ES2624665T3 - Medio cromogénico selectivo - Google Patents
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Abstract
Un medio cromogénico adecuado para el crecimiento selectivo y la detección de una o más levadura(s) de una levadura de los géneros Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del género Zygosaccharomyces, y/o una levadura del género Lachancea, y dicho medio comprende - al menos un nutriente adecuado para la alimentación y/o el crecimiento de dicha una o más levadura(s) a detectar, - un agente capaz de inhibir el crecimiento de especies de Saccharomyces, y - una tinción cromogénica, en la que la tinción cromogénica es la combinación de los siguientes colorantes, y dicha combinación es cromática con luz visible: - múltiple(s) tipo(s) de bis-3,7 diaminofenotiazinas sustituidas y/o sin sustituir que comprenden una mezcla de azul de metileno y Azure B, y - uno o múltiple(s) tipo(s) de fluoresceína(s) sustituida(s) en el que la fluoresceína sustituida se selecciona del grupo que consiste en eosina Y, eosina B y cualquier mezcla de las mismas.
Description
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DESCRIPCION
Medio cromogenico selectivo Campo de la invencion
La invencion se refiere a medios cromogenicos adecuados para el crecimiento y la deteccion selectivos de una o mas especies de levaduras seleccionadas.
Preferiblemente, la invencion se refiere a metodos adecuados para la deteccion de especies de levaduras de Brettanomyces/Dekkera y Zygosaccharomyces y para la determinacion del recuento de celulas de dichas levaduras. La invencion se refiere ademas al uso de dicho metodo en los procesos de la industria enologica y/o alimentaria y a los medios y kits necesarios para llevar a cabo el examen.
Antecedentes de la invencion
La invencion es adecuada para la deteccion de las especies de levaduras descritas en la presente memoria teoricamente a partir de cualquier tipo de muestra, preferiblemente a partir de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos o una materia prima de alimentos.
La deteccion y separacion selectivas de especies de levaduras que tienen un papel en la produccion de cerveza y vino que en muchos casos se ven perjudicadas por las especies de levaduras naturales tiene una importancia especial.
Loureiro V y Malfeito-Ferreira M. [Spoilage yeasts in the wine industry. Int J Food Microbiol. 2003; 86(1-2):23-50.] proporcionan un resumen detallado sobre los problemas microbiologicos provocados por levaduras que estan presentes en el vino. Los autores de la publicacion hablan sobre los metodos que se conocen en la actualidad para la deteccion de levaduras que provocan el deterioro de alimentos, y analizan los factores que ayudan a la colonizacion por levaduras en las uvas y el vino.
La depreciacion del vino que se origina por razones microbiologicas provoca perdidas graves en todo el mundo, y afecta aun mas gravemente al vino de categonas de primera calidad, que madura en un barril de madera.
Como este problema tiene una enorme importancia economica, los procedimientos que reconocen la presencia y la multiplicacion de microorganismos daninos con el tiempo son extremadamente importantes. Con la ayuda de estos, se puede prevenir la infestacion, o se puede realizar de manera selectiva una intervencion para disminuir el grado de deterioro.
La mayona de los microorganismos que tienen un papel en la creacion del vino entran en el proceso desde las uvas o desde el equipo de produccion del vino.
La composicion de las especies y el numero de celulas de la microflora cambian dependiendo de las circunstancias, el numero de bacterias es infinitesimal, y las levaduras predominan. Entre las levaduras, aparte de la cepa cultivada (noble) de Saccharomyces hay presentes muchas levaduras naturales, que predominan en el medio de fermentacion durante mucho tiempo. Entre las levaduras naturales, los generos de Brettanomyces/Dekkera y Zygosaccharomyces toleran relativamente bien un nivel alto de concentracion de alcohol y son resistentes a los procedimientos habituales de produccion de vino, y por lo tanto si proliferan durante la maduracion del vino pueden provocar su deterioro.
Los generos de Zygosaccharomyces, especialmente Zygosaccharomyces bailii, pueden generar una fermentacion secundaria indeseable y la formacion de un aroma desfavorable en los vinos con un contenido de azucar residual, pero al mismo tiempo tienen un papel muy importante en el comienzo de la fermentacion de mosto con alto contenido de azucar y en la fermentacion de mosto con una proporcion inadecuada glucosa:fructosa
Hay un caracter fenolico adverso (el llamado "caracter brett") que esta provocado por el subproducto del metabolismo de las especies de Brettanomyces (principalmente la B. bruxellensis), en particular durante la produccion de vino tinto, y como consecuencia existe una disminucion significativa de la calidad y el precio. Estos componentes indeseables de aroma se describieron mediante evaluaciones sensoriales como "desinfectante", "caracter brett", "cuero", "perro mojado" "rancio", "caballo sudado" "estiercol", "urinario" y "caracter animal". Los compuestos que surgen por la influencia de Brettanomyces, en pequenas cantidades, pueden contribuir a la complejidad del vino (animalidad leve), sin embargo, por encima de cierto numero de celulas, la presencia de Brettanomyces es indeseable. Su proliferacion en una etapa temprana de la maduracion se puede prevenir con un tratamiento con monoxido de carbono, al que estas levaduras son relativamente sensibles. Aunque la sulfuracion por sf misma puede influir en el olor del vino de una manera desventajosa y puede inhibir el desarrollo, y por tanto el tratamiento tiene que ser selectivo. La condicion de la intervencion selectiva es la identificacion temprana de la presencia de Brettanomyces en el vino en maduracion, cuando el numero de estos microorganismos y la concentracion de sus productos del metabolismo todavfa son bajos.
Para esto, se pueden usar varios metodos analfticos (ELISA, metodos de biologfa molecular, citometna de flujo, cultivo, metodos de cromatograffa), pero la mayona de ellos requieren un equipo y conocimientos especiales, y
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ademas consumen mucho tiempo y son caros, porque en el medio hay un gran numero de otros microorganismos que hacen que la demostrabilidad sea muy diffcil.
Por ejemplo, Cocolin y colaboradores [Molecular Detection and Identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in Spoiled Wines. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(3): 1347-1355.] crearon un ensayo mediante PRC-RFLP para la identificacion de Brettanomyces bruxellensis y Brettanomyces anomalus. La clave de su metodo es que se obtienen diferentes patrones para las dos especies, cuando un fragmento de ADN que se amplifica durante la reaccion de PCR se digiere con enzimas de restriccion. El metodo es muy sensible, y es adecuado para detectar y separar dos especies de Brettanomyces, sin embargo, se requiere un equipamiento de laboratorio especial y es relativamente costoso.
Phister y Mills [Real-Time PCR Assay for Detection and Enumeration of Dekkera bruxellensis in Wine. Applied and Environmental Microbiology. 2003; 69(12):7430-7434.] usaron el metodo de RT-PCR para la identificacion de Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis en el vino. El metodo es muy sensible (es capaz de hacer una deteccion a una concentracion de 1 celula/ml) y selectivo, pero es aun mas caro que la pCr tradicional, los costes de equipamiento tambien son altos y su uso requiere un personal adecuadamente cualificado.
Stender y colaboradores [Identification of Dekkera bruxellensis (Brerranomyces) from wine by fluorescence in situ hybridization using peptide nucleic acid probes. Appl. Environ. Microbiol. 67:938-941 (2001)] detectaron Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis a partir de vino, Connell y colaboradores [Rapid Detection and Identification of Brettanomyces from Winery Air Samples Based on Peptide Nucleic Acid Analysis. Am. J. Enol. Vitic. 2002; 53(4): 322-24] detectaron cepas de Brettanomyces a partir del aire de bodegas con el metodo de hibridacion in situ quimioluminiscente (con la aplicacion de una sonda de acido peptidonucleico). El metodo es muy sensible, pero se basa en el cultivo, y por lo tanto consume tiempo y requiere trabajadores cualificados, y ademas el coste de las pruebas es significativo.
Mitrakul y colaboradores [Discrimination of Brettanomyces/Dekkera yeast isolates from wine by using various DNA fingerprinting methods. Food Microbiol. 1999 16 3-14.] usaron el metodo RAPD-PCR para la identificacion de cepas de Brettanomyces/Dekkera. Este metodo es adecuado para la identificacion de especies y cepas, pero su condicion es tener un instrumento especial (PCR). Los autores lo usaron en combinacion con otros metodos de identificacion, que se basan en el cultivo y las pruebas fisiologicas, y por lo tanto el ensayo tambien requirio tiempo.
