ES2624177T3 - Plataformas de cultivo celular potenciadas en oxigeno - Google Patents

Abstract

Un aparato de cultivo de células y de tejidos que comprende: un dispositivo de cultivo de tejidos que contiene una barrera de membrana permeable a los gases e impermeable a los líquidos que comprende una composición de silicona impregnada o mezclada con perfluorocarbonos; miembros de soporte que se extienden desde la parte inferior, lateral o superior del dispositivo de cultivo de tejidos para elevar el dispositivo de cultivo de tejidos para permitir el flujo de aire; y una bandeja o matraz de cultivo que comprende el dispositivo de cultivo de tejidos, en el que la barrera de membrana impermeable a los líquidos define una superficie continua del dispositivo de cultivo de tejidos y permite la oxigenación y minimización de la hipoxia en las células en reposo sobre la misma.

Description

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Descripción

Plataformas de cultivo celular potenciadas en oxígeno

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a un aparato y métodos para cultivar células o cultivos de tejidos in vitro. Más

5 particularmente, la presente invención se refiere a un aparato de cultivo celular que contiene al menos una membrana permeable a los gases que permite una transferencia rápida, mejorada y uniforme de oxígeno entre el entorno de células contenidas en el aparato contenedor del cultivo celular y la atmósfera de la incubadora, en la que se incuba el aparato de cultivo celular.

Antecedentes de la invención

10 En los sistemas de cultivo de células eucarióticas, el cultivo de las células está generalmente bajo condiciones controladas de pH, temperatura, humedad, osmolaridad, concentraciones iónicas e intercambio de gases. Respecto a este último, el oxígeno y el dióxido de carbono (CO2) son de particular importancia para el cultivo de células. En los sistemas de cultivo de células eucariotas típicos, se proporciona una incubadora en la que se infunde CO2 para mantener una atmósfera de aproximadamente 5% de CO2 dentro de la incubadora. El CO2 interactúa con el medio

15 de cultivo de tejidos, particularmente su sistema tampón, manteniendo el pH cerca de los niveles fisiológicos. Los recipientes de cultivo de células convencionales comprenden frascos de cultivo de tejidos, botellas de cultivo de tejidos y placas de cultivo de tejidos. La entrada de CO2 desde la atmósfera de la incubadora en una placa de cultivo de tejidos generalmente implica una cubierta de ajuste holgada que sobresale de la placa para excluir que los contaminantes en partículas entren en la cámara o las cámaras de la placa, pero permite el intercambio de gas entre

20 la atmósfera de la incubadora y la atmósfera dentro de las placas del cultivo de tejido. De manera similar, para los frascos o botellas de cultivo de tejidos, una tapa de ajuste suelto excluye los contaminantes en partículas que entran en la cámara del frasco o de la botella, pero permite el intercambio de gases entre la atmósfera de la incubadora y la atmósfera dentro del matraz o de la botella. Más recientemente, se proporciona una tapa con una membrana o filtro permeable a los gases, permitiendo de este modo el intercambio de gases con una tapa ajustada herméticamente.

25 Además del CO2, el cultivo de células depende de la capacidad de suministrar a las células una cantidad suficiente de oxígeno necesaria para la respiración celular y la función metabólica. El suministro de oxígeno para la respiración celular en recipientes convencionales de cultivo celular está en el espacio de cabecera del recipiente, por ejemplo, el espacio vacío en el recipiente que está por encima de la superficie del medio de cultivo de tejidos. Los esfuerzos para aumentar la concentración de oxígeno en las células cultivadas incluyen la agitación mecánica, la perfusión o

30 aireación del medio, el aumento de la presión parcial de oxígeno y/o el aumento de la presión atmosférica, así como el uso de un sustrato de cultivo celular preparado a partir de una mezcla de un perfluorocarbono, un perfluoroaldehído y un factor de adhesión (documento WO 02/44341 A2). Por lo tanto, en recipientes de cultivo de células convencionales, el volumen o la superficie proporcionada para el intercambio gaseoso, en relación con el volumen o las superficies del recipiente entero, se utiliza ineficientemente y/o da como resultado la limitación de la velocidad de

35 intercambio gaseoso o el equilibrado de gases. Esto es aún más notable en cultivos de pequeña escala (15 ml o menos) en los que la tasa de crecimiento celular, la densidad celular y el número total de células son frecuentemente bajas debido al espacio, la superficie y las limitaciones del intercambio gaseoso. También hay pruebas de que los niveles subóptimos de oxígeno a través de los tejidos precursores in vitro resultan en un menor grado de diferenciación.

40 Los niveles variables de oxígeno en las células madre embrionarias cultivadas, por ejemplo, determinan si proliferarán o se diferenciarán. También se ha observado una clara relación entre la oxigenación y la diferenciación en las células madre endoteliales y mesenquimatosas. En otro sistema in vitro, los inventores han demostrado que la diferenciación de las células beta pancreáticas in vitro es muy potenciada por el oxígeno. Esto es consistente con la observación de que la segunda y más significativa onda de especificación de células beta durante el desarrollo

45 embrionario (transición secundaria) es concurrente con el inicio del flujo sanguíneo dentro de los brotes pancreáticos. Existe, por lo tanto, una necesidad en la técnica de proporcionar sistemas de cultivo de tejidos en los que la liberación de oxígeno se mejore o se ajuste dependiendo del establecimiento del cultivo, la proliferación, la diferenciación y/o la viabilidad.

Sumario

50 Se describe un aparato que proporciona una liberación mejorada de oxígeno a las células en plataformas convencionales de cultivo estático a través de la modificación de sistemas de cultivo convencionales en los que se produce difusión de oxígeno en ambos lados del recipiente de cultivo, arriba y abajo. También se proporciona una composición de membrana permeable a los gases.

En recipientes de cultivo típicos, hechos de plásticos estables, relativamente impermeables a los gases tales como

55 poliestireno o polipropileno, las células descansan sobre la superficie de plástico inferior y están cubiertas por una profundidad de medio dada para permitir una oxigenación adecuada del aire por encima de la capa de medio. Este sistema está lejos de ser ideal porque la capa de célula/medio forma rápidamente gradientes de oxígeno agudos dependiendo de la densidad de la siembra y de la tasa de consumo de oxígeno del tejido cultivado. Esto conduce al

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cultivo puede incubarse en porcentajes variables de CO2, CO, NO, O3, H2S o cualquier otra composición de gas considerada apropiada para el crecimiento, la viabilidad o la diferenciación celular. Por ejemplo, incubadoras con aproximadamente de 1% a 100% de O2, y/o cámaras hiperbáricas.

La tapa o los medios de cierre de la bandeja pueden ser de cualquier conformación o forma incluyendo, pero sin limitarse a, una tapa roscada o una tapa a presión. Los medios de tapa/cierre están dimensionados para adaptarse a la bandeja. Además, los medios de cierre pueden estar construidos a partir de cualquier material incluyendo, pero sin limitarse a, plástico. En una realización preferida, los medios de cierre pueden contener un filtro de aire de manera que el filtro de aire no permita el paso de microorganismos, células, virus o cualquier contaminante dentro o fuera del dispositivo de cultivo de células. Los filtros de aire de esterilización son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Millipore, Mass.

