sintetasa se confirmo usando una version modificada de ensayo acoplado in vitro, mas adelante. Brevemente, el avance de la reaccion se siguio espectrofotometricamente a 340 nm en presencia de tris 100 mM pH 8,0, PEP 1 mM, NADH 0,4 mM, MgCh 10 mM, CoA 0,2 mM, ATP 0,2 mM, PK 3,5 U/ml, LDH 5 U/ml, y SCS. La reaccion se inicio por la adicion de succinato 1 mM.

5.4.3 - Ensayo acoplado in vitro

La identificacion de los sustratos de la AAD-13 (v2) in vitro se baso en la actividad enzimatica detectada durante el seguimiento espectrofotometrico continuo de un volumen de reaccion de 0,2 ml en una placa de microvaloracion de 96 pocillos. Las condiciones de reaccion eran las siguientes: MOPS 100 mM a pH 7,0, NaDH 0,4 mM, ATP 0,4 mM, CoA 0,4 mM, PEP 1 mM, MgCh 10 mM, FeSO4 0,1 mM (solubilizado en HCl), y ascorbato 0,1 mM, a-cetoglutarato 1 mM y suficiente AAD-13 (v2) para producir una velocidad observable en presencia de 2,4-D. Las enzimas de acoplamiento (SCS/PK/LDH) se ajustaron por lote para asegurar el acoplamiento adecuado, y los potenciales sustratos se ensayaron en general a 1 mM. Las alteraciones en las concentraciones de sustrato se hicieron segun fuera necesaria para ajustar la solubilidad. Las reacciones se iniciaron bien por adicion de AAD-13 (v2) o del sustrato potencial. La velocidad de conversion independiente del sustrato del a-cetoglutarato en succinato por la AAD se siguio en las condiciones de ensayo anteriores y se resto de las velocidades de reaccion observadas. Las velocidades de reaccion observadas con sustratos de propionato se dividieron entre dos para ajustar para la produccion de piruvato resultante de la escision de estos compuestos con la AAD. Adicionalmente, se comprobo en los compuestos de propionato la contaminacion por piruvato por seguimiento espectrofotometrico del consumo de NADH en presencia del compuesto y PK/LDH.

5.4.4 Resultados de cribado in vitro

La tabla Ej5 presenta la velocidad de reaccion de la AAD-13 (v2) observada con multiples procesos qmmicos por el ensayo acoplado in vitro. Las velocidades de reaccion se dan como un porcentaje de la velocidad de reaccion del

2,4-D obtenida en el mismo conjunto de muestra. Estos datos se pueden usar para separar cualitativamente sustratos de no sustratos, asf como para identificar tendencias en la eficacia del sustrato. Debe observarse que velocidades mas rapidas pueden ser mas diffciles de comparar con precision dependiendo del porcentaje de sustrato disponible consumido. Esto es particularmente cierto para compuestos de propionato que presentan doble velocidad que los compuestos que no son propionato para el numero equivalente de recuperaciones de enzima. Como resultado, se agruparan adecuadamente sustratos muy eficientes cuando se comparen con sustratos de baja eficacia. Sin embargo, dentro del agrupamiento de sustratos muy eficientes, los compuestos no se pueden separar cuantitativamente por un cribado usando velocidades individuales del sustrato y AAD. Los compuestos indicados con un asterisco se ensayaron en concentracion 0,5 mM en lugar de 1 mM debido a la interferencia en la absorbancia a mayores concentraciones.

Tabla Ej 5

Nombre

X n° Sustrato S/N % de actividad de 24D ESTRUCTURA MOLECULAR

191716 S 66 OH h3c^^o^4o CH3

571320 S 39 CH, h3c'1L^no"V0 OH

93116 S 128 OH <A-0 ^jQ}

475726 S 112 O Cl'y^ /-oh

118942 S 46 on . OJ H3C ^

470901 S 30 CT oVF

R-fenoxaprop

11044492 N 2 O Quiral (Vo ft CH. WVV'o

Mecoprop

188874 S 169 H,C

r diclorprop

19

r,s diclorprop

117613 S 195 „ CH, _ r^0jya ho Cl

S-dihlorprop

S 233

2,4-D

195517 S 100 V o-Ocl ho Cl

24DB

178577 N 2 K.C y^cr a

Nombre

X n° Sustrato S/N % de actividad de 24D ESTRUCTURA MOLECULAR

3-amino 24D

11263526 S 151 NH, °xix: V"

11113675 S 113 o o o ^ o

124988 S 44 LL o

83293 S 106 „ CH,___ Vo jqt ho C 1

alfa metil floroxipir

11182286 S 43 NH2 o

fluroxipir

68316 S 67 F ho yv cir NH=

triclopir

156136 N 6 Cl hH-H-o, Cl

93833 S 33 F Cl

66357 S 24 ChL ..._. Vo jya ho Cl

91767 S 88 n CH3 / v-( J?l’vCl ho7 o'y/ Cl

116844 S 25 MS- vcy J

Nombre

X n° Sustrato S/N % de actividad de 24D ESTRUCTURA MOLECULAR

diclofop

460511 S >100 C! Cl OH

fluazifiop

67131 S ~50 OH F 0 T °'lPl n ch3

quizalofop

44936* S oOVrs ho j ^ JL // ft ch3 a

cihalofop

7466 S OH f oK y,cHs NHJ"0 \Lr°

66732 S >100 O H^° 0

8563 S 64 CHj

193908 S 56 Q r-v A V)r-^V0 °H o N^=/

761310* No detectado 0 C!^a P^VH cr b

11077344* No detectado c'YYVt° OH Cl

198167 No detectado BrTtv/ OH Br

11077347* No detectado ciYVh° oh

238166* No detectado 0 t + o-YYVf --^''0 OH

Nombre

X n° Sustrato S/N % de actividad de 24D ESTRUCTURA MOLECULAR

657338 N 5 Cl O^-^OH CHJ Uf 6

657339 N 5 o Q-vC O X

11213586 N 2 ___F O a~0~*!!xsi 4 0 OH

11453845 N 13 fy0H

187507 N 10 y-V Cl

204558* No detectado Cl Oy"

188495 M 19 CH, ____/ 3 Cl VvfV1 ho u y=zJ Cl

187439 No detectado a •Vv-6- a

1190305 No detectado Nl- HO _______ t a

La AAD-13 es diferente de otras dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato que tienen actividad degradadora de

2,4-D. Una diferencia clave es la amplia variedad de sustratos ariloxi y alquiloxialcanoato, pero una serie de sustitutos piridiloxi son herbicidas y sustratos eficaces (p. ej., fluroxipir) pero otros herbicidas como triclopir son 5 sustratos considerablemente peores. Esto crea una nueva oportunidad para usar herbicidas alternativos para el control de plantas transgenicas con sustratos de la AAD-13. Tambien proporciona la oportunidad de complementar genes similares en la planta, para ampliar la tolerancia o mejorar la variedad de sustratos a los que son tolerantes las plantas.

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Ejemplo 6 - Transformacion en Arabidopsis y seleccion

6.1 - Condiciones de crecimiento de Arabidopsis thaliana

Se suspendieron semillas de Arabidopsis de tipo natural en solucion de agarosa al 0,1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La semilla suspendida se almaceno a 4°C durante 2 dfas para completar los requisitos de dormancia y asegurar germinacion de la semilla sincronica (estratificacion).

La mezcla Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) se cubrio con vermiculita fina y se sub-rego con solucion de Hoagland hasta estar humeda. L mezcla de suelo se dejo drenar durante 24 horas. La semilla estratificada se sembro sobre la vermiculita y se cubrio con cupulas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 7 dfas.

Las semillas germinaron y las plantas se desarrollaron en un Conviron (modelos CMP4030 y CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) en condiciones de dfa largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) con una intensidad de luz de 120-150 pmol/m2s a temperatura (22° C) y humedad (40-50%) constante. Las plantas inicialmente se regaron con solucion de Hoagland y posteriormente con agua desionizada para mantener la humedad del suelo, pero no mojado.

6.2 - Transformacion de Agrobacterium

Se uso una placa de LB + agar con eritromicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) que contema una colonia de DH5a en estriado, para proporcionar una colonia para inocular 4 ml de cultivos miniprep (lfquido LB + eritromicina). Los cultivos se incubaron durante la noche a 37°C con agitacion constante. Se usaron Spin Mini Preps de Qiagen (Valencia, CA), realizados por las instrucciones del fabricante para purificar el ADN plasmfdico.

Se prepararon celulas electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens (cepas Z707s, EHA101s, y LBA4404s) usando un protocolo de Weigel y Glazebrook (2002). Las celulas de Agrobacterium competentes se transformaron usando un metodo de electroporacion adaptado del de Weigel y Glazebrook (2002). Se descongelaron 50 pl de celulas competentes de agro se descongelaron sobre hielo, y se anadieron 10-25 ng del plasmido deseado a las celulas. La mezcla de ADN y celulas se anadio a cuberas previamente enfriadas de electroporacion (2 mm). Se uso un electroporador Eppendorf 2510 para la transformacion con las siguientes condiciones, Voltaje: 2,4 kV, Longitud de pulso: 5 ms.

Despues de electroporacion, se anadio 1 ml de caldo YEP (por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bactopeptona, 5 g de NaCl) a la cubeta y la suspension de celulas-YEP se transfirio a un tubo de cultivo de 15 ml. Las celulas se incubaron a 28°C en un bano de agua con agitacion constante durante 4 horas. Despues de incubacion, los cultivos se pusieron en placas en YEP + agar con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (250 mg/l). Las placas se incubaron durante 2-4 dfas a 28°C.

Las colonias se seleccionaron y se aplicaron en estnas en YEP + agar de nueva aportacion con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y se incubaron a 28°C durante 1-3 dfas. Las colonias se seleccionaron para el analisis por PCR para verificar la presencia del inserto genico usando cebadores espedficos de vector. Se usaron Spin Mini Preps de Qiagen, realizados segun las instrucciones del fabricante, para purificar el ADN plasmfdico de las colonias de Agrobacterium seleccionadas, con la siguiente excepcion: se usaron partes alfcuotas de 4 ml de un cultivo miniprep de 15 ml de una noche (YEP lfquido + eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l)) para la purificacion del ADN. Una alternativa al uso del ADN de Spin Mini Prep de Qiagen, era la lisis de las celulas de Agrobacterium transformadas, suspendidas en 10 pl de agua, a 100°C durante 5 minutos. El ADN plasirndico del vector binario usado en la transformacion de Agrobacterium se incluyo como un control. La reaccion de PCR se completo usando la ADN polimerasa Taq de Takara Mirus Bio Inc. (Madison, Wisconsin) por las instrucciones del fabricante en concentraciones 0,5x. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un ciclador termico MJ Research programado con las siguientes condiciones 1) 94°C durante 3 minutos, 2) 94°C durante 45 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) 72°C durante 1 minuto, durante 29 ciclos despues 1 ciclo de 72°C durante 10 minutos. La amplificacion se analizo por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizo por tincion con bromuro de etidio. Se selecciono una colonia cuyo producto de la PCR era identico al plasmido de control.

