ES2624742T3 - Andamios de biomatriz - Google Patents

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ES2624742T3 ES11801493.5T ES11801493T ES2624742T3 ES 2624742 T3 ES2624742 T3 ES 2624742T3 ES 11801493 T ES11801493 T ES 11801493T ES 2624742 T3 ES2624742 T3 ES 2624742T3
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Yunfang Wang
Lola Cynthia Mcadams Ried
Mitsuo Yamauchi
Cai-Bin Cui
Andrew Zhuang Wang
Michael Edward Werner
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University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

Un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepático de mamífero, que comprende: a) perfundir u homogeneizar el tejido hepático con un primer medio basal, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio está libre de suero y a pH neutro; después b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón de deslipidación que comprende desoxicolato sódico y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; después c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a un pH neutro y que comprende una concentración de sal de 2,0 M de NaCl a 5,0 M, la concentración elegida para mantener insolubles los colágenos identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampón; y después e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que está a pH neutro, está libre de suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz retiene al menos el 95 % de sus colágenos originales y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico.

Description

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DESCRIPCION
Andamios de biomatriz Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a andamios de biomatriz y metodos para producir andamios de biomatriz y su uso en diversas aplicaciones como andamios intactos o como andamios que se seccionan o pulverizan y se dispersan de diversas maneras para usos experimentales y clfnicos especfficos.
Antecedentes de la invencion
La capacidad de utilizar celulas diferenciadas ex vivo o en programas clfnicos tales como terapias celulares depende de la capacidad de mantener a las celulas con un fenotipo adulto y completamente funcionales o de ser capaces de restringir el linaje a las celulas madre o progenitoras ("madre/progenitoras") para lograr ese fenotipo adulto. La revolucion en curso en la investigacion con celulas madre ha hecho posible la identificacion y aislamiento de poblaciones de celulas madre/progenitoras, que incluyen las de tejidos embrionarios, fetales y posnatales1. La capacidad de identificar y aislar las celulas madre/progenitoras para todos los tipos de celulas adultas y de expandirlas y diferenciarlas aumenta enormemente el potencial para utilizarlas en programas de investigacion farmaceuticos e industriales, en investigaciones academicas y en programas clfnicos tales como terapias basadas en celulas, e ingenierfa de tejidos2.
Los metodos actuales para mantener las celulas diferenciadas o restringir el linaje de las celulas madre a un destino adulto ex vivo tienen un exito parcial e implican sembrar las celulas o incorporarlas en un sustrato de uno o mas componentes de la matriz extracelular y en un medio compuesto de hormonas especfficas, factores de crecimiento y nutrientes adaptados para el fenotipo adulto deseado. Para las celulas madre muy primitivas, tales como las celulas madre embrionarias (ES) o las celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) o las derivadas de manera postnatal, que pueden seguir multiples destinos adultos, tales como celulas madre mesenquimales (MSC) o celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC), las celulas madre se someten a una mezcla de senales solubles y/ componentes de la matriz extracelular y deben tratarse con multiples conjuntos de estas senales durante semanas. Tfpicamente, el fenotipo adulto que se logra es distinto con cada preparacion y tiene sobre o baja expresion de determinados genes especfficos para adultos y/o regulacion aberrante de uno o mas de los genes especfficos de tejidos adultos.
La matriz extracelular es secretada por las celulas, esta adyacente a ellas en una o mas de sus superficies, y desde hace tiempo se ha entendido como el soporte estructural para las celulas7. Es un andamio extraordinariamente complejo compuesto de una variedad de moleculas biologicamente activas que estan muy reguladas y son fundamentales para determinar la morfologfa, el crecimiento y la diferenciacion de las celulas unidas8. La expresion genica especffica de tejidos en celulas cultivadas se mejora mediante el cultivo de las celulas en extractos de matriz o componentes purificados de la matriz9. Sin embargo, los componentes individuales de la matriz, solos o en combinacion, son incapaces de recapitular la qufmica y la arquitectura complejas de una matriz del tejido. Esto se relaciona con el hecho de que los componentes de la matriz se encuentran en gradientes asociados con zonas tisulares naturales y con estructuras histologicas tales como vasos sangufneos. Esta complejidad de la matriz tisular se logra mas facilmente mediante extracciones que descelularizan un tejido y dejan atras la matriz como residuo10,11. Sin embargo, los actuales protocolos de descelularizacion dan como resultado perdidas importantes de algunos de los componentes de la matriz debido al uso de enzimas que degradan la matriz o tampones que solubilizan los componentes de la matriz. A partir de la tecnica anterior se conoce (Ross y otros, J.AM. Soc. Nephrol 2009, 20, 11, 2338-2347 and Shupe Organogenesis, 2010, 6, 2, 134-136) el uso de tratamientos tanto con SDS como con Triton o SDS solo (documento num. WO2010/039823). Sin embargo, estos detergentes duros pueden danar la matriz extracelular.
La presente invencion proporciona andamios de biomatriz y metodos para obtener y utilizar tales andamios de biomatriz. Los metodos de esta invencion dan como resultado la produccion de un extracto de especificidad tisular, enriquecido mayoritariamente de los colagenos del tejido y con componentes de union a la matriz y hormonas, factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz que en conjunto producen efectos de diferenciacion mas reproducibles y potentes tanto en celulas maduras como en la restriccion del linaje de poblaciones de celulas madre/progenitoras.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona, en un aspecto, un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepatico de mamffero, que comprende las etapas de: a) perfundir u homogeneizar el tejido hepatico con un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues b) perfundir el tejido biologico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende lipasas y/o detergentes en dicho primer medio; despues c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con
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un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de aproximadamente NaCI 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, la concentracion elegida para mantener los colagenos insolubles identificados en el tejido biologico; despues d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biologico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos el 95 % de los colagenos y la mayor parte de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico.
Ademas, la presente invencion proporciona un andamio de biomatriz que comprende colagenos, fibronectinas, lamininas, nidogeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, citocinas o cualquier combinacion de estos, donde todos forman parte del andamio de biomatriz.
En aspectos adicionales, la presente invencion proporciona un metodo para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
En la presente descripcion se proporciona ademas un metodo para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una seccion congelada del andamio de biomatriz de la etapa (b) como un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta obtener un polvo (por ejemplo, en algunas modalidades, despues de congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) recubrir al menos parte de un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con medio de cultivo celular en el aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular. En modalidades particulares de este metodo, la trituracion del andamio de biomatriz puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un molino con congelacion a temperaturas del nitrogeno lfquido, o cercanas a estas.
En la presente descripcion se proporciona ademas el uso del andamio de biomatriz de especificidad tisular de esta invencion para facilitar la diferenciacion de celulas madre embrionarias o celulas pluripotentes inducidas hacia un destino especffico, asf como el uso del andamio de biomatriz de especificidad tisular de esta invencion para facilitar la diferenciacion de celulas madre derivadas de lfquido amniotico o celulas madre mesenquimales de medula osea, tejido adiposo o cualquier tejido fetal o postnatal o cualquier celula madre determinada (por ejemplo, de intestino, pulmon, arbol biliar, rinon, piel, corazon) hacia un destino adulto especffico.
En modalidades adicionales, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar y acelerar la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras, que comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los metodos de esta invencion, en donde las celulas son celulas madre y el medio de cultivo celular se formula para celulas maduras, y de esta manera aumentar y acelerar la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras.
Se describe ademas un metodo para suministrar celulas a un sujeto, que comprende sembrar el andamio de biomatriz de esta invencion con celulas y despues trasplantar al sujeto, el andamio de biomatriz sembrado con las celulas.
En la presente descripcion se proporciona, ademas, un metodo para identificar el potencial metastasico de celulas tumorales en un tipo de tejido, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las celulas tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, lo que identifica de esta manera el potencial metastasico de las celulas tumorales en el tipo de tejido.
Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para identificar una celula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en
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condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las celulas tumorales en el andamio de biomatriz; y f) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la ausencia de crecimiento de las celulas tumorales y/o la muerte de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica a las celulas tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para producir un injerto tumoral para el trasplante a un animal huesped; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) establecer una poblacion de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), para producir de esta manera un injerto tumoral para un trasplante en el animal huesped.
Otras modalidades de esta invencion incluyen un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) diluir el andamio de biomatriz de (a) en medio basal; c) congelar el andamio de biomatriz de (b) a aproximadamente -80 °C; d) pulverizar el andamio de biomatriz de (c) mediante trituracion criogenica a partfculas de la biomatriz que tienen un tamano en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 pm; e) descongelar las partfculas de la biomatriz de (d) en suspension en medio basal; y f) dispersar las partfculas de la biomatriz de la etapa (e) sobre un aparato de cultivo, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo.
En otras modalidades, la presente invencion proporciona un metodo para producir partfculas virales de un virus dependiente del linaje; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas de un tipo y una etapa del linaje que pueden ser infectadas con el virus dependiente del linaje; d) infectar las celulas de (c) con el virus dependiente del linaje; e) mantener las celulas infectadas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y f) recolectar partfculas virales producidas en las celulas infectadas, para producir de esta manera partfculas virales del virus dependiente del linaje.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para producir un organoide formado por recelularizacion de un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas del mismo tipo de tejido que el tejido biologico usado para preparar el andamio de biomatriz; d) mantener las celulas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, con lo que se forman organoides a partir de las celulas, para producir de esta manera un organoide formado mediante recelularizacion del andamio de biomatriz.
En la presente descripcion se proporciona ademas un metodo para producir una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas que producen la protefna de interes; d) mantener las celulas de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y f) recolectar la protefna de interes producida por las celulas de (d), para producir de esta manera una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz. Tratamiento con nucleasa para la eliminacion de acidos nucleicos. (B-D) Cuatro etapas en la preparacion de un andamio de biomatriz de rata. (B) Despues del lavado por perfusion con medio basal durante 10 minutos el hfgado se vuelve palido; (C) durante la deslipidacion, el hfgado se vuelve parcialmente transparente bajo GC (D) el andamio intacto final parece transparente a los 40 minutos de perfusion; (E) el andamio de biomatriz mostrado a un bajo aumento. (E1) La visualizacion del andamio perfundido con partfculas de dextrano marcadas con rodamina demuestra el flujo progresivo desde vasos grandes a las ramas finas de los vasos sangufneos a lo largo de los canales sin fugas, lo que indica una vasculatura evidente en los andamios. La tincion correspondiente con hematoxilina y eosina (H&E) del andamio de biomatriz en diferentes etapas demostro que las estructuras histologicas tales como los vasos sangufneos y la matriz tipo encaje que envuelve el parenquima se conservan, mientras que las celulas se eliminan. La estructura normal de trfada portal hepatica en la rata que consiste en la vena porta (PV), la arteria hepatica (HA) y el conducto biliar (BD) (B1); las fibras de la matriz se vuelven evidentes a medida que las celulas se eliminan gradualmente durante el proceso de descelularizacion (C1); region de la trfada portal descelularizada, comparar (B1) con la de (D1); D2 y D3 muestran que todas las celulas se eliminan del andamio de matriz, pero se conservan las estructuras de malla tales como los vasos sangufneos, GC y la matriz tipo encaje que rodea la muralia de celulas parenquimatosas.
Figuras 2A-H. Imagenes de TEM (A-C) y SEM (D-H) de andamios de biomatriz de hfgado de rata. (A) Imagen a poco aumento de un vaso sangufneo (BV) con una pared gruesa (W). El colageno tipo I (punta de flecha grande) es abundante y contiene secciones transversales de fibras individuales que no absorben tinciones de metales pesados (puntos blancos, puntas de flecha pequenas). (B) El mayor aumento de la pared de un vaso muestra la membrana basal (flecha grande), elastina amorfa (*) y fibras elasticas asociadas, un resto raro de vesfculas con membrana
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(punta de flecha pequena), una fibra en bandas de colageno tipo I (punta de flecha) y fibrillas pequenas (flechas pequenas). Las fibrillas pequenas son probablemente fibrilina (colageno tipo VI) que se asocia estrechamente con el colageno tipo I y ayuda a organizarlo. (C) Imagen a gran aumento del colageno tipo I con un patron de bandas de 64 nm (flechas). (D) Imagen a bajo aumento de un vaso con pared delgada (BV) y la pared de un vaso mas grande (W). (E) A mayor aumento, la pared del vaso grande (W) es festoneada, consistente con la arteria hepatica de una trfada portal, ver (A). Debajo de la pared hay numerosos haces de colageno tipo I (flecha grande) unidos por fibrillas de colageno delgadas, reticulares (tipo III), largas y ramificadas. (F) Un gran haz de colageno tipo I tiene fibras paralelas caracterfsticas (flecha grande) asociadas con una variedad de fibras mas pequenas (flecha) y fibras nodulares o en forma de cuentas (punta de flecha). (G) Malla 3D de fibras grandes/pequenas interconectadas en un plano que forma un lfmite tal como para un sinusoide hepatico. (H). Imagen a mayor aumento de la malla que muestra una variedad de fibras (flechas): Colageno tipo III (mayor diametro recto), fibras elasticas o colageno tipo VI.
Figuras 3A-B. Analisis qufmico de colagenos y expresion de componentes de la matriz extracelular (ECM) en los andamios de biomatriz. (A) El contenido de tres aminoacidos, los cuales se encuentran en los colagenos: hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl) y glicina (Gly). Los numeros representan los residuos de cada aminoacido/1000 aminoacidos. Los datos indican el drastico aumento en el contenido de colageno en el proceso de descelularizacion que va de <0,2 % en el hfgado a mas del 15 % en los andamios de biomatriz. (B) La tincion inmunohistoqufmica de moleculas de la matriz en andamios de biomatriz, muestra una distribucion en los andamios de biomatriz hepatica de laminina (LAM), sulfato de heparan (HS), colageno tipo III (COL3) y fibronectina (FN) y protefnas tfpicas de la membrana basal en asociacion con restos de vasos sangufneos. A mayor aumento, pueden observarse los miembros principales de la membrana basal, que incluyen colageno tipo IV (COL4), entactina (Ent, denominada ademas nidogeno), laminina (LAM) y perlecan (Per), una forma de HS-PG en la porcion de los andamios cercana a las trfadas portales.
Figuras 4A-D. Patron de los componentes de ECM desde la trfada portal hasta la vena central en andamios de biomatriz. Comparacion histologica desde la trfada portal (zona 1) hasta la vena central (zona 3) de un hfgado normal (A) y un andamio de biomatriz hepatica (B); ambas son secciones tenidas con hematoxilina/eosina. (C) El modelo que ilustra una celula madre y un sistema de linaje de maduracion en el hfgado con componentes representativos de la matriz que muestra la formacion de patrones asociados con la zonificacion hepatica. Los componentes se enumeran en orden de abundancia a partir de los hallazgos de inmunohistoqufmica. Las etapas de linaje conocidas dentro de los hfgados humanos comienzan periportalmente en la zona 1 (alrededor de las trfadas portales) y progresan en la maduracion para terminar con celulas apoptoticas en la zona 3. La qufmica conocida de la matriz identificada en el nicho de celulas madre del hfgado esta compuesta de hialuronanos, colageno tipo III, una forma de laminina que se une a la integrina a6p4 y una forma sulfatada debilmente de CS-PG43,44. Justo fuera del nicho de celulas madre se encuentra el colageno tipo IV, normalmente con CS-PG sulfatados y HS-PG y formas de laminina que se unen a la integrina ap1. Se ha documentado que los HP-PG se ubican exclusivamente de manera pericentral45,46. (D) El estudio de los componentes de la matriz y su ubicacion en el hfgado frente a los de los andamios de biomatriz, datos resumidos de los hallazgos de inmunohistoqufmica (N/D = no analizado. *Otros han informado que se encuentran exclusivamente cerca de las venas centrales). La mayorfa de los componentes del citoesqueleto se pierden durante los lavados, quedan presentes residuos de algunas, pero no de todas, las protefnas citoesqueleticas. Los andamios no tienen cantidades detectables de tubulina, desmina y actina (ensayos de faloidina). Sin embargo, existen cantidades trazas de citoqueratinas diseminadas al azar en los andamios; cantidades traza de a-actina del musculo liso alrededor de restos de vasos sangufneos en las trfadas portales; y niveles bajos de vimentina en todas partes.
Figuras 5E-I. Caracterizacion de hHpSC sobre andamios de biomatriz hepatica frente a hHpSC sobre colageno tipo 1. Las imagenes de contraste de fase (A-D) muestran los cambios morfologicos de las colonias de hHpSC derivadas del mismo hfgado y cultivadas en medio de Kubota libre de suero y sobre plastico de cultivo de tejido (A), una de las condiciones para la autorreplicacion, frente a las condiciones de diferenciacion del medio de diferenciacion libre de suero para el hfgado, y sobre colageno tipo I (B) frente a los andamios de biomatriz hepatica bovino (C-E). Los cultivos funcionales y completamente viables no duraron mas de ~ 2 semanas en colagenos tipo I. Por el contrario, aquellas en andamios de biomatriz hepatica estaban viables y sanas y con un repertorio completo de funciones que duraron al menos un mes. Los cultivos indujeron una transicion en las celulas hacia los dfas 7-12 con un aumento de la relacion citoplasmica/nuclear y una expresion marcada de glucogeno (C) y despues a unas con morfologfa clasica de hepatocitos poligonales intercalados por canalfculos biliares claros (D), una morfologfa de cultivo que persistio despues, segun lo indicado en el cultivo representativo en el dfa 24 (E). Los ensayos de RT-PCR muestran cambios en la expresion genica de hHpSC en condiciones de autorreplicacion en plastico de cultivo (F) frente a andamios de biomatriz hepatica de rata en el dfa 7 (G). Se comparo la expresion de los marcadores de hHpSC, que incluyen CXCR4 y EpCAM; genes hepatocfticos tempranos que incluyen CK19 (KRT19), HNF6, FOXA2, AFP y niveles bajos de albumina; marcadores hepatocfticos maduros que incluyen niveles altos de albumina (ALB), transferrina (TF), CYP450-3A4, tirosina aminotransferasa (TAT) y glucosa-6-fosfatasa (G6PC) y genes colangiocfticos, que incluyen CFTR, gamma glutamil transpeptidasa (GGT1) intercambiador anionico 2 (AE2) y transportador de acido biliar dependiente de sodio apical (ASBT). Ensayos bioqufmicos que miden la urea (H) sintetizada en cultivos sobre colageno tipo I frente a andamios de biomatriz hepatica de rata y actividad de CYP450-3A4 (I) en cultivos sobre colageno tipo I frente a andamios de biomatriz preparados a partir de hfgados de rata o de bovino. La Tabla 7 proporciona un resumen de las medidas cuantitativas que comparan la union, la viabilidad, el crecimiento, la
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duracion de la vida del cultivo y la expresion genica con especificidad tisular de hHpSC recien aisladas, en condiciones de cultivo para la autorreplicacion (colageno tipo III) o en condiciones de diferenciacion sobre colageno I, frente a andamios de biomatriz hepatica.