En otra realización preferida, el aparato y los pocillos de cultivo de células/tejidos pueden configurarse según las necesidades del usuario. Por ejemplo, en una realización, el conjunto está configurado en una placa de cultivo tisular típica. Otras configuraciones incluyen placas de 6 pocillos, placas de 12 pocillos, placas de 24 pocillos, placas de 96 pocillos y similares. Otras configuraciones incluyen matraces de cultivo de tejidos, recipientes para el transporte de órganos, especialmente aquellos órganos para uso en el trasplante de órganos, botellas de rodillo para cultivar grandes volúmenes de células, bolsas y similares.

Bolsas de silicona PFC: La mezcla PFC/silicona se inyecta a alta presión en un molde de acero inoxidable (fabricado previamente por mecanizado CNC) que es el inverso del objeto deseado, en este caso una bolsa. El molde comprende una porción interna sólida de la bolsa, un canal delgado para la inyección del material al espesor deseado de la membrana y un bloque exterior final que servirá para mantener el material con el espesor deseado durante el proceso de curado. El molde está hecho generalmente de dos piezas, el núcleo y la cavidad, que permite que la pieza sea extraída después del moldeo por inyección. Una vez que la mezcla ha curado, puede ser retirada del molde por una serie de pasadores integrados en el molde antes de la fabricación, o por expulsión de aire a través de canales cortados en el molde. Las bolsas de silicona PFC se pueden hacer a cualquier espesor deseado utilizando esta técnica.

Moldeo por compresión de prototipos de PFC/Silicona: En un ejemplo, se fabricó una cavidad de molde de un bloque de acero inoxidable con un canal circular de 8 mm de profundidad y un espesor de 6 mm. Se perforaron orificios de inyección de aire a lo largo del lado del canal para permitir la retirada del molde. Éste se colocó dentro de las cerraduras de tornillo de una máquina de moldeo por compresión y se bloqueó enrasado con la superficie principal de la máquina de moldeo. Sobre la cavidad y sobre la superficie de la máquina de moldeo por compresión, se vertió la mezcla de PFC/silicona en exceso, y se colocaron unos calzos de acero inoxidable de 300 micrómetros a lo largo de los lados de la superficie de moldeo apical (superficie de compresión hidráulica). La superficie superior, que es simplemente una gran superficie de acero inoxidable de aproximadamente 24"x 24" (0,6096 m x 0,6096 m), se comprimió hasta el nivel de los calzos y el material se dejó curar durante tres horas a 37ºC. Al final del período de tres horas, se liberó el compresor, se elevó la superficie apical y se inyectó aire en los orificios liberando una placa de silicona sólida con una membrana de fondo de 300 micrómetros.

En una realización preferida, el aparato comprende 96 pocillos y es del mismo tamaño que los típicamente usados para los ensayos.

En otra realización preferida, los pocillos de cultivo de tejidos pueden comprender un inserto separable en el que la única pieza del pocillo comprende la barrera de membrana, similar a la arquitectura de transpocillos. Por ejemplo, la porción del pocillo del cultivo de tejido utilizada para ayudar al crecimiento de células que comprende la membrana PFC/Si, está fijada de forma desmontable a la parte del dispositivo usada para suspender la membrana dentro de un pocillo que contiene medio de crecimiento. Esta disposición permite una fácil manipulación de las células cultivadas.

En esta configuración, el dispositivo de cultivo de tejidos comprende un transpocillo de dos piezas que tiene dos componentes, un elemento de retención de células y un colgador para suspender el elemento de retención de células dentro de un pocillo. El elemento de retención está fijado de forma desmontable a la parte inferior del colgador. El elemento de retención de células incluye la superficie de la membrana PFC/Si. El colgador está construido y dispuesto de tal manera que puede estar suspendido desde la periferia del pozo, con una porción inferior del colgador que se extiende dentro del pozo. Cuando el colgador está suspendido de la periferia del pozo, el elemento de retención está suspendido horizontalmente dentro del pozo.

En otra realización preferida, el elemento de retención comprende elementos sobresalientes o elevadores.

En una realización, el elemento de retención está asegurado al fondo del colgador mediante un ajuste por fricción. En otra realización, el elemento de retención está asegurado al fondo del colgador mediante un ajuste por fricción pero en una orientación invertida en comparación con la de la primera realización. En otra realización más, el elemento de retención está colgado del colgador.

El colgador incluye preferiblemente una pestaña que se extiende hacia fuera que está escalonada de modo que pueda colgarse sobre el extremo superior de un pocillo en un plato de grupo de cultivo de tejidos. La pestaña escalonada impide que el colgador se desplace lateralmente dentro del pocillo, manteniendo de este modo la pared

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Tradicionalmente, al menos con células independientes del anclaje, se ajustan las mayores necesidades de oxígeno mediante métodos de agitación mecánica y el rociado de gases en el cultivo. Sin embargo, tanto la agitación como el rociado de los gases pueden dar como resultado células dañadas, disminuyendo así la viabilidad del cultivo y la eficiencia y productividad totales del cultivo de células y/o tejidos. Además, el rocío directo de cultivos de células y tejidos con gas puede conducir a la producción de espuma, lo cual es también perjudicial para la viabilidad celular.

La presente invención supera estas deficiencias mediante un mejor aporte de oxígeno.

Como ejemplo ilustrativo que no pretende limitar o interpretar la invención de ninguna manera, se proporciona lo siguiente. Las formas de acero inoxidable fueron fabricadas por BioRep, Inc. de Miami, Florida, con las siguientes especificaciones: diámetro interior de 8,5 cm con una ranura biselada a lo largo de la cresta inferior a aproximadamente 300 micras desde el borde inferior para permitir que la silicona se cure en su lugar y se mantenga rápido. Estas formas se ajustaron dentro de un anillo exterior, también hecho de acero inoxidable, con tres pies a lo largo del borde exterior, para permitir el intercambio de gases a lo largo de la superficie inferior cuando se colocaba en una incubadora, manteniendo los pies la superficie inferior elevada sobre los estantes de acero inoxidable de la incubadora de cultivo. Otro dispositivo fue fabricado usando insertos de cultivo Millipore CM, eliminando los fondos de teflón permeables a los líquidos y reemplazándolos con silicona vertida/PFC. Sin embargo, cualquier forma de cultivo geométrico podría fabricarse eficazmente. El PFC/Silicona se preparó de la siguiente manera: se pesó silicona eléctrica Dow Corning RTV-615A (densidad 1,1 g/mL) para conseguir un volumen específico. A esto se añadió FC43 (corporación 3M) y se pesó (1,9 g/ml) de tal manera que el volumen añadido fue de 10% -20% el de la silicona y el catalizador que se añadiría posteriormente a una relación en porcentaje en volumen de 10 partes de silicona a 1 parte del catalizador. La mezcla de PFC-silicona enfriada con suspensión de hielo en una cónica de 50 ml se sonicó luego usando un sonicador de sonda a veinte segundos de intervalos de pulso, comenzando en la parte inferior de la cónica y moviendo gradualmente el sonicador hacia arriba hasta la parte superior de la cónica para dispersar homogéneamente la PFC en todas partes. Se realizaron intervalos de enfriamiento de cinco minutos después de cada minuto de sonicación. Lo que ocurre es la formación de una mezcla opaca blanca. La sonicación continúa hasta que ya no hay evidencia de separación de fases entre el PFC y la silicona y hasta que la dispersión es visiblemente uniforme. En este punto, la mezcla se agita en vórtice durante 1 minuto para homogeneizar más y luego se coloca en una cámara de desecación de vacío de vidrio para su desgasificación. La desgasificación se realiza mediante la eliminación al vacío de burbujas de aire de la mezcla de silicona, rompiendo el vacío cada cinco a diez minutos para romper las burbujas. Cuando ya no hay ninguna burbuja visible, la mezcla se retira de la cámara de desgasificación y el catalizador se añade añadiendo 10% de volumen a la mezcla. El catalizador es mucho menos viscoso que la suspensión de polímero y, por tanto, invirtiendo el tubo cuidadosamente durante varios minutos, el catalizador se dispersa bien a través de la mezcla de silicona. En este punto, las áreas de fondo abiertas de las formas están cubiertas con una superficie uniforme y tensa de Parafilm. A continuación, utilizando una pipeta de distribución de émbolo, que impide la adhesión de la silicona a lo largo del interior de las puntas de pipeta, se añade un volumen dado de la mezcla de silicona/PFC a la capa de parafilm para obtener el espesor de membrana deseado. Por ejemplo, en un plato de 8,5 cm se utiliza un espesor de membrana de 300 micrómetros, por lo que el volumen añadido sería πr2h, o 0,03*(π)*(4,25)2 o 1,7 ml. Este volumen se distribuye entonces uniformemente a través de la superficie girando el plato y permitiendo que la silicona se disemine y cubra completamente el Parafilm. A continuación, se deja reposar el plato que distribuye adicionalmente la mezcla de silicona uniformemente a medida que se asienta a lo largo de la superficie. Una vez que esto se completa, el plato entero se coloca en una incubadora

