ES2622906T3 - Endonucleasas - Google Patents

Abstract

Una endonucleasa I o fragmento enzimáticamente activo de la misma en la que dicha endonucleasa I tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que es al menos el 70 % idéntica a la misma y en la que el resto de aminoácido que está inmediatamente en el extremo N del motivo de pentapéptido FYCGC ha sido sustituido con un resto que tiene carga negativa.

Description

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necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación satisfactoria y a mezclas que están incompletas y, por tanto, solo contienen algunos (por ejemplo al menos 2, 3 o 4) de los componentes requeridos. Si va seguido del término "completa", la mezcla de reacción contiene todos los componentes necesarios para la amplificación.

El término "remanente" se usa para describir cualquier ácido nucleico que sea accidentalmente o involuntariamente introducido en una mezcla de reacción, en particular secuencias diana llevadas de las reacciones de amplificación previas.

El término "resultado positivo falso" se refiere a un resultado que parece mostrar que la muestra de ácido nucleico en investigación contiene la secuencia diana, pero en la que el producto amplificado se deriva de remanente. Claramente, la reducción en ADN contaminante que la invención proporciona es particularmente ventajosa en los campos forense y de diagnóstico. Los métodos de la invención permiten aumentar la especificidad y sensibilidad de la amplificación de ácido nucleico.

El término "endonucleasa" se refiere a una enzima que hidroliza un enlace fosfodiéster en el esqueleto de polinucleótido y no es específica de secuencia de nucleótidos. La "endonucleasa I" de la presente invención puede escindir polinucleótidos bc y mc, ADN y ARN.

El término "polinucleótido" se refiere a cualquier cadena de nucleótidos. Estos polinucleótidos pueden ser ARN o ADN, y pueden ser tanto bicatenarios como monocatenarios. Las hebras también pueden ser tanto lineales como superenrolladas.

El término "sal" se refiere a cualquier compuesto iónico que resulte de la reacción de neutralización de un ácido y una base. Sales que son de interés son aquellas que se usan comúnmente para limitar las interacciones ADNproteína y producen una muestra de proteína más pura después de la adición de una endonucleasa, y el experto conocería estas sales. Sales de importancia particular son cloruro sódico y cloruro de potasio.

Por "sustancialmente inactivada" se indica que la enzima está inactivada al menos el 95 %, preferentemente está inactivada el 98 %, más preferentemente la enzima está inactivada el 100 %. El porcentaje de inactivación puede medirse convenientemente incubando una muestra de ADN (por ejemplo, producto de PCR de 500 pb) durante 3 horas tanto con una endonucleasa inactivada como con una endonucleasa no inactivada en un tampón adecuado (por ejemplo, Tris, HEPES, PBS) a 37 ºC; separando los productos de reacción en un gel de bromuro de etidioagarosa por electroforesis y midiendo las intensidades relativas de fluorescencia de las bandas de ADN relevantes bajo luz UV. Métodos alternativos podrían ser ideados por el experto para medir actividades relativas de endonucleasas inactivadas y no inactivadas. Por ejemplo, podrían usarse cambios relativos en la fluorescencia de muestras de ADN que contienen SYBR green. Métodos adicionales son el ensayo de Kunitz (Kunitz, M; 1950, S. Gen Physiol, 33:363 y el documento WO 2011/010094) y el ensayo de Kunitz modificado ideado por Yamamoto (Yamamoto, M; 1971, Biochem BiophysActa, 228:95 y el documento WO 2011/010094). Métodos adecuados se describen en los ejemplos en el presente documento.

El beneficio de la inactivación "irreversible" es que la función catalítica de la endonucleasa no puede ser recuperada por cambios en la temperatura y, por tanto, la muestra tratada, que todavía puede contener la endonucleasa inactivada, puede usarse en procesamiento adicional o aplicaciones que implican el contacto con ácido nucleico de interés sin digestión de ese ácido nucleico. Así, la endonucleasa no recupera su actividad y sustancialmente no hay actividad residual; específicamente, queda menos del 5 %, preferentemente menos del 2 %, lo más preferentemente no queda actividad de endonucleasa detectable. Las enzimas de la invención son capaces de tal inactivación "irreversible" (condiciones que proporcionan tal inactivación se describen en el presente documento) y así la inactivación es preferentemente inactivación irreversible. La inactivación puede considerarse "irreversible" aunque depende de la presencia continuada de un aditivo de inactivación, por ejemplo un agente quelante de ion metálico o agente reductor.

