ES2624284T3 - Métodos para cuantificar exosomas - Google Patents

Métodos para cuantificar exosomas Download PDF

Info

Publication number
ES2624284T3
ES2624284T3 ES11804372.8T ES11804372T ES2624284T3 ES 2624284 T3 ES2624284 T3 ES 2624284T3 ES 11804372 T ES11804372 T ES 11804372T ES 2624284 T3 ES2624284 T3 ES 2624284T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
lectin
exosomes
fluid
detectable
exosome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11804372.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Richard H. Tullis
Paul Duffin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aethlon Medical Inc
Original Assignee
Aethlon Medical Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aethlon Medical Inc filed Critical Aethlon Medical Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2624284T3 publication Critical patent/ES2624284T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5751—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5753—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the stomach or small intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Un método de cuantificación de exosomas en una muestra que comprende: poner en contacto la muestra con lectina inmovilizada en un sustrato; poner en contacto exosomas unidos a la lectina con un agente de unión a exosomas detectable; y medir una señal del agente de unión a exosomas detectable unido, cuantificando de este modo los exosomas unidos; en los que se selecciona la lectina a partir del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Metodos para cuantificar exosomas Solicitudes relacionadas Campo de la invencion
Las realizaciones de la presente invencion se refieren a metodos para cuantificar exosomas.
En particular, se proporcionan metodos que utilizan lectinas para cuantificar exosomas.
Antecedentes de la invencion
Los exosomas incluyen pequenas vesfculas liberadas por celulas de mairnfero para una serie de fines entre los que se incluye la inmunomodulacion. Dependiendo de las afecciones, los exosomas pueden ser inmunoestimulantes o inmunosupresores. Durante el embarazo, los exosomas inhiben la produccion de ciertas celulas T protegiendo de este modo el feto (Taylor, D.D., et al., Pregnancy- associated exosomes and their modulation of T cell signaling. J Immunol, 2006. 176(3): 1534-42). En el caso de ciertas infecciones bacterianas, los exosomas derivados de celulas infectadas expresan fragmentos antigenicos de la bacteria para estimular el sistema inmunitario contra el patogeno (Bhatnagar, S., et al., Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo. Blood, 2007. 110(9): 3234-44). Se ha postulado que los canceres utilizan las propiedades inmunomoduladoras de los exosomas para eludir el sistema inmunitario (Taylor D.D. et al., (2005) Tumor-derived exosomes and their role in cancer associated T-cell signaling defects. Brit. J. of Cancer 92:305-311).
Mientras que cada vez existen mas pruebas de la importancia de los exosomas en la progresion y el pronostico de canceres y enfermedades infecciosas tanto como medio de tratamiento como de diagnostico, no existe actualmente ningun ensayo que detecte con precision exosomas de varios tipos de celulas. Los exosomas se caracterizan y purifican actualmente mediante metodos tales como cromatograffa de tamano y ensayo de protemas general. Los exosomas tambien pueden purificarse usando anticuerpos espedficos para epftopos de exosomas particulares (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 20090220944). No obstante, los metodos que usan tales anticuerpos se limitan a los exosomas que muestran antfgenos particulares unicamente. En vista de la creciente importancia de los exosomas en el diagnostico y pronostico de ciertas enfermedades, existe la necesidad de metodos simples y eficientes para cuantificar exosomas que sean aplicables de forma general a exosomas de una serie de tipos de celulas. El documento WO2010056337 desvela un metodo para determinar la caractenstica bio-distintiva de los exosomas en una muestra, en la que la determinacion de la caractenstica bio-distintiva puede ser la cuantificacion de exosomas aislados. El metodo comprende capturar exosomas usando un agente aglutinante, tal como una lectina.
Sumario de la invencion
En su sentido mas amplio la invencion se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas que abarcan los siguientes aspectos:
1. Un metodo para cuantificar exosomas en una muestra que comprende: poner en contacto la muestra con lectina inmovilizada en un sustrato; poner en contacto exosomas unidos a la lectina con un agente de union a exosomas detectable; y medir una senal del agente de union a exosomas detectable unido, cuantificando de este modo los exosomas unidos; en los que se selecciona la lectina a partir del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A.
2. El metodo de 1, que comprende adicionalmente comparar la senal del agente de union detectable unido con una senal en una curva patron.
3. El metodo de uno cualquiera de 1-2, en el que los exosomas se derivan de una celula seleccionada del grupo que consiste en una celula de cancer de ovarios, una celula de melanoma, una celula de cancer de colon y una celula infectada de tuberculosis.
4. El metodo de uno cualquiera de 1-3, en el que el metodo proporciona una sensibilidad de deteccion de
exosomas en la muestra que es de al menos 1 x 109 exosomas/ml, preferentemente de al menos 1 x 108
exosomas/ml o mas preferentemente de al menos 1 x 101 2 3 4 5 6 7 exosomas/ml.
5. El metodo de uno cualquiera de 1-4, en el que la muestra comprende un exosoma que tiene un diametro de 10 nm a 800 nm, o preferentemente un diametro de 30 nm a 200 nm.
6. El metodo de uno cualquiera de 1-5, en el que la muestra comprende exosomas aislados de un fluido
mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en cromatograffa de exclusion por tamano,
centrifugacion de gradiente de densidad, centrifugacion diferencial, ultrafiltracion de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificacion de afinidad, separacion de microfluidos y una combinacion de los mismos.
7. El metodo de uno cualquiera de 1-6, en el que al menos una de la lectina inmovilizada en el sustrato y el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
agente de union detectable son capaces de unirse a exosomas derivados de una pluralidad de tipos de celulas.
8. El metodo de uno cualquiera de 1-7, en el que el agente de union a exosomas detectable se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una lectina seleccionada del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A; y opcionalmente en el que el agente de union a exosomas detectable comprende un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en una enzima, un agente quimioluminiscente, un agente fluorescente y un isotopo.
9. El metodo de uno cualquiera de 1-8, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre periferica, suero, plasma, ascitis, orina, lfquido cefalorraqmdeo (LCR), esputo, saliva, medula osea, lfquido sinovial, humor acuoso, lfquido amniotico, cerumen, leche materna, lfquido de lavado broncoalveolar, semen, lfquido prostatico, lfquido de Cowper o lfquido preeyaculador, eyaculacion femenina, sudor, materia fecal, pelo, lagrimas, lfquido de quiste, lfquido pleural o lfquido peritoneal, lfquido pericardico, linfa, quimo, quilo, bilis, lfquido intersticial, menstruacion, pus, sebo, vomito, secreciones vaginales, secrecion mucosa, agua de heces, jugo pancreatico, lfquidos de lavado de cavidades nasales, aspirados broncopulmonares, lfquido de cavidad de blastocisto, sangre de cordon umbilical y lfquido asdtico.
