ES2622980T3 - Fluoro-9-metil-beta-carbonilo - Google Patents

Abstract

Los compuestos de fórmula general (I)**Fórmula** donde R1 es -F y R2 es -H o -F, o R1 es -H y R2 es -F; así como sales farmacológicamente aceptables, solvatos e hidratos de los compuestos antes mencionados.

Description

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Fluoro-9-metil-beta-carbonilo

Descripcion

[0001] La presente invention se refiere a fluoro-9-metilo-p-carbonilo, cuya production as! como utilization farmaceutica y composiciones farmaceuticas contienen fluoro-9-metilo-beta-carbolina.

[0002] Los compuestos de la invencion se utilizan para tratar enfermedades agudas y cronicas del oldo y de perdida de la audition, trastornos de vertigo y de equilibrio, en particular de perdida aguda de la audition, traumatismo por ruido, trauma por explosion, tinnitus, perdida de la audicion debido a la exposition cronica al ruido, presbiacusia, trauma durante la implantation de las protesis del oldo interno (trauma de insertion) , mareo debido a trastornos en la zona del oldo interno, mareos relacionada y/o como slntoma de la enfermedad de Meniere, perdida de equilibrio relacionada y/o como slntoma de la enfermedad de Meniere y deterioro de la audicion causado por antibioticos y citostaticos.

[0003] De acuerdo con estudios realizados por la Organization Mundial de la Salud (OMS), aproximadamente 250 millones de personas en todo el mundo sufren de trastornos ligeros o graves del oldo. En los EE.UU., entre 30 y 40 millones de personas experimentan trastornos de audicion y perdidas auditivas. Solo en EE.UU. el costo de los tratamientos es de aproximadamente 50 mil millones de dolares al ano. La asociacion alemana para personas con discapacidad auditiva informo en 2007 que alrededor del 19% de la poblacion alemana sufre mas de 14 anos de trastornos de la audicion.

[0004] Con la edad, aumenta el porcentaje en personas con discapacidad auditiva. En este momento, los trastornos de la audicion son la cuarta discapacidad flsica cronica mas comun en personas de mas de 65 anos, despues de las enfermedades de los huesos y las articulaciones, presion arterial alta y enfermedades del corazon. En las personas de entre 60 y 69 anos son el 37%, y en las de los 70 y mas anos son el 54 % de la poblacion que sufre de perdidas de audicion. En la Republica Federal de Alemania cerca de 12-15 millones de pacientes sufren de perdidas de audicion y alrededor de 2,9 millones de pacientes sufren de tinnitus.

[0005] El termino "tinnitus aurium", o simplemente tinnitus se refiere a un slntoma o slndrome en el que la persona percibe ruido persistente o recurrente, pudiendose distinguir dos formas de tinnitus. En el "tinnitus objetivo" relativamente poco comun, los sonidos percibidos por los pacientes se perciben o al menos se miden desde el exterior. Se basan generalmente en la fuente de sonido de un cuerpo, tal como en un vaso sangulneo que pasa cerca del oldo interno. En el "tinnitus subjetivo" significativamente mas frecuente, los fenomenos acusticos no se basan, sin embargo, en una fuente externa para otros. Asl, el "tinnitus subjetivo" es una perception acustica, que se percibe de forma independiente de un sonido que actua sobre el oldo del paciente. Las razones de esta percepcion pueden ser diversas y se deben en parte a un fallo de la funcion acustica del oldo interno. Sin embargo, hay que distinguir el tinnitus significativamente de las alucinaciones auditivas. La naturaleza del ruido aparente, que percibe el paciente de tinnitus es muy diversa. Se puede resumir, entre otras, las siguientes impresiones acusticas del termino tinnitus:

- Ruido de zumbido o pitido

- Silbido

- Susurro

- Crujido o golpe

[0006] El sonido puede ser constante en su intensidad, pero tambien puede tener un caracter rltmico y pulsante.

[0007] El oldo esta estructurado del siguiente modo. Del pabellon auricular, el conducto auditivo externo conduce al interior del oldo. El conducto auditivo externo termina en el timpano. Esta parte del oido se llama el oido externo. Detras del oido externo se encuentra un espacio, el oido medio, tambien llamado el timpano, que esta conectado a la trompa de eustaquio y por tanto tambien con la nasofaringe. El oido medio se completa en un lado de la membrana del timpano y en el lado opuesto a traves de la ventana oval y la ventana redonda. Detras de las dos ventanas se cierra el espacio conocido como oido interno. El oido interno alberga varios organos, como el organo de equilibrio (vestibular), y el denominado caracol (coclea) para la percepcion acustica. Esto a su vez contiene el organo de Corti como un portador de las celulas de sensor (celulas ciliadas) en el oido interno.

[0008] La membrana de la ventana redonda forma una barrera biologica para el espacio del oido interno y representa el mayor obstaculo para el tratamiento local de lesiones y enfermedades del oido interno. El principio activo administrado debe superar esta membrana para alcanzar el espacio del oldo interno. Pero el medicamento no puede aplicarse a traves de la membrana de modo mecanico-automatizado, ya que de otro modo la membrana se dana por esta manipulation. Sin embargo, puede aplicarse quirurgicamente y localmente (por ejemplo, por inyeccion a traves de la membrana timpanica) a la membrana de ventana redonda y luego penetrar en la membrana de la ventana redonda. Por lo tanto, la sustancia activa pasa al espacio de oldo interno lleno de perilinfa que esta formado por los compartimentos interconectados de la coclea, a saber, la rampa timpanica y la rampa vestibular. En un compartimento separado por membranas entre la rampa timpanica y la rampa vestibular, tambien denominado Scala

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media (tambien conducto coclear), se encuentran las celulas sensoriales del oldo (celulas ciliadas exterior e interior) rodeadas por endolinfas. Estas, junto con las celulas circundantes de apoyo, se denominan el organo de Corti. Las celulas ciliadas se danan con perdida auditiva por todas las causas (edad, medicamentos como ciertos antibioticos y citostaticos) y sobre todo por el tinnitus. En de las membranas, que separan la escala media del espacio perilinfatico, los agentes tambien pueden entrar en la endolinfa o bien directamente en las celulas de pelo. Dado que tanto los compartimentos perilinfaticos como los endolinfaticos de la coclea se conectan con el sistema vestibular, los agentes pueden acceder desde la coclea a las celulas sensoriales del aparato vestibular.

[0009] La solicitud de patente alemana (DE 10 2007 009 264 A1) describe 9-alquilo-p-carbolina, la cual se puede aplicar debido a su accion neuroprotectora a la terapia y/o profilaxis de trastornos del movimiento y/o enfermedades neurologicas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

[0010] Von Hamann et al. (J. Hamann et al;. Neurochem Internat. 2008, 52, 688-700) manifesto un efecto neuroprotector de la p-carbolina 9-metilo-p-carbolina en cultivos celulares primarios de neuronas mesencefalicas. El aumento de la supervivencia de las neuronas mostrado all! por 9-metilo-p-carbolina no se debla a una proliferacion elevada. Por el contrario, la administracion de 9-metilo-p-carbolina llevo a la inhibicion de la proliferacion y el aumento de la diferenciacion de las neuronas. Este efecto de la 9-metilo-beta-carbolina se confirmo en celulas de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). Junto con la diferenciacion promovida, se detecto un aumento de la expresion de factores neurotroficos tales como hedgehog sonica, Wnt1 y Wnt5a. Ademas, en las celulas primarias de neuronas mesencefalicas se manifesto un aumento inducido por 9-metilo-p-carbolina en el numero de neuronas dopaminergicas. Por lo tanto, se promete un beneficio terapeutico de 9-metilo-p-carbolina en el tratamiento de Parkinson.

[0011] La solicitud de patente de EE.UU. (US 2004/038970 A1) describe el uso de p-carbolinas como un ingrediente activo para el tratamiento de una variedad de indicaciones medicas, incluyendo tinnitus, en el que se menciona, no obstante, un grupo de p-carbolinas estructuralmente fuerte de 9-alquilo-p-carbolinas y por lo tanto tambien de 6- y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolinas.

[0012] La solicitud de patente internacional (WO 2011/079841) describe p-carbolinas, en particular 9 alquilo-p- carbolina y su uso para el tratamiento de enfermedades o lesiones del oldo interno. Se pudo demostrar que la aplicacion de 9-alquilo-p-carbolina promueve la diferenciacion neuronal de celulas de neuroblastoma humano (SH- SY5Y) y la expresion de factores neurotroficos con propiedades neuroprotectoras. Esto se confirmo en cultivos de celulas de preparaciones cocleares de rata. Ademas, se demostro en cobayas que 9-metilo-p-carbolina puede difundirse en el espacio perilinfatico del oldo interno tras la aplicacion local interior a la ventana redonda del oldo interno y provoca un aumento en la actividad electrofisiologica de las celulas ciliadas del organo de Corti.

[0013] La presente invencion tiene por objeto proporcionar un ingrediente activo, y formulaciones farmaceuticas que se pueden utilizar para la profilaxis y tratamiento de la perdida de audicion, la presbiacusia, mareos y trastornos del equilibrio, as! como la mejora del aprendizaje y la memoria y aportan una ventaja a la tecnica anterior.

[0014] Este objetivo se consigue mediante la ensenanza tecnica de las reivindicaciones independientes. Otras formas ventajosas de realizacion, aspectos y detalles de la invencion resultan de las reivindicaciones dependientes, la descripcion y los ejemplos.

Fluor-9-metilo-beta-carbolina

[0015] Sorprendentemente, se ha encontrado que fluoro-9-metilo-beta-carbolina de acuerdo con la invencion de la formula general (I) en comparacion con los compuestos de la tecnica anterior (por ejemplo, p-carbolina 9-metilen) tiene una efectividad aumentada en el tratamiento de enfermedades del oldo interno. Ofrecen la opcion de aplicarse en dosis mas bajas en toxicidad reducida, lo que representa una mejora terapeutica significativa sobre la tecnica anterior. Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que 6- y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina segun la invencion promueve caracterlsticas especiales del estado de la tecnica, promoviendose una aplicacion terapeutica. Por lo tanto, para 6 y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina segun la invencion se podrla detectar una mayor eficacia en comparacion con 9-metilo-p-carbolina en la promocion de la diferenciacion en celulas de neuroblastoma humanas. Tambien manifiestan 6 y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9-metilo-p-carbolina un aumento significativo en lipofilia, lo cual se asocia con un aumento de la permeabilidad de la membrana. Esto tiene implicaciones de largo alcance para el uso terapeutico del compuesto novedoso para el tratamiento de enfermedades o danos en el oldo interno o para mejorar la memoria y aumentar la capacidad de aprender. Como ya se ha descrito membranas biologicas tales como la membrana timpanica, la membrana de la ventana redonda y las membranas de la escala media (Membrana tectoriana y de membrana de Reissner) forman una barrera natural para una sustancia activa en la forma de las celulas pilosas del oldo interno. Esto es especialmente cierto en la aplicacion topica de un ingrediente activo en el timpano o ventana redonda. Por lo tanto la disponibilidad del ingrediente activo se incrementa a las celulas diana a traves de aumento de la permeabilidad de la membrana. Ademas de la permeabilidad de la membrana, la degradacion de una sustancia activa en el cuerpo tiene un papel crucial en su eficacia, especialmente en la administracion sistemica, y tambien para los posibles efectos secundarios. Mientras que 9-metilo-p-carbolina se degrada a traves de una hidroxilacion en la posicion 6 y reaccion de conjugacion

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posterior, esta via metabolica se bloquea en 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina por el grupo de fluoruro. De este modo, la vida media de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina no solo se incrementa, sino que tambien se reduce el riesgo de la formacion de productos de degradacion potencialmente toxicos. Debido a la eficacia incrementada de 6- y/o 7-fluoro- 9-metilo-p-carbolina parece posible una dosis reducida en comparacion con otras 9-alquilo-p-carbolinas en la terapia. Esto es solo para el tratamiento a largo plazo de las enfermedades cronicas de enorme importancia, ya que esto reduce la presion sobre el cuerpo y tambien los efectos secundarios no deseados se pueden reducir. Por lo tanto, la presente solicitud se trata de una invencion de seleccion.

[0016] Con el termino "6 y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina" se entiende por una operacion "o", o bien el compuesto 6- fluoro-9-metilo-p-carbolina o bien el compuesto 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y por una operacion "y" los compuestos 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0017] La presente invencion comprende compuestos de la formula general (I), p.ej., fluoro-9-metilo-beta-carbolinas de la formula general (I):

donde R1 donde R1

= -F y R2 es -H = H y R2 = -F;

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o -F, o

as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos, y compuestos complejos de los compuestos antes mencionados.

[0018] La presente invencion tambien se refiere a compuestos de formula general (I) o fluoro-9-metilo-p-carbolina de formula general (I):

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donde R1 y R2 son -F o -H independientes el uno del otro, y donde al menos uno de los dos radicales R1 o R2 es = -F;

as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos, y compuestos complejos de los compuestos de comparacion mencionados.

[0019] La presente invencion tambien se refiere a compuestos de la formula general (I) o fluoro-9-metilo-p-carbolina de formula general (I):

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donde R1 y R2 son -F o -H independientes el uno del otro, y donde por lo menos uno de los dos radicales R1 o R2 no es -H;

as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos, y profarmacos y complejos de los compuestos antes mencionados.

Es preferido cuando R1 = -F y R2 = -H, o cuando R1 = H y R2 = -F.

[0020] El termino profarmaco empleado en este documento se define como una sustancia farmacologica que se administra en una forma inactiva o menos activa. Despues de la administracion, se convierte en el cuerpo del paciente en su forma activa y eficaz, tal como fluoro-9-metilo-p-carbolina de formula general (I).

[0021] Como acidos posibles que forman una sal de adicion de acido con el compuesto de la presente invencion, se pueden mencionar los siguientes: acido sulfurico, acido sulfonico, acido fosforico, acido nltrico, acido nitroso, acido perclorico, acido bromhldrico, acido clorhldrico, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido succlnico, acido oxalico, acido gluconico (glicon, acido dextronico), acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido tartronico (acido hidroximalonico, acido hidroxipropanoico), acido fumarico, acido cltrico, acido ascorbico, acido maleico, acido malonico, acido hidroximaleico, acido piruvico, acido fenilacetico, (o-, m-, p-) acido toluico, acido benzoico, acido p- aminobenzoico, acido p-hidroxibenzoico, acido salicllico, acido p-aminosalicllico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido hidroxietanosulfonico, acido etilenosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfonico de naftilamina, acido sulfanllico, acido sulfonico, acido qulnico (acido qulnico), acido o-metilo- mandelico, acido hidrogenbencensulfonico, acido plcrico (2,4,6-trinitrofenol), acido adlpico, acido d-o-toliltartarico, aminoacidos tales como metionina, triptofano, arginina, y en particular aminoacidos, acidos tales como acido glutamico o acido aspartico. Ademas, son posibles las formas de betalna.

[0022] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar el compuesto de la formula general (I) (o un atomo de fluor-9-metilo-p-carbolina de la formula general (l)), que comprende las pasos de:

a) reaccion del compuesto de partida de formula general (II) (o un clorhidrato fluoro-1-metiltriptamina de la formula general (II)) con la adicion de acido de hidrato glioxllico de formula (III) y de una base a una union de la formula general (IV)

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b) descarboxilacion del compuesto de formula general (IV) mediante la adicion de un acido, y bajo calentamiento a un compuesto de Formula general (V) (p.ej., a fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula general (V))

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c) aromatizacion del compuesto de formula general (V) (es decir, de fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula general (V)) (para dar un compuesto de la formula general I) (p.ej., un fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula general (I)) con la adicion de un catalizador;

en la que

R1 = es -F y R2 = -H o -F, o R1 = H y R2 = -F.