Ibeas y colaboradores [Detection of Dekkera-Brettanomyces Strains in Sherry by a Nested PCR Method. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62(3) 998-1003] identificaron cepas de Brettanomyces/Dekkera en jerez con PCR "anidada". Este metodo es muy sensible, no requiere cultivar las cepas, y por lo tanto da un resultado rapido y fiable en 10 horas. Aunque requiere un equipamiento especial, y los restos de jerez en la muestra bloquean la reaccion, y asf se puede obtener un resultado falso.
La identificacion mediante Oeno Yeast Kit (Partec) es un metodo de deteccion de fluorescencia, basado en citometna de flujo, que detecta las celulas de levadura metabolicamente activas. De manera similar a otros procedimientos citometricos, este metodo no es espedfico de especies de Brettanomyces/Dekkera, por lo tanto solamente se puede usar en muestras de vino que estan en la fase de maduracion, cuando no es probable la presencia de otras levaduras. El ensayo es caro y necesita instrumentos especiales.
En resumen, la ventaja de los metodos moleculares es la selectividad y la rapidez, la ventaja de los metodos instrumentales es la precision y la rapidez. Su desventaja es que requieren instrumentos especiales y caros, la reaccion es bastante costosa y la implementacion y la evaluacion requieren un personal cualificado. La desventaja comun de los procedimientos de biologfa molecular es que si identifican una o dos especies, otras especies que pueden desencadenar el deterioro del vino y los alimentos permanecen ocultas.
La solucion a este problema es usar un medio que sea selectivo para las especies de Brettanomyces/Dekkera y/o Zygosaccharomyces. El beneficio significativo de este medio es que su uso no requiere un equipamiento especial, ni un microbiologo, ni cualificaciones analtticas, y el examen se puede llevar a cabo y evaluarlo en una bodega por parte de un enologo. Una desventaja de esta tecnica es que la selectividad del medio es limitada, y por tanto podnan aparecer otros microorganismos, p.ej. colonias de levaduras naturales (resultado falso positivo).
Renouf V. y Lonvaud-Funel A. [Development of an enrichment medium to detect Dekkera/Brettanomyces bruxellensis, a spoilage wine yeast, on the surface of grape berries. Microbiol Res. 2007; 162(2): 154-67.] crearon un medio selectivo y con el, las especies de Dekkera/Brettanomyces se pueden enriquecer, y asf se puede hacer sensible el procedimiento de identificacion.
Barata A. y colaboradores [Ascomycetous yeast species recovered from grapes damaged by honeydew and sour rot. Journal of Applied Microbiology, 2008 104(4) 1182-1191.] incrementaron el contenido de alcohol y uso cicloheximida solamente como fuente de carbono, lo que aseguro que su medio es selectivo para las especies de Dekkera/Brettanomyces.
Schuller D. y colaboradores C. [A differential medium for the enumeration of the spoilage yeast Zygosaccharomyces bailii in wine. J Food Prot. 2000 63(11):1570-5.] crearon un medio que sirve para el cultivo selectivo de
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Zygosaccharomyces bailii. Con el ajuste adecuado de la concentracion de acido formico y de glucosa se hizo el medio tan selectivo que solamente Z. bailii provoco un desplazamiento del pH en direccion alcalina, que dio como resultado un cambio de color del medio.
El objetivo de Hocking AD. [Media for preservative resistant yeasts: a collaborative study. Int J Food Microbiol. 1996 29(2-3):167-75] fue crear un medio que fuera mas adecuado para la identificacion de una levadura que es resistente a los conservantes en los alimentos. Segun la publicacion, los autores examinaron 5 medios, de los cuales 3 fueron selectivos. Dos de 3 se hicieron selectivos mediante la adicion de acido acetico, mientras el tercer medio fue un medio ZBM (Zygosaccharomyces bailii), que contuvo tinte azul tripan. Al comparar la eficacia de los medios, el medio ZBM parecio ser adecuadamente selectivo para Z. bailii, sin embargo, fue menos adecuado para el recuento debido a su efecto de inhibicion del crecimiento.
Mediante la aplicacion de los metodos mencionados anteriormente, los medios se pueden hacer selectivos para las levaduras en crecimiento. Una tarea adicional es identificar la especie de levaduras determinadas, que en caso de la levadura natural se realiza a menudo mediante una muestra de olor, mediante la adicion de un compuesto al medio, p.ej., acido p-cumarico, que la levadura transforma en un compuesto con un olor caractenstico.
Couto J. A. y colaboradores [A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts Brettanomyces/Dekkera in wines. Lett Appl Microbiol. 2005 41(6):505-10.] presenta en su publicacion un metodo sencillo y fiable para identificar las levaduras de Brettanomyces/Dekkera. La base de su metodo es la utilizacion de un medio selectivo, que contiene glucosa, cicloheximida, cloranfenicol y acido p-cumarico. La presencia de levaduras se evalua mediante la turbidez y el olor.
Rodrigues N, y colaboradores [Development and use of a new medium to detect yeasts of the genera Dekkera/Brettanomyces. J Appl Microbiol. 2001 90(4):588-99.] tambien desarrollaron un medio selectivo para la identificacion de especies de Dekkera/Brettanomyces en un medio asociado a la produccion de vino. Aseguraron la selectividad del medio anadiendo etanol y cicloheximida. Demostraron la identificacion de cepas productoras de acido anadiendo verde de bromocresol. La adicion de acido p-cumarico aseguro la identificacion de cepas de Dekkera/Brettanomyces basada en muestras de olor.
Durante el metodo aplicado por Lebrun Labs (kit Easy Blue Brettanomyces Test), el medio selectivo que bloquea el crecimiento de la mayona de levaduras se decolora por efecto de los acidos producidos por los microbios (cambio del pH). Ademas, las colonias Dekkera/Brettanomyces producen un compuesto volatil de olor caractenstico a partir del acido p-cumarico del medio, cuya percepcion ocurre al olerlo, por lo que requiere experiencia y/o una muestra de olor comparativa. Aunque este metodo no requiere una cualificacion o instrumentos especiales, tiene sus desventajas: el medio no es absolutamente selectivo, lo que puede conducir a resultados positivos falsos.
Durante el uso complementario de acido p-cumarico, el metabolito que desarrolla [4-etilfenol (4-EP), 4-etilguayacol (4-EG), acido isovalerico] tiene un olor que es tfpico de las levaduras de Brettanomyces/Dekkera, cuya identificacion requiere experiencia y/o una muestra de olor. Tomar una muestra de olor implica abrir la placa Petri una y otra vez, lo que se convierte en una fuente potencial de infeccion por sf misma.
Por lo tanto, segun el conocimiento tecnico, hubo propuestas de soluciones, en las que se identificaron las especies mencionadas de levadura natural en un medio cromogenico, basandose en una reaccion que fue acompanada de decoloracion.
Loureiro V, Malfeito-Ferreira M. ["Spoilage yeasts in the wine industry." Int J Food Microbiol. 2003 86(1-2):23-50.] tienen un resumen detallado en profundidad en el que discuten las colonias de levaduras en uvas y en vinos, y tambien mencionan las tecnicas de identificacion industriales. Presentan los componentes que se deben hallar en los medios generales que son para la identificacion de levaduras, y con respecto a estos mencionan los indicadores que se usan en estos medios: verde de bromocresol y azul de bromofenol.
En la publicacion internacional n° WO0073494 (A1) Leao Cecilia y colaboradores describen medios que son elegibles para la identificacion de especies de Zygosaccharomyces, tales como Zygosaccharomyces Bailii y Zygosaccharomyces bisporus, de vino y otros alimentos. El medio esta constituido por un medio mineral general, que se complementa con vitaminas y oligoelementos, glucosa y acido formico como fuentes de carbono, un indicador acido-base y opcionalmente con antibioticos. En este caso, el indicador es generalmente verde de bromocresol.
En el medio selectivo azul, distribuido por Millipore, se experimenta la decoloracion alrededor de las colonias de Brettanomyces, debido al acido que producen.