10. El metodo de uno cualquiera de 1-9, en el que el sustrato comprende una placa multipocillo que comprende un material seleccionado del grupo que consiste en sefarosa, latex, vidrio, poliestireno, polivinilo, nitrocelulosa y silicio.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es una representacion de absorbancia a 450 nm frente a la concentracion de manano medida mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion.
La FIG. 2 es una representacion de absorbancia a 450 nm frente a la concentracion de perlas de latex recubiertas con manano medidas mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion.
La FIG. 3 ilustra una curva patron de manano y una preparacion purificada de exosomas medida mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion.
La FIG. 4 ilustra una dilucion de una muestra de exosoma medida mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion. Las FIG. 5A y 5B ilustran un experimento de optimizacion de manano (FIG. 5A) y una perla de latex recubierta con manano (FIG. 5B) en el que se incubaron cantidades conocidas de manano y perlas de manano en pocillos de placa de 96 pocillos que se recubrieron con diferentes cantidades de GNA (10 jg/ml, 5 |jg/ml, 2,5 jg/ml y 1,25 jg/ml).
La FIG. 6 ilustra una curva patron de perla de manano medida mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion. La FIG. 7 ilustra un grafico de cantidades de exosomas presentes en una muestra purificada de gradiente de sacarosa o una muestra purificada de una columna de GNA, relativa a una curva patron de manano medida mediante una realizacion de un ensayo de la presente invencion.
La FIG. 8 ilustra un grafico de exosomas de cancer de ovarios detectado usando un anticuerpo anti-PLAP en una realizacion de un ensayo de la presente invencion.
Descripcion detallada
Las realizaciones de la presente invencion se refieren a metodos que utilizan lectinas para cuantificar exosomas. Lectinas tales como la concanavalina A y la lectina de Galanthus Nivalis (GNA) se unen espedficamente a celulas cancerosas indicando que estas celulas contienen restos de azucar poco habituales en celulas sanas. Exosomas espedficos de cancer secretados a partir de estas celulas tienen los mismos restos y son, por tanto, capaces de ser capturados por la lectina y detectados.
Ensayos tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) son una herramienta poderosa que se ha usado durante las ultimas 4 decadas para detectar protemas en muestras homogeneas y heterogeneas, generalmente mediante la adsorcion de un anticuerpo espedfico de antfgeno a una superficie solida tal como una placa de plastico de 96 pocillos, incubando el antfgeno con el anticuerpo adsorbido y detectando el antfgeno con un anticuerpo secundario marcado con diversos compuestos qrnmicos que reaccionan para proporcionar color, fluorescencia u otros medios de deteccion.
No obstante, el uso de ELISA para la deteccion de exosomas requiere un anticuerpo que sea espedfico para un antfgeno de superficie en el exosoma que no esta presente en celulas normales. El desarrollo de anticuerpos para su uso con un ensayo de ELISA puede ser diffcil y laborioso. Por lo tanto, existe una necesidad de metodos y composiciones que capturen y/o detecten exosomas de forma espedfica y precisa, preferentemente de una forma cuantitativa.
Mas alla de los potenciales beneficios terapeuticos de eliminar exosomas inmunosupresores de la circulacion, los investigadores reconocen que los exosomas representan un diagnostico de interes importante para determinar la progresion y pronostico de tanto canceres como afecciones de enfermedades infecciosas. No obstante, la disponibilidad de ensayos funcionales que detecten espedficamente exosomas es limitada. Actualmente, los exosomas se caracterizan y purifican generalmente mediante cromatograffa de exclusion por tamano y ensayo de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
protemas general, no mediante estructuras qmmicas espedficas para el exosoma. Entre algunas de las realizaciones de la presente tecnologfa se incluyen los ensayos de lectina espedfica ligada a enzimas (ELLSA) disenados para unirse espedficamente a estructuras de carbohidratos comunes a exosomas, pero no a componentes celulares humanos sanos. En algunas de tales realizaciones, cada placa ELLSA permite hasta 96 pruebas de deteccion de exosomas. Es posible realizar analisis adicionales de los exosomas capturados a traves de la deteccion de moleculas tales como anticuerpos unidos a un biomarcador espedfico en el exosoma.
El Hemopurifier® es un dispositivo medico que dirige de forma selectiva la retirada de virus infecciosos y protemas inmunosupresoras de todo el sistema circulatorio (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7226429). Se ha descubierto que dispositivos tales como el Hemopurifier® capturan exosomas secretados por tumores que suprimen el sistema inmunitario de aquellos que padecen cancer (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 20090304677). Anterior a este descubrimiento, no existia en los tratamientos oncologicos una estrategia terapeutica para inhibir directamente o revertir la destruccion de inmunosupresores causada por exosomas. Al eliminar este mecanismo, el Hemopurifier® puede suplir una necesidad clmica insatisfecha y proporcionar los beneficios de una terapia basada en la inmunidad sin anadir toxicidad farmacologica o riesgos de interaccion con estrategias de tratamiento establecidas o que esten surgiendo.
En algunas realizaciones, el Hemopurifier® es un dispositivo de filtracion selectivo que contiene agentes de afinidad que se unen fuertemente a estructuras altas en manosa unicas a la superficie de exosomas producidos por cancer y glucoprotemas que residen en la envuelta de virus. Los agentes pueden incluir algunos biomarcadores (vease, por ejemplo, la Publicacion de Patente Internacional n.° WO 2010/065765). Estos agentes se inmovilizan sobre aproximadamente 2800 fibras huecas porosas que abarcan la longitud interna del dispositivo. El diseno resultante aumenta la capacidad de separar tanto los exosomas como los objetivos virales de las celulas sangumeas de forma que pueden retirarse de forma selectiva y permanente del sistema circulatorio. En algunas aplicaciones, la circulacion sangumea se establece en el Hemopurifier® a traves de un cateter u otro dispositivo para acceder a la sangre. Una vez se ha establecido el flujo sangumeo, el beneficio del tratamiento es inmediato ya que todo el sistema circulatorio puede pasar a traves del Hemopurifier®, en algunas realizaciones, en tan solo 15 minutos. No obstante, persiste la necesidad de medir la concentracion de exosomas en muestras de pacientes para calibrar la efectividad del tratamiento con el Hemopurifier®. Las realizaciones de la presente invencion satisfacen esta necesidad proporcionando metodos para cuantificar un amplio espectro de exosomas en muestras.