[0023] Se entiende que la representacion de los radicales R1 y R2 como se indica anteriormente, sirve para un proceso en particular para la preparacion de un compuesto de la invencion no solo para el producto de salida de la slntesis correspondiente, sino tambien para los productos intermedios obtenidos del mismo, as! como para el producto final ultimo de la slntesis.

[0024] Otro aspecto de la presente invencion se refiere por tanto a un procedimiento para la preparacion del compuesto de la invencion de la formula general (I) (p.ej., un fluoro-9-metilo-p-carbolina de formula general (I)) que contiene las siguientes pasos:

a) reaccion del compuesto de partida de formula general (II) (p.ej., fluoro-1-metiltriptamina-clorhidrato de la formula general (II)) con la adicion de acido de hidrato glioxllico de la formula (III) y de una base a un compuesto de la formula general (IV)

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b) descarboxilacion del compuesto de formula general (IV) mediante la adicion de un acido y con calentamiento a un compuesto de la formula general (V) (p.ej., un fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula general (V))

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c) la aromatizacion del compuesto de formula general (V) (p.ej. fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula general (V)) a un compuesto de la formula general (I) (p.ej. fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula general (I)) con la adicion de un catalizador;

donde R1 = -F y R2 = -H o -F y esto sirve del mismo modo para los compuestos de formula general (I), (II), (IV) y (V),

o donde R1 = H y R2 = -F y esto sirve para los compuestos de formula general (I), (II), (IV) y (V).

[0025] Los fluoro-1-metiltriptaminclorhidratos estan disponibles comercialmente como productos de salida (vease a abajo). En una realizacion preferida de la invencion mediante la adicion de la base en el paso a), se alcanza un valor de pH de entre 2 y 6, preferiblemente un valor de pH de entre 3 y 5 y preferiblemente particularmente un valor de pH de 4. En una realizacion preferida adicional, la cristalizacion del compuesto IV en un paso a)' se promueve por la incubacion en agua con hielo.

[0026] En una realizacion preferida adicional, la reaccion en el paso b) bajo un gas inerte, es especialmente preferible en N2. Ademas, preferiblemente, la cristalizacion del producto de reaccion del paso b) mediante un paso b)' de incubacion en frlo, es particular preferiblemente para promover entre 0°C y 5°C durante varias horas. En una realizacion preferida adicional, la recristalizacion se lleva a cabo a partir de metanol para la purificacion del producto de reaccion del paso b) despues de la cristalizacion. Ademas, es preferible disolver primero fluor-9-metilo-2,3,4,9- tetrahidro-p-carbolina (o el compuesto de formula general (V)) en el paso c) en agua y anadir una base, por ejemplo hidroxido de sodio o carbonato de sodio, a un pH basico, mas preferiblemente un valor de pH entre pH 11 y pH 14, especialmente preferible pH. 13

[0027] En una forma de realizacion preferida, Pd / C, Pt / C, PdCl2, Pd / sepiolita, Pd / SiO2 y Pd / AlO4 son posibles como catalizador de aromatizacion oxidativa en el paso c. Para expertos en la tecnica, se conocen tambien aditivos adicionales que permiten la aromatizacion oxidativa. Sin embargo, se emplea preferiblemente Pd / C (Paladium on carbon, paladio sobre carbono activado) como catalizador.

[0028] Con la adicion de una base en el paso a) y el paso c) puede tratarse independientemente el uno del otro de bases organicas o inorganicas tales como NaOH, KOH, NH4OH, hidroxido de tetraalquilamonio, lisina o arginina. Expertos en la tecnica saben las bases que son adecuadas para realizar la reaccion. Sin embargo, se prefieren KOH y NaOH.

[0029] Con la adicion de un acido en el paso b) puede tratarse de acidos inorganicos y organicos tales como acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido acetico, acido cltrico, acido oxalico, acido malico, acido salicllico, acido p-aminosalicllico, acido malonico, acido fumarico, acido succlnico , acido ascorbico, acido maleico, acido sulfonico, acido fosfonico, acido perclorico, acido nltrico, acido formico, acido propionico, acido gluconico, acido lactico, acido tartarico, acido piruvico, acido fenilacetico, acido benzoico, acido hidroximaleico, acido p-aminobenzoico, acido p-hidroxibenzoico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido nitroso, acido hidroxietanosulfonico, acido etilensulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfanllico, acido canforsulfonico, acido qulnico, acido mandelico, acido o-metilmandelico, acido hidrogenbenzolsulfonico, acido plcrico, acido adlpico, acido d-o-toliltartarico, acido tartronico, acido a-toluico, (o-, m-, p-) acido toluico, acto sulfonico de naftilamina. El experto en la tecnica es consciente de que el acido en este caso es adecuado para llevar a cabo la reaccion. Sin embargo, se prefiere acido clorhldrico.

[0030] De acuerdo con otras formas de realizacion, la presente invencion esta dirigida a fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula general (I)

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donde R1 = -F y R2 = -F, aun mas preferiblemente donde R1 = -H y R2 = -F, y mas preferiblemente donde R1 = -F y R2 = -H.

6-fluoro-9-metilo-B-carbolina (6F9MBC)

[0031] De acuerdo con una forma de realizacion particularmente preferida, la presente invencion comprende p- carbolina 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, cuya preparation y cuyo uso medico y compuesto farmaceutico contienen 6- fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0032] El compuesto de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina se abrevia en la presente memoria a "6F9MpC" o "AC102". 9- metilo-p-carbolina de la tecnica anterior, sin embargo, se abrevia en lo sucesivo tambien a "9MpC" o "AC002".

[0033] El compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina no se describe de modo individual, es decir, concreto, en el estado de la tecnica. Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que 6-fluoro-9-metilo-p- carbolina segun la invencion promueve el uso terapeutico a traves de propiedades particulares de la tecnica anterior. De este modo, para 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de acuerdo con la invencion, se pudo detectar mayor eficacia en comparacion con 9-metilo-p-carbolina en la promotion de la diferenciacion neuronal en celulas de neuroblastoma humano (vease el Ejemplo 2). Ademas, 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9-metilo-p-carbolina muestra lipofilia significativamente aumentada, lo cual se asocia con un aumento de la permeabilidad de la membrana. Esto tiene implicaciones de gran alcance para el uso terapeutico del compuesto novedoso para el tratamiento de enfermedades o danos en el oldo interno. Como ya se ha descrito, membranas biologicas tales como la membrana timpanica, la membrana de la ventana redonda y las membranas de la escala media (Membrana tectoriana y membrana de Reissner) forman una barrera natural para una sustancia activa en la forma de las celulas pilosas del oldo interno. Esto es especialmente cierto en la aplicacion topica de un ingrediente activo en el timpano o ventana redonda. Por lo tanto la disponibilidad del ingrediente activo se incrementa a las celulas diana a traves del aumento de la permeabilidad de la membrana. Ademas de la permeabilidad de la membrana, la degradation de un farmaco en el cuerpo tambien tiene un papel vital en su eficacia, especialmente cuando se administra por via sistemica, y tambien para los posibles efectos secundarios. Mientras que 9-metilo-p-carbolina se degrada a traves de una hidroxilacion en la position 6 y con una reaction de conjugation posterior, se bloquea esta via metabolica en 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina por el grupo de fluoruro. De este modo, se pudo no solo incrementar la vida media de 6- fluoro-9-metilo-p-carbolina, sino tambien reducir el riesgo de la formation de productos de degradacion potencialmente toxicos. Debido a la mayor eficacia de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina parece posible una dosis mas reducida en comparacion con otra 9-alquilo-p-carbolina en la terapia. Esto de enorme importancia solo para el tratamiento a largo plazo de las enfermedades cronicas, ya que se puede reducir la presion sobre el cuerpo y tambien los efectos secundarios no deseados.

[0034] La presente invencion se refiere al compuesto 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula (la)

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as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos, y compuestos complejos del compuesto mencionado.

[0035] Tal como se utiliza aqul, el termino profarmaco se define como una sustancia farmacologica que se administra en una forma inactiva o menos activa. Despues de la administration, se convierte en el cuerpo del paciente en su forma activa y eficaz, en el caso anterior la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0036] Como acidos posibles, los cuales forman una sal de adicion de acido con el compuesto de la invencion 6- fluoro-9-metilo-®-carbolina, se pueden mencionar los siguientes: acido sulfurico, acido sulfonico, acido fosforico, acido nltrico, acido nitroso, acido perclorico, acido bromhldrico, acido clorhldrico, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido succlnico, acido oxalico, acido gluconico (glicon., acido dextronico), acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido tartronico (acido hidroximalonico, acido hidroxipropanoico), acido fumarico, acido cltrico, acido ascorbico, acido maleico, acido malonico, acido hidroximaleico, acido piruvico, acido fenilacetico, (o-, m-, p-) acido toluico, acido benzoico, acido acido p-aminobenzoico, acido p-hidroxibenzoico, acido salicllico, acido p- aminosalicllico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido hidroxietanosulfonico, acido etilenosulfonico,

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acido p-toluenosulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfonico, acido, acido canforsulfonico, acido qulnico (acido qulnico), acido o-metilo-mandelico, acido hidrogenbencensulfonico, acido plcrico (2,4,6-trinitrofenol), acido adlpico, acido do-toliltartarico, aminoacidos tales como metionina, triptofano, arginina y aminoacidos especialmente acidos tales como acido glutamico o acido aspartico. Ademas, son posibles las formas de betalna.

[0037] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion del compuesto segun la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, que comprende las pasos de:

a) reaccion del compuesto de salida 5-fluoro-1-metiltriptamina-clorhidrato de formula (Ila) con la adicion de acido de hidrato glioxllico de formula (Ill) y una base al compuesto de formula (IVa)

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b) descarboxilacion del compuesto de formula (IVa) con la adicion de un acido y con calentamiento para dar 6- fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de formula (Va)

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c) aromatizacion de 6-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (Va) para dar 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la) con la adicion de un catalizador.

[0038] El material de partida 5-fluoro-1-metiltriptaminclorhidrato esta comercialmente disponible, por ejemplo a traves de AKos GmbH (piedras). En una forma de realizacion preferida de la invencion se logra mediante la adicion de la base en el paso a) un valor de pH de entre 2 y 6, preferiblemente un valor de pH de entre 3 y 5 y especialmente preferiblemente un valor de pH de 4. En una forma de realizacion preferida adicional, la cristalizacion del compuesto IVa se consigue en el paso a)' mediante la incubacion en agua con hielo.

[0039] En una realizacion preferida adicional, se logra la reaccion en el paso b) bajo una atmosfera inerte, con especial preferencia en atmosfera de N2. Ademas, preferiblemente, se promueve la cristalizacion del producto de reaccion del paso b) mediante un paso b)' de incubacion en frlo, especialmente preferiblemente entre 0°C y 5°C durante varias horas. En una realizacion preferida adicional, la recristalizacion se lleva a cabo a partir de metanol para la purificacion del producto de reaccion del paso b) despues de la cristalizacion. Ademas, preferiblemente, la 6- fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina se disuelve inicialmente en agua y alcalina en el paso c mediante la adicion de una base tal como hidroxido de sodio o carbonato de sodio, a un valor de pH basico, mas preferiblemente un valor de pH de entre pH 11 y pH 14, especialmente preferiblemente pH. 13

[0040] En una realizacion preferida, entre otros Pd/C, Pt/C, PdCl2, Pd/sepiolita, Pd/SiO2 y Pd/AlO4 son posibles como catalizador de aromatizacion oxidativa en el paso c. Expertos en la tecnica conoceran tambien aditivos

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adicionales que permiten la aromatizacion oxidativa. Sin embargo, Pd/C (paladio sobre carbono, paladio sobre carbono activado) se usa preferiblemente como catalizador.

[0041] Con la adicion de una base en el paso a) y el paso c) puede tratarse de forma independiente de bases organicas o inorganicas tales como NaOH, KOH, NH4OH, hidroxido de tetraalquilamonio, lisina o arginina. El experto en la tecnica conoce que las bases que son adecuadas para realizar la reaccion. Sin embargo, se prefieren KOH y NaOH.

[0042] Con la adicion de un acido en el paso b) puede tratarse de acidos inorganicos y organicos tales como acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido acetico, acido cltrico, acido oxalico, acido malico, acido salicllico, acido p-aminosalicllico, acido malonico, acido fumarico, acido succlnico, acido ascorbico, acido maleico, acido sulfonico, acido fosfonico, acido perclorico, acido nltrico, acido formico, acido propionico, acido gluconico, acido lactico, acido tartarico, acido hidroximaleico, acido piruvico, acido fenilacetico, acido benzoico, p- aminoacido benzoico, acido p-hidroxibenceno, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido nitroso, acido hidroxietanosulfonico, acido etilenosulfonico, acido p-toluolsulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfanllico, acido canforsulfonico, acido qulnico, acido mandelico, acido o-metilmandelico, acido hidrogenbencenosulfonico, Acido plcrico, acido adlpico, acido d-o-toliltartarico, acido tartronico, a-acido toluico, (o-, m-, p-) acido toluico, acido naftilaminasulfonico. El experto en la tecnica es consciente de que el acido es adecuado para la realizacion de la reaccion. Sin embargo, se prefiere acido clorhldrico.

[0043] Se ha encontrado sorprendentemente que el compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la) tiene en comparacion con p-Carbolina ya conocida y probada tales como 9-metilo-p-carbolina un eficacia aumentada en el tratamiento de enfermedades del oldo interno. Esto se reflejo tanto en los estudios sobre la expresion genica inducida por farmacos de los factores celulares importantes (vease el Ejemplo 4), que son de importancia para la regeneracion celular (especialmente en el oldo interno) despues de traumas como en examenes histologicos (vease el Ejemplo 6) y fisiologicos (vease el ejemplo 7) para la regeneracion del sistema auditivo despues de un trauma acustico exito. Ademas, varios experimentos muestran un aumento de la lipofilia significativa (vease el Ejemplo 3) del compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la). En comparacion con la misma sustancia 9-metilo-p- carbolina existen las siguientes ventajas:

1. Se aumenta la permeabilidad de la membrana.

2. La eliminacion se hace mas lenta (tiempo de vida media de elimination de 6F9MpC circa 1,75 veces mayor que para 9MpC).

3. Al conocerse que p-carbolinas se degradan por la hidroxilacion en la position 6 y reaccion de conjugacion posterior, mediante el bloqueo de esta via de metabolizacion por el grupo de fluorescencia en la posicion 6:

- la biodisponibilidad tras la administracion oral se mejora.

- se minimiza el riesgo de metabolitos toxicos o metabolitos potencialmente alergenicos.

4. Otra via metabolica conocida de p-carbolinas, que genera productos de degradacion demasiado toxicos di- metilados, procede a traves de la N-metilacion secuencial in vivo, en la que primero el atomo de nitrogeno esta metilado en la posicion 2, y despues el atomo de nitrogeno en la posicion 9. En los experimentos actuales, se demostro que el 6F9MpC, afortunadamente, no genera productos toxicos di-metilados (vease el Ejemplo 8), por lo que se reduce aun mas riesgo de metabolitos toxicos.

5. Eficacia mejorada en la expresion genica inducida por farmacos de los factores celulares importantes (vease el Ejemplo 4), que son de importancia para la regeneracion celular (especialmente en el oldo interno) despues de traumas, as! como en investigaciones histologicas (vease el Ejemplo 6) y fisiologicas (vease el ejemplo 7) para la regeneracion del sistema auditivo despues del logro de un trauma acustico.

7-fluoro-9-metilo-B-carbolina (7F9MBC)

[0044] Segun una realizacion adicional, la presente invencion comprende p-carbolina 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, cuya preparacion y cuyo uso medico y composiciones farmaceuticas incluyen 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0045] El compuesto de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina se abrevia en el presente documento en ocasiones tambien a "7F9MpC".

[0046] La presente invencion se refiere a un compuesto de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula (Ib)

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as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos, y profarmacos y complejos del compuesto antes mencionado.