6.3 - Transformacion de Arabidopsis

Arabidopsis se transformo usando el metodo de inmersion floral. La colonia seleccionada se uso para inocular uno o mas precultivos de 15-30 ml de caldo YEP que conteman eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l). El o los cultivos se incubaron durante la noche a 28°C con agitacion constante a 220 rpm. Cada precultivo se uso para inocular dos cultivos de 500 ml de caldo YEP que conteman eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l), y los cultivos se incubaron durante la noche a 28°C con agitacion constante. Las celulas despues se sedimentaron a aproximadamente 8700x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y el lfquido sobrenadante resultante se descarto. El sedimento celular se volvio a suspender

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suavemente en 500 ml de medio de infiltracion que conteman: 1/2x sales de Murashige y Skoog/vitaminas B5 de Gamborg, sacarosa al 10% (p/v), bencilaminopurina 0,044 pM (10 pl/litro de solucion madre 1 mg/ml en DMSO) y 300 pl/litro de Silwet L-77. Las plantas de aproximadamente 1 mes de edad se sumergieron en el medio durante l5 segundos, asegurandose de sumergir la florescencia mas nueva. Despues las plantas se tendieron sobre sus lados y se cubrieron (transparente u opaco) durante 25 horas, despues se lavaron con agua y se pusieron derechas. Las plantas se desarrollaron a 22°C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente 4 semanas despues de la inmersion, se recogieron las semillas.

6.4 - Seleccion de plantas transformadas

Las semillas T1 recien recogidas [gen AAD-13 (v1)] se dejaron secar durante 7 dfas a temperatura ambiente. Las semillas T1 se sembraron en bandejas de germinacion de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), recibiendo cada una, una parte almuota de 200 mg de semillas T1 estratificadas (-10.000 semillas) que se habfan suspendido previamente en 40 ml de solucion de agarosa al 0,1% y se almacenaron a 4°C durante 2 dfas.

Mezcla Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) se cubrio con vermiculita fina y se rego por abajo con solucion de Hoagland hasta estar mojado, despues se dreno por gravedad. Se sembraron partes almuotas de 40 ml de semillas estratificadas uniformemente sobre vermiculita con una pipeta y se cubrieron con cupulas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dfas. Las cupulas se retiraron 1 dfa antes de la seleccion de transformante inicial usando pulverizacion post-brotado con glufosinato (seleccion del gen PAT cotransformado).

Siete dfas despues de la plantacion (DDP) y de nuevo 11 DDP, las plantas T1 (cotiledon y fase de 2-4 hojas, respectivamente) se pulverizaron con una solucion al 0,2% de herbicida Liberty (200 g ea/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) con un volumen de pulverizacion de 10 ml/bandeja (703 l/ha) usando una boquilla de pulverizador de aire comprimido DeVilbiss para suministrar una tasa eficaz de 280 g ea/ha de glufosinato por aplicacion. Las supervivientes (plantas que crecen activamente) se identificaron 4-7 dfas despues de la pulverizacion final y se trasplantaron individualmente a macetas de 7,6 cm (3 pulgadas) preparadas con medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se cubrieron con cupulas de humedad durante 3-4 dfas y se pusieron en una camara de crecimiento a 22°C como antes o se llevaron directamente al invernadero. Posteriormente se retiraron las cupulas y las plantas se criaron en el invernadero (22±5°C, 50±30% HR, 14 h de luz:10 de oscuridad, mrnimo 500 pE/m2s1 natural + luz complementaria) al menos 1 dfa antes del ensayo de la capacidad de AAD-13 (v1) de proporcionar resistencia a herbicidas auxmicos de fenoxi.

Despues, las plantas T1 se asignaron aleatoriamente a diferentes tasas de 2,4-D. Para Arabidopsis, 50 g ea/ha de

2,4-D es una dosis eficaz para distinguir las plantas sensibles de las que tienen niveles significativos de resistencia. Tambien se aplicaron tasas elevadas para determinar los niveles relativos de resistencia (280, 560, 1120, o 2240 g ea/ha). Las tablas 11 y 12 muestran comparaciones hechas con un gen de resistencia a herbicida de ariloxialcanoato (AAD-12 (v1)) descrito previamente en el documento PCT/US20061042133.

Todas las aplicaciones de herbicidas auxmicos se hicieron usando el pulverizador DeVilbiss como se ha descrito antes, para aplicar un volumen de pulverizacion de 703 l/ha (0,4 ml de disolucion/maceta de 7,6 cm (3 pulgadas)) o se aplicaron por pulverizacion de surco en un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. Se uso 2,4-D de calidad tecnica (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en DMSO y diluido en agua (concentracion final en DMSO <1%) o la formulacion de la sal de dimetilamina (456 g ea/l, NuFarm, St Joseph, MO). El diclorprop era de calidad comercial formulado como la sal de potasio de R-diclorprop (600 g ai/l, AH Marks). Cuando las tasas de herbicidas aumentaban mas alla de 800 g ea/ha, el pH de la solucion de pulverizacion se hacfa demasiado acida, quemando las hojas de las plantas de Arabidopsis tiernas, jovenes y complicando la evaluacion de los efectos principales de los herbicidas.

Algunas T1 individuales se sometieron a herbicidas comerciales alternativos en lugar de una auxina de fenoxi. Un punto de interes era determinar si los herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato, triclopir y fluroxipir, podfan ser degradados eficazmente en la planta. Los herbicidas se aplicaron a plantas T1 usando un pulverizador de surco con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. Las plantas T1 que presentaron tolerancia a 2,4-D DMA accedieron ademas a la generacion T2.

6.5 - Resultados de la seleccion de plantas transformadas:

Las primeras transformaciones de Arabidopsis se llevaron a cabo usando AAD-13 (v1) (gen optimizado para plantas). Los transformantes T1 se seleccionaron primero del fondo de semillas no transformadas usando un esquema de seleccion con glufosinato. Se cribaron alrededor de 160.000 semillas T1 y se identificaron 238 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion de 0,15% lo que esta en el intervalo normal de frecuencia de seleccion de construcciones donde se usaron PAT + Liberty para la seleccion. Las plantas T1 seleccionadas antes posteriormente se trasplantaron a macetas individuales y se pulverizaron con diferentes tasas de herbicidas de ariloxialcanoato comerciales. La tabla 11 compara la respuesta de AAD-13 (v1) y los genes de control para impartir resistencia a 2,4-D a los transformantes de Arabidopsis T1. La respuesta se presenta en terminos de % de dano visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos que presentan poco o no presentan dano (<20%), dano moderado (20-40%), o dano grave (>40%). Se

presenta una madia aritmetica y desviacion estandar para cada tratamiento. El intervalo de respuesta individual tambien se indica en la ultima columna para cada tasa y transformacion. Arabidopsis transformada por PAT/Cry1F sema como un control transformado sensible a auxinas. El gen AAD-13 (v1) impartfa resistencia a herbicidas a plantas Arabidopsis Ti individuales. Con un tratamiento dado, el nivel de la respuesta de la planta variaba mucho y 5 se puede atribuir al hecho de que cada planta representa un suceso de transformacion independiente. Es importante destacar, con cada tasa de 2,4-D ensayada, habfa individuos que no se afectaron mientras que otros estaban gravemente afectados. El dano medio por tasa de la poblacion general se presenta en la tabla 11 simplemente para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-13 (v1) frente a controles transformados con AAD-12 (v1) o PAT/Cry1F. Con tasas altas la solucion de pulverizacion se volvio muy acida salvo 10 que se tamponara, por lo que algo del dano se puede atribuir a la acidez de la solucion de pulverizacion. Arabidopsis desarrollada principalmente en la camara de crecimiento tiene una cutfcula muy fina y efectos de quemado graves pueden complicar el ensayo a estas tasas elevadas. No obstante, han sobrevivido muchos individuos con 2.240 g ea/ha de 2,4-D con poca o sin danos.

Tabla 11. Respuesta de Arabidopsis T1 transformada con AAD-13 (v1) a un intervalo de tasas de 2,4-D aplicadas post-brote, comparado con una poblacion resistente homocigotica AAD-12 v1 (T4), o un control sensible a auxinas, transformado con Pat-Cry1F (14 DAT).

plantas T1 con gen AAD-13 (v1) Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 0 0 0

280 g ea/ha 2,4-D DMA

12 4 4 21 31 0-90

560 g ea/ha 2,4-D DMA

17 2 0 2 6 0-20

1120 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 2 4 0-10

2240 g ea/ha 2,4-D DMA

14 3 3 15 23 0-70

PAT / Cry1F (control transformado) Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 0 0 0

280 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 20 100 0 100

560 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 20 100 0 100

1120 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 20 100 0 100

2240 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 20 100 0 100

Plantas T4con gen AAD-12 (v1) homocigoticas Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 0 0 0

280 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 0 0 0

560 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 1 3 0-10

1120 g ea/ha 2,4-D DMA

20 0 0 2 4 0-15

2240 g ea/ha 2,4-D DMA

16 3 1 13 13 0-50

15 La tabla 12 muestra una respuesta a la dosis llevada a cabo de forma similar de Arabidopsis Ti al acido fenoxipropionico, diclorprop. Los datos muestran que el isomero (R) de diclorprop activo como herbicida no sirve como un sustrato adecuado para AAD-13 (v1) o AAD-12 (v1). El hecho de que AaD-1 (v3) metabolizara R-diclorprop

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suficientemente bien para impartir tolerancia comercialmente aceptable es una caractenstica distintiva que separa los tres genes (tabla12 y ejemplo 7 del documento WO/2007/053482 (Wright et al., presentado el 27 de octubre, 2006), AAD-1 y AAD-13 se consideran a-cetoglutarato dioxigenasas espedficas para R y S, respectivamente.

Tabla 12. Respuesta de Arabidopsis T1 a un intervalo de tasas de R-diclorprop aplicadas post-brotacion. (14 DAT)

plantas T1 con gen AAD-13 (v1) Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha

20 0 0 0 0 0

800 g ea/ha R-diclorprop

0 0 20 100 0 100

Tipo natural (control transformado) Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha

20 0 0 0 0 0

800 g ea/ha R-diclorprop

0 0 20 100 0 100

Plantas T4con gen AAD-12 (v1) homocigoticas Medias

% dano % dano

<20%

20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha

20 0 0 0 0 0

800 g ea/ha R-dicloroprop

0 0 20 100 0 100

6.6 - AAD-13 (v1) como un marcador seleccionable

Se analizo la capacidad de usar AAD-13 (v1) como un marcador seleccionable usando 2,4-D como el agente de seleccion con Arabidopsis transformadas como se ha descrito antes. Se anadieron aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis de generacion T4 (homocigotica para AAD-13 (v1)) en aproximadamente 5.000 semillas de tipo natural (sensibles). Se compararan diferentes tratamientos, cada bandeja de plantas recibira una o dos veces aplicacion de

2.4- D en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: a los 7 DDP, 11 DDP, o 7 seguido de 11 DDP. Puesto que todos los individuos tambien contienen el gen PAT en el mismo vector de transformacion, AAD-13 seleccionado con

2.4- D se puede comparar directamente con PAT seleccionado con glufosinato.