Muestras biologicas
Algunas realizaciones de los metodos y composiciones que se proporcionan en el presente documento incluyen una muestra biologica. Las muestras biologicas incluyen, por ejemplo, medio de cultivo celular y muestras obtenidas de un voluntario. Tal como se usa en el presente documento, el termino "voluntario" incluye un animal, un mairnfero y un ser humano. Una muestra obtenida de un voluntario puede incluir cualquier tejido o fluido del voluntario que pueda contener exosomas. Entre los ejemplos de muestra biologicas obtenidas de un voluntario que pueden contener exosomas se incluye sangre periferica, sueros, plasma, ascitis, orina, lfquido cefalorraqrndeo (LCR), esputo, saliva, medula osea, lfquido sinovial, humor acuoso, lfquido amniotico, cerumen, leche materna, lfquido de lavado broncoalveolar, semen (incluyendo lfquido prostatico), lfquido de Cowper o lfquido preeyaculador, eyaculacion femenina, sudor, materia fecal, pelo, lagrimas, lfquido de quiste, lfquido pleural o lfquido peritoneal, lfquido pericardico, linfa, quimo, quilo, bilis, lfquido intersticial, menstruacion, pus, sebo, vomito, secreciones vaginales, secrecion mucosa, agua de heces, jugo pancreatico, lfquidos de lavado de cavidades nasales, aspirados broncopulmonares u otros lfquidos de lavado. Una muestra biologica tambien puede incluir la cavidad de blastocisto, sangre del cordon umbilical o circulacion materna que puede ser de origen fetal o materno. La muestra biologica tambien puede ser una muestra de tejido o biopsia, de las que se pueden obtener exosomas. Por ejemplo, si la muestra es una muestra solida, pueden cultivarse las celulas de la muestra e inducirse el producto de exosoma. En algunas realizaciones, la muestra es lfquido asdtico de un voluntario, por ejemplo, Lfquido asdtico de un voluntario humano con cancer de ovarios; medio de cultivo celular sobrenadante de una lmea celular de melanoma primario humano; medio de cultivo celular sobrenadante de una lmea celular de cancer de colon primario humano; o macrofago murino, por ejemplo, macrofago murino infectado con tuberculosis.
Exosomas
Algunas realizaciones de los metodos y composiciones proporcionadas en el presente documento incluyen una muestra que comprende exosomas. En general, los exosomas son pequenas vesmulas que se liberan en el medio extracelular de una variedad de diferentes celulas, por ejemplo, celulas que se originan o derivan del ectodermo, endodermo o mesodermo incluyendo cualquiera de tales celulas que se hayan sometido a variaciones o alteraciones geneticas, ambientales y/o de otro tipo. Un exosoma se crea tfpicamente de forma intracelular cuando un segmento de la membrana celular invagina de forma espontanea y se exocita en ultima instancia (vease, por ejemplo, Keller et al. (2006), Immunol. Lett. 107: 102-8). En algunas realizaciones, los exosomas tienen un diametro superior a aproximadamente 10 nm, 20 nm o 30 nm; un diametro de, o aproximadamente de, 30 -1000 nm, 30 -800 nm, 30-200 o 30-100 nm. En algunas realizaciones, los exosomas tiene un diametro inferior a, o inferior a aproximadamente, 10.000 nm, 1000 nm, 800 nm, 500 nm, 200 nm, 100 nm o 50 nm. Los exosomas tambien pueden denominarse microvesmulas, nanovesmulas, vesmulas, dexosomas, ampolla, ampollita, prostasomas, micropartmulas, vesmulas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
intraluminales, vesmulas endosomicas o vesmulas exocitadas. Los exosomas tambien pueden incluir cualquier parffcula unida a membrana separada que viene derivada de la membrana plasmatica o de una membrana interna. Los exosomas tambien pueden incluir estructuras derivadas de celulas unidas mediante una membrana de bicapa lipfdica que surge de tanto la separacion de evaginacion herniada como del sellado de porciones de la membrana plasmatica o de la exportacion de cualquier estructura vesicular unida a membrana intracelular que contiene diversas protemas asociadas con la membrana de origen tumoral, entre las que se incluyen moleculas unidas a la superficie derivadas de la circulacion hospedadora que se unen de forma selectiva a las protemas derivadas del tumor junto con moleculas contenidas en el lumen del exosoma que incluyen microARN derivados del tumor o protemas intracelulares.
Los exosomas tambien pueden incluir fragmentos de membrana.
En algunas realizaciones, los exosomas son exosomas cancengenos. Los exosomas cancengenos incluyen exosomas de celulas cancerosas y/o celulas tumorales (primarias o cultivo celular) de canceres tales como cancer de mama, cancer de ovarios, cancer de pulmon, cancer de colon, polipo hiperplasico, adenoma, cancer colorrectal, displasia de grado alto, displasia de bajo grado, hiperplasia prostatica, cancer de prostata, melanoma, cancer de pancreas, cancer cerebral (tal como glioblastoma), malignidad hematologica, hepatocarcinoma, cancer de cuello de utero, cancer de endometrio, cancer de cabeza y cuello, cancer de esofago, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), carcinoma de celulas renales (RCC) o cancer gastrico. El cancer colorrectal incluye CRC en estadio B de Dukes o en estadio C-D de Dukes. La malignidad hematologica incluye leucemia linfatica cronica de celulas B, linfoma LDCBG de celulas B, linfoma LDCBG de celulas B centrogerminales, linfoma LDCBG de celulas B activadas y linfoma de Burkitt. Los exosomas cancengenos tambien pueden derivar de una afeccion premaligna, por ejemplo, pero sin limitacion, el esofago de Barrett. En algunas realizaciones, los exosomas cancengenos incluyen exosomas de cancer de ovarios, cancer de colon y melanoma.