Figuras 6A-D. Tincion de inmunofluorescencia de celulas con restriccion del linaje a partir de hHpSC sobre andamios de biomatriz. (A) Tincion con marcador especffico hepatico: albumina (Alb, gris claro) y marcador de la superficie de celulas madre hepaticas: EpCAM (blanco). Observese que las celulas sembradas sobre el andamio de biomatriz no expresan EpCAM. Barra de escala = 200 pm. (B) Tincion con el marcador hepatico temprano a-fetoprotefna (AFP, gris claro) y con un anticuerpo contra el marcador de colangiocitos humanos, la citoqueratina 19 (CK19, blanco) que a este nivel de expresion es indicativa de colangiocitos maduros. El anticuerpo para el ensayo de CK19 es especffico de humanos y no tino el residuo en la CK19 de rata en los andamios no sembrados con celulas. La expresion de AFP es baja pero todavfa evidente en el dfa 7. Barra de escala = 200 pm. (C) Tincion con Alb (gris claro) y marcador de celulas estrelladas hepaticas, a-actina del musculo liso (ASMA, blanco). La expresion de albumina y ASMA es una fuerte indicacion de la presencia de hepatocitos maduros y celulas estrelladas. Barra de escala = 100 pm. (D) Tincion con protefna hepatica funcional CYP450-3A4 (gris claro) y marcador especffico de colangiocitos, receptor de secretina (SR, blanco) que muestra que los colangiocitos y hepatocitos maduros son funcionales y expresan los marcadores clasicos para estos dos tipos celulares. Barra de escala = 200 pm.
Figuras 7A-D. Estabilidad de hepatocitos humanos maduros y completamente funcionales sobre andamios de biomatriz. Hepatocitos humanos adultos sembrados en el medio de diferenciacion y sobre colageno tipo I (A,B) frente a andamios de biomatriz hepatica bovina (C) que se pulverizaron criogenicamente, se dispersaron en el medio y se dejaron sedimentar sobre las placas. Las celulas sobre el colageno tipo I son totalmente viables y en su maximo de diferenciacion de 7-12 dfas (A - mostradas a los 7 dfas); comienzan a deteriorarse despues de ~ 2 semanas, y hacia los 20 dfas (B) mueren, estan en un proceso de muerte y no son funcionales. Por el contrario, las sembradas sobre andamios de biomatriz hepatica (C) son funcionales durante al menos 8 semanas (aun no se han evaluado tiempos mas largos); aquf se muestra despues de 21 dfas en cultivo sobre andamios de biomatriz hepatica pulverizados. Ensayos de CYP450-3A4 en cultivos de dos preparaciones separadas de celulas hepaticas humanas adultas criopreservadas, sembradas sobre andamios de biomatriz frente a colageno tipo I y sometidas al ensayo en el dfa 12 (D). La muestra ZHep-007 es representativa de muestras criopreservadas con buena adherencia despues de la descongelacion; la muestra ZL-013 es representativa de los lotes que tienen mala o ninguna adherencia despues de la descongelacion. Por lo tanto, incluso estas muestras de menor calidad son capaces de unirse a los andamios de biomatriz y permanecer viables a largo plazo. En ambas muestras sometidas al ensayo, los niveles de P450 son mayores cuando se cultivan sobre andamios de biomatriz hepatica. Con el tiempo sobre los andamios de biomatriz, los lotes de celulas criopreservadas de menor calidad mejoraran.
Figura 8. Activacion de la fosfolipasa A2 por desoxicolato sodico para producir lisolecitina. Principio del protocolo: La fosfolipasa A2 (PLA2) activada por desoxicolato de sodio degradara el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensioactivo, que induce necrosis celular.
Figura 9. Analisis de la composicion de colageno de hfgados de rata frente a andamios de biomatriz hepatica de rata. La composicion de aminoacidos de la biomatriz (negro) y del hfgado entero (gris claro) presentada en forma de un diagrama de rosa. Se utiliza una abreviatura de tres letras para cada aminoacido analizado. El triptofano y la cistefna no se analizaron. Los numeros indican los residuos de aminoacidos/1000.
Figuras 10A-C. Analisis de acidos nucleicos del andamio de biomatriz hepatica de rata. Foto de contraste de fase (A) y tincion fluorescente con DAPI (B) de la lamina de biomatriz hepatica, y ensayos cuantitativos en ARN y ADN total de tejido hepatico fresco de rata frente al andamio de biomatriz (C).
Figuras 11A-C. Tincion del andamio de biomatriz despues de sembrar hHpSC sobre el andamio de biomatriz. El ensayo Vivas (calcefna-AM, blanco)/Muertas (bromuro de etidio o EtD-Br1, gris claro) indica que las colonias de hHpSC eran viables en secciones del andamio de biomatriz, pero no incorporaron el colorante en el centro de las colonias (A,B) durante los primeros dfas debido a las bombas conocidas en las celulas madre (por ejemplo, MDR1) que eliminan los colorantes vitales. En (B) la imagen de fluorescencia se fusiona con la de fase para indicar que el centro de la colonia contiene celulas. En el dfa 7, las celulas a lo largo de la colonia se habfan diferenciado e incorporado el colorante vital en casi todas las celulas a lo largo de la colonia (C).
Figuras 12A-F. Comparacion de hepatocitos de rata cultivados sobre colageno tipo I con respecto a hepatocitos de rata cultivados sobre andamios de biomatriz hepatica de rata. Hepatocitos adultos de rata cultivados sobre colageno tipo I y andamio de biomatriz en el dfa 3 (A,C) y el dfa 10 (B,D). Las celulas se unieron en cuestion de varios minutos a los andamios de biomatriz hepatica y sobrevivieron durante todo el tiempo ensayado, mas de 8 semanas (C,D); no se analizaron perfodos de tiempo mas largos. Los cultivos son muy tridimensionales en los andamios de biomatriz. Sfntesis de urea (E) y ensayo de viabilidad celular (F) en los dfas 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28, n = 3.
Figuras 13A-D. Comparacion de un pancreas humano con un andamio de biomatriz pancreatica humana. Pancreas humano (A) vs andamio de biomatriz pancreatica humana (B-D) embebidos en parafina, cortados y tenidos con Hematoxilina y Eosina (H & E). Las estructuras de los islotes se han delineado en B. Las regiones acinares de los
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andamios de biomatriz pancreatica se muestran en C y D.
Figura 14. Comparacion de los componentes representativos de la matriz y un componente del citoesqueleto, la vimentina, que se encuentra en el tejido pancreatico humano frente a los andamios de biomatriz pancreatica de rata. Otros componentes del citoesqueleto (desmina, tubulina, actina) no se encontraron en cantidades detectables o se encontraron en cantidades traza (citoqueratinas). Las lfneas discontinuas rodean los islotes, donde se observa que sindecano1 y el colageno tipo VI son fuertemente positivos en los islotes tanto en el tejido pancreatico como en los andamios de biomatriz. Sindecano 1 se encuentra solo en los islotes (lfnea discontinua), pero no en las celulas acinares (flechas); el colageno tipo III es mas abundante en las celulas acinares y alrededor de los vasos sangufneos (flechas), pero no en los islotes.
Figuras 15A-C. Tincion histologica e inmunohistoqufmica del andamio de biomatriz de duodeno humano. (A) Lado exterior y del lumen del andamio de biomatriz de duodeno humano. Las estructuras de multiples capas entre el tejido normal (B) y el andamio de biomatriz (C) se compararon en secciones tenidas con H & E, y los resultados muestran que los andamios retuvieron las vellosidades y vasos sangufneos en las capas de la mucosa y la submucosa. Los paneles inferiores muestran que la tincion inmunohistoqufmica del andamio de biomatriz de duodeno humano indico cantidades variables de protefnas de la matriz extracelular retenidas en el andamio.
Figuras 16A-D. Comparacion de un tejido de vesfcula biliar humana con un andamio de biomatriz de vesfcula biliar humana. Tejido de la vesfcula biliar (A,B) frente a andamios de biomatriz (C,D) preparados a partir de este. El tejido y los andamios de biomatriz se embebieron en parafina, se cortaron y tineron con hematoxilina y eosina.
Figuras 17A-B. Las lfneas celulares de tumor de colon HT29 (A) y SW480 (B) se sembraron sobre andamios de biomatriz y formaron colonias de celulas compuestas de cientos a miles de celulas y que eran bastante tridimensionales.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se describira ahora mas en detalle de aquf en adelante. Esta invencion puede, sin embargo, realizarse en formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Mas bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripcion sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica.
La terminologfa que se usa en la descripcion de la invencion en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares unicamente y no se pretende que sean limitativas de la invencion. Tal como se usa en la descripcion de la invencion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pretenden incluir las formas plurales tambien, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos (que incluyen los terminos tecnicos y cientfficos) usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Se comprendera ademas que los terminos, tales como los definidos en los diccionarios utilizados comunmente, deben interpretarse como que tienen un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la tecnica relevante y no deben interpretarse en un sentido idealizado o excesivamente formal, a menos que asf se defina expresamente en la presente descripcion. La terminologfa que se usa en la descripcion de la invencion en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares y no se pretende que sean limitativas de la invencion. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente estan incorporadas completamente como referencia.
Ademas, como se usa en la presente descripcion, "y/o" se refiere y abarca a todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o mas de los elementos enumerados asociados, asf como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
A menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera, se pretende especfficamente que las diversas caracterfsticas de la invencion descritas en la presente puedan utilizarse en cualquier combinacion. Ademas, los diccionarios actuales de uso comun deben interpretarse como que tienen un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la tecnica relevante y no deben interpretarse en un sentido idealizado o excesivamente formal a menos que se defina expresamente en la presente descripcion. La terminologfa que se usa en la descripcion de la invencion en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares y no se pretende que sean limitativas de la invencion.
Ademas, como se usa en la presente descripcion, "y/o" se refiere y abarca a todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o mas de los elementos enumerados asociados, asf como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
A menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera, se pretende especfficamente que las diversas
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caracterfsticas de la invencion descritas en la presente puedan utilizarse en cualquier combinacion. Por otra parte, la presente invencion contempla ademas que en algunas modalidades de la invencion, cualquier caracterfstica o combinacion de caracterfsticas expuestas en la presente descripcion pueden excluirse u omitirse. Para ilustrar, si la descripcion establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, esta especfficamente destinado que cualquiera de A, B o C, o una combinacion de estos, puede omitirse y rechazarse individualmente o en cualquier combinacion.
Como se usa en la presente descripcion, la frase de transicion "que consiste esencialmente en" (y variantes gramaticales) ha de interpretarse que abarca los materiales o etapas citados y "los que no afectan materialmente la(s) caracterfstica(s) basica(s) y novedosas de la invencion reivindicada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USpQ 461, 463 (CcPA 1976) (enfasis en el original); ver ademas MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el termino "que consiste esencialmente en" como se usa en la presente descripcion no debe interpretarse como equivalente de "que comprende".
El termino "aproximadamente", como se usa en la presente descripcion cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad o concentracion (por ejemplo, el porcentaje de colageno en las protefnas totales en el andamio de biomatriz) y similares, esta destinado a abarcar variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, o incluso 0,1 % de la cantidad especificada.
La presente invencion esta dirigida al descubrimiento y desarrollo de un andamio de biomatriz que tiene mejoras y ventajas inesperadas sobre los andamios de tejido descelularizado ahora conocidos, donde algunos ejemplos de la mejora y ventaja son el uso del andamio de biomatriz de esta invencion para, de manera eficiente, mantener celulas maduras y/o restringir el linaje y/o diferenciar celulas madre a destinos maduros y/o mantener dichas celulas maduras como funcionales durante un perfodo de tiempo prolongado. Como otro ejemplo, el uso de los andamios de biomatriz de esta invencion reduce el tiempo para producir celulas de destinos maduros de aproximadamente tres a seis semanas o mas a aproximadamente una a dos semanas. Los andamios de biomatriz de esta invencion se producen mediante el uso de protocolos especfficos que emplean el equilibrio apropiado de concentracion de sal y fuerza ionica (diferentes colagenos tienen diferentes constantes de solubilidad (23)) para un tejido dado, para permitir la retencion de colagenos nativos presentes en ese tejido en forma insoluble, lo que produce un andamio de biomatriz que retiene un alto por ciento de colagenos nativos que proporcionan senales para conducir a la restriccion del linaje y la diferenciacion. Por el contrario, los andamios descelularizados producidos de acuerdo con protocolos conocidos no emplean tal equilibrio de concentracion de sal y fuerza ionica para permitir la retencion de un alto por ciento de estos colagenos nativos y la mayorfa de estos colagenos nativos se pierden cuando se usan estos protocolos conocidos. Ademas, los andamios de biomatriz de esta invencion permiten la produccion de virus y/o agentes patogenos dependientes del linaje (por ejemplo, dependientes de la diferenciacion) en cantidades suficientes para uso experimental y/o terapeutico (por ejemplo, para la produccion de vacunas).
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invencion proporciona un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepatico de mamffero, que comprende las etapas de: a) perfundir u homogeneizar el tejido hepatico con un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues b) perfundir el tejido biologico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; despues c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de aproximadamente NaCl 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, la concentracion elegida para mantener insolubles a los colagenos identificados en el tejido biologico; despues d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido biologico, que comprende dicho andamio de biomatriz al menos 95 % (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 %) de los colagenos y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico sin procesar. En la presente invencion se proporciona ademas un andamio de biomatriz producido mediante cualquiera de los metodos de esta invencion.
"Andamio de biomatriz", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un extracto tisular aislado enriquecido en matriz extracelular, como se describe en la presente, que retiene muchos o la mayorfa de los colagenos y factores unidos al colageno encontrados naturalmente en el tejido biologico. En algunas modalidades se retienen esencialmente todos los colagenos y factores unidos al colageno y en otras modalidades el andamio de biomatriz comprende todos los colagenos que se conoce que estan en el tejido. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %,
Los colagenos ilustrativos incluyen todos los tipos de colageno, tales como, pero sin limitacion, colagenos tipo I a tipo XXIX. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de uno o mas de los colagenos encontrados en el tejido biologico natural y/o pueden tener uno o mas de los colagenos presentes en una concentracion que es al menos
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aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de los encontrados en el tejido biologico natural. La cantidad de colageno en el andamio de biomatriz puede determinarse mediante diversos metodos conocidos en la tecnica y como se describen en la presente descripcion, tales como, pero sin limitacion, la determinacion del contenido de hidroxiprolina.
Los componentes ilustrativos de la matriz asociada al colageno incluyen, pero sin limitacion, moleculas de adhesion; protefnas de adhesion; L- y P-selectina; molecula asociada al crecimiento de union a la heparina (HB-GAM); repeticion de trombospondina tipo I (TSR); amiloide P (AP); lamininas; nidogenos/entactinas; fibronectinas; elastinas; vimentinas; proteoglicanos (PG); sulfato de condroitina-PG (CS-PG); sulfato de dermatan-PG (DS-PG); miembros de la familia de proteoglicanos pequenos ricos en leucina (SLRP), tales como biglicano y decorinas; heparina-PG (HP- PG); sulfato de heparan-PG (HS-PG) tales como glipicanos, sindecanos y perlecanos; y glicosaminoglicanos (GAG) tales como hialuronanos, sulfatos de heparan, sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina y heparinas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste o consiste esencialmente en colagenos, fibronectinas, lamininas, nidogenos/entactinas, elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, hormonas y citocinas (en cualquier combinacion) unidos a diversos componentes de la matriz. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de uno o mas de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno que se encuentran en el tejido biologico natural y/o puede tener uno o mas de estos componentes presentes en una concentracion que es al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de la que se encuentra en el tejido biologico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende todos o la mayor parte de las hormonas citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno, que se conoce que estan en el tejido. En otras modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste esencialmente o consiste en uno o mas de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno en concentraciones que estan cercanas a las encontradas en el tejido biologico natural (por ejemplo, aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la concentracion encontrada en el tejido natural).
Los factores de crecimiento ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento transformantes, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) insulina-como el tejido biologico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende todos o la mayor parte de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno, que se conoce que estan en el tejido. En otras modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste esencialmente o consiste en uno o mas de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno en concentraciones que estan cercanas a las encontradas en el tejido biologico natural (por ejemplo, aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la concentracion encontrada en el tejido natural).
Los factores de crecimiento ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento transformantes, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), protefnas de union a IGF, factores basicos de crecimiento de fibroblastos y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las citocinas ilustrativas incluyen, pero sin limitacion, interleucinas, linfocinas, monocinas, factores estimulantes de colonias, quimiocinas, interferones y factor de necrosis tumoral (TNF). El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o mas (en cualquier combinacion) de uno o mas de los factores de crecimiento unidos a la matriz y/o citocinas encontradas en el tejido biologico natural y/o puede tener uno o mas de estos factores de crecimiento y/o citocinas (en cualquier combinacion) presentes a una concentracion que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % o mas de la encontrada en el tejido biologico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende niveles fisiologicos o niveles cercanos a los fisiologicos de muchos o la mayorfa de los factores de crecimiento unidos a la matriz, hormonas y/o citocinas conocidas por estar en el tejido natural y/o detectadas en el tejido, y en otras modalidades el andamio de biomatriz comprende uno o mas de los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz, a concentraciones que estan cercanas a las concentraciones fisiologicas encontradas en el tejido biologico natural (por ejemplo, que se diferencian en no mas de aproximadamente 30 %, 25 %, 20 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % en comparacion). La cantidad o concentracion de factores de crecimiento o citocinas presentes en el andamio de biomatriz puede determinarse por diversos metodos conocidos en la tecnica y como se describen en la presente, tales como, pero sin limitacion, diversos ensayos de anticuerpos y ensayos de factores de crecimiento.
"Tejido biologico" como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier tejido de un organismo vivo o fallecido o cualquier tejido derivado de un organismo vivo o fallecido. El termino "tejido biologico natural" y variaciones de este, como se usan en la presente descripcion, se refieren al tejido biologico tal como existe en su estado natural o no modificado en el organismo. Los andamios de biomatriz pueden prepararse a partir de cualquier tejido biologico. El tejido biologico puede incluir cualquier tejido individual (por ejemplo, una coleccion de celulas que pueden estar interconectadas) o un grupo de tejidos que constituyen un organo o parte o region del cuerpo de un organismo. El tejido puede comprender un material celular homogeneo o puede ser una estructura compuesta tal
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como la que se encuentra en regiones del cuerpo que incluyen el torax que, por ejemplo, puede incluir tejido pulmonar, tejido esqueletico y/o tejido muscular.
Los tejidos biologicos ilustrativos incluyen hfgado, pulmon, tiroides, piel, pancreas, vasos sangufneos, vejiga, rinones, cerebro, arbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilfaca, corazon e intestinos, que incluyen cualquier combinacion de estos. El organismo (es decir, sujeto) del cual se asocia o deriva el tejido biologico puede ser cualquier animal, que incluye animales mamfferos y no mamfferos tales como invertebrados.