Los tratamientos se aplicaran con una boquilla de pulverizacion DeVilbiss como se ha descrito previamente. Las plantas se identificaran como resistentes o sensibles 17 DDP. El tratamiento optimo de 75 g ea/ha de 2,4-D aplicado a los 7 y 11 dfas despues de plantacion (DDP), es igualmente eficaz en la frecuencia de seleccion, y produce menos dano herbicida a los individuos transformados que el esquema de seleccion con Liberty. Estos resultados indicaran que AAD-13 (v1) se puede usar eficazmente como un marcador seleccionable alternativo para una poblacion de Arabidopsis transformadas.

6.7 - Heredabilidad

Una variedad de sucesos T1 autopolinizaron para producir semillas T2. Se llevo a cabo el ensayo de progenie de estas semillas aplicando Liberty (280 g ea/ha) a 100 hermanos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual se trasplanto a macetas cuadradas de 7,5 cm antes de la aplicacion de la pulverizacion (pulverizacion de surco con tasas de aplicacion de 187 l/ha). El 50 por ciento de las familias de T1 (plantas T2) segregaron en el modelo anticipado de 3 resistentes:1 sensible para un solo locus heredado de forma dominante con herencia mendeliana determinada por analisis de Chi cuadrado (P>0,05).

Se recogieron las semillas de 12 a 20 individuos T2 (semillas T3). Se llevo a cabo el ensayo de progenie en 25 hermanos T3 de cada una de 8 familias T2 seleccionadas aleatoriamente. La mitad de las familias T2 ensayadas eran homocigoticas (poblaciones que no se segregan) en cada lmea. Estos datos muestran que AAD-13 (v1) es integrado establemente y heredado de forma mendeliana en al menos tres generaciones.

6.8 - Resistencia herbicida en aplicaciones foliares adicionales en Arabidopsis AAD-13

La capacidad de AAD-13 (v1) para proporcionar resistencia a otros herbicidas auxmicos de ariloxialcanoato en Arabidopsis transgenicas, se determino por aplicacion foliar de diferentes sustratos. Semillas de Arabidopsis de generacion T2 se estratificaron, y se sembraron en bandejas de seleccion muy parecidas a las de Arabidopsis 5 (ejemplo 6.4). Se planto de forma similar una lmea de control transformada que contema PAT y el gen de resistencia a insectos CrylF. Los plantones se transfirieron a macetas individuales de 7,6 cm (3 pulgadas) en el invernadero. Todas las plantas se pulverizaron usando un pulverizador de surco ajustado a 187 l/ha. Las plantas se pulverizaron con un intervalo de herbicidas de piridiloxiacetato: 200-800 g ea/ha de triclopir (Garlon 3A, Dow AgroSciences) y 200-800 g ea/ha fluroxipir (Starane, Dow AgroSciences). El metabolite 2,4-D resultante de la actividad de la AAD-13, 10 2,4-diclorofenol (DCP, Sigma) (con un equivalente molar de 280-2240 g ea/ha de 2,4-D, calidad tecnica) tambien se ensayo. Todas las aplicaciones se formularon en agua. Cada tratamiento se repitio 3-4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 dfas despues de tratamiento.

Las plantas transformadas con AAD-13 tambien estaban claramente protegidas frente al dano por el herbicida fluroxipir que se vio en la lmea de control transformada, Pat/Cry1F (vease la tabla 13); sin embargo, las plantas 15 transformadas con AAD-13 fueron gravemente danadas por triclopir. Estos resultados confirman que AAD-13 (v1) en Arabidopsis proporciona resistencia a las auxinas piridiloxiaceticas ensayadas. El gen AAD-13 (v1) proporcionaba resistencia fuerte hasta 400 g ea/ha de fluroxipir, mientras que el gen AAD-12 (v1) proporcionaba solo un nivel modesto de tolerancia tan bajo como 200 g/ha. El gen AAD-13 (v1) proporcionaba significativamente menos tolerancia al triclopir que el gen AAD-12 (v1) gene. La tolerancia significativamente mayor al fluroxipir es inesperada, 20 y permite distinguir la actividad de tipo AAD-13 (v1) de la de AAD-12 (v1) y es apoyado por los datos enzimaticos del ejemplo 5.

Tabla 13. Comparacion de respuesta de la planta Arabidopsis T2 AAD-13 (v1) y de control transformada frente a herbicidas auxmicos con aplicacion foliar

Auxinas piridiloxiaceticas

Tratamiento herbicida

% medio de danos 14DAT

Plantas T2 AAD-13 (v1) que segregan (pDAB4114.01.094) Plantas T4 AAD-12(v1) homocigoticas Control Pat/Cry1f

200g ea/ha triclopir

75 25 100

400 g ea/ha triclopir

90 33 100

800 g ea/ha triclopir

100 79 100

200 g ea/ha fluroxipir

10 48 100

400 g ea/ha fluroxipir

16 55 100

800 g ea/ha fluroxipir

55 60 100

Ejemplo 7 - Transformacion de especies de cultivos adicionales

El mafz se puede transformar para proporcionar niveles altos de resistencia al 2,4-D y fluroxipir usando las mismas 25 tecnicas descritas previamente en el ejemplo n° 8 del documento WO 2007/053482 (PCT/US2006/042133 (Wright et al.).

La soja se puede transformar para proporcionar niveles altos de resistencia al 2,4-D y fluroxipir usando las mismas tecnicas descritas previamente en el ejemplo n° 11 o ejemplo n° 13 del documento WO 2007/053482 (PCT/US2006/042133 (Wright et al.)).

30 El algodon se puede transformar para proporcionar niveles altos de resistencia al 2,4-D y fluroxipir usando las mismas tecnicas descritas previamente en el ejemplo n° 14 de la solicitud de patente WO/2005/107437 (Wright et al., presentada el 2 de mayo, 2005) o el ejemplo n°12 del documento WO 2007/053482 (Wright et al.).

La canola se puede transformar para proporcionar niveles altos de resistencia al 2,4-D y fluroxipir usando las mismas tecnicas descritas previamente en el ejemplo n° 26 de la solicitud de patente WO/2005/107437 (Wright et al., 35 presentada el 2 de mayo,2005) o el ejemplo n° 22 del documento WO 2007/053482 (Wright et al.).

Ejemplo 8 - Deteccion de protemas de las plantas transformadas mediante anticuerpos

Se pueden desarrollar e implementar anticuerpos y los posteriores ensayos ELISA como se describe en el ejemplo 9

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15

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55

del documento WO 2007/053482 (Wright et al.), por ejemplo.

Ejemplo 9 -Transformacion de tabaco

La transformacion de tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevo a cabo por un metodo similar, pero no identico, a los metodos publicados. Para proporcionar el tejido fuente para la transformacion, se esterilizo la superficie de semillas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. KY160) y se plantaron en la superficie de medio TOB, que es un medio de Murashige y Skoog sin hormonas, solidificado con agar. Las plantas se desarrollaron durante 6-8 semanas en una sala incubadora iluminada a 28-30°C, y se recogieron hojas de forma esteril para usar en el protocolo de transformacion. Se cortaron de forma esteril trozos de aproximadamente 1 centimetro cuadrado de las hojas, excluyendo la nervadura. Cultivos de las cepas de Agrobacterium (EHA101S que contema pDAB3278, tambien llamado pDAS1580, AAD-13 (v1) + PAT), cultivadas durante la noche en un matraz en un agitador ajustado a 250 rpm a 28°C, se sedimentaron en una centnfuga y se volvieron a suspender en sales de Murashige y Skoog esteriles, y se ajustaron hasta una densidad optica final de 0,5 a 600 nm. Se sumergieron trozos de hoja en esta suspension bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, despues se secaron por absorcion sobre toallas de papel esteril y se pusieron boca arriba en medio TOB+ (medio de Murashige y Skoog que contema acido indolacetico 1 mg/l y benciladenina 2,5 mg/l) y se incubaron en la oscuridad a 28°C. Dos dfas despues, los trozos de hojas se llevaron a medio TOB+ que contema cefotaxima 250 mg/l (Agri-Bio, North Miami, Florida) y glufosinato amonico 5 mg/l (ingrediente activo en Basta, Bayer Crop Sciences) y se incubaron a 28-30°C con luz. Los trozos de hojas se llevaron a medio TOB+ de nueva aportacion con cefotaxima y Basta dos veces por semana durante las dos primeras semanas y despues una vez por semana. De 2 a 4 semanas despues de tratar los trozos de hojas con Agrobacteria, se sacaron de esta preparacion tisular pequenas plantas que surgfan de los focos transformados y se plantaron en medio TOB que contema cefotaxima 250 mg/l y Basta 10 mg/l en recipientes Phytatray™ II (Sigma). Estos plantones se desarrollaron en una sala incubadora iluminada. Despues de 3 semanas, se cogieron estacas del tallo y se arraigaron de nuevo en el mismo medio. Las plantas estaban listas para enviarlas al invernadero despues de 2-3 semanas adicionales.

Las plantas se llevaron al invernadero lavando el agar de las rafces, se trasplantaron a suelo en macetas cuadradas de 13,75 cm, poniendo la maceta en una bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), poniendo agua corriente en el fondo de la bolsa, y poniendolas con luz indirecta en un invernadero a 30°C durante una semana. Despues de 3-7 dfas, se abrio la bolsa; las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que las plantas se aclimataron al invernadero, momento en el que se retiro la bolsa. Las plantas crecieron en condiciones de invernadero templado ordinarias (30°C, 16 horas de dfa, 8 horas de noche, luz minima natural + complementaria = 500 |jE/m2s1).

Antes de la propagacion, se tomaron muestras de las plantas T0 para el analisis de ADN para determinar el numero de copias de inserto. Se ensayo por conveniencia el gen PAT que esta molecularmente unido a AAD-13 (v1). Se puso tejido reciente en tubos y se liofilizo a 4°C durante 2 dfas. Despues de secar el tejido completamente, se puso un haz de tungsteno (Valenite) en el tubo, y las muestras se sometieron a 1 min de trituracion en seco usando un molino de perlas Kelco. Despues se siguio el procedimiento convencional de aislamiento de ADN DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Despues se tino una parte alfcuota del ADN extrafdo con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en el fluorometro (BioTek) con referencias conocidas para obtener la concentracion en ng/jl.