La inactivación, que incluye inactivación resistente al cambio térmico ("irreversible"), puede requerir que la endonucleasa esté todavía en contacto con un aditivo de inactivación, como se ha definido anteriormente. A menos que sea de otro modo evidente del contexto, las actividades residuales descritas en el presente documento suponen la presencia continuada de un aditivo de inactivación, por ejemplo al menos 0,1, preferentemente al menos 0,2 mM de aditivo, por ejemplo, TCEP; agentes reductores más débiles pueden requerir concentraciones más altas, por ejemplo al menos 0,5 o 1 mM. Normalmente no se requiere más de 10 mM, preferentemente no más de 5 mM, o está presente.

Para ciertas aplicaciones, puede desearse tener una endonucleasa I que es inactiva incluso cuando no está presente, o esencialmente no está presente, aditivo de inactivación. Métodos para la eliminación del agente de inactivación se conocen en la técnica e incluyen diálisis y el uso de columnas de desalación o de intercambio de tampón. Las enzimas de la presente invención, si se tratan apropiadamente, pueden inactivarse hasta este grado. Condiciones adecuadas se describen en el Ejemplo 8. Las condiciones apropiadas dependerán de (i) la elección del aditivo de inactivación usado, (ii) la concentración de aditivo de inactivación añadido a la endonucleasa, (iii) la temperatura de inactivación a la que se calienta la endonucleasa (en presencia de aditivo de inactivación), (iv) el

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La Fig. 9 muestra las fotografías de geles de agarosa que muestran la actividad de la endonucleasa de VsEndA_S44E y VsEndA no mutante que han sido incubadas a 4 ºC durante tanto 6 como 18 horas en presencia de tanto DTT (Fig. 9a) como TCEP (Fig. 9b) a una concentración de tanto 1 mM, 10 mM como 20 mM. Los resultados se compararon con tanto sin enzima (control negativo) como 6 U de VsEndA no mutante (control positivo).

La Fig. 10 muestra el grado de eliminación de ADN enriquecido de la ADN polimerasa AccuStart™ Taq comercialmente disponible (Fig. 9a) o polimerasa GoTaq® Hot Start (Fig. 9b) usando VsEndA_S44E mutante.

La Fig. 11 muestra el grado de eliminación de ADN enriquecido de la mezcla madre de qPCR Maxima comercialmente disponible usando VsEndA_S44E mutante.

La Fig. 12 muestra el grado de eliminación de ADN genómico bicatenario enriquecido de ADN polimerasa TEMPase comercialmente disponible usando VsEndA_S44E mutante en una solución que contenía tanto cloruro sódico 0,5 M (Fig. 11a) como cloruro sódico 1 M (Fig 11b).

La Fig. 13 muestra el grado de eliminación de ADN genómico bicatenario enriquecido de una solución de lisado celular de E. coli que contiene una proteína recombinantemente expresada usando VsEndA_S44E mutante en soluciones de cloruro sódico variables (0 M, 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M y 1,0 M).

La Fig. 14 muestra la actividad óptima de VsEndA_S44E mutante en soluciones con alta salinidad. La actividad se probó en un tampón Tris-HCI 25 mM, pH 8,5, cloruro de magnesio 5 mM, con concentraciones variable de cloruro sódico y cloruro de potasio. La máxima actividad obtenida se estableció al 100 %.

La Fig. 15 muestra la actividad de VsEndA_S44E mutante a temperaturas variables. La actividad se probó en un tampón Tris-HCI 25 mM, pH 8,5, que contenía cloruro de magnesio 5 mM y cloruro sódico 0,5 M.

La Fig. 16 muestra la capacidad de VsEndA_S44E mutante para degradar ADN a niveles variables de pH y concentraciones de cloruro sódico, en comparación con la nucleasa Benzonase comercialmente disponible (Serratia marcescens). Se llevaron a cabo reacciones a un pH de tanto 7,5, 8,0 como 8,5 y a una concentración de cloruro sódico de tanto 0,25 M o 0,5 M (Fig. 16a) como 0,75 M o 1,0 M (Fig. 16b). Las mezclas de reacción contuvieron 100 l de tampón Tris-HCI con cloruro de magnesio 5 mM, 50 g de ADN de timo de ternero y 300 U de tanto VsEndA_S44E como Benzonase. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos. Las reacciones se detuvieron usando un tampón de carga que contenía EDTA y se ejecutaron en un 1 % de gel de agarosa.