o estufa a 45ºC para curar durante la noche. El curado se produce dentro de las 6 horas, pero para asegurar el curado completo, las placas se curaron durante aproximadamente 18 horas antes de utilizar los dispositivos. Una vez curados, los dispositivos pueden esterilizarse en autoclave para asegurar la esterilidad antes de usarlos en cultivo celular, aunque con los insertos más pequeños, las placas se remojaron en etanol al 70% durante varias horas antes de su uso.

Ejemplos

Ejemplo 1: Plataformas de cultivo celular de alto contenido en oxígeno de silicona perfluorada

Los fondos del inserto del cultivo se modificaron con una matriz de silicona altamente permeable impregnada con perfluorocarbono en un porcentaje de volumen/volumen dado. Esta combinación proporciona un depósito de oxígeno en la superficie basal, sin barrera de medio entre las células y el aire, ya que la superficie inferior sería impermeable al líquido.

Se compraron en Dow Corning Chemical silicona RTV de grado biomédico/eléctrico (RTV-615A) y el correspondiente catalizador de vulcanización (RTV-615B), ambos con una densidad de 1,1 g/cm3. Esta silicona se eligió por sus características conocidas de biocompatibilidad, alta solubilidad en oxígeno y dureza alta. Dado que el espesor de la membrana afecta en gran medida a las propiedades de transferencia de oxígeno de la membrana, los inventores desearon la membrana más delgada posible con un potencial mínimo de rotura.

La perfluorotributilamina (PFC), FC-43, con una densidad de 1,9 g/cm3 se adquirió de 3M corporation. Aunque otros hidrocarburos perfluorados tienen solubilidades de oxígeno más altas, el FC-43 se eligió más por su estabilidad química y propiedades no reactivas (punto de ebullición alto, baja presión de vaporización), haciéndolo más susceptible de mezclarse en la silicona.

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Se pesó silicona en un tubo cónico estéril de 50 ml utilizando la densidad para obtener un volumen dado de silicona. Por ejemplo, cuando se deseaban 10 ml de silicona, se añadieron 11 g de silicona a los 50 ml cónicos (10 x 1,1 g/cm3). A la silicona, se añadió una fracción dada de FC-43 (10% ó 20% v/v) de la misma manera. Por ejemplo, para obtener una concentración de PFC al 10% v/v en los 10 ml de silicona anteriores, se añadirían 1,9 g de FC-43.

Debido a la extrema densidad de los compuestos perfluorocarbonados, son virtualmente inmiscibles con todos los compuestos menos densos. Cuando se mezclan con otro componente, forman inmediatamente un sistema de dos capas con la otra sustancia. Con el fin de obtener una suspensión homogénea del PFC dentro de otros líquidos o componentes menos densos, se requiere sonicación o emulsificación a alta presión. El resultado final de estos procesos es una suspensión de partículas de micelas de perfluorocarbono de dimensiones de micrómetros a nanométricas. Sin embargo, con el tiempo, las micelas a menudo comienzan a unirse en gotitas más grandes, un fenómeno conocido como maduración de Oswaldt. Esto es sólo característico de las emulsiones en líquidos no viscosos, y en la experiencia previa de los inventores con soluciones de polímero gelificado, no se observó. La ventaja de usar hidrogeles semi-sólidos o compuestos tales como silicona, es que tienen la capacidad de atrapar las gotitas de PFC dentro de sus matrices que previenen o reducen en gran medida la coalescencia de gotitas.

Las mezclas de PFC/Silicona de dos capas se sonicaron usando un sonicador de sonda Virsonic 200 durante 20 segundos de impulsos, con intervalos de enfriamiento de un minuto entre los dos, para un tiempo de sonicación total de tres minutos a 40 W. La mezcla se enfrió continuamente en una suspensión de baño de hielo. El resultado final de la sonicación fue una mezcla blanca, opaca y homogénea. Una vez sonicada, no se observó más separación de fase del FC-43 y la silicona. En este punto, se añadió una alícuota al 10% v/v del catalizador de vulcanización a la mezcla y se agitó en vórtice dentro de la suspensión para obtener una distribución homogénea.

A continuación, la mezcla completa se colocó en una cámara de vacío para extraer todas las burbujas de gas de la mezcla. Según las burbujas eran extraídas a la superficie, el vacío se interrumpía regularmente para hacer a las burbujas a estallar. La desgasificación total duró aproximadamente 45 minutos. El resultado final fue una suspensión lisa y opaca libre de bolsas de gas que de otro modo afectarían la integridad de la silicona.

Las membranas de Teflon se retiraron entonces de la superficie inferior de los insertos Millipore CM usando fórceps microquirúrgicos estériles. Se colocó Parafilm cuidadosamente a lo largo de toda la superficie inferior. El parafilm fue tensado sobre los pies del plato y fue fijado alrededor del borde exterior de cada inserto para asegurar un fondo plano y rígido para que la silicona cure.

Después de que se aseguró el Parafilm, se añadió un volumen dado de la mezcla de silicona/PFC a la superficie inferior usando un pipeteador de émbolo especial diseñado especialmente para el pipeteado de precisión de líquidos viscosos. Se añadieron volúmenes específicos para obtener espesores de membrana precisos. Utilizando las dimensiones conocidas de los insertos, se calculó un grosor deseado usando la fórmula para el volumen de un cilindro, πR2h. Se deseaba hacer que las membranas fueran lo más delgadas posibles y tuvieran una probabilidad mínima de fallo de la membrana. Por estas razones, se ensayaron diversas profundidades de membrana. La profundidad de 300 μm se utilizó para proporcionar la optimización de la difusión y la integridad de la membrana. Por lo tanto, el volumen de silicona/PFC añadido a cada fondo de la placa fue π(0,5 cm)2*(0,03 cm) o 23,5 μl.