Aislamiento de exosomas
Algunas realizaciones de los metodos y composiciones proporcionadas en el presente documento incluyen aislar exosomas a partir de una muestra. Tal como se usa en el presente documento, el termino "aislamiento" se refiere a aumentar la concentracion o densidad de exosomas en una muestra y, o, retirar sustancias no exosomicas (por ejemplo, protemas, celulas) a partir de una muestra. Se conocen bien en la tecnica metodos de aislamiento de exosomas. Los ejemplos de metodos utiles para aislar exosomas incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa de exclusion por tamano, centrifugacion de gradiente de densidad, centrifugacion diferencial, ultrafiltracion de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificacion de afinidad, separacion de microfluidos o combinaciones de los mismos. Puede usarse cromatograffa de exclusion por tamano, tal como columnas de permeacion de gel, centrifugacion o centrifugacion de gradiente de densidad y metodos de filtracion. Por ejemplo, pueden aislarse exosomas mediante centrifugacion diferencial, intercambio anionico y/o cromatograffa por permeacion en gel (por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n° 6.899.863 y n° 6.812.023), gradientes de densidad de sacarosa, electroforesis de organulos (por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.198.923), separacion de celulas activadas por magnetismo (MACS), o con un concentrador de ultrafiltracion de nanomembranas. Pueden usarse diversas combinaciones de metodos de aislamiento o concentracion.
Sustratos
Algunas realizaciones de los metodos y composiciones proporcionadas en el presente documente incluyen un sustrato. En algunas realizaciones el sustrato puede comprender una superficie. Los sustratos pueden incluir, pero sin limitacion, por ejemplo, placas, perlas y fibras. En algunas realizaciones, un sustrato comprende una placa multipocillo, tal como una placa de 96 pocillos convencional. Un sustrato puede comprender cualquier material adecuado. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero sin limitacion, sefarosa, latex, vidrio, poliestireno, polivinilo, nitrocelulosa y silicio.
Agentes de union a exosomas
Las lectinas usadas para esta invencion se seleccionan del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A. En algunas realizaciones, la lectina es GNA, NPA, SNA o MAL. En realizaciones particulares, la lectina es GNA.
Restos detectables
Algunas realizaciones de los metodos y composiciones proporcionadas en el presente documento incluyen un agente de union a exosomas o un agente de union secundario que comprende un resto detectable. Entre los ejemplos de restos detectables se incluyen, pero sin limitacion enzimas, tal como peroxidasa de rabano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), p-galactosidasa y ureasa. Puede usarse un sistema de deteccion de peroxidasa de rabano picante, por ejemplo, con el sustrato cromogenico tetrametilbencidina (TMB), que da un producto soluble en presencia de peroxido de hidrogeno que es detectable a 450 nm. Otros sistemas enzimaticos convenientes incluyen,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
por ejemplo, el sistema de deteccion de fosfatasa alcalina, que puede usarse con el sustrato cromogenico fosfato de p-nitrofenilo para dar un producto soluble facilmente detectable a 405 nm. De forma analoga, puede usarse un sistema de deteccion de p - galactosidasa con el sustrato cromogenico orto-nitrofenil-p-D-galactopiranosido (ON-PG) para dar un producto soluble detectable a 410 nm o puede usarse un sistema de deteccion de ureasa con un sustrato tal como urea- purpura de bromocresol (Sigma Immunochemicals, San Luis, Mo.).
Mas ejemplos de restos detectables incluyen, pero sin limitacion, marcadores quimioluminiscentes. Se conocen en la tecnica metodos de deteccion de marcadores quimioluminiscentes. La deteccion fluorescente tambien puede ser util en ciertos metodos que se proporcionan en el presente documento. Los ejemplos de fluorocromos incluyen, pero sin limitacion, DAPI, fluorescema, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo Texas y lisamina. Anticuerpos marcados con fluorescema o rodamina, o anticuerpos secundarios marcados con fluorescema o rodamina pueden ser utiles con realizaciones que se proporcionan en el presente documento. Un ejemplo de anticuerpo secundario incluye un anticuerpo de anti-GNA. Tambien pueden ser utiles isotopos en ciertos metodos proporcionados en el presente documento. Tales restos y ensayos se conocen bien en la tecnica.
Puede analizarse una senal a partir de un resto detectable, por ejemplo, usando un espectrofotometro para detectar el color de un sustrato cromogenico; un contador de radiacion para detectar la radiacion, tal como un contador gamma para la deteccion de 125I; o un fluonmetro para detectar la fluorescencia en presencia de luz de una cierta longitud de onda. Cuando se usa un ensayo enzimatico, puede realizarse un analisis de la cantidad de un biomarcador utilizando un espectrofotometro, tal como un Lector de Microplacas EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos de la invencion pueden automatizarse o realizarse de manera robotica y la senal de multiples muestras puede detectarse simultaneamente.
Metodos para cuantificar exosomas
Realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento incluyen cuantificar exosomas en una muestra biologica. Exosomas unidos a una lectina inmovilizada en un sustrato se detectan y/o cuantifican usando un agente de union a exosomas detectable que incluye lectina, un anticuerpo de union a exosoma, o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el agente de union a exosomas detectable se detecta usando un agente de union secundario que se marca con un resto detectable. Por ejemplo, un anticuerpo secundario que reconoce el agente de union a exosomas detectable.
Se pone en contacto una muestra biologica que comprende exosomas con un sustrato que tiene una superficie con lectina inmovilizada en la misma. La muestra biologica se incuba con la lectina inmovilizada, y los exosomas se unen a la lectina inmovilizada. La muestra biologica no unida se lava de la superficie. Los exosomas unidos se detectan y miden usando un agente de union a exosomas, por ejemplo, un agente que comprende una lectina marcada, o un anticuerpo marcado o un fragmento marcado del mismo. Detectar y medir incluye poner en contacto los exosomas unidos con el agente de union a exosomas detectable; incubar el agente con los exosomas unidos; y lavar el agente no unido de los exosomas unidos a la lectina inmovilizada en el sustrato. Puede medirse la senal del agente de union a exosomas detectable unido (de forma opcional poniendo en contacto el agente de union a exosomas con un agente de union marcado secundario) y el nivel de la senal puede usarse para determinar la cantidad de exosomas unidos a la lectina inmovilizada en el sustrato. Metodos para determinar la cantidad de exosomas unidos usando una senal medida pueden incluir comparar el nivel de la senal con una referencia, tal como una curva patron. Una curva patron de ejemplo incluye una curva que se ha preparado usando un control con diversas cantidades de un compuesto de union a lectina, tal como manano o perlas recubiertas con manano. En algunas realizaciones, el metodo incluye de forma opcional aislar exosomas en una muestra antes de poner en contacto la muestra con lectina inmovilizada a un sustrato. Metodos para aislar exosomas son bien conocidos en la tecnica y tambien se proporcionan ejemplos en el presente documento.