[0047] El termino profarmaco que se utiliza en el presente documento se define, como ya se ha explicado, como una sustancia farmacologica que se administra en una forma inactiva o menos activa. Despues de la administracion, se convierte en el cuerpo del paciente en su forma activa, eficaz, en el caso anterior, el 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0048] Como posibles acidos, que forman una sal de adicion de acido con el compuesto de la invencion 7-fluoro-9- metilo-p-carbolina, se puede mencionar los siguientes: acido sulfurico, acido sulfonico, acido fosforico, acido nltrico, acido nitroso, acido perclorico, acido bromhldrico, acido clorhldrico, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido succlnico, acido oxalico, acido gluconico (Glycon., dextronico), acido lactico, acido malico, acido tartarico, acido tartronico (acido hidroximalonico, acido hidroxipropanoico), acido fumarico, acido cltrico, acido ascorbico, acido maleico, acido malonico, acido hidroximaleico, acido piruvico, acido fenilacetico, (o-, m-, p-) del acido toluico, acido benzoico, acido p-aminobenzoico, acido p-hidroxibenzoico, acido salicllico, acido p-aminosalicllico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido hidroxietanosulfonico, acido etilenosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfonico naftilamina, acido sulfanllico, acido canforsulfonico, acido qulnico (acido qulnico), acido o-metilo-mandelico, acido hidrogenbencenosulfonico, acido picrlnico (2,4,6-trinitrofenol), acido adlpico, acido do-toliltartarico, aminoacidos tales como metionina, triptofano, arginina, y en particular los aminoacidos tales como acido glutamico o acido aspartico. Ademas, formas de betalna son posibles.

[0049] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar el compuesto de la invencion 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, que comprende los siguientes pasos:

a) La reaccion del compuesto de partida 6-fluoro-1-metiltriptamina-clorhidrato de la formula (IIb) con la adicion de

hidrato de acido glioxllico de formula (III) y una base al compuesto de formula (IVb)

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b) Descarboxilacion del compuesto de la formula (IVb) con la adicion de un acido y bajo calentamiento para dar 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula (Vb)

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c) aromatizacion de 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (Vb) para dar 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina (Ib) bajo adicion de un catalizador.

[0050] El material de partida es 6-fluoro-1-metiltriptaminclorhidrato disponible comercialmente, por ejemplo a traves de la Otavachemicals Ltd. (Vaughan, Canada). En una forma de realization preferida de la invention se alcanza mediante la adicion de la base en el paso a) un pH de entre 2 y 6, preferiblemente entre 3 y 5 y especialmente preferiblemente un valor de pH de 4. En una forma de realizacion preferida adicional, la cristalizacion del compuesto IVb en un paso a)' promueve la incubation en agua con hielo.

[0051] En una forma de realizacion preferida adicional, la reaction en el paso b) se realiza en una atmosfera inerte, con especial preferencia en atmosfera de N2. Ademas, es preferible promover la cristalizacion del producto de reaccion del paso b) por un paso b)' de incubacion en el frlo, en particular preferiblemente para promover entre 0°C y 5°C durante varias horas. En una forma de realizacion preferida adicional, la purification del producto de reaccion del paso b) despues de la cristalizacion realiza una recristalizacion a partir de metanol. Ademas, se prefiere disolver 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina en el paso c primero en agua y mediante la adicion de una base, tal como hidroxido de sodio o carbonato de sodio, ajustar el pH a un valor basico, mas preferiblemente un valor de pH de entre pH 11 y pH 14, con especial preferencia pH 13.

[0052] En una forma de realizacion preferida,) como catalizador de aromatizacion oxidativa en el paso c son posibles entre otros Pd/C, Pt/C, PdCl2, Pd/sepiolita, Pd/SiO2 y Pd/AlO4. Expertos en la tecnica conoceran tambien aditivos adicionales que permiten la aromatizacion oxidativa. Sin embargo, se prefiere Pd/C (Palladium on carbon, paladio sobre carbon activado) como catalizador.

[0053] Con la adicion de una base en el paso a) y el paso c) puede tratarse de modo independiente de bases organicas o inorganicas tales como NaOH, KOH, NH4OH, tetraalquilamonio hidroxido, lisina o arginina. El experto en la tecnica sabe las bases que son adecuadas para realizar la reaccion. Sin embargo, se prefieren KOH y NaOH.

[0054] Con la adicion de un acido en el paso b) puede tratarse de acidos inorganicos y organicos tales como acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido acetico, acido cltrico, acido oxalico, acido malico, acido salicllico, acido p-aminosalicllico, acido malonico, acido fumarico, acido succlnico, acido ascorbico, acido maleico, acido sulfonico, acido fosfonico, acido perclorico, acido nltrico, acido formico, acido propionico, acido gluconico, acido lactico, acido tartarico, acido piruvico, acido fenilacetico, acido benzoico, acido hidroximaleico, acido p-aminobenzoico, acido p-hidroxibenzoico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido nitroso, acido hidroxietanosulfonico, acido etilensulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido naftilsulfonico, acido sulfanllico, acido canforsulfonico, acido qulnico, acido mandelico, acido o-metilmandelico, acido hidrogenbencenosulfonico, acido plcrico, acido adlpico, acido d-o-toliltartarico, acido tartronico, acido a-toluico, (o-, m-, p-) acido toluico, acido sulfonico naftilamina. El experto en la tecnica sabra que acidos son adecuados para realizar la reaccion. Sin embargo, se prefiere acido clorhldrico.

[0055] Se ha encontrado sorprendentemente que el compuesto de la invencion 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina (Ib) en comparacion con p-carbolinas ya conocidas y probadas tales como 9-metilo-p-carbolina, tienen una eficacia aumentada en el tratamiento de enfermedades del oldo interno. En base a los estudios actuales sobre los ingredientes activos de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con la misma sustancia 9-metilo-p-carbolina, existen, entre otras, las siguientes ventajas:

1. Se aumenta la permeabilidad de la membrana.

2. Se hace mas lenta la elimination (tiempo de vida media de elimination de 7F9MpC ca 1,5 veces mayor que para 9MpC).

3. Eficiencia incrementada de la expresion genica inducida por farmacos de factores celulares importantes (vease el Ejemplo 4 y 5), que son importantes para la regeneration celular (especialmente en el oldo interno) despues de un trauma.

Aplicaciones y formulaciones farmaceuticas

[0056] Los compuestos de la invencion son particularmente adecuados para el tratamiento de enfermedades o danos en el oldo interno, en particular las estructuras neuronales y sensoriales del oldo interno. Estas enfermedades o danos relacionados afectan especialmente la audition y el funcionamiento vestibular. Los slntomas asociados incluyen, entre otros, danos en la audicion, perdida de la audicion, mareos, problemas de equilibrio, tinnitus, desorientacion, nauseas y vomitos.

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[0057] Por lo tanto, un aspecto de la presente invention se refiere a los compuestos de la formula general (I) (o fluoro-9-metilo-p-carbolina de la formula general (I)) para su uso como un medicamento. Tambien, la presente invencion se refiere al compuesto 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina para su uso como un medicamento. Tambien, la presente invencion se refiere al compuesto de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina para su uso como un medicamento. El suministro de los presentes compuestos de la invencion, en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, son particularmente adecuados para el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, en particular perdida de audition neurosensorial. En las enfermedades y/o danos en el oldo interno, se tratan especialmente de enfermedades agudas y cronicas del oldo interno. Entre las enfermedades agudas del oldo interno se encuentran el trauma acustico, el trauma de explosion de la oreja, la perdida de audicion y el trauma auditivo durante la implantation de protesis de oldo interno (trauma de insertion). Las enfermedades cronicas del oldo interno incluyen, entre otros trauma acustico cronico (perdida de la audicion debido a la exposition cronica a ruido), la presbiacusia (audicion relacionada con la edad), otoesclerosis y la enfermedad de Meniere. La perdida auditiva neurosensorial (tambien denominada perdida de audicion coclear o sensorial) incluye tanto la perdida de audicion debido a la exposicion cronica a ruido (tambien conocida como perdida de audicion cronica o trauma acustico cronico), as! como la presbiacusia (audicion relacionada con la edad).

[0058] Otro aspecto de la presente invencion se refiere por tanto a un compuesto de la formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para la aplicacion en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, donde en las enfermedades y/o danos en el oldo interno se trata de enfermedades y/o trastornos agudos del oldo interno, seleccionados de entre el grupo consistente en trauma acustico, trauma por explosion del oldo, la perdida repentina de la audicion y el trauma de insercion.

[0059] Otro aspecto de la presente s invencion se dirige por tanto a un compuesto de formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para la aplicacion en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, donde en las enfermedades y/o danos del oldo interno se trata de enfermedades cronicas del oldo interno, seleccionadas del grupo que consiste en trauma cronico acustico, tinnitus y presbiacusia.

[0060] Ademas, los compuestos de la invencion son adecuados para el tratamiento del vertigo y trastornos en el equilibrio causan una perdida de audicion o enfermedades del oldo, causadas en particular por danos en el sentido del equilibrio en el oldo y para mejorar la memoria, para aumentar la capacidad de aprendizaje y el aumento de la capacidad de retention, en particular, la memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo.

[0061] Enfermedades y danos en el oldo interno tambien pueden ser causados por sustancias ototoxicos, tales como antibioticos y/o citostaticos. Los compuestos de la invencion, en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina y con especial preferencia 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, son adecuados para el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, caracterizado porque el dano en el oldo interno es debido a sustancias ototoxicos. En las sustancias ototoxicas se trata preferiblemente de antibioticos y/o farmacos citostaticos, en particular preferentemente de entre el grupo que comprende o que consiste en: ampicilina, baAMPcicilina, indanilo carbenicilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina, amoxicilina-acido clavulanico, ampicilina-sulbactam, bencilpenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, tazobactam, ticarcilina, acido clavulanico, nafcilina, cefalosporinas, cefadroxilo, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, cefradina, cefaclor, cefamandol, cefonicida, cefotetan, cefoxitina, cefprozilo, ceftmetazol, cefuroxima, loracarbef, cefdinir, ceftibuteno, cefoperazon, cefixima, cefotaxima, proxetilo de cefpodoxima, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, azitromicina, claritromicina, clindamicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, telitromicina, cetromicina, espiramicina, ansimacina, oelandomicina, lincomicina, troleandomicina, cinoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, acido nalidlxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, trovafloxacina, acido oxollnico, gemifloxacina, perfloxacina, imipenem-cilastatina, meropenem, aztreonam, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, teicoplanina, vancomicina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina, tigeciclina, mafenida, sulfadiazina de plata, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprima- sulfametoxazol, sulfametizol, rifabutina, rifampina, rifapentina, linezolida, estreptograminas, quinopristina, dalfopristina, bacitracina, cloranfenicol, fosfomicina, isoniazida, metenamina, metronidazol, mupirocina, nitrofurantolna, nitrofurazona, novobiocina, polimixina, espectinomicina, trimetoprima, colistina, cicloserina, capreomicina, etionamida, pirazinamida, acido para-aminosalicllico, eritromicina-2-acetato, eritromicina-2-estearato, estolato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, eritromicinglutamato, rifampicina, miconazol, ketoconazol, clotrimazol, econazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol, fluconazol, itroconauzol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, teraconazol, abfungina, terbinafina, amorolfina, naftifina, butenafina, anidulafungina, caspofungina, micafungina, acido benzoico, ciclopiroxolamina, tolnaftato, 5-fluorocitosina, griseofulvina, haloprogina, acido fusldico, gramicidina, pristinamicina, ramoplanina, tirotricina, natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina y hamicina.

[0062] Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invencion esta dirigido a un compuesto de formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina y en particular 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para su uso en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, en el que el dano al oldo interno por sustancias ototoxicas es limitado.

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[0063] Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso de los compuestos segun la invencion, en particular 7- fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para la fabricacion de un medicamento para tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno. Una realizacion de la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento de enfermedades y/o danos del oldo interno mediante la administracion de un compuesto de la formula general (I), preferiblemente 7-fluoro-9-met il-p-carbolina (Ib), y especialmente preferiblemente de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la).

[0064] Ademas en este punto, se tomara un aspecto interesante adicional: Hemos encontrado en nuestros estudios a nivel celular que 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) aumenta la concentracion de CREB por un factor 8 y aumenta la concentracion de BDNF (brain derived neurotrophic factor) hasta tres veces. Estos hallazgos sugieren que la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) de la invencion se puede emplear no solo en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno sino que tambien promueve el aprendizaje y la memoria.

[0065] Los mecanismos de aprendizaje y memoria subyacentes son extremadamente complejos. Se pueden ver a nivel molecular y celular, a nivel de la biologla de sistemas y la psicologla. Uno de los procesos clave para la formacion de la memoria a nivel molecular es la activacion del elemento de respuesta de protelna de union AMPc (CREB). Esto conduce a la nueva formacion de sinapsis, un proceso al que la formacion de la memoria esta acoplado en general. Este proceso se regula por muchos factores. Un refuerzo positivo se induce por el cerebro BDNF y su receptor TRKB. En los experimentos de biologla del comportamiento (vease el Ejemplo 9) se pudo demostrar en el modelo animal de rata que la administracion intraperitoneal de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) de la invencion en comparacion con animales de control no tratados acelero los procesos de aprendizaje y mejoro la memoria,

[0066] Otro aspecto de la presente invencion esta por tanto dirigido a un compuesto de la formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina para la aplicacion en la mejora del aprendizaje y la memoria y para aumentar la memoria, en el aumento de la capacidad de aprendizaje y de la capacidad de retencion.

[0067] Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al uso de los compuestos segun la invencion, en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para la preparacion de una formulacion farmaceutica para mejorar el aprendizaje y la memoria. Una forma ejemplar de la presente invencion se refiere a un metodo para mejorar el aprendizaje y la memoria mediante la administracion de un compuesto de la formula general (I), preferiblemente de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina (Ib) y se prefiere particularmente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la).

[0068] Otro aspecto de la presente invencion esta dirigida a un compuesto de general formula (I), en particular 7- fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina para la aplicacion en la mejora de los procesos de aprendizaje y/o memoria.

[0069] Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al uso de los compuestos segun la invencion, en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, para preparar una formulacion farmaceutica para mejorar los procesos de aprendizaje y/o memoria. Una realizacion de la presente invencion se refiere a un metodo para la mejora de los procesos de aprendizaje y/o memoria mediante la administracion de un compuesto de la formula general (I), preferiblemente de 7-fluoro-9 -metilo-p-carbolina (Ib) y lo mas preferiblemente de 6-fluoro -9-metilo-p-carbolina (la).

[0070] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones para inyeccion que comprenden al menos uno de los compuestos de esta invencion (o al menos un compuesto de formula general (I)).

[0071] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones de inyeccion que comprenden uno o mas de los compuestos de la invencion (o uno o mas compuestos de formula general (I)).

[0072] Sin embargo, otro aspecto de la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones para inyeccion que comprenden 6-fluoro-9- metilo-p-carbolina.

[0073] Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones para inyeccion que contiene 7-fluoro-9-metilo-p- carbolina.

[0074] Sin embargo, otro aspecto de la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones de inyeccion que comprende 6-fluoro-9-metilo- p-carbolina y 7-fluoro-9-metilo -p-carbolina.

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[0075] Por consiguiente, la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos en forma de gotas, unguentos, sprays, liposomas, geles, emulsiones o soluciones de inyeccion que comprenden 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y/o 7- fluoro-9-metilo -p-carbolina.

[0076] Ademas, la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos que se prepararon usando al menos uno de los compuestos de la invencion (o al menos un compuesto de formula general (I)) o una sal del mismo.

[0077] La presente invencion se refiere tambien a compuestos farmaceuticos que se prepararon mediante el uso de uno o mas de los compuestos de la invencion (o uno o mas compuestos de formula general (I)) o sus sales.