La solucion (inventores: Loureiro Virgilio Borges y colaboradores. "Culture medium for detection of Dekkera and Brettanomyces") que se describio en la solicitud de patente, publicada con el numero EP1185686(A1) (que corresponde a la publicacion internacional n° WO2000073495A1), se refiere a un metodo y al uso de un medio general para la identificacion de levaduras Dekkera y Brettanomyces, y la determinacion de sus recuentos de celulas. Segun el metodo, se anade lo siguiente al medio: nutrientes; fuente de energfa no fermentable, principalmente etanol; acido p-cumarico; indicador acido-base, principalmente verde de bromocresol; cicloheximida
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para bloquear el crecimiento de levaduras y antibioticos para bloquear el crecimiento de bacterias, cloranfenicol u oxitetraciclina. El medio muestra una decoloracion distintiva como efecto de las colonias cultivadas (nobles) de cepas de Dekkera y Brettanomyces. El grado de cambios por decoloracion depende del patron de crecimiento como efecto de la disminucion del pH. Ademas, durante el cultivo se desarrolla un aroma fenolico caractenstico tras unos pocos dfas de incubacion, que es facil de identificar. La invencion se puede aplicar tambien en la industria alimentaria.
En la publicacion N° ES2268970(A1) Velazquez P. E. et al ("Yeasts detection culture medium comprises glucose mixed with buffer microorganism and bacterial growth inhibitors and e.g. a nitrogen source") se ha ensenado un medio adecuado para la deteccion de levaduras, en el que el medio comprende glucosa como fuente de carbono, un tampon de carbonato calcico, agentes activos capaces de inhibir el crecimiento de diferentes microorganismos y bacterias, fuentes de nitrogeno y un indicador de pH que realmente es rojo neutro. El medio es capaz de detectar Brettanomyces/Dekkera bruxellensis en alimentos y bebidas. La identificacion se basa en el olor a acido acetico del medio y en la aparicion de lmeas transparentes alrededor de las colonias de levaduras de Dekkera/Brettanomyces presentes en el medio.
La solicitud de patente japonesa JP56106588 describe un metodo para la produccion de un medio de cultivo biologico que contiene pectina metoxilada y que se forma mezclando lactosa (5 g), eosina Y (0,5 g), azul de metileno (0,065 g), pectina de baja metoxilacion (25 g) y agua desionizada (1 l) en presencia de agar-agar. La mezcla resultante se esteriliza, se ajusta su pH a 7,1 con fosfato sodico, y en una placa Petri se vierte un gel de la mezcla resultante. El medio de cultivo se usa para cultivar levaduras, bacterias, microorganismos y hongos. Los inventores no tienen conocimiento sobre si el medio es adecuado para la deteccion de especies de levaduras, en particular colonias de levaduras de Dekkera/Brettanomyces, basandose en el cambio de color.
En un resumen de Marki-Zay y colaboradores [Development and Evaluation of Methods for the Detection of Brettanomyces in Wine. A Magyar Mikrobiologiai Tarsasag 2010. evi Nagygyulese - Abstraktfuzet, Helikon Szallo. 2010, 58-59] se comparo un medio y ensayo selectivos para la deteccion cuantitativa de Brettanomyces/Dekkera con los analisis comerciales.
Los metodos mencionados anteriormente, que se basan en el cultivo, se pueden llevar a cabo con una experiencia previa minima y son baratos. En el caso de los presentes metodos, la identificacion se basa principalmente en el cambio de color del indicador, por ejemplo, los acidos organicos producidos por Brettanomyces provocan la acidificacion del pH del medio y, por tanto, el cambio de color del indicador. La selectividad de los metodos normalmente fue limitada, y por tanto no pudieron distinguir ciertas levaduras naturales de otras. El objetivo de la invencion se dirige a desarrollar un medio y un metodo de cultivo selectivo que sea mas fiable y mas facilmente estimable que los anteriores, y mediante cuya aplicacion las colonias de levaduras espedficas se puedan identificar visualmente y distinguirlas de manera ineqrnvoca, y separarlas de otros microorganismos capaces de crecer en el medio, y que sean relativamente menos problematicos con respecto a la enologfa.
Descripcion breve de la invencion
La invencion se basa en el hallazgo de que los diferentes metabolitos de levaduras provocan cambios diferenciados de color de ciertas cepas, es decir, diferentes grupos de levaduras provocan diferentes reacciones de color en el medio de la invencion y por tanto son detectables selectivamente.
La invencion se define en su sentido mas amplio mediante las reivindicaciones adjuntas.
La invencion se refiere a un medio selectivo cromogenico adecuado para la deteccion y el crecimiento de una o mas levadura(s) a partir de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del genero Zygosaccharomyces, y/o una levadura del genero Lachancea, y dicho medio comprende
- un nutriente adecuado para la alimentacion y/o el crecimiento de dicha una o mas especies de levaduras a detectar,
- un agente capaz de inhibir el crecimiento de especies de Saccharomyces, preferiblemente a una concentracion capaz de inhibir dicho crecimiento, y
- una tincion cromogenica, en la que la tincion cromogenica es la combinacion de los siguientes colorantes, y dicha combinacion es cromatica con luz visible:
- multiple(s) tipo(s) de bis-3,7 diaminofenotiazinas sustituidas y/o sin sustituir que comprenden una mezcla de azul de metileno y Azure B, y
- uno o multiple(s) tipo(s) de fluorescema(s) sustituida(s)
en el que la fluorescema sustituida se selecciona del grupo que consiste en eosina Y, eosina B y cualquier mezcla de las mismas.
Tambien se describe que el colorante de bis-3,7 diaminofenotiazina de formula I en el medio puede tener la
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estructura qmmica
R2 Q2 Q3 R3
en la que
R1, R2, R3 y R4 son independientemente H, metilo o etilo, preferiblemente H o metilo,
Q1, Q2, Q3 y Q4 son independientemente H, alquilo C1-4, halogeno, pseudohalogeno, -NO o -NO2, preferiblemente H, metilo o etilo, lo mas preferiblemente H,
o la sal soluble de la misma, y
que la estructura qmmica del colorante de fluorescema sustituida de formula II puede ser
en la que
R1, R2, R3 y R4 son independientemente halogeno, pseudohalogeno, -NO o -NO2,
Q1 y Q2 son H, alquilo C1-4, alcoxi C1-4, halogeno, pseudohalogeno, -NO o -NO2, heterociclo de 5 o 6 miembros, o Q1 y Q2 forman juntos un heterociclo de 5 o 6 miembros, en cuyo caso Q1 y Q2 estan situados en atomos de C adyacentes,
o la sal soluble de la misma.
Preferiblemente, la fluorescema sustituida es Eosina Y.
La tincion cromogenica comprende al menos dos tipos de bis-3,7 diaminofenotiazinas que tienen diferentes grados de metilacion, es decir, una mezcla de azul de metileno y Azure B. En una realization preferida, las bis-3,7 diaminofenotiazinas de dos grados diferentes de metilacion tienen cantidades molares que son como maximo un 50% o 30%, preferiblemente como maximo un 20% o 10% diferentes respecto del componente que esta presente en la cantidad mas pequena. Lo mas preferiblemente, la tincion cromogenica es una mezcla de azul de metileno y Azure B en una proportion basicamente 1:1 y de Eosina Y (Azure II-eosinato).
Lo mas preferiblemente, la tincion cromogenica es una mezcla de la bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir y la fluorescema sustituida, preferiblemente en una proporcion de 1,5:1 a 1:1. Muy preferiblemente, la bis- 3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir es una mezcla de azul de metileno y Azure B en una proporcion basicamente de 1:1. Mas preferiblemente, la tincion cromogenica en el medio selectivo y cromogenico es Azure II- eosinato.
En una realizacion preferida, las cantidades molares del al menos un tipo de colorante de bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir y del al menos un tipo de colorante de fluorescema sustituida son como maximo un 50% o 30%, preferiblemente un 20% o 10% diferentes respecto de la cantidad del componente que esta presente en la cantidad mas pequena.
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Como se describe en la presente memoria, tambien se puede usar azul de metileno y los intermedios desmetilados del mismo o la mezcla de los mismos en la tincion, seleccionados de:
una sal de 3,7-bis(dimetilamino)-fenotiazin-5-io, preferiblemente acetato o cloruro (azul de metileno), una sal de N-metil-N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure B), una sal de N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure A: CAS 531 533), una sal de N-metilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure C), una sal de fenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente cloruro o acetato (tionina).
La tincion comprende una mezcla de Azure B y azul de metileno.