Los sujetos ilustrativos incluyen mamfferos, tales como, pero sin limitacion, seres humanos, ratones, ratas, hurones, hamsteres, conejos, cobayos, cerdos, porcinos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, monos y chimpances. El sujeto puede ser de cualquier edad y/o tamano. El tejido biologico puede estar sano, enfermo y/o tener mutaciones geneticas. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz de la presente invencion son especfficos de tejidos en su naturaleza qufmica y funcionalidad, es decir, los andamios de biomatriz son representativos o comparables con el tejido biologico a partir del cual se crearon en terminos de su naturaleza qufmica y funcionalidad.
En algunas modalidades, la histologfa original y las vasculaturas evidentes se mantienen en los andamios de biomatriz. Esto puede incluir los restos reconocibles de las entidades histologicas principales del tejido biologico, tales como, pero sin limitacion, vasos sangufneos y otra vasculatura para cualquier tejido; conductos biliares y capsula de Glisson (GC) del hfgado; conductos pancreaticos, islotes y acinos del pancreas; bronquios, traquea y alveolos de los pulmones, etcetera. En otras modalidades, la qufmica del andamio de biomatriz se adapta a la histologfa (por ejemplo, la matriz alrededor de los vasos sangufneos es distinta de la que rodea a los hepatocitos). En algunas modalidades la qufmica del andamio de biomatriz esta en un gradiente que se correlaciona con la histologfa. Por ejemplo, cuando el tejido biologico es el hfgado, el andamio de biomatriz puede retener el gradiente en la qufmica de la matriz que se correlaciona con las zonas acinares hepaticas 1-3 desde la trfada portal a la vena central y con entidades histologicas tales como los canales vasculares y la capsula de Glisson (GC). Otros ejemplos incluyen, pero sin limitacion, vasos sangufneos donde la qufmica de la matriz alrededor de los vasos sangufneos esta repleta de altos niveles de colagenos en red (por ejemplo, tipo IV y tipo VI), elastinas y formas de HS-PG; alrededor de los hepatocitos en la zona periportal (zona 1), donde las lamininas estan en alta concentracion junto con una mezcla de CS-PG y HS-PG, mientras que alrededor de la zona pericentral (zona 3), los hepatocitos estan rodeados por una mezcla de HS-PG y HP-PG; asociados con los conductos biliares donde existen altos niveles de colageno tipo I, fibronectinas y formas de CS-PG y DS-PG. En todos los tejidos existen gradientes paralelos en la qufmica de la matriz.
Una serie de medios de enjuague, tales como el primer y el segundo medio, y tampones pueden utilizarse en la presente invencion. En particular, puede usarse cualquier medio de enjuague o tampon que mantenga los colagenos y los factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) en un estado insoluble. Cuando se elige un medio o tampon, la concentracion de sal, el pH y la fuerza ionica deben ser adecuados para mantener los colagenos y/o la mayorfa o la mayor parte de los componentes de la matriz unidos al colageno y otros factores (por ejemplo, en virtud de sus conexiones qufmicas directa o indirectamente con los colagenos) en un estado insoluble. La Tabla 1 proporciona intervalos de concentracion molar del cloruro de sodio para diversos tipos de colageno para ayudar a un experto en la tecnica a proporcionar medios y tampones que aseguren que los colagenos, los componentes de la matriz asociados al colageno y los factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz permanezcan insolubles. Deyl y otros ("Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins" Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275), adicionalmente, proporcionan informacion sobre la qufmica del colageno que puede facilitar la identificacion de las condiciones optimas para mantener los colagenos y los factores unidos en un estado insoluble.
La Tabla 1 demuestra que el pH es una variable que actua junto con la concentracion de sal para definir la solubilidad. Cuando se tienen altas concentraciones de sal, el pH puede ser neutro. En algunas modalidades de la presente invencion, la concentracion de sal elegida es la que mantiene todos los colagenos del tejido en un estado insoluble, no solo uno de los colagenos del tejido en un estado insoluble. Por ejemplo, los colagenos conocidos en el hfgado fetal son los insolubles en concentraciones de sal de 4,5 M de NaCl y los de tejido hepatico adulto que son insolubles en concentraciones de sal de aproximadamente 3,4 M-3,5 M de NaCl.
La osmolalidad de cualquiera de los medios de enjuague y/o tampones puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 200 mOsm/kg a aproximadamente 400 mOsm/kg, de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de aproximadamente 275 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg, o de aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg, que incluyen, pero sin limitacion, cualquier valor dentro de estos intervalos no citado explfcitamente en la presente. El agua destilada y los tampones diluidos (por ejemplo, con osmolalidad <100 mOsm/kg) produciran la perdida de cantidades significativas de colageno, componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento unidos a la matriz y citocinas. Por lo tanto, en algunas modalidades de los metodos de esta invencion, no se incluyen agua destilada ni tampones diluidos.
Como reconocera un experto en la tecnica, la osmolalidad es una expresion de la concentracion osmotica de un soluto por masa, mientras que la osmolaridad es por volumen del disolvente. Por lo tanto, la conversion de
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osmolaridad a osmolalidad puede realizarse mediante la multiplicacion por la densidad de masa. La osmolalidad puede
La molaridad y la osmolaridad no se utilizan comunmente en osmometrfa porque son dependientes de la temperatura. Esto se debe a que el agua cambia su volumen con la temperatura. Sin embargo, si la concentracion de solutos es muy baja, la osmolaridad y la osmolalidad se consideran equivalentes.
La osmolaridad de una solucion puede calcularse a partir de la siguiente expresion:
oemol/L = ifa v^Ci
i ,
donde 9 es el coeficiente osmotico, que explica el grado de no idealidad de la solucion; n es el numero de partfculas (por ejemplo iones) en las que se disocia una molecula; C es la concentracion molar del soluto; y el fndice i representa la identidad de un soluto particular. En el caso mas simple 9 es el grado de disociacion del soluto. Entonces, 9 esta entre 0 y 1, donde 1 indica el 100 % de disociacion. Sin embargo, 9 tambien puede ser mayor que 1 (por ejemplo, para la sacarosa). Para las sales, los efectos electrostaticos provocan que 9 sea menor que 1 incluso si se produce 100 % de disociacion.
La perfusion del tejido biologico con cualquier medio o tampon puede lograrse al forzar el medio o tampon a traves de la vasculatura relevante del tejido biologico. Por ejemplo, si el tejido biologico es el hfgado, entonces el medio o tampon pueden perfundirse a traves de la vena porta del hfgado. Alternativamente, el medio o tampon pueden verterse sobre el tejido biologico y/o dejar que difundan a traves del tejido biologico. Por ejemplo, el tejido biologico puede sumergirse y/o dializarse en el medio o tampon, para permitir que el medio o tampon difundan a traves del tejido biologico. Mientras se sumergen y/o se dializan en el medio o tampon, la solucion y el tejido biologico pueden sacudirse, tal como sobre un balancfn, y/o agitarse. En algunas modalidades los medios y tampones se perfunden a traves de la vasculatura relevante del tejido biologico.
Alternativamente, el tejido puede homogeneizarse en el medio inicial y los tampones y medios usados despues de esto son para la extraccion del homogeneizado. Las versiones homogeneizadas de los andamios de biomatriz se preparan a partir de organos grandes (por ejemplo, de tejidos de vaca o porcino), despues se pulverizan hasta obtener un polvo a temperaturas del nitrogeno lfquido y el polvo se usa en placas para estudios de cultivo.
En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio es un medio basal, tal como, pero sin limitacion, medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, bMe, DMEM, Waymouth o William. En la tecnica se conocen otros medios basales ilustrativos y estan disponibles comercialmente. El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir esencialmente o consistir en componentes que se combinan para mantener la mayorfa de los colagenos insolubles y como moleculas nativas, como se describe en la presente descripcion (por ejemplo, mediante la
combinacion particular de la osmolalidad y la fuerza ionica asf como la ausencia de suero). El primer medio y/o el
segundo medio pueden pulverizarse hasta obtener un polvo a temperaturas del nitrogeno lfquido, y el polvo se usa en placas para estudios de cultivo.
En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio es un medio basal, tal como, pero sin limitacion, medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, bMe, DMEM, Waymouth o William. En la tecnica se conocen otros medios basales ilustrativos y estan disponibles comercialmente. El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir esencialmente o consistir en componentes que se combinan para mantener la mayorfa de los colagenos insolubles y como moleculas nativas, como se describe en la presente descripcion (por ejemplo, mediante la
combinacion particular de la osmolalidad y la fuerza ionica asf como la ausencia de suero). El primer medio y/o el
segundo medio pueden comprender, consistir, o consistir esencialmente en los constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial tales como, pero sin limitacion, agua; sales tales como, pero sin limitacion, sales inorganicas; vitaminas; minerales; aminoacidos tales como, pero sin limitacion, glicina, serina, treonina, cistefna, asparagina y/o glutamina; azucares; acidos grasos; coenzimas; hormonas; y neurotransmisores. En determinadas modalidades donde el primer medio y/o el segundo medio comprenden constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial, los constituyentes pueden producir una osmolalidad aproximadamente equivalente a la osmolalidad del medio basal disponible comercialmente o producir una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio incluyen medios que estan libres de suero, comprenden constituyentes presentes en el fluido intersticial, y/o tienen una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. Tales medios tambien pueden estar a pH neutro. La composicion especffica del primer medio y/o el segundo medio se determina, en modalidades particulares, por las constantes de insolubilidad de los colagenos del tejido biologico utilizado para obtener el andamio de biomatriz, como conocera un experto en la tecnica.
El tampon de deslipidacion de la presente invencion debe ser eficaz y sin embargo suave. El tampon de deslipidacion puede comprender, consistir o consistir esencialmente en detergentes o tensioactivos, medio basal,
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sales y/o lipasas. Al elegir los componentes para el tampon de deslipidacion, deben evitarse detergentes duros (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, Triton X-100) para minimizar la perdida de componentes de la matriz. Los detergentes ilustrativos incluyen detergentes anionicos, tales como sales del acido desoxicolico, acido 1- heptanosulfonico, N-laurilsarcosina, laurilsulfato, acido 1-octanosulfonico y acido taurocolico; detergentes cationicos tales como cloruro de benzalconio, cetilpiridinio, cloruro de metilbenzetonio y bromuro de decametonio; detergentes zwitterionicos tales como alquil betafnas, alquil amidoalquil betafnas, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1- propanosulfonato y fosfatidilcolina; y detergentes no ionicos tales como n-decil a-D-glucopiranosido, n-decil p-D- maltopiranosido, n-dodecil p-D-maltosido, n-octil p-D-glucopiranosido, esteres de sorbitan, n-tetradecil p-D- maltosido, tritones, Nonidet-P-40, Poloxamero 188 y cualquiera de los grupos de detergentes Tween; lauril sulfato sodico; y desoxicolato sodico. En algunas modalidades, el tampon de deslipidacion comprende desoxicolato sodico.
Las lipasas ilustrativas incluyen fosfolipasas tales como fosfolipasa A2, lipasa pancreatica humana, esfingomielinasas, lipasa lisosomal, lipasa endotelial y lipasa hepatica. En algunas modalidades, el tampon de deslipidacion comprende fosfolipasa a2. En otras modalidades, el tampon de deslipidacion comprende desoxicolato sodico y fosfolipasa A2. Esta combinacion, en algunas modalidades, puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y aproximadamente 1 % de desoxicolato de sodio preparado en un medio basal de pH neutro y libre de suero, que puede ser, por ejemplo, el primer medio. La combinacion de desoxicolato sodico y fosfolipasa A2 degrada rapidamente el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un tensioactivo potente, que puede inducir necrosis y citolisis. Como reconocera un experto en la tecnica, la cantidad y el tipo de lipasa y/o detergente pueden depender del tejido biologico.
La etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion se lleva a cabo, en algunas modalidades, hasta que el tejido se vuelve transparente. En otras modalidades, la etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion se lleva a cabo hasta que la efusion se vuelve clara. En algunas modalidades, la etapa de deslipidacion se lleva a cabo hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusion se vuelve clara.
En algunas modalidades se evita la exposicion prolongada de los andamios de biomatriz a las enzimas de las celulas lisadas, ya que puede disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos tales como sulfatos de heparan, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatan y heparinas, que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento. La exposicion a las enzimas de las celulas lisadas puede evitarse, por ejemplo, durante la deslipidacion y/o los lavados posteriores despues de la deslipidacion. En algunas modalidades, puede emplearse el uso de un inhibidor de proteasas y/o un control cuidadoso del pH, la temperatura y/o el tiempo para limitar la actividad de las proteasas y/u otras enzimas de las celulas lisadas.
Los inhibidores de proteasas ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, inhibidores de serina proteasas tales como, pero sin limitacion, antipafna, aprotinina, quimostatina, elastatinal, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, leupeptina e inhibidor de tripsina de soja; cistefna proteasas tales como, pero sin limitacion, IAA (acido indolacetico) y E-64; inhibidores de la proteasa aspartica tales como, pero sin limitacion, pepstatina y VdLPFFVdL; metaloproteasas tales como, pero sin limitacion, EDTA, 1,10-fenantrolina y fosforamodon; exopeptidasas aunque no se citan en la presente descripcion. En otras modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios se mantienen a pH neutro. La temperatura del andamio de biomatriz (por ejemplo, durante y/o despues de la preparacion), los tampones y/o los medios puede ser de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, que incluyen, pero sin limitacion, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no citado en la presente descripcion. En algunas modalidades la temperatura se mantiene a aproximadamente 20 °C. El tiempo de perfusion del tejido biologico con cualquier medio o tampon puede ser de aproximadamente 5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos, aproximadamente 1 hora o menos, aproximadamente 30 minutos o menos, o aproximadamente 15 minutos o menos. En algunas modalidades, la etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion es de aproximadamente 30 minutos o menos. En algunas modalidades en las que se usan pH acidos, las concentraciones de sal para mantener insolubles a los colagenos y los componentes asociados al colageno pueden ser diferentes; las concentraciones pueden determinarse por la literatura existente sobre la qufmica del colageno mediante la eleccion de concentraciones de sal que mantienen la insolubilidad de los colagenos.
Los tampones ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, cloruro sodico, lactato sodico, acetato sodico, fosfato sodico, citrato sodico, borato sodico, gluconato sodico, tampones citrato, tampones bis\tris, tampones fosfato, fosfato potasico, citrato/dextrosa, bicarbonato sodico, cloruro de amonio, acido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfonico, tris(hidroximetil)metilamina, N-tris(hidroximetil)metilglicina, acido 4,2- hidroxietil-1-piperazinoetanosulfonico y acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico.
En algunas modalidades, el tampon de esta invencion (por ejemplo, el tampon usado en la etapa © descrita en la presente descripcion) puede comprender una sal en una concentracion de aproximadamente 2,0 M o mas. Por ejemplo, en algunas modalidades la sal puede estar en una concentracion de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,5 M, o de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,0 M, que incluyen, pero sin limitacion,
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cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos, pero no citado explfcitamente en la presente descripcion. Por ejemplo, en algunas modalidades el tampon utilizado en los metodos de la presente invencion puede comprender una sal tal como cloruro sodico en una concentracion de aproximadamente 2,0 M de NaCl a aproximadamente 4,5 M de NaCl. En otras modalidades, tales como las de hfgados adultos, el tampon utilizado puede comprender de aproximadamente 3,4 M a aproximadamente 3,5 M de NaCl. En modalidades tales como las del hfgado fetal, el tampon utilizado puede comprender una sal tal como cloruro sodico en una concentracion de aproximadamente 4,0 M a aproximadamente 4,50 M. En algunas modalidades la perfusion del tejido biologico con un lavado con sal, tal como el de la etapa c) de los metodos ilustrativos descritos en la presente, se lleva a cabo hasta que el perfusado (es decir, el lfquido usado para la perfusion, tal como el lfquido que se ha forzado a traves de la vasculatura) es negativo para protefnas segun la densidad optica (DO) a 280 nm.
Cualquiera de los medios y/o tampones de la presente invencion puede comprender un inhibidor de proteasas. Los inhibidores de proteasas ilustrativos se describen anteriormente. En algunas modalidades, el tampon tal como el de la etapa (c) de los metodos ilustrativos descritos en la presente comprende un inhibidor de proteasas, tal como un inhibidor de tripsina de soja. En otras modalidades, el tampon de la etapa (d) comprende uno o mas inhibidores de proteasas, tales como un inhibidor de tripsina de soja.
Los medios y/o tampones de la presente invencion pueden comprender una o mas nucleasas, que en algunas modalidades pueden prepararse en los tampones estandar recomendados por los proveedores comerciales de estas enzimas. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tampon de la etapa d) comprende una o mas nucleasas, tales como, pero sin limitacion, RNAasa y DNAasa. La perfusion con nucleasas elimina residuos de acidos nucleicos. En otras modalidades, el tampon de la etapa d) comprende RNAasa, DNAasa y uno o mas inhibidores de proteasas. En algunas modalidades la perfusion del tejido biologico con una o mas nucleasas se lleva a cabo hasta que el perfusado (es decir, el lfquido usado para la perfusion, tal como el lfquido que se ha forzado a traves de la vasculatura) es negativo para acidos nucleicos segun la densidad optica (DO) a 260 nm. En algunas modalidades, las nucleasas eliminan el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de los acidos nucleicos en el tejido biologico.
El segundo medio (por ejemplo, el medio de enjuague final) puede ser cualquier medio que asegure que los colagenos y factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) permaneceran insolubles, como se describio anteriormente. Los medios de enjuague finales ilustrativos se han descrito anteriormente con referencia al primer medio y estan libres de suero, a pH neutro y con una osmolalidad de 250-350 mOsm/kg. Por ejemplo, en algunas modalidades el segundo medio comprende un medio basal. En algunas modalidades, el segundo medio es un medio basal libre de suero. En otras modalidades, el segundo medio es un medio hormonalmente definido, libre de suero (HDM) que comprende hormonas, factores de crecimiento, lfpidos y albumina serica y se adapta a las necesidades de las celulas a cultivar. Un segundo medio ilustrativo es el medio de Kubota (Kubota y Reid, PNAS 97:12132-12137, 2000), que esta disenado para celulas madre hepaticas, hepatoblastos y otros progenitores. En determinadas modalidades, el segundo medio puede o no comprender la suplementacion con suero o un factor derivado de suero, tal como, pero sin limitacion, albumina serica humana. En algunas modalidades, el enjuague del tejido con el segundo medio elimina los residuos del tampon de deslipidacion y las nucleasas. En otras modalidades, el lavado con el segundo medio y/o cualquier tampon o medio posteriores equilibra el andamio de biomatriz con el medio o tampon. En algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser los mismos y en algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser diferentes, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir del tejido biologico.