La Fig. 17 muestra la capacidad de VsEndA_S44E mutante para degradar ADN en lisados de E. coli que contienen una proteína de unión a ADN. Se añadió VsEndA_S44E a lisados de E. coli a concentraciones variables de cloruro sódico y se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos. El control no contiene cloruro sódico.

y en la que

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la porción traducida de la secuencia de nucleótidos de ADNc de la endonucleasa I de Vibrio salmonicida no mutante, que incluye el péptido señal.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos de ADNc de endonucleasa I de Vibrio salmonicida mutante (VsEndA con la mutación TCC a GAG) que incluye la secuencia señal.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la porción traducida de la secuencia de nucleótidos de ADNc de la endonucleasa I de Vibrio cholerae no mutante, que incluye el péptido señal.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la porción traducida de la secuencia de nucleótidos de ADNc de la endonucleasa I de Vibrio salmonicida no mutante, sin el péptido señal.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la porción traducida de la secuencia de nucleótidos de ADNc de la endonucleasa I de Vibrio cholerae no mutante, sin el péptido señal.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de endonucleasa I de Vibrio salmonicida mutante (VsEndA, con un resto de serina sustituido por un glutámico y resto en la posición 44), que incluye la secuencia señal.

SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 20 son secuencias de aminoácidos de endonucleasa I, sin péptido señal, derivadas de bacterias de una variedad de géneros diferentes como se describe en la Tabla 2 y la Figura 3.

SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 30 son secuencias de aminoácidos de endonucleasa I, sin péptido señal, derivadas de diversas bacterias del género Vibrio como se describen en la Tabla 1 y la Figura 4.

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EJEMPLO 5 -Estabilidad a la temperatura de VsEndA_S44E en comparación con VsEndA

La semivida de la enzima no mutante (VsEndA) es aproximadamente 2 h a 70 ºC y 5 h a 60 ºC (datos no mostrados).

Se diluyeron enzimas, VsEndA_S44E y VsEndA, a una concentración de 200.000 U/ml en un tampón que contenía Tris/HCI 25 mM, pH 8, MgCI2 5 mM, NaCI 150 mM, 0,01 % de Triton X-100 y ditiotreitol (DTT) ± 1 mM. Se transfirió un volumen de 6 x 100 l a diferentes tubos de Eppendorf. Las muestras se incubaron a 40 ºC o 50 ºC durante 0 a 40 minutos y a partir de aquí se dispusieron sobre hielo secuencialmente. La actividad restante se midió usando el ensayo de Kunitz modificado como se describe en el Ejemplo 3. A partir de los datos mostrados en la Figura 6, es evidente que para tanto VsEndA_S44E como VsEndA, se requiere la adición de DTT para la inactivación térmica. Tras la adición de DTT, las enzimas se inactivan a una tasa más rápida. VsEndA_S44E mutante se ha abreviado "S44E" y VsEndA no mutante "wt" en las leyendas de las figuras.

EJEMPLO 6 -Inactivación a la temperatura usando diferentes agentes reductores

Se probó la capacidad de VsEndA_S44E para inactivarse usando una variedad de aditivos de inactivación que comprendían DTT, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y 2-mercaptoetanol a una temperatura de 40 ºC.

Cuando se comparan los datos mostrados en la Figura 7 con los de la Figura 6a, puede determinarse que todos los aditivos de inactivación facilitaron la inactivación. Se encontró que DTT y TCEP eran más eficaces como aditivos de inactivación en comparación con 2-mercaptoetanol. VsEndA_S44E mutante se ha abreviado "S44E" y VsEndA no mutante "wt" en las leyendas de las figuras.

EJEMPLO 7 -Experimentos de inactivación térmica

Para examinar la estabilidad a la temperatura y para determinar si es posible inactivar completamente VsEndA_S44E usando calor, se evaluó la integridad de un producto de PCR purificado en presencia de la enzima inactivada por calor. Esto proporcionó un ensayo más sensible en comparación con el ensayo de Kunitz modificado descrito en el Ejemplo 3, ya que puede probar si la inactivación es reversible tras la disminución en la temperatura, o irreversible.