[0078] Ademas, la presente invencion se refiere a compuestos farmaceuticos que se prepararon mediante el uso del compuesto de la invencion 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina o una sal del mismo.

[0079] Ademas, la presente invencion proporciona compuestos farmaceuticos que se prepararon mediante el uso del compuesto segun la invencion 6-fluoro-9-metilo- p-carbolina o una sal del mismo.

[0080] La presente invencion tambien se refiere a compuestos farmaceuticos se prepararon mediante el uso del compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina o una sal del mismo, y el uso del compuesto de la invencion 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina o una sal del mismo.

[0081] Del mismo modo, la presente invencion se refiere compuestos farmaceuticos que se prepararon mediante el uso del compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y/o 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina o sales de los mismos.

[0082] Ademas de al menos un compuesto de la presente invencion (o un compuesto de la formula general (I)), en particular junto a 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y lo mas preferiblemente junto a 6-Fluoro-9-metilo-p-carbolina, los compuestos farmaceuticos preferiblemente incluyen un vehlculo, excipiente y/o disolvente farmacologicamente aceptable.

[0083] Ademas de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la presente invencion, los compuestos farmaceuticos comprenden preferiblemente un vehlculo, excipiente y/o disolvente farmacologicamente aceptable.

[0084] Los compuestos farmaceuticos, que contienen el compuesto de la invencion, se pueden de preparar y administrar en la forma de sistemas de administracion transdermica (parches, lamina), gotas, plldoras, comprimidos, comprimidos recubiertos con lamina, comprimidos con lamina, grageas, geles, hidrogeles, unguentos, jarabes, granulos, supositorios, emulsiones, dispersiones, microcapsulas, capsulas, microformulaciones, nano-formulaciones, liposomas, polvos, polvos de espolvoreo, pulverizaciones, aerosoles, soluciones, zumos, suspensiones, soluciones para soluciones de infusion o de inyeccion. Se prefieren compuestos farmaceuticos en forma de liposomas, geles y emulsiones. En particular, se prefieren formulaciones de hidrogel.

[0085] Tales composiciones son adecuadas para la administracion, entre otros medios, por inhalacion o por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, mucocutanea, oral, rectal, transdermica, topica, bucal, intradermica, intragastrica, intracutanea, intranasal, intrabucal, percutanea, intratimpanica o sublingual. Se prefiere particularmente la administracion o inyeccion en el oldo medio, as! como la administracion topica en el timpano.

[0086] Como vehlculo farmacologicamente aceptable se puede aplicar, por ejemplo, lactosa, almidon, sorbitol, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicalcico, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etilico y similares. Polvos, asi como tabletas pueden estar presentes a 5 a 95 % en peso de un portador semejante.

[0087] Ademas, se pueden anadir los compuestos farmaceuticos o disgregantes, colorantes, aromatizantes y/o aglutinantes.

[0088] Las formulaciones liquidas incluyen soluciones, suspensiones, aerosoles y emulsiones. Por ejemplo, las inyecciones de solucion, a base de glicol-agua o agua-propilenglicol para inyeccion parenteral. Para preparar supositorios, se utilizan ceras de bajo punto de fusion, esteres de acidos grasos y gliceridos.

[0089] Las capsulas se preparan, por ejemplo, de celulosa de metilo, alcoholes de polivinilo, o gelatina desnaturalizada o almidon. Como almidon disgregante, se puede emplear carboximetilo de almidon sodico, gomas naturales y sinteticas tales como goma de algarroba, karaya, guar, tragacanto y agar, y derivados de celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa microcristalina y alginatos, arcillas y bentonitas. Estos ingredientes se pueden utilizar en cantidades de 2 a 30 % en peso.

[0090] Como aglutinante, se puede emplear azucar, almidon de maiz, arroz o patatas, gomas tanto naturales como sinteticas tales como goma de acacia o goma de guar, gelatina, tragacanto, acido alginico, alginato de sodio, alginato de calcio y amonio, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa de hidroxipropilo, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, ceras, y se anaden compuestos inorganicos tales como silicatos de aluminio de

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magnesio. Los aglutinantes pueden aplicarse en cantidades de 1 a 30 % en peso.

[0091] Como lubricante, se emplean estearatos como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de potasio, acido estearico, ceras de alto punto de fusion, y lubricantes solubles en agua tales como cloruro de sodio, benzoato de sodio, acetato de sodio, oleato de sodio, polietilenglicol, acido borico y aminoacidos tales como leucina. Tales lubricantes se pueden utilizar en cantidades de 0,05 a 15 % en peso.

[0092] De este modo se prefieren todas las formulaciones farmaceuticas adecuados para la administracion del ingrediente activo localmente a la membrana de ventana redonda. Se prefiere ademas que las formulaciones farmaceuticas contengan un promotor de penetracion de membrana, el cual apoya el paso del compuesto de la formula general (I), en particular de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina y en particular preferiblemente de 6-fluoro-9-metilo- p-carbolina a traves de la membrana de ventana redonda. De acuerdo con ello, se prefieren particularmente las formulaciones llquidas o en gel. Por supuesto, tambien es posible administrar el farmaco por via oral.

[0093] Los compuestos farmaceuticos para cualquier via de administracion de los compuestos de la formula general (I) contienen una cantidad de compuesto/s de la formula general (I) suficiente para el efecto terapeutico y, si es necesario, vehlculos farmaceuticamente aceptables organicos u inorganicos, solidos o llquidos. Los compuestos farmaceuticos adecuados para la administracion topica en el oldo medio incluyen soluciones acuosas o suspensiones que se pueden preparar antes de la administracion en el oldo medio, por ejemplo, en el caso de formulaciones liofilizadas que contienen el compuesto de la formula general (I), eventualmente junto con un vehlculo.

[0094] Los compuestos farmaceuticos para cualquier via de administracion de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina

contienen un efecto terapeutico suficiente para la cantidad de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina y, si es necesario, vehlculos farmaceuticamente aceptables inorganicos u organicos, solidos o llquidos. Compuestos farmaceuticos, adecuados para la administracion topica en el oldo medio, incluyen soluciones acuosas o suspensiones que se pueden preparar antes de la administracion en el oldo medio, por ejemplo, en el caso de formulaciones liofilizadas, las cuales contienen 7-fluoro-9- metilo-p-carbolina solo o junto con un vehlculo.

[0095] Los compuestos farmaceuticos para cualquier via de administracion de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina

contienen un efecto terapeutico suficiente para la cantidad de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y, si es necesario, vehlculos farmaceuticamente aceptables inorganicos u organicos, solidos o llquidos. Compuestos farmaceuticos, adecuadas para la administracion topica en el oldo medio, incluyen soluciones acuosas o suspensiones que se pueden preparar antes de la administracion en el oldo medio, por ejemplo, en el caso de formulaciones liofilizadas, 6-fluoro-9- metilo-p-carbolina sola o incluida con un vehlculo.

[0096] Los compuestos farmaceuticos comprenden ademas geles, a base de microesferas biologicamente

degradables o no biodegradables, acuosas o no acuosas. Ejemplos de tales geles incluyen poloxameros, hialuronatos, xiloglucanos, quitosanos, poliesteres, polilactidas, poliglicolide o su co-pollmero PLGA, isobutirato de acetato de sacarosa y monooleato de glicerina. Los compuestos farmaceuticos que son adecuados para la administracion enteral o parenteral incluyen tabletas o capsulas de gelatina o soluciones acuosas o suspensiones como se describe anteriormente.

[0097] Los compuestos farmaceuticos pueden estar esterilizados y/o contener adyuvantes, por ejemplo,

conservantes, estabilizantes, agentes, humectantes y/o emulsionantes, sales para regular la presion y/o tampones osmoticos. El compuesto farmaceutico de la invencion puede, si se desea, contener otros ingredientes activos. Estos compuestos farmaceuticos se pueden preparar por cualquier metodo que se conoce de la tecnica anterior, se pueden preparar, por ejemplo, por metodos convencionales tales como mezclado, granulacion, confeccion, disolucion y liofilizacion y pueden variar desde aproximadamente 0,01 a 100 por ciento en peso, preferiblemente entre 0,1 y 50 por ciento en peso, liofilizados hasta 100 por ciento en peso de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina. Estos compuestos farmaceuticos pueden estar presentes tambien en aproximadamente 0,01 a 100 por ciento en peso, preferiblemente entre 0,1 y 50 por ciento en peso, liofilizados hasta un 100 por cien en peso de 7-fluoro-9-metilo-p- carbolina. Estos compuestos farmaceuticos pueden estar presentes tambien en aproximadamente 0,01 a 100 por ciento en peso, preferiblemente entre 0,1 y 50 por ciento en peso, liofilizados hasta 100 por ciento en peso de compuestos de la formula general (I)

[0098] En una forma de realizacion preferida, se formula el compuesto farmaceutico de la invencion para la administracion topica. Vehlculos adecuados para la administracion otogenica son sustancias organicas o inorganicas, que son farmaceuticamente aceptables y que no reaccionan con un compuesto de la invencion y/o mas ingredientes activos, por ejemplo, solucion salina, alcoholes, aceites vegetales, alcoholes bencllicos, glicoles de alquilo, polietileno, triacetato de glicerina, gelatina, carbohidratos tales como lactosa o almidon, carbonato de magnesio (magnesia, tiza), estearato (ceras), talco y petrolato (vaselina). Las composiciones descritas pueden estar esterilizadas y/o auxiliares como lubricantes, conservantes, tales como timerosal (por ejemplo, 50 % en peso), estabilizantes y/o agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, sustancias de tampon, sustancias colorantes y/o saborizantes. Estas composiciones tambien pueden contener una o mas sustancias. De acuerdo con la invencion, composiciones otogenicas pueden comprender varios materiales y/o sustancias, incluyendo otras sustancias biologicamente activas, por ejemplo, otros ingredientes activos biologicos,

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como antibioticos, sustancias antiinflamatorias tales como esteroides, cortisona, analgesicos, antipirina, benzocalna, procalna.

[0099] Las composiciones de la invencion para la administracion topica pueden incluir otras sustancias y/o sustancias farmaceuticamente aceptables. En realizaciones preferidas de la presente invencion, se selecciona un excipiente topico que no fortalece la administracion de los compuestos de la formula general (I), en particular, 7- fluoro-9-metilo-p-carbolina, y particularmente preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y opcionalmente ademas sustancias activas o las sustancias activas en el sistema circulatorio de la sangre o en el sistema nervioso central cuando se administra a la oreja, en el oldo medio o en el canal auditivo. Posibles vehlculos incluyen acidos hidroxicarboxllicos, agente de absorcion anhidro tal como petrolato hidrofilo (vaselina), y lanolina anhidra (por ejemplo, Aquaphor®), y medios basados en emulsiones de agua-en-aceite tales como lanolina y crema frfa. Mas preferidos son vehlculos que son sustancialmente no exclusivos y tlpicamente incluyen aquellos excipientes, que son solubles en agua, as! como los materiales a base de emulsiones aceite-en-agua (cremas o unguentos hidrofllicos) y sustancia de base soluble en agua tal como excipientes y soluciones acuosas a base de glicol de polietileno, que se gelifican con varios agentes como metilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa.

[0100] Para la administracion oral en forma de comprimidos o capsulas, un compuesto de la invencion puede ser mezclado en general con excipientes no toxicos farmaceuticamente aceptables seleccionados de la lista que comprende agentes aglutinantes tales como almidon de malz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa; material de relleno tales como lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol y otros azucares reductores y no reductores, celulosa microcristalina, sulfato de calcio o fosfato de hidrogeno de calcio; lubricantes tales como estearato de magnesio, talco o sllice, acido estearico, estearilo de fumarato sodico, behenato de glicerilo, estearato de calcio y similares; agentes tales como almidon de patata o almidon de glicolato sodico de desintegracion; humectantes tales como dodecilo de sulfato sodico; colorantes; agentes aromatizantes; gelatina; edulcorantes; gomas naturales y sinteticas tales como acacia, tragacanto o alginatos; sales de tampon; carboximetilcelulosa; polietilenglicol; ceras y similares.

[0101] Los comprimidos pueden recubrirse con una solucion concentrada de azucar que contiene goma arabe, por ejemplo, puede contener gelatina, talco, dioxido de titanio y similares. En otra realizacion, los comprimidos se pueden revestir con un pollmero que se disuelve en un disolvente organico facilmente volatil o mezcla de disolventes organicos. En realizaciones preferidas, los compuestos de la formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p- carbolina, y mas preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina como un comprimido formulado para liberacion inmediata o en forma de tabletas para liberacion sostenida. Formas de dosificacion para la liberacion inmediata permiten la liberacion de una gran parte o de la cantidad total de un compuesto de formula general (I) dentro de un perlodo tan corto como 60 minutos o menos, y permiten la rapida absorcion del compuesto de la invencion. Formas de liberacion sostenida permiten la liberacion sostenida durante un perlodo de tiempo mas largo para alcanzar niveles plasmaticos terapeuticamente eficaces de un compuesto de formula general (I) y/o para mantener estables estos niveles plasmaticos terapeuticamente eficaces durante un perlodo prolongado y/u para modificar otras propiedades farmacocineticas de los compuestos de formula general (I), en particular de 7-fluoro-9-metilo-p- carbolina y en particular preferiblemente de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0102] Para la formulacion de capsulas de gelatina blanda, se puede mezclar un compuesto de la invencion, por ejemplo, con un aceite vegetal o glicol de polietileno. Capsulas de gelatina dura pueden incluir un compuesto de la invencion en forma de granulos incluidos utilizando los excipientes mencionados anteriormente para tabletas, tales como lactosa, sacarosa, manitol, almidones tales como almidon de patata, almidon de malz o amilopectina, derivados de celulosa o gelatina general. Tambien formas llquidas o semi-llquidas del compuesto activo se pueden llenar en capsulas de gelatina dura.

[0103] Los compuestos de la invencion de la formula general (I), en particular 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina y mas

preferiblemente 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, pueden introducirse tambien en microesferas o microcapsulas, las cuales se producen por ejemplo a partir de acido poliglicolico/acido lactico (PGLA). Pollmeros biocompatibles, seleccionados de la lista que comprende acido polilactico, acido poliglicolico, copollmeros de acido polilactico y poliglicolico, poli-£-caprolactona, acido polihidroxi butlrico, polioetoester, poliacetales, polihidropurano,

policianoacrilatos y copollmeros de bloque anfipaticos de hidrogeles se pueden utilizar para proporcionar una liberacion controlada para conseguir la liberacion de un compuesto de la invencion a partir de los compuestos farmaceuticos de la presente invencion.

[0104] En una forma de realizacion adicional de la invencion los compuestos de formula general (I), en particular el 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y mas preferiblemente el 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, se preven como una formulacion llquida para administracion oral. Las preparaciones llquidas para administracion oral pueden proporcionarse en la forma de soluciones, jarabes, emulsiones o suspensiones. Alternativamente, las formulaciones llquidas para administracion oral pueden producirse por reconstitucion de la formulacion seca para la administracion oral con agua o con otro vehlculo adecuado antes de su uso. Las preparaciones para administracion oral pueden formularse de manera que se logre una liberacion controlada o sostenida de un compuesto de acuerdo con la invencion y opcionalmente otros agentes activos.

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[0105] Para la administracion oral en forma llquida, se pueden emplear un compuesto de la invencion con sustancias de portador farmaceuticamente aceptables no toxicas inertes tal como etanol, glicerol, agua; agentes de suspension tales como jarabe de sorbital, derivados de celulosa o grasas comestibles endurecidas; emulsionantes tales como lecitina, o acacia; vehlculos no acuosos tales como aceite de almendra, esteres oleosos, etanol o aceites vegetales fraccionados; conservantes tales como p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico; y similares. Estabilizadores tales como, por ejemplo, antioxidantes como butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, galato de propilo, ascorbato de sodio, acido cltrico tambien se pueden utilizar para estabilizar la forma de dosificacion. Por ejemplo, las soluciones pueden contener de aproximadamente 0,2% en peso hasta aproximadamente 20% en peso de un compuesto de acuerdo con la invencion, con lo que la masa de equilibrado puede ser azucar y una mezcla de etanol, agua, glicerol y propilenglicol. Opcionalmente, estas formulaciones llquidas pueden contener agentes saborizantes, colorantes, sacarina, celulosa carboxllica como espesante y/u otros excipientes.

