ES2624780T3 - Reprogramación de células - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para inducir una célula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, comprendiendo el método: (I) (a) poner en contacto la célula humana no pluripotente con un polipéptido Oct4 o introducir en la célula humana no pluripotente un polinucleótido que codifica un polipéptido Oct4; y (b) poner en contacto la célula humana no pluripotente con una receptor de TGFß /inhibidor de ALK5 de molécula pequeña, un inhibidor de MEK de molécula pequeña, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) de molécula pequeña, y un activador alostérico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosítido 1 (PDK1) de molécula pequeña en condiciones suficientes para inducir que la célula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la célula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido; o (II) (a) poner en contacto la célula humana no pluripotente con un polipéptido Oct4 y un polipéptido Klf4 o introducir en la célula humana no pluripotente un polinucleótido que codifica un polipéptido Oct4 y un polinucleótido que codifica un polipéptido Klf4; y (b) poner en contacto la célula humana no pluripotente con una receptor de TGFß /inhibidor de ALK5 de molécula pequeña, un inhibidor de MEK de molécula pequeña, y un activador alostérico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosítido 1 (PDK1) de molécula pequeña en condiciones suficientes para inducir que la célula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la célula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente.

Description

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DESCRIPCION
Reprogramacion de celulas Antecedentes de la invencion
La tecnologfa de citoblastos pluripotentes inducidos (iPSC), es decir, la reprogramacion de celulas somaticas en celulas pluripotentes que se asemejan mucho a embriocitoblastos (ESC) mediante la introduccion de factores definidos, tiene un gran potencial en la investigacion biomedica y la medicina regenerativa (Takahashi, K., y Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Takahashi et al., Cell 131,861-872 (2007); Yu et al., Science 318, 19171920 (2007); Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); Kim et al., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009); Maherali, N., y Hochedlinger, K., Cell Stem Cell 3, 595-605 (2009a); Daley et al., Cell Stem Cell 4, 200-201 (2009); Documento US 2009/0227032 de Yamanaka et al.; Documento US 2008/0268533 de Dalton et al.; Zhu et al., Cell Stem Cell 7, 651655 (2010)). Se han desarrollado diversas estrategias para generar iPSC con menos o sin ninguna manipulacion genetica exogena, lo que representa un obstaculo importante para las aplicaciones iPSC (Yamanaka et al., 2009; Saha, K., Jaenisch, R., Cell Stem Cell 5, 584-595 (2009)). En el camino hacia una meta definitiva de generar iPSC con un coctel definido de moleculas pequenas que ofrecena significativas ventajas sobre las manipulaciones geneticas o de sustancias biologicas mas diffciles de fabricar/utilizar, se han realizado esfuerzos sustanciales para identificar compuestos qmmicos que puedan sustituir funcionalmente los factores de transcripcion de la reprogramacion exogenos (TF) y/o potenciar la eficacia y la cinetica de la reprogramacion (Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528 (2008a); Shi et al., Cell Stem Cell 3, 568-574 (2008b); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008a); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 1269-1275 (2008b); Silva et al., Plos Bio 6, e253. doi: 10.1371/journal.pbio.0060253 (2008); Lyssiotis et al., PNAS 106, 8912-8917 (2009); Ichida et al., Cell Stem Cell 5, 491-503 (2009); Maherali, N., Hochedlinger, K., Curr Biol 19, 1718-1723 (2009b); Esteban et al., Cell Stem Cell 6, 71-79 (2010); Feng et al., Cell Stem Cell 4, 301-312 (2009); Documento WO 2011/047300). Sin embargo, la reduccion adicional del numero de TF exogenos ha supuesto un extraordinario desaffo ya que (1) la mayor parte de las condiciones que facilitan o potencian la reprogramacion (por ejemplo, aprovechar un tipo espedfico de celula o utilizar moleculas pequenas) son dependientes del contexto, es decir, dichas condiciones espedficas (por ejemplo, la una molecula pequena de reprogramacion) sena normalmente mucho menos eficaz o incluso perjudicial en un tipo de celula diferente con diferentes factores exogenos y utilizados en una ventana diferente de tratamiento; y (2) el cribado de alto rendimiento supone un desaffo tecnologico cuando la eficacia y la velocidad de la reprogramacion disminuyen ademas exponencialmente debido a que se utilizan menos TF exogenos. Hasta la fecha, solo se habfa demostrado que los neurocitoblastos (NSC) que expresan endogenamente Sox2 y cMyc a un alto nivel se reprogramaban a iPSC mediante la expresion endogena solo de Oct4 (Kim et al., Cell 136, 411-419 (2009a); Kim et al., Nature 461,643-649 (2009b)). Sin embargo, los NSC fetales humanos son raros y diffciles de obtener en la practica (Nunes et al., Nat Med 9, 439-447 (2003)). En consecuencia, sena beneficioso desarrollar condiciones de reprogramacion qmmica aplicables a otras celulas somaticas mas accesibles y abundantes.
Sumario breve
La invencion proporciona un metodo in vitro de inducir una celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, comprendiendo el metodo:
(I)
(a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Oct4 o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4; y
(b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con una receptor de TGFp /inhibidor de ALK5 de molecula pequena, un inhibidor de MEK de molecula pequena, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) de molecula pequena, y un activador alosterico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) de molecula pequena en condiciones suficientes para inducir que la celula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido; o
(a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Oct4 y un polipeptido Klf4 o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 y un polinucleotido que codifica un polipeptido Klf4; y
(b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con una receptor de TGFp /inhibidor de ALK5 de molecula pequena, un inhibidor de MEK de molecula pequena, y un activador alosterico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) de molecula pequena en condiciones suficientes para inducir que la celula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente.
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La presente divulgacion proporciona tambien un metodo de inducir una celula de mai^ero no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido que comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente. El activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, acido (Z)-5-(4- clorofeni)-3-fenilpent-2-enoico ("PS48"), acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3-fenilpent-2-enoico ("PS08"), acido 2-(3- (4-clorofenil)-3-oxo-1-denilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3-fenilpent-2-enoico ("12Z"), o acido (Z)-5-(1H- indol-3-il)-3-fenilpent-2-enoico ("13Z").
En algunos aspectos de la invencion, el metodo comprende ademas poner en contacto, la celula no pluripotente con un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos de la invencion, el metodo comprende ademas poner en contacto la celula no pluripotente con un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos de la invencion, el metodo comprende ademas poner en contacto la celula no pluripotente con un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA).
Como se ha mencionado anteriormente, en algunos aspectos de la divulgacion, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente. En algunos aspectos, las condiciones comprenden introducir al menos un factor de transcripcion exogeno en la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende un polipeptido. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende un polipeptido Oct. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una protema seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct y un polipeptido Klf. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una protema seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, la condicion comprende introducir al menos dos, tres o cuatro factores de transcripcion exogenos en la celula no pluripotente, en el que cada uno de los factores de transcripcion exogenos comprende una protema diferente seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno se introduce mediante la introduccion de un polinucleotido en la celula no pluripotente, en el que el polinucleotido codifica el factor de transcripcion exogeno, expresando de esta forma el(los) factor(es) de transcripcion en la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno se introduce poniendo en contacto el factor de transcripcion exogeno con la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
En algunos aspectos, la celula no pluripotente es una celula humana. En algunos aspectos, el activador de PDK1 esta presente en una concentracion suficiente para aumentar en al menos un 10% la eficacia de la induccion de la celula no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, en condiciones suficientes para inducir la conversion de la celula no pluripotente en el citoblasto pluripotente inducido.
En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente. En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1 en ausencia de un inhibidor de MEK, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1 y un inhibidor de MEK. En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, y un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) en ausencia de un inhibidor de MEK, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) y un inhibidor de MEK.
En algunos aspectos, el metodo comprende ademas purificar las celulas pluripotentes para generar una poblacion homogenea de las celulas pluripotentes. En algunos aspectos, en los que se induce una pluralidad de citoblastos pluripotentes, el metodo comprende ademas purificar los citoblastos pluripotentes para generar una poblacion homogenea de citoblastos pluripotentes.
La presente invencion proporciona tambien una mezcla que comprende:
(I) (a) celulas de mairnfero, que comprenden un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 exogeno; (b) un activador de PDK1 de molecula pequena; (c) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; (d) un inhibidor de MEK de molecula pequena; y (e) un inhibidor de HDAC de molecula pequena; o
(II) (a) celulas de mamffero; (b) un polipeptido Oct4 exogeno; (c) un activador de PDK1 de molecula pequena alosterico; (d) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; (e) un inhibidor de MEK de molecula pequena; y (f) un inhibidor de HDAc de molecula pequena; o
(III) (a) celulas de mamffero, que comprenden un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 exogeno y un polinucleotido que codifica un polipeptido Klf4 exogeno; (b) un activador de PDK1 de molecula pequena; (c) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; y (d ) un inhibidor de MEK de molecula pequena; o
(IV) (a) celulas de mai^ero; (b) un polipeptido Oct4 exogeno y un polipeptido Klf4 exogeno; (c) un activador de PDK1 de molecula pequena alosterico; (d) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; y (e) un
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inhibidor de MEK de molecula pequena.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una mezcla que comprende celulas de mai^ero, un activador de PDK1, y uno o mas de (1) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (2) un inhibidor de MEK; (3) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (4) uno o mas factores de transcripcion exogenos seleccionados entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox.
En algunos aspectos, al menos un 99% de las celulas en la mezcla son celulas no pluripotentes. En algunos aspectos, esencialmente todas las celulas son celulas no pluripotentes. En algunos aspectos, las celulas son celulas humanas. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, acido (Z)-5- (4-clorofeni)-3-fenilpent-2-enoico ("PS48"), acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3-fenilpent-2-enoico ("PS08"), acido 2- (3-(4-clorofenil)-3-oxo-1-denilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3-fenilpent-2-enoico ("12Z"), o acido (Z)-5- (1H-indol-3-il)-3-fenilpent-2-enoico ("13Z"). En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA).
En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un factor de transcripcion exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares. En algunos aspectos, el activador de PDK1 en la mezcla esta presente en una concentracion suficiente para aumentar en al menos un 10% la eficacia de induccion de las celulas no pluripotentes en la mezcla en citoblastos pluripotentes inducidos en condiciones suficientes para inducir la conversion de las celulas en citoblastos pluripotentes inducidos.