Las muestras de ADN se diluyeron a aproximadamente 9 ng/jl y despues se desnaturalizaron por incubacion en un termociclador a 95°C durante 10 minutos. Despues se prepara la mezcla Signal Probe usando la mezcla de oligonucleotidos proporcionada y MgCh (Third Wave Technologies). Se pone una parte alfcuota de 7,5 jl en cada pocillo de la placa de ensayo Invader seguido de una parte alfcuota de 7,5 jl de controles, referencias y 20 ng/jl de muestras desconocidas diluidas. Cada pocillo se cubrio con 15 jl de aceite mineral (Sigma). Las placas se incubaron a 63°C durante 1,5 horas y se leyeron en el fluorometro (Biotek). El calculo del % de senal frente al fondo para la sonda objetivo dividido entre el % de senal frente al fondo de la sonda de control interno, calculara la relacion. La relacion de referencias de copias conocidas desarrolladas y validadas con analisis de transferencia southern se uso para identificar las copias estimadas de sucesos desconocidos.

Tambien se ensayo en todos los sucesos la presencia del gen AAD-13 (v1) por PCR usando las mismas muestras de ADN extrafdas. Se usaron un total de 100 ng de ADN total como molde. Se uso 20 mM de cada cebador con el kit de Takara Ex Taq PCR Polymerase. Los cebadores para AAD-13 para la PCR por unidad de transcripcion de planta (PTU) eran (SdpacodF: ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO: 6) y (SdpacodR: CGGGCAGGCCTAACTCCACC AA) (SEQ ID NO: 7). La reaccion de PcR se llevo a cabo en un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos, y 72° C durante 1 minuto y 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% tenido con EtBr.

9.1 - Seleccion de plantas transformadas

Despues de la aclimatacion en el invernadero, las plantas T0 se asignaron aleatoriamente a diferentes tasas de 2,4- D DMA en el intervalo de 140 a 2240 g ea/ha en incrementos de 4 veces. Para el tabaco, 140 g ea/ha de 2,4-D es una dosis eficaz para distinguir las plantas sensibles de las que tienen niveles significativos de resistencia. La tabla

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14 muestra comparaciones extrafdas de plantas To transformadas con un gen de resistencia al herbicida glufosinato (tabaco transformado con PAT/Cry1F). Los datos demostraron que AAD-13 (v1) en plantas de tabaco transformadas proporciona una tolerancia fuerte al 2,4-D DMA de al menos 2240 g ea/ha.

Tabla 14. Comparacion de la respuesta de plantas de tabaco T0 AAD-13 (v1) y de control transformadas (PAT) a diferentes tasas de 2,4-D DMA 14 dfas despues de la aplicacion.

PAT/Cry1F (controles transformados)

% dano % dano

Medias

<20% 20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha 2,4-D DMA

3 0 0 0,0 0,0 0

140 g ea/ha 2,4-D DMA

0 1 2 47,0 6,0 40-50

560 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 3 75,0 0,0 75

2240 g ea/ha 2,4-D DMA

0 0 3 97,0 8,0 90-100

plantas T0 con gen AAD-13 (v1)

% dano % dano

Medias

<20% 20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

0 g ea/ha 2,4-D DMA

2 0 0 0,0 0,0 0

140 g ea/ha 2,4-D DMA

2 0 0 8,0 11,0 0-15

560 g ea/ha 2,4-D DMA

2 0 0 3,0 4,0 0-5

2240 g ea/ha 2,4-D DMA

2 0 0 5,0 0,0 5

Se guardaron semillas T1 de transformantes T0 individuales y las semillas se estratificaron y se sembraron en bandejas de seleccion en el invernadero de forma muy similar a la del ejemplo 5. Antes de ensayar las tasas elevadas de 2,4-D DMA, se llevo a cabo el ensayo de la progenie de la lmea T1 aplicando 2,4-D DMA (560 g ea/ha) a 100 hermanos T1 aleatorios. Las aplicaciones de pulverizacion se hicieron como se ha descrito previamente con un pulverizador de surco calibrado para una tasa de aplicacion de 187 l/ha. El 43 por ciento de las familias T0 (plantas T1) segregaron en el modelo previsto de 3 resistentes:1 sensible para un locus solo heredado de forma dominante con herencia mendeliana determinado por analisis de Chi cuadrado (P> 0,05).

Se recogieron las semillas de 12 a 20 individuos T2 (semillas T2). Se llevo a cabo el ensayo de progenie en 25 hermanos T3 de cada una de 8 familias T2 seleccionadas aleatoriamente, como se ha descrito previamente. Aproximadamente un tercio de las familias T2 se preve que sean homocigoticas (poblaciones que no segregan) en cada lmea. Estos datos muestran que AAD-13 (v1) es integrado establemente y heredado de forma mendeliana en al menos tres generaciones.

Despues, las plantas T1 que sobreviven se asignaron aleatoriamente a diferentes tasas de 2,4-D. Para el tabaco 140 g ea/ha de 2,4-D es una dosis eficaz para distinguir plantas sensibles de aquellas con niveles significativos de resistencia. Tambien se aplicaron tasas elevadas para determinar los niveles relativos de resistencia (140, 560 o 2240 g ea/ha). La tabla 15 muestra las comparaciones extrafdas de una variedad de tabaco de control no transformada (KY160).

Todas las aplicaciones de herbicida auxmico se aplicaron mediante pulverizador de surco con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-D usado era la formulacion comercial de la sal de dimetilamina (456 g ae/l, NuFarm, St Joseph, MO). Algunos individuos T1 se sometieron a herbicidas comerciales alternativos en lugar de una auxina de fenoxi. Un punto de interes era determinar si los herbicidas auxmicos de piridiloxiacetato, triclopir y fluroxipir, podrian ser degradados eficazmente en la planta. Los herbicidas se aplicaron a las plantas T1 usando un pulverizador de surco con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. Las plantas T1 que presentaban tolerancia a 2,4- D DMA despues accedieron a la generacion T2.

9.2 - Resultados de la seleccion de plantas transformadas

Los transformantes T1 se seleccionaron primero del fondo de plantas no transformadas usando un esquema de seleccion con 2,4-D. La tabla 15 compara la respuesta de AAD-13 (v1) y los genes de control para impartir resistencia a 2,4-D a los transformantes de T1 del tabaco. La respuesta se presenta en terminos de % de dano visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos que presentan poco o no presentan dano (<20%),

dano moderado (20-40%), o dano grave (>40%). Se presenta una madia aritmetica y desviacion estandar para cada tratamiento. El intervalo de respuesta individual tambien se indica en la ultima columna para cada tasa y transformacion. El tabaco no transformado KY160 serv4a como un control sensible a auxinas. El gen AAD-13 (v1) impartfa resistencia a herbicidas a plantas de tabaco Ti individuales.

Tabla 15. Respuesta del tabaco T1 transformado con AAD-13 (v1) a un intervalo de tasas de 2,4-D aplicadas post- brotacion a un control no transformado sensible a auxinas.

Tipo natural (control no transformado)

% dano % dano

Medias

<20% 20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

Control no tratado

3 0 0 0,0 0,0 0

140 g ea/ha 2,4-DMA

0 0 3 80,0 0,0 80

560 g ea/ha 2,4-DMA

0 0 3 88,0 1,0 88-89

2240 g ea/ha 2,4-DMA

0 0 3 92,0 3,0 90-95

Plantas T1 con gen AAD-13 (v1)

% dano % dano

Medias

<20% 20-40% >40% Media Desv. est. Intervalo (%)

Control no tratado

3 0 0 0,0 0,0 0

140 g ea/ha 2,4-DMA

3 0 0 0,0 0,0 0

560 g ea/ha 2,4-DMA

3 0 0 0,0 0,0 0

2240 g ea/ha 2,4-DMA

3 0 0 2,0 3,0 0-5

5

9.3 - Resistencia a herbicida en aplicaciones foliares adicionales en el tabaco con AAD-13

Se determino la capacidad de AAD-13 (v1) para proporcionar resistencia a otros herbicidas auxmicos de ariloxialcanoato en el tabaco transgenico, por aplicacion foliar de diferentes sustratos. Plantas de generacion Ti extras despues del ensayo de progenie de Ti se pulverizaron usando el pulverizador de surco ajustado a 187 l/ha. 10 Las plantas se pulverizacion con una variedad de herbicidas: 140-1120 g ea/ha de triclopir (Garlon 3A, Dow AgroSciences) y 280-1120 g ea/ha de fluroxipir (Starane, Dow AgroSciences). Todas las aplicaciones se formularon en agua. Cada tratamiento se repitio 3 veces. Las plantas se evaluaron 3 y 14 dfas despues de tratamiento.

Las plantas transformadas con AAD-13 eran poco protegidas del triclopir pero estaban bien protegidas del dano por el herbicida fluroxipir que se vio en la lmea de control no transformada (vease la tabla 16). Estos resultados 15 confirman que AAD-13 (v1) en el tabaco proporciona resistencia a algunas auxinas piridiloxiaceticas ensayadas. El gen AAD-13 (v1) proporcionaba tolerancia significativa hasta 1120 g ea/ha de fluroxipir, mientras que el gen proporcionaba solo un nivel modesto de tolerancia al triclopir tan bajo como 280 g/ha. Estos datos confirman que AAD-13 (v1) proporciona una selectividad sesgada hacia el fluroxipir frente al triclopir de las auxinas de piridiloxi en multiples especies. Esta observacion inesperada distingue ademas el gen AAD-13 (v1) de otras enzimas de 20 tolerancia a herbicidas de mecanismo similar y se observa en multiples especies de plantas.

Tabla 16. Comparacion de la respuesta de plantas de tabaco T1 con AAD-13 (v1) y de control transformadas a diferentes herbicidas auxmicos por aplicacion foliar 14 dfas despues de la aplicacion.

Auxinas piridiloxiaceticas

Tratamiento con herbicida

Plantas que segregan T1 AAD-13 (v1) (pDAB4114[1]003.006) KY160 (control no transformado)

280 g ea/ha triclopir

53,0 82,0

560 g ea/ha triclopir

65,0 88,0

1120 g ea/ha triclopir

75,0 92,0

280 g ea/ha fluroxipir

7,0 100,0

5

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30

35

40

45

50

560 g ea/ha fluroxipir

25,0 100,0

1120 g ea/ha fluroxipir

37,0 100,0

Ejemplo 10 - AAD-13 (v1) en canola y transformacion de otros cultivos

10.1 - Transformacion de canola

El gen AAD-13 (v1) que confiere resistencia al 2,4-D se puede usar para transformar Brassica napus con la transformacion mediada por Agrobacterium usando PATcomo un marcador seleccionable.