En algunas modalidades uno o mas de los medios y/o tampones utilizados en la preparacion del andamio de biomatriz estan libres (es decir, no contienen una cantidad detectable) de una o mas enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. En otras modalidades, todos los medios y tampones utilizados en la preparacion del andamio de biomatriz estan libres (es decir, no contienen una cantidad detectable) de una o mas enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. Las enzimas ilustrativas incluyen, pero sin limitacion, colagenasas; proteasas; glicosidasas tales como heparinasa, heparitinasa, condroitinasa e hialuronidasa; y elastasas.
La esterilizacion del tejido biologico, del homogenado y/o del andamio de biomatriz de esta invencion puede realizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, con la advertencia de que deben evitarse metodos que utilicen un factor que pueda unirse al andamio de biomatriz (por ejemplo oxido de etileno). Los metodos de esterilizacion ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, irradiacion gamma, descargas luminiscentes de radiofrecuencia (RFGD) esterilizacion por plasma, esterilizacion por haz de electrones y esterilizacion por dioxido de carbono supercrftico. En algunas modalidades, la esterilizacion del tejido, del homogeneizado y/o del andamio de biomatriz se realiza con irradiacion gamma a aproximadamente 5000 rads. Si los andamios se usaran inmediatamente para la recelularizacion, y si se usaron procedimientos esteriles en el proceso de descelularizacion (especialmente despues de la extraccion con alto contenido de sal), puede que la esterilizacion no sea necesaria.
El almacenamiento del andamio de biomatriz puede realizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para usarse intacto), el andamio de biomatriz puede almacenarse a aproximadamente 4 °C y en otras modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para dispersarse
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en la secta, el andamio de biomatriz se congela, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste, o consiste esencialmente en colagenos, fibronectinas, lamininas, nidogeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y cualquier combinacion de estos, todos los cuales forman parte del andamio de biomatriz (por ejemplo, unidos al andamio de biomatriz). En algunas modalidades, el andamio de biomatriz carece de una cantidad detectable de un colageno, fibronectina, laminina, nidogeno/entactina, elastina, proteoglicano, glicosaminoglicano y cualquier combinacion de estos.
Los andamios de biomatriz de la presente invencion han demostrado ser potentes sustratos de diferenciacion para las celulas y pueden usarse para muchos tipos celulares, tales como, pero sin limitacion, cualquier celula madura o para diversas poblaciones de celulas madre. Estas incluyen, por ejemplo, celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS), celulas madre de la capa germinal (por ejemplo, celulas madre endodermicas definitivas), celulas madre determinadas (por ejemplo, celulas madre hepaticas, pulmonares, pancreaticas o intestinales) celulas madre hepaticas humanas (hHpSC), celulas madre perinatales (por ejemplo, celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC)), celulas madre mesenquimales (MSC) tales como de la medula osea o del tejido adiposo, progenitores comprometidos, celulas adultas de cualquier tipo de tejido, celulas enfermas, celulas tumorales, celulas maduras, celulas parenquimatosas, celulas estrelladas, colangiocitos, celulas del arbol biliar tales como las que no son colangiocitos, hepatocitos, celulas de rinon, celulas uroteliales, celulas mesenquimales, celulas de musculo liso o esqueletico, miocitos, (celulas madre de musculo), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, fibromioblastos, celulas endoteliales, celulas ectodermicas, que incluyen celulas ductiles y cutaneas, celulas neurales, celulas de los islotes, celulas presentes en el intestino, osteoblastos, otras celulas que forman hueso o cartflago, y cualquier combinacion de estas. Estas celulas pueden ser normales o enfermas.
En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se usan para estudios biologicos, farmaceuticos, geneticos, moleculares y/o virologicos de las celulas, ya sean recien aisladas a partir de un tejido o a partir de celulas madre con restriccion del linaje. En otras modalidades los andamios de biomatriz se usan para organos implantados, vascularizados y modificados, tales como, pero sin limitacion, el hfgado. Otros usos ilustrativos para los andamios de biomatriz incluyen, pero sin limitacion, produccion de protefnas, pruebas de toxicidad de farmacos, desarrollo de farmacos, tamizaje de anticuerpos y/o produccion de virus para preparaciones de vacunas de virus. La produccion de virus dependientes del linaje (por ejemplo, virus del papiloma y hepatitis C) puede lograrse mediante la siembra de poblaciones de celulas madre en un andamio de biomatriz de especificidad tisular y despues cultivar en un medio que actua en combinacion con el andamio de biomatriz para inducir completamente la diferenciacion de las celulas. Los viriones maduros se produciran cuando las celulas maduren completamente. Mientras el virus en si no afecte la viabilidad celular, las celulas maduras infectadas con el virus pueden mantenerse durante al menos ocho semanas lo que ofrece un medio para generar grandes cantidades de virus con un sistema de cultivo estable.
Los andamios de biomatriz pueden usarse intactos, tales como, pero sin limitacion, para usarse en cultivos celulares 2-D y/o 3-D. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz pueden usarse en combinacion con un medio especffico para la diferenciacion en cultivos 2-D y/o 3-D para lfneas celulares, tales como, pero sin limitacion, celulas normales o enfermas de cualquier etapa de maduracion del linaje a partir de las celulas madre a celulas en etapa tardfa.
Alternativamente, los andamios de biomatriz pueden congelarse. Estas secciones congeladas pueden prepararse y utilizarse como sustratos. Los andamios de biomatriz pueden congelarse rapidamente en hielo seco y las secciones congeladas preparadas con un criostato, pueden colocarse sobre aparatos de cultivo (por ejemplo, placas, matraces, tela, transwells, etcetera), esterilizarse y rehidratarse en un medio antes de sembrar las celulas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz congelado de esta invencion puede seccionarse.
En algunas modalidades se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
En algunas modalidades se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invencion; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una seccion congelada del andamio de biomatriz de la etapa (b) como un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
En otras modalidades los andamios de biomatriz pueden triturarse hasta obtener un polvo. Un metodo de triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo comprende triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo en un molino con congelacion a temperaturas del nitrogeno lfquido, o cercanas a estas. En la tecnica se conocen otros aparatos para triturar a temperaturas del nitrogeno lfquido o equivalentes (por ejemplo, congelacion con hielo seco). El polvo puede llevarse a temperatura ambiente a la cual adquiere la consistencia de una pintura con la que se puede recubrir los aparatos de cultivo mediante el uso de un cepillo de pintura esterilizado o un aparato equivalente. El polvo o las placas pueden esterilizarse.
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Por lo tanto, en algunas modalidades se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invencion; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta obtener un polvo; c) recubrir un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con medio de cultivo celular en el aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular. En algunas modalidades de este metodo, la trituracion de la biomatriz puede llevarse a cabo en un molino con congelacion (por ejemplo, trituracion criogenica) a la temperatura del nitrogeno lfquido, o cercana a esta.
En algunas modalidades antes de sembrar las celulas para el cultivo celular, se anade una porcion del medio al aparato de cultivo ya que las celulas pueden unirse en segundos. Las celulas, en algunas modalidades, se unen en cuestion de segundos a minutos para las celulas adultas normales y en cuestion de minutos a algunas horas para diversos tipos de celulas madre. En algunas modalidades la fijacion de las celulas puede depender de como se dispersan los andamios de biomatriz para su uso en los cultivos. El medio celular puede ser cualquier medio que sea adecuado para producir un cultivo celular. En algunas modalidades, el medio de cultivo celular comprende al menos un constituyente presente en el fluido intersticial, en donde la osmolalidad de dicho medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, en donde dicho medio esta libre de suero y en donde el pH es neutro. En otras modalidades, el medio de cultivo celular puede ser un medio basal, tal como, pero sin limitacion, RPMI-1640, DME/F12, medio de Ham, medio de Kubota, etcetera.
Los cultivos celulares producidos con los andamios de biomatriz, en algunas modalidades, comprenden, consisten esencialmente, o consisten en el mismo tipo de celulas que las celulas del tejido biologico que se utilizo para fabricar el andamio de biomatriz. Los ejemplos no limitantes de las celulas de esta invencion incluyen celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS), celulas madre determinadas, celulas madre perinatales, celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC), celulas madre mesenquimales (MSC) de cualquier fuente, progenitores comprometidos o celulas adultas de cualquier tipo de tejido, celulas maduras, celulas normales, celulas enfermas, celulas tumorales y cualquier combinacion de estas. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen celulas hepaticas, celulas parenquimatosas, celulas estrelladas, celulas endoteliales, hepatocitos, colangiocitos, celulas del arbol biliar que no son colangiocitos y celulas pancreaticas.
En algunas modalidades, las celulas madre primitivas (ES, iPS, MSC o AFSC) restringiran el linaje de las celulas, al menos parcialmente, al tipo de tejido utilizado para fabricar el andamio de biomatriz. Las celulas madre determinadas de una capa germinal dada limitaran su linaje al tipo de tejido utilizado para obtener el andamio de biomatriz cuando el andamio se prepara a partir de un tejido derivado de esa capa germinal y pueden diferenciarse parcialmente al destino adulto si estan sobre un andamio a partir de un tejido derivado de una capa germinal diferente. Por lo tanto, la capacidad de las celulas adultas de diferenciarse completamente puede determinarse por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. Paralelamente, el destino de las celulas madre puede estar parcial o totalmente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz o el destino de las celulas madre puede estar completamente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. En algunas modalidades, las celulas del cultivo celular son de un tipo diferente que las celulas del tejido biologico utilizado para obtener el andamio de biomatriz. Como se describio con detalle anteriormente, los tipos celulares ilustrativos que pueden usarse en la produccion de un cultivo celular incluyen, pero sin limitacion, celulas madre embrionarias, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas madre mesenquimales, celulas madre derivadas de lfquido amniotico, celulas madre determinadas, celulas maduras, celulas normales, celulas enfermas, celulas tumorales y cualquier combinacion de estas. Estas celulas pueden ser de cualquier tejido biologico como se describe en la presente descripcion.
En algunas modalidades los andamios de biomatriz inducen un crecimiento lento o detencion del crecimiento correlacionado con la diferenciacion de las celulas normales, ya sean celulas madre o celulas maduras. Las celulas maduras, en algunas modalidades, se diferencian completamente en cuestion de horas y permanecen diferenciadas de manera estable durante al menos ocho semanas despues. En algunas modalidades, las celulas adultas (es decir, las celulas completamente maduras) se unen a los andamios en cuestion de minutos y mantienen su diferenciacion completa despues de eso por mas de ocho semanas. Las celulas madre, en algunas modalidades, sufren unas pocas divisiones y despues entran en detencion del crecimiento y se diferencian completamente. Las celulas madre permanecen estables en la detencion del crecimiento, viables y totalmente diferenciadas durante al menos ocho semanas. En algunas modalidades, las celulas madre sembradas sobre andamios de biomatriz entran en detencion del crecimiento o ralentizan el crecimiento, pierden los marcadores de celulas madre y se diferencian a celulas maduras funcionales en aproximadamente una semana, que retienen fenotipos estables y viabilidades durante al menos ocho semanas o mas (por ejemplo, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de viabilidad durante un perfodo de tiempo prolongado (por ejemplo, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas, al menos 11 semanas, al menos 12 semanas, al menos 13 semanas, al menos 14 semanas, al menos 15 semanas, al menos 16 semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos 11 meses, al menos un ano, etcetera).
En otras modalidades, el andamio de biomatriz se utiliza para diferenciar celulas madre embrionarias (ES) y/o inducir
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celulas madre pluripotente (IPS) a un destino especffico. Por ejemplo, en algunas modalidades se utiliza un andamio de biomatriz con especificidad tisular para facilitar la diferenciacion de celulas madre embrionarias o celulas pluripotentes inducidas hacia un destino especffico.
En determinadas modalidades de la presente invencion, el andamio de biomatriz se utiliza para diferenciar celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC) o celulas madre mesenquimales (MSC) de la medula osea o del tejido adiposo o de cualquier tejido fetal o postnatal o cualquier celula madre determinada (por ejemplo, de pulmon, intestino, arbol biliar, rinon, piel, corazon, etcetera) hacia un destino adulto especffico. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz de la presente invencion se usan para potenciar y acelerar la diferenciacion de celulas madre a celulas maduras mediante la produccion de un cultivo celular.
En otras modalidades, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar y/o acelerar la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras; el metodo comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los metodos de esta invencion, en donde las celulas son celulas madre y el medio de cultivo celular se formula para celulas maduras, para potenciar y/o acelerar de esta manera la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras. El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio que se formule para celulas maduras. Los constituyentes en el medio son distintos para cada tipo celular. La diferenciacion significa que las condiciones provocan que las celulas maduren a tipos celulares adultos que producen productos genicos especfficos de adultos. Las celulas empleadas en estos metodos pueden ser celulas adultas de cualquier tipo o celulas madre o progenitores, cuyos ejemplos no limitantes incluyen celulas madre embrionarias, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas madre de la capa germinal, celulas madre determinadas, celulas madre perinatales, celulas madre derivadas de lfquido amniotico, celulas madre mesenquimatosas, celulas amplificadoras de transito o progenitores comprometidos de cualquier tipo de tejido.
Las celulas sembradas en los andamios de biomatriz (por ejemplo, andamios de biomatriz intactos, secciones de andamios o andamios de biomatriz en polvo mezclados en/sobre otros materiales implantables) pueden trasplantarse a animales o seres humanos como un metodo de injerto de celulas in vivo. En algunas modalidades se proporciona un metodo para suministrar celulas a un sujeto, el metodo comprende poner en contacto al sujeto con el andamio de biomatriz de la presente invencion, en donde el andamio de biomatriz comprende las celulas. En otras modalidades se proporciona un metodo para suministrar celulas a un sujeto; el metodo comprende sembrar el andamio de biomatriz de la presente invencion con celulas y despues trasplantar el andamio de biomatriz sembrado con las celulas al sujeto. En algunas modalidades, un andamio de biomatriz que no se ha sembrado con ninguna celula puede trasplantarse a un sujeto.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz puede utilizarse como un injerto que puede usarse para regenerar el tejido u organo en el sujeto.
Los andamios de biomatriz de la presente invencion pueden utilizarse para establecer organos bioartificiales, que pueden ser utiles para programas analfticos y/o clfnicos. Los andamios de biomatriz pueden usarse, ademas, para identificar productos genicos especfficos o facetas de estados patologicos. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos de animales mutantes y posteriormente se usan para definir factor(es) relevante(s) asociado(s) con la(s) mutacion(es). En otras modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos patologicos y se usan para definir cambios en la matriz relevantes para la enfermedad.
Los ejemplos adicionales no limitantes de usos de los andamios de biomatriz de esta invencion incluyen: 1) uso del andamio para cultivar celulas malignas para definir su potencial metastasico (la capacidad de las celulas tumorales para formar colonias crecientes de celulas en un tipo dado de andamio de biomatriz es predictiva de la capacidad de las celulas para hacer metastasis al tejido del que se preparo ese andamio; 2) colocar injertos de tejido en el andamio para utilizarse para el trasplante en un sujeto); 3) produccion de organoides formados por recelularizacion de andamios para utilizarse como dispositivos auxiliares, tales como, por ejemplo, un organoide hepatico que despues se conecta a un sujeto con insuficiencia hepatica; 4) el uso del andamio para la produccion de protefnas (las celulas en el andamio producen un factor que puede aislarse del medio y/o de las celulas y despues purificarse, y 5) el uso del andamio para la produccion de virus dependientes del linaje; por ejemplo, para la produccion de virus que requieren celulas diferenciadas para producir partfculas suficientes para su uso como vacuna.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para identificar el potencial metastasico de celulas tumorales en un tipo de tejido, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de celulas tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las celulas tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, lo que identifica de esta manera el potencial metastasico de las celulas tumorales en el tipo de tejido.
En la presente descripcion se proporciona, ademas, un metodo para identificar una celula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos
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de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de celulas tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las celulas tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, lo que identifica de esta manera el potencial metastasico de las celulas tumorales en el tipo de tejido.
En la presente descripcion se proporciona, ademas, un metodo para identificar una celula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las celulas tumorales en el andamio de biomatriz; y f) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la falta de crecimiento de las celulas tumorales y/o la muerte de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica las celulas tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral. Los ejemplos no limitantes de tratamiento antitumoral incluyen agentes quimioterapeuticos, anticuerpos, terapia de radiacion, inmunoterapia, terapia hormonal, etcetera, como se conoce bien en la tecnica. En algunas modalidades, las celulas tumorales de un sujeto pueden sembrarse en diferentes andamios de biomatriz de esta invencion y exponerse a tratamientos antitumorales respectivos. De acuerdo con los resultados de estos respectivos analisis de diferentes tratamientos antitumorales, se puede seleccionar un tratamiento antitumoral que sea eficaz contra las celulas tumorales del sujeto y el tratamiento antitumoral que pueda administrarse al sujeto para tratar el tumor del sujeto.
En otras modalidades, la presente invencion proporciona un metodo para producir un injerto tumoral para el trasplante a un animal huesped; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) establecer una poblacion de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), para producir de esta manera un injerto tumoral para el trasplante al animal huesped. En diversas modalidades, el injerto tumoral puede ser singenico, alogenico o xenogenico con respecto al animal huesped.
En la presente descripcion se proporciona, ademas, un metodo para producir partfculas virales de un virus dependiente del linaje; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas de un tipo y una etapa de linaje, que pueden infectarse.
Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para producir un organoide formado por recelularizacion de un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas del mismo tipo tisular que el tejido biologico usado para preparar el andamio de biomatriz; y d) mantener las celulas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, con lo que se forman organoides a partir de las celulas, para producir de esta manera un organoide formado por recelularizacion del andamio de biomatriz. Este metodo puede comprender ademas la etapa de poner en contacto el organoide producido por las etapas (a) a (d) con un sujeto, para usar como un dispositivo auxiliar, como se conoce en la tecnica. Cualquier tipo de celula que pueda usarse para producir el andamio de biomatriz de esta invencion puede usarse en este metodo. En algunas modalidades, las celulas son celulas hepaticas.
La presente invencion proporciona adicionalmente un metodo para producir una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas que producen la protefna de interes; d) mantener las celulas de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y e) recolectar la protefna de interes producida por las celulas de (d), para producir de esta manera una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz. Este metodo puede comprender la etapa adicional de purificar la protefna de interes recolectada en la etapa (f). La protefna de interes de esta invencion puede ser cualquier protefna producida por una celula, ya sea a partir de un gen endogeno y/o como una protefna recombinante, en una cantidad que pueda recolectarse de las celulas en cultivo y/o el medio de cultivo. Numerosos ejemplos de tales protefnas de interes se conocen en la tecnica.
La presente invencion se explica con mas detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. La restriccion del linaje de celulas madre hepaticas humanas a los destinos maduros se vuelve eficiente mediante andamios de biomatriz con especificidad tisular.