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un kit para inducir la pluripotencia en una celula de mamftero no pluripotente, comprendiendo el kit un activador de PDK1, y uno o mas de (1) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (2) un inhibidor de MEK; (3) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (4) uno o mas factores de transcripcion seleccionados entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, acido (Z)-5-(4-clorofeni)-3-fenilpent-2-enoico ("PS48"), acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3- fenilpent-2-enoico ("PS08"), acido 2-(3-(4-clorofenil)-3-oxo-1-denilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3- fenilpent-2-enoico ("12Z"), o acido (Z)-5-(1H-indol-3-il)-3-fenilpent-2-enoico ("13Z"). En algunos aspectos, el kit comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA).
En algunos aspectos, el kit comprende ademas un factor de transcripcion exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un metodo de inducir una celula de mamftero no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido que comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la celula de mamfero no pluripotente en un citoblasto pluripotente. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de PDK1. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, PS48, PS08, 12Z, o 13Z. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 2,6-bisfosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un sustrato de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un intermedio glucolftico o sus precursores metabolicos, por ejemplo, acido nicotmico, NADH, o fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del transportador de captacion de glucosa. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, el modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa, por ejemplo, 2,4-dinitrofenol, o acido 2- hidroxiglutarico. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del factor inducible por hipoxia, por ejemplo, N-oxaloilglicina, o quercetina. En algunos aspectos, el metodo comprende ademas poner en contacto, la celula no pluripotente con un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83- 01. En algunos aspectos, el metodo comprende ademas poner en contacto la celula no pluripotente con un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, el metodo comprende ademas poner en contacto la celula no pluripotente con un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA).
En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente. En algunos aspectos, las condiciones comprenden introducir al menos un factor de
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transcripcion exogeno en la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende un polipeptido. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende un polipeptido Oct. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una protema seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct y un polipeptido Klf. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una protema seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, la condicion comprende introducir al menos dos, tres o cuatro factores de transcripcion exogenos en la celula no pluripotente, en el que cada uno de los factores de transcripcion exogenos comprende una protema diferente seleccionada entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno se introduce mediante la introduccion de un polinucleotido en la celula no pluripotente, en el que el polinucleotido codifica el factor de transcripcion exogeno, expresando de esta forma el(los) factor(es) de transcripcion en la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno se introduce poniendo en contacto el factor de transcripcion exogeno con la celula no pluripotente. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
En algunos aspectos, la celula no pluripotente es una celula humana. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico esta presente en una concentracion suficiente para aumentar en al menos un 10% la eficacia de la induccion de la celula no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, en condiciones suficientes para inducir la conversion de la celula no pluripotente en el citoblasto pluripotente inducido.
En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en condiciones suficientes para inducir que la celula se convierta en un citoblasto pluripotente. En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico y un inhibidor de MEK. En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en ausencia de un inhibidor de MEK, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente que promueve el metabolismo glucolftico y un inhibidor de MEK. En algunos aspectos, el metodo comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, y un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) en ausencia de un inhibidor de MEK, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) y un inhibidor de MEK.
En algunos aspectos, el metodo comprende ademas purificar las celulas pluripotentes para generar una poblacion homogenea de las celulas pluripotentes. En algunos aspectos, en los que se induce una pluralidad de citoblastos pluripotentes, el metodo comprende ademas purificar los citoblastos pluripotentes para generar una poblacion homogenea de citoblastos pluripotentes.
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona una mezcla que comprende celulas de mairftfero, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, y uno o mas de (1) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (2) un inhibidor de MEK; (3) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (4) uno o mas polipeptidos exogenos seleccionados entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, al menos un 99% de las celulas en la mezcla son inicialmente celulas no pluripotentes. En algunos aspectos, esencialmente todas las celulas son inicialmente celulas no pluripotentes. En algunos aspectos, las celulas son celulas humanas. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de PDK1. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, PS48, PS08, 12Z, o 13Z. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 2,6-bisfosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un sustrato de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un intermedio glucolftico o sus precursores metabolicos, por ejemplo, acido nicotmico, NADH, o fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del transportador de captacion de glucosa. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, el modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa, por ejemplo, 2,4-dinitrofenol, o acido 2-hidroxiglutarico. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del factor inducible por hipoxia, por ejemplo, N-oxaloilglicina, o quercetina. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA).
En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en la mezcla esta presente en una concentracion suficiente para aumentar en al menos un 10% la eficacia de induccion de las celulas no pluripotentes en la mezcla en citoblastos pluripotentes inducidos en condiciones suficientes para inducir la conversion de las celulas en citoblastos pluripotentes inducidos.
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En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un kit para inducir la pluripotencia en una celula de mamftero no pluripotente, comprendiendo el kit un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, y uno o mas de (1) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (2) un inhibidor de MEK; (3) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (4) uno o mas factores de transcripcion seleccionados entre el grupo que consiste en un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox; o un polipeptido que codifica un factor de transcripcion seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de PDK1. En algunos aspectos, el activador de PDKl es un activador de PDK1 alosterico, porejemplo, PS48, PS08, 12Z, o 13Z. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 2,6- bisfosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un sustrato de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un intermedio glucolftico o sus precursores metabolicos, por ejemplo, acido nicotmico, NADH, o fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del transportador de captacion de glucosa. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, el modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa, por ejemplo, 2,4-dinitrofenol, o acido 2-hidroxiglutarico. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del factor inducible por hipoxia, por ejemplo, N-oxaloilglicina, o quercetina. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA). En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
Definiciones
Un "polipeptido Oct" se refiere a cualquiera de los miembros que se producen naturalmente de la familia de octameros de los factores de transcripcion, o sus variantes que mantienen la actividad del factor de transcripcion, por ejemplo, en al menos un 50%, 80% o 90% de actividad en comparacion con el miembro de la familia mas estrechamente relacionado que se produce naturalmente, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union de ADN del miembro de la familia que se produce naturalmente, y puede comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Los polipeptidos Oct ilustrativos incluyen, Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9, y Oct-11. por ejemplo, Oct3/4 (denominado en el presente documento "Oct4") contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoacidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2, y uric-86. Vease, Ryan, A.K. y Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997). En algunos aspectos, las variantes tienen al menos un 85%, 90% o 95% de identidad de la secuencia de aminoacidos a traves de su secuencia completa en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido Oct que se produce naturalmente tal como los relacionados anteriormente o tal como los relacionados en el numero de registro del Genbank NP_002692.2 (Oct4 humano) o NP_038661.1 (Oct4 de raton). Los polipeptidos Oct (por ejemplo, Oct3/4) pueden ser de ser humano, raton, rata, bovino, porcino, u otros animales. En general, las mismas especies de protemas se usaran con las especies de celulas que se estan manipulando.
Un "polipeptido Klf" se refiere a cualquiera de los miembros que se producen naturalmente de la familia de los factores analogos a Kruppel (Klf), protemas de dedo de cinc que contienen secuencias de aminoacidos similares a las del Kruppel regulador del modelo embrionario de Drosophila, o variantes de los miembros que se producen naturalmente que mantienen la actividad del factor de transcripcion, similar, por ejemplo, en al menos un 50%, 80% o 90% de actividad en comparacion con el miembro de la familia mas estrechamente relacionado que se produce naturalmente, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union de ADN del miembro de la familia que se produce naturalmente, y puede comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Vease, Dang, D.T., Pevsner, J. & Yang, V.W. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Los miembros de la familia Klf ilustrativos incluyen, Klfl, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16, y Klf17. Se ha descubierto que Klf2 y Klf-4 eran factores capaces de generar celulas iPS en ratones, y los genes Klf1 y Klf5 relacionados tambien lo hacen, aunque con eficacia reducida. Vease, Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007). En algunos aspectos, las variantes tienen al menos un 85%, 90% o 95% de identidad de la secuencia de aminoacidos a traves de su secuencia completa en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido Klf que se produce naturalmente tal como los relacionados anteriormente o tal como los relacionados en el numero de registro del Genbank CAX16088 (Klf4 de raton) o CAX14962 (Klf4 humano). Los polipeptidos Klf (por ejemplo, Klfl, Klf4, y Klf5) pueden ser de ser humano, raton, rata, bovino, porcino, u otros animales. En general, las mismas especies de protemas se usaran con las especies de celulas que se estan manipulando. En la medida en la que un polipeptido Klf se describe en el presente documento, se puede sustituir con un polipeptido del receptor beta relacionado con estrogeno (Essrb). Por lo tanto, se pretende que para cada aspecto de polipeptido Klf descrito en el presente documento, se describa igualmente un aspecto correspondiente usando Essrb en lugar de un polipeptido Klf4.
Un "polipeptido Myc" se refiere a cualquiera de los miembros que se producen naturalmente de la familia de la familia Myc (vease, por ejemplo, Adhikary, S. y Eilers, M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635-645 (2005)), o sus variantes que mantienen la actividad del factor de transcripcion, por ejemplo, en al menos un 50%, 80% o 90% de actividad en
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comparacion con el miembro de la familia mas estrechamente relacionado que se produce naturalmente, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union de ADN del miembro de la familia que se produce naturalmente, y puede comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Los polipeptidos Myc ilustrativos incluyen, por ejemplo, c-Myc, N-Myc y L-Myc. En algunos aspectos, las variantes tienen al menos un 85%, 90% o 95% de identidad en la secuencia de aminoacidos a traves de su secuencia completa en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido Myc que se produce naturalmente, tal como los relacionados anteriormente o tal como los relacionados en el numero de acceso al Genbank CAA25015 (Myc humano). Los polipeptidos Myc (por ejemplo, c-Myc) pueden ser de ser humano, raton, rata, bovino, porcino, u otros animales. En general, las mismas especies de protemas se usaran con las especies de celulas que se estan manipulando. En la medida en la que un polipeptido Myc se describe en el presente documento, se puede sustituir con un polipeptido Wnt, por ejemplo, Wnt 3A (por ejemplo, NP_149122.1), o el agente que estimula la ruta de senalizacion de Wnt, por ejemplo, un inhibidor alfa o beta de la glucogeno sintasa quinasa. Por lo tanto, se pretende que para cada aspecto del polipeptido Myc descrito en el presente documento, se describa igualmente un aspecto correspondiente usando un polipeptido Wnt o agente que estimula la ruta de senalizacion de Wnt en lugar de un polipeptido Myc.