Un agente de union a exosomas unido a un exosoma puede detectarse y medirse mediante una diversidad de metodos. Preferentemente, el agente de union a exosomas comprende un resto detectable. El resto detectable puede detectarse y medirse usando metodos bien conocidos en la tecnica; ejemplos de tales metodos se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, la senal del resto detectable puede compararse con una senal de una referencia, por ejemplo, una curva patron. Usando tales metodos bien conocidos, puede determinarse la cantidad relativa de resto detectable unido. Por consiguiente, puede determinarse la cantidad relativa de exosomas unidos mediante el resto de union de exosomas que comprende el resto detectable.
En algunas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, la sensibilidad del metodo de deteccion de exosomas en una muestra es, es alrededor de, es al menos de, o es al menos alrededor de, 1 x 1010 exosomas/ml, 1 x 109 exosomas/ml, 1 x 108 exosomas/ml, 1 x 107 exosomas/ml, o 1 x 106 exosomas/ml, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los anteriores valores. En algunas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, la sensibilidad de deteccion de exosomas es relativa a una referencia, por ejemplo, perlas recubiertas con manano. En dichas realizaciones, la sensibilidad de deteccion de exosomas en una muestra es equivalente a, es equivalente a alrededor de, es equivalente al menos a, o es equivalente al menos alrededor de, 1 x 1010 perlas/ml, 1 x 109 perlas/ml, 1 x 108 perlas/ml, 1 x 107 perlas/ml, o 1 x 106 perlas/ml, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los anteriores valores. En algunas realizaciones, la sensibilidad de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
deteccion de exosomas en una muestra es, es alrededor de, es al menos de, o es al menos alrededor de, el equivalente de 1000 ng de manano/ml, 500 ng de manano/ml, 100 ng de manano/ml, 50 ng de manano/ml, 1000 pg de manano/ml, 500 pg de manano/ml, 100 pg de manano/ml, o 50 pg de manano/ml, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los anteriores valores.
Ejemplos
Ejemplo 1- Preparacion de un sustrato recubierto con lectina
Una placa de 96 pocillos recubierta con lectina se preparo anadiendo 100 pl de lectina 10 pg/ml de Galanthus nivalis (GNA) a cada pocillo y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. La solucion de GNA se retiro de los pocillos. La lectina inmovilizada se bloqueo con 200 pl de BSA 1 % + Tween 20 0,1 % en una solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBs) 1 x durante 1 hora a temperatura ambiente.
Ejemplo 2- Cuantificacion de union de manano en un sustrato recubierto con lectina
Para generar una curva patron de manano, se incubaron 100 pl por pocillo de una solucion de manano en cada pocillo en una placa preparada como en el ejemplo 1 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se usaron soluciones que conteman 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25ng/ml, 3,125 ng/ml y 1,5625 ng/ml de manano en dPBS 1 X, y un blanco sin manano (dPBS solo), para crear la curva patron. La solucion de manano se lavo de la placa x1 con 300 pl de Tween 20 0,1 % en dPBS (solucion de lavado) y se detecto manano unido mediante incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de GNA marcado (1 pg/ml) con peroxidasa de rabano picante (HRP). La placa se lavo x 4 con una solucion de lavado y se detecto con 100 pl de tetrametilbencidina (TMB) (SIGMA-Aldrich). La TMB se incubo hasta 30 minutos o hasta que se vio color en el blanco. La reaccion de HRP de TMB se detuvo con 100 pl de acido sulfurico 1 M. El color amarillo resultante se midio en un lector de placa a 450 nm de longitud de onda. La curva patron resultante se muestra en la FIG.1.
Ejemplo 3- Cuantificacion de perlas de manano en un sustrato de lectina
Se prepararon perlas recubiertas con manano mediante la incubacion de manano a 1 mg/ml con perlas de latex fluorescente 1e14 (100 nm de diametro), que recubre las perlas de tal modo que pueden capturarse por un GNA. Para preparar una curva patron, las perlas recubiertas con manano se incubaron en una placa que se preparo como en el ejemplo 1. 100 pl de las perlas de manano se incubaron en la placa durante 1 hora a temperatura ambiente a 1e10 perlas/ml, 5e09 perlas/ml, 2,5e09 perlas/ml, 1,25e09 perlas/ml, 6,25e08 perlas/ml, 3,125e08 perlas/ml, y 1,56e08 perlas/ml, 7,81e07 perlas/ml, 3,91e07 perlas/ml, 1,95e07 perlas/ml, 9,77e06 perlas/ml en 1X dPBS, y un blanco sin perlas de manano (dPBS solo), para crear una curva patron, parte de esta curva patron se muestra en la FIG. 2. La solucion de perla de manano se lavo de la placa x 1 con 300 pl de Tween 20 0,1 % en dPBS (solucion de lavado) y se detectaron perlas de manano unidas mediante incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de GNA marcado (1 pg/ml) con HRP. La placa se lavo x 4 con solucion de lavado y se detecto con 100 pl de TMB. La TMB se incubo hasta 30 minutos o hasta que se vio color en el blanco. La reaccion de HRP de TMB se detuvo con de acido sulfurico 1 M. El color amarillo resultante se midio en un lector de placa a 450 nm de longitud de onda.
Ejemplo 4- Cuantificacion de exosomas celulares de cancer de ovarios
Se obtuvo y trato una muestra de exosoma de celulas de cancer de ovarios de acuerdo con los metodos de los ejemplos 2 y 3 usando placas preparadas como en el ejemplo 1. La senal generada a partir de los exosomas de cancer de ovarios se correlaciono con las curvas patron de manano y de perlas de manano de los ejemplos 2 y 3; las perlas recubiertas con manano tienen aproximadamente el mismo tamano que los exosomas de cancer de ovarios. Los resultados de tales experimentos se muestran en la FIG. 3 y FIG. 4.
Ejemplo 5- Cuantificacion de exosomas de macrofago infectado con bacilo de tuberculosis (TB)
Se incuba una muestra de exosoma purificado a partir de un macrofago infectado con bacilo de tuberculosis (TB) mediante el mismo metodo y en la misma placa que las curvas de patron de manano o de perla de latex de manano descritas en los ejemplos 1, 2 y 3. La senal generada a partir de los exosomas derivados del macrofago infectado con TB se correlaciona con una cantidad conocida de manano o un numero de perlas recubiertas de manano que tienen aproximadamente el mismo tamano que el exosoma derivado del macrofago infectado con TB.