Tras la adición de la mezcla de silicona/PFC, las placas se giraron lentamente sobre un rotador de tubo modificado para distribuir uniformemente la solución a lo largo de toda la superficie de Parafilm. A temperatura ambiente, el curado con silicona es relativamente lento, permitiendo una posterior sedimentación de la solución una vez que los platos se colocaron en posición vertical. Lo que se observó fue que la silicona después de una manipulación manual/rotación se distribuía más y más uniformemente cuando se colocaba sobre una superficie plana. Una vez que se observó una distribución homogénea, los insertos se colocaron en una estufa a 40ºC y se dejaron curar completamente, lo que ocurrió en 2-3 horas.

Después de que la silicona se hubiese curado completamente, los insertos se retiraron del horno y se dejaron enfriar. A continuación, se retiró cuidadosamente la base de Parafilm, para no romper la membrana de silicona/PFC, dejando un fondo intacto permeable a los gases capaz de contener el líquido y el tejido. Antes del uso, los insertos se esterilizaron por inmersión durante la noche en etanol al 70%, seguido de 30 minutos en etanol al 100%. Inmediatamente antes de añadir el tejido recolectado, se lavaron cinco veces con PBS estéril para eliminar completamente todo el etanol y después se dejaron secar sobre una media lámina estéril en una campana laminar

Ejemplo 2: Modelo matemático

Los brotes pancreáticos se recolectaron y se midieron cuidadosamente usando un retículo graduado en un microscopio invertido. La Tabla 1 describe las mediciones de 18 brotes pancreáticos.

Tabla 1

Dimensiones promedio

anchura m longitud m

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375 750

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375 800

Dimensiones promedio

anchura m longitud m

promedio

450,0 653,5 551,7

desv st

99,9 111,8 105,8

cv

22,20% 17,11% 19,65%

El modelo matemático se realizó utilizando una elipse con las dimensiones anteriores para todas las condiciones suponiendo que la tercera dimensión era uniforme a lo largo de todo el brote. La tasa de consumo de oxígeno de los 5 brotes se determinó mediante el uso de un sistema de cámara de microlitros agitado de Instech, Inc. Brevemente, se colocaron tres brotes en una cámara que contenía 400 μl de medio de cultivo convencional sin bicarbonato. La cámara se precalibró a concentraciones de oxígeno en aire ambiente en medio y cero, usando NaSO3 suspendido en agua destilada. En todo momento la temperatura se mantuvo dentro del sistema a 37,5ºC ± 0,05ºC por medio de una cámara de titanio de baño de agua. Después de que las células y el medio se añadieran a la cámara, se selló 10 por medio de una tapa de vidrio biselado que extruía las burbujas de aire y el exceso de medio a través de un orificio lateral y se llevó el volumen final a 250 μl. El software espectroscópico monitorizó y registró la presión parcial de oxígeno cada segundo a lo largo de la duración de la medición. Los perfiles de oxígeno se analizaron a partir de presiones parciales inferiores a 140 mmHg, cuando el sistema se había estabilizado térmicamente, hasta un punto de linealidad adecuada, usualmente alrededor de 70-80 mmHg.

15 La pendiente se convirtió de mmHg a μM mediante el uso de un factor de conversión (210/158,8). A continuación, la pendiente convertida en μM se convirtió en micromoles de oxígeno consumidos multiplicando por el volumen de la cámara. Este valor se dividió por 60 para convertir el consumo por minuto en consumo por segundo, y finalmente, la cantidad total fue dividida por el volumen de todos los brotes utilizados, en m3 de tejido, para obtener una tasa de consumo final en mol/m3\s-1. Esto se realizó en cada lote individual de brotes que fueron cosechados y lo que se

observó fue que la tasa de consumo era muy consistente independientemente de la cosecha. La Tabla 2 muestra las tasas de consumo individual y el promedio utilizado en el modelado matemático.

Tabla 2

OCR de BUD

mol/m3 s

Experimento 2

OCR

1

8,35E-03

2

9,68E-03

Experimento 3

1

8,57E-03

2

7,97E-03

Experimento 4

1

9,53E-03

Media

8,82E-03

dev st.

7,49E-04

cv

8,50%

5 Las condiciones de cultivo fueron modeladas utilizando el software de modelado de elementos finitos Comsol Multiphysics 3.2. Las condiciones de cultivo convencionales se modelaron con los siguientes parámetros. Se supuso que la concentración inicial de oxígeno era de 0,1995 mol/m3, basada en las condiciones convencionales de cultivo de 95% RA/5% CO2. La difusividad de oxígeno a través del medio se tomó como la del oxígeno a través del agua a 37ºC, 3,3 E-09 m2/s. La difusividad del oxígeno a través del tejido también se tomó de la media de los valores

10 informados en la bibliografía, 1,3E-09 m2/s. La tasa de consumo de oxígeno se consideró de primer orden con un valor de Km de 5,81E-04 mol/m3, también basado en los valores de la bibliografía para el consumo de oxígeno endocrino y fue modelado como Rm*(c/(c+Km), basado en la cinética de Michaelis-Menten. El valor Rm utilizado fue el valor medio mostrado anteriormente en la tabla de 8,82E-03 mol/m3 de tejido. Las condiciones de contorno utilizadas fueron la concentración inicial a lo largo de la superficie superior del medio de cultivo de una altura de 2,65

15 mm y 3,15 mm en las placas de silicona PFC y tanto la concentración de oxígeno con un coeficiente de difusión en el medio sobre la superficie inferior del plato, como la difusión efectiva de oxígeno en el caso de los platos de pfc/silicona.

El cultivo se modeló con dos y tres brotes en un plato, agrupados juntos, como se observó, y se mantuvieron separados. Los perfiles de oxígeno se determinaron a través de las distancias dimensionales para cada brote. Se

20 calculó el porcentaje de tejido anóxico como tejido donde la concentración de oxígeno en equilibrio fue menor que el valor Km, 5,81E-04 mol/m3 de la tasa de consumo de oxígeno, nuevamente tomado de los supuestos de la bibliografía. La Tabla 3 resume los cálculos de tejido anóxico para todas las condiciones de cultivo, suponiendo o bien dos brotes o tres brotes por plato de 1 cm.