Un "polipeptido Sox" se refiere a cualquiera de los miembros de los factores de transcripcion HMG-box (Sox) relacionados con SRY, caracterizado por la presencia del dominio del grupo de elevada movilidad (HMG), o sus variantes, que mantienen la actividad del factor de transcripcion, por ejemplo, en al menos un 50%, 80% o 90% de actividad en comparacion con el miembro de la familia mas estrechamente relacionado que se produce naturalmente, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union de ADN del miembro de la familia que se produce naturalmente, y puede comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Vease, por ejemplo, Dang, D.T., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000). Los polipeptidos Sox ilustrativos incluyen, por ejemplo, Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21, y Sox30. Se ha demostrado que Sox1 produce celulas iPS con una eficacia similar a Sox2, y los genes Sox3, So15, y Sox18 han mostrado tambien generar celulas iPS, aunque con algo menos de eficacia que Sox2. Vease, Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101 - 106 (2007). En algunos aspectos, las variantes tienen al menos un 85%, 90% o 95% de identidad de la secuencia de aminoacidos a traves de su secuencia completa en comparacion con un miembro de la familia del polipeptido Sox que se produce naturalmente tal como los relacionados anteriormente o tal como los relacionados en el numero de registro del Genbank CAA83435 (Sox2 humano). Los polipeptidos Sox (por ejemplo, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, o So18) pueden ser de ser humano, raton, rata, bovino, porcino, u otros animales. En general, las mismas especies de protemas se usaran con las especies de celulas que se estan manipulando.
Un "factor de transcripcion exogeno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un factor de transcripcion que no se expresa naturalmente (es decir, de forma endogena) expresado en una celula de interes. Por lo tanto, un factor de transcripcion exogeno puede expresarse a partir de un casete de expresion introducido (por ejemplo, bajo el control de un promotor diferente de un promotor del factor de transcripcion nativo) o se puede introducir como una protema desde el exterior de la celula. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende un polipeptido Oct (por ejemplo, Oct4), un polipeptido Klf (por ejemplo, Klf4), un polipeptido Myc (por ejemplo, c-Myc), o un polipeptido Sox (por ejemplo, Sox2).
"H3K9" se refiere a la lisina 9 de la histona H3. Las modificaciones de H3K9 asociadas con la actividad genica incluyen la acetilacion de H3K9 y las modificaciones de H3K9 asociadas con la heterocromatina, incluyen la dimetilacion o trimetilacion de H3K9. Vease, por ejemplo, Kubicek, et al., Mol. Cell 473-481 (2007). "H3K4" se refiere a la lisina 4 de la histona H3. Vease, por ejemplo, Ruthenburg et al., Mol. Cell 25:15-30 (2007).
El termino "pluripotente" o "pluripotencia" se refiere a celulas con la capacidad de dar lugar a una progenie que puede experimentar diferenciacion, en las condiciones adecuadas, para dar tipos celulares que demuestran en su conjunto caractensticas asociadas con linajes celulares procedentes de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo, y ectodermo). Los citoblastos pluripotentes pueden contribuir a muchos o a todos los tejidos de un animal prenatal, postnatal o adulto. Se puede utilizar un ensayo normalizado aceptado en la tecnica, tal como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, para establecer la pluripotencia de una poblacion de celulas, sin embargo, se puede usar tambien la identificacion de diversas caractensticas de los citoblastos pluripotentes para detectar celulas pluripotentes.
"Caractensticas de citoblastos pluripotentes" se refiere a las caractensticas de una celula que distinguen los citoblastos pluripotentes de otras celulas. La capacidad para dar lugar a una progenie que puede experimentar diferenciacion, en las condiciones adecuadas, para dar tipos celulares que demuestran en su conjunto caractensticas asociadas con linajes celulares procedentes de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo, y ectodermo) es una caractenstica del citoblasto pluripotente. La expresion o la no expresion de determinadas combinaciones de marcadores moleculares son tambien caractensticas de citoblastos pluripotentes. Por ejemplo, los citoblastos pluripotentes humanos expresan al menos uno, dos, o tres, y opcionalmente todos, los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rex1, y Nanog. Las morfologfas celulares asociadas con los citoblastos pluripotentes son tambien caractensticas de citoblastos pluripotentes.
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Un polinucleotido "recombinante" es un polinucleotido que no esta en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que no se encuentra en la naturaleza, o el polinucleotido esta en un contexto diferente del que se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, separado de secuencias de nucleotidos con las que esta normalmente proximo en la naturaleza, o adyacente (o contiguo con) las secuencias de nucleotidos con las cuales no esta normalmente proximo. Por ejemplo, la secuencia en cuestion puede ser clonada en un vector, o recombinada de otra forma con uno o mas acidos nucleicos adicionales.
"Casete de expresion" se refiere a un polinucleotido que comprende un promotor u otra secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia que codifica una protema.
Los terminos "promotor" y "secuencia control de la expresion" se utilizan en el presente documento para referirse a una matriz de secuencias control de acido nucleico que dirigen la transcripcion de un acido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, un promotor incluye las secuencias de acidos nucleicos necesarias proximas al sitio de inicio de la transcripcion, tales como, en el caso de un promotor del tipo de la polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor incluye tambien opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden localizarse como mucho a varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripcion. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayona de condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulacion ambiental o de desarrollo. El termino "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia control de la expresion de un acido nucleico (tal como un promotor, o matriz de sitios de union del factor de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en la que la secuencia control de la expresion dirige la transcripcion del acido nucleico que corresponde a la segunda secuencia.
Una "secuencia heterologa" o un "acido nucleico heterologo", tal como se usa en el presente documento, es la que se origina de una fuente extrana a la celula hospedadora concreta, o, si desde la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. Por lo tanto, un casete de expresion heterologo en una celula es un casete de expresion que no es endogeno para la celula hospedadora concreta, por ejemplo, uniendose a las secuencias de nucleotidos a partir de un vector de expresion en lugar de un ADN cromosomico, que esta unido a un promotor heterologo, que esta unido a un gen indicador, etc.
Los terminos "acido nucleico" y "polinucleotido" se usan de manera indistinta en el presente documento para referirse a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y sus polfmeros tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. El termino abarca acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotidos conocidos o restos o enlaces de estructuras modificadas, que son sinteticas, que se producen naturalmente, y que no se producen naturalmente, que tienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleotidos de referencia. Los ejemplos de dichos analogos incluyen, sin limitacion, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleotidos, acidos peptidonucleicos (PNA).
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de acido nucleico concreta tambien abarca sus variantes modificadas conservativamente (por ejemplo, las sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias, asf como la secuencia explfcitamente indicada. Espedficamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) se sustituye con una base mixta y/o restos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
Los "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de la expresion o de la actividad se usan para referirse a moleculas inhibidoras, activadoras, o moduladoras, respectivamente, identificadas utilizando ensayos in vitro e in vivo para determinar la expresion o actividad de una protema diana descrita, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homologos y mimeticos. El termino "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresion o se unen para bloquear parcial o totalmente la estimulacion o la actividad inhibidora de la proteasa, disminuyen, previenen, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan, o regulan por defecto la actividad de la protema diana descrita, por ejemplo, los antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresion de una protema diana descrita o se unen para, estimular, aumentar, abrir, activar, facilitar, potenciar la activacion o la actividad inhibidora de la proteasa, sensibilizar o regular en exceso la actividad de la protema diana descrita (o el polinucleotido de codificacion), por ejemplo, los agonistas. Los moduladores incluyen ligandos que se producen naturalmente y ligandos sinteticos, antagonistas y agonistas (por ejemplo, moleculas qmmicas pequenas, anticuerpos y analogos que funcionan como agonistas o como antagonistas). Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, aplicar posibles compuestos moduladores a las celulas que expresan la protema diana descrita y a continuacion determinar los efectos funcionales sobre la actividad de la protema diana descrita, tal como se describe anteriormente. Las muestras o ensayos que comprenden la protema diana descrita que se tratan con un potencial activador, inhibidor, o modulador se comparan con las muestras del control sin el inhibidor, activador, o modulador para examinar la extension del efecto. Las muestras del control (no tratadas con moduladores) se asignan a un valor de actividad relativa del 100%. Se consigue la inhibicion de una protema diana descrita cuando el valor de actividad relativa con respecto al control es aproximadamente del 80%, opcionalmente 50% o 25%, 10%, 5% o 1%. Se consigue la activacion de la protema
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diana descrita cuando el valor de actividad relativa con respecto al control es del 110%, opcionalmente del 150%, opcionalmente del 200, 300%, 400%, 500%, o 1000-3000% o mucho mayor.
El termino "alosterico" se usa para referirse a un efecto que influye sobre la actividad de una parte de una enzima (tal como un sitio activo) mediante la union de una molecula a un sitio diferente (sitio regulador) en una localizacion diferente en la enzima. La union de moleculas no de sustrato en sitios alostericos influye sobre la cinetica de union del sitio de union al sustrato (activo). Los "sitios de union alostericos" estan contenidos en muchas enzimas y receptores. Como resultado de la union a los sitios de union alostericos, la interaccion con el ligando normal puede tanto potenciarse como reducirse. Por ejemplo, un sitio de union alosterico en quinasa dependiente de 3'- fosfoinosftido-1 (PDK1) es la bolsa de union con el fragmento que interactua con PDK1 (PIF) situada entre la helice C, la helice B y las hojas 4 y 5 (Pearl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 761-767 (2002); Biondi et al., Biochem. J. 372, 1-13 (2003); Newton et al., Chem. Rev. 101,2353-2364 (2001)).
Tal como se usa en el presente documento, "promueve" o "aumenta", o "promover" o "aumentar" se utilizan de forma indistinta en el presente documento. Estos terminos se refieren al aumento en un parametro medido (por ejemplo, actividad, expresion, glucolisis, metabolismo glucolftico, captacion de glucosa, la biosmtesis posterior a la glucolisis) en una celula tratada (tejido o sujeto) en comparacion con una celula no tratada (tejido o sujeto). Se puede hacer tambien una comparacion de la misma celula o tejido o sujeto entre antes y despues del tratamiento. El aumento es suficiente para ser detectable. En algunos aspectos, el aumento en la celula tratada es de al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o mas en comparacion con una celula no tratada.