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Resumen. Los protocolos actuales para la diferenciacion de celulas madre hacen uso de multiples tratamientos de senales solubles y/o factores de la matriz y producen tipicamente la diferenciacion parcial a celulas maduras con subexpresion o sobreexpresion de genes espedficos de tejidos adultos. En la presente invencion, se desarrollo una estrategia para la diferenciacion rapida y eficaz de celulas madre mediante el uso de sustratos de andamios de biomatriz, extractos espedficos de tejidos enriquecidos en matriz extracelular y factores de crecimiento y citocinas asociados, en combinacion con un medio hormonalmente definido y libre en suero (HDM) adaptado para el tipo de celulas adultas de interes. Los estudios descritos en la presente demuestran la eficacia de los andamios de biomatriz de esta invencion en la diferenciacion de celulas madre hepaticas humanas (hHpSC) a destinos maduros y en el mantenimiento de celulas parenquimatosas maduras como completamente funcionales durante largos penodos de tiempo. Los andamios de biomatriz se prepararon por un novedoso protocolo de descelularizacion de cuatro etapas mediante el uso de condiciones disenadas para mantener insolubles a todos los tipos de colageno. Los andamios mantuvieron la histologfa nativa, vasculatura evidente y aproximadamente el 1 % de las protemas tisulares, pero > 95 % de sus colagenos, la mayor parte de los componentes de la matriz asociados al colageno del tejido y los niveles fisiologicos de factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz. Los colagenos aumentaron de niveles casi indetectables a > 15 % de las protemas del andamio con el resto que incluye lamininas, fibronectinas, elastina, nidogeno/entactina, proteoglicanos y citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz en patrones correlacionados con la histologfa. Las celulas madre hepaticas humanas (hHpSC), sembradas en los andamios de biomatriz hepatica y en un HDM adaptado para celulas hepaticas adultas, perdieron los marcadores de celulas madre y se diferenciaron a celulas parenquimatosas maduras y funcionales en aproximadamente una semana, permaneciendo viables y con fenotipos de celulas maduras estables para mas de ocho semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de esta invencion pueden usarse para estudios biologicos y farmaceuticos de celulas madre restringidas al linaje, para el mantenimiento de celulas maduras y para tejidos u organos modificados, vascularizados e implantables.
Procedimientos para la descelularizacion. Despues de la anestesia con ketamina y xilacina, se abrio la cavidad abdominal de la rata y se inserto un manguito con una canula en la vena porta para perfundir todo el hngado. (1) La perfusion se realiza con RPMI 1640 durante 10 minutos; seguido de (2) deslipidacion con una lipasa (por ejemplo, 20-50 unidades de fosfolipasa A2--PLA2) combinada con un detergente suave tal como desoxicolato sodico al 1 % (SDC) durante aproximadamente 30-60 minutos hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusion se vuelve clara; (3) la perfusion con lavados con alto contenido de sal (para dgados fetales: 4,5 M de NaCl y para hngados adultos 3,4 M-3,5 M de NaCl) se realiza hasta que el perfusado sea negativo para protemas segun la densidad optica (DO) a 280 nm; (4) perfusion con nucleasas (DNAasa, RNAasa) en RPMI 1640 hasta que el perfusado sea negativo para acidos nucleicos segun DO 260; y (5) enjuague final con RPMI 1640 durante 2 horas o mas.
Los andamios de biomatriz se congelan rapidamente en hielo seco y se preparan secciones congeladas con un criostato, se colocan en placas de cultivo celular de 24 pocillos, se esterilizan por irradiacion gamma (5000 rads) y se rehidratan en medio (KM) durante 30 minutos antes de sembrar las celulas. Las secciones de andamios de biomatriz cubrieron ~ 95 % de la superficie de los pocillos en la placa de 24 pocillos.
Un metodo alternativo para distribuir los andamios de biomatriz en las placas de cultivo consistio en pulverizarlo hasta obtener un polvo mediante el uso de un molino con congelacion lleno con nitrogeno lfquido. El polvo pulverizado, cuando se lleva a temperatura ambiente, adquiere la consistencia de una pintura, y con el puede recubrirse cualquier superficie, tal como placas, portaobjetos, tela, filtros u otras superficies utilizadas para unir celulas y/o cultivo de celulas. La pulverizacion de los andamios elimina los gradientes de los componentes y las senales de la matriz, pero la mezcla de componentes presentes todavfa produce potentes efectos de diferenciacion. Los andamios pueden usarse ademas intactos y volver a sembrarse con celulas en la preparacion de organos modificados para el trasplante in vivo o para cultivos 3-D.
Se desarrollaron metodos alternativos para usar con fngados porcinos y bovinos. Los fngados de cerdo y bovino se obtuvieron de una instalacion de procesamiento de carne certificada por el USDA (CT). Ver el Ejemplo 3 para un esquema de un protocolo representativo. Cada dgado se inspecciono por USDA y recibio el sello USDA antes de salir de la instalacion. Los hfgados se transportaron en medio ESP-Gro (Gigacyte, Branford, CT, num. de catalogo 1101-250). Los hfgados recibidos en el laboratorio se pesaron, se fotografiaron y se prepararon para la perfusion. Despues de triturar, la mezcla se descongelo y se diluyo a una relacion de medio:biomatriz de 1:48. Esta suspension de biomatriz se uso despues para recubrir las placas. Despues de secar, la biomatriz se lavo tres veces y despues se aplicaron las celulas. Las celulas hepaticas adultas se unieron en 10 minutos a las placas. Las celulas madre/progenitores pueden tomar mas tiempo (unas pocas horas). Sin embargo, tanto para las celulas madre/progenitores como las celulas hepaticas adultas, esencialmente el 100 % de las celulas viables se adhieren.
Medios y soluciones. Todos los medios se filtraron de manera esteril (filtro de 0,22 pm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes de su uso. Para mantener los colagenos estables en la biomatriz, el pH del medio de perfusion para la preparacion de los andamios de biomatriz se mantuvo a 7,5 - 8,0. Se utilizo RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) como medio basal para la preparacion de los andamios de biomatriz y para los cultivos de hepatocitos o celulas madre hepaticas. Todos los reactivos excepto los indicados se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
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Medios de perfusion para la preparacion de andamios de biomatriz.
(1) . Lavado por perfusion y enjuague por perfusion: medio basal libre de suero (por ejemplo, RPMI-1640);
(2) . Perfusion con detergente: 36 unidades/l de PLA2 mas 1 % de SDC;
(3) . Perfusion con alto contenido de sal: NaCl 3,4 M con inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml;
(4) . Perfusion con nucleasas: RNAasa a 5 mg/100 ml, DNAasa a 1 mg/100 ml e inhibidor de la tripsina de soja a 0,1 mg/ml (por ejemplo, preparado en RPMI 1640).
Medio de Kubota. El KM se diseno originalmente para hepatoblastos47 y ahora se ha encontrado que es eficaz para los progenitores hepaticos humanos48 y para otros progenitores endodermicos, que incluyen los del arbol biliar (Wang y otros, "Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic islets" Hepatology, 2011, en prensa) y el pancreas (Wang, Y y Reid L, datos no publicados). Consiste en cualquier medio basal (en este caso RPMI 1640) sin cobre, bajo contenido de calcio (0,3 mM), selenio 10-9 M, 0,1 % de BSA, nicotinamida 4,5 mM, sulfato de zinc heptahidrato 0,1 nM (de Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston, Inglaterra), hidrocortisona 10 - 8 M, transferrina/Fe 5 pg/ml, insulina 5 pg/ml, lipoprotefna de alta densidad a 10 pg/ml y una mezcla de acidos grasos libres que se anaden unidos a la albumina serica humana purificada.
Para diferenciar las celulas a un destino adulto, puede utilizarse un medio hormonalmente definido, libre de suero (HDM) adaptado al tipo deseado de celulas adultas. Por ejemplo, se utilizo un HDM para el destino hepatico adulto que consistfa en KM suplementado adicionalmente con calcio para alcanzar una concentracion de 0,6 mM, cobre 1012 M, triyodotironina (T3) 1 nM, glucagon 7 ng/ml, FGF 20 ng/ml, galactosa 2 g/l, oncostatina M (OSM) 10 ng/ml, factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 20 ng/ml e hidrocortisona 10-8 M.
Las celulas se sembraron en este HDM libre de suero en caso de sembrarse en los andamios; en circunstancias en las que se usaron enzimas para procesar las celulas o los tejidos, entonces el HDM se suplemento con FBS al 5 % (HyClone, Waltham, MA) durante unas pocas horas y despues se cambio a HDM libre de suero a continuacion. En paralelo, los experimentos de control, los cultivos se mantuvieron en el HDM con 5 % de FBS en todo el estudio, pero se encontro que la presencia de suero provoco que las celulas perdieran funciones diferenciadas con el tiempo. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores estan unidos a los andamios de biomatriz. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores estan unidos a los andamios de biomatriz.
Caracterizacion de arboles vasculares intactos en los andamios de biomatriz hepatica. Los restos en la matriz de la ramificacion y derivacion de la vasculatura que incluyen la red de capilares en el andamio de biomatriz hepatica de rata se han visualizado por microscopfa optica y de fluorescencia, respectivamente. Se inyectaron partfculas de dextrano de 250 kDa marcadas con rodamina en el andamio de biomatriz hepatica a traves del resto de la vena porta para comprobar la integridad de los restos del sistema vascular en la matriz en los andamios de biomatriz. Se preparo una pelfcula mediante el uso de un microscopio de diseccion de fluorescencia Leica MZ16FA (motorizado).
Procesamiento del hfgado fetal humano. Los tejidos hepaticos fetales se proporcionaron por una agencia acreditada (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) de fetos entre 16-20 semanas de edad gestacional obtenidos por interrupciones electivas del embarazo. El protocolo de investigacion se reviso y aprobo por la Junta de Revision Institucional para Estudios de Investigacion en Humanos en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se prepararon suspensiones de celulas hepaticas humanas fetales como se describio anteriormente48,49. Brevemente, el procesamiento se llevo a cabo en RPMI 1640 suplementado con albumina de suero bovino al 0,1 %, selenio 1 nM y antibioticos. El tampon de procesamiento enzimatico contenfa colagenasa tipo IV a 300 U/ml y desoxirribonucleasa a 0,3 mg/ml a 32 °C con agitacion frecuente durante 15-20 min. Las suspensiones enriquecidas se presionaron a traves de una malla de calibre 75 y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos antes de la resuspension. La viabilidad celular estimada por exclusion de azul de tripan fue habitualmente superior al 95 %.
Enriquecimiento de hHpSC y cultivo en andamios de biomatriz. Se utilizaron dos metodos para la purificacion o enriquecimiento de hHpSC:
1) Seleccion de cultivos. Se sembraron aproximadamente 3 x 105 celulas en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y en KM. El medio se cambio cada 3 dfas. Las colonias se formaron en cuestion de 5-7 dfas y se observaron durante y hasta 3 meses. Las colonias Se recolectaron manualmente despues de 14-18 dfas mediante el uso de un microscopio invertido (1X-FLAIII, Olympus, Japon y Melville, NY).
2) La inmunoseleccion magnetica de subpoblaciones progenitoras hepaticas multipotentes (hHpSC y hHB) se logro mediante la seleccion de celulas positivas para la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM, CD326) mediante el uso de tecnologfas de inmunoseleccion de perlas magneticas con el sistema MACS de Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania) segun las instrucciones del fabricante50. En resumen, las celulas disociadas se incubaron con anticuerpo para EpCAM unido a microperlas magneticas durante 30 min a 4 °C, y se separaron mediante el uso de un sistema de separacion en columna magnetica de Miltenyi segun los procedimientos recomendados por el fabricante.
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Los cultivos se sembraron con 250 colonias de hHpSC, o 5 * 105 hHpSC enriquecidas o 2,5 * 105 hepatocitos adultos primarios. El medio se reemplazo diariamente y el medio recolectado se almaceno a -20 °C para un analisis posterior. Las celulas cultivadas en placas de 24 pocillos recubiertas con Colageno tipo I sirvieron como control.
Aislamiento de hepatocitos adultos de rata. Las suspensiones recien aisladas de hepatocitos de rata se obtuvieron a partir de ratas Lewis macho adultas de 3 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que pesaban 200-250 g. Se utilizo un metodo mejorado de perfusion en dos etapas como se describio anteriormente49 para el aislamiento y purificacion de los hepatocitos de rata. El hfgado se perfundio durante 10-15 minutos con un tampon libre de calcio que contenfa EGTA y despues colagenasa en un tampon que contenfa calcio durante 10-15 minutos. Despues el hfgado se disocio mecanicamente presionando el hfgado digerido a traves de una tela de queso y despues se filtro secuencialmente la suspension celular a traves de tamices con tamano de la malla cada vez menores. Las celulas se lavaron dos veces y despues se sedimentaron a 50 g. La viabilidad se definio mediante el conteo de las celulas despues de la tincion con azul de tripan. Rutinariamente, se aislaron 200-300 millones de celulas por rata con una viabilidad del 89-96 % y una pureza > 99 %.
Aislamiento y cultivo de celulas hepaticas adultas humanas. Las suspensiones de celulas hepaticas humanas frescas se obtuvieron de CellzDirect. (ahora una parte de Invitrogen, rTp, NC). Las suspensiones se procesaron mediante metodos de CellzDirect y despues se resuspendieron en medio HeptoMAIN (num. de catalogo 1103-250; GigaCyte, Branford, CT), se sembraron a 1,88 x 105 celulas/cm2 en placas de multiples pocillos recubiertas con andamios de biomatriz hepatica o sobre colageno tipo I (1 pg/ml, Meridian num. de catalogo A33704H).
Analisis de la qufmica del colageno. La cantidad de colageno en los andamios de biomatriz se evaluo en base al contenido de hidroxiprolina (hyp). Las muestras de hfgados enteros y de andamios de biomatriz se pulverizaron, lavaron y liofilizaron. Las alfcuotas se hidrolizaron despues y se sometieron a analisis de aminoacidos51, y el contenido de colageno por protefna total se estimo sobre la base del valor de hyp de 300 residuos/colageno.
Analisis cuantitativo del contenido de ADN y ARN. Para evaluar el ADN total que permanecfa en la biomatriz hepatica descelularizada, tanto el tejido hepatico fresco de rata como la biomatriz descelularizada se pesaron, cortaron y digirieron con proteinasa K y se aislo el ADN celular total52. Para evaluar el ARN total que permanecfa en la biomatriz hepatica descelularizada, tanto el tejido hepatico fresco de rata como la biomatriz hepatica descelularizada de rata se pesaron y despues se homogeneizaron en solucion de TRIzol (Invitrogen), y se aislo el ARN celular total.
Ensayos de factores de crecimiento. Las muestras de hfgados de rata, andamios de biomatriz hepatica de rata, tejido del conducto biliar humano y andamios de biomatriz de conducto biliar humano (dos muestras de cada uno) se enviaron a RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia) para el analisis de los factores de crecimiento. Las muestras se homogeneizaron, se prepararon como lisados y despues se sometieron a ensayo con 1 mg/ml de protefna, que produce fluorescencia, definida en unidades de intensidad fluorescente (FIU). Los ensayos semicuantitativos de factores de crecimiento se realizaron mediante el uso de los Arreglos para Factores de Crecimiento Humanos RayBio®, Serie G 1. Las FIU se redujeron con respecto a la de los controles negativos en cuanto a la union no especffica y se normalizaron con respecto a la concentracion de protefnas. Los datos de los duplicados se promediaron. Se utilizaron cuatro arreglos que permitieron el estudio de ~ 40 factores de crecimiento. Aunque el ensayo se desarrollo para factores de crecimiento humanos, hay suficiente solapamiento en reaccion cruzada con los factores de crecimiento de rata para permitir el uso tanto de muestras de rata como humanas.
Microscopfa electronica de transmision y barrido (TEM y SEM). Para TEM, los andamios de biomatriz se enjuagaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en glutaraldehfdo al 3 %/cacodilato sodico 0,1, pH 7,4 durante la noche. Despues de tres lavados con tampon de cacodilato sodico, los andamios de biomatriz se fijaron posteriormente durante 1 hora en tampon de tetroxido de osmio al 1 %/cacodilato sodico 0,1. Despues de enjuagar en agua desionizada, se deshidrato y se embebio en resina epoxica Polybed 812 (Polysciences, Niles, IL). Los andamios de biomatriz se cortaron perpendicular al sustrato a 70 nm mediante el uso de una cuchilla de diamante. Las secciones ultrafinas se recogieron en rejillas de cobre con malla 200 y se tineron con acetato de uranilo acuoso al 4 % durante 15 minutos, seguido por citrato de plomo de Reynolds durante 7 minutos. Las muestras se visualizaron mediante el uso de un microscopio electronico de transmision LEO EM910 que funciona a 80 kV (LEO Electron Microscopy, Oberkochen, Alemania). Las imagenes digitales se adquirieron mediante el uso de una camara digital CCD SC1000 Orius de Gatan y Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan, Pleasanton, CA).
Para SEM, despues de la fijacion y los enjuagues, los andamios de biomatriz se deshidrataron y se transfirieron en etanol al 100 % al secador de punto crftico CPD -020 Balzers (Bal-Tec AG, Balzers, Suiza) y se secaron mediante el uso de dioxido de carbono como disolvente de transicion. La matriz se monto sobre soportes de muestra de aluminio con lenguetas adhesivas de carbono y se recubrio con un espesor de 10 nm de metal oro-paladio (aleacion 60:40) mediante el uso de un recubridor por pulverizacion Hummer X (Anatech, Worcester MA). Las muestras se examinaron mediante el uso de un Zeiss Supra 55 FESEM a un voltaje de aceleracion de 5 kV y se adquirieron imagenes digitales mediante el uso del programa informatico SmartSEM de Zeiss (Carl Zeiss SMT, Alemania y Thornwood, NY).
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Inmunocitoqufmica e inmunohistologfa. Para la tincion fluorescente de las celulas cultivadas en los andamios de biomatriz, las celulas se fijaron con paraformaldehfdo al 4 % (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con HBSS, se bloquearon con suero de cabra al 10 % en HBSS durante 2 h y se enjuagaron. Las celulas fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, se lavaron, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios especfficos del isotipo y marcados, se lavaron, se contratineron con 4',6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) para visualizar los nucleos celulares y se observaron mediante el uso de un microscopio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX).
Para la inmunohistoqufmica, los andamios de biomatriz se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 %. Se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 5 pm. Las secciones se desparafinaron, y los antfgenos se recuperaron. Las peroxidasas endogenas se bloquearon por incubacion durante 30 minutos en una solucion de H2O2 al 0,3 %. Despues de bloquear con suero de caballo al 10 %, se aplico el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche; el anticuerpo secundario y la tincion ABC se realizaron mediante el uso del kit RTU Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El vector Nova RED se uso como sustrato. Las secciones se deshidrataron, fijaron y embebieron en medio de montaje Eukitt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y se analizaron mediante el uso de un microscopio invertido. Los anticuerpos utilizados para las secciones de hfgado y para los cultivos se enumeran en la Tabla 4.