Se transfirió enzima (VsEndA_S44E o no mutante, VsEndA, 130 U/l) en tampón Tris/HCI 25 mM a pH 8,5, NaCI 0,5 M, MgCI2 5 mM a tubos de Eppendorf en un volumen total de 50 l. Se añadió ditiotreitol (DTT) recién preparado a una concentración final de 1, 10 o 20 mM. Las muestras se inactivaron térmicamente durante 15, 30 o 60 minutos a diversas temperaturas. Los tubos se colocaron sobre hielo después de la etapa de inactivación.

Se realizó el ensayo para la determinación de actividad residual añadiendo 5 l de enzima inactivada por calor a 500 ng de un producto de PCR de 500 pb en un tampón que consistía en Tris/HCI 25 mM a pH 8,5, MgCI2 5 mM y NaCI 0,5 M. Las muestras se incubaron durante 3 horas a 37 ºC. Donde se añadió DTT a la preparación de enzima para la inactivación, también estuvo presente en el ensayo para actividad residual.

Finalmente, para determinar cualquier degradación del producto de PCR, se analizaron muestras en 1 % de gel de agarosa. Se trataron un control negativo (sin enzima) y un control positivo (que contenía 6 U de enzima wt) de la misma forma que en las reacciones anteriores.

La Figura 8 resume los experimentos de inactivación térmica de VsEndA_S44E mutante en comparación con la enzima VsEndA no mutante a 50 ºC, 40 ºC, 30 ºC y 25 ºC. El control negativo muestra el producto de PCR intacto, mientras que el control positivo ilustra el efecto de aproximadamente el 1 % de actividad residual. A 50 ºC, se encontró que la enzima VsEndA_S44E mutante estaba completamente inactivada después de 15 minutos en presencia de DTT 1 mM, mientras que la no mutante solo estaba parcialmente inactivada. A 40 ºC, DTT 1 mM fue capaz de inactivar parcialmente VsEndA_S44E mutante después de 15 minutos, en comparación con 10 mM requerido para inactivar parcialmente la enzima VsEndA. A 25 ºC, DTT a una concentración de 20 mM o menos no fue capaz de inactivar completamente la enzima VsEndA después de 60 minutos, mientras que 10 mM de DTT fue capaz de inactivar completamente VsEndA_S44E mutante después de 60 minutos, demostrando el efecto de la sustitución. La adición de al menos DTT 10 mM es necesaria para la inactivación completa de la enzima VsEndA_S44E mutante a 30 ºC. VsEndA_S44E mutante se ha abreviado "S44E" y VsEndA no mutante "wt" en las leyendas de las figuras.

En otro experimento de inactivación térmica, se comparó VsEndA_S44E mutante con la enzima no mutante VsEndA a 4 ºC, en presencia de tanto DTT como TCEP a una concentración de tanto 1 mM, 10 mM como 20 mM, usando los mismos controles descritos anteriormente. Como se muestra en la Figura 9, incluso a esta baja temperatura, la presencia de DTT 10 mM o TCEP fue capaz de inactivar completamente VsEndA_S44E mutante después de 6 horas. En comparación, incluso DTT 20 mM no fue capaz de inactivar la enzima no mutante VsEndA después de 18 horas de incubación. Se mostró que TCEP inactivaba completamente la enzima VsEndA a esta temperatura tanto después de 18 horas de incubación a una concentración de 10 mM o más como después de 6 horas de incubación a

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una concentración de 20 mM.

EJEMPLO 8 -Experimentos de inactivación térmica -Actividad residual en ausencia de TCEP

En este ejemplo, los presentes inventores determinaron las condiciones donde la inactivación de VsEndA_S44E todavía se observa después de la eliminación del aditivo de inactivación.

Este ejemplo se llevó a cabo de un modo similar al Ejemplo 7, excepto que se estudió el aditivo de inactivación TCEP, y, después de haber tenido lugar la inactivación, se eliminó TCEP por diálisis usando tubos de diálisis de PurA-Lyzer (Sigma). El tampón se intercambió una vez durante una diálisis de dos días. La determinación de la actividad residual se realizó usando un 1 % de gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 7.

Una selección de parámetros de inactivación óptimos determinados a partir de este estudio se presenta en la Tabla

5.