Tal como se usa en el presente documento, "inhibir", "evitar" o "reducir" o "que inhibe" "que evita" o "que reduce" se usan de manera indistinta en el presente documento. Estos terminos se refieren a la disminucion en un parametro medido (por ejemplo, actividad, expresion, respiracion mitocondrial, oxidacion mitocondrial, fosforilacion oxidativa) en una celula tratada (tejido o sujeto) en comparacion con una celula no tratada (tejido o sujeto). Se puede hacer tambien una comparacion de la misma celula o tejido o sujeto entre antes y despues del tratamiento. La disminucion es suficiente para ser detectable. En algunos aspectos, la disminucion en la celula tratada es al menos de aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o esta completamente inhibida en comparacion con una celula no tratada. En algunos aspectos, el parametro medido es indetectable (es decir, esta completamente inhibido) en la celula tratada en comparacion con la celula no tratada.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Generacion de citoblastos pluripotentes inducidos humanos procedentes de queratinocitos primarios mediante un solo gen, OCT4, y moleculas pequenas. (a) El tratamiento con PD0325901 (PD) 0,5 |jM y A-83-01 (A83) 0,5 |jM aumento significativamente la generacion de iPSC procedentes de queratinocitos humanos primarios transducidos tanto con 4TF (4F, OKSM) o 3TF (3F, OKS). Se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm. (b) Los cribados qmmicos adicionales identificaron PS48, NaB, y su combinacion, que pueden potenciar sustancialmente la reprogramacion de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2Tf (OK). Se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm. (c) Esquema experimental para la generacion de iPSC humanos procedentes de queratinocitos humanos primarios transducidos mediante un unico gen de reprogramacion, OCT4. KCM, medio de cultivo de queratinocitos; hESCM, medio de cultivo de ESC humanos. (d) Inmunotincion en vivo con TRA-1-81 de colonias de iPSC que se generaron a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TF/OK o 1TF/OCT4 antes del repicado de las colonias. (e) Las celulas iPSC-OK e iPSC-O humanas establecidas expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo ALP (fosfatasa alcalina), OCT4, SOX2, NANOG, SSEA-4 y TRA-1-81. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 2. Caracterizaciones en profundidad de celulas iPSC-OK e iPSC-O humanas. (a) Analisis de expresion mediante RT-PCR de los genes de pluripotencia endogenos y OCT4 y KLF4 exogenos. Se uso GAPDH como un control de entrada. (b) Analisis de metilacion de los promotores OCT4 y NANOG mediante secuenciacion genomica con bisulfato. Los drculos abiertos y los drculos cerrados indican CpG sin metilar y metilados en las regiones promotoras, respectivamente. (c) Graficas de dispersion que comparan los modelos de expresion genica global entre las celulas iPSC-O y NHEK, y hESC. Las posiciones de los genes de pluripotencia OCT4, NANOG, y SOX2 se muestran mediante flechas. Las lmeas negras indican el equivalente lineal y dos veces de cambio en los niveles de expresion genica entre las muestras. (d) iPSC-OK e iPSC-O humanas podnan diferenciarse eficazmente in vitro en celulas en las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neurales (tubulina pIII+), celulas mesodermicas (SMA+), y celulas endodermicas (AFP+), utilizando el metodo EB. (e) Ensayo de la PCR cuantitativa de los tres marcadores de capas germinales procedentes de iPSC humanos diferenciados utilizando el metodo EB: ectodermo (PAX6, TuBuLINA fiIII), mesodermo (FOXF1, HAND1) y endodermo (AFP, GATA6). Los datos denotan veces de cambio normalizadas para GAPDH con respecto a iPSC humanos parenterales indiferenciados. (f) iPSC-OK e iPSC-O humanas podnan producir eficazmente un teratoma completo, que contiene celulas diferenciadas en las tres capas germinales, en ratones SCID.
Figura 3. Generacion y caracterizacion de citoblastos pluripotentes inducidos humanos procedentes de
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celulas endoteliales de la vena umbilical humana por un unico gen, OCT4, y moleculas pequenas. (a)
Esquema experimental de la generacion de iPSC humanos procedentes de HUVEC transducidas por OCT4. HCM, medio de cultivo HUVEC; hESCM, medio de cultivo de ESC humanos. (b) Las celulas hiPSC-O establecidas procedentes de HUVEC expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG y SSEA- 4. Los nucleos se tineron con DAPI. (c) Analisis de expresion mediante la RT-PCR de los genes de pluripotencia endogenos. Se uso GAPDH como un control de entrada. (d) Analisis de metilacion de los promotores OCT4 y NANOG mediante secuenciacion genomica con bisulfato. Los drculos abiertos y los drculos cerrados indican CpG sin metilar y metilados en las regiones promotoras, respectivamente. (e) Las celulas hiPSC-O procedentes de HUVEC podnan diferenciarse eficazmente in vitro en celulas de las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neurales (tubulina pIII+), celulas mesodermicas (SMA+), y celulas endodermicas (AFP+), utilizando el metodo EB. (f) Las celulas hiPSC-O podnan producir eficazmente un teratoma completo, que contiene celulas diferenciadas en las tres capas germinales en ratones SCID.
Figura 4. Caracterizacion de celulas iPSC-O humanas procedentes de AHEK. (a) Las celulas hiPSC-O establecidas procedentes de queratinocitos adultos expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI. (b) Estas celulas hiPSC-O podnan diferenciarse eficazmente in vitro en celulas de las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neurales (tubulina pIII+), celulas mesodermicas (SMA+), y celulas endodermicas (AFP+), utilizando el metodo EB.
Figura 5. Caracterizacion de celulas iPSC-O humanas procedentes de AFDC. (a) Las celulas hiPSC-O establecidas procedentes de celulas derivadas de fluido amniotico expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI. (b) Estas celulas hiPSC-O podnan diferenciarse eficazmente in vitro en celulas de las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neurales (tubulina pNI+), celulas mesodermicas (SMA+), y celulas endodermicas (AFP+), utilizando el metodo EB.
Figura 6. Las lmeas de celulas hiPSC adicionales expresan marcadores de pluripotencia tfpicos. Las otras lmeas de celulas hiPSC-O establecidas expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 7. Cultivo sin alimentador de lmeas de celulas hiPSC. Las celulas hiPSC se dividieron sobre placas revestidas con Matrigel/ECM en medio hESC qmmicamente definido como se ha notificado anteriormente. Estas hiPSC podnan mantenerse y expandirse en un entorno sin alimentador. Las ICC mostraron la expresion de marcadores de pluripotencia, OCT4 y SSEA4. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 8. Genotipacion de hiPSC. El analisis de la RT-PCR utilizando ADN genomico muestra que solo el transgen OCT4 se integro en el genoma de las lmeas hiPSC-O (hiPSC-O#1, hiPSC-O#3, hiPSC-O#2l, hiPSC- O#26 y hiPSC-O#31). NHEK (a) y HUVEC (b) se utilizaron como controles negativos, aunque se usaron vectores como controles positivos.
Figura 9. Integracion del transgen OCT4 en hiPSC. Se digirio ADN genomico (10 |jg) con EcoRI y se hibrido con la sonda de ADNc OCT4 (un fragmento EcoRI/SpeI de pSin-EF2-OCT4-Pur). Se detectaron multiples integraciones transgenicas.
Figura 10. Cariotipacion de lmeas de celulas hiPSC. La diseminacion de hiPSC-O# 1 (a) e hiPSC-O# 21 (b) en la metafase muestra un cariotipo normal tras el pase 15.
Figura 11. PS48 potencia el proceso de reprogramacion facilitando un cambio metabolico hacia la glucolisis. (a) El tratamiento con PS48 activo la actividad de PDK1. Analisis de transferencia Western de la fosforilacion de Akt (Thr-308) tras el tratamiento con PS48 (5 jM) o UCN-01(20 nM). (b) PS48 potencio la reprogramacion de NHEK, mientras que UCN-01 (un inhibidor de pDk1) o 2-Desoxi-D-glucosa (10 mM) (2-DG, un inhibidor de la glucolisis) inhibio el proceso de reprogramacion. Se sembraron NHEK transducidas con tres factores (Klf, Sox, y Oct) a una densidad de 100.000 celulas transducidas por pocillo, se trataron con compuestos durante cuatro semanas, y a continuacion se contaron las colonias positivas para TRA-1-81. (c) El tratamiento con PS48 facilito/activo un cambio metabolico hacia la glucolisis, mientras que el tratamiento de UCN-01 o 2-DG inhibio la glucolisis. Se trataron las NHEK bien con PS48, PS48 y UCN-01, o bien con PS48 y 2-DG durante 8 d y a continuacion se midio la produccion de lactato en el medio como un mdice tfpico de la glucolisis utilizando el Kit de ensayo del lactato (BioVision, Mountain View, CA, EE.UU.). (d) El tratamiento con PS48 regulo en exceso la expresion de algunos genes glucoltticos clave, incluyendo GLUT1, HK2, PFK1 y LDHA. (e) Las moleculas pequenas conocidas que se han utilizado ampliamente para modular la respiracion mitocondrial, el metabolismo glucolftico o la activacion de HIF mostraron tambien efectos consistentes correspondientes sobre la reprogramacion. Se sembraron HUVEC transducidas con cuatro factores (Klf, Sox, Myc, y Oct) a una densidad de 20.000 celulas transducidas por pocillo, se trataron con compuestos moduladores del metabolismo durante tres semanas y se contaron las colonias positivas para TRA-1-81. F2,6P, Fructosa 2,6-bisfosfato 10 mM; F6P, Fructosa 6-fosfato 10 mM; 6-AN, 6-Aminonicotinamida 10 jM; OA, Oxalato 10 jM; DNP, 2,4-dinitrophenol 1 jM; NOG, N-oxaloilglicina 1 jM; QC, Quercetina 1 jM; 2-HA, Acido 2-hidroxiglutarico 10 jM; NA, Acido nicotmico 10 jM; Se uso DMSO como control.
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Descripcion detallada
I. Introduccion
La presente divulgacion se basa en el sorprendente descubrimiento de que un activador de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) aumenta mucho la eficacia de induccion de la pluripotencia en celulas de mamfero no pluripotentes. Por consiguiente, la presente divulgacion de metodos para inducir pluripotencia en celulas de mamftero no pluripotentes en el que el metodo comprende poner en contacto las celulas no pluripotentes con un activador de PDK1.