Se esterilizo la superficie de las semillas con ^a comercial al 10% durante 10 minutos y se aclararon 3 veces con agua destilada esteril. Las semillas se pusieron en medio basal MS a mitad de concentracion y se mantuvieron en regimen de crecimiento ajustado a 25°C, y un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad.

Se cortaran segmentos de hipocotilo (3-5 m) de plantones de 5-7 dfas de edad y se pondran en medio de induccion de callo K1D1 (medio MS con kinetina 1 mg/l y 2,4-D 1 mg/l) durante 3 dfas como pretratamiento. Despues los segmentos se transferiran a una placa petri tratada con la cepa de Agrobacterium Z707S o LBA4404 que contiene pDAB3759. El Agrobacterium se cultivara durante la noche a 28°C en la oscuridad en un agitador a 150 rpm y posteriormente se volvera a suspender en el medio de cultivo.

Despues de 30 min de tratamiento de los segmentos de hipocotilo con Agrobacterium, estos se pondnan de nuevo en el medio de induccion de callo durante 3 dfas. Despues de cocultivo, los segmentos se pondran en K1D1TC (medio de induccion de callo que contiene cabenicilina 250 mg/l y timentina 300 mg/l) durante una semana o dos semanas de recuperacion. Alternativamente, los segmentos se pondnan directamente en medio de seleccion K1D1H1 (el medio anterior con Herbiace 1 mg/l). Los antibioticos carbenicilina y timentina se usanan para matar la Agrobacterium. El agente de seleccion Herbiace permite el crecimiento de las celulas transformadas.

Los segmentos de hipocotilos del callo se pondnan en medio de regeneracion de brote B3Z1H1 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 gm/l [acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 1 mg/l, carbenicilina y timentina). Despues de 2-3 semanas se regeneran los brotes y los segmentos de hipocotilo junto con los brotes se transfieren a medio B3Z1H3 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 gm/l [acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 3 mg/l, carbenicilina y timentina) durante otras 2-3 semanas.

Los brotes se cortanan de los segmentos de hipocotilos y se transferinan a medio de alargamiento de brote MESH5 o MES10 (MS, MES 0,5 gm/l, Herbiace 5 o 10 mg/l, carbenicilina, timentina) durante 2-4 semanas. Los brotes alargados se cultivan para la induccion de rafces en MSI.1 (MS con acido indolbutmco 0,1 mg/l). Una vez que las plantas tienen el sistema de rafces bien establecido, estas se trasplantaran al suelo. Las plantas se aclimatan en condiciones ambientales controladas en Conviron durante 1-2 semanas antes de la transferencia al invernadero.

10.2 - Transformacion con Agrobacterium de otros cultivos

A la luz de la presente descripcion, se pueden transformar cultivos adicionales de acuerdo con la presente invencion usando tecnicas que son conocidas en la materia.

Se dan a continuacion los nombres en latm de estas y otras plantas. Debe quedar claro que se pueden usar estas y otras (no tipo Agrobacterium) tecnicas de transformacion para transformar con AAD-13 (v1), por ejemplo en estas y otras plantas, que incluyen, pero no se limitan a mafz (Zea mays), trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza spp. y Zizania spp.), cebada (Hordeum spp.), algodon (Abroma augusta y Gossypium spp.), soja (Glycine max), remolachas de azucar y de mesa (Beta spp.), cana de azucar (Arenga pinnata), tomate (Lycopersicon esculentum y otras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp., y Cyphomandra betacea), patata (Solanum tubersoum), batata (Ipomoea betatas), centeno (Secale spp.), pimientas (Capsicum annuum, sinense, y frutescens), lechuga (Lactuca sativa, perennis, y pulchella), col (Brassica spp), apio (Apium graveolens), berenjena (Solanum melongena), cacahuete (Arachis hypogea), sorgo (todas las especies de Sorghum), alfalfa (Medicago sativua), zanahoria (Daucus carota), judfas (Phaseolus spp. y otros generos), avenas (Avena sativa y strigosa), guisantes (Pisum, Vigna, y Tetragonolobus spp.), girasol (Helianthus annuus), calabacm (Cucurbita spp.), pepino (Cucumis sativa), tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), cesped (Lolium, Agrostis, Poa, Cynadon, y otros generos), trebol (Tifolium), alverja (Vicia). Dichas plantas con genes AAD-13 (v1), por ejemplo, estan incluidas en la presente invencion.

AAD-13 (v1) tiene el potencial de aumentar la aplicabilidad de herbicidas auxmicos clave para el uso en la temporada en muchos sistemas de cultivo de madera caducifolios y de hoja perenne. Las especies de madera resistentes a triclopir, 2,4-D, y/o fluroxipir aumentanan la flexibilidad del uso excesivo de estos herbicidas sin problemas de danos. Estas especies incluinan, pero no se limitan a: aliso (Alnus spp.), fresnos (Fraxinus spp.), especies de chopos y alamos (Populus spp.), haya (Fagus spp.), abedul (Betula spp.), cerezo (Prunus spp.),

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eucalipto (Eucalyptus spp.), nogal (Carya spp.), arce (Acer spp.), roble (Quercus spp), y pino (Pinus spp). El uso de resistencia a auxinas para el control selectivo de malas hierbas en especies ornamentales y de frutas, tambien esta dentro del alcance de esta invencion. Los ejemplos podnan incluir, pero no se limitan a, rosa (Rosa spp.), bonetero (Euonymus spp.), petunia (Petunia spp), begonia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp), manzano silvestre o manzano (Malus spp.), peral (Pyrus spp.), melocotonero (Prunus spp), y tagetes (Tagetes spp.).

Ejemplo 11 - Evidencia adicional de resultados sorprendentes AAD-13 frente a AAD-2

Semillas de arabidopsis Ti recien recogidas transformadas con un gen AAD-13 (v1) optimizado para planta o AAD-2 (v1) natural (vease el documento WO/2005/107437) se plantaron y se seleccionaron por la resistencia al glufosinato como se ha descrito previamente. Despues, las plantas se asignaron aleatoriamente a diferentes tasas de 2,4-D (503200 g ea/ha). Las aplicaciones de herbicidas se hicieron con pulverizador de surco con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-D usado era la formulacion comercial de sal de dimetilamina (456 g ae/L, NuFarm, St Joseph, MO) mezclada con tampon de Tris 200 mM (pH 9,0) o tampon de HEPES 200 mM (pH7,5).

AAD-13 (v1) y AAD-2 (v1) proporcionaron resistencia detectable al 2,4-D frente a las lmeas de control transformadas y no transformadas; sin embargo, los individuos variaban en su capacidad para impartir resistencia al 2,4-D a plantas de Arabidopsis Ti individuales. Sorprendentemente, los transformantes de AAD-2 (v1) y AAD-2 (v2) eran bastante menos resistentes al 2,4-D que el gen AAD-13 (v1), todos de una frecuencia de plantas muy tolerantes, asf como de dano medio general. No sobrevivieron plantas transformadas con AAD-2 (v1) a 200 g ea/ha de 2,4-D, relativamente danadas (<20% de dano visual), y el dano general de la poblacion era 83% (vease el documento PCT/US2005/014737). En cambio, AAD-13 (v1) tema una media de dano de la poblacion de aproximadamente 15% cuando se trataron con 2.240 g ea/ha de 2,4-D (Tabla 11). La comparacion de los genes optimizados para plantas tanto AAD-13 como AAD-2 indica una ventaja significativa para AAD-13 (v1) en la planta.

Estos resultados son inesperados dado que la comparacion in vitro de AAD-2 (v1) (documento WO/2005/107437) y AAD-13 (v2) indicaba que ambos eran muy eficaces en la degradacion de 2,4-D y ambos compartfan una especificidad de tipo S con respecto a sustratos de ariloxialcanoato quirales. AAD-2 (v1) es expresada en plantas T1 individuales en diferentes niveles; sin embargo, esta protema expresada proporciona poca proteccion del dano por

2,4-D. No eran evidentes diferencias sustanciales en el nivel de expresion de protemas (en la planta) para los genes naturales y optimizados para la planta (vease el documento WO/2005/107437). Estos datos corroboran descubrimientos anteriores que hacen la expresion funcional de AAD-13 (v1) en la planta, y la resistencia a herbicida resultante al 2,4-D y herbicidas de piridiloxiacetato seleccionados, es inesperada.

Ejemplo 12 - Aplicaciones de efecto quemado antes de plantar

Este y los siguientes ejemplos son ejemplos espedficos de nuevos usos de herbicidas hechos posibles por AAD-13 de la presente invencion.

Las aplicaciones de herbicidas de efecto quemado antes de plantar estan previstas para matar malas hierbas que han brotado a lo largo del invierno o a principios de la primavera antes de plantar un cultivo dado. Tfpicamente, estas aplicaciones se aplican en sistemas de gestion sin labranza o con labranza reducida donde la eliminacion de las malas hierbas no es completa antes de la plantacion. Por lo tanto, un programa herbicida debe controlar un espectro muy amplio de malas hierbas de hoja ancha y maleza presente en el momento de la plantacion. El glifosato, gramoxone y glufosinato son ejemplos de herbicidas no selectivos, no residuales usados para aplicaciones herbicidas de efecto quemando antes de plantar. Sin embargo, algunas malas hierbas son diffciles de controlar en este momento de la temporada debido a uno o mas de lo siguiente: insensibilidad inherente de la especie de mala hierba o biotipo al herbicida, malas hierbas anuales de invierno y condiciones de tiempo fno que limitan la absorcion y actividad del herbicida. Hay varias opciones de herbicidas disponibles para mezclar en tanque con estos herbicidas, para aumentar el espectro y la actividad sobre las malas hierbas donde los herbicidas no selectivos son debiles. Un ejemplo sena aplicaciones de mezcla en tanque del 2,4-D con glifosato para ayudar a controlar Conyza canadensis (engero del Canada). El glifosato se puede usar de 420 a 1680 g ea/ha, mas tipicamente de 560 a 840 g ea/ha, para el control por efecto quemado antes de plantar de la mayona de las malas hierbas presentes; sin embargo, se pueden aplicar, 280 - 1120 g ea/ha de 2,4-D para ayudar a controlar muchas especies de malas hierbas de hoja ancha (p. ej., engero del Canada). El 2,4-D es un herbicida de eleccion debido a que es eficaz en una amplia variedad de malas hierbas de hoja ancha, eficaz incluso a bajas temperaturas y extremadamente barato. Sin embargo, si el siguiente cultivo es un cultivo de dicotiledonea sensible, los residuos de 2,4-D en el suelo (aunque de vida de corta) pueden tener un impacto negativo en el cultivo. Las sojas son un cultivo sensible y requieren que pase un periodo de tiempo mmimo de 7 dfas (para una tasa de 2,4-D de 280 g ea/ha) a al menos 30 dfas (para aplicaciones de 2,4-D de 1120 g ea/ha) entre aplicaciones de efecto quemado y la plantacion. El 2,4-D esta prohibido como tratamiento de efecto quemado antes de plantar algodon (veanse las etiquetas federales, la mayona estan disponibles por CPR, 2005 o en internet en cdms.net/manuf/manuf.asp). Con el algodon o la soja transformados con AAD-13 (v1), estos cultivos podnan sobrevivir a los restos de 2,4-D en el suelo de aplicaciones de efecto quemado, aplicadas hasta e incluso despues de plantar antes de brotacion del cultivo. La mayor flexibilidad y menor coste de las parejas de mezcla en tanque (o premezcla comercial), mejorara las opciones de control y aumentara la robustez de las aplicaciones de efecto quemado en situaciones importantes sin labranza o con labranza reducida. Este ejemplo es una de las muchas opciones que estaran disponibles. Los expertos en la