Tambien se describe un medio cromogenico y preferiblemente selectivo adecuado para el crecimiento y la deteccion selectiva de una o mas levadura(s) seleccionada(s) de:
- una especie de levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera,
- una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces,
- una especie de levadura del genero Lachancea,
preferiblemente al menos una especie de levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, y que comprende
- un nutriente adecuado para la nutricion y/o el crecimiento de levaduras que incluyen al menos o preferiblemente una o mas especies de levaduras a detectar,
- un agente capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos, preferiblemente de otras levaduras, mas preferiblemente de una especie de Saccharomyces, preferiblemente a una concentracion capaz de inhibir dicho crecimiento, y
- una tincion cromogenica, en la que la tincion cromogenica es la combinacion de los siguientes colorantes, y dicha combinacion es cromatica con luz visible:
- uno o mas tipos, preferiblemente al menos dos tipos, preferiblemente dos tipos de bis-3,7 diaminofenotiazinas sustituidas y/o sin sustituir seleccionadas de:
una sal de 3,7-bis(dimetilamino)-fenotiazin-5-io, preferiblemente acetato o cloruro (azul de metileno),
una sal de N-metil-N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure B),
una sal de N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure A),
una sal de N-metilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure C),
una sal de fenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente cloruro o acetato (tionina), y
- uno o mas tipos de fluorescemas sustituidas seleccionadas de: colorantes de eosina, preferiblemente Eosina B y Eosina Y.
En una realizacion preferida, el medio selectivo y cromogenico comprende un agente gelificante y se formula como:
polvo solido, medio de cultivo gelificado y preferiblemente el medio esta en una forma preparada previamente, lista para el uso, preferiblemente en forma solida y/o de gel, lo mas preferiblemente vertida previamente en placas.
Lo mas preferiblemente, el agente que inhibe el crecimiento de las especies de Saccharomyces es un agente quimioterapico o un antibiotico, preferiblemente cicloheximida.
Segun un aspecto adicional, la invencion se refiere al uso del medio cromogenico de la invencion para la deteccion o determinacion cualitativa o cuantitativa de una o mas levadura(s) a partir de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos, y/o una materia prima de alimentos, preferentemente un producto agncola, y la levadura se selecciona de: una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del genero Zygosaccharomyces y/o una levadura del genero Lachancea.
En una realizacion preferida, se detecta una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, y dicha levadura se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, y Brettanomyces nanus.
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En una realizacion preferida, se detecta una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces, en la que dicha levadura es preferiblemente Zygosaccharomyces bailii.
En una realizacion preferida, se detecta una especie de levadura del genero Lachancea, en la que dicha levadura es preferiblemente Lachancea fermentatii.
En la presente memoria se describe el uso del siguiente medio cromogenico y selectivo para la deteccion o determinacion cualitativa o cuantitativa de una o mas levadura(s) de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos, y/o una materia prima de alimentos, en el que el producto alimenticio es preferiblemente un producto alimenticio preparado mediante fermentacion, en particular vino, y dicha levadura se selecciona de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del genero Zygosaccharomyces y/o una levadura del genero Lachancea, preferiblemente al menos una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera,
en el que el medio que es cromogenico y selectivo es adecuado para el crecimiento y la deteccion selectiva de dicha o dichas levadura(s),
y dicho medio contiene
- un nutriente adecuado para la nutricion y/o el crecimiento de levaduras que incluyen al menos o preferiblemente una o mas especies de levaduras a detectar,
- un agente capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos, preferiblemente de otras levaduras, mas preferiblemente de una especie de Saccharomyces, preferiblemente a una concentracion capaz de inhibir dicho crecimiento, y
- una tincion cromogenica, en la que la tincion cromogenica es la combinacion de los siguientes colorantes, y dicha combinacion es cromatica con luz visible:
- al menos dos tipos, preferiblemente dos tipos de bis-3,7 diaminofenotiazinas sustituidas y/o sin sustituir seleccionadas de:
una sal de 3,7-bis(dimetilamino)-fenotiazin-5-io, preferiblemente acetato o cloruro (azul de metileno), una sal de N-metil-N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure B), y
- uno o mas tipo(s) de fluorescemas sustituidas seleccionadas de: Eosina B y Eosina Y y cualquier mezcla de las mismas.
En el uso segun la invencion
- preferiblemente, cuando la colonia es rosa y/o intensamente fluorescente con luz UV, se considera que es la deteccion de una especie de levadura o multiples especies de levaduras de los generos Brettanomyces y/o Dekkera,
- preferiblemente, cuando la colonia es azul y opcionalmente ligeramente fluorescente con luz UV, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces, preferiblemente Zygosaccharomyces bailii,
- preferiblemente, cuando la colonia es azul verdosa con un borde rosa y/o es ligeramente fluorescente con luz UV con el borde intensamente fluorescente con luz UV, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Lachancea, preferiblemente Lachancea fermentatii.
Preferiblemente, el producto alimenticio preparado mediante fermentacion segun la invencion es preferiblemente vino o cerveza, en particular preferiblemente vino tinto.
Segun un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para la deteccion o determinacion cualitativa o cuantitativa de una o mas levadura(s) seleccionada(s) del grupo a continuacion, de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos, y/o una materia prima de alimentos, y el metodo comprende las etapas siguientes:
- proporcionar el medio de la invencion, en particular un medio seleccionado de los medios definidos anteriormente,
- obtener una muestra de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos y/o una materia prima de alimentos, en el que el producto alimenticio es preferiblemente un producto alimenticio preparado mediante fermentacion, en particular vino,
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- preparar la muestra para anadirla al medio, opcionalmente filtrar y/o concentrar y/o enriquecer la muestra en microorganismos,
- colocar en placas la muestra o una parte adecuada de la misma en el medio,
- incubar el medio en condiciones adecuadas para el cultivo de las especies de levaduras hasta obtener
colonias,
- detectar las especies de levaduras mediante la decoloracion de dichas colonias.
Preferiblemente, dicha levadura es una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera.
Preferiblemente, dicha levadura es una levadura o especies de levaduras del genero Zygosaccharomyces.
Preferiblemente, dicha levadura es una levadura o especies de levaduras del genero Lachancea.
Preferiblemente, cuando la colonia es rosa e intensamente fluorescente con luz UV, se considera que es la
deteccion de una levadura o multiples especies de levaduras de los generos Brettanomyces y/o Dekkera.
Preferiblemente, cuando la colonia es azul y opcionalmente ligeramente fluorescente con luz UV, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces, preferiblemente Zygosaccharomyces bailii.
Preferiblemente, cuando la colonia es azul verdosa con un borde rosa y/o es ligeramente fluorescente con luz UV con el borde intensamente fluorescente con luz UV, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Lachancea, preferiblemente Lachancea fermentatii.
Segun una realizacion preferida, el numero de las colonias se proporciona respecto de la cantidad de la muestra original, preferiblemente el volumen o el peso de la misma, y por lo tanto el metodo es cuantitativo.
Lo mas preferiblemente, las colonias y preferiblemente el numero de las colonias se determinan con luz UV, basandose en la fluorescencia.
En una realizacion preferida, el producto alimenticio es un producto alimenticio preparado mediante fermentacion, preferiblemente
- cerveza o vino, preferiblemente vino tinto,
- el intermedio de procesamiento de alimentos es malta, mosto, malta o mosto en fermentacion, y/o
- la materia prima de alimento es uva.
Segun una realizacion preferida, el medio de cultivo adecuado para el cultivo de dicha levadura se proporciona en una forma preparada previamente, lista para el uso, preferiblemente en forma solida o de gel, lo mas preferiblemente vertida previamente en placas.
Segun un aspecto adicional, la invencion se refiere a un kit de reactivos para el uso en el metodo de la invencion, que contiene el medio de la invencion y medios para preparar un medio de cultivo en gel del mismo.
Definiciones
De acuerdo con la clasificacion taxonomica del genero Brettanomyces/Dekkera, primero se identificaron las formas anamorfas (que se reproducen de manera asexual), y tales formas se clasificaron posteriormente en el genero Brettanomyces. Mas tarde, tambien se observo la presencia de formas con reproduccion sexual en ciertas especies, que se clasificaron en el genero Dekkera. Las siguientes especies se identificaron como especies anamorfas: Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, y Brettanomyces nanus, aunque se establecio un caracter teleomorfo con respecto a dos especies: Dekkera bruxellensis y Dekkera anomala. Sin embargo, mas tarde, se verifico mediante ensayos de ADN que estas dos son identicas a Brettanomyces bruxellensis y Brettanomyces anomalus, que realmente representan sus variaciones teleomorfas. Por lo tanto, en la descripcion se usa la expresion aceptada profesionalmente "Brettanomyces/Dekkera", que incluye en general cualquier levadura que se identifique o se clasifique taxonomicamente como miembro de este genero.