La presente divulgacion se basa tambien en el sorprendente descubrimiento de que los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico como se describe en el presente documento aumentan mucho la eficacia de induccion de la pluripotencia en celulas de mamfero no pluripotentes. Se ha descubierto que los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico facilitan la reprogramacion metabolica a partir de la oxidacion mitocondrial (utilizada principalmente por celulas somaticas adultas) hacia la glucolisis (utilizada principalmente por embriocitoblastos (ESC)), induciendo por tanto la pluripotencia en celulas de mamfero no pluripotentes. Los compuestos que promueven la glucolisis o los compuestos que inhiben o impiden la respiracion/oxidacion mitocondrial son, por tanto, utiles para inducir la pluripotencia en celulas de mai^ero no pluripotentes. Ademas, se ha descubierto que los compuestos que promueven un proceso tanto antes (por ejemplo, la ruta PDK1, la ruta del factor inducible por hipoxia, la ruta del transportador de captacion de glucosa) como despues de la glucolisis (por ejemplo, la smtesis de acidos grasos, la smtesis de ftpidos, la smtesis de nucleotidos, y la smtesis de aminoacidos) son utiles para inducir pluripotencia en celulas de mamfero no pluripotentes. Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona los metodos de inducir la pluripotencia en celulas de mamffero no pluripotentes en los que el metodo comprende poner en contacto las celulas no pluripotentes con uno o mas compuestos que promueven el metabolismo glucolftico como se describe en el presente documento.
Hasta la fecha, se ha establecido un gran numero de metodos y protocolos diferentes para inducir celulas de mamffero no pluripotentes en citoblastos pluripotentes inducidos (iPSc). Se cree que los agentes descritos en el presente documento pueden utilizarse en combinacion con esencialmente cualquier protocolo para generar iPSC y por tanto, mejorar la eficacia del protocolo. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona la incubacion de celulas no pluripotentes con al menos un activador de PDK1, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un activador de PDK1 alosterico, en combinacion con cualquier protocolo para generar iPSC. En otros aspectos, la presente divulgacion proporciona la incubacion de celulas no pluripotentes con al menos un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico en combinacion con cualquier protocolo para generar iPSC.
Tal como se usa en el presente documento, "eficacia de induccion", con respecto a la induccion de una celula no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, se refiere al numero de celulas no pluripotentes que se pueden convertir en iPSC en un marco de tiempo definido, o la cantidad de tiempo que tarda en convertirse un numero definido de celulas no pluripotentes en iPSC, en condiciones suficientes para inducir citoblastos pluripotentes. El aumento en la eficacia de un protocolo de generacion de iPSC dependera del protocolo y de que agentes se utilizan. En algunos aspectos, la eficacia aumenta en al menos un 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300% o mas en comparacion con el mismo protocolo sin la inclusion de los agentes utilizados de acuerdo con la divulgacion (por ejemplo, un activador de PDK1, por ejemplo, un activador de PDK1 alosterico, o un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, por ejemplo, activadores de PDK1, activadores de la glucolisis, sustratos de la glucolisis, intermedios glucolfticos y sus precursores metabolicos, activadores del transportador de captacion de la glucosa, moduladores de la respiracion mitocondrial tales como inhibidores de la fosforilacion oxidativa, y activadores del factor inducible por hipoxia). En algunos aspectos, la eficacia se mide con respecto al aumento del numero de iPSC generados en un marco de tiempo concreto (por ejemplo, comparando el numero de iPSC generados a partir de celulas no pluripotentes en un marco de tiempo definido en condiciones que comprenden la introduccion de uno o mas agentes utilizados de acuerdo con la divulgacion con el numero de iPSC generados a partir de celulas no pluripotentes en un marco de tiempo de tiempo definido, en condiciones que no comprenden la introduccion de uno o mas agentes utilizados de acuerdo con la divulgacion). En algunos aspectos, la eficacia se mide con respecto al aumento de la velocidad mediante el cual se generan los iPSC (por ejemplo, comparando el lapso de tiempo que se tarda en generar un numero definido de iPSC a partir de celulas no pluripotentes en condiciones que comprenden la introduccion de uno o mas agentes utilizados de acuerdo con la divulgacion con el lapso de tiempo que se tarda en generar un numero definido de iPSC a partir de celulas no pluripotentes en condiciones que no comprenden la introduccion de uno o mas agentes). En algunos aspectos, la eficacia de la induccion se mide en condiciones que comprenden transducir celulas no pluripotentes (por ejemplo, queratinocitos epidermicos humanos normales) con Oct4 y Klf4, a continuacion cultivar las celulas transducidas en ausencia o presencia de uno o mas agentes utilizados de acuerdo con la divulgacion (por ejemplo, un activador de PDK1), como se describe a continuacion en la seccion de Ejemplos. Se puede medir la induccion de iPSC a partir de celulas no pluripotentes de acuerdo con cualquier metodo conocido en la materia, incluyendo, aunque no de forma limitativa el analisis de marcadores (por ejemplo, utilizando marcadores de pluripotencia Tra-1-81 y/u OCT4).
De acuerdo con los metodos de la presente divulgacion, los regfmenes de tratamiento espedficos, dependientes del contexto, pueden mejorar la eficacia de la reprogramacion. La eficacia de un determinado regimen de tratamiento
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puede depender, en algunos aspectos, de los tipos de celulas, el numero de pasos de celulas, y los factores de transcripcion exogenos utilizados. Por ejemplo, en algunos aspectos, se puede observar una mejora mas significativa en la eficacia de la reprogramacion mediante un regimen de tratamiento espedfico cuando las celulas en reprogramacion transducidas con o en contacto con menos de cuatro factores de transcripcion exogenos, es dear, con uno, dos, o tres factores de transcripcion exogenos, en comparacion con las celulas en reprogramacion transducidas con o en contacto con cuatro factores de transcripcion exogenos.
Por lo general, las celulas humanas pueden tardar considerablemente mas tiempo (por ejemplo, 6-8 semanas) en reprogramarse que las celulas de raton (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas). Los efectos de un regimen de tratamiento espedfico, en algunos aspectos, pueden ser mas exagerados cuando las celulas humanas en reprogramacion se comparan con las celulas de raton. Por consiguiente, cuando se usan periodos mas largos (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, o mas semanas) en la reprogramacion, se puede usar un regimen de tratamiento, por ejemplo, uno que utilice un modificador epigenetico, para mejorar la eficacia de la reprogramacion.
Los inventores han encontrado que los modificadores epigeneticos pueden mejorar la eficacia de la reprogramacion. Como se define en el presente documento, el termino "modificador epigenetico" se refiere a un agente modificador de la metilacion (es decir, agentes que inducen cambios producidos por metilacion en el ADN o las histonas) y/o un agente modificador de la acetilacion (es decir, agentes que inducen cambios producidos por acetilacion en el ADN o las histonas). En algunos aspectos, el agente modificador de la metilacion es un inhibidor de la metilacion del ADN (por ejemplo, un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) tal como RG108)), el inhibidor de la histona y/o el inhibidor de la desmetilacion de la histona. En algunos aspectos, el agente modificador de la acetilacion es un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) (por ejemplo, acido valproico (VPA), butirato de sodio (NaB), tricostatina A (TSA), o acido suberoilanilida hidroxamico (SAHA)), un inhibidor de la histona acetiltransferasa (HAT),un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), histona desacetilasa e histona acetiltransferasa. En algunos aspectos, los modificadores epigeneticos son agentes que inhiben las metiltransferasas o las desmetilasas o agentes que activan las metiltransferasas o desmetilasas. En algunos aspectos, el modificador epigenetico es un agente que inhibe la metilacion de la histona H3K9 o promueve la desmetilacion de H3K9, por ejemplo, una G9a histona metiltransferasa tal como BIX01294.
Algunos modificadores epigeneticos, sin embargo, pueden inducir tambien la diferenciacion celular. Por consiguiente, en algunos aspectos, los modificadores epigeneticos se usan solo en una etapa inicial del tratamiento, por ejemplo, en las primeras 1,2, 3 o 4 semanas, en la primera mitad, el primer tercio, el primer cuarto, o el primer quinto del periodo de tratamiento. Omitiendo los modificadores epigeneticos en la ultima etapa del tratamiento, por ejemplo, en las ultimas 1, 2, 3 o 4 semanas, en la ultima mitad, el ultimo tercio, el ultimo cuarto, o el ultimo quinto del periodo de tratamiento, pueden evitarse, al menos parcialmente los efectos secundarios de inducir la diferenciacion celular mediante estos modificadores epigeneticos.
Como alternativa, se pueden usar modificadores epigeneticos que no inducen la diferenciacion, o inducen solo mmimamente la diferenciacion. Por ejemplo, cuando se usa un inhibidor de HDAC en un regimen de tratamiento, se usa un inhibidor de HDAC que no induce la diferenciacion o solo induce mmimamente la diferenciacion por ejemplo, butirato de sodio.
Se ha descubierto adicionalmente que el regimen de tratamiento que utiliza inhibidores de MEK puede mejorar la eficacia de la reprogramacion. Los inhibidores de MEK soportan tambien la autorrenovacion celular de las celulas pluripotentes inducidas. Algunos inhibidores de MEK, sin embargo, pueden inhibir la proliferacion celular. Por consiguiente, en algunos aspectos, los inhibidores de MEK se usan solo en la ultima etapa del tratamiento, por ejemplo, en las ultimas 1, 2, 3 o 4 semanas, en la ultima mitad, el ultimo tercio, el ultimo cuarto, o el ultimo quinto del periodo de tratamiento. Omitiendo los inhibidores de MEK en la etapa inicial del tratamiento, por ejemplo, en las primeras 1, 2, 3 o 4 semanas, en la primera mitad, el primer tercio, el primer cuarto, o el primer quinto del periodo de tratamiento, la proliferacion celular no se inhibe en la etapa inicial. Por ejemplo, se puede inducir la pluripotencia poniendo en contacto una celula de mairnfero no pluripotente con un activador de PDK1 o con un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1) en ausencia de un inhibidor de MEK en la etapa inicial, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1 o un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1) y un inhibidor de MEK en la ultima etapa. En algunos aspectos, el metodo de inducir la pluripotencia comprende poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1 o con un compuesto que promueva el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1), un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, y un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) en la etapa inicial, seguido por poner en contacto la celula no pluripotente con un activador de PDK1 o con un compuesto que promueva el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1), un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) y un inhibidor de MEK en la etapa inicial.