Tabla 3

CONDICIONES DE CULTIVO

ANOXICO % O2 mínimo

2 brotes característicos de cultivo convencional

59%

2 brotes característicos de cultivo con alta concentración de oxígeno

30%

2 brotes característicos de cultivo de pfc silicona

0% 0,083

2 brotes separados de cultivo convencional

33%

5

10

15

20

25

30

35

40

2 brotes separados de cultivo con alta concentración de oxígeno

11%

2 brotes separados de cultivo de pfc silicona

0% 0,134

3 brotes característicos de cultivo convencional

68%

3 brotes característicos de cultivo con alta concentración de oxígeno

41%

3 brotes característicos de cultivo de pfc silicona

0% 0,038

3 brotes separados de cultivo convencional

43%

3 brotes separados de cultivo con alta concentración de oxígeno

24%

3 brotes separados de cultivo de pfc silicona

0% 0,12

El modelado adicional demostró que el PFC Silicona también tiene una ventaja en comparación con las plataformas de cultivo compuestas únicamente de silicona. En el caso de los brotes pancreáticos, la diferencia media en la concentración de oxígeno fue un aumento de 0,012 moles/m3 de concentración de oxígeno localizada en las placas de PFC/Silicona en comparación con la Silicona, sola. Esto es extremadamente importante, ya que los inventores han observado que incluso pequeñas diferencias en la concentración de oxígeno pueden afectar drásticamente el aumento del pliegue relativo de la expresión del gen marcador endocrino durante el cultivo del tejido embrionario. Con base en esta información de modelado, se realizaron experimentos para evaluar los efectos sobre la diferenciación del aumento del oxígeno. El diseño experimental y los resultados se detallan en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 3: Estudios de transferencia de oxígeno

El propósito de estos estudios fue evaluar las características representativas de transferencia de oxígeno de los sistemas PFC/Silicona en relación con la silicona sola y los sistemas convencionales de cultivo de plástico, donde el oxígeno procede principalmente de la superficie apical.

Uso de sensores ópticos de oxígeno basados en la decaimiento de fluorescencia para medir la transferencia de oxígeno: Materiales: Platos de 2,4 cm de silicona PFC, silicona y plástico.

Para la medición de la concentración de oxígeno se utilizaron sensores de oxígeno de punto ópticos de película delgada (PreSens Inc, Alemania y WPI Inc, Sarasota, Fla.). Estos sensores tienen aproximadamente 5 mm de diámetro y 50 μm de espesor. Estos sensores están generalmente sujetos dentro de un sistema de cultivo sobre una superficie plana y un cable de detección de fibra óptica se fija de forma no invasiva al exterior de la plataforma de cultivo, valores de fluorescencia (intensidad y ángulo de fase) a un detector y paquete de software para análisis. Los sensores se basan en la caída de la fluorescencia con el tiempo (fluorescencia de por vida) y están construidos de fluoróforos sensibles al oxígeno con características de fluorescencia inversamente proporcionales a la cantidad de oxígeno presente. Los sensores son increíblemente estables y una vez calibrados pueden ser reutilizados varias veces y esterilizados en autoclave, según sea necesario. La deriva es mínima y puede ser fácilmente contrarrestada por una calibración puntual a una temperatura conocida y presión parcial del aire ambiente. La imagen a continuación detalla el conjunto de sensor/fibra para la medición: Los sensores de punto se fijaron a la parte central inferior de los insertos de PFC/Silicona (10% v/v FC-70, FC-43), silicona y plástico (poliestireno) de 2,4 cm silicona de curado rápido. Los conectores SMA se pegaron en el fondo exterior de las placas de 6 pocillos alineadas de tal manera que la superficie fluorescente del sensor estaba al ras con la salida óptica del conector SMA.

Después de que el pegamento se había endurecido, se aseguraron los cables de transmisión de fibra óptica en los conectores SMA y se probó la transmisión de señal para asegurar que la señal fluorescente pudiera pasar a través de la silicona, PFC/silicona y plástico con suficiente intensidad para ser analizada. La distancia de separación de varios milímetros entre la sonda de fibra óptica y los sensores de punto no generó lecturas de artefactual ni problemas de intensidad de señal.

La placa de pocillo se colocó entonces en una incubadora de 5% de CO2 estándar a 37ºC y se añadieron 1,8 ml de ddH2O a cada plato. A continuación, se cubrió la placa del pocillo y se dejó equilibrar el sistema mientras se monitorizaba durante aproximadamente 1 hora. Cuando el sistema había alcanzado el equilibrio y estaba leyendo cerca de la presión parcial de oxígeno esperada de 142 mmHg, se inició la grabación del software durante una lectura de referencia de 10 minutos. Al final de la lectura de referencia de 10 minutos, se añadieron 18 μl de una solución de sulfito de sodio 1M recién preparada y precalentada a cada pocillo mediante un pipeteo inicial y después una mezcla completa mediante un pipeteado adicional.

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El sulfito sódico es un sistema bien establecido y utilizado para la eliminación del oxígeno. En equilibrio, el agua contendrá aproximadamente 192 μM de oxígeno disuelto, que es mucho menor que la concentración final de 10 mM de sulfito de sodio tras la adición de la reserva de 1M. Por lo tanto, existe un consumo rápido y extremo de oxígeno que excede con mucho cualquier tipo de célula en cultivo y por lo tanto, puede utilizarse como un "peor escenario" de control para cualquier sistema. El volumen de agua (1,8 ml) elegido para su uso era asegurar una altura media suficiente (4 mm) de manera que la mayor parte de la transferencia de oxígeno medida por el sensor en los sistemas de membrana se debiera a la difusión a través de la membrana ya que los gradientes de la superficie apical a la basal eran grandes y les tomaría algún tiempo equilibrarse (L2/D, donde L es la longitud de la trayectoria de la difusión de la superficie al sensor en centímetros y D es la difusividad del oxígeno en el agua a 37ºC, 3,0E-05 cm2/s). Los valores de oxígeno se registraron hasta que los sistemas regresaron a por lo menos el 95% del valor basal. Las comparaciones de transferencia de oxígeno se hicieron utilizando la pendiente durante el retorno a la línea de base O2 y el tiempo a la mitad de la concentración máxima de oxígeno T en: (concentración máximaconcentración mínima)/2. Estos estudios se realizaron después del período de curado de 24 horas después de la fabricación, para minimizar la pérdida debido a la volatilidad de PFC.

Resultados: La figura 3 detalla los resultados de la comparación de todos los tipos de platos 24 horas después de la fabricación. La figura muestra curvas medias representativas de las repeticiones de cada grupo. No se muestran barras de error, pero las diferencias entre las plataformas PFC/Silicona frente a la silicona sola y frente al poliestireno fueron altamente significativas a favor de las plataformas PFC/Silicona (P <0,01 frente a la silicona sola y el poliestireno para el tiempo a la mitad de la concentración máxima y la velocidad de la pendiente de reoxigenación). Las diferencias entre las plataformas FC-70 frente a las plataformas FC-43 no fueron estadísticamente significativas, aunque hubo una tendencia que favoreció al FC-70 con respecto al FC-43 tanto para la tasa de reoxigenación como para el tiempo hasta la mitad de concentración máxima. Claramente, las plataformas PFC/Silicona ofrecen una mejora sustancial tanto en la placa de silicona como en las placas de poliestireno en términos de capacidades de transferencia de oxígeno.

Actualmente, se están llevando a cabo experimentos para estudiar las tasas de transferencia a lo largo del tiempo junto con la pérdida observada de PFC debido a la volatilidad. Adicionalmente, los experimentos se realizarán usando alturas de medios más bajas para simular mejor el cultivo celular y se están generando modelos matemáticos para describir las observaciones de cultivo y para usarlas en la optimización posterior del sistema.

Ejemplo 4: Optimización del proceso de fabricación

Importante para el desarrollo de las plataformas de cultivo de PFC/Silicona es la capacidad de fabricar lotes individuales de platos con variación mínima. Cada variable de fabricación se examinó cuidadosamente para desarrollar un método óptimo para generar suspensiones micelares homogéneamente reproducibles del perfluorocarbono dentro de la silicona y la mezcla de catalizador asegurando concentraciones uniformes de perfluorocarbono a través de la matriz de membrana antes del proceso de curado.