El genero Brettanomyces/Dekkera incluye las especies B. anomalus, B. bruxellensis, B. claussenii, B. custersianus, B. lambicus, B. naardenensis y B. nanus.
Las "levaduras" constituyen un grupo de hongos que son especies eucariotas que tiene un nucleo, en general unicelulares, aunque en ciertas condiciones algunas especies son capaces de formar pseudomicelios o micelios autenticos. Se reproducen por medio de gemacion o por medio de fision. Aunque en un sentido amplio, estas especies no constituyen una unica categona filogenetica, se pueden clasificar en general en dos filos (divisiones), los
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Ascomicetos y los Basidiomicetos.
Preferiblemente, una o mas levaduras que se pueden detectar segun la invencion pertenecen a las levaduras del filo Ascomycota, mas preferiblemente del subfilo Saccharomycotina, mas preferiblemente de la clase Saccharomycetes, muy preferiblemente de la familia Saccharomycetaceae.
El termino "levadura" se refiere a una levadura, tipo de levadura o categona de levadura definida de una manera espedfica, preferiblemente, una levadura que pertenece a una unidad taxonomica definida, en particular preferiblemente a un genero o especie definido.
En la descripcion, el termino "especie de levadura" significa cualquier levadura que se sabe que tiene un efecto beneficioso expresamente sobre el proceso de fermentacion concreto, y que esta caracterizada de manera adecuada. Preferiblemente, la levadura noble es una cepa establecida de una especie de levadura concreta. Las expresiones "especie de levadura perjudicial" o "levadura perjudicial" significan cualquier levadura cuya presencia o cuya presencia por encima de una cantidad o concentracion concreta tiene un efecto perjudicial sobre la produccion de un producto concreto preparado mediante fermentacion.
"Producto preparado mediante fermentacion" significa cualquier producto, preferiblemente los productos alimentarios, para cuya preparacion es necesario el efecto de la levadura, preferiblemente la conversion de carbohidratos en alcohol y dioxido de carbono por parte de la levadura. Preferiblemente, el producto preparado mediante fermentacion contiene alcohol, es decir, es una bebida alcoholica, preferiblemente cerveza o vino, muy preferiblemente vino, mas preferiblemente vino tinto.
La palabra "contiene" no es exclusiva en su significado, y permite la adicion o implicacion de otras propiedades o etapas procedimentales al contenido de las propiedades o etapas procedimentales ya enumeradas.
En el contexto de la descripcion, la palabra "contiene" se puede limitar a las expresiones "contiene basicamente" y/o "de hecho, contiene", que se debenan interpretar como "contiene" propiedades prescritas o etapas procedimentales prescritas o componentes que se especifican en alguna lista, p.ej. dentro del alcance de la reivindicacion de la patente, pero ademas de estas, tambien esta permitida la presencia de otras propiedades, etapas procedimentales, o componentes que no afectan fundamentalmente a ningun otro objetivo descrito en la invencion.
La palabra "uno" usada en algunas de las definiciones de la descripcion, y cuando el contexto asf lo permite el artfculo "un", que expresa el singular se puede considerar que contiene el significado del plural a menos que sea necesario de otra manera por el contexto, a menos que, por ejemplo, el uso de "uno" se refiera de manera inequvoca a "uno" como dfgito.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Identificacion de levaduras naturales junto con levaduras de produccion de vino (nobles) en un medio selectivo
Los patrones asignados a los numeros en secuencia son los siguientes:
1: Dekkera bruxellensis CBS 73; 2: Pichia membranifaciens var. membranifaciens CBS 191; 3: Zygosaccharomyces bailii var. bailii CBS 4688; 4: Zygosaccharomyces bailii var. bailii CBS 4689; 5: Zygosaccharomyces mellis CBS 684; 6: Zygosaccharomyces rouxii CBS 441; 7: Lachancea fermentati CBS 707; 8: Issatchekia orientalis CBS 6799; 9: Brettanomyces custersianus CBS 4805; 10: Saccharomyces cerevisiae T-158C; 11: Saccharomyces cerevisiae S6; 12: Schizosaccharomyces pombe
Figura 2: colonias de Brettanomyces de un medio vinoso, sobre un medio selectivo, coloreado Descripcion detallada de la invencion
Los presentes inventores descubrieron inesperadamente durante la creacion de la invencion que si se anade azure- II-eosinato a un medio selectivo - que es adecuado para hacer crecer levaduras, pero bloquea el crecimiento de Saccharomyces - en el medio que se obtiene se pueden identificar especies de Brettanomyces entre las colonias que aparecen, con la ayuda de azure-II-eosinato.
De manera bastante sorprendente, los presentes inventores observaron lo siguiente:
1. En este medio, las colonias de Brettanomyces tienen un color rosa, y son visibles a simple vista.
2. Las colonias rosas son fluorescentes con luz ultravioleta, lo que confirma la separacion de las especies.
Con la ayuda de este metodo, las colonias de Brettanomyces/Dekkera se pueden distinguir facilmente de otras levaduras naturales, que son capaces de crecer en un medio selectivo, mirandolas. La identificacion que se basa en la visibilidad, no solamente hace que el proceso de identificacion sea mucho mas sencillo, sino que ademas no requiere experiencia y muestras de olor, ademas, hace que el analisis del olor de las muestras sea innecesario, lo
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que conlleva la posibilidad de extender la infeccion. La razon por la que es mas espedfico para las especies de Brettanomyces/Dekkera que otros metodos es que es capaz de identificar otras especies de levaduras que no son levaduras de production de vino (nobles), lo cual (solamente) provoca un problema en caso de los vinos dulces con un residuo mayor de azucar.
Tambien se han llevado a cabo los experimentos mediante el uso de diferentes colorantes de azure y eosina. Los colores de todas las tinciones cambiaron con el incremento del pH. Sin embargo, estas tinciones no proporcionaron la reaction de color previamente experimentada, y no fueron adecuadas para distinguir las especies de Brettanomyces/Dekkera de otras levaduras examinadas.
Segun la invention, para obtener los resultados deseados, se necesitan bis-3,7-diamino-fenotiazinas sustituidas o sin sustituir junto con los derivados sustituidos de fluorescema.
Hubo una tincion de medio que se conoda antes con los mismos componentes, eosina y azul de metileno, pero no se uso para identificar la contamination con levaduras. Por ejemplo, la publication del Reino Unido n° GB1248197 [ABBOTT LAB (US), "Diagnostic method and apparatus for the detection of bacteria"] describe un medio de agar con eosina-azul de metileno que contiene lactosa, sin embargo, la identification de las levaduras en la referencia no se basa en el medio de eosina-azul de metileno. Hasta donde se puede entender, previamente se uso azure-II-eosina para otros fines, principalmente para tenir muestras de tejido.
Segun el documento de la description japonesa n° JP56106588A se uso eosina-Y (0,5 g, 7,23 x 10-4 mol) y azul de metileno (0,065 g, 2,03 x 10-4 mol) en un medio solamente, sin embargo, el documento no proporciona ninguna information sobre la decoloration diferente del medio y/o las colonias como resultado del crecimiento de diferentes tipos de levaduras.
La tincion cromogenica descrita en la presente memoria es, por lo tanto, la combination de al menos un tipo de tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir y al menos un tipo de tincion de fluorescema sustituida. Preferiblemente, la combinacion de la tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir de formula I siguiente y la tincion de fluorescema sustituida de formula II siguiente.
La estructura qmmica de la tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina de formula I es
Ql Q4
R2 Q2 Qs R3
en la que
R1, R2, R3 y R4 son independientemente H, metilo o etilo, preferiblemente H o metilo,
Q1, Q2, Q3 y Q4 son independientemente H, alquilo C1-4, halogeno, pseudohalogeno, -NO o -NO2, preferiblemente H, metilo o etilo, preferiblemente H o metilo, lo mas preferiblemente H.