Ejemplo 6- Optimizacion de perlas recubiertas de manano
La prueba ELLSA de lectina se optimizo con diferentes concentraciones de GNA recubierto. En un experimento, Se incubaron 100 pl de GNA en dPBS durante 1 hora a temperatura ambiente en los pocillos de una placa de 96 pocillos con las siguientes concentraciones: 10 pg/ml, 5 pg/ml, 2,5 pg/ml y 1,25 pg/ml. La solucion de recubrimiento de GNA se retiro de la placa a continuacion y la placa se bloqueo con 300 pl de BSA 1%, Tween 20 0,1 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Bien el manano o bien las perlas recubiertas de manano se incubaron en la placa
5
10
15
20
25
30
35
40
durante 1 hora a temperatura ambiente a 1000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml y 1 ng/ml para el manano y 1e11 perlas/ml, 1e10 perlas/ml, 1e9 perlas/ml y 1e8 perlas/ml para perlas de latex de manano, incluyendo 2 pocillos blancos (dPBS solo) por concentracion de recubrimiento de GNA para determinar la sensibilidad y antecedentes de la prueba. Se incubo manano o perlas de manano durante 1 hora a temperatura ambiente en las platas recubiertas de GNA. Los pocillos se lavaron x 1 con 300 pl de solucion de lavado. Se incubaron 100 pl de GNA (1 pg/ml) marcado con HRP con manano unido o perlas de manano durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron x 4 con 300 pl de solucion de lavado y se anadieron 100 pl de TMB a cada pocillo durante 30 minutos o hasta que se desarrollo color en los pocillos blancos. La reaccion de HRP de TMB se detuvo con acido sulfurico 1 M y el color amarillo resultante se midio en un lector de placa a 450 nm de longitud de onda. Los resultados se muestran en las FIG. 5A y 5B. Los sustratos recubiertos con 10 pg/ml de GNA proporcionaron resultados optimos en este experimento.
Ejemplo 7- Cuantificacion de exosomas de cancer de colon
Se preparo una placa de 96 pocillos de acuerdo con el ejemplo 1. Se obtuvieron diversas diluciones de sobrenadantes de medios de cultivo celular a partir de celulas de cancer de colon primario.
Se anadio una muestra de 100 pl de un patron de perla de manano o una muestra sobrenadante a cada pocillo y se incubo durante 1 hora aTA. Las placas se lavaron X 1 con PBS + Tween-20 0,1 %. Se detectaron exosomas unidos o manano unido mediante la adicion de 100 pl de GNA 1 pg/ml acoplado a peroxidasa de rabano picante (HRP) e incubandolo durante 1 hora a TA, lavando la placa X 4 con PBS + Tween-20 0,1 %. Se detecto y midio HRP anadiendo 100 pl de tetrametilbencidina, permitiendo que el color se desarrolle 30 minutos a TA, deteniendo la reaccion con 100 pl de acido sulfurico 1 M. La intensidad de color se midio a una absorbancia de 450 nm. La FIG 6 muestra la curva patron de perla de manano. La tabla 1 resume la concentracion de exosoma calculada relativa a la curva patron de manano.
TABLA 1
Dilucion sobrenadante
A450 Concentracion de exosomas relativa a la curva patron de perla de manano (perlas/ml)
1,00
1,019 3,28E+09
0,1
0,08 3,43E+07
0,01
0,039 9,47E+06
0,001
0,028 5,23E+06
Ejemplo 8- Cuantificacion de exosomas de melanoma
Se prepararon sobrenadantes de cultivo celular de exosomas de melanoma mediante la siembra en placas de cinco lmeas celulares de melanoma (lmeas celulares de melanoma primario humano). Despues de cinco dfas, se lavaron las celulas y a continuacion se incubaron durante 48 horas en medios complementados. Se recogieron los sobrenadantes.
Se detectaron y midieron los exosomas como se describe en el ejemplo 7. La tabla 2 resume las mediciones de absorbancia a 450 nm de sobrenadantes diluidos y la concentracion de los exosomas respecto a una curva patron de manano.
TABLA 2
Lmea celular
Dilucion sobrenadante A450 Concentracion de exosomas respecto a la curva patron de manano (ng/ml) Concentracion de exosomas relativa media (ng/ml)
No diluido 0,298 24
CCS-1
1:2 0,211 26 25
1:4 0,152 25
No diluido 0,531 51
CCS-2
1:2 0,267 40 45
1:4 0,191 43
CCS-3
No diluido 0,171 8 17
5
10
15
20
25
Lmea celular
Dilucion sobrenadante A450 Concentracion de exosomas respecto a la curva patron de manano (ng/ml) Concentracion de exosomas relativa media (ng/ml)
1:2 0,187 21
1:4 0,144 21
No diluido 0,388 34
CCS-4
1:2 0,313 51
1:4 0,203 49 45
No diluido 0,263 19 20
CCS-5
1:2 0,182 20
1:4 0,147 22
Ejemplo 9- Cuantificacion de exosomas de cancer de ovarios
Se obtuvieron diversas diluciones de lfquido asdtico humano a partir de un paciente con cancer de ovarios. Los exosomas en el fluido se cuantificaron de acuerdo con un metodo similar al metodo descrito en el ejemplo 7. La tabla 3 resume las concentraciones calculadas de los exosomas de ovarios respecto al manano.
TABLA 3
Dilucion sobrenadante
A450 Concentracion de exosomas respecto a la curva patron de manano (ng/ml)
1
0,404 55,6
0,5
0,259 35,4
0,25
0,163 22,1
0,125
0,115 15,4
0,0625
0,073 9,6
0
0
-0,5
Ejemplo 10- Cuantificacion de exosomas derivados de macrofago infectado con tuberculosis
Se purificaron exosomas de macrofago murino infectado con tuberculosis mediante el uso de un gradiente de sacarosa, o usando una resina de GNA y eluyendo con metil alfa-manosidasa 1 M. Las concentraciones de exosomas se determinaron usando un metodo similar al metodo del ejemplo 7. La FIG. 7 resume los resultados.
Ejemplo 11- Cuantificacion de exosomas de cancer de ovarios con un anticuerpo de Anti-PLAP
Se ensayo la capacidad del anti fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) para detectar exosomas de cancer de ovarios unidos a placas recubiertas de GNA. Las placas multipocillo recubiertas de GNA se prepararon como se describe en el ejemplo 1. Los exosomas celulares de cancer de ovarios se incubaron en los pocillos. La presencia de exosomas se determino usando un anticuerpo anti-PLAP marcado que detecta un marcador de celulas de ovarios. Los resultados se resumen en la FIG. 8.