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tecnica del control de las malas hierbas apreciaran una variedad de otras aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a gramoxone + 2,4-D o glufosinato + 2,4-D usando productos descritos en las etiquetas de herbicidas federales (CPR, 2005) y los usos descritos en la Agriliance Crop Protection Guide (2005), como ejemplos. Los expertos en la tecnica tambien reconoceran que el ejemplo anterior se puede aplicar a cualquier cultivo sensible al

2.4- D (u otro herbicida auxmico de fenoxi) que estana protegido por el gen AAD-13 (v1) si se ha transformado establemente. Igualmente, la propiedad unica de la AAD-13 que permite la degradacion del fluroxipir aumenta la utilidad permitiendo la sustitucion o mezclas en tanque de 35-560 g ea/ha de fluroxipir para aumentar el espectro y/o aumentar la capacidad de control de especies de malezas perennes o anuales.

Ejemplo 13 - Uso en el cultivo de herbicidas auxmicos en sojas, algodon y otros cultivos de dicotiledoneas transformados solo con AAD-13 (v1)

AAD-13 (v1) puede permitir el uso de herbicidas auxmicos de fenoxi (p. ej., 2,4-D y MCPA) y auxinas de piridiloxi (fluroxipir) para el control de una amplia variedad de malas hierbas de hoja ancha directamente en cultivos normalmente sensibles al 2,4-D. La aplicacion de 280 a 2240 g ea/ha de 2,4-D controlana la mayor parte de especies de malas hierbas de hoja ancha en entornos agncolas. Mas tfpicamente, se usan 560 - 1120 g ea/ha. Para el fluroxipir, las tasas de aplicacion tfpicamente estanan en el intervalo de 35-560 g ea/ha, mas tfpicamente 70-280 ae/ha.

Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el potencial control de malas hierbas residual de vida corta proporcionado por tasas mayores de 2,4-D y fluroxipir cuando se usan en tasas mas altas, mientras que un herbicida no residual como el glifosato no proporcionana control a las semillas que germinan mas tarde. Esta herramienta tambien proporciona un mecanismo para combinar modos de accion herbicidas con la conveniencia de HTC como una resistencia a herbicidas integrada y estrategia de gestion de desplazamiento de malas hierbas.

Una ventaja adicional que proporciona esta herramienta es la capacidad de mezclar en tanque una amplia variedad de herbicidas de control de malas hierbas de hoja ancha (p. ej., 2,4-D y fluroxipir) con herbicidas residuales de control de malas hierbas usados habitualmente. Estos herbicidas tfpicamente se aplican antes de o en la plantacion, pero a menudo son menos eficaces en malas hierbas que han brotado, establecidas que pueden existir en el campo antes de la plantacion. Ampliando la utilidad de estos herbicidas auxmicos de ariloxi para incluir las aplicaciones en la planta, post-brotacion o pre-plantacion, aumenta la flexibilidad de los programas residuales de control de malas hierbas. Un experto en la tecnica reconocera que el programa de herbicidas residuales diferira basandose en el cultivo de interes, pero los programas tfpicos incluinan herbicidas de las familias de herbicidas de cloracetamida y dinitroanilina, pero tambien incluyen herbicidas tales como clomazona, sulfentrazona, y una variedad de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO e inhibidores de HPPD.

Beneficios adicionales podnan incluir la tolerancia a 2,4-D o fluroxipir requerida antes de plantar despues de la aplicacion del herbicida auxmico de acido ariloxiacetico (vease el ejemplo previo); y menos problemas por dano de contaminacion a cultivos de dicotiledoneas que resultan de la limpieza incompleta de los tanques que han contenido

2.4- D o fluroxipir. Dicamba, R-diclorprop, y muchos otros herbicidas todavfa se pueden usar para el posterior control de plantas de regeneracion natural en cultivos de dicotiledoneas transformadas con AAD-13 (v1).

Los expertos en la tecnica reconoceran tambien que el ejemplo anterior se puede aplicar a cualquier cultivo sensible al 2,4-D (o herbicida auxmico de ariloxi) que estana protegido por el gen AAD-13 (v1) si es transformado establemente. Un experto en la tecnica del control de malas hierbas ahora reconocera que el uso de diferentes herbicidas auxmicos de fenoxi o piridiloxi comerciales solos o en combinacion con un herbicida, esta permitido por la transformacion por AAD-13 (v1). Las tasas espedficas de otros herbicidas representativos de estos productos qmmicos se pueden determinar por las etiquetas de los herbicidas recopiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o recopilaciones similares o cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005). Cualquier herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

Ejemplo 14 - Uso en cultivo de herbicidas auxmicos de fenoxi y auxmicos de piridiloxi en mafz, arroz y otras especies de monocotiledoneas transformadas solo con AAD-13 (v1)

De una forma analoga, la transformacion de especies de hierbas (tales como, pero no limitado a mafz, arroz, trigo, cebada o cesped y pastos) con AAD-13 (v1) permitina el uso de auxinas de fenoxi y piridiloxi muy eficaces en cultivos donde la selectividad normal no esta clara. La mayona de las especies de hierbas tienen una tolerancia natural a los herbicidas auxmicos tales como las auxinas de fenoxi (es decir, 2,4-D). Sin embargo, un nivel relativamente bajo de selectividad del cultivo ha producido una menor utilidad en estos cultivos debido a la ventana de periodo de aplicacion acortada o riesgo de dano inaceptable. Los cultivos de monocotiledoneas transformados con AAD-13 (v1), por lo tanto, permiten el uso de una combinacion similar de tratamientos descritos para los cultivos de dicotiledoneas tales como la aplicacion de 280 a 2240 g ea/ha de2,4-D para controlar la mayona de las especies de malas hierbas de hoja ancha. Mas tfpicamente, se usan 560 - 1120 g ea/ha. Para el fluroxipir, las tasas de aplicacion tfpicamente estanan en el intervalo de 35-560 g ea/ha, mas tfpicamente 70-280 ae/ha.

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Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el potencial control de malas hierbas residual de vida corta con tasas mayores de 2,4-D y fluroxipir. En cambio, un herbicida no residual como el glifosato no proporcionana control a las semillas que germinan mas tarde. Esta herramienta tambien proporcionana un mecanismo para rotar modos de accion herbicidas con la conveniencia de HTC como una resistencia a herbicidas integrada y estrategia de gestion de desplazamiento de malas hierbas en una estrategia de combinacion de cultivo tolerante a glifosato/HTC con AAD-13 (v1), se roten o no especies de cultivos.

Una ventaja adicional que proporciona esta herramienta es la capacidad de mezclar en tanque una amplia variedad de herbicidas de control de malas hierbas de hoja ancha (p. ej., 2,4-D y fluroxipir) con herbicidas residuales de control de malas hierbas usados habitualmente. Estos herbicidas tipicamente se aplican antes de o en la plantacion, pero a menudo son menos eficaces en malas hierbas que han brotado, establecidas que pueden existir en el campo antes de la plantacion. Ampliando la utilidad de estos herbicidas auxmicos de ariloxi para incluir las aplicaciones en la planta, post-brotacion o pre-plantacion, aumenta la flexibilidad de los programas residuales de control de malas hierbas. Un experto en la tecnica reconocera que el programa de herbicidas residuales diferira basandose en el cultivo de interes, pero los programas tfpicos incluinan herbicidas de las familias de herbicidas de cloracetamida y dinitroanilina, pero tambien incluyen herbicidas tales como clomazona, sulfentrazona, y una variedad de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO e inhibidores de HPPD.

La mayor tolerancia del mafz, arroz y otras monocotiledoneas a las auxinas de fenoxi o piridiloxi permitira el uso de estos herbicidas en cultivo sin restricciones de la fase de crecimiento o potencial inclinacion del cultivo; fenomenos de despliegue tales como en “cola de rata”, fragilidad del tallo inducido por reguladores del crecimiento en el mafz, o rafces de refuerzo deformadas. Cada herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

Ejemplo 15 - AAD-13 (v1) apilado con rasgo de tolerancia al glifosato en cualquier cultivo

La amplia mayona de acres de algodon, canola, mafz y soja plantados en America del Norte contienen un rasgo de tolerancia al glifosato (GT), y aumenta la adopcion de mafz con GT. Se han desarrollado cultivos con GT adicionales (p. ej., trigo, arroz, remolacha azucarera y cesped) pero hasta la fecha no se han comercializado. Muchas otras especies resistentes al glifosato estan en etapa de desarrollo experimental (p. ej., alfalfa, cana de azucar, girasol, remolacha, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el alamo y el liquidambar; y especies hortmolas como calendula, petunia y begonias; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 en internet). Los GTC son herramientas valiosas por la amplitud de malas hierbas controlada y la conveniencia y eficacia de coste proporcionado por este sistema. Sin embargo, la utilidad del glifosato como un tratamiento de base ahora estandar esta seleccionando las malas hierbas resistentes al glifosato. Ademas, las malas hierbas en las que el glifosato es inherentemente menos eficaz producen desplazamiento a las especies dominantes en los campos donde se han estado practicando programas qrnmicos solo con glifosato. Mediante el apilamiento de AAD- 13 (v1) con un rasgo de GT, sea por reproduccion convencional o junto con suceso de transformacion nuevo, se podna mejorar la eficacia del control de malas hierbas, la flexibilidad y la capacidad para gestionar los desplazamientos de malas hierbas y el desarrollo de resistencia a herbicidas. Como se ha mencionado en ejemplos previos, mediante cultivos que se transforman con AAD-13 (v1), los cultivos de monocotiledoneas tendran un margen mayor de seguridad frente a auxinas de fenoxi o piridiloxi, y las auxinas de fenoxi se pueden aplicar selectivamente en cultivos de dicotiledoneas. Se pueden prever varios escenarios de opciones de control mejorado de malas hierbas donde el AAD-13 (v1) y un rasgo de GT estan apilados en cualquier especie de cultivo de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) El glifosato se puede aplicar con una tasa de aplicacion post-brotacion estandar (de 420 a 2160 g ea/ha, preferiblemente de 560 a 840 g ea/ha) para el control de la mayona de las especies de hierbas y malas hierbas de hoja ancha. Para el control de las malas hierbas de hoja ancha resistentes al glifosato como Conyza canadensis o malas hierbas inherentemente diffciles de controlar con el glifosato (p. ej., Commelina spp, Ipomoea spp, etc.), se pueden aplicar 280-2240 g ea/ha (preferiblemente 560-1120 g ea/ha) de 2,4-D de forma secuencial, mezclado en tanque o como una premezcla con glifosato para proporcionar control eficaz. Para el fluroxipir, las tasas de aplicacion tfpicamente estanan en el intervalo de 35-560 g ea/ha, mas tfpicamente 70-280 ae/ha.