Preferiblemente, la tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina de formula I esta presente en una forma cationica, tal como una sal formada con un anion. El anion es preferiblemente un ion haluro, lo mas preferiblemente ion cloruro. Segun una variation, el anion se forma mediante la tincion fluorescente sustituida de formula II.
La estructura qmmica de la tincion fluorescente sustituida de formula II es
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en la que R1, R2, R3 y R4 son independientemente halogeno, pseudohalogeno, -NO o -NO2,
Q1 y Q2 son H, alquilo C1-4, alcoxi C1-4, halogeno, pseudohalogeno, -NO o NO2, heterociclo de 5 o 6 miembros, o Q1 y Q2 forman juntos un heterociclo de 5 o 6 miembros, en cuyo caso Q1 y Q2 estan situados en atomos de C adyacentes.
Preferiblemente, R1 y R4 son halogeno, mas preferiblemente Br o -NO2.
Preferiblemente, R2 y R3 son halogeno, mas preferiblemente Br.
Preferiblemente, Q1' es H, metilo o halogeno y Q2 es H.
Preferiblemente, la tincion de fluorescema sustituida de formula II se usa en una forma anionica, preferiblemente en forma de una sal formada con un cation. Preferiblemente, el cation es ion sodio, ion potasio o ion amonio. Segun una variation adicionalmente preferida, el cation se forma mediante la tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina de formula I.
Preferiblemente, el medio cromogenico comprende al menos un tipo de tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir y al menos un tipo de tincion de fluorescema sustituida en cantidades molares basicamente identicas, es decir, la cantidad del al menos un tipo de tincion de bis-3,7 diaminofenotiazina sustituida o sin sustituir y la cantidad del al menos un tipo de tincion de fluorescema sustituida en el medio de cultivo son como maximo un 50% o 30%, preferiblemente como maximo un 20% o 10% diferentes respecto del componente que esta presente en una cantidad mas pequena, es decir, la proportion de las cantidades molares es de 1,5:1 a 1:1 o de 1,3:1 a 1:1, preferiblemente de 1,2:1 a 1:1 o de 1,1:1 a 1:1, lo mas preferiblemente la proporcion de las cantidades molares es 1:1 o viceversa.
Lo mas preferiblemente, el medio de cultivo contiene multiples tipos de tinciones de bis-3,7 aminofenotiazina sustituida o sin sustituir, en cuya formula general I R1, R2, R3 y R4 son H, metilo o etilo, de forma que los sustituyentes R1, R2, R3 y R4 son diferentes en las diferentes tinciones (R1, R2, R3 y R4 pueden no ser identicos). Lo mas preferiblemente, R1, R2, R3 y R4 son H o metilo y las tinciones de componentes de bis-3,7 diaminofenotiazina son diferentes en los grados de metilacion.
Por lo tanto y preferiblemente, tambien se puede usar azul de metileno y los intermedios desmetilados del mismo o la mezcla de los mismos en la tincion, seleccionados de
una sal de 3,7-bis(dimetilamino)-fenotiazin-5-io, preferiblemente acetato o cloruro (azul de metileno), una sal de N-metil-N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure B), una sal de N',N'-dimetilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure A: CAS 531 533) una sal de N-metilfenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente acetato o cloruro (Azure C), una sal de fenotiazin-5-io-3,7-diamina, preferiblemente cloruro o acetato (tionina).
La mezcla de Azure B y azul de metileno esta presente en la tincion.
Formula qmmica de azul de metileno:
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De forma similar, las fluorescemas sustituidas pueden ser de uno o mas tipos. Se usa una tincion de eosina o una mezcla de tinciones de eosina, que comprende Eosina B o Eosina Y.
La tincion de eosina es Eosina B o Eosina Y, cuyas formulas son respectivamente
Lo mas preferiblemente, la tincion usada segun la invention es Azure II-eosinato. El Azure II-eosinato (CAS 5309285-6) es una mezcla de azul de metileno y Azure B en la proportion 1:1 y de eosina Y. El Azure II-eosinato esta disponible de diversos fabricantes (tales como Fluka, Sinopharm, CN y Nile Chemicals, IN).
Como se describe en la presente memoria, se pueden usar variantes sustituidas adicionales o sales de las tinciones de la invencion, con tal de que sean cromaticas y el color cambie en presencia de levaduras.
Con respecto a los medios de crecimiento, se puede usar cualquier medio de crecimiento que sea adecuado para cultivar levaduras y que contenga al menos un agente que inhiba el crecimiento de las cepas de Saccharomyces, p.ej. los medios de crecimiento descritos en los antecedentes de la invencion.
Basandose en lo anterior, la invencion se refiere a un metodo para el cultivo selectivo de levaduras de Brettanomyces/Dekkera y para la tincion diferencial de sus colonias, en el que se prepara un medio de crecimiento adecuado para cultivar celulas de levadura, que se hace selectivo mediante la adicion de un agente quimioterapico adecuado o antibiotico que inhibe el crecimiento de las cepas de Saccharomyces, y mediante la adicion de la tincion cromogenica de la invencion.
El medio de cultivo puede ser de una composition variada. Teoricamente, cualquier medio de crecimiento adecuado para cultivar levaduras es adecuado y conocido para una persona experta en la tecnica. El medio de crecimiento contiene preferiblemente ingredientes seleccionados del grupo siguiente: carbohidrato, p.ej. glucosa; extracto o hidrolizado que contiene aminoacidos o peptidos, tal como peptona, extracto de levadura, "base de nitrogeno para levaduras" o "base de carbono para levaduras"; agente gelificante, p.ej. agar; y opcionalmente sal. Muy preferiblemente, el medio de crecimiento comprende glucosa, base de nitrogeno para levaduras y agar.
Ademas, el medio de crecimiento tambien contiene sustancias que inhiben la reproduction de microbios que tienen un papel en la fermentation normal o sana de productos alimenticios. Con tal de que el producto alimenticio en el que se lleva a cabo el metodo de detection sea un producto alimenticio preparado mediante fermentacion, la sustancia que inhibe el crecimiento previene de manera viable el crecimiento de microorganismos que realizan la fermentacion natural del producto alimenticio, p.ej. bloquea el crecimiento de levaduras nobles. Es evidente para una persona experta en la tecnica que el inhibidor del crecimiento se deberia aplicar al menos a una concentration que ya sea suficiente para bloquear el crecimiento de tales microorganismos. Al mismo tiempo, la concentracion de inhibidor puede tener un umbral superior para que no se inhiba el crecimiento de las levaduras, cuya presencia se desea ensayar. Preferiblemente, el producto alimenticio es un producto alimenticio fermentado mediante una especie de Saccharomyces, tal como cerveza, vino u otro producto o intermedio que contiene levaduras, y el agente que inhibe el crecimiento de las cepas de Saccharomyces es un agente quimioterapico o antibiotico adecuado, p.ej. cicloheximida aplicada a una concentracion, p.ej. de 0,5-50 ^g/ml, preferiblemente 1-20 ^g/ml, en particular
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preferiblemente 2-10 |jg/ml, muy preferiblemente alrededor de 5 |jg/ml, y de ese modo se incrementa o se hace selectiva la selectividad del medio de crecimiento.
La muestra puede ser cualquier muestra usada en la produccion de tal producto alimenticio, p.ej. una muestra tomada de dispositivos usados en el proceso o una muestra extrafda del lfquido usado para limpiar los dispositivos.
El medio de cultivo preparado se coloca en una forma adecuada para la aplicacion de la muestra. Segun una cierta variacion, se prepara un gel y se vierte en una placa, p.ej., una placa Petri. De manera alternativa, se puede aplicar cualquier otro medio de cultivo solido (p.ej., en forma de gel) en el que la muestra se pueda colocar en placas y se pueda separar la progenie (p.ej. colonias) de una unica celula.
Ademas de placas Petri, se puede usar preferiblemente cualquier otro recipiente de cultivo que tenga una gran superficie, en el que la muestra se pueda extender sobre la superficie del medio formado en el, y se pueda cerrar (p.ej., que tenga una tapa) y en el que se puedan detectar las colonias de microorganismos y visualizarlas de manera viable. Es preferible que el recipiente de cultivo este hecho de vidrio o plastico, mas preferiblemente plastico, y preferiblemente que tenga una tapa transparente.