[0106] En otra realizacion, una dosis terapeuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invencion se administra por via oral a traves de una solucion, pudiendo contener la solucion un conservante, un edulcorante, un solubilizante y un disolvente. La solucion para la administracion oral puede contener uno o mas tampones, aromatizantes u otros excipientes. En otra realizacion, se anade hierbabuena u otro aromatizante a la solucion del compuesto de la invencion para la administracion oral.

[0107] Para la administracion por inhalacion, un compuesto de acuerdo con la invencion se puede administrar de un modo adecuado, tal como por pulverizacion de aerosol con paquetes presurizados o un nebulizador , con el uso de un propulsor adecuado, tal como diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclortetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. Cuando se utiliza un aerosol presurizado, la dosificacion puede determinar que se proporcione una valvula para extender una cantidad medida a administrar. Las capsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en inhaladores o insufladores, pueden formularse de tal forma que las capsulas y los cartuchos contengan una mezcla en polvo del compuesto de la invencion y opcionalmente otro o mas de otros ingredientes activos y un material de base en polvo adecuado tal como lactosa o almidon.

[0108] Las soluciones para administracion parenteral por inyeccion se pueden preparar a partir de una solucion acuosa de una sal farmaceuticamente aceptable soluble en agua de un compuesto de la invencion, en particular, 7- fluoro-9-metilo-p-carbolina y de modo particularmente preferible 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, a una concentration de aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 10% en peso. Estas soluciones pueden tambien contener estabilizantes y/o sustancias de tampon y pueden proporcionarse en viales con diferentes unidades de dosificacion apropiada.

[0109] Por lo tanto, los compuestos de la invencion que se presentan aqul, en particular, 7-fluoro-9-metilo-p- carbolina y especialmente preferiblemente, 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, son utiles para la preparation de compuestos farmaceuticos para el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno. Con ello, en las enfermedades y/o danos en el oldo interno se trata preferiblemente del tratamiento de enfermedades agudas y/o cronicas del oldo interno. Entre las enfermedades agudas del oldo interno se incluye el trauma acustico, trauma por explosion del oldo, perdida de audition y el trauma de insertion. Entre los trastornos cronicos del oldo interno se incluyen trauma cronico acustico, tinnitus y la presbiacusia. Las enfermedades y/o danos en el oldo interno tambien se pueden caracterizar por deberse a sustancias ototoxicas.

Descripcion de las figuras

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Fig1 : El esquema de reaction para la reaction de tres pasos de fluoro-1-metiltriptamina (como clorhidrato) de la formula general (II) y hidrato de acido glioxllico (III) a traves del producto intermedio de la formula general (IV) y fluor-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina de la formula general (V) a fluor-9-metilo-p-carbolina de la formula general (I). Aqul, o bien R1 es -F y R2 es -H o -F y esto se aplica para los compuestos de formula general (I), (II), (IV) y (V), o R1 = H y R2 = -F y esto se aplica del mismo modo para los compuestos de formula general (I), (I I), (IV) y (V).

Fig. 1 a: El esquema de reaccion para la reaccion de tres pasos de hidrocloruro de 5-fluoro-1-metiltriptamina (IIa) y hidrato de acido glioxllico (III) a traves del producto intermedio (IVa) y 6-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (Va) para 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (la).

Fig. 1b: El esquema de reaccion para la reaccion de tres pasos de clorhidrato de 6-fluoro-1-metiltriptamina (IIb), y hidrato de acido glioxllico (III) a traves del producto intermedio (IVb) y 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (Vb) para dar 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina (Ib).

Fig. 2 : SH-SY5Y-llnea celular de 15 dlas de incubation con AC102 (6-fluoro-9-metilo-p-carbolina)

Fig. 3 : SH-SY5Y-llnea celular de 15 dlas de incubacion con AC002 (9-metilo-p-carbolina)

Fig. 2 y 3 : muestran el cultivo de celulas de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) que se expondrlan con crecientes

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concentraciones de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (AC102) durante 15 dlas (Fig. 2). En comparacion, en la Fig. 3 se muestra el efecto de 9-metilo-p-carbolina bajo las mismas condiciones (AC002), respectivamente. La fila superior procede del experimento actual con la concentracion de 70 pmol/L, mientras que la fila inferior muestra la dependencia de la concentracion de un experimento anterior. El compuesto de la invencion (AC102) inhibe la proliferacion de las celulas e induce la germinacion de las proyecciones delgadas y un cambio en el tamano y forma de las celulas. Esto se puede explicar con la induccion de una diferenciacion. Este efecto del compuesto se hace particularmente evidente en la comparacion de las concentraciones 0 pM (control) y 30 pM a ambos puntos de tiempo.

Fig. 4: Cromatograma de HPLC de 9-metilo-p-carbolina (9MpC, AC002) y 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC, AC102). Los tiempos de retencion fueron 5,3 y 7,3 min Columna: Phenomenex Luna 3uC18 (2) 100A; Eluyente: ACN90%/NH4Ac 40 mM [45/55]

Fig. 5 muestra la relativa expresion de genes de BDNF (brain-derived neurotrophic factor, Fig. 5A), de Lif (Leukemia inhibitory factor, Fig 5B) de NT3 (neurotrofina 3, Fig. 5C) de Id2 (inhibitor of Differentiation 2, Fig. 5D) de BTG2 (B- cell translocation gene 2, Fig. 5E), de CBLN (Cerebellin 1 precursor Protein. Fig. 5F) de DRD2S (variante corta del subtipo 2 de receptor de dopamina, Fig. 5H) de DKK1 (Dickkopf-related protein 1, Fig. 5I) y el cociente Bax/Bcl-2 (Fig. 5G) en cada caso despues de la exposicion de 2 dlas (vigas gris claro), 7 dlas (vigas gris oscuro) y 14 dlas (vigas negras) de celulas SH-SY5Y a 6F9MpC (10 pm, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM, y 70 pM). La expresion genica relativa significa la expresion de cada factor relativo a las condiciones de control.

Fig. 6 muestra la expresion genica relativa de BDNF (brain-derived neurotrophic factor, Fig. 6A) de Lif (Leukemia inhibitory factor, Fig. 6B) de DRD2S (variante corta del subtipo 2 de receptor de dopamina, Fig. 6C) y de DKK1 (Dickkopf-related Protein 1, Fig. 6D) en cada caso despues de exposicion de 2 dlas (vigas gris claro), 7 dlas (vigas gris oscuro) y 14 dlas (vigas negras) de celulas SH-SY5Y a 7F9MpC. La expresion genica relativa significa la expresion del factor respectivo con relacion a las condiciones de control.

Fig. 7 Micrograflas de fluorescencia de secciones de coclea despues de la tincion inmunohistoqulmica con faloidina (etiquetadas con Alexa Fluor® 488) de un conejillo de Indias despues de un trauma acustico, en el que un oldo esta tratado con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC, un total de 0,105 mg por oldo) (Fig. 7B) y el segundo oldo no tratado se utilizo como control intra-individual (tambien conocido como "contr." Fig. 7A). Las celulas internas de pelo (IHC) y las tres filas (I, II, II) de celulas ciliadas externas (OHC) tambien son visibles. Las celulas muertas estan marcadas con flechas blancas y demuestran el efecto nocivo del trauma acustico. Escala = 25 pM.

Fig. 8 Micrograflas de fluorescencia de secciones de coclea despues de la tincion inmunohistoqulmica con faloidina (etiquetadas con Alexa Fluor® 488) de un conejillo de Indias despues de un trauma acustico, en el que un oldo se trata con 9-metilo-p-carbolina (9MpC, en total 0,2 mg por oldo) (Fig. 8B) y el segundo oldo no tratado sirve como control intra-individual (tambien conocido como "contr.", Fig. 8A). Las celulas internas de pelo (IHC) y celulas ciliadas externas (OHC) tambien son visibles. Celulas muertas estan marcadas por flechas blancas y demuestran el efecto danino de los traumas acustico. Escala = 100 pM.

Fig. 9 muestra el desplazamiento permanente del umbral de audicion en el conejillo de Indias despues de un trauma acustico inducido acusticamente, en el que un oldo se trato despues del trauma con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC, un total de 0,18 mg por oldo) y el segundo oldo no tratado sirvio como control intra-individual (contr.). El umbral de audicion se determino mediante medicion la del potencial del tronco encefalico acusticamente evoluido, midiendose 3 dlas antes del trauma por ruido acustico (D-3), 30 minutos despues del trauma acustico (D0), as! como 14 dlas despues del trauma acustico (D14). El desplazamiento permanente del umbral de audicion se calcula a partir de los valores medidos D14 - D3. Los valores mostrados son valores promedio de cuatro mediciones independientes (n = 4).

Fig. 10: En la Fig. 9, sin embargo, se muestra la recuperacion de los umbrales auditivos en el conejillo de Indias de acuerdo con cualquier trauma acustico acusticamente inducido. Esto se calcula a partir de los valores medidos D0 - D14. Los valores mostraron en general valores medios a partir de cuatro mediciones independientes (n = 4).

Fig. 11 muestra la recuperacion de los umbrales auditivos en el conejillo de Indias de acuerdo con cualquier trauma acustico acusticamente inducido, en el que una oreja despues del trauma acustico se trato con 9-metilo-p-carbolina (9MpC, un total de 0,2 mg por oldo) y la segunda oreja no tratado sirvio como control intra-individual (contr.). El umbral de audicion se determino mediante medicion la del potencial del tronco encefalico acusticamente evoluido, midiendose 3 dlas antes del trauma acustico (D-3), despues del trauma acustico (D1) y 14 dlas despues del trauma acustico (D14). La recuperacion de los umbrales de audicion se calcula a partir de los valores medidos D1 - D14.

Fig. 12: Como se muestra en la Fig. 11, se administro 0,35 mg de 9-metilo-p-carbolina por oldo.

Fig. 13: Los cromatogramas de HPLC de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina no tratada (6F9MpC, Fig. 13A), 6-fluoro-9- metilo-p-carbolina se incubaron durante 1 h con homogeneizado de hlgado (Fig. 13B), 6 fluoro-2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (6F29DMpC, Fig. 13C) y 2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (29DMpC, Fig. 13D). Los tiempos de retencion

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eran 19,0 min (6F9MpC & hlgado + 6F9MpC), 10,1 min (6F29DMpC) y 9,1 min (29DMpC). Columna: Phenomenex Luna 3uC18 (2) 100A; Eluyente: ACN90%/NH4Ac 40 mM [45/55]

Ejemplos

Ejemplo 1a Sfntesis de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina

[0111] De manera analoga al metodo de Ho y Walker (Beng T. Ho y K.E. Walker; Org. Synth. 1971, 51, 136 o Org. Synth. 1988, Coll. Vol. 6, 965) se disuelven en 10 mL de agua 3,5 mmol (800 mg) de 5-fluoro-1-clorhidrato de metilotriptamina (Figura 1a, Formula Ila, AKos GmbH, piedras) y se trato con una solucion de 3,9 mmol (356,4 mg) hidrato de acido glioxllico (1a, Formula Ill) en 810 pl de agua unida. Con agitacion, a continuation, se anade con una pipeta una solucion de 3,4 mmol (190,4 mg) de hidroxido de potasio, en el que el pH se ajusta a aproximadamente 4. La mezcla de reaction se agita durante 3 h a temperatura ambiente y se coloca en un bano de hielo durante una hora adicional para completar la cristalizacion. El precipitado beige anaranjado de la betalna (1a, Formula IVa) se separa por filtration y se lava con una cantidad de agua con hielo.

[0112] Para la descarboxilacion, se transfiere la torta de filtro aun humeda de la betalna (1a, formula IVa) a un matraz y se disuelve en acido clorhldrico diluido (6,48 mL de agua y 918 pl de acido clorhldrico concentrado). La mezcla de reaccion se calienta a reflujo bajo nitrogeno durante 10 min, de nuevo 945 pl de acido clorhldrico concentrado se anade a traves de un septo y se somete a reflujo durante otros 15 min. A continuacion, la solucion se vuelve a la temperatura ambiente y 12 h se almacena a 0-5°C. Los cristales resultantes de la 6-fluoro-9-metilo- 2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (1a, Formula Va) se filtran y se recristalizan a partir de metanol. Rendimiento: 230 mg (52%).

[0113] Para la aromatizacion se disuelve 230 mg de 6-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina (Figura 1a, Formula Va,) en 15 mL de agua, con hidroxido de sodio a pH 13 y se extrae con una mezcla de acetato de etilo y tolueno (1: 1) 3 x. Las capas organicas purificadas se secan con sulfato de magnesio (MgSO4) y se evaporan bajo presion reducida. El residuo oleoso se recoge en 50 mL de tolueno, se le anade 100 mg de Pd/C (10%) y somete a reflujo durante 24 h. De la solucion todavla caliente Pd/C se separa por filtracion y la torta del filtro se lava con 20 mL de tolueno caliente. La fase organica se evapora a vaclo. El residuo oleoso de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (Figura

la, Formula Ia) se cristaliza en reposo, y forma 183 mg (96%) de cristales amarillos.

Punto de fusion: 117-118°C; GC/MS para la base libre: m/z = 201 (10%), 200 (100%), 199 (71%), 185 (13%), 145 (6%), 131 (6%), 1H RMN: 5 (ppm) de metanol d4, 400 MHz: 3,80, s, 3H, N-CH3; 7,34, m, 1H; 7,43, m, 1H; 7,73, m, 1H; 7,91, m, 1H; 8,24, m, 1H; 8,73, m, 1H, 13C-RMN: 5 (ppm) Metanol d4, 100 MHz: 28,23; 106,38; 106,64; 110,20 y 110,29, d; 114.67; 116.25; 116,52; 120,59 y 120,66, d; 127,91; 131,30; 136.95; 137,51; 138.35; 156,20 y 158,55, d,

Analisis elemental: para C12H9FN2 x 0,1 H2O x 0,1 tolueno: C, H, N,

Calculado: C: 72,21; H: 4,77; N: 13,26, Encontrado: C: 72,01; H: 4,55; N: 13,45

Ejemplo 1b Sfntesis de 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina

[0114] De manera analoga a la sfntesis de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina en 10 mL de agua 3,5 mmo l (800 mg) de clorhidrato de 6-fluoro-1-metiltriptamina (Figura 1b, Formula IIb, Otavachemicals Ltd., Vaughan, Canada) y se trato con una solucion de 3,9 mmol (356,4 mg) hidrato de acido glioxllico (Figura 1b, Formula III) en 810 pL de agua. Bajo agitacion, despues se anade con pipeta una solucion de 3,4 mmol (190,4 mg) mediante hidroxido de potasio, ajustandose el pH a aproximadamente 4. La mezcla de reaccion se agita durante 3 h a temperatura ambiente y se coloca durante otra hora en un bano de hielo para completar la cristalizacion. El precipitado beige anaranjado de la betalna (Figura 1b, Formula IVb) se separa por filtracion y se lava con un poco de agua con hielo. Para la descarboxilacion de la torta del filtro aun humeda es de la betalna (Figura 1b, Formula IVb) se transfiere a un matraz y se disuelve en acido clorhldrico diluido (6,48 mL de agua y 918 pl de acido clorhldrico concentrado) se disuelve. La mezcla de reaccion se calienta a reflujo bajo nitrogeno durante 10 min, de nuevo 945 pl de acido clorhldrico concentrado se anade a traves de un septum y de nuevo a reflujo durante 15 min. A continuacion, la solucion se vuelve a la temperatura ambiente y 12 h a 0-5°C almacenado, en el que 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9- tetrahidro-p-carbolina falla como sal de HCl (Figura formula 1b Vb). Los cristales resultantes se separan por filtracion y se recristalizan en metanol. Rendimiento: 1 mmol y 250 mg (28%).