b) Actualmente, las tasas de glifosato aplicadas en GTC en general estan en el intervalo de 560 a 2240 g ea/ha por periodo de aplicacion. El glifosato es mucho mas eficaz en especies de hierbas que en especies de malas hierbas de hoja ancha. Los rasgos apilados de AAD-13 (v1) + GT permitinan tasas eficaces para las hierbas de glifosato (105-840 g ea/ha, mas preferiblemente 210-420 g ea/ha). El 2,4-D (con 280-2240 g ea/ha, mas preferiblemente 5601120 g ea/ha) se podna aplicar entonces de forma secuencial, mezclado en tanque o como una premezcla con tasas de aplicacion de glifosato eficaces para hierbas para proporcionar el necesario control de malas hierbas de hoja ancha. El fluroxipir con las tasas mencionadas antes sena un componente aceptable en el regimen de tratamiento. La tasa baja de glifosato tambien proporcionana algun beneficio en el control de malas hierbas de hoja ancha; sin embargo, el control principal sena por el 2,4-D o fluroxipir.

Un experto en la tecnica de control de malas hierbas reconocera que el uso de uno o mas herbicidas auxmicos de ariloxi comerciales solos o en combinacion (de forma secuencial o independiente) esta permitido por la

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transformacion con AAD-13 (v1) en los cultivos. Las tasas espedficas de otros herbicidas representativos de estos productos qmmicos se puede determinar por las etiquetas de los herbicidas recopiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o recopilaciones similares, etiquetas recopiladas en internet (p. ej.,

cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005). Cualquier herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

Ejemplo 16 - AAD-13 (v1) apilado con el rasgo de tolerancia al glufosinato en cualquier cultivo

La tolerancia al glufosinato (PAT, bar) esta actualmente presente en una serie de cultivos plantados en America del Norte sea como marcador seleccionable para un rasgo introducido como protemas de resistencia a insectos o espedficamente como un rasgo de HTC. Los cultivos incluyen, pero no se limitan a canola, mafz y algodon resistentes a glufosinato. Se han estado desarrollando cultivos adicionales tolerantes al glufosinato (p. ej., arroz, remolacha de azucar, sojas y cesped) pero hasta la fecha no se ha comercializado ninguno. El glufosinato, como el glifosato, es un herbicida de hierbas y malas hierbas de hoja ancha de amplio espectro, relativamente no selectivo. El modo de accion del glufosinato difiere de la del glifosato. Es de accion mas rapida, dando como resultado la desecacion y “quemado” de las hojas tratadas 24-48 horas despues de la aplicacion del herbicida. Esto es ventajoso para el aspecto del control rapido de malas hierbas. Sin embargo, esto tambien limita la traslocacion del glufosinato a regiones meristemicas de las plantas objetivo dando como resultado un control peor de las malas hierbas, como se pone de manifiesto por las tasas relativas de rendimiento de control de malas hierbas de los dos componentes en muchas especies (Agriliance, 2005).

Mediante el apilamiento de AAD-13 (v1) con un rasgo de tolerancia al glufosinato, sea por reproduccion convencional o junto con suceso de transformacion nuevo, se podna mejorar la eficacia del control de malas hierbas, la flexibilidad y la capacidad para gestionar los desplazamientos de malas hierbas y el desarrollo de resistencia a herbicidas. Se pueden prever varios escenarios de opciones de control mejorado de malas hierbas donde el AAD-13 (v1) y un rasgo de tolerancia al glufosinato estan apilados en cualquier especie de cultivo de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) El glufosinato se puede aplicar con una tasa de aplicacion post-brotacion estandar (de 200 a 1700 g ea/ha, preferiblemente de 350 a 500 g ea/ha) para el control de la mayona de las especies de hierbas y malas hierbas de hoja ancha. Hasta la fecha no se han confirmado malas hierbas no resistentes al glufosinato; sin embargo, el glufosinato tiene un mayor numero de malas hierbas que son inherentemente mas tolerantes que para el glifosato.

i) Especies de malas hierbas de hoja ancha inherentemente tolerantes (p. ej., Cirsium arvensis Apocynum cannabinum, y Conyza candensis) se podnan controlar por mezcla en tanque de 280-2240 g ea/ha, mas preferiblemente 560-2240 g ea/ha, de 2,4-D para el control eficaz de estas especies perennes de control mas diffcil, y mejorar la robustez del control en especies de malas hierbas de hoja ancha anuales. El fluroxipir sena un componente aceptable para considerar en el regimen de control de malas hierbas. Para el fluroxipir, las tasas de aplicacion tfpicamente estanan en el intervalo de 35-560 g ea/ha, mas tfpicamente 70-280 ae/ha.

b) Una combinacion multiple de glufosinato (200-500 g ea/ha) +/- 2,4-D (280-1120 g ea/ha) +/- fluroxipir (con las tasas citadas antes), por ejemplo, podna proporcionar un espectro de control de malas hierbas que se solapa, mas robusto. Ademas, el espectro que se solapa proporciona un mecanismo adicional para la gestion o retraso de las malas hierbas resistentes a herbicida.

Un experto en la tecnica de control de malas hierbas reconocera que el uso de uno o mas herbicidas auxfnicos ariloxiaceticos comerciales solos o en combinacion (de forma secuencial o independiente) esta permitido por la transformacion con AAD-13 (v1) en los cultivos. Las tasas espedficas de otros herbicidas representativos de estos productos qmmicos se puede determinar por las etiquetas de los herbicidas recopiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o recopilaciones similares, etiquetas recopiladas en internet (p. ej.,

cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier gma de proteccion de cultivos comercial o academica tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005). Cualquier herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

La presente invencion incluye, por lo tanto, una planta transgenica (y celulas de planta) que comprenden un gen AAD-13 (v1) de la presente invencion “apilado” con un gen DSM-2 del documento WO/2008/070845 (presentado el 7 de diciembre, 2007). Dichos genes DSM-2 incluyen la SEQ ID NO: 1 y 3 de esta solicitud. Estos genes codifican las protemas que comprenden las SEQ ID NO: 2 y 4 de esta solicitud. Ademas tambien, se pueden incluir genes de tolerancia a herbicida adicionales en “apilamientos” multiples que comprenden tres o mas de dichos genes.

Ejemplo 17 - AAD-13 (v1) apilado con el rasgo AAD-1 (v3) en cualquier cultivo

Las plantas homocigoticas para AAD-13 (v1) y AAD-1 (v3) (vease el documento WO/2005/107437 para este ultimo) se pueden cruzar redprocamente y recoger las semillas F1. Las semillas F1 de dos cruces redprocos de cada gen se estratificaron y se trataron 4 repeticiones de cada cruce en el mismo regimen de pulverizacion usado para los

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otros ensayos con uno de los siguientes tratamientos: 70, 140, 280 g ea/ha de fluroxipir (selectivo para el gen AAD-

12 (v1)); 280, 560, 1120 g ea/ha de R-dicloroprop (selectivo para el gen AAD-1 (v3)); o 560, 1120, 2240 g ea/ha de

2,4-D DMA (para confirmar la tolerancia a 2,4-D). Las plantas homocigoticas T2 para cada gen tambien se plantaron para usar como controles. Las plantas se clasificaron en 3 y 14 DAT. Los resultados de pulverizacion se muestran en la tabla 24.

Los resultados confirman que AAD-13 (v1) puede apilarse satisfactoriamente con AAD-1 (v3), aumentando as^ el espectro de herbicidas que se pueden aplicar al cultivo de interes (acidos fenoxiaceticos, acidos fenoxipropionicos frente a acidos fenoxiaceticos + acidos piridiloxiaceticos para AAD-1 y AAD-13, respectivamente). La naturaleza complementaria de los patrones de resistencia cruzada a herbicidas permite el uso conveniente de estos dos genes como marcadores complementarios y de campo seleccionables apilables. En los cultivos donde la tolerancia con un solo gen puede ser marginal, un experto en la tecnica reconoce que se puede aumentar la tolerancia apilando un segundo gen de tolerancia para el mismo herbicida. Esto se puede hacer usando el mismo gen con el mismo o diferentes promotores; sin embargo, como se observa aqrn el apilamiento y seguimiento de dos rasgos complementarios puede ser facilitado por la proteccion cruzada distintiva para acidos fenoxipropionicos [de AAD-1 (v3)] o acidos piridiloxiaceticos [de AAD-13 (v1)].

La presente invencion incluye por lo tanto una planta transgenica (y celulas de planta) que comprenden un gen AAD-

13 de la presente invencion “apilado” con un gen AAD-1 del documento WO 2005/107437 (publicado el 17 de noviembre, 2005; WO/2005/107437 (presentado el 2 de mayo, 2005)). Dichos genes AAD-1 incluyen las SEQ ID NO: 3, 4, 5, y 12 de esta solicitud. Estos genes codifican protemas que comprenden las SEQ ID NO: 9, 10, 11, y 13 de esta solicitud. Ademas tambien, se pueden incluir genes de tolerancia a herbicida adicionales en “apilamientos” multiples que comprenden tres o mas de dichos genes.

Ejemplo 18 - AAD-13 (v1) apilado con el rasgo AAD-12 (v1) en cualquier cultivo

Las plantas homocigoticas para AAD-13 (v1) y AAD-12 (v1) (vease el documento WO 2007/053482 para este ultimo) se pueden cruzar y recoger las semillas F1. Las semillas F1 de dos cruces redprocos de cada gen se pueden sembrar y tratar las plantas F1 con el mismo regimen de pulverizacion usado para los otros ensayos con uno de los siguientes tratamientos: 70, 280, 1120 g ea/ha de fluroxipir (selectivo para el gen AAD-12 (v1)); 70, 280, 1120 g ea/ha de triclopir (selectivo para el gen AAD-13 (v1)); o 560, 1120, 2240 g ea/ha de 2,4-D DMA (para confirmar la tolerancia a 2,4-D).