II. Activadores de PDK1
Quinasa dependiente de 3’-fosfoinosftido-1 o "PDK1" es una quinasa maestra asociada con la activacion de AKT/PKB y muchas otras quinasas AGC incluyendo PKC, S6K, SGK. Un importante papel de PDK1 esta en las rutas de senalizacion activadas mediante diversos factores de crecimiento y hormonas que incluyen la senalizacion de la
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insulina. La estructura de PDK1 puede dividirse en dos dominios; la quinasa o el dominio catalftico y el dominio PH. El dominio PH funciona principalmente en la interaccion de PDK1 con fosfatidilinositol (3,4)-bisfosfato y fosfatidilinositol (3,4,5)-trisfosfato que es importante en la localizacion y activacion de algunos sustratos de PDK1 asociados a membrana que incluyen AKT. El dominio de la quinasa tiene tres sitios de union a ligando; el sitio de union al sustrato, el sitio de union a ATP, y la bolsa de union a PIF. Algunos sustratos de PDK1 incluyendo S6K y la protema quinasa C requieren la union a esta bolsa de union a PIF. Los activadores alostericos de molecula pequena de PDK1 mostraron inhibir selectivamente la activacion de los sustratos que requieren una interaccion en el sitio de acoplamiento. Estos compuestos no se unen al sitio activo y permiten que PDK1 active otros sustratos que no requieren interaccion en el sitio de acoplamiento. PDK1 es constitutivamente activo y actualmente no existen protemas inhibidoras conocidas para PDK1. Se cree que la activacion del efector principal de PDK1, AKT, requiere una orientacion adecuada de la quinasa y los dominios PH de PDK1 y AKT en la membrana. quinasa dependiente de fosfoinosftido-1 ha mostrado interactuar con SGK, PRKACA, Cofactor 2 regulador del intercambio de sodio- hidrogeno, PRKCD, Protema quinasa MZ (PKMzeta), PKN2, PRKCI, Protema quinasa N1, YWHAH y AKT1.
Los activadores de PDK1 ilustrativos incluyen esfingosina (King et al., Journal of Biological Chemistry, 275:1810818113, 2000). Los activadores alostericos ilustrativos de pDk1 incluyen PS48 (acido (Z)-5-(4-clorofenil)-3-fenilpent- 2-enoico), PS08 (acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3-fenilpent-2-enoico) (Hindie et al., Nature Chemical Biology, 5:758-764, 2009; Huse y Kuriyan, Cell 109: 275-282, 2002; Johnson & Lewis, Chem. Rev. 101:2209-2242, 2001), y el compuesto 1 (acido 2-(3-(4-clorofenil)-3-oxo-1-fenilpropiltio)acetico) (Engel et al., EMBO J. 25: 5469-5480, 2006); acidos 3,5-difenilpent-2-enoico tales como el compuesto 12Z y el compuesto 13Z (12Z: acido 2-(3-(4-clorofenil)-3- oxo-1-denilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3-fenilpent-2-enoico; 13Z: acido (Z)-5-(1H-indol-3-il)-3- fenilpent-2-enoico (Stroba et al., J. Med. Chem. 52, 4683-4693 (2009)). PS48 tiene la siguiente formula:
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Como se muestra en los Ejemplos, la inclusion de un activador de PDK1 en la reprogramacion celular puede aumentar la eficacia mucho cuando se usa solo y da como resultado incluso aumentos de eficacia adicionales cuando se usa en combinacion con un inhibidor de HDAC. Pueden incluirse tambien inhibidores adicionales, que incluyen, aunque no de forma limitativa, un inhibidor de ALK5 y/o un inhibidor de Mek, como se muestra en los Ejemplos, en la reprogramacion, particularmente cuando menos de los cuatro factores de transcripcion (Oct4, Klf4, Sox2, y c-Myc) se introducen en la celula durante la reprogramacion.
IN. Compuestos que promueven el metabolismo glucolftico
Como se define en el presente documento, un compuesto modulador del metabolismo se refiere a un compuesto que modula (por ejemplo, promueve o inhibe) el metabolismo de los hidratos de carbono u otras moleculas. Los compuestos moduladores del metabolismo incluyen compuestos que promueven el metabolismo glucolftico. Como se define en el presente documento, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico se refiere a un compuesto que facilita la reprogramacion metabolica celular desde la oxidacion mitocondrial (usada principalmente por celulas somaticas adultas) a la glucolisis (usada principalmente por los ESC). En algunos aspectos, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un compuesto que promueve la glucolisis o un compuesto que promueve un proceso antes de la glucolisis (por ejemplo, la ruta PDK1, la ruta del factor inducible por hipoxia, la ruta transportadora de captacion de la glucosa). En algunos aspectos, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un compuesto que inhibe o impide la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un compuesto que promueve un proceso despues de la glucolisis (por ejemplo, la smtesis de acidos grasos, la smtesis de ftpidos, la smtesis de nucleotidos, y la smtesis de aminoacidos). Los ejemplos de compuestos que promueven el metabolismo glucolftico incluyen activadores de PDK1, activadores de la glucolisis, sustratos de la glucolisis, intermedios glucolfticos y sus precursores metabolicos, activadores del transportador de captacion de la glucosa, moduladores de la respiracion mitocondrial tales como inhibidores de la fosforilacion oxidativa, y activadores del factor inducible por hipoxia. En algunos aspectos, un compuesto que
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promueve el metabolismo glucolftico no es un azucar sencillo (por ejemplo, un azucar sencillo comunmente utilizado en un medio de cultivo celular). Los ejemplos de azucares sencillos incluyen aldosas tales como D-glucosa, D- manosa y D-galactosa, y cetosas tales como D-fructosa.
1. Activadores de la glucolisis
Se conocen en la tecnica activadores de la glucolisis (por ejemplo, activadores de la ruta glucolftica). Se conocen en la tecnica enzimas asociadas con la ruta de la glucolisis e incluyen hexoquinasa, glucoquinasa, fosfoglucosa isomerasa, fosfofructoquinasa, aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceraldehftdo 3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfogliceromutasa, enolasa, piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa. En algunos aspectos, el activador de la glucolisis (por ejemplo, un activador de la ruta de la glucolisis) es un activador de una enzima asociada con la ruta glucolftica. En algunos aspectos, un activador de la glucolisis es un activador de una de tres enzimas concretas asociadas unicamente con la ruta glucolftica: hexoquinasa, fosfofructoquinasa, y piruvato quinasa.
Los ejemplos de activadores de la hexoquinasa incluyen fosfato, citrato, D-malato, 3-fosfoglicerato, catecolaminas y derivados de catecolaminas. En algunos aspectos, el activador de la hexoquinasa es un activador alosterico. En algunos aspectos, los activadores de la hexoquinasa no incluyen fosfato o citrato.
Los ejemplos de activadores de la glucoquinasa incluyen GKA1 (acido 6-[(3-isobutoxi-5-
isopropoxibenzoil)amino]nicotmico; Brocklehurst et al., Diabetes 53:535-541,2004), GKA2 (acido 5-({3-isopropoxi-5- [2-(3-tienil)etoxi]benzoil}amino)-1,3,4-tiadiazol-2-carboxflico; Brocklehurst et al., Diabetes 53:535-541,2004), Ro-28- 1675 (Grimsby et al., Science 301:370-373, 2003), y el compuesto A (N-Tiazol-2-il-2-amino-4-fluoro-5-(1- metilimidazol-2-il)tiobenzamida; Kamata et al., Structure 12, 429-438, 2004), LY2121260 (tiazol-2-ilamida del acido 2- (S)-ciclohexil-1-(R)-(4-metanosulfonilfenil)-ciclopropano- carboxftico; Efanov et al., Endocrinology, 146:36963701,2005). En algunos aspectos, el activador de la glucoquinasa es un activador alosterico. Se divulgan los activadores de la glucoquinasa adicionales en los documentos WO 00/058293, WO 01/44216, WO 01/83465, WO 01/83478, WO 01/85706, WO 01/85707 y WO 02/08209, WO07/075847, WO07/061923, WO07/053345, WO07/104034, WO07/089512, WO08/079787, WO08/111473, WO09/106203, WO09/140624, WO09/140624,
WO08/079787, WO02/046173, WO07/006814, WO07/006760, WO06/058923, WO02/048106, WO07/125103,
WO07/125105, WO08/012227, WO08/074694, WO08/078674, WO08/084043, WO08/084044, WO09/127544,
WO09/127546, WO07/125103, WO07/125105, WO02/014312, WO04/063179, WO07/006761, WO07/031739,
WO08/091770, WO08/116107, WO08/118718, WO09/083553, WO04/052869, WO05/123132, WO04/072066,
WO07/117381, WO07/115967, WO08/005964, WO08/154563, WO09/022179, WO09/046784, WO08/005964,
WO/10/080333, WO/03/095438, WO/06/016194, WO/05/066145, WO/07/115968, WO/07/143434, WO/08/005914,
WO/08/149382, WO/09/018065, WO/09/047798, WO/09/046802, WO/10/029461, WO/08/005914, WO/08/149382,
WO/07/143434, WO/10/103438, WO/03/047626, WO/05/095418, WO/08/104994, WO/09/082152, WO/09/082152,
WO/05/049019, WO/07/048717, WO/09/042435, y WO/09/042435.
Los ejemplos de activadores de la fosfofructoquinasa (o fructosa-6-P quinasa) incluyen fructosa 2,6-bifosfato.
Los ejemplos de activadores de la piruvato quinasa incluyen xilulosa 5-P, ceramida, un agonista de los receptores de la adenosina A1 tales como N-6-ciclopentiladenosina. Los activadores de la piruvato quinasa adicionales se divulgan en los documentos WO10/042867, WO10/042867, WO99/048490, y WO09/025781.
Se conocen en la tecnica los ejemplos de los activadores de la fosfoglucoisomerasa, activadores de la aldolasa, activadores de la gliceraldehftdo 3P deshidrogenasa, activadores de la triosa fosfato isomerasa, fosfoglicerato quinasa, enolasa, fosfoglicerato mutasa y lactato deshidrogenasa.
2. Sustratos de la glucolisis
Los ejemplos de sustratos de la glucolisis incluyen glucosa 6-fosfato, fructosa 6-fosfato, fructosa 1,6-bisfosfato, gliceraldehftdo 3-fosfato, 1,3-bisfosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 2-fosfoglicerato, y fosfoenolpiruvato. En algunos aspectos, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico no es un azucar sencillo (por ejemplo, glucosa).