[0115] Para la aromatizacion se disuelve 250 mg de 7-fluoro-9-metilo-2,3,4,9-tetrahidro-p-carbolina x HCl (Figura

lb, Formula Vb) en 15 mL de agua, se disuelve en solucion de hidroxido de potasio a pH 13 y se almacena en el refrigerador durante la noche. La base libre se cristaliza como un solido cristalino beige que se filtra, se lava con agua y se seca a vaclo. El solido se suspende en 50 mL de tolueno, se coloca con 100 mg de Pd/C (10%) y 8 h se calienta a reflujo (DC como control de conversion). De la solucion todavla caliente se separa Pd/C por filtracion y la torta del filtro se lava con 20 mL de tolueno caliente. La fase organica se evapora a vaclo. El residuo aceitoso de 7- fluoro-9-metilo-p-carbolina (Figura 1b, Formula Ib) se cristaliza al dejarse en reposo, y forma cristales de color amarillo mostaza que purifican cromatografla en columna (CHCl3/metanol 9: 1). Se mantienen 160 mg (80%).

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Ejemplo 2: Diferenciacion de celulas de neuroblastoma humano (SH-SY5Y)

[0116] La ilnea celular SH-SY5Y se obtuvo de la Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares - DSMZ, Braunschweig. Las celulas se cultivaron en MEM (medio esencial mlnimo, Life Technologies) suplementado con 10% de FCS (suero de ternero fetal, Biochrom AG) y penicilina/estreptomicina (Biochrom AG). Para los estudios morfologicos, las celulas se sembraron con 1 mL de medio a una densidad de 1,5 x 104 celulas/cm2 en placas de 24 pocillos (Falcon, cultivo celular tratado). Una solucion madre de 10 mmol/L del compuesto de la invencion 6-fluoro-9- metilo-p-carbolina se preparo en 50% de etanol y filtrado esteril. Cinco horas despues de sembrar las celulas, el compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina se aplico en la cantidad apropiada al medio dado para obtener la concentracion final deseada. El medio se cambio una vez por semana. Las celulas se examinaron microscopicamente con regularidad. Micrograflas se tomaron en BZ Keyence 10 con 10 x objetivo y 4 x Digitalzoom. Una mejora del contraste automatico se realizo con el programa BZ Analyzer.

[0117] Los resultados proporcionan una ventaja del nuevo compuesto 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina frente a 9-metilo- p-carbolina, al observarse una diferenciacion similar de las celulas de la prueba solamente en una concentracion de aproximadamente 70 pM 9-metilo-p-carbolina en comparacion con 30 pM 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina. 50 pM 9- metilo-p-carbolina condujo a un crecimiento mas reducido de neuritas como signos de una diferenciacion de celulas de neuroblastos humanos, como 30 pM del presente compuesto 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

Ejemplo 3: Lipofilia de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9-metilo-p-carbolina

[0118] Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para comprobar si la lipofilia de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina es mayor que la de 9-metilo-p-carbolina. Experimentalmente, la lipofilia se determina o bien a traves de la distribucion real entre octanol y agua, o bien, mas simplemente, como se describe por Valko mediante experimentos de HPLC con una columna de fase inversa (RP 18) (K. Valko, Journal of Chromatography A 2004, 1037 (1- 2), 299310). Con ello, interaction los componentes de la sustancia objeto de investigacion de modo diferente con las fases estacionarias. Cuando un componente interactue mas debilmente con las fases estacionarias, sale antes de la columna. Dependiendo de la fuerza de estas interacciones, los componentes de la sustancia aparecen en diversos momentos (tiempos de retencion) al final de la columna de separacion. Tales experimentos se llevaron a cabo para las dos sustancias. Se encontro que el compuesto de la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina tiene un tiempo de retencion mas largo que 9-metilo-p-carbolina (Figura 4), que indica en la columna elegida o fases estacionarias sin ambiguedad una mayor lipofilia de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina.

[0119] Ademas, se determino la solubilidad de ambos compuestos en agua, en la que una serie de concentracion se preparo en agua a temperatura ambiente para ambos compuestos. La concentracion, que todavla era solo soluble se determino mediante una calibracion externa. La concentracion correspondiente se cuantifico por HPLC. Tiene una concentracion soluble maxima de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (base) de 29,7 mg/L y 9-metilo-p-carbolina (base) de 168,3 mg/L encontrado. Esta solubilidad en agua inferior de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina apoya por lo contrario el aumento de la lipofilia en comparacion con 9-metilo-p-carbolina.

[0120] La lipofilicidad de una sustancia tiene un fuerte efecto sobre sus parametros de ADME ("absorcion", "distribucion", "metabolismo", y "excrecion"). Por el aumento de lipofilas se concentran sustancias principalmente en compartimentos lipofllicos. Con el fin de atravesar las membranas, las sustancias qulmicas deben ser capaces de pasar a traves de la region hidrofoba de una doble membrana biologica, por lo que deben ser auto-lipofilas. A menudo hay una buena correlacion entre la solubilidad en llpidos y el paso de membrana. Por lo tanto, la lipoflla afecta de manera crucial la farmacocinetica de una conexion. En resumen, varios experimentos muestran una lipofilia considerablemente mayor de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9-metilo-p-carbolina

[0121] Otro aspecto importante del compuesto de la invencion se refiere a la extension de vida media de eliminacion. Mientras que 9-metilo-p-carbolina en una hidroxilacion en la posicion 6 se degrada con la reaccion de conjugacion final, se bloquea la via metabolica en 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina por el grupo fluoruro. Esto es probablemente la razon por el aumento de la vida media de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9- metilo-p-carbolina. Dado que la vida media de Harman, un analogo estructural de 9-metilo-p-carbolina, en el plasma sangulneo del hombre es de aproximadamente 68 min (Rommelspacher et al;. Eu J Pharmacol 2002, 441 (1-2), 115125) una extension de este valor proporciona una ventaja relevante del compuesto de la invencion, en particular en aplicaciones para el tratamiento de enfermedades cronicas.

[0122] Para una mejor evaluacion de las vidas medias de 9-metilo-p-carbolina (9MpC), 6-Fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) y 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina (7F9MpC) en el organismo animal, o mas especlficamente en la perilinfa (sitio diana de la accion) se llevaron a cabo experimentos en cobayas. Para este proposito, se aplico en cobayas el ingrediente activo particular (un total de 1,4 mg de cada ingrediente activo por oldo), en 40 pl de un hidrogel (18% Poloxamer 407, y 0,6% de alginato), una vez antes de la membrana de la ventana redonda en el oldo medio. Esta membrana separa el oldo medio lleno de aire del oldo interno lleno de la perilinfa. Despues de la expiracion del tiempo deseado (20 min, 2 h, 8 h y 24 h) se retiro perilinfa de la punta de la coclea (apice) bajo anestesia cada 5 pL. A continuacion, el animal se mato. Por tiempo (20 min, 2 h, 8 h o 24 h) se tomaron mediciones a partir de al menos tres orejas.

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[0123] La concentracion de la sustancia activa en la muestra de perilinfa se determino por cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC, en parte tambien indicada como cromatografla llquida de alta presion) y la medicion de las propiedades de fluorescencia del compuesto activo correspondiente. En la HPLC, el eluyente consistio en 45% a partir de 90% de acetonitrilo y 55% de acetato de amonio (40 mM, pH <5). El caudal era de 0,4 ml/min y el volumen de inyeccion era de 10 pL. Cada muestra se diluyo con metanol al 60%, siempre que la senal era demasiado fuerte. Despues de cada ejecucion, la aguja de inyeccion se lavo abundantemente con 100% de isopropanol. El llmite de deteccion era de 20 fmol/L.

[0124] De las concentraciones determinadas de ingrediente activo se pudo calcular la vida media de elimination. Se encontro en este caso para 9-metilo-p-carbolina una vida media de eliminacion de aproximadamente 3,4 h, para 6- fluoro-9-metilo-p-carbolina una vida media de eliminacion de aproximadamente 6,0 horas, y para el 7-fluoro-9-metilo- p-carbolina una vida media de eliminacion de aproximadamente 5,0 horas. Mediante el aumento de 1,5 veces (7F9MpC) a 1,75 veces (6F9MpC) la vida media de eliminacion de las sustancias de la invention en comparacion con 9-metilo-p-carbolina resultan en una biodisponibilidad significativamente mejorada en comparacion con la tecnica anterior. En general, se determina que las vidas medias en la perilinfa son mas altas que las vidas medias estimadas en sangre (por ejemplo, en relation con 9MpC).

Ejemplo 4: Experimentos RT-PCR I cuantitativos

[0125] Respecto a celulas de neuroblastoma se debe investigar en que medida los compuestos de la presente invencion, 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina, y 9-metilo-p-carbolina del estado de la tecnica afectan la expresion de factores neuroprotectores y neurotroficos importantes, de los cuales se conoce un efecto regenerador sobre las celulas ciliadas danadas. Tambien mejoran la vitalidad de las celulas nerviosas del ganglio espiral, que transmiten la information desde el oldo interno a traves de la base del cerebro y en en el centro de audition del cerebro. En trauma, los axones se retraen de las celulas ciliadas, con lo que no se reenviara la senal de los sonidos correspondientes. Los factores neurotroficos causan conjuntos continuos de la conexion entre el nervio y se atan las celulas ciliadas apropiadas de nuevo para que los tonos apropiados se oigan de nuevo.

[0126] Para ello, a traves de experimentos de RT-PCR cuantitativos (reaction en cadena de la polimerasa con transcriptasa) se utilizaron de nuevo las llneas de celulas de SH-SY5Y que se hicieron disponibles por el Instituto de Genetica Humana de la Cllnica Universitaria de Eppendorf, el cual obtuvo las celulas del Centro de Recursos de Braunschweig.

[0127] Las celulas se cultivaron en MEM (medio esencial mlnimo, Life Technologies) con FCS al 10% (suero de ternera fetal, Biochrom AG) y penicilina/estreptomicina (Biochrom AG). Las celulas se sembraron a una densidad de 1x105 celulas/cm2 en frascos de cultivo celular de 25 cm2 (Falcon, cultivo celular tratado) con 5 ml de medio. Las soluciones madre de 10 mmol/L de las sustancias 9-metilo-p-carbolina (AC-002 o 9MpC) y 6-fluoro-9-metilo-p- carbolina (AC102 o 6F9MpC) se disolvieron en agua destilada y se esterilizaron por filtration. Un dla despues de la siembra de las celulas, se anadieron las sustancias en las cantidades apropiadas (5-55pL) para mantener la concentracion final en el medio de 10pM, 20pM y 30pM para 6F9MpC y 30 pM, 50pM y 70pM para 9MpC. Los controles recibieron solo la cantidad apropiada de disolvente (agua destilada). El medio se cambio una vez por semana.

[0128] Las celulas se examinaron microscopicamente con regularidad y se cosecharon despues de 2, 7 y 14 dlas de incubation, se lavaron con PBS y se congelaron inmediatamente a -80°C.

[0129] El aislamiento del ARN se realizo utilizando el HighPure RNA Isolation Kit de la empresa Roche. Este aislamiento comprende una digestion de AADNsa. La concentracion de ARN se midio en el espectrofotometro nanoDrop y la integridad de ARN se determino usando el Bioanalyzer 2100 (Agilent). Mediante la muestra, bajo el uso de Random-Hexamerprimer, del Protector RNA Inhibitor (Roche) y de la Transcriptor Reverse Transcriptase (Fermentas), se describio 300 ng de ARN en ADNc.

[0130] Despues de la reaccion, este enfoque 1: 4 se diluyo y se aplico respectivamente 2 pl por RT-PCR cuantitativa. Esto se realizo en LightCycler 480 en condiciones estandar en el formato de SybrGreen con temperaturas de hibridacion de cebadores. Si es posible, se emplearon cebadores de sobreextension de exon.

[0131] La lista de los cebadores usados se dan en la Tabla 1 a continuation.

Tab. 1: Secuencias de cebador para experimentos cuantitativos de RT-PCR. Ademas, se muestran los numeros de identification de secuencia de los soportes respectivos (SEQ ID). La secuencia de todos los cebadores se da en la

direction 5'-3'.

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Gen diana

Cebador directo Cebador inverso

BDNF (brain- derived neurotrophic factor)

GGATGAGGACCAGAAAGT (SEQ- ID 01) AG CAGAAAGAGAAGAG GAG(SEQ- ID 02)

Lif (Leukemia inhibitory factor)

CCAACAACCTGGACAAGCTATG (SEQ-ID 03) GTGGCGTTGAGCTTGCTGTG (SEQ- ID 04)

NT3 (Neurotrophin 3)

CGGAGCATAAGAGTCACC (SEQ- ID 05) CCTGGCTTCCTTACATCG (SEQ-ID 06)

Id2 (Inhibitor of Differentiation 2)

CATCCTGTCCTTGCAGGCTT (SEQ- ID 07) CCATT CAACTT GTCCTCCTT GT G (SEQ-ID 08)

BTG2 (B-cell translocation gene 2)

CAGGAGGCACTCACAGAGCA (SEQ- ID 09) AAT GCGGTAGGACACCTCATA (SEQ- ID 10)

Cbln (Cerebellin 1 precursor Protein)

CAAGTGCCTGGTGGTGT (SEQ-ID 11) GTT CACT AGT ACCTGGTCGAAGT AG (SEQ-ID 12)

DRD2S (kurze Variante des Dopaminrezeptors Subtyp 2)

GGACT CAAT AACGCAGACCAGAA (SEQ-ID 13) CGGGCAGCCTCCTTTAGT (SEQ-ID 14)

DKK1 (Dickkopf- related Protein 1)

CATTGACAACTACCAGCCGT (SEQ- ID 15) ATCAGAAGACACACATATTCCATT (SEQ-ID 16)

Bax

GAT GATT GCCGCCGTGGACA (SEQ- ID 17) CACCTTGGTGCACAGGGCCTT (SEQ-ID 18)

Bcl2

GTGTGGAGAGCGTCAACC (SEQ- ID 19) CTTCAGAGACAGCCAGGAG (SEQ- ID 20)

B2M (p2- Mikroglobulin)

ACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACT (SEQ-ID 21) CTT CAAACCTCCAT GATGCT(SEQ- ID 22)

[0132] La especificidad fue verificada por analisis de la curva de fusion y la electroforesis en gel posterior. Para cada PCR, se determino la eficiencia de PCR y el valor CQ mediante el programa LinRegPCR y estos se utilizaron en los calculos adicionales. A partir de una pluralidad de genes de referencia, se determino que B2M (p2-microglobulina) era adecuada para las condiciones de investigation. Todos los resultados son resultados relativos en relation con las condiciones respectivas de control, en las que para el perlodo de tiempo especificado (es decir, 2 dlas, 7 dlas o 14 dlas) se administro un unico disolvente. En las Figuras 5A a 5I se muestra la expresion genica relativa (relativa a las condiciones de control) del correspondiente factor. Con ello, se muestra la exposition de 2 dlas en gris claro, la exposition de 7 dlas en gris oscuro y la exposicion de 14 dlas en negro. Cada valor de medicion a partir de las Figuras 5A - 5I representa una media de 3 muestras biologicas independientes.

[0133] La Figura 5A muestra la expresion genica relativa de la neurotrofina BDNF (brain-derived neurotrophic factor) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20pM, 30pM) o 9MpC (30 pM, 50pM, 70 pM). El comparar la expresion de BDNF despues de la exposicion a 30pM, 6F9M|3C o 9MpC, se muestra en estas concentraciones, que 6F9MpC lleva a una expresion de BDNF casi dos veces mayor que 9MpC.