Tambien se pueden usar placas de Kolle o matraces de Roux, ya que tambien tienen grandes superficies, pero la muestra se debena introducir en la placa a traves de una pequena abertura, y tambien presenta dificultades conseguir una colocacion uniforme en las placas. Despues, la abertura se debena cerrar de una manera que permita una cierta ventilacion, pero que la muestra no se contamine.
Por lo tanto, se pueden usar placas de cultivo con tapa esterilizables, en las que las muestras a ensayar se puedan colocar sobre una gran superficie.
De las muestras (p.ej., agua usada para lavar barriles u otras superficies), o de sus diluciones adecuadas, se coloca en placas una cantidad predeterminada sobre la superficie de los medios de cultivo, despues se incuban a 10-37 °C, preferiblemente a 20-30 °C, en particular preferiblemente a temperatura ambiente durante alrededor de 5-20 dfas, preferiblemente durante 8-16 dfas, y muy preferiblemente durante 10-14 dfas. Es evidente para una persona experta en la tecnica que el tiempo de incubacion es necesariamente mas largo a temperaturas inferiores.
En el medio de cultivo preparado segun la invencion, las levaduras de Saccharomyces dejan de crecer, y el color de las colonias de Brettanomyces/Dekkera se hace rosa y se pueden distinguir de los microorganismos que no son perjudiciales o solamente ligeramente perjudiciales para el vino. Los resultados se evaluan visualmente. En el caso de la aplicacion de la muestra, el resultado se puede hacer cuantitativo proporcionando el numero de celulas de levadura cultivables por 1 ml.
La sensibilidad de la deteccion de las levaduras de Brettanomyces/Dekkera se puede incrementar filtrando una cantidad mayor de vino a traves de membranas con un tamano de poro de 0,45 jm o 0,22 jm, y despues colocando la membrana sobre la superficie del medio de cultivo. En este caso se debena asegurar que no haya burbujas de aire entre la membrana y la superficie de agar.
Ademas, la invencion se refiere a medios de cultivo para llevar a cabo el metodo anterior, en los que el medio esta en una forma en polvo o una forma lista para el uso, y tambien a los kits que los contienen y a otros componentes necesarios para llevar a cabo el examen (p.ej. dispositivos de aplicacion de muestras), y tambien las instrucciones para el usuario. Preferiblemente, el kit de reactivos de la invencion comprende el medio de cultivo necesario para llevar a cabo el metodo de la invencion en la forma y cantidad pesada previamente para cada ensayo, y en una forma vertida por adelantado en placas Petri de plastico.
El metodo desarrollado es barato y no requiere una instrumentacion especial, y es sencillo de llevar a cabo por cualquier persona. El procedimiento no requiere condiciones esteriles de laboratorio, y solamente se debe prestar un poco de atencion para asegurar que se coloca la muestra correcta sobre la superficie del medio de cultivo. El medio de cultivo contiene componentes facilmente disponibles. Ademas de los componentes usados para el crecimiento, el medio contiene antibioticos que inhiben el crecimiento de levaduras, p.ej. - otros medios de cultivo similares al selectivo para Brettanomyces - tambien cicloheximida. Este antibiotico se usa para la identificacion de especies diferentes en diagnosticos de levaduras. A la concentracion usada por los inventores, previene el crecimiento de la mayona de levaduras que desempenan un papel en la produccion de vino (p.ej. Saccharomyces), mientras esta concentracion todavfa es tolerada por la especie que provoca la degradacion del vino.
La presente invencion se ilustra adicionalmente, pero sin limitacion, mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplos
En los ejemplos siguientes, a menos que se indique de otra manera, se aplicaron las siguientes concentraciones y composiciones. La composicion de medio que fue adecuada para el crecimiento de celulas de levadura fue la siguiente: 1% de glucosa, 0,67% de "base de nitrogeno para levaduras", 2% de agar, que se hizo selectivo mediante el uso de 5 jg/ml de cicloheximida como antibiotico para bloquear el crecimiento de las cepas de Saccharomyces. Se uso Azure-II-eosinato a una concentracion de 30 jg/ml.
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Ejemplo 1: Identificacion de especies de Brettanomyces/Dekkera a partir de mosto
Se hace una secuencia de dilucion a escala 10 en 5 etapas a partir de agua destilada obtenida a partir de mosto. De cada dilucion, se extienden 50 |jl sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en las placas Petri. Se hacen las extensiones en tres medidas hechas en paralelo. Se incuban las placas Petri entre 20-25 °C durante 10-14 dfas. Las colonias rosas que aparecen sobre la superficie del medio tras finalizar el tiempo de incubacion implican una infeccion por Brettanomyces/Dekkera. Se eligen las placas en las que se puede identificar facilmente el numero de colonias. Si se multiplica el numero de colonias por veinte, mas el valor de la dilucion, se consigue el recuento de las placas de Brettanomyces/Dekkera del mosto aplicado a 1 ml.
Tambien se puede examinar una placa positiva con luz UV. La fluorescencia de las colonias confirma los resultados obtenidos.
Ejemplo 2: Identificacion de especies de Brettanomyces/Dekkera a partir de vino embotellado
Se agita el vino antes de tomar una muestra, despues se filtran 500 ml a traves de un filtro de membrana con un diametro de poro de 0,45 jm. Se coloca el filtro de membrana sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en la placa Petri, de manera que se ajusta de manera adecuada (no debena haber burbujas de aire entre ellos). Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas.
Ejemplo 3: Identificacion de especies de Brettanomyces/Dekkera a partir de vino tinto almacenado en barriles
Se centrifugan 50 ml del vino tinto de un barril (3000 rpm, 10 min, Hereus Multifuge 3S). Se suspende el sedimento en 1 ml de agua destilada. De la suspension, se extienden 100 jm sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en la placa Petri. Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas.
Ejemplo 4: Identificacion de especies de Brettanomyces/Dekkera a partir de barriles
Despues de lavar los barriles, se filtran 500 ml del agua de lavado a traves de un filtro de membrana con un diametro de poro de 0,45 jm. Se coloca el filtro de membrana sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en la placa Petri, de manera que se ajusta de manera adecuada (no debena haber burbujas de aire entre ellos). Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas.
Ejemplo 5: Identificacion de especies de Brettanomyces/Dekkera a partir de uvas
Se agitan suavemente las uvas que estan empapadas en agua destilada durante una hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, las celulas de las uvas se lavan en agua. Tras esto, se vierte el agua de las uvas y se filtra a traves de un filtro de membrana con un diametro de poro de 0,45 jm. Se coloca el filtro de membrana sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en la placa Petri, de manera que se ajusta de manera adecuada (no debena haber burbujas de aire entre ellos). Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas.
Ejemplo 6: Identificacion de Zygosaccharomyces bailii a partir de vinos dulces embotellados
Se filtran 500 ml de vino dulce embotellado a traves de un filtro de membrana con un diametro de poro de 0,45 jm. Se coloca el filtro de membrana sobre la superficie del medio cromogenico selectivo en la placa Petri, de forma que se ajusta de manera adecuada (no debena haber burbujas de aire entre ellos). Las placas Petri se incuban a 30 °C durante 10-14 dfas. Las colonias azules que aparecen muestran un resultado positivo.
Ejemplo 7: Identificacion del nivel de infectividad de cepas colectivas de Brettanomyces/Dekkera, Zygosaccharomyces bailii y Lachancea fermentatii
Se suspende 1 asa de siembra del cultivo en 5 ml de agua destilada. Desde la suspension, se extiende sobre la superficie del medio de diferenciacion con el asa de siembra. Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas. Las colonias de Zygosaccharomyces bailii que parecen azules, las de Brettanomyces/Dekkera rosas, y las de Lachancea fermentatii azules verdosas con el borde rosa indican una infeccion.
Ejemplo 8: Recuperacion de un cultivo puro de cepas de Brettanomyces/Dekkera en una coleccion de cultivos
Se suspende 1 asa de siembra del cultivo infectado en 5 ml de agua destilada. Con el asa, se siembra sobre el medio de diferenciacion desde la suspension. Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10-14 dfas. Se hace una suspension de las colonias rosas que aparecen (1 asa/5 ml de agua destilada esteril), y desde la suspension se extiende sobre el medio de diferenciacion con un asa de siembra. Las placas Petri se incuban a 20-25 °C durante 10 dfas. Si no se observan otras colonias aparte de las rosas, se puede confirmar la pureza del cultivo.