3. Intermedios glucolfticos y sus precursores metabolicos
Los intermedios glucolfticos se utilizan de forma diversa, como para la biosmtesis de otras moleculas importantes tales como acidos grasos, ftpidos, nucleotidos y aminoacidos. Por lo tanto, como se define en el presente documento, los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico incluyen compuestos que promueven un proceso que es posterior a la glucolisis (por ejemplo, la smtesis de acidos grasos, la smtesis de ftpidos, la smtesis de nucleotidos, y la smtesis de aminoacidos). En algunos aspectos, los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico incluyen intermedios glucolfticos, por ejemplo, los intermedios glucolfticos que se utilizan en estas rutas biosinteticas posteriores. En algunos aspectos, los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico incluyen precursores metabolicos de los intermedios glucolfticos. Como se define en el presente documento, el termino "precursores metabolicos" se refiere a compuestos a partir de los cuales los intermedios glucolfticos se convierten
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metabolicamente, por ejemplo, en una celula, un tejido, u organismo humano.
Los ejemplos de intermedios glucoltticos incluyen glucosa-6-fosfato, fructosa 6-fosfato, fructosa 1,6-bisfosfato, dihidroxiacetona fosfato, gliceraldehudo 3-fosfato, 1,3-bisfosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 2-fosfoglicerato, fosfoenol piruvato, oxaloacetato, piruvato y sus precursores metabolicos. En algunos aspectos, el intermedio glucolftico es nicotinamida adenina dinucleotido (NADH). En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un precursor metabolico de NADH. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es acido nicotmico o nicotinamida.
4. Activadores del transportador de captacion de la glucosa
Como se define en el presente documento, el termino "activador del transportador de captacion de la glucosa" se refiere a compuestos que estimulan o promueven de otra forma la expresion o la actividad de un transportador de captacion de la glucosa. Como se define en el presente documento, el termino "transportador de la glucosa" se refiere a protemas que transportan los compuestos (tanto glucosa, analogos de glucosa, otros azucares tales como fructosa o inositol, o no azucares, tales como acidos ascorbicos) a traves de la membrana celular y son miembros de la "familia" de transportadores de glucosa, basandose en su similitud estructural (por ejemplo, homologfa con otras protemas transportadoras de glucosa). Como se define en el presente documento, los transportadores de la glucosa incluyen tambien protemas transportadoras que tienen un sustrato primario diferente a la glucosa. Por ejemplo, el transportador de glucosa GLUTS es principalmente un transportador de fructosa, y se ha notificado que tambien transporta glucosa con baja afinidad. De un modo similar, el sustrato primario para el transportador de glucosa HMIT es mioinositol (un alcohol azucarado). Tal como se usa en el presente documento, el termino "transportador de glucosa", salvo que se especifique otra cosa, incluye transportadores de fructosa e inositol. Los ejemplos de transportadores de captacion de la glucosa incluyen un transportador de la glucosa seleccionado entre los grupos de GLUTl-12, transportadores HMIT y SGLT1-6.
Los ejemplos de activadores del transportador de captacion de la glucosa incluyen insulina, pinitol (vease, por ejemplo, WO/2000/071111), AMP 8-bromo-dclico (vease, por ejemplo, Ogura et al., Journal of Endocrinology, 164:171-178, 2000), acido araquidonico (Fong et al., Cellular Signalling, 8:179-183, 1996), esteres de forbol tal como 13-acetato 12-O-tetra-decanoil-forbol (vease, por ejemplo, Molecular Brain Research, 15:221-226, 1992).
5. Moduladores de la respiracion mitocondrial (inhibidores de la fosforilacion oxidativa)
Como se define en el presente documento, el termino "respiracion mitocondrial" u "oxidacion mitocondrial" se refiere a la oxidacion de moleculas de sustrato (por ejemplo, azucares, acidos organicos, piruvato, etc.) en el interior de la mitocondria. En algunos aspectos, un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. Un compuesto que puede influir sobre el grado de respiracion/oxidacion de la mitocondria se denomina generalmente en el presente documento "modulador de la respiracion mitocondrial" u otro termino similar. En algunos aspectos, un modulador de la respiracion mitocondrial es un compuesto que inhibe o impide la respiracion mitocondrial o la oxidacion mitocondrial. En algunos aspectos, un modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa.
Un inhibidor de la fosforilacion oxidativa puede ser cualquier inhibidor de una o mas enzimas de la fosforilacion oxidativa o un desacoplador de la fosforilacion oxidativa. Se conocen en la tecnica las enzimas de la fosforilacion oxidativa e incluyen el complejo I enzimatico (NADH coenzima Q reductasa), II (succinato-coenzima Q reductasa), III (coenzima Q citocromo C reductasa), IV (citocromo oxidasa), y V (F0-F1, ATP sintasa).
Los inhibidores del complejo I enzimatico son cualquiera de los conocidos en la tecnica y pueden incluir, aunque no de forma limitativa cualquiera de los siguientes: tritiltioalanina, carminomicina, y piperazinadiona, rotenona, amital, 1- metil-4-fenilpiridinio (MPP+), paraquat, azul de metileno, y ferricianuro (los 2 ultimos son aceptores de electrones). Los inhibidores del complejo II enzimatico son cualquiera de los conocidos en la tecnica. Los inhibidores de la coenzima Q son cualquiera de los conocidos en la tecnica. Los inhibidores del complejo III enzimatico son cualquiera de los conocidos en la tecnica y pueden incluir, aunque no de forma limitativa mioxotiazol, antimicina A, ubisemiquinona, citocromo C, derivados de 4,6-diaminotriazina, metotrexato o aceptores de electrones tales como metosulfato de fenazina y 2,6-diclorofenol-indofenol. Los inhibidores del complejo IV enzimatico son cualquiera de los conocidos en la tecnica y pueden incluir, aunque no de forma limitativa cianuro, sulfuro de hidrogeno, azida, formiato, fosfina, monoxido de carbono y el aceptor de electrones ferricianuro. Los inhibidores del complejo V enzimatico son cualquiera de los conocidos en la tecnica y pueden incluir, aunque no de forma limitativa acido 2- hidroxiglutarico, VM-26 (4'-demetil-epipodofilotoxin tenilideno glucosido), tritiltioalanina, carminomicina, piperazinadiona, dinitrofenol, dinitrocresol, 2-hidroxi-3-alquil-1,4-naftoquinonas, apoptolidin aglicona, oligomicina, osamicina, citovaricina, derivados de naftoquinona (por ejemplo, dicloroalil-lawsona y lapachol), rodamina, rodamina 123, rodamina 6G, carbonil cianuro de p-trifluorometoxifenilhidrazona, rotenona, safranina O, cihexatina, DDT, clordecona, arseniato, pentaclorofenol, benzonitrilo, herbicidas de tiadiazol, salicilato, farmacos anfifflicos cationicos (amiodarona, perhexilina), gramicidina, calcimicina, pentaclorobutadienil-cistema (PCBD-cys), y
trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona (FCCP). Otros inhibidores de la fosforilacion oxidativa pueden incluir atractilosido, DDT, acidos grasos libres, lipofosfoftpidos, n-etilmaleimida, mersanilo, y p-benzoquinona.
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Los desacopladores de la fosforilacion oxidativa se refieren a compuestos que actuan como desacopladores de la fosforilacion oxidativa procedentes del transporte de electrones. Los ejemplos de desacopladores de la fosforilacion oxidativa incluyen, aunque no de forma limitativa, DNP, 5-cloro- 3-terc-butil-2'-cloro-4'-nitrosalicilanilida (S-13), 2,3,4,5,6-pentaclorofenolato de sodio (PCP), 4,5,6,7-tetracloro-2-(trifluorometil)-1H-bencimidazol (TTFB), Acido flufenamico (acido 2-[3-(trifluorometil)anilino]benzoico), 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-bencilidenomalononitrilo (SF6847), cianuro de carbonil m-cloro fenilhidrazona (CCCP), derivados de cianuro de carbonil p-[trifluorometoxi]-fenil- hidrazona (FCCP), y alfa-(fenilhidrazono)fenilacetonitrilo, derivados de fenilacetonitrilo; y acidos debiles que comprenden: Fenoles debilmente acidos, bencimidazoles, N-fenilantranilatos, salicilanidas, fenilhidrazonas, acidos salidlicos, acilditiocarbazatos, cumarinas, y aminas aromaticas.
6. Activadores del factor inducible por hipoxia
Se conocen en la tecnica activadores de la ruta del factor inducible por hipoxia e incluyen alcaloides y otros derivados de aminoacidos, inhibidores de la HIF asparaginil hidroxilasa (factor inhibidor de HIF o FIH) y HIF prolil hidroxilasas (HPH o PHD), inhibidores de la glicogeno sintasa quinasa 3p (GSK3p), donantes de oxido mtrico (NO), agentes de despolimerizacion de microtubulos (MDA), compuestos fenolicos, terpenos/esteroides, y prostaglandina E2 (PGE2). Los ejemplos de alcaloides y otros derivados de aminoacidos incluyen deferoxamina y desferri- exoquelina DFE 722 SM, Ciclopiroxolamina [Loprox®, 6-ciclohexil-1-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridona 2-aminoetanol], y 8-metil-piridoxatina. Los ejemplos de inhibidores de la glicogeno sintasa quinasa 3p (GSK3p) incluye indirrubina, derivados de indirrubina tales como 5-yodoindirrubin-3'-oxima y 5-metilindirrubin-3'-oxima. Los ejemplos de donantes de oxido mtrico (NO) incluyen S-nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina (SNAP), 3-(hidroxi-1-(1-metiletil)-2-
nitrosohidrazino)-1-propanamina (NOC5), diazen-1-io-1,2-diolato (NOC-18), S-nitrosoglutation (GSNO), espermina NONOato (un complejo de NO con el producto natural espermina), dietilamina NONOato, y dietiltriamina NONOato. Los ejemplos de agentes de despolimerizacion de microtubulos (MDA) incluyen los alcaloides vegetales vinblastina, colchicina, y MDA sinteticos tales como nocodazol. Los ejemplos de compuestos fenolicos incluyen dibenzoilmetano (DBM), el flavonoide quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona), (-)-epicatequin-3-galato (ECG), y (-)- epigalocatequin-3-galato (EGCG). Los ejemplos de terpenos y esteroides incluyen sesquiterpeno-tropolonas (por ejemplo, picnidiona, epolona A y epolona B), 4-hidroxi estradiol (4-OHE2), dihidrotestosterona, metiltrienolona (R1881), y diterpeno ester de forbol 12-O-miristato 13-acetato (PMA, conocido tambien como 12-O- tetradecanoilforbol 13-acetato o TPA).