Analisis por reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR). Las hHpSC se cultivaron en placas de cultivo celular, y las colonias se transfirieron sobre un andamio de biomatriz. Despues de otro cultivo durante 7 dfas, las colonias se lisaron para RT-PCR. El ARN total se extrajo mediante el uso de un Mini kit RNeasy Plus (Qiagen GmbH, Valencia, CA) segun las instrucciones del fabricante. La transcripcion inversa se llevo a cabo con el sistema de sfntesis de primera cadena SuperScript para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se utilizo el Kit Master Mix HotStarTaq (Qiagen) para la PCR. Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 5.
Ensayo LIVE/DEAD y ensayo de viabilidad celular. Se utilizo un kit para el ensayo de viabilidad LIVE/DEAD (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) para los ensayos de adhesion y proliferacion. Las hHpSC o los hepatocitos se incubaron con dos sondas, calcefna-AM (Live, gris claro) y homodfmero-1 de etidio (EtdD-1, Dead), para la actividad de esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmatica, respectivamente. Los especfmenes se observaron bajo un estereoscopio de fluorescencia Olympus SZX12 (OLYMPUS, Japon y Melville, NY). Se utilizo un kit para el ensayo de viabilidad celular de resazurina (Biotium, Hayward, CA) segun el manual del fabricante. Brevemente, se anadio 10 % de solucion de resazurina al medio de cultivo y se incubo a 37 °C durante la noche. La absorbancia OD570-OD600 se obtuvo mediante el uso de un lector de microplacas con deteccion multiple Biotek Synergy HT (Winooski, VT) y se obtuvo la curva de viabilidad. Todos los experimentos se realizaron tres veces mediante el uso de un mfnimo de tres muestras por condicion experimental.
Ensayos funcionales especfficos hepaticos. La actividad de CYP450 3A4 se detecto mediante el uso de un sistema de tamizaje P450-GloTM™ (Promega, Madison, WI). Brevemente, las celulas cultivadas se incubaron con medio que contenfa el sustrato luminogenico CYP3A4, luciferina-PPXE para CYP, durante 4 horas a 37 °C. La deteccion y analisis de luciferina se realizo segun las instrucciones del fabricante con un contador Wallace Victor2 Multilabel (ahora parte de Perkins/Elmer en Waltham, MA). La cuantificacion de la secrecion de albumina se realizo mediante el uso de un kit de cuantificacion de ELISA para albumina humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Para los ensayos de sfntesis de urea, las celulas se incubaron con amonio 2 mM durante 24 horas y el sobrenadante se recogio y se ensayo con el kit de ensayo para urea Quantichrom (Bioessay Systems, Hayward, CA). El sobrenadante de una muestra para cada condicion de cultivo se ensayo por triplicado y el experimento se repitio 3 veces.
Analisis estadfstico. Los experimentos se repitieron al menos 2-3 veces con muestras duplicadas o triplicadas para cada condicion. Se presentan datos de experimentos representativos, mientras que se observaron tendencias similares en los multiples ensayos. Todas las barras de error representan la S.E.M.
Los andamios de biomatriz se prepararon con un novedoso protocolo de cuatro etapas. Los andamios de biomatriz se prepararon mediante el uso de un protocolo que comprende la deslipidacion seguida por extracciones con alto contenido de sal y mediante el uso de metodos de perfusion (Figura 1). Una presentacion detallada del protocolo se proporciona en los metodos. Esto se logra mediante un novedoso protocolo de cuatro etapas: 1) deslipidacion suave; 2) lavados con tampones con concentraciones de sal de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M (por ejemplo, 2,0 M - 2,5 M, 2,6 M - 3,0 M, 3,1 M - 3,5 M, 3,6 M - 4,0 M, 4,1 M - 4,5 M, 4,6 M - 5,0 M), concentraciones de sal que se conoce que mantienen los colagenos en un estado insoluble23 (la concentracion exacta y el pH de los tampones esta dictada por los tipos de colageno en el tejido), concentraciones que se conoce que mantienen los colagenos en un estado insoluble23; 3) tratamiento con nucleasa para eliminar acidos nucleicos residuales; y 4) enjuagues con un medio basal para eliminar los residuos de detergente, sales y nucleasas, asf como para equilibrar los componentes de la matriz con el medio (Figura 1A).
Las elecciones de los medios de enjuague o de los tampones para las nucleasas pueden ser cualquiera de un numero de opciones siempre y cuando la concentracion de sal y la fuerza ionica sean tales que mantengan los componentes de la matriz en un estado insoluble. En la eleccion del metodo de deslipidacion es fundamental que
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sea eficaz y sin embargo suave. Se selecciono una combinacion de desoxicolato sodico (SDC) y Fosfolipasa A2 (PLA2) para degradar rapidamente el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensioactivo, que puede inducir necrosis y citolisis. La formula reactiva se muestra en la Figura 8. Evitamos los detergentes duros, como el dodecilsulfato sodico (SDS) o el Triton-X 100, que podrfa disolver algunos componentes de la matriz como los glicosaminoglicanos (Ver la resena de Gilbert y otros, "Decellularization of tissues and organs" Biomaterials 27:3675-3683 (2006)).
Evitamos una exposicion prolongada de los andamios a las enzimas de las celulas lisadas durante la deslipidacion y los lavados con alto contenido de sal, porque pueden disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos (GAG) tales como sulfatos de heparan (HS), sulfatos de condroitina (CS), sulfatos de dermatan (DS) y heparinas (HP), que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento24. Se utilizo un inhibidor de la tripsina de soja y un control cuidadoso del pH (7,5 - 8,0), la temperatura (20 °C) y el tiempo (30-60 min) para limitar la actividad de las proteasas derivadas de las celulas lisadas.
Se perfundio todo el tejido a traves de la vasculatura relevante (por ejemplo, la vena porta en el hfgado), lo que permitio aislar rapidamente (en pocas horas) un andamio de biomatriz con perdida minima de los componentes de la matriz. La rapidez del aislamiento se debe a la etapa inicial con detergente que deslipida el tejido en aproximadamente 30-60 minutos (no horas o dias como en los protocolos utilizados por otros). Los andamios de biomatriz resultantes son translucidos o blancos (Figura 1). Ademas, mediante el uso de este metodo de perfusion, se mantuvieron los canales de la vasculatura primaria, vena porta y hepatica y la mayor parte de las ramas vasculares en el hfgado, lo que aumento la eficacia de la descelularizacion. Las particulas fluorescentes de dextrano marcadas con rodamina perfundidas a traves de los andamios de biomatriz permanecieron dentro de los restos de la vasculatura lo que demuestra su presencia (Figura 1E) Existe un flujo progresivo del colorante de los vasos grandes a las ramas finas de los vasos sanguineos a lo largo de los canales sin fugas. Este hecho sera util en la revascularizacion de los andamios como un medio para preparar los tejidos modificados para el cultivo tridimensional y/o para la implantacion ex vivo.
Cuando se cortan, los andamios retienen la estructura histologica del tejido original, que incluye los restos reconocibles de las entidades histologicas principales tales como los vasos sanguineos, los conductos biliares y la capsula de Glisson (GC) (Figura 1). Comparar las Figuras 1B1 y 1D1, en donde una seccion del tejido hepatico se contrasta con la de un andamio de biomatriz. Los restos de matriz de la muralia de celulas parenquimatosas consistieron en una red tipo encaje (Figura 1D2-1D3).
El colageno, las protefnas asociadas al colageno y las citocinas unidas se mantienen en los andamios de biomatriz. La cantidad de colageno en los andamios de biomatriz se evaluo mediante el analisis de aminoacidos por metodos utilizados previamente25. Dado que la hidroxiprolina (Hyp) es unica para los colagenos y las protefnas colagenas, la composicion de colageno en relacion con la protefna total se expreso como residuos de Hyp por cada 1000 aminoacidos. Los resultados demostraron que el contenido de colageno aumento desde niveles casi indetectables, es decir, menos de 0,2 residuos de hidroxiprolina (Hyp)/1000 en el hfgado, a ~ 13 residuos de Hyp/1000 en los andamios de biomatriz. Esto indica que la deslipidacion y los lavados con alto contenido de sal, descritos anteriormente, no eliminaron los colagenos, dejando casi todos los colagenos en los andamios de biomatriz. La deteccion de niveles significativos de hidroxilisina (Hyl), otro aminoacido asociado al colageno y niveles mas altos de glicina (Gly) en los andamios de biomatriz apoya nuestra conclusion de que el colageno se enriquece marcadamente en los andamios de biomatriz (Figuras 2A, 9 y Tabla 2).
Mediante los estudios inmunohistoqufmicos y ultraestructurales, pudimos identificar en los andamios todas las formas conocidas de los colagenos encontrados en el hfgado in situ, que incluyen colagenos fibrilares (colageno tipo I, III y V, 10-30 nm de diametro para las fibrillas y 500-3000 nm para fibras ensambladas) y filamentos en cuentas (posiblemente tipo VI). Esas fibras y filamentos estan presentes en la capa de tejido conectivo subcapsular situada debajo de la capa mesotelial. Aunque las estructuras tfpicas de las membranas basales no se encontraron a lo largo de los sinusoides desde las trfadas portales a las venas centrales, encontramos que el colageno tipo IV y algunas pequenas fibrillas unidas forman estructuras reticulares tridimensionales porosas, semejantes a redes, que sirven de andamio para las celulas parenquimatosas (Figura 2). Los haces de colageno tipo I pueden observarse como la estructura principal de los andamios a los que se unen otros tipos de colageno, glicoprotefnas y proteoglicanos. En el espacio de Disse encontramos pequenos haces de colageno tipo I y fibras de colageno tipo III y VI asf como algun tipo V, el cual es mas abundante cerca de las trfadas portales y venas centrales. Los datos representativos de inmunohistoqufmica se presentan en la Figura 3B, y un resumen de los componentes de la matriz y su ubicacion en el tejido hepatico normal frente a los de los andamios de biomatriz se enumeran en la Figura 4d. Los primeros estudios en el desarrollo de los protocolos para la preparacion de andamios de biomatriz indicaron que la mayor parte de los componentes del citoesqueleto se pierden en los lavados. Sin embargo, evaluamos los andamios mediante inmunohistoqufmica y no encontramos evidencia de tubulina, desmina o actina, cantidades traza de citoqueratinas 18 y 19, y bajos niveles de vimentina dispersos a lo largo de los andamios.
La matriz asociada con los conductos biliares y las porciones de los sistemas vasculares hepaticos (vasos arteriales y venosos) consiste en estructuras tfpicas de la membrana basal y por lo tanto es bastante distintiva de las capas delgadas de la matriz asociada con las estructuras vasculares encontradas en los sinusoides. En la trfada portal se
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encuentra laminina, entactina/nidogeno, perlecan y colageno tipo IV, mientras que en el Espacio de Disse solo se encuentra perlecan y algo de colageno tipo IV. Estan presentes cantidades enormes de elastina ondulada e hidrofoba; esta se reticula y forma laminas y fibras restringidas principalmente al tejido conectivo subcapsular, regiones portales y paredes arteriales. Las fibronectinas son ubicuas y prevalecen en toda la matriz hepatica y son especialmente abundantes en el espacio de Disse, donde forman filamentos finos o depositos granulares (Figuras 2 y 3).
La inmunohistoqufmica indica que los proteoglicanos conocidos en el tejido se conservan en los andamios de biomatriz (Figuras 3B, 4D). Entre los proteoglicanos heterogeneos identificados, el sindecano se encontro intercalado y de manera continua a lo largo de los sinusoides, y el perlecan es mas puntual en el espacio de Disse. Las formas de HS-PG y CS-PG se encuentran a lo largo de los restos de los sinusoides en los andamios de biomatriz y en patrones que se correlacionan con la zonacion conocida del tejido hepatico.
Los proteoglicanos y otros componentes de la matriz son depositos importantes para citocinas y factores de crecimiento que se unen estrechamente a sus GAG26. La mayorfa de los factores de crecimiento y las hormonas se encuentran en los andamios de biomatriz en concentraciones cercanas a las encontradas en el tejido original. En la Tabla 6 se proporcionan los datos de los lisados de hfgados de rata frente a los andamios de biomatriz hepatica de rata, y en la Tabla 3, se proporcionan datos paralelos de tejido de conducto biliar humano frente a andamios de biomatriz de conducto biliar. Curiosamente, hubo algunos ejemplos (por ejemplo, bFGF) con un fuerte enriquecimiento en los andamios de biomatriz hepatica sobre el que se encontro en los lisados hepaticos. Los factores de crecimiento y las citocinas unidas tienen diferencias cualitativas y cuantitativas entre los andamios de tejido hepatico con respecto a los de conducto biliar, lo que implica especificidad tisular o especificidad de especie. Alternativamente, puede deberse, en parte, al hecho de que los andamios de conductos biliares se prepararon, por necesidad, mediante agitacion del tejido en los tampones sobre un balancfn y no mediante perfusion a traves de la vasculatura.
La qufmica de los andamios de biomatriz se correlaciona con la histologfa. Una caracterfstica importante de este nuevo protocolo es la retencion de la qufmica de la matriz en los patrones que se correlacionan con las zonas acinares hepaticas 1-3 de la trfada portal a la vena central y con entidades histologicas como los canales vasculares y la Capsula de Glisson (GC) como se muestra en las Figuras 4A-C. La qufmica de la matriz periportalmente en la zona 1 es similar a la encontrada en los hfgados fetales y consiste, en parte, en colageno tipo III, laminina y formas de CS-PG. Esta transita a una qufmica diferente de la matriz en las zonas medio acinar (zona 2) y pericentral (zona
3) que termina con una matriz muy estable con altos niveles de colageno tipo IV y HP-PG27.
Se sabe que una gran variedad de protefnas (por ejemplo, factores de crecimiento y hormonas, protefnas de coagulacion, diversas enzimas) se unen a la matriz y se mantienen establemente mediante la union a los patrones de sulfatacion discretos y especfficos en los GAG u otros componentes de la matriz24. Por lo tanto, la qufmica de la matriz transita desde su punto de inicio en el nicho de celulas madre que tiene una qufmica de matriz labil asociada con alta tasa de recambio y minima sulfatacion a una qufmica de matriz estable y que tiene cantidades crecientes de sulfatacion con progresion hacia la zona pericentral. Esperamos que el mantenimiento de la arquitectura natural y la qufmica de la matriz en correlacion con la histologfa facilitara la recelularizacion en los procesos de ingenierfa tisular al dirigir a las celulas a sitios especfficos en los andamios de biomatriz y/o proporcionar la mezcla adecuada de senales para conducir a la expansion y/o diferenciacion a celulas maduras.
El andamio de biomatriz puede prepararse a partir de diferentes tejidos y especies. Los andamios de biomatriz pueden prepararse facilmente a partir de cualquier tejido, normal o patologico y de cualquier especie. En las Figuras 13-16 se muestran andamios de biomatriz de pancreas, arbol biliar y duodeno humanos y de pancreas de rata y porcino. En las Figuras 5-7 y la Figura 12 se muestran efectos de andamios de biomatriz hepatica de bovino o de rata sobre las celulas hepaticas. Ademas, los andamios de biomatriz se han preparado a partir de aorta abdominal, vena ilfaca humanas y a partir de intestino de rata y cerdo. Los estudios histologicos, ultraestructurales e inmunohistoqufmicos en los andamios de biomatriz indican una marcada especificidad tisular, pero no especificidad de especie, en su estructura, composicion qufmica y funciones.
Los andamios de biomatriz indujeron y/o mantuvieron la diferenciacion de las celulas. La siembra de hHpSC en placas con secciones de andamios de biomatriz hepatica y en HDM adaptado para celulas hepaticas adultas dio como resultado que esencialmente el 100 % de las celulas viables se unieron en unas pocas horas a los andamios de biomatriz; ya sea intactos o despues de una pulverizacion criogenica. Las colonias de celulas que inicialmente se formaron en las secciones de los andamios retuvieron parte de su fenotipo de celulas madre, ya que las celulas en el centro de las colonias eran capaces de resistir la tincion con colorantes (Figura 11) y expresaron marcadores clasicos de progenitores hepaticos, tales como el receptor 4 de quimiocinas (motivo C-X-C) (CXCR4) y la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM) (Figura 5). Se dividieron una o dos veces y despues transitaron a detencion del ciclo celular y morfologfas similares a un cordon tridimensional (3-D), tfpicas de cultivos de celulas parenquimatosas maduras (Figuras 5 y 6 para la diferenciacion de celulas madre, comparar con la Figura 7 y la Figura 12). El HDM utilizado no requirio todas las citocinas o factores de crecimiento habituales, ya que estos estan presentes unidos a los andamios de biomatriz. La transicion a la detencion del crecimiento se correlaciono con la tincion en todas las colonias con colorantes de viabilidad (Figura 12), con perdida de la expresion de EpCAM y
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CXCR4 y con un aumento constante en la expresion de genes hepatocfticos y colangiocfticos especfficos de adultos como la urea y el citocromo P450 3A4. (Figura 5).
Los hepatocitos normales adultos humanos y adultos de rata se sembraron sobre andamios de colageno tipo I o de biomatriz hepatica a partir de hfgado de rata o de bovino y en HDM para celulas adultas. Las celulas parenquimatosas adultas fueron capaces de fijarse a los andamios en 10 minutos (incluso en medio libre de suero) frente a horas en el colageno tipo I, permanecieron en detencion del crecimiento a partir del punto de union; y se mantuvieron viables y totalmente funcionales durante mas de 8 semanas en los andamios frente a solo aproximadamente 2 semanas en el colageno tipo I. (Figuras 7 y 12). Los niveles de funciones de las celulas hepaticas maduras en los andamios de biomatriz durante semanas resultaron ser los mismos o similares a los hallados en otros de hepatocitos adultos recien aislados28. Las diferencias drasticas son que los cultivos sobre colageno tipo I se deterioran rapidamente despues de 2 semanas, mientras que los de los andamios de biomatriz permanecen estables morfologica y funcionalmente mientras los cultivos se mantengan (hasta ahora ~8 semanas).
Los andamios de biomatriz contienen la mayor parte de los componentes de la matriz extracelular del tejido y las citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz que proporcionan un conjunto compuesto de senales qufmicas que pueden usarse como un andamio insoluble y estable con una extraordinaria capacidad para inducir hHpSC a destinos hepaticos adultos, asf como mantener las celulas adultas completamente diferenciadas durante semanas. Al comparar los tipos existentes de extractos de matriz preparados por los investigadores con los de andamio de biomatriz de la presente invencion, esta claro que los tratamientos fisicos, enzimaticos y qufmicos tienen efectos sustanciales sobre la composicion, el comportamiento mecanico y las respuestas del huesped a los andamios biologicos derivados de la descelularizacion de tejidos y organos nativos, y en consecuencia, tienen implicaciones importantes para sus aplicaciones in vitro e in vivo. Todos los demas metodos existentes para la preparacion de sustratos o andamios dan como resultado la eliminacion de una gran parte de los componentes de la matriz ya sea mediante el uso de enzimas degradantes de la matriz16 o mediante el uso de tampones que disuelven las porciones principales de la matriz11. Los metodos fisicos (por ejemplo, congelacion rapida y agitacion) pueden utilizarse para preparar extractos de matriz a partir de tejidos con una estructura estratificada como la dermis (por ejemplo, SIS, BSM)29, pero no son utiles para organos con estructuras tisulares complejas como el hfgado. Por el contrario, nuestro metodo para obtener andamios de biomatriz dio como resultado la perdida de la mayoria de las proteinas celulares pero conservo esencialmente todos o al menos la mayoria de los colagenos y los componentes asociados al colageno, que incluyen citocinas, hormonas y factores de crecimiento unidos a la matriz.