Ejemplo 9: Ensayos de otras tinciones con azure y eosina (ejemplo de referencia)
Se llevo a cabo el experimento segun el ejemplo X, tambien con las siguientes tinciones:
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Azure A (cloruro de Azure A)
Azure B Azure II Eosina B Eosina Y
El color de las tinciones aplicadas cambia en cada caso con el incremento del pH. Las tinciones no fueron adecuadas para separar claramente entre sf las especies de Brettanomyces/Dekkera de las otras levaduras examinadas.
Ejemplo 10: Ensayos de los medios
Se llevo a cabo el experimento segun el ejemplo X, con los medios siguientes:
YPD (1% de glucosa, 1% de peptona, 0,5% de extracto de levadura, 2% de agar)
YNB (1% de glucosa, 0,67% de base de nitrogeno para levaduras, 2% de agar)
YCB (0,5% de sulfato amonico, 1,17% de base de carbono para levaduras, 2% de agar)
Se experimento la decoloracion rosa/azul mas contrastada en medio YNB en el caso de azure II-eosina. Aplicabilidad industrial
El proceso y los medios especificados por la invencion se pueden aplicar de manera ventajosa en primer lugar para monitorizar los recuentos de celulas de Brettanomyces/Dekkera, identificar o descartar su proliferacion, asf como para detectar para fines higienicos las levaduras de Brettanomyces/Dekkera responsables del deterioro de vinos y provisiones en el caso de los utensilios usados para el almacenamiento con los que pueden entrar en contacto directamente. El uso del medio hace posible la identificacion temprana del crecimiento de levaduras de Brettanomyces/Dekkera - que puede desencadenar el deterioro de alimentos y vino - asf como la verificacion del efecto de los tratamientos que se dirigen a evitar su deterioro. El metodo puede identificar otros microorganismos, tales como especies de levaduras que pertenecen al genero Zygosaccharomyces y al genero Lachancea.
Una ventaja de este metodo es que hace posible identificar facilmente las colonias de Brettanomyces/Dekkera observandolas, ademas, se pueden distinguir colonias de especies de levaduras que pertenecen al genero Zygosaccharomyces y Lachancea de las colonias de otras especies y de levaduras naturales que son capaces de crecer en un medio selectivo. La identificacion que se basa en la visibilidad, no solamente hace que el proceso de identificacion sea mucho mas sencillo, sino que ademas no requiere experiencia y muestras de olor, ademas, hace que el analisis del olor de las muestras sea innecesario, lo que conlleva la posibilidad de extender la infeccion. La razon por la que es mas espedfico para las especies de Brettanomyces/Dekkera que otros metodos es que es capaz de identificar otras especies de levaduras que no son levaduras de produccion de vino (nobles), lo cual provoca un problema en caso de los vinos dulces con un residuo mayor de azucar.
El metodo que se ha desarrollado es barato, no requiere instrumentos especiales, y cualquiera puede llevarlo a cabo. No son necesarias las circunstancias de un laboratorio esteril, y solamente requiere una atencion minima para colocar la muestra correcta sobre la superficie del medio. El medio contiene componentes facilmente accesibles.
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Documento WO0073494 (A1) Leao Cecilia; Corte-Real Manuela; Schuller Dorit
Claims (16)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un medio cromogenico adecuado para el crecimiento selectivo y la deteccion de una o mas levadura(s) de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del genero Zygosaccharomyces, y/o una levadura del genero Lachancea, y dicho medio comprende- al menos un nutriente adecuado para la alimentacion y/o el crecimiento de dicha una o mas levadura(s) a detectar,- un agente capaz de inhibir el crecimiento de especies de Saccharomyces, y- una tincion cromogenica, en la que la tincion cromogenica es la combinacion de los siguientes colorantes, y dicha combinacion es cromatica con luz visible:- multiple(s) tipo(s) de bis-3,7 diaminofenotiazinas sustituidas y/o sin sustituir que comprenden una mezcla de azul de metileno y Azure B, y- uno o multiple(s) tipo(s) de fluorescema(s) sustituida(s)en el que la fluorescema sustituida se selecciona del grupo que consiste en eosina Y, eosina B y cualquier mezcla de las mismas.
- 2. El medio selectivo y cromogenico segun la reivindicacion 1, en el que dicha tincion cromogenica comprende la mezcla de azul de metileno y Azure B, y de Eosina Y.
- 3. El medio selectivo y cromogenico segun la reivindicacion 2 en el que dicha tincion cromogenica es Azure II- eosinato.
- 4. El medio selectivo y cromogenico segun la reivindicacion 1, en el que dicha tincion cromogenica es una mezcla de- las bis-3,7 diaminofenotiazinas que consisten en una mezcla de azul de metileno y Azure B y- el o los multiples tipo(s) de fluorescema(s) sustituida(s) en la proporcion de 1,5:1 a 1:1.
- 5. El medio selectivo y cromogenico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende un agente gelificante y que se formula como una de las formas siguientes:polvo solido, medio de cultivo gelificado,en el que preferiblementeel medio esta en una forma preparada previamente, lista para el uso.
- 6. El uso del medio selectivo y cromogenico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la deteccion o determinacion de una o mas levadura(s) de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una levadura del genero Zygosaccharomyces, y/o una levadura del genero Lachancea a partir de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos, y/o una materia prima de alimentos, preferiblemente a partir de un producto agncola.
- 7. El uso de la reivindicacion 6, en el que la levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera se selecciona de Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, y Brettanomyces nanus,y/o la especie de levadura del genero Zygosaccharomyces es Zygosaccharomyces bailii, y/o la especie de levadura del genero Lachancea es Lachancea fermentatii.
- 8. El uso de la reivindicacion 6 o 7, en el que el producto alimenticio se prepara mediante fermentacion, y dicho producto alimenticio es preferiblemente vino o cerveza, en particular preferiblemente vino tinto.
- 9. Un metodo para la deteccion o la determinacion de una o mas especies de levaduras seleccionadas del grupo siguiente: levaduras de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, levaduras del genero Zygosaccharomyces, y levaduras del genero Lachancea, a partir de un producto alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos y/o una materia prima de alimentos, y dicho metodo comprende las etapas de- proporcionar el medio de cualquiera de las reivindicaciones 1-4,51015202530- obtener una muestra de un producto prima de alimentos,- preparar la muestra para anadirla al microorganismos,- colocar en placas la muestra o una parte adecuada de la misma en el medio,- incubar el medio en condiciones adecuadas para el cultivo de dichas especies de levaduras hasta obtener colonias,- detectar dichas especies de levaduras mediante la decoloracion de dichas colonias.
- 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha levadura se selecciona de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces y una especie de levadura del genero Lachancea, y- cuando la colonia es rosa, se considera que es la deteccion de una levadura de los generos Brettanomyces y/o Dekkera, y/o- cuando la colonia es azul, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Zygosaccharomyces, y/o- cuando la colonia es azul verdosa con un borde rosa, se considera que es la deteccion de una especie de levadura del genero Lachancea.
- 11. El metodo segun la reivindicacion 9 o 10, en el que se determina el numero de colonias detectadas respecto de la cantidad de la muestra original, preferiblemente el volumen o el peso de la misma, de forma que el metodo es cuantitativo.
- 12. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que se determinan las colonias y preferiblemente el numero de colonias a luz UV, mediante fluorescencia.
- 13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el producto alimenticio se prepara mediante fermentacion, preferiblemente- cerveza o vino, preferiblemente vino tinto,- el intermedio de procesamiento de alimentos es malta, mosto, malta o mosto en fermentacion, y/o- la materia prima de alimento es uva.
- 14. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el medio de cultivo adecuado para el cultivo de dicha levadura se proporciona en una forma preparada previamente, lista para el uso, preferiblemente en forma solida o de gel, lo mas preferiblemente vertida en placas.
- 15. Un kit para el uso en el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-14, que contiene el medio segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y medios para preparar un medio de cultivo en gel del mismo.alimenticio, un intermedio del procesamiento de alimentos y/o una materia medio, opcionalmente filtrar y/o concentrar y/o enriquecer la muestra enLuz UV Luz blancaControl Cepa espedfica
imagen1 1. FIGURA: Identification de levaduras naturales al lado de levaduras de production de vino en medio selectivoimagen2 - 2. FIGURA: Colonias de Brettanomyces de medio vinoso, en un medio selectivo tenido
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