Métodos.

Fabricación de PFC/Silicona: Después de la manipulación de variables componentes y ajustes de procesamiento, así como estudios de la estabilidad del PFC para determinar las propiedades de volatilidad y las características óptimas de transferencia, se formuló un protocolo de fabricación óptimo. Los pasos detallan el protocolo. En este ejemplo, se fabrican 10 ml de PFC al 10% v/v, 20% de la composición de membrana del catalizador y se generan insertos de transpocillo de 2,4 cm a partir de la solución de PFC/Silicona.

Materiales: RTV615-A GE Silicona, catalizador RTV615-B para RTV615-A, y 3M Inc. FC-70 Fluorinert líquido.

Verter un exceso de silicona en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar la silicona durante 5 minutos a aproximadamente 1000 g con un tubo de contrapeso lleno de agua. Esto es para desgasear la silicona. Pesar un tubo cónico de 50 ml (sin tapa) en un soporte de tubo cónico y registrar el peso. Tener cuidado de no introducir burbujas de aire en la silicona, pipetear 7 ml de la silicona en el tubo cónico pesado de 50 ml. Es necesario utilizar una pipeta de émbolo común para la transferencia de soluciones viscosas ya que una pipeta convencional no extruirá un volumen exacto ya que la mayor parte de la silicona se adherirá a las paredes de la punta de la pipeta. Para asegurar que se han añadido 7 ml de la solución al tubo, se pesa de nuevo el tubo y se resta el peso inicial. Esto dará el peso de la silicona sola. Dividir este número por la densidad de la silicona y esto dará el volumen de silicona añadido. Por ejemplo, la densidad de la silicona es 1,013 g/mL y por lo tanto, 7 ml deben producir un peso de 7,091 g. Preparar una lechada de hielo en un cubo mezclando 1/2 cubo de hielo con 1/2 de agua fría. En una campana, colocar los 50 ml cónicos que contienen la silicona sostenida con un soporte de anillo y una abrazadera tal que todo el volumen de silicona se sumerja en la suspensión de hielo. Colocar la punta de la sonda del sonicador de 3/16" (VirTis 390910 para Virsonic 100), sostenida sobre el soporte del anillo con otra pinza en la silicona, colocar la punta 1/8" del fondo del tubo cónico. Se debe tener cuidado para asegurarse que la punta del sonicador no toque ninguna parte del tubo cónico y permanezca centrada en el fondo. Comenzar a sonicar la solución a 25-30 W (ajuste 16 en el sonicador VirSonic 100). La silicona hará que el sonicador suene como si no esté sintonizado, pero proceda añadiendo 1 mL del FC-70 con una pipeta de émbolo. Trate de poner la punta de la pipeta tan cerca de la sonda como sea posible. Esto asegurará que el PFC comience a mezclarse al introducirlo en la silicona. Como el PFC es

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mucho más denso que la silicona (ρ = 1,9243 g/mL), se hundirá rápidamente al fondo del tubo. Dejar de sonicar después de 30 segundos y dejar que la solución se enfríe en el baño de hielo durante 30 segundos. Repetir este paso dos veces adicionales para un total de 3 sonicaciones. Después de la sonicación 3ª, no permitir que la muestra se enfríe durante 30 segundos. En lugar de permitir que la solución se enfríe durante los últimos 30 segundos, levantar la punta de la sonda de la solución, que ahora debe comenzar a parecer blanquecina y opaca, permitir que el exceso gotee de nuevo en la cónica y, a continuación, retirar el tubo cónico de la abrazadera colocando el tapón en la cónica. Agitar con vórtice la solución durante 1 minuto en el ajuste más alto. Devolver la mezcla a la suspensión de hielo, retirar la tapa y colocar la punta de la sonda del sonicador en la posición anterior en la mezcla. Si la suspensión de hielo se está calentando y el hielo está desapareciendo en cualquier paso, reemplazar la suspensión con las cantidades descritas anteriormente. Dejar enfriar la solución durante 1 minuto. Sonicar la solución como antes, 30 segundos de pulso y 30 segundos de enfriamiento, por 3 veces más (ahora 6 ciclos totales). Levantar la punta de la sonda, permitir que el exceso vuelva a caer en la mezcla y luego extraer la mezcla de la abrazadera y la suspensión. Colocar la tapa en el tubo y apretar firmemente. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos con el tubo de equilibrio en su lugar (esto es para eliminar las burbujas de aire y evaluar si no se mezcla PFC). Retirar la mezcla de la centrífuga, retirar la tapa del tubo cónico y agregar 2 ml de solución de catalizador a la mezcla. Agitar en el catalizador completamente con una espátula estéril. Retirar la espátula de la mezcla que raspa el exceso de solución en el tubo. Volver a colocar la tapa del tubo y apretar firmemente. Agitar con un vórtice la solución durante 1 minuto, como arriba. Centrifugar la solución hasta el tiempo final, como arriba.

El resultado general de este procesamiento es una suspensión micelar homogénea, opaca y viscosa. Estos protocolos producen una suspensión libre de separación de fase. A menudo, hay una capa muy fina y más transparente cerca de la parte superior de la mezcla que es probablemente debido a la incapacidad del sonicador para forzar la mezcla completamente a la parte superior. Por esta razón generalmente se tomaron alícuotas para la fabricación de la plataforma a partir de la región central de la mezcla (en la dirección vertical) cuando se observó la uniformidad más reproducible en esta porción. Los siguientes experimentos utilizarán el flujo a través de sonicadores que mezclarán continuamente los volúmenes juntos durante el procesamiento.

Fabricación de platos: Soportes transpocillos permeables de 2,4 cm de Corning (para placa de 6 pocillos), parafilm, bisturí para la eliminación de la membrana.

Retirar el número deseado de insertos de transpocillos del embalaje estéril. Utilizando el bisturí, cortar con cuidado a través del fondo de la membrana de policarbonato y retirar la membrana completamente del marco plástico del inserto. Colocar un cuadrado de parafilm lo suficientemente grande como para cubrir el fondo del inserto y tirar tenso a lo largo del marco del inserto con cuidado para no arrugar el parafilm. Esto servirá como una plataforma temporal en la que el PFC/Silicona curará. El volumen añadido a cada plato se determina por el espesor de membrana deseado calculado usando la siguiente fórmula:

V = πr2m Td (1)

donde V es el volumen añadido, r es el radio de la plataforma de cultivo y Td es el espesor deseado de la membrana. El espesor típico de la membrana que utilizamos para asegurar una distribución uniforme a través de la superficie de la plataforma con una variación mínima es de 650 μm, aunque utilizando otros métodos de fabricación (moldeo por compresión) se es capaz de generar membranas más uniformes y más delgadas. Con un espesor de membrana de 650 μm, el volumen necesario de la mezcla de PFC/Silicona es de 295 μl. Si se utilizan las placas para estudios de volatilidad o determinaciones de homogeneidad, véanse las instrucciones a continuación, si no, pipetéese cuidadosamente, usando la pipeta de émbolo, 295 μl de la composición PFC/Silicona en el centro de cada plato. Se debe tener cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla y asegurarse de que la punta de la pipeta se llena completamente cuando se aspira la mezcla. Al expulsar el volumen, téngase cuidado de asegurarse de que toda la mezcla se extruye eliminando la última gotita tocando la punta de la pipeta en la superficie del parafilm. La mezcla se extenderá uniformemente a través de la superficie del parafilm con el tiempo, pero si las regiones del parafilm permanecen descubiertas, manténgase el plato a 90º con la región descubierta en una orientación basal de modo que la mezcla fluya hacia abajo y cubra el parafilm. Gírese el plato según sea necesario para asegurar un recubrimiento uniforme. Colóquense los platos en placas de 6 pocillos y cubra con la tapa de la placa. Poner en la incubadora a 37ºC para curar durante la noche. Después de un período de noche, tocar con una punta de pipeta la superficie de varias superficies de membrana de plato para ver que el curado ha llegado a su finalización (debe ser flexible y resistente, no pegajoso o pegajoso). Pelar el parafilm cuidadosamente fuera de cada fondo del plato. La membrana puede estirarse a medida que el parafilm se separa, pero deben separarse sin rasgarse ni romperse. En este punto los platos están listos para su uso.

Determinación de la homogeneidad: Para cada lote de platos fabricados, se utilizaron mediciones gravimétricas para determinar el porcentaje en volumen de PFC en cada plato individual fabricado con respecto al ideal calculado a partir de las adiciones en volumen conocidas de cada componente de la matriz. Como ejemplo, se describen a continuación la fabricación de platos compuestos por PFC (FC-70) al 10% v/v, catalizador al 20% v/v y silicona al 70% v/v: Se fabrica un volumen inicial de PFC/Silicona como anteriormente. Asumiendo un volumen inicial de 110 ml de material de membrana, el peso ideal de la mezcla en cualquier plato individual sería igual a:

V mezcla (ml) x (0,7 x ρ silicona + 0,2 x ρ catalizador + 0,1 x ρ PFC) (2)

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Ensayos de PCR en tiempo real: Los ensayos utilizados fueron: PCNA (Mm00448100_g1) Carboxipeptidasa A (Mm00465942_m1); Amilasa (Mm02342487_g1); Insulina 1 (Mm01259683_g1); Insulina 2 (Mm00731595_gH); Glucagon (Mm00801712_m1); Ptfla (p48) (Mm00479622_m1); Pdx1 (Mm00435565_ml); Isl-1 (Mm00627860_ml); Ngn3 (Mm00437606_s1); Pax4 (Mm01159035_g1); Glut-2 (Mm00446224_m1); Pax6 (Mm00443072_m1); y Arx (Mm00545903_m1). Los niveles de expresión se normalizaron contra 18S rRNA (Hs99999901_s1).

Análisis Ratiométrico: Además de la cuantificación relativa de los genes individuales, también se examinó la expresión diferencial de genes endocrinos versus exocrinos, así como de genes de células beta vs células alfa en cada grupo (análisis ratiométrico). Primero se calculó el promedio de los pocillos triplicados para el gen numerador y denominador de interés. En este caso, las relaciones génicas se calcularon dentro de los grupos individuales. A partir de los valores medios de los genes (Ct), se sustrajo el valor promedio del gen de limpieza (18S). El número resultante es dCt. A continuación, el promedio de los ciclos del numerador ajustados se restó de los ciclos del denominador ajustados. Finalmente, dado que cada ciclo representa una duplicación del producto de reacción, la diferencia del pliegue se calculó mediante la siguiente fórmula:

Cambio de plegado = 2-n

donde n es igual a la diferencia media de números de ciclos entre los genes numerador y denominador. Una vez que estas proporciones se calcularon para cada combinación de genes en el grupo de control y experimental, respectivamente, se determinó la relación entre el valor experimental y el valor de control. De esta manera, se pudo examinar las diferencias ratiométricas dentro de cada grupo y luego entre los grupos. Un ejemplo ilustrativo del método se proporciona a continuación para una relación de gen A/gen B.

Grupo: PFC/Si

Ct 18S dCt(Ct-18S)

Gen A20 12 8

Gen B 30 14 16 8-16 = -8 2-(-8)= 256

Por tanto, la relación del gen A con respecto al gen B en el grupo PFC/Si es 256. Cálculos similares resultaron en relaciones de 32 en el control estándar. Se puede concluir, por lo tanto, que la relación del gen A/gen B es 256/32 = 8 veces mayor en el PFC/Si que en el grupo de control estándar.

Consumo de oxigeno: Los brotes pancreáticos se colocaron en un sistema de microcámaras agitado (OCR) de velocidad de consumo de oxígeno, controlado con la temperatura, con sensores de oxígeno ópticos de fibra de rutenio (Instech Laboratories, Plymouth Meeting, Pa.). Este sistema mide la disminución de la concentración de oxígeno (ΔcO2) con el tiempo. Las sondas se calibraron utilizando aire ambiente, (210 μM de oxígeno) y sulfito de sodio 100 mM (NaSO3-) (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo.), que consume todo el oxígeno en el sistema a través de la unión química con el azufre. Esto se realizó utilizando cinco cosechas consecutivas de brotes precursores. Se realizaron duplicaciones de 3 brotes por cámara en tres cosechas y una de 6 brotes en la cuarta y quinta cosecha. Todas las mediciones se realizaron en medio de cultivo completo. El sistema se agitó continuamente, manteniendo así el equilibrio de oxígeno dentro de la cámara. Dado que el volumen de la cámara es conocido, el consumo de oxígeno podía determinarse a partir de la pendiente lineal del ΔcO2. La pendiente (expresada en μM) se multiplicó por el volumen de la cámara (250 μl) para obtener los moles de oxígeno consumido. Este valor, expresado en mol/min, se dividió por 60 para obtener los moles de oxígeno consumido por segundo.

Medidas del oxígeno del microelectrodo polarográfico: Al día siguiente de la cosecha, se utilizaron brotes pancreáticos murinos de las condiciones de cultivo de control y PFC/Si para la medición de gradientes de oxígeno de tejido. 3 brotes pancreáticos de cada grupo se transfirieron a un plato de cultivo de 35 mm, ya sea con un fondo de plástico estándar o con un fondo de matriz de perfluorocarbono-silicona (3,36 ml de medio de cultivo). Cada plato se colocó secuencialmente en una microincubadora (Harvard Apparatus, Boston, Mass.) fijada a la etapa de un microscopio invertido Zeiss, con 3,36 ml de medio de cultivo fresco sin bicarbonato sódico. La microincubadora mantuvo la temperatura a 37ºC durante la duración de las mediciones. En ausencia de bicarbonato, el pH del medio se mantuvo mediante tampón HEPES 25 mM. La evaporación durante las mediciones fue mínima (<2% del volumen total). Los microelectrodos de oxígeno utilizados (Diamond General Inc, Ann Arbor, MI) tenían un diámetro de punta promedio de 8 m. Cada sonda se sometió a una calibración de dos puntos, primero en nitrógeno disuelto en medio de cultivo (0%) y luego por aire ambiente en el medio de cultivo (20,9%). Las calibraciones se realizaron a 37ºC para mantener la consistencia térmica.