[0134] La Figura 5B muestra la expresion relativa del gen de Lif (Leukemia inhibitory factor), que estimula la diferenciacion celular e inhibe la proliferation, despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM y 70 pM). Al comparar la expresion de Lif despues de la exposicion a 30pM de 6F9MpC o 9MpC, se muestra en esta concentration que 6F9MpC despues de una exposicion de solo 2 dlas conduce a una expresion de Lif casi tres veces mas alta como 9MpC. Incluso despues de 14 dlas de exposicion a 6F9MpC la expresion de Lif es aproximadamente dos veces mas alta en comparacion con 9MpC. Solo despues de una exposicion de 7 dlas respecto a 6F9MpC, la expresion de Lif parece algo menor en comparacion con 9MpC. La alta expresion a concentraciones mas bajas de 6F9MpC tambien es notable.

[0135] La Figura 5C muestra la expresion genica relativa de la neurotrofina NT3 (neurotrofina 3) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30pM, 50 pM, 70 pM). Al comparar la expresion de NT-3 despues de la exposicion con 30pM, 6F9MpC o 9MpC, se muestra a esta concentracion, que 6F9MpC conduce a una expresion de NT-3 casi 3,5 veces mas alta despues de 14 dlas de exposicion como 9MpC. La alta expresion de NT-3 a concentraciones mas bajas a 6F9MpC tambien es notable, especialmente despues de la exposicion de 7 dlas a solamente 10pM6F9MpC.

[0136] La Figura 5D muestra la expresion genica relativa de Id2 (Inhibitor of Differentiation 2), la cual inhibe la diferenciacion celular y por lo tanto promueve la proliferacion. Tambien se informo de que los ratones en los que el gen se habia desactivado, mostraron sintomas neurodegenerativos. La expresion genica relativa de Id2 tras 2 dias, 7 dias y 14 dias de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50pM, 70 pM). Al comparar la

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expresion de Id2 despues de la exposicion a 30pM 6F9MC o 9MpC, se muestra en esta concentration, que 6F9MpC conduce a una expresion de Id2 casi dos veces a 3,5 veces tan alta, como 9MpC. La expresion alta de Id2 a concentraciones reducidas de 6F9MpC tambien es notable.

[0137] La Figura 5E muestra la expresion genica relativa del neuroprotector BTG2 (B-cell translocacion gene 2) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM, 70 pM). Al comparar la expresion de BTG2 despues de la exposicion a 30pM 6F9MpC o 9MpC, se muestra a esta concentracion que 6F9MpC conduce a una expresion aproximadamente 1,25 veces a 2,7 veces mayor de BTG2, como 9MpC. Ademas, es notable que en 10pM 6F9MpC se calcula una expresion comparable de BTG2, como en la mayor concentracion de 9MpC (excepto despues de una exposicion de 2 dlas).

[0138] La Figura 5F muestra la expresion genica relativa del neuroprotector de CBLN (Cerebellin 1 precursor Protein) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20pM y 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50pM y 70 pM). Al comparar la expresion de CBLN despues de la exposicion a 30pM 6F9MpC o 9MpC, se muestra a esta concentracion que 6F9MpC conduce a una expresion mas alta de aproximadamente 1,5 veces de CBLN como 9MpC (excepto despues de 2 dlas de exposicion). A tan solo 20pM 6F9MpC, la expresion de CBLN parece ser incluso mas alta.

[0139] La Figura 5G muestra la relation entre la expresion genica de Bax y Bcl-2, que cuenta como marcadores de apoptosis, despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM, 70 pM). Cuanto menor sea el cociente de Bax/Bcl-2, cuanto menos apoptosis. Al comparar el cociente Bax/Bcl-2 despues de la exposicion a 30pM 6F9MpC o 9MpC, esto es, despues de 6F9MpC, significativamente menor que despues de 9MpC (excepto despues de la exposicion de 2 dlas). Tambien es notable el bajo cociente de Bax/Bcl-2 a concentraciones mas bajas de 6F9MpC.

[0140] La Figura 5H muestra la expresion genica relativa de DRD2S (Variante corta de receptor de dopamina de subtipo 2) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20 pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM, 70 pM). Al comparar la expresion de DRD2S despues de la exposicion a 30pM 6F9MpC o 9MpC, se muestra a esta concentracion que 6F9MpC a los 2 dlas y 14 dlas de exposicion conduce a una mayor expresion de DRD2S como 9MpC y despues de 7 dlas de exposicion conduce a una menor expresion de DRD2S como 9MpC. A concentraciones mas bajas de 6F9MpC la expresion de DRD2S despues de 7 dlas de expresion parece comparable a la despues de 9MpC.

[0141] La Figura 5I muestra la expresion genica relativa del factor DKK1 (Dickkopf-related Protein 1), el cual es de importancia para la diferenciacion de las celulas nerviosas y tambien juega un papel en traumas en celulas sensoriales de acuerdo con el conocimiento actual, despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 6F9MpC (10 pM, 20pM, 30 pM) o 9MpC (30 pM, 50 pM, 70 pM). Al comparar la expresion de DKK1 despues de la exposicion con 30pM 6F9MpC o 9MpC, como es particularmente evidente a exposiciones reducidas (2 dlas y 7 dlas) que 6F9MpC conduce a una expresion aproximadamente 1,4 veces a 2,7 veces mas alta de DKK1 como 9MpC. A los 14 dlas de exposicion, los valores son comparables. Es de destacar tambien que, incluso a 10pM 6F9MpC, se describe una expresion de DKK1 que es comparable, que la mayor concentracion de 9MpC.

[0142] En general, por lo tanto, se muestra que 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la invention tiene un efecto ventajoso con respecto a 9-metilo-p-carbolina en practicamente todos los factores celulares investigados que afecten directa o indirectamente la diferenciacion y proliferation de las celulas y por lo tanto una regeneration de tejidos despues de trauma, con respecto al estado de la tecnica. De particular interes son los factores de BDNF y Lif, que estan entre los factores mas importantes para los procesos de reparation celular despues de un traumatismo en el oldo interno. Segun la invencion 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina por lo tanto tiene el potencial, no solo para utilizarse con exito en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno, sino tambien en una concentracion mas baja como metilo-p-carbolina segun el estado de la tecnica.

Ejemplo 5: experimentos RT-PCR II cuantitativos

[0143] De manera analoga al Ejemplo 4, se realizaron experimentos de RT-PCR con el ingrediente activo de la invencion 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina para algunos de los factores celulares importantes (7F9MpC). El procedimiento experimental en este caso era identico a los experimentos con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y 9- metilo-p-carbolina. Aqul tambien (como para 6F9MpC) se aplicaron concentraciones finales de 30 pM, 50pM y 70pM 7F9MpC en medios de cultivo. En los factores investigados se trata de BDNF (Brain-derived neurotrophic Factor), Lif (Leukemia inhibitory factor), DRD2S (variantes cortas del receptor de dopamina de subtipo 2) y DKK1 (Dickkopf- related Protein 1). Se empleo el mismo cebador que para los correspondientes genes diana en el Ejemplo 4 (Tabla 1). Como ya se ha mencionado, BDNF y Lif son factores particularmente importantes para los procesos de reparacion celular despues de un traumatismo en el oldo interno.

[0144] La Figura 6A muestra la expresion genica relativa de la neurotrofina BDNF (brain-derived neurotrophic factor) despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 7F9MpC (10 pM, 20pM, 30 pM). Al comparar la expresion de BDNF despues de la exposicion a 30pM 7F9MpC y con 30pM 9MpC (Fig. 5A), se muestra en una exposicion de 2

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dlas que 7F9MpC conduce a una expresion de BDNF tres veces mas alta como 9MpC. Para las exposiciones mas largas, los valores son comparables.

[0145] La Figura 6B muestra la relativa expresion genica de Lif (Leukemia inhibitory factor), que estimula la diferenciacion e inhibe la proliferacion celular, despues de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de exposicion a 7F9MpC (10 pM, 20pM, 30 pM). Al comparar la expresion Lif despues de la exposicion a 30pM 7F9MpC con 30pM 9MpC (Fig. 5B), lo que muestra en una exposicion de 2 dlas que 7F9MpC conduce a una expresion de Lif tres veces mas alta como 9MpC. A los 7 dlas de exposicion, la induccion por 7F9MpC es ligeramente mas debil que a traves de 9MpC y a los 14 dlas de exposicion, los valores son comparables. La alta expresion de Lif despues de 2 dlas de exposicion con 20pM 7F9MpC tambien es notable.

[0146] La Figura 6C muestra la relativa expresion de genes de DRD2S (variante corta de receptor de dopamina de subtipo 2) despues de exposicion a 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas a 7F9MpC (10 pM, 20pM, 30 pM). Al comparar la expresion de DRD2S despues de la exposicion a 30pM 7F9MpC con 30pM 9MpC (Fig. 5H), a continuation, se refleja en una exposicion de 2 dlas que 7F9MpC conduce a una expresion dos veces mas alta de DRD2S como 9MpC. A 7 dlas de exposicion, los valores son comparables y en la exposicion a 14 dlas, la induccion por 7F9MpC ligeramente es mas debil que a traves de 9MpC.

[0147] La Figura 6D muestra la expresion genica relativa del factor de DKK1 (Dickkopf-related protein 1), que es de importancia para la diferenciacion de las celulas nerviosas y tambien tiene un papel en el trauma de celulas, despues de exposicion de 2 dlas, 7 dlas y 14 dlas de 7F9MpC (10 pM, 20pM, 30 pM). Al comparar la expresion de DKK1 despues de la exposicion a 30pM 7F9MpC con 30pM 9MpC (Fig. 5I), se muestra en una exposicion de 2 dlas que 7F9MpC conduce a una expresion de dKK1 aproximadamente 1,4 veces mas alta como 9MpC. A 7 dlas de exposicion, los valores son comparables y a 14 dlas de exposicion, la induccion por 7F9MpC es aproximadamente 2,2 veces mayor que 9MpC.

[0148] En general, 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina en comparacion con 9-metilo-p-carbolina en el estado de la tecnica logra efectos superiores, especialmente con una exposicion corta. Una posible explication es que 7-fluoro-9-metilo- p-carbolina es mas lipofila que 9-metilo-p-carbolina y por lo tanto penetra mas rapidamente en las celulas, alcanzando rapidamente por lo tanto concentraciones mas altas en la celula. Desde un punto de vista terapeutico tales ventajas son, por supuesto, deseables, ya que permiten una duration eficiente y mas corta de tratamiento, que es por el bien del paciente. Desde el punto de vista terapeutico, 7-fluoro-9-metilo-p-carbolina es superior por lo tanto para el tratamiento de dano agudo del oldo interno tales como trauma acustico y perdida de audition aguda que 9- metilo-p-carbolina del estado de la tecnica.

Ejemplo 6: Experimentos inmunohistoqufmicos

[0149] En lo siguiente se debe examinar en cobayas sobre una base histologica como la administration de 9-metilo- p-carbolina (9MpC) o de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) afecta la muerte por trauma acustico de las celulas ciliadas externas (outer hair cells, OHC) en el oldo interno. Cabe mencionar en este punto que las celulas ciliadas internas (IHC) son menos sensibles en comparacion con cualquier trauma.

[0150] Para causar un trauma acustico se anestesiaron cobayas con 60 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilazina. Despues se aplico un unguento (Bayer) a los ojos y se coloco el animal en una camara insonorizada. Un altavoz calibrada se coloca directamente encima de la cabeza del animal, y esto se ajusto de modo que emitiera una banda de media octava a 8 kHz en un volumen de 110 dB durante un perlodo de 30 minutos.

[0151] 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina y 9-metilo-p-carbolina, envueltas en un hidrogel (18% Poloxamer 407, y 0,6% de alginato) estaban recien preparadas para cada experimento, y almacenadas hasta su uso a 4°C en el refrigerador.

[0152] La mezcla llquida termosensible se aplico directamente por medio de una jeringa Hamilton delante de la membrana de la ventana redonda del oldo medio (10 pL). La primera dosis de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (por ejemplo 0,07mg) se aplico una hora despues del trauma acustico (dla 0) a una concentration de 0,007 mg/pl y la segunda dosis de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (0,035mg en un volumen de 5pL) en el tercer dla. Con ello, solo se trato en cada caso un oldo por animal, mientras que el segundo oldo sirvio como control intra-individual. El control se abrevia en este documento en parte con "contr.". En experimentos de comparacion, se encontro que una simple transferencia del vehlculo farmaco (es decir, el hidrogel) en comparacion con una oreja completamente no tratada no tuvo ningun efecto. Para cada sustancia activa (incluyendo los controles), se estudiaron cuatro cobayas.

[0153] En el dla 14 despues del trauma acustico se preparo la region de la oreja, de modo que contenla la coclea. La preparation se suspendio en paraformaldehldo helado de 4% (PFA) durante 24 horas y se almaceno a + 4°C. Despues de la fijacion de PFA, se enjuago la preparacion 2 veces 5 minutos con solution salina tamponada con fosfato (PBS) y despues se coloca en un 10% de acido tetraacetico de etilendiamina (EDTA) para la descalcificacion. Despues de al menos 48 horas, se enjuago la preparacion dos veces con PBS y despues se extrajo la coclea. Todo el organo de Corti, que contiene las celulas sensoriales, se extrajo de la coclea y se corto en cuatro secciones iguales. Cada una de las secciones corresponde al organo de Corti de un tercio de una espira coclear. De esta

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manera, el dano inducido por sonido puede ser localizado y cuantificado. Las secciones se colocaron durante 10 minutos en PBS que contiene 2% de albumina de suero bovino (BSA) y (con Alexa Fluor® 488-faloidina etiquetada (Invitrogen, n° de catalogo A12379) en una dilucion 1:40. Despues de ello, las secciones se lavaron tres veces durante 10 minutos con PBS y se colocaron sobre un portaobjetos de microscopio. Una gota Pro Long DAPI, que comprende el medio de fijacion (Invitrogen, n° de cat P36935), se anadio a las secciones, las cuales se cubrieron con un cubreobjetos. Posteriormente se sello la preparacion con esmalte. Se hicieron imagenes de las secciones con un microscopio de fluorescencia (Keyence) con una ampliacion de 40 veces. Las Figuras 7 y 8 muestran resultados representativos de los estudios de cuatro cobayas.

[0154] Se encontro en los controles no tratados (vease la Fig. 7A y la Fig. 8A), que se llevo por trauma acustico a una muerte aguda de celulas ciliadas externas. Esta muerte podrla evitarse por administracion intratimpanica de solo un total de 0,105 mg de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (vease Fig. 7B). Ademas, la administracion de 9-metilo-p- carbolina podrla prevenir la muerte de celulas ciliadas externas (vease la Fig. 8B), con lo que require una dosis significativamente mayor (un total de 0,2 mg de 9-metilo-p-carbolina) que en la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la invencion. Por consiguiente, la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la invencion no solo es adecuado para el tratamiento de perdidas de audicion, sino tambien es mas eficiente que 9-metilo-p-carbolina en el estado de la tecnica.

Ejemplo 7: potenciales auditivos evocados

[0155] En lo siguiente, se deberla investigar el efecto de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) y de 9-metilo-p- carbolina (9MpC) en el cambio del umbral de la audicion inducido por el trauma acustico en el modelo de cobaya.

[0156] Para provocar un trauma acustico los cobayas se anestesiaron con 60 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilazina. Entonces se aplico unguento (Bayer) a los ojos y se coloco el animal en una camara insonorizada. Un altavoz calibrado se coloca directamente encima de la cabeza del animal, y esto se ajusto de modo que emite una banda de media octava a 8 kHz en un volumen de 110 dB durante un perlodo de 30 minutos.