La matriz extracelular esta embebida en una bicapa lipfdica en mosaico, que incluso en el organismo mas simple es un ambiente complejo, heterogeneo y dinamico. El metodo de deslipidacion es una faceta crftica del protocolo. Los metodos utilizados comunmente para la descelularizacion de tejidos implican detergentes ionicos tales como SDC y dodecilsulfato sodico (SDS). El SDC es relativamente mas suave que el SDS, tiende a provocar menos alteracion a la arquitectura tisular nativa y es menos eficaz para solubilizar las membranas celulares tanto citoplasmaticas como nucleares. No existen informes de descelularizacion tisular con el uso de SDC solo. Muchos estudios han utilizado detergentes no ionicos duros (por ejemplo, Triton X-100)31 o detergentes zwitterionicos (por ejemplo, 3-(3- colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, CHAPS)32. Por el contrario, nuestro metodo donde se utiliza una combinacion de SDC y PLA2 logra la deslipidacion del tejido rapida y suavemente.
Al menos veintinueve tipos de colagenos (I-XXIX) se han identificado hasta ahora en vertebrados, donde tienen papeles funcionales en la adhesion celular, diferenciacion, crecimiento, desarrollo tisular e integridad estructural33,34. Se conoce que los principales componentes estructurales en la matriz, los colagenos, permanecen insolubles en altas concentraciones de sal y a pH neutro35,36, un hallazgo que es la base de nuestra estrategia en la preparacion de andamios de biomatriz. La estrategia tiene las ventajas anadidas de que los colagenos permiten la preservacion de los componentes de la matriz unidos a ellos, tales como lamininas y fibronectinas (FN), proteoglicanos ricos en leucina (PG) y GAG que a su vez preservan las citocinas, factores de crecimiento o receptores de la superficie celular que estan unidos a ellos.
Los andamios de biomatriz son unicos en su gran capacidad para inducir una diferenciacion rapida y consistente de las celulas madre/progenitoras tales como hHpSC a destinos adultos y para mantener aquellas celulas restringidas a un linaje y para mantener aquellas celulas restringidas a un linaje o tambien para mantener celulas adultas sembradas en los andamios, como celulas viables y plenamente funcionales durante muchas semanas (> 8 semanas).
La diferenciacion de las celulas madre, tales como celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) o diversas formas de celulas madre mesenquimales (MSC) a tipos de celulas hepaticas completamente maduras, requiere multiples conjuntos de senales presentes (solubles y en la matriz) en etapas, con induccion por un conjunto de cebado necesario para responder a un conjunto diferente, y puede necesitar muchas semanas, hasta 6 semanas de cultivo, para generar celulas que tienen el destino hepatico adulto37. Ademas, la restriccion del linaje de las MSC a los destinos hepaticos produce resultados inconsistentes con celulas adultas que tienen fenotipos mezclados de hepatocitos y MSC. La diferenciacion de las celulas ES, celulas iPS y MSC da como resultado celulas similares a hepatocitos que expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes especfficos del hfgado; con variabilidad en los genes que se observan; y los niveles de protefna para los genes hepaticos
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expresados son generalmente bajos40 o altos para un gen hepatico e insignificantes para otros41,42 Por el contrario, la diferenciacion de las hHpSC en los andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las celulas expresaron un fenotipo adulto clasico y con actividades de urea, albumina y CYP450 a niveles casi normales despues de una semana en cultivo.
Las celulas similares a hepatocitos a partir de cualquiera de estos precursores y diferenciadas mediante otros protocolos distintos a los andamios de biomatriz, expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes especfficos del hfgado, con variabilidad en los genes que se observan y con niveles de protefna para los genes hepaticos generalmente mas bajos o altos para un gen hepatico e insignificantes para otros. Por razones desconocidas, los resultados son diferentes de preparacion en preparacion. Se espera que la utilizacion de los andamios de biomatriz de esta invencion de como resultado una diferenciacion mas rapida de estas poblaciones de celulas madre y con mayor consistencia en el logro de celulas con un fenotipo adulto estable.
La diferenciacion de determinadas poblaciones de celulas madre, tales como hHpSC en andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las celulas expresan un repertorio clasico de genes adultos y con actividades de urea, albumina, y CYP450 a niveles casi normales en 1 a 2 semanas en cultivo y con estabilidad de ese fenotipo durante muchas semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de la presente invencion tienen el potencial de facilitar en gran medida la diferenciacion de determinadas poblaciones de celulas madre a un fenotipo hepatico adulto.
La capacidad de diferenciar las celulas madre en los andamios de biomatriz para lograr celulas y tejidos maduros y funcionales ofrece oportunidades considerables para los programas academicos, industriales y clfnicos que permiten el uso de tipos de celulas bien diferenciadas para cada tipo de estudio analftico y, lo mas emocionante, permite la generacion de tejidos o incluso organos implantables, revascularizados que pudieran utilizarse para la investigacion basica y programas clfnicos.
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Ejemplo 2. Uso de andamios de biomatriz para cultivos de lfneas de celulas tumorales o cultivos primarios de tumores
Los andamios de biomatriz de esta invencion pueden usarse para producir cultivos de lfneas de celulas tumorales o cultivos primarios de tumores. La capacidad para lograr esto significa que el tumor de un paciente puede evaluarse para determinar la sensibilidad a diversas terapias en un ensayo ex vivo.
Los andamios de biomatriz de esta invencion pueden usarse ademas como sustratos para injertos de tumores (ya sean singenicos, alogenicos o xenogenicos) trasplantados a huespedes.
Los andamios de biomatriz de esta invencion pueden usarse ademas para evaluar el potencial metastasico de un tumor. Las celulas tumorales se siembran a bajas densidades de celulas sobre los sustratos de andamios de biomatriz de diversos tejidos. Las celulas tumorales se uniran y sobreviviran en muchos tipos de andamios de biomatriz. Creceran y formaran colonias preferentemente en algunos de ellos. Su capacidad para formar colonias en un tipo especffico de andamio de biomatriz es predictiva de la capacidad de las celulas tumorales para colonizar el tejido a partir del cual se preparo el andamio de biomatriz.
Los canceres colorrectales que habfan metastizado en el hfgado se resecaron y el tejido se preparo como cultivos primarios en medio de Kubota y en diversos sustratos. En la Tabla 9 se muestran los hallazgos de seis pacientes. Algunos de los pacientes tenfan tumores que tambien habfan metastizado a los pulmones. Las celulas se cultivaron en placas de cultivo de tejidos, plasticas, recubiertas con colageno tipo I ("colageno") o placas recubiertas con andamios de biomatriz de colon, hfgado o pulmon de rata. Todos los pocillos se sembraron con 20 000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos y se alimentaron con medio de Kubota. Las celulas se unieron y sobrevivieron en todos los sustratos (ver las Figuras 17A-B). Sin embargo, fueron capaces de crecer y formar colonias mejor en determinados sustratos. Las condiciones que soportan el mayor numero de colonias se correlacionaron con la capacidad de las celulas para crecer in vivo en los tejidos particulares a partir de los cuales se preparo un andamio. La cantidad de matriz o componentes de la matriz demostro ser una variable en la obtencion de alguna colonia. En la Tabla 8 se muestra la cantidad de la matriz/pocillo necesaria para observar colonias. Evidentemente, la cantidad necesaria para el colon, el sitio del tumor primario, fue la menor. Los datos significativos se destacan en letras negritas.
Lo anterior es ilustrativo de la presente invencion, y no debe interpretarse como limitante de esta. La invencion se define mediante las siguientes reivindicaciones, donde se incluyen los equivalentes de las reivindicaciones. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, publicaciones de patentes, secuencias identificadas por la Base de Datos GenBank® y/o numeros de registro de SNP, y otras referencias citadas en la presente descripcion se incorporan mediante referencia en su totalidad para las ensenanzas relevantes a la oracion y/o parrafo donde se presenta la referencia.
Tabla 1: Intervalos de concentraciones molares de NaCl para los colagenos tipo I-V.
Tipo de colageno
Fuente Intervalo de concentracion molar de NaCl para la precipitacion (por lo tanto, insolubilidad a la concentracion especificada y/o a concentraciones superiores a la indicada)
pH acido pH neutro
I
Piel 0,7-0,9 2,6
I Trfmero
Piel 0,7-0,9 4,0
III
Piel 0,7-0,9 1,5-1,7
IV
Placenta 1,2 1,7-2,0
V
Amnios y corion; placenta 1,2 3,6-4,5
Referencia: Paul Bornstein y Helene Sage (1980) Structurally Distinct Collagen Types. Annual Review of Biochemistry. 49:957-1003.
Estos datos son representativos de las condiciones para la insolubilidad de los tipos de colagenos. Se deben identificar los tipos de colageno dentro de un tejido y despues usar la concentracion de sal mas alta identificada para esos colagenos en el tejido y como la de los tampones usados para preparar los andamios de biomatriz. Por ejemplo, para la piel, se utilizarfa un tampon a pH neutro y con una concentracion de sal de 4,0 M, una
concentracion de sal que mantendrfa insolubles a los colagenos tipo I y III. Por el contrario, para la placenta, se utilizarfa un tampon a pH neutro y sal a 4,5 M para mantener insoluble tanto al colageno tipo IV como el tipo V.
Los tipos de colagenos presentes en un tejido son distintos en las diferentes edades de un huesped. Por ejemplo, 5 los hfgados fetales tienen niveles altos de colagenos tipo III, IV y V (que requieren concentraciones de sal superiores a 4,0 M), mientras que los hfgados adultos tienen una mezcla de colagenos tipo I, III, IV, V, VI y XVIII (que requieren concentraciones de sal mas bajas). Por lo tanto, la concentracion de sal necesaria para la preparacion de un andamio de biomatriz esta dictada por el repertorio de colagenos que son dominantes en el tejido. Ver la referencia 23 del Ejemplo 1 para mas detalles.
10
15
CT>CT>cncn-^-^cocororo^^
cnocnocnocnocnocnocn
Tabla 2. Analisis del contenido de colageno en andamio de biomatriz hepatica
AminoScidos
ANDAMIOS DE BIOMATRIZ (N = 4) TEJIDO HEPATICO (N = 3)
Muestra 1
Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 PROMEDIO SD Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 PROMEDIO SD
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Hyp
10,0 13,8 15,3 12,1 12,8 2,3 0,0” 0,0* 0,0* 0,0* 0,0*
Asp
82,7 77,1 78,4 85,5 80,9 3,9 93,0 94,5 90,8 92,8 1,8
Thr
52,6 51,1 45,6 52,4 50,4 3,3 52,2 51,0 53,7 52,3 1,3
Ser
56,5 53,7 61,9 62,4 58,6 4,2 57,7 57,0 62,0 58,9 2,7
Glu
112,0 107,0 117,4 118,1 113,6 5,2 123,9 122,0 130,1 125,4 4,2
Pro
52,3 52,2 55,7 51,6 52,9 1,9 46,6 45,9 46,4 46,3 0.4
Glv
118,7 134,0 125,4 109,4 121,9 10,4 88,2 84,6 89,1 87,3 2,4
Ala
88,3 86,1 89,5 83,6 86,9 2,6 79,0 78,2 90,6 82,6 7,0
Val
64,3 57,2 54,8 65,9 60,6 5,4 71,6 71,3 70,1 71,0 0.8
Met
21,7 20,6 20,7 20,4 20,8 0,6 21,4 21,4 21,7 21,5 0,2
lie
51,8 47,7 47,4 41,7 47,2 4,2 49,6 50,1 42,3 47,3 4,3
Leu
92,7 83,8 109,7 87,5 93,4 11,5 93,8 95,1 92,7 93,9 1,2
Tyr
30,8 26,9 22,4 28,1 27,0 3,5 31,8 32,1 27,5 30,5 2,6
Phe
45,5 40,7 42,4 42,8 42,8 2,0 47,8 51,0 43,7 47,5 3,7
His
21,0 18,8 13,2 21,8 18,7 3,9 21,8 21,5 24,1 22,5 1,4
Hyl
1,0 1.8 1,6 4,3 2.2 1,5 0,0** 0,0** 0,0** 0,0** 0,0**
Lys
40,6 70,0 49,8 66,2 56,7 13,8 74,6 78,5 73,0 75,3 2,8
Arq
57,5 57,6 48,7 46,1 52,5 6,0 47,0 46,0 42,1 45,0 2,6
Nota: * menor que 0,2 res/1000; ** no detectado.
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Tabla 3. Analisis de factores de crecimiento unidos a los andamios de biomatriz de conducto biliar
Nombre
Nombre completo de la citocina Conductos biliares humanos Andamios de biomatriz de conducto biliar humano %
bFGF
Factor de crecimiento de fibroblastos basico 58299 126 0 %
b-NGF
Factor de crecimiento nervioso (polipeptido beta) 516 81 16 %
EGF
Factor de crecimiento epidermico 91 108 119 %
EGF R
Receptor del factor de crecimiento epidermico 479 145 30 %
FGF-4
Factor de crecimiento de fibroblastos 4 31 36 116 %
FGF-6
Factor de crecimiento de fibroblastos 6 14 17 121 %
FGF-7
Factor de crecimiento de fibroblastos 7 149 23 15 %
GCSF
Factor estimulante de colonias de granulocitos 207 233 113 %
GDNF
Factor neurotrofico derivado de la glia 53 49 92 %
GM-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos 108 97 90 %
HB-EGF
Factor de crecimiento epidermico de union a heparina 28 23 82 %
IGFBP-1
Protefnas 1 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 431 61 14 %
IGFBP-2
Protefnas 2 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 255 20 8 %
IGFBP-3
Protefnas 3 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 77 54 70 %
IGFBP-4
Protefnas 4 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 81 58 72 %
IGFBP-6
Protefnas 6 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 783 107 14 %
IGF-I
Factor de crecimiento similar a la insulina I 18 6 33 %
IGF-I SR
Factor de crecimiento similar a la insulina I 89 25 28 %
IGF-II
Factor de crecimiento similar a la insulina 2 2873 3945 137 %
M-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos 149 105 70 %
M-CSF R
Receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos 358 71 20 %
NT-3
Neurotrofina 3 71 71 100 %
NT-4
Neurotrofina 4 75 58 77 %
PDGF R a
Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas 104 63 61 %
PDGF R b
Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas 489 110 22 %
PDGF-AA
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA 114 52 46 %
PDGF-AB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB 87 65 75 %
PDGF-BB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas BB 155 75 48 %
PIGF
Biosfntesis del anclaie glicosilfosfatidilinositol, clase F 146 14 10 %
SCF
Factor derivado de celulas estromales 1 39 22 56 %
SCF R
Receptor del factor derivado de celulas estromales 159 31 19 %
TGF-a
Factor de crecimiento transformante alfa 52 25 48 %
TGF-b
Factor de crecimiento transformante beta 234 277 118 %
TGF-b 2
Factor de crecimiento transformante beta 2 103 121 117 %
TGF-b 3
Factor de crecimiento transformante beta 3 28 16 57 %
VEGF
Factor de crecimiento vascular endotelial 74 35 47 %
VEGF R2
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 108 33 31 %
VEGF R3
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3 45 40 89 %
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Tabla 4. Anticuerpo utilizado
Nombre del anticuerpo
Huesped e isotipo Compania Num. de catalogo Dilucion
Anticuerpos primarios para los componentes de la matriz extracelular
1.
Colageno 1 IgG1 de raton Sigma C2456 1/2000
2.
Colageno 3A1 IgG1 de raton Sigma C7805 1/2000
3.
Colageno 4A1 IgG de cabra Santa Cruz sc-9302 1/50
4.
Colageno 5A1 IgG de conejo Santa Cruz sc-20648 1/50
5.
Colageno 6 IgG de conejo Santa Cruz Sc-20649 1/50
6.
sulfato de condroitina IgM de raton Sigma C8035 1/200
7.
Elastina IgG de conejo Abcam ab21610 1/200
8.
entactina (nidogeno 1) IgG de rata GeneTex GTX72367 1/200
9.
sulfato de heparan IgM de raton Seiko, Japon 270426 1/200
10.
HS-PG: perlecan IgG2a de raton NeoMarkers RT-794 1/200
11.
HS-PG: sindecano-1 IgG de cabra R&D AF2780 1/100
12.
Fibronectina IgG1 de raton Sigma F7387 1/200
13.
Laminina IgG1 de raton Sigma L8271 1/1000
Anticuerpos primarios para otras protefnas
1.
AFP IgG de conejo Novus Biologicals NB100-1611 1/200
2.
Albumina IgG de conejo Novus Biologicals NB 600-570 1/200
3.
ASMA IgG2a de raton Sigma A2547 1/300
4.
Ck18 IgG2b de raton Sigma SAB3300016 1/400
5.
hCK19 IgG2a de raton Abcam ab7754 1/250
6.
CK19 IgG de conejo Abcam Ab52625 1/200
7.
CYP3A4 IgG de raton Abnova H00001576-B01P 1/200
8.
Desmina IgG de conejo Abcam Ab8592 1/200
9.
EpCAM IgG1 de raton NeoMarkers MS-181 1/200
10.
receptor de secretina IgG de conejo Santa Cruz sc-26633 1/100
11.
PAN CK IgG1 de raton Abcam ab-7753 1/300
12.
Tubulina-a IgG1 de raton Neomarkers MS-581 1/1000
13.
Vimentina IgG1 de raton Abcam Ab8978 1/200
Anticuerpos secundarios o colorantes para tincion fluorescente de celulas o inmunohistoqufmica tisular
1.
Alexa Fluor® 488/594 anticuerpo de cabra anti- IgG 1 o 2a de raton o anti-IgG de conejo Molecular Probes 1/500
2.
Sistema ABC VECTASTAIN® Vector Laboratories
3.
KIT DE SUBSTRATO NovaRED™ Vector Laboratories
4.