Para cada medición, un brote pancreático individual se fijó a una punta de pipeta de vidrio en un lado de la etapa del microscopio mediante la técnica de la pinza de parche al vacío. Los brotes se dejaron equilibrar durante 105 minutos, que es el tiempo de equilibrado calculado del sistema -el cuadrado de la longitud de la trayectoria de difusión (altura media) dividido por la difusión

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Coeficiente de oxígeno a través del medio (2,1E-0,5cm2/s). El microelectrodo de oxígeno fue fijado al otro lado de la etapa del microscopio en un micromanipulador robótico (Eppendorf) capaz de movimientos de precisión en los planos x, y y z hasta una resolución de 0,2 m. Todos los datos de electrodo y temperatura se registraron a través de un panel de recopilación de datos analógicos en interfaz con un PC de laboratorio a través de una conexión RS

232. Se utilizó el software de recogida de datos (DASYLab) para transformar las señales analógicas de tensión en lecturas digitales para la evaluación de las concentraciones de oxígeno dentro de los brotes pancreáticos.

Las mediciones de oxígeno se recogieron durante intervalos de dos minutos guiando el electrodo normal a la superficie en el tejido. Se realizó una medida inicial a -250 μm con respecto a la superficie con mediciones internas realizadas a intervalos de 10 μm desde la superficie hasta el núcleo del brote pancreático (aproximadamente 260 μm). Se realizaron tres mediciones individuales por brote y se utilizaron tres brotes por grupo para las mediciones de oxígeno.

Cuantificación de la inmunotinción: Se utilizó el software de imágenes Metamorph® (Molecular Devices Inc., Downington, Pa.) para cuantificar las cantidades relativas de tinción de insulina y glucagón en cada sección. Este paquete de imágenes permite la cuantificación precisa de la señal fluorescente en cualquier sección de tejido biológico. Las áreas positivas se calcularon como porcentajes dividiendo el número de píxeles positivos/sección por el número de píxeles totales/sección. Se calcularon entonces los porcentajes de volumen positivos totales/brote para todas las secciones de cualquier brote dado, de acuerdo con la ecuación:

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Donde n es el número de secciones, Pt, es el total de píxeles y P+ es el número de píxeles positivos para cada hormona específica. Los porcentajes medios se calcularon a partir de los valores porcentuales individuales de cada grupo.

Adquisición y cultivo de los tejidos: Los brotes pancreáticos de embriones e9.5-e16.5 CBA × B6 (mediodía del día se encuentra un tapón vaginal se considera 0,5 días de gestación) fueron aislados y microdiseccionados. El medio de cultivo fue GMEM (Invitrogen) suplementado con aminoácidos no esenciales de MEM 0,1 mM (Invitrogen), piruvato de sodio, suero bovino de recién nacido al 5% (v/v), suero fetal de ternera al 5% (v/v), 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 μg/ml) y L-glutamina (250 μM) (Invitrogen). Los controles se colocaron en insertos de Millicell de 12 mm, 0,4 μM (típicamente 2 brotes/inserto) y se incubaron a 37ºC y 5% de CO2, ya sea a 21% o 35% de O2. Los brotes asignados al grupo experimental se sembraron en insertos de placas de cultivo de PFC/Si (véanse las Figuras 5A-5B) y se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 y 35% de O2.

Inmunotinción y análisis de imágenes: Los explantes se cultivaron como antes durante 3 días y luego se fijaron con paraformaldehído al 4% (30 minutos), se lavaron con PBS (30 min) y se congelaron en compuesto O.C.T. (Sakura). Los rudimentos pancreáticos se seccionaron en su totalidad (5 μm) y se montaron con DAPI-vectashield (Vector). Se utilizaron anticuerpos anti-insulina de conejo de indias y anticuerpos anti-glucagón de conejo (BioGenex, solución lista para usar) para doble tinción. Se añadió BrdU (Sigma) al medio de cultivo a una concentración final de 10 μM y se mantuvo durante la noche (y se añadió recién preparado cada día) antes de la fijación. Se utilizaron anticuerpos anti-bromodesoxiuridina (BrdU) de rata (dilución exacta 1: 100) y hipoxipropo conjugado con FITC (Chemicon, dilución 1: 100) para la detección de células proliferantes e hipoxia, respectivamente. Se obtuvieron anticuerpos de conejo contra amilasa (1: 200), carboxipeptidasa (1: 200), E-cadherina (1: 100) y Nestin (1: 100) de Santa Cruz, Sigma, Zymed y Covance, respectivamente. Todos los anticuerpos secundarios se adquirieron de Molecular Probes (Invitrogen). Se utilizó el software METAMORPH® para cuantificar la tinción con insulina y glucagón

qRT-PCR a tiempo real. El ARN total se purificó usando kits Qiagen (QIAShredder, RNeasy y libre de ADNasa). El sistema First-Strand (Roche) se utilizó para generar ADNc (oligómeros aleatorios). La expresión génica relativa se calculó usando ensayos de Taqman en un ciclador de PCR Fast Real Time 7500 (Applied Biosystems, ABI). El método ΔCt para la cuantificación relativa se consideró óptimo para esta aplicación. Todos los ensayos (ABI) fueron diseñados para abarcar las uniones exón-exón, eliminando así la posibilidad de contaminación del ADN genómico. Los resultados de qRT-PCR son el promedio de varios experimentos independientes, como se indica en la sección Resultados. Además, en cada experimento cada marcador se analizó por triplicado. Los números de ensayo específicos se proporcionan como información complementaria. La expresión génica se normalizó contra 18S rRNA. Este control endógeno ha sido validado en el sistema de los inventores y ha demostrado ser extremadamente estable y más exacto sobre las concentraciones de O2 variables que otros estándares.

Análisis estadístico. Los análisis de ANOVA se utilizaron para analizar la varianza entre las medias de los diferentes grupos (P <0,05). Cuando se comparan más de dos grupos, las pruebas t de Student emparejadas generalmente resultan en una mayor probabilidad de errores de tipo I (es decir, cuando la hipótesis nula es rechazada aunque sea verdadera), de ahí el uso de ANOVA. Se utilizó un error estándar de los medios (S.E.M) para todos los análisis.

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período de 48 h. Se confirmaron tasas de proliferación más altas mediante tinción con BrdU (Figuras 2A-2D). La proliferación fue mínima en ambos grupos a baja O2.

Discusión: Los platos de PFC/Si aumentan drásticamente la proliferación de células madre neurales en neurosferas. Los estudios de incorporación de BrdU muestran que la mayor parte de la actividad proliferativa se detecta 5 superficialmente en agregados de control (Figura 2C). Esto concuerda con la hipótesis de que, siendo dependiente del oxígeno, la proliferación ocurrirá rara vez en el núcleo hipóxico de las neurosferas. El cultivo de PFC/Si, por el contrario, permite el crecimiento continuo de las neurosferas sin limitaciones de difusión de oxígeno hasta un umbral más alto. A diferencia de los del grupo de control, la proliferación también puede observarse en el núcleo de las neurosferas cultivadas en PFC/Si (Figura 2D). En resumen, el sistema de cultivo evita las limitaciones de

10 transferencia de oxígeno inherentes a los métodos convencionales, y permite un aumento drástico de la tasa de proliferación de células madre neurales in vitro.

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