La expresion "que comprende" tal como se usa en el presente documento es sinonimo de "que incluye", "que contiene", o "caracterizado por", y es inclusivo o indeterminado y no excluye elementos o etapas de metodo adicionales no mencionados.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de cuantificacion de exosomas en una muestra que comprende:
    poner en contacto la muestra con lectina inmovilizada en un sustrato;
    poner en contacto exosomas unidos a la lectina con un agente de union a exosomas detectable; y
    medir una senal del agente de union a exosomas detectable unido, cuantificando de este modo los exosomas
    unidos;
    en los que se selecciona la lectina a partir del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente comparar la senal del agente de union detectable unido con una senal en una curva patron.
  3. 3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que los exosomas se derivan de una celula seleccionada del grupo que consiste en una celula de cancer de ovarios, una celula de melanoma, una celula de cancer de colon y una celula infectada de tuberculosis.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el metodo proporciona una sensibilidad de deteccion de exosomas en la muestra que es de al menos 1 x 109 exosomas/ml, preferentemente de al menos 1 x 108 exosomas/ml o mas preferentemente de al menos 1 x 107 exosomas/ml.
  5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra comprende un exosoma que tiene un diametro de 10 nm a 800 nm, o preferentemente un diametro de 30 nm a 200 nm.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la muestra comprende exosomas aislados de un fluido mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en cromatograffa de exclusion por tamano, centrifugacion de gradiente de densidad, centrifugacion diferencial, ultrafiltracion de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificacion de afinidad, separacion de microfluidos y una combinacion de los mismos.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que al menos una de la lectina inmovilizada en el sustrato y el agente de union detectable son capaces de unirse a exosomas derivados de una pluralidad de tipos de celulas.
  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el agente de union a exosomas detectable se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una lectina seleccionada del grupo que consiste en lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), lectina de Allium sativum (ASA), lectina de Lens culinaris (LCH), lectina de Sambucus nigra (SNA), lectina de Maackia amurensis (MAL) y concanavalina A; y opcionalmente en el que el agente de union a exosomas detectable comprende un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en una enzima, un agente quimioluminiscente, un agente fluorescente y un isotopo.
  9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre periferica, suero, plasma, ascitis, orina, lfquido cefalorraqrndeo (LCR), esputo, saliva, medula osea, lfquido sinovial, humor acuoso, ifquido amniotico, cerumen, leche materna, lfquido de lavado broncoalveolar, semen, lfquido prostatico, lfquido de Cowper o lfquido preeyaculador, eyaculacion femenina, sudor, materia fecal, pelo, lagrimas, lfquido de quiste, lfquido pleural o lfquido peritoneal, lfquido pericardico, linfa, quimo, quilo, bilis, kquido intersticial, menstruacion, pus, sebo, vomito, secreciones vaginales, secrecion mucosa, agua de heces, jugo pancreatico, lfquidos de lavado de cavidades nasales, aspirados broncopulmonares, lfquido de cavidad de blastocisto, sangre de cordon umbilical y lfquido asdtico.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el sustrato comprende una placa multipocillo que comprende un material seleccionado del grupo que consiste en sefarosa, latex, vidrio, poliestireno, polivinilo, nitrocelulosa y silicio.
ES11804372.8T 2010-07-07 2011-07-07 Métodos para cuantificar exosomas Active ES2624284T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36212910P 2010-07-07 2010-07-07
US362129P 2010-07-07
PCT/US2011/043265 WO2012006476A2 (en) 2010-07-07 2011-07-07 Methods and compositions for quantifying exosomes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2624284T3 true ES2624284T3 (es) 2017-07-13

Family

ID=45441811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11804372.8T Active ES2624284T3 (es) 2010-07-07 2011-07-07 Métodos para cuantificar exosomas

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20130323756A1 (es)
EP (1) EP2591359B1 (es)
ES (1) ES2624284T3 (es)
WO (1) WO2012006476A2 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116362A2 (en) 2005-04-25 2006-11-02 The Trustees Of Boston University Structured substrates for optical surface profiling
DK3517151T3 (da) * 2006-03-09 2021-07-12 Aethlon Medical Inc Ekstrakorporal fjernelse af mikrovesikulære partikler
WO2010065765A2 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Aethlon Medical, Inc. Affinity capture of circulating biomarkers
EP2542696B1 (en) 2010-03-01 2016-09-28 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Biomarkers for theranostics
JP2013526852A (ja) 2010-04-06 2013-06-27 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス 疾患に対する循環バイオマーカー
US9493810B2 (en) * 2012-06-07 2016-11-15 Pioma, Inc. 5-ALA for detection of brain tumors
KR101933622B1 (ko) * 2012-10-09 2018-12-28 삼성전자주식회사 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법
WO2014059336A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 University Of Notre Dame Du Lac Exosomes and diagnostic biomarkers
CN103767985A (zh) * 2012-10-22 2014-05-07 吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用
CN110106229B (zh) * 2013-01-03 2023-03-28 外来体诊断公司 用于分离微囊泡的方法
CA2904181A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Anahit Aghvanyan Sandwich immunoassay comprising anchoring reagent
US10114015B2 (en) 2013-03-13 2018-10-30 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods
CA2907606A1 (en) * 2013-04-08 2014-10-16 Shionogi & Co., Ltd. Method for detecting colon cancer
WO2015143113A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 Barb Ariel Cohen Preparations of derived extracellular vesicles, assays, and methods to modify therapeutic outcomes using such preparations
EP3143401A4 (en) * 2014-05-15 2017-10-11 Meso Scale Technologies, LLC Improved assay methods
US11268085B2 (en) 2014-05-27 2022-03-08 Exosome Diagnostics, Inc. Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples
CA3084920C (en) 2014-07-09 2023-02-28 Exosome Diagnostics, Inc. Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples
JP2016147839A (ja) * 2015-02-13 2016-08-18 国立大学法人広島大学 タンパク質分離デバイス、タンパク質を分離する方法、および、高マンノース型糖鎖の構造を決定する方法
CA2988771A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Diagnostic test for early stage cancer
AU2016327573B2 (en) 2015-09-22 2022-07-14 Trustees Of Boston University Multiplexed phenotyping of nanovesicles
WO2017136676A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Nanoview Diagnostics Inc. Detection of exosomes having surface markers
WO2018208670A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Trustees Of Tufts College EXTRACELLULAR VESICLES COMPRISING MEMBRANE-TETHERED TGF-β, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP3623809A4 (en) 2017-05-12 2021-03-24 Hiroshima University CANCER DIAGNOSTIC DEVICE
WO2019066501A1 (ko) * 2017-09-27 2019-04-04 ㈜로제타엑소좀 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도
KR102243415B1 (ko) * 2017-09-27 2021-04-22 ㈜로제타엑소좀 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도
CN115047182B (zh) * 2017-10-05 2025-03-11 香港科技大学 外泌体分析及癌症诊断方法
US12083448B2 (en) 2017-12-29 2024-09-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Purification and labeling of extracellular vesicles using a mixed mode resin composition
JP2019154283A (ja) * 2018-03-09 2019-09-19 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導することにより得られうる細胞集団から骨芽細胞を検出する方法、及びその方法のために用いられるキット
WO2019232321A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 NanoView Biosciences, Inc. Compositions, systems, and methods for enhanced label-free and fluorescence - based detection of nanoparticles
AU2019362006A1 (en) * 2018-10-17 2021-05-20 ImMutriX Therapeutics, Inc. Adsorption and binding of plasma molecules and particles to carbon
CN120098057A (zh) 2019-03-01 2025-06-06 中尺度技术有限责任公司 用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的方法和包含这类探针的试剂盒
CN111257073B (zh) * 2020-01-19 2022-03-25 北京尧景基因技术有限公司 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物
CN111253491B (zh) * 2020-01-19 2022-03-25 北京尧景基因技术有限公司 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物
JP7591205B2 (ja) * 2020-09-01 2024-11-28 株式会社Ｊｖｃケンウッド 膵臓がんのデータ収集方法及び膵臓がん検出キット
CN113275133A (zh) * 2021-06-09 2021-08-20 会泽县民悦农业科技有限公司 清洁型原粮除杂系统

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4629694A (en) * 1983-07-12 1986-12-16 Cornell Research Foundation, Inc. Detecting and distinguishing between plasminogen activators
CA2268038A1 (en) * 1996-10-15 1998-04-23 Seikagaku Corporation Method for assaying agalacto-igg and assay kits, polypeptides of lectins, and dnas encoding the same
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
KR100394940B1 (ko) * 1999-11-10 2003-08-19 주식회사 코비아스 간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로당단백질양의측정방법 및 측정용 킷트
GB9927320D0 (en) 1999-11-18 2000-01-12 Chiron Spa Exosome separation
US20010055596A1 (en) * 2000-03-24 2001-12-27 Meagher Madeleine Joy Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer
US6812023B1 (en) 2000-04-27 2004-11-02 Anosys, Inc. Methods of producing membrane vesicles
US7462491B2 (en) * 2002-01-31 2008-12-09 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for diagnosis and monitoring of prostate cancer progression by detection of serum caveolin
WO2004064608A2 (en) 2003-01-17 2004-08-05 Aethlon Medical, Inc. Method for removal of viruses from blood by lectin affinity hemodialysis
US7776550B2 (en) * 2005-05-05 2010-08-17 Philadelphia Health & Education Corporation Diagnosis of liver pathology through assessment of protein glycosylation
DK3517151T3 (da) * 2006-03-09 2021-07-12 Aethlon Medical Inc Ekstrakorporal fjernelse af mikrovesikulære partikler
WO2008029886A1 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 National University Corporation Tottori University Kit for diagnosis of alzheimer's disease, diagnostic marker, and method for detection of indicator for disease condition
CA2676113C (en) * 2007-07-25 2014-07-08 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker
US8617806B2 (en) 2008-01-25 2013-12-31 Hansabiomed Ou Method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
WO2010065765A2 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Aethlon Medical, Inc. Affinity capture of circulating biomarkers
US20120077263A1 (en) * 2009-06-05 2012-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for isolating exosomes
CN103782174A (zh) * 2011-06-07 2014-05-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于癌症的循环生物标志物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2591359A4 (en) 2014-01-22
EP2591359A2 (en) 2013-05-15
WO2012006476A3 (en) 2012-04-12
US20200166514A1 (en) 2020-05-28
EP2591359B1 (en) 2017-03-01
WO2012006476A2 (en) 2012-01-12
US20130323756A1 (en) 2013-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2624284T3 (es) Métodos para cuantificar exosomas
ES2626611T3 (es) Sistema microfluídico usando micro-aberturas para la detección de alto rendimiento de entidades
KR102243597B1 (ko) 세포로의 선택적 물질 전달
JP6163560B2 (ja) マイクロ流体細胞の捕捉チップ及びその製作方法
US10434511B2 (en) Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
US9816987B2 (en) Rotors for immunoassays
US20080050769A1 (en) Method for detecting bioparticles
CN103792364B (zh) 用于检测外周血中循环肿瘤细胞ror1蛋白的试剂及其应用
Nowak et al. Entamoeba histolytica-pathogenic protozoan of the large intestine in humans
ES2436372T3 (es) Detección de Trichomonas y Candida
CN102027127A (zh) 一种包括肝羧酸酯酶1的用于诊断肝癌的血浆生物标记物工具及肝癌筛选方法
Park et al. High-precision extracellular-vesicle isolation-analysis integrated platform for rapid cancer diagnosis directly from blood plasma
CN106645752A (zh) Galectin‑10及其特异性抗体在制备检测鼻咽癌试剂盒中的应用
CN103487493A (zh) 尿液分子的应用
CN104990905B (zh) 一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒
JP2022104553A (ja) ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法
CN102344916B (zh) 类风湿关节炎特异性抗原
WO2013104103A1 (zh) 诊断和预示肠癌的标志物
Li et al. Detection of serum EphA2-EVs for pancreatic cancer diagnosis by light initiated chemiluminescent assay
CN107271672B (zh) 外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用
JP6669731B2 (ja) がん患者由来のヒト血清のエクソソーム画分からのアスパルチル（アスパラギニル）ベータヒドロキシラーゼ（ｈａａｈ）の回収
CN111019901A (zh) 一种捕获肠癌循环肿瘤细胞的方法
CN103076447B (zh) 血吸虫虫卵粗抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒
TWI490230B (zh) 卵巢癌專一性寡胜肽及其應用
WO2025129182A1 (en) Screening samples for subclinical indicia of cancer