AAD-13 (v1) puede apilarse satisfactoriamente con AAD-12 (v1), aumentando asf el espectro de herbicidas que se pueden aplicar al cultivo de interes (acidos fenoxiaceticos + triclopir frente a acidos fenoxiaceticos + fluroxipir para AAD-12 y AAD-13, respectivamente). La naturaleza complementaria de los patrones de resistencia cruzada a herbicidas permite el uso conveniente de estos dos genes como marcadores complementarios y de campo seleccionables apilables. En los cultivos donde la tolerancia con un solo gen puede ser marginal, un experto en la tecnica reconoce que se puede aumentar la tolerancia apilando un segundo gen de tolerancia para el mismo herbicida. Esto se puede hacer usando el mismo gen con el mismo o diferentes promotores; sin embargo, como se observa aqrn el apilamiento y seguimiento de dos rasgos complementarios puede ser facilitado por la proteccion cruzada distintiva para fluroxipir [de AAD-13 (v1)] y triclopir [de AAD-12 (v1)].

La presente invencion incluye por lo tanto una planta transgenica (y celulas de planta) que comprenden un gen AAD- 13 de la presente invencion “apilado” con un gen AAD-12 del documento Wo 2007/053482 (publicado el 10 de mayo, 2007; PCT/US2006/042133 (presentado el 27 de octubre, 2006)). Dichos genes AAD-12 incluyen las SEQ ID NO: 1, 3 y 5 de esta solicitud. Estos genes codifican protemas que comprenden las SEQ ID NO: 2 y 4 de esta solicitud. Ademas tambien, se pueden incluir genes de tolerancia a herbicida adicionales en “apilamientos” multiples que comprenden tres o mas de dichos genes.

Ejemplo 19 - AAD-13 (v1) apilado con el rasgo AHAS en cualquier cultivo

La tolerancia a herbicidas de imidazolinona (AHAS y otros) esta actualmente presente en una serie de cultivos plantados en America del Norte que incluyen, pero no se limitan a mafz, arroz y trigo. Se han estado desarrollando cultivos tolerantes a imidazolinona adicionales (p. ej., algodon y remolacha de azucar) pero hasta la fecha no se ha comercializado ninguno. Actualmente se usan muchos herbicidas de imidazolinona (p. ej., imazamox, imazetapir, imazaquin, e imazapic) selectivamente en diferentes cultivos convencionales. El uso de imazetapir, imazamox, y el no selectivo imazapir ha sido posible por los rasgos de tolerancia a imidazolinonas como AHAS y otros. Esta clase qrnmica tambien tiene una actividad residual en el suelo significativa, pudiendo proporcionar control de malas hierbas prolongado mas alla del periodo de aplicacion, a diferencia de los sistemas basados en glifosato o glufosinato. Sin embargo, el espectro de malas hierbas controladas por herbicidas de imidazolinona no es tan amplio como el del glifosato. Ademas, los herbicidas de imidazolinona tienen un modo de accion (inhibicion de la acetolactato sintasa, ALS) al cual han desarrollado resistencia muchas malas hierbas. Mediante el apilamiento de AAD-13 (v1) con un rasgo de tolerancia a imidazolinonas, sea por reproduccion convencional o junto con suceso de transformacion nuevo, se podna mejorar la eficacia del control de malas hierbas, la flexibilidad y la capacidad para gestionar los desplazamientos de malas hierbas y el desarrollo de resistencia a herbicidas. Como se ha mencionado en ejemplos previos, transformando cultivos con AAD-13 (v1), los cultivos de monocotiledoneas tendran un margen

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mayor de seguridad con auxinas de fenoxi o piridiloxi, y estas auxinas se pueden aplicar selectivamente en cultivos de dicotiledoneas. Se pueden prever varios escenarios de opciones de control mejorado de malas hierbas donde el AAD-13 (v1) y un rasgo de tolerancia a las imidazolinonas estan apilados en cualquier especie de cultivo de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) El imazetapir se puede aplicar con una tasa de aplicacion post-brotacion estandar (de 35 a 280 g ea/ha, preferiblemente 70-140 g ea/ha) para el control de muchas especies de hierbas y malas hierbas de hoja ancha.

i) Las malas hierbas de hoja ancha resistentes a inhibidores de ALS como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album, se podnan controlar con mezcla en tanque de 280-2240 g ea/ha, mas preferiblemente 5601120 g ea/ha, de 2,4-D. Para el fluroxipir, las tasas de aplicacion estanan tfpicamente en el intervalo de 35-560 g ea/ha, mas tfpicamente 70-280 ae/ha.

ii) Las especies de hoja ancha inherentemente mas tolerantes a herbicidas de imidazolinona como Ipomoea spp. tambien se pueden controlar por mezcla en tanque de 280-2240 g ea/ha, mas preferiblemente 560-1120 g ea/ha, de

2,4-D. Veanse las tasas anteriores para triclopir o fluroxipir.

b) Una combinacion multiple de imazetapir (de 35 a 280 g ea/ha, preferiblemente 70-140 g ea/ha) +/- 2,4-D (2801120 g ea/ha) +/- fluroxipir (con las tasas citadas antes), por ejemplo, podna proporcionar un espectro de control de malas hierbas que se solapa, mas robusto. Ademas, el espectro que se solapa proporciona un mecanismo adicional para la gestion o retraso de las malas hierbas resistentes a herbicida.

Un experto en la tecnica de control de malas hierbas reconocera que el uso de cualquiera de diferentes herbicidas de imidazolinona comerciales, herbicidas auxmicos fenoxiaceticos o piridiloxiaceticos comerciales solos o en combinaciones multiples, esta permitido por la transformacion con AAD-13 (v1) y apilamiento con cualquier rasgo de tolerancia a imidazolinonas sea por reproduccion convencional o modificacion genetica. Las tasas espedficas de otros herbicidas representativos de estos productos qmmicos se pueden determinar por las etiquetas de los herbicidas recopiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o recopilaciones similares, etiquetas recopiladas en internet (p. ej., cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier gma de proteccion de cultivos comercial o academica tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005). Cualquier herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

Ejemplo 20 - AAD-13 (v1) apilado con resistencia a insectos (IR) u otros rasgos introducidos en cualquier cultivo

La resistencia a insectos en cultivos que tienen un rasgo transgenico esta extendida en la produccion de mafz y algodon en America del Norte y por todo el mundo. Los productos comerciales que tienen combinados rasgos de iR y HT se han desarrollado en multiples empresas de semillas. Estos incluyen rasgos de Bt IR (p. ej. toxinas Bt citadas en la pagina de internet lifesci.sussex.ac.uk, 2006) y cualquiera o todos los rasgos de HTC mencionados antes. El valor de esta oferta es la capacidad para controlar multiples problemas de plagas por medios geneticos en un solo producto. La conveniencia de este producto estana restringida si el control de malas hierbas y el control de insectos se llevan a cabo independientemente uno de otro. AAD-13 (v1) solo o apilado con uno o mas rasgos adicionales de HTC se puede apilar con uno o mas rasgos introducidos adicionales (p. ej., resistencia a insectos, resistencia a hongos o tolerancia al estres, y otros) (isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005) sea por reproduccion convencional o junto con un nuevo suceso de transformacion. Los beneficios incluyen la conveniencia y flexibilidad descritas en ejemplos previos junto con la capacidad para manejar plagas de insectos y/u otros estreses agncolas, ademas del control de malas hierbas mejorado ofrecido por AAD-13 (v1) y tolerancia a herbicida asociada. Por lo tanto, la presente invencion se puede usar para proporcionar un paquete agronomico completo de calidad mejorada del cultivo con la capacidad del control flexible y barato de una serie de problemas agncolas.

Los rasgos combinados de IR y HT tienen aplicacion en la mayona de los cultivos agncolas y de horticultura/ornamentales y forestales. La combinacion de AAD-13 y su tolerancia a herbicidas correspondiente y resistencia a insectos proporcionada por cualquiera de una serie de genes de IR Bt o no Bt, se puede aplicar a especies de cultivo citadas (pero no limitado a) en el ejemplo 13. Un experto en la tecnica de control de malas hierbas reconocera que el uso de cualquiera de diferentes herbicidas comerciales descritos en los ejemplos 18-20, herbicidas auxmicos fenoxiaceticos o piridiloxiaceticos solos o en combinaciones multiples, esta permitido por la transformacion con AAD-13 (v1) y apilamiento con el correspondiente rasgo de HT o IR, sea por reproduccion convencional o modificacion genetica. Las tasas espedficas de otros herbicidas representativos de estos productos qmmicos se pueden determinar por las etiquetas de los herbicidas recopiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o recopilaciones similares, etiquetas recopiladas en internet (p. ej., cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier gma de proteccion de cultivos comercial o academica tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2005). Cualquier herbicida alternativo permitido para usar en HTC por el AAD-13 (v1), usado solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera que esta dentro del alcance de esta invencion.

Ejemplo 21 - AAD-13 (v1) como un marcador seleccionable de dicotiledoneas in vitro

La modificacion genetica de celulas, tejidos, organos vegetales y plantas u organulos tales como plastidos, empieza con el procedimiento de insertar genes de interes en las celulas de plantas usando un metodo de suministro

Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. - Un polinucleotido aislado que codifica una protema que degrada enzimaticamente una subestructura qmmica de ariloxialcanoato de un herbicida de ariloxialcanoato, en donde dicho polinucleotido esta operativamente unido a un promotor de planta o un promotor de virus de planta, y en donde una molecula de acido nucleico que codifica dicha protema hibrida en condiciones restrictivas con el complemento entero de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, y en donde la protema es capaz de degradar herbicidas auxmicos de fenoxiacetato y piridiloxiacetato.
2. 2. - El polinucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicha protema es al menos 95% identica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.
3. 3. - El polinucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicho polinucleotido comprende una composicion de codones no natural que tienen un sesgo hacia el uso de codones de la planta para aumentar la expresion de dicho polinucleotido en una planta.
4. 4. - El polinucleotido de la reivindicacion 3, en donde dicha composicion de codones esta sesgada hacia el uso de codones de plantas dicotiledoneas.
5. 5. - Una celula de planta que comprende un polinucleotido que codifica una protema que degrada enzimaticamente una subestructura qmmica de ariloxialcanoato de un herbicida de ariloxialcanoato, en donde dicho polinucleotido esta operativamente unido a un promotor que es funcional en una planta y comprende una composicion de codones no natural que tienen un sesgo hacia el uso de codones de la planta para aumentar la expresion de dicho polinucleotido en una planta, en donde una molecula de acido nucleico que codifica dicha protema hibrida en condiciones restrictivas con el complemento entero de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, y en donde dicha protema es al menos 95% identica con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 y en donde la protema es capaz de degradar herbicidas auxmicos de fenoxiacetato y piridiloxiacetato.
6. 6. - Una planta que comprende una pluralidad de celulas de planta de acuerdo con la reivindicacion 5.
7. 7. - La planta de la reivindicacion 6, en donde dicha planta es una planta dicotiledonea, y opcionalmente en donde dicha planta es una planta de soja.