Parámetro

(i) (mM)

(ii) (ºC) (iii) (min) (iv) (ºC) (v) (días)

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50 60 TA 2

10

N/A N/A 37 1

10

N/A N/A TA 4

1

50 60 37

1

Tabla 5 -Parámetros requeridos para lograr la inactivación en VsEndA_S44E. Parámetro (i) -concentración del aditivo de inactivación TCEP añadido a la endonucleasa (mM), parámetro (ii) -la temperatura de inactivación a la que se calienta la endonucleasa (en presencia de aditivo de inactivación) (ºC), parámetro (iii) -el tiempo que se incuba la endonucleasa a la temperatura de inactivación (minutos), parámetro (iv) -la temperatura a la que se almacena la endonucleasa después de enfriarse desde la temperatura de inactivación (en presencia del aditivo de inactivación) (ºC o "TA" para temperatura ambiente) y parámetro (v) tiempo que se incuba la endonucleasa a la temperatura de almacenamiento (días). "N/A" para los parámetros (ii) y (iii) se aplica cuando VsEndA_S44E no se calienta a una temperatura de inactivación.

EJEMPLO 9 -Eliminación de ADN contaminante de una preparación de ADN polimerasa

Se probó la capacidad de VsEndA_S44E para eliminar ADN genómico bacteriano contaminante de ADN polimerasas comerciales en un tampón de polimerasa típico. Se trataron 0,14 U/l de Accustart (Quanta Biosciences), Tempase (VWR) o GoTaq (Promega) con 28 U/l de VsEndA_S44E durante 15 minutos a 37 ºC en un tampón que consistía en Tris-HCI 10 mM, KCI 111 mM, MgCI2 5,6 mM. Después de la incubación a 37 ºC durante 15 minutos, se añadió DTT a una concentración final de 10 mM y las muestras se incubaron a 40 ºC durante 30 minutos con el fin de inactivar VsEndA_S44E mutante. Finalmente se añadieron cebadores, sondas y dNTP, y la concentración final de los componentes en la mezcla de reacción de polimerasa fue: 25 mU/l de ADN polimerasa, 300 nM de cada cebador, sonda 200 nM, dATP 100 M, dCTP, dGTP y dUTP 200 M en un tampón compuesto de Tris-HCI 10 mM, KCI 20 mM, MgCI2 5 mM.

Se incluyeron los siguientes controles: a) muestras que contienen tampón en lugar de VsEndA_S44E, b) muestras que contienen tampón y ADN genómico de E. coli, c) muestras donde se añadió ADN genómico de E. coli antes de la inactivación de VsEndA_S44E, y d) muestras donde se añadió ADN genómico de E. coli después de la inactivación de VsEndA_S44E. Se realizó qPCR en reacciones de 20 l en Stratagene Mx3500P (Agilent Technologies) y las condiciones de ciclado térmico fueron como se recomendó por los fabricantes de las ADN polimerasas.

VsEndA_S44E fue capaz de eliminar ADN genómico bacteriano contaminante de todas las polimerasas probadas. La Figura 10 ilustra el efecto del tratamiento con VsEndA_S44E de polimerasas Accustart y GoTaq. VsEndA_S44E mutante se ha abreviado "S44E" en las leyendas de las figuras. Se redujo el nivel de ADN contaminante bacteriano y se eliminó ADN genómico de E. coli enriquecido. No hay alteración o alteración mínima de la función de polimerasa después del tratamiento con VsEndA_S44E.

EJEMPLO 10 -Eliminación de ADN contaminante de una mezcla madre de PCR

Se ha mostrado que mezclas madres de PCR cuantitativa (qPCR) comerciales contienen cantidades traza de ADN genómico bacteriano contaminante. En este ejemplo se probó la capacidad de VsEndA_S44E para eliminar contaminantes de ADN genómico bacteriano de mezclas madres de qPCR comerciales. Se trató mezcla madre de qPCR Maxima (Fermentas) o Express qPCR Supermix Universal (Invitrogen) con 25 U/l de VsEndA_S44E durante 15 minutos a 37 ºC. Se inactivó S44E_End I añadiendo DTT 10 mM (1-4 ditiotreitol) e incubando a 40 ºC durante 30 minutos. Para probar el efecto del tratamiento con VsEndA_S44E sobre la eliminación de ADN contaminante de la polimerasa, se analizó una muestra tratada con S44E_End I junto con los siguientes controles: a) muestras que

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