Faloidina 488 Molecular Probes 1/500
1.1 Transferir la biomatriz triturada a una botella de 100 ml marcada previamente con el numero de lote y el numero de la bolsa (el numero de la bolsa identifica la fecha de la trituracion)
1.2 Mantener congelado a -80 °C hasta que este listo para recubrir las placas
2.0 Preparar la biomatriz para recubrir las placas
2.1 Descongelar una botella de biomatriz por metodo de descongelacion rapida en bano de agua a 37 °C
2.2 Medir la suspension de biomatriz descongelada (debe ser ~ 30 ml ± 2 ml)
2.3 Diluir a 1:24 con la Solucion 5
2.3.1 Calcular el volumen de la Solucion 5 para anadir a la suspension de biomatriz a 1:6
2.3.1.1 Multiplicar el volumen de la suspension de biomatriz x 3
2.3.1.2 Anadir ese volumen a la suspension de 1:6 para una dilucion de 1:24
2.4 Recubrir las placas inmediatamente (dejar que el conjunto de biomatriz diluido de lugar a un aglomerado)
3.0 Revestir las placas con biomatriz
3.1 Determinar el numero de placas a recubrir. Consultar la Tabla 8 para los volumenes de siembra
• Retirar asepticamente las placas del empaque y organizarlas en la campana de flujo laminar
• Transferir el volumen apropiado de la suspension de biomatriz en cada pocillo mediante el uso de una pipeta multicanal cuando sea apropiado. Consultar la Tabla 1 para el volumen de siembra
• Asegurar que la suspension este uniformemente distribuida en el pocillo, si es necesario, golpee suavemente
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la placa pero no la retire de la superficie plana de la campana.
• Dejar que las placas permanezcan en reposo durante la noche
• La primera accion a realizar el dfa siguiente es retirar la solucion de cada pocillo
o Manipular las placas con cuidado para que el recubrimiento de la matriz no se altere o Inclinar la placa hacia usted sin retirar el borde de la placa de la superficie de la campana. Esto estabiliza la placa para evitar movimientos bruscos que produzcan que la biomatriz salga de la placa o Mediante el uso de un aparato de succion con una pipeta de punta fina, aspirar toda la solucion de cada pocillo. jNO TOQUE LA SUPERFICIE DE LA MATRIZ CON LA PIPETA!!! o Colocar suavemente la placa hacia abajo, retirar la tapa y dejar secar completamente (~ 2 horas)
■ Mover la placa mientras esta humeda altera el recubrimiento de la biomatriz
■ No mueva las placas hasta que la matriz este seca
o Cuando este completamente seca, cambie la tapa y examine la calidad o Colocar las placas que tienen un recubrimiento liso en la bolsa de la placa o Sellar la bolsa y aplicar la etiqueta o Esterilizar mediante irradiacion gamma (5000 rads) o Almacenar las placas recubiertas a 4 °C
o Enviar las placas recubiertas en paquetes de 5 en el paquete con hielo
4.0 Utilizacion de las placas de biomatriz
4.1 Retirar asepticamente la placa del empaque y colocarla en su lugar en el gabinete de seguridad biologica
4.2 Agregar medio a cada pocillo y colocar en la incubadora durante al menos 2 horas antes del uso
4.3 Cuando esten listas para sembrar las celulas, retirar el medio de rehidratacion y lavar con medio de cultivo de tejidos una vez
4.4 Anadir las celulas
Tabla 6. Analisis de factor de crecimiento unido a andamios de biomatriz hepatica
Nombre
Nombre completo de la citocina Hfgados de rata Andamios de biomatriz de rata Por ciento
bFGF
Factor de crecimiento de fibroblastos basico 100,06 394,14 394
EGF
Factor de crecimiento epidermico 74,81 76,02 102
EGF R
Receptor del factor de crecimiento epidermico 92,81 81,64 88
FGF-4
Factor de crecimiento de fibroblastos 4 15,06 13,21 88
FGF-6
Factor de crecimiento de fibroblastos 6 4,81 3,77 78
FGF-7
Factor de crecimiento de fibroblastos 7 10,06 6,32 63
GCSF
Factor estimulante de colonias de granulocitos 348,06 338,20 97
GDNF
Factor neurotrofico derivado de la glia 81,31 43,59 54
GM-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos 133,56 105,38 79
HB-EGF
Factor de crecimiento epidermico de union a heparina 44,56 38,23 86
IGFBP-1
Protefnas 1 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 67,81 70,40 104
IGFBP-3
Protefnas 3 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 140,81 201,90 143
IGFBP-4
Protefnas 4 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 83,56 58,92 71
IGFBP-6
Protefnas 6 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 91,81 72,19 79
IGF-I
Factor de crecimiento similar a la insulina I 1,56 1,98 127
IEGF-I SR
Factor de crecimiento similar a la insulina I 7,31 3,51 48
IGF-II
Factor de crecimiento similar a la insulina 2 3749,06 3482,52 93
M-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos 170,31 134,68 79
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M-CSF R
Receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos 70,56 50,47 72
NT-3
Neurotrofina 3 25,56 5,03 20
NT-4
Neurotrofina 4 55,06 43,59 79
PDGF R a
Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas 10,56 21,11 200
PDGF R b
Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas 113,81 85,46 75
PDGF-AA
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA 62,06 106,40 171
PDGF-AB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB 19,31 19,34 100
PDGF-BB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas BB 9,56 14,23 149
PIGF
Biosfntesis de anclaje glicosilfosfatidilinositol, clase F 4,81 836 174
SCF
Factor derivado de celulas estromales 1 2,06 42,56 2064
SCF R
Receptor del factor derivado de celulas estromales 17,06 17,80 104
TGF-a
Factor de crecimiento transformante alfa 21,31 21,63 102
TGF-b
Factor de crecimiento transformante beta 330,31 342,77 104
TGF-b 2
Factor de crecimiento transformante beta 2 134,06 152,34 114
TGF-b 3
Factor de crecimiento transformante beta 3 1,06 0,18 17
VEGF
Factor de crecimiento vascular endotelial 70,56 94,14 133
VEGF R2
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 13,56 11,93 88
VEGF R3
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3 459,56 46,91 10
Tabla 7. Propiedades de las celulas madre hepaticas humanas (hHpSC) despues del aislamiento y en cultivo
Propiedades
hHpSC- recien aisladas Condiciones de autorreplicacion (Dfa 12) Condiciones de Diferenciacion (Dfa 12)
KM y TCP o colageno tipo III
DM y colageno tipo I DM y andamios de biomatriz
Tiempo necesario para adherirse
--- ~4-5 horas en TCP; ~3 horas en colageno tipo III 7-12 horas - 3 horas
% de adherencia de celulas viables
--- 60-80 % en TCP y ~100 % en colageno tipo III -100 %
Morfologfa de las colonias
Colonias bidimensionales (monocapa) Cordones de celulas; algo cuboidal Cordones de celulas; muy tridimensional
Tiempo de duplicacion (tasa de division)
Una division cada ~36 horas en TCP y -2426 horas en colageno tipo III Una division cada -40-50 horas con transicion a la detencion del crecimiento hacia los 7-10 dfas Solo unas pocas divisiones con transicion a la detencion del crecimiento hacia ~5 dfas
Duracion de la viabilidad
> 6 meses (permanecen como celulas madre) - 2 semanas > 8 semanas como celulas diferenciadas (no probado aun por mas tiempo)
Porcentaie de celulas que expresan el marcador especificado
EpCAM
100 % Presente en membranas de colangiocitos pequenos; ninguna expresion en absoluto en hepatocitos maduros
NCAM
>80 % Ninguno
CD133/1
90 % Ninguno
SOX 17
100 % Ninguno
CK 8/18, E- cadherina
100 % 100 %
CK19
90 % Presente en los colangiocitos pero no en los hepatocitos
a-fetoprotefna
Ninguna; En caso de haberla, es debido a contaminacion con hepatoblastos Expresion moderada en la mayorfa de las celulas a los 1012 dfas La expresion en los primeros 2-3 dfas, disminuye drasticamente despues de eso, sin expresion a partir del dfa 7 en adelante.
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P450
Ninguno o niveles insignificantes 100 % (~ 18 000 RLU)* 100 % (~ 35 000 RLU)*
Urea sintetizada
Ninguno ~ 2,5 mg/dl ~ 7 mg/dl
Marcadores: hepatocitos maduros
La mayorfa de las celulas no tienen ninguno; las que expresan lo hacen muy debilmente (por ejemplo, albumina); todas expresan ARNm de transferrina, pero no la protefna de transferrina albumina, protefna transferrina, tirosina aminotransferasa (TAT), glucogeno. Niveles debiles en colageno I frente a niveles fuertes en andamios de biomatriz
Marcadores: colangiocitos maduros
La mayorfa ninguno; las que expresan alguno lo hacen muy debilmente: (por ejemplo, CFTr, GGT1, AE2: ninguna expresion de ASBT ni acuaporinas tardfas Receptor de secretina, AE2, ABAT, CFTR, GGT1, AE2, ASBT, pero con niveles debiles en colageno I frente a niveles muy fuertes en andamios de biomatriz
KM = medio de Kubota, un medio libre de suero utilizado para hHpSC y progenitores; HM-L = medio de diferenciacion derivado de KM y con hormonas y factores dados en los metodos. TCP = plastico de cultivo de tejidos. *Ver la Figura 5F; **Ver la Figura 5E
Tabla 8. Cantidad de la matriz/pocillo necesaria para observar las colonias
Cantidad de matriz en ug/CM2
Colageno Colon Hfgado Pulmon
Inferior
5 3 10 30
Medio
50 5 25 50
Superior
100 7 50 100
Tabla 9. Resultados de seis pacientes
Num. de colonias
Paciente 1
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baja de la matriz
6 5,5 7,5 5,5 4
Concentracion media de la matriz
7,5 14,5 14 1,5
Concentracion alta de la matriz
9 9,5 19 2
Paciente 2
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baja de la matriz
5 15 13,5 25 1
Concentracion media de la matriz
9 22,5 24 2,5
Concentracion alta de la matriz
5 19,5 23,5 3
Num. de colonias
Paciente 3
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baia de la matriz
6 7 5 5,5 1,5
Concentracion media de la matriz
10,5 40,5 28 3,5
Concentracion alta de la matriz
9,5 18,5 21 5,5
Paciente 4
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baia de la matriz
5,5 5,5 9 12 3
Concentracion media de la matriz
6,5 11 16 2
Concentracion alta de la matriz
7,5 13,5 18 1
Paciente 5
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baia de la matriz
5 6 10,5 14,5 4
Concentracion media de la matriz
6,5 12,5 20 2,5
Concentracion alta de la matriz
6,5 13 24,5 1,5
Paciente 6
Plastico Colon Hfgado Pulmon Colageno
Concentracion baia de la matriz
3,5 5,5 9 19 2,5
Concentracion media de la matriz
6,5 15,5 18 3,5
Concentracion alta de la matriz
4,5 16,5 25,5 3,5

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepatico de mamffero, que comprende:
    a) perfundir u homogeneizar el tejido hepatico con un primer medio basal, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues
    b) perfundir el tejido biologico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende desoxicolato sodico y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; despues
    c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de 2,0 M de NaCl a 5,0 M, la concentracion elegida para mantener insolubles los colagenos identificados en el tejido biologico; despues
    d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues
    e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg,
    para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biologico, dicho andamio de biomatriz retiene al menos el 95 % de sus colagenos originales y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico.
  2. 2. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el medio basal se selecciona del grupo que consiste en medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, medio de Waymouth y medio de William.
  3. 3. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el fluido intersticial.
  4. 4. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el tampon de deslipidacion de la etapa (b) comprende de 20 unidades/l a 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y desoxicolato sodico al 1 % en el primer medio.
  5. 5. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde la concentracion de sal del tampon de la etapa (c) es de 3,4 M de NaCl a 3,5 M de NaCl cuando se usa para la preparacion de un andamio a partir de un hfgado adulto y es de 4,0 M de NaCl a 4,5 M de NaCl cuando se usa para la preparacion de un andamio a partir de un hfgado fetal.
  6. 6. El metodo de conformidad con la reivindicacion precedente 1, en donde el tampon de la etapa (c) comprende ademas un inhibidor de proteasa, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
  7. 7. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el tampon de la etapa (d) comprende ademas un inhibidor de proteasa, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
  8. 8. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde todos los medios y tampones de las etapas (a) a la (e) estan libres de una cantidad detectable de una enzima que degrade los componentes de la matriz extracelular.
  9. 9. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente que comprende ademas esterilizar el andamio de biomatriz, opcionalmente en donde la etapa de esterilizacion comprende irradiacion gamma del andamio de biomatriz.
  10. 10. Un andamio de biomatriz producido mediante el metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  11. 11. Un metodo para producir un cultivo celular, que comprende:
    a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con el metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
    b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y
    c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
  12. 12. El metodo de conformidad con la reivindicacion 11 en donde la etapa (b) comprende
    congelar el andamio de biomatriz de la etapa, preparar una seccion congelada del andamio de biomatriz como un sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo.
    El metodo de conformidad con la reivindicacion 11 en donde la etapa (b) comprende
    triturar la biomatriz hasta obtener un polvo, que opcionalmente se lleva a cabo en un molino con congelacion a temperaturas del nitrogeno lfquido o cercanas a estas, recubrir al menos una parte de un aparato de cultivo con el polvo para producir un sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con un medio de cultivo celular en el aparato de cultivo.
    imagen1
    Lavado de perfusion RPMI-1640
    Detergente PLA2 + SDC
    Alto contenido de sal NaCl 3,4 M
    --------------------------qr
    Nucleasas RNAasa + DNAasa
    Enjuague Medio de Kubota
    Figura 1
    imagen2
    imagen3
    Figura 2
    imagen4
    Figura 2 (continuacion)
    a
    imagen5
    160
    120
    16
    O
    o
    o
    Figura 3
    » Hfgado completo g Biomatriz
    imagen6
    b LAM
    " ' ( ' auiym
    COL3
    Figura 3 (continuacion)
    imagen7
    Figura 4
    imagen8
    Colagenos
    L&V lit V IV, VI l,IV, VI
    Proteinas de adhesion
    LAM LARfn fft Fn
    Proteoglicanos
    CS, HS CS-.HS- 1______^_____1 HS,CS US, HP-
    Trfada portal
    Endotelio sinusoidal
    Espacio de Disse
    Vena
    hepatica
    Figura 4 (continuacion)
    d
    Componente de la matriz Hfgado (in vivo) Andamios de biomatriz
    (O o c CD o> '-5 o o
    Tipo I Capsula de Glisson, trfadas portales y puntos de los cordones hepaticos Trfadas portales y region acinar media
    Fibrilar
    Tipo III Trfadas portales, placas ductales, canales de Hering, red de reticulina de los sinusoides Por todo el andamio, especialmente alrededor de las trfadas portales y los restos de muralia de celulas parenquimatosas
    Tipo V
    Alrededor de las trfadas portales y puntos de los cordones hepaticos Trfadas portales y region acinar media
    Membrana basal
    Tipo IV Alrededor de las trfadas portales y la vena central, entre el parenquima y el endotelio en los espacios de Disse Trfadas portales y alrededor de los resto de la vasculatura
    Tipo VI
    Trfadas portales y alrededor de la vasculatura Trfadas portales y alrededor de los resto de la vasculatura
    Protelnas de adhesion
    Membrana basal Laminina Nidogeno Trfadas portales Alrededor de la vasculatura Trfadas portales Trfadas portales y alrededor de los resto de la vasculatura
    A lo largo de los andamios de biomatriz; especialmente alrededor de los restos de muralia de las celulas parenquimatosas
    otros
    Fibronectina A lo largo de las placas hepaticas como filamentos finos
    Elastina
    Particularmente evidente alrededor de la vasculatura y la capsula de Gisson Ondas de elastina cerca de restos de vasos sanguineos
    Vimentina
    Particularmente evidente alrededor de la vasculatura A lo largo de los andamios de biomatriz; especialmente alrededor de los restos de vasculatura
    Hialuronano Alrededor de la trfada portal y areas adyacentes —
    Proteoglicanos
    CS-PG Predominantemente periportal Predominantemente periportal
    HS-PG (glipicanos, sindecanos)
    Distribucion radial rodeando la vena porta y a lo largo de las vasculaturas sinusoidales. No se encontro en las trfadas portales. . A lo largo de la matriz alrededor de la vasculatura
    HS-PG (Perlecano) Mas evidente alrededor de las trfadas portales (es espacios fuera de los sinusoides) Predominantemente alrededor de las trfadas periportales
    HP-PG
    Predominantemente alrededor de las venas centrales M, —-------------- -------------- ■ ■
    Figura 4 (continuacion)
    imagen9
    Figura 5
    Figura 5 (continuacion)
    Actividad de CYP 3A4 (RLU)
    S8 SSSS SS SB
    oc>e?ocfCioooo 00000(^0 o o □ o
    imagen10
    imagen11
    o
    o
    0)'
    ID
    CD
    3
    O
    imagen12
    Sintesis de urea (mg/dl)
    __:__E__I I : :—I----L—J
    imagen13
    up
    o'
    3
    £D
    imagen14
    Alexa Fluor 568
    Alexa Fluor 488
    Fusionado con DAPI
    Fusionado con biomatriz
    imagen15
    fa*-'
    cn
    cn
    imagen16
    250000
    200000
    150000
    100000
    50000
    imagen17
    P450 3A4 en el dia 12
    imagen18
    ZHep-007 ZL-013
    Figura 7
    imagen19
    Figura 7 (continuacion)
    imagen20
    R,-C—0“CH O
    1 II A J
    CHj-O-P-O-X
    l
    ____ ____________ OH
    Fosfoglicerido en la membrana de celulas y mitocondrias
    HaC—OH
    HO—OOCR O
    HjO—0—P—OCHaCHjN (CEa)jOH
    imagen21
    Hyp
    imagen22
    Figura 9
    biomatriz tejido hepatico
    cn
    CD
    imagen23
    Higado fresco (n = 6) Biomatriz (n = 5) Valor de p Relacion
    ADN (Mg/g de peso humedo)
    585,82 ± 4,78 17,85 ±0,96 <0,001 3,05 %
    ARN (mg/g de peso humedo)
    5,38 ± 1,02 No detectado N/A N/A
    imagen24
    imagen25
    imagen26
    imagen27
    Dias
    D5-i
    ati
    M
    Q3&
    0 IL3
    Q_
    QZi -
    1 DU
    >
    CL* B.1 ’ DIB D '
    f D
    12
    Viabilidad
    T M 2t 3
    Dias
    Urea
    —*—Biomatriz ■■* 'Colageno I
    Figura 12 (continuacion)
    CD
    CO
    imagen28
    Celulas acinares
    Islotes
    Islotes
    2
    >■ Celulas acinares
    U* Celulas acinares
    Andamio de biomatriz Tejido pancreatico pancreatica de rata humano
    Vimentina Sindecanol Colageno VI
    imagen29
    Colageno III
    I
    imagen30
    Figura 14
    SU BJnBjj
    imagen31
    imagen32
    Figura 15 (continuacion)
    CD
    Tejido de vesfcula biliar humana Biomatriz de vesfcula biliar humana
    imagen33
    A
    imagen34
    B
    imagen35
    Figura 17
ES11801493.5T 2010-07-02 2011-07-01 Andamios de biomatriz Active ES2624742T3 (es)

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