[0157] Como medida para evaluar el umbral de audicion en cobayas se midieron potenciales evocados auditivos. Para este proposito, la actividad electrofisiologica de las celulas nerviosas en el tronco cerebral, la cual reenvla los pulsos desde el oldo interno, se derivo despues de la sonicacion de la oreja con 8, 11,3, 16, 22,6 y 32 kHz. El sonido siguio en orden ascendente desde 0 dB a 90 dB en pasos de 5 dB.

[0158] La medicion se realizo 3 dlas antes del trauma acustico (D-3), 30 minutos despues del trauma acustico (D0) y 14 dlas despues del trauma acustico (D14).

[0159] En cada animal, un oldo no se trato, y se utilizo como control intra-individual (abreviado en el presente documento tambien con "contr.") y la segunda oreja se trato con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina. Para este proposito, una hora despues del trauma acustico, se administro una dosis de 0,12 mg de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (en un hidrogel como vehlculo) intratimpanico. 3 dlas despues del trauma acustico tiene lugar una nueva administracion intratimpanica de 0,06 mg de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina. Las mediciones se realizaron a cuatro cobayas (n = 4).

[0160] En los experimentos de comparacion, se encontro que una simple transferencia del vehlculo de farmaco (es decir, los geles hidro) en comparacion con una oreja completamente no tratada no tuvo ningun efecto.

[0161] Posteriormente, a partir de los valores medidos antes de la determinacion del trauma acustico (D-3) y despues de 14 dlas (D14), se determino el desplazamiento restante del umbral de audicion (tambien denominado desplazamiento permanente del umbral de audicion). A partir de los valores medidos directamente despues del trauma acustico (D0) y despues de 14 dlas (D14) se determino tambien la recuperacion del trauma (D0 D14).

[0162] Se encontro que con respecto a la perdida de la audicion que queda despues de 14 dlas (vease Fig. 9), la administracion de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (en total 0,18 mg) conduce a una reduccion significativa del umbral de audicion en comparacion con el control no tratado. Particularmente a una frecuencia sonica de 11,3 kHz y 16, se mostro por 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina una reduccion en el umbral de audicion a alrededor de 20 dB o 30 dB.

[0163] Ademas, con respecto a la recuperacion del trauma acustico (vease Fig. 10) la recuperacion podrla mejorarse significativamente mediante la administracion de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (0,18 mg total) en comparacion con el control no tratado. Por lo tanto, con frecuencias de sonido de 8, 11,3 o 16 kHz se podrla lograr una recuperacion mejorada por aprox . 5 dB, 25 dB y 20 dB por 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la invencion en comparacion con la oreja no tratada.

[0164] De manera similar a los experimentos anteriores llevados a cabo con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina se realizaron tambien experimentos con 9-metilo-p-carbolina. El procedimiento experimental era practicamente identico, excepto, por supuesto, 9-metilo-p-carbolina en lugar de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina. La dosis total de 9-metilo-p- carbolina en este caso era de 0, 2 mg o 0,35 mg por oldo.

[0165] Ademas, 9-metilo-p-carbolina del estado de la tecnica promovio la recuperacion en comparacion con el

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control no tratado (vease la Fig. 11 y 12). En comparacion con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina, sin embargo se mostro un aumento relativamente ligero en la dosis de 0,2 mg (vease la Fig. 11) solamente una mejora en la recuperacion de aproximadamente 5 dB hasta un maximo de 10 dB. Tambien en un aumento de la dosis adicional de 0,35 mg de 9-metilo-p-carbolina (dos veces tan alta como la de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina) se evidencio solamente una mejora de aproximadamente 10 dB (vease la Fig. 12).

Ejemplo 8: Degradacion en el hfgado a productos de degradacion toxicos

[0166] En lo siguiente debe examinarse si 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) de la invencion se metaboliza en el hlgado a conocidos productos de degradacion toxicos.

[0167] Respecto a p-carbolina se ha sabido desde hace mucho tiempo que esta se hace reaccionar en una reaccion catalizada de N-metiltransferasas a cationes de p-carbolinio metilados. Estos tienen algunas propiedades toxicologicas con 1 -metilo-4-fenilpiridinio (MPP+, tambien conocido como neurotoxina Parkinson), ya que pueden inhibir la respiracion mitocondrial, entre otras cosas, y son neurotoxicas. Particularmente toxicos aqul son los cationes p-carbolinio dimetilados, es decir, 2,9-dimetilo-p-carbolinio-cationes. Estos se forman por metilacion secuencial en la posicion 2 y 9. Por lo tanto, debe examinarse a continuacion si la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) de la invencion se convierte en el hlgado a las correspondientes toxinas 6-fluoro-2,9-dimetilo-p-carbolinio- cationes (directamente derivados de 6F9MpC) y 2,9-dimetilo-p-carbolinio-cation (derivado de 9MpC).

[0168] Para poder identificar estas sustancias por medio de HPLC, se sintetizaron tanto 6-fluoro-2,9-dimetilo-p- carbolinio-cation (6F29DMpC) como tambien 2,9-dimetilo-p-carbolinio-cation (29DMpC) en el sitio y los correspondientes tiempos de retencion se determinaron por las mediciones de HPLC de referencia. Igualmente se realizo una medida de referencia con 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina pura (6F9MpC).

[0169] Para simular el proceso de degradacion en el hlgado, diversas concentraciones (1 pM, 10pM y 100 pM) de 6- fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) se incubaron durante una hora en condiciones fisiologicas (37°C en solucion de salina de fosfato tamponada fisiologica, PBS) con el hlgado homogeneizado de la rata. Finalmente, tuvo lugar una medicion HPLC de un extracto filtrado.

[0170] La caracterizacion de las respectivas sustancias se llevo a cabo por cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC, a veces denominada cromatografla llquida de presion alta). En la HPLC, el eluyente consistio en 45% de 90% de acetonitrilo y 55% de acetato de amonio (40 mM, pH <5) era. El caudal era de 0,4 ml/min y el volumen de inyeccion era de 10pL. Cada muestra se diluyo con metanol al 60%, siempre que la senal era demasiado fuerte. Asl, por ejemplo, la muestra del homogeneizado de hlgado tuvo que diluirse antes de la medicion 1:40, para estar en el rango dinamico del metodo analltico.

[0171] Para 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) no tratada, se midio un tiempo de retencion de 19,0 minutos (vease la Fig. 13A), mientras que las mediciones de referencia para 6-fluoro-2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (6F29DMpC) mostraron un tiempo de retencion de 10,1 minutos (vease la Fig. 13C) y para 2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (29DMpC) exhibio un tiempo de retencion de 9,1 minutos (vease la Fig. 13D). Por lo tanto las muestras de referencia mostraron tiempos de retencion claramente separables. La 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina incubada con homogeneizados de hlgado de la rata (100 pM) mostro el pico a los 19,0 minutos (es decir, 6F9MpC), pero no hay picos para 6-fluoro-2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (6F29DMpC) o 2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (29DMpC). Las concentraciones mas bajas tambien ensayadas de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (1pMy 10 pM) mostraron resultados identicos.

[0172] Se puede concluir que 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina de la invencion bajo las condiciones dadas afortunadamente no se metabolizan a productos de degradacion toxicos conocidos.

[0173] En lo siguiente, se describe brevemente la slntesis para los cationes de referencia 6-fluoro-2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (6F29DMpC) y 2,9-dimetilo-p-ion de carbolinio (29DMpC).

[0174] Para la slntesis de 6F29DMpC se anade 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (base libre) en 3 mL de acetonitrilo 200 mg (es decir, 1,4 mmol) de metilo yoduro a una solucion de 50 mg (es decir, 0,25 mmol). La mezcla de reaccion se agita en atmosfera de nitrogeno durante 24 horas a temperatura ambiente. Los disolventes despues se inflan bajo una corriente de nitrogeno. El residuo amarillo fluorescente se recristaliza en acetonitrilo. Rendimiento: 53 mg (es decir, 15 mmol) 60%.

[0175] Para la slntesis de 29DMpC se anadio a una solucion de 50 mg (es decir, 0,27 mmol) 9-metilo-p-carbolina (base libre) en 3 mL de acetonitrilo de 200 mg (es decir, 1,4 mmol) de yoduro de metilo. La mezcla de reaccion se agito bajo nitrogeno durante 24 horas a temperatura ambiente. Los disolventes despues se inflaron bajo una corriente de nitrogeno. El residuo amarillo fluorescente se recristalizo en acetonitrilo, se filtro y se seco a vaclo. De rendimiento: 43 mg (es decir, 13 mmol) 48%.

Ejemplo 9: 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina mejora el aprendizaje y la memoria

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[0176] Los mecanismos de aprendizaje y memoria subyacentes son extremadamente complejos. Se pueden ver a nivel molecular y celular, a nivel de la biologia de sistemas y la psicologia. Uno de los procesos clave para la formacion de la memoria a nivel molecular es la activacion del cAMP response element binding proteins (CREB). Esto conduce a la formacion de sinapsis, un proceso al que esta vinculado en general la formacion de la memoria. Este proceso es regulado por muchos factores. Un refuerzo positivo inducido por el brain derived neurotrophic factor (BDNF) y su receptor TrkB. Por lo tanto, se debe investigar al nivel celular, la 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) de la invencion.

[0177] Hemos encontrado en nuestras investigaciones a nivel celular que 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) incrementa la concentracion de CREB por un factor de 8 e incrementa la concentracion de BDNF hasta tres veces. Estos descubrimientos sugieren que 6F9MpC promueve el aprendizaje y la memoria. Esta hipotesis se puso a prueba en el siguiente experimento.

[0178] En un laberinto de ocho brazos el efecto de 6F9MpC en el comportamiento de aprendizaje se puso a prueba. Ratas macho de 5 meses de edad fueron utilizadas en sesiones diarias durante 10 dias en el experimentador. Despues, eran capaces de explorar el laberinto durante 2 dias y tambien aprendieron que recibieron una recompensa de comida alli. Posteriormente, se coloco una recompensa de comida en cada extremo de los 8 brazos del labarinto y se instalo una camara que registro cada movimiento del animal. En el primer dia de la prueba, se coloco la rata sin inyeccion en la plataforma en el centro del laberinto. Al dia siguiente, se administro a la rata por via intraperitoneal por el experimentador 2 mg/kg de peso corporal de 6-fluoro-9-metilo-p-carbolina (6F9MpC) como base libre disuelta en solucion salina fisiologica. 2 horas despues, el animal se coloco en la plataforma en el centro del laberinto, desde donde tenia acceso a todos los brazos. Este procedimiento se repitio todos los dias hasta que el animal cometio un maximo de un error, p.ej. entro en un brazo, al cual ya habia accedido en la correspondiente sesiones. Al final de la sesion, los ocho brazos habian sido visitados.

[0179] Se investigaron 12 ratas, a los que se administro 6F9MpC y un grupo control de 12 ratas que solamente habian recibido solucion salina. El grupo de farmacos (que ha recibido 6F9MpC) alcanzo el criterio despues de 6 dias y el grupo de control despues de 14 dias. La diferencia se comprobo por ANOVA para mediciones repetidas y era significante (p <0,01). Estos resultados muestran claramente que 6F9MpC acelera el aprendizaje y mejora la memoria. Asi pudimos comprobar nuestra hipotesis.

[0180] Esto demuestra que el ingrediente activo 6F9MpC es eficaz no solo para los trastornos del oido interno, pero tambien tiene una influencia favorable en comportamientos complejos como el aprendizaje y la memoria.

Referencias

[0181]

1. ) Application of high-performance liquid chromatography based measurements of lipophilicity to model biological distribution. Valko K Journal of Chromatography A 2004;1037 (1-2): 299-310.

2. ) The levels of norharman are high enough after smoking to affect monoamineoxidase B in platelets. Rommel- spacher et al., Eu J Pharmacol 2002;441 (1-2): 115-125.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0182]

<110> Audiocure Pharma GmbH <120> Fluoro-9-metil-B-carbonilo <130> AUD-P03632WO <160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para BDNF

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ggatgaggac cagaaagt 18

<210>2 <211> 19 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para BDNF <400> 2

agcagaaaga gaagaggag 19

<210> 3 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para Lif <400> 3

ccaacaacct ggacaagcta tg 20

<210> 4 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para NT3 <400> 4

gtggcgttga gcttgctgtg 18

<210> 5 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para Id2 <400> 5

cggagcataa gagtcacc 20

<210> 6 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para Id2 <400> 6

cctggcttcc ttacatcg 18

<210> 7 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para Id2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<400>7

catcctgtcc ttgcaggctt 20

<210> 8 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para Id2 <400> 8

ccattcaact tgtcctcctt gtg 23

<210> 9 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para BTG2 <400> 9

caggaggcac tcacagagca 20

<210> 10 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para BTG2 <400> 10

aatgcggtag gacacctcat a 21

<210> 11 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para Cbin <400> 11

caagtgcctg gtggtgt 17

<210> 12 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para Cbln <400> 12

gttcactagt acctggtcga agtag 25

<210> 13 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> Cebador directo para DRD2S <400> 13

ggactcaata acgcagacca gaa 23

<210> 14 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para DRD2S <400> 14

cgggcagcct cctttagt 18

<210> 15 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para DKK1 <400> 15

cattgacaac taccagccgt 20

<210> 16 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para DKK1 <400> 16

atcagaagac acacatattc catt 24

<210> 17 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para Bax <400> 17

gatgattgcc gccgtggaca 20

<210> 18 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para Bax <400> 18

caccttggtg cacagggcct t 21

<210> 19 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> Cebador directo para Bcl2 <400> 19

gtgtggagag cgtcaacc 18

<210> 20 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para Bcl2 <400> 20

cttcagagac agccaggag 19

<210> 21 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador directo para B2M (referencias) <400> 21

actggtcttt ctatctcttg tact 24

<210> 22 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador inverso para B2M (referencias) <400> 22

cttcaaacct ccatgatgct 20

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Los compuestos de formula general (I)

   imagen1

   donde

   R1 es -F y R2 es -H o -F, o R1 es -H y R2 es -F;

   as! como sales farmacologicamente aceptables, solvatos e hidratos de los compuestos antes mencionados.
2. 2. Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que R1 es -F y R2 es -H.
3. 3. Procedimiento para preparar un compuesto segun la reivindicacion 1, que comprende las pasos siguientes:

   a) Reaccion del material de partida de formula general (II) bajo adicion de hidrato de acido glioxllico de la formula (III) y una base a un compuesto de formula general (IV)

   imagen2

   b) Descarboxilacion del compuesto de formula general (IV) bajo adicion de un acido y bajo calentamiento a un compuesto de formula general (V)

   imagen3

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   c) Aromatizacion del compuesto de formula general (V) a un compuesto de formula general (I) bajo adicion de un catalizador

   donde

   R1 es -F y R2 es -H o -F, o R1 es -H y R2 es -F.
4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado porque el catalizador utilizado en el paso c) es Pd/C.
5. 5. Compuesto segun la reivindicacion 1 o 2 para uso como medicamento.
6. 6. Compuesto segun la reivindicacion 1 o 2 para uso en el tratamiento de enfermedades y/o danos en el oldo interno.
7. 7. Compuesto para uso segun la reivindicacion 6, caracterizado porque las enfermedades y/o los danos del oldo interno son enfermedades agudas del oldo interno, seleccionadas del grupo que comprende traumatismo por explosion, lesion por explosion del oldo, perdida de audicion e trauma de insercion,
8. 8. Compuesto para uso segun la reivindicacion 6, caracterizado porque las enfermedades y/o danos del oldo interno son enfermedades cronicas del oldo interno, seleccionadas del grupo que comprende trauma acustico cronico, tinnitus y presbiacusis.
9. 9. Compuesto para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 6 - 8, caracterizado porque el dano del oldo interno es causado por sustancias ototoxicas.
10. 10. Composicion farmaceutica en forma de gotitas, unguentos, aerosoles, liposomas, geles, emulsiones o soluciones de inyeccion que contienen al menos un compuesto segun la reivindicacion 1.