Los ejemplos de inhibidores de la HIF asparaginil hidroxilasa (factor inhibidor de HIF, o FIH) y HIF prolil hidroxilasas (HPH o PHD) incluyen analogos de 2-oxoglutarato (2OG) tales como N-oxaloilglicina (5, NOG), derivados de esteres de NOG (por ejemplo, DMOG (dimetil-oxalilglicina)), N-((3-hidroxi-6-cloroquinolin-2-il)carbonil)-glicina, 3- hidroxipiridina-2-carbonil-glicina, 3,4-dihidroxibenzoato, piridina-2,5-dicarboxilato, piridina-2,4-dicarboxilato, N-oxalil- 2S-alanina, analogos adicionales de 2OG como se describe en Mole et al., Bioorg Med Chem Lett.13:2677-80, 2003, alahopcina y desalanilalahopcina, analogos de la desalanilalahopcina 3-carboximetileno N-hidroxi succinimida, 3- carboxi-N-hidroxi pirrolidona,l-mimosina (L-Mim), 3,4-dihidroxibenzoato de etilo (3,4-DHB), y N-carboximetilamida del acido 6-cloro-3-hidroxiquinolin-2-carbonico (S956711). Los inhibidores de la HIF asparaginil hidroxilasa y las HIF prolil hidroxilasas adicionales se describen en, por ejemplo, Ivan et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 13459-13464, 2002, WO03/049686, WO03/080566, y WO06/084210, WO10/056767.
Otros activadores de la ruta HIF incluyen quelantes de hierro (por ejemplo, desferoxamina, 2,2'-piridilo, 1,10- fenantrolina, quelante de Ca2+ BAPTA (acido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacetico), metales de transicion (por ejemplo, cobalto, mquel, cromo (VI) y cobre), el compuesto de organomercurio mersalilo, y FG-0041 (un compuesto que esta estructuralmente relacionado con 1,10-fenantrolina).
Los activadores adicionales de la ruta de HIF incluyen protemas que regulan en exceso la traduccion de HIF-1. La protema quinasa C (PKC) aumenta la velocidad de transcripcion de HIF-1a y funciona junto con la ruta de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), que potencia tambien la traduccion de HIF-1a. La ruta de PKC activa la expresion de la protema ribosomica s6, que reconoce espedficamente los transcritos de ARNm tales como HIF-1a. Mediante la fosforilacion de la protema S6 en condiciones normoxicas, se pueden aumentar mucho las velocidades de traduccion del ARNm de HIF-1a, contrarrestando eficazmente los efectos de la degradacion del proteosoma de esta subunidad y aumentando los niveles del complejo HIF-1 en el interior de la celula. La ruta PI3K se ha identificado como los medios primarios por los cuales diversos mediadores, tales como los lipopolisacaridos, influyen sobre la activacion de HIF-1a en las celulas del musculo liso vascular y los macrofagos (Dery et al., Int J Biochem Cell Bio. 37:535-540, 2004; Page et al., J Biol Chem. 277:48403-48409, 2002).
El peptido PR39 derivado de macrofago ha mostrado estabilizar HIF-1a disminuyendo su degradacion, dando como resultado una formacion acelerada de estructuras vasculares in vitro y una vasculatura miocardica aumentada en ratones (Li et al., Nat Med 6: 49-55. 2000). Se ha conseguido la induccion directa de HIF-1 utilizando los extremos N o C de los polipeptidos ODDD que bloquean la degradacion mediada por VHL (Maranchie et al., Cancer Cell 1: 247255, 2002).
Los activadores de la ruta HIF incluyen ademas otros estfmulos fisiologicos no hipoxicos tales como factores de crecimiento, citoquinas, y hormonas. Los ejemplos de factores de crecimiento que activan la ruta HIF incluyen el
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factor de crecimiento de tipo insulina (IGF)-1 e IGF- 2, la protema de union a IGF (IGFBP)-2 e IGFBP-3, EGF, el factor basico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), y la herregulina. Los ejemplos de citoquinas que activan la ruta HIF incluyen el factor alfa de necrosis tumoral (TNFa), la interleuquina-1 beta (IL-1p), e IL-1.
Los ejemplos de hormonas que activan la ruta HIF incluyen las hormonas vasculares angiotensina II y trombina, la hormona tiroidea y la hormona estimuladora del folmulo. Otros factores fisiologicos tales como la protema redox tiorredoxina-1 (Trx-1) y la lipoprotema de baja densidad oxidada (oxLDL) pueden inducir tambien la protema HIF-1a y activar HIF-1.
7. Activadores de PDK1
En algunos aspectos, los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico son activadores de PDK1. Los activadores de PDK1 ilustrativos se describen en el presente documento en la seccion II, mas arriba.
IV. Inhibidores de HDAC
Los inhibidores de HDAC ilustrativos pueden incluir anticuerpos que se unen a variantes negativas dominantes, y ARNip y acidos nucleicos de sentido contrario que se dirigen a HDAC. Los inhibidores de HDAC incluyen, aunque no de forma limitativa, TSA (tricostatina A) (vease, por ejemplo, Adcock, British Journal of Pharmacology 150:829-831 (2007)), VPA (acido valproico) (vease, por ejemplo, Munster et al., Journal of Clinical Oncology 25:18S (2007): 1065), butirato de sodio (NaBu) (vease, por ejemplo, Han y col., Immunology Letters 108:143-150 (2007)), SAhA (acido suberoanilida hidroxamico o vorinostat) (vease, por ejemplo, Kelly et al., Nature Clinical Practice Oncology 2:150-157 (2005)), fenilbutirato de sodio (vease, por ejemplo, Gore et al., Cancer Research 66:6361-6369 (2006)), depsipeptido (documento FR901228, FK228) (vease, por ejemplo, Zhu et al., Current Medicinal Chemistry 3(3):187- 199 (2003)), trapoxina (TPX) (vease, por ejemplo, Furumai et al., PNAS 98(1):87-92 (2001)), peptido 1 que contiene acido hidroxamico dclico (CHAP1) (vease, Furumai mas arriba), MS-275 (vease, por ejemplo, Carninci et al., documento WO2008 /126932)), LBH589 (vease, por ejemplo, Goh et al., documento WO2008/108741) y PXD101 (vease, Goh, mas arriba). En general, a nivel global, las celulas pluripotentes tienen mas acetilacion de la histona, y las celulas diferenciadas tienen menos acetilacion de la histona. La acetilacion de la histona esta implicada tambien en la regulacion de la histona y la metilacion del ADN. En algunos aspectos, Los inhibidores de HDAC facilitan la activacion de los genes de pluripotencia silenciados.
V. Inhibidores de ALK5
Los inhibidores del receptor de TGFp (por ejemplo, ALK5) pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes, y acidos nucleicos de sentido contrario que suprimen la expresion de los receptores de TGFp (por ejemplo, ALK5). Los receptores de TGFp/inhibidores de ALK5 ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, SB431542 (vease, por ejemplo, Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)), A-83-01, conocido tambien como 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida (vease, por ejemplo, Tojo et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005), y comercialmente disponible de, por ejemplo, Toicris Bioscience); 2-(3- (6-metilpiridin- 2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (vease, por ejemplo, Dalton et al., documento WO2008/094597), BMP4 (vease, Dalton, mas arriba), GW788388 (-{4-[3-(piridin-2-il)-1 H-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N- (tetrahidro-2H- piran-4-il)benzamida) (vease, por ejemplo, Gellibert et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210- 2221 (2006)), SM16 (vease, por ejemplo, Suzuki et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)), IN-1130 (3-((5-(6- metilpiridin-2-il)-4-(quinoxalin-6-il)-1H-imidazol-2-il)metil)benzamida) (vease, por ejemplo, Kim et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)), GW6604 (2-fenil-4-(3-piridin-2-il-1H-pirazol-4-il)piridina) (vease, por ejemplo, de Gouville et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)), SB-505124 (clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H- imidazol-4-il)-6-metilpiridina) (vease, por ejemplo, DaCosta et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (vease, por ejemplo, aquellos relacionados en Stiefl et al., documento WO2008/006583), SU5416; clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'- pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; y TBR2-Fc soluble (vease, por ejemplo, Wrzesinski et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); y Chang et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)). Ademas, aunque no se pretende que "un inhibidor de ALK5"abarque los inhibidores de la quinasa no espedficos, debe entenderse que un "inhibidor de ALK5" abarca los inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7 ademas de ALK5, tales como, por ejemplo, SB-431542 (vease, por ejemplo, Inman et al., J, Mol. Phamacol. 62(1): 65-74 (2002). Sin pretender limitar el alcance de la divulgacion, se cree que los inhibidores de ALK5 influyen sobre el proceso de conversion/transicion mesenquimal a epitelial (MET). La ruta TGFp/activina es una ruta impulsora de la transicion epitelial a mesenquimal (EMT). Por lo tanto, inhibir la ruta TGFp/activina puede facilitar el proceso MET (es decir, la reprogramacion).
A la vista de los datos del presente documento que muestran el efecto de inhibir ALK5, se cree que la inhibicion de la ruta TGFp/activina tendra efectos similares. Por lo tanto, cualquier inhibidor (por ejemplo, antes o despues) de la ruta TGFp/activina se puede usar en combinacion con, o en vez de, los inhibidores ALK5, que se han descrito en todos los parrafos del presente documento. Los inhibidores de la ruta TGFp/activina ilustrativos incluyen, aunque no de
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forma limitativa: inhibidores del receptor TGFp, inhibidores de la fosforilacion de SMAD2/3, inhibidores de la interaccion de SMAD2/3 y SMAD4 y activadores/agonistas de SMAD6 y SMAD7. Ademas, las clasificaciones descritas a continuacion tienen meramente fines organizativos y un experto en la materia sabna que los compuestos pueden influir sobre uno o mas puntos de una ruta y, por tanto, los compuestos pueden funcionar en mas de una de las categonas definidas.
Los inhibidores de la fosforilacion de SMAD2/3 pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes, y acidos nucleicos de sentido contrario que se dirigen a SMAD2 o SMAD3. Los ejemplos espedficos de inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-43l542; LY364947; A77-01; y 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin). Vease, porejemplo, Wrzesinski, mas arriba; Kaminska, mas arriba; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007); y Kataoka et al., EP1992360.
Los inhibidores de la interaccion de SMAD2/3 y SMAD4 pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes, y acidos nucleicos de sentido contrario que se dirigen a SMAD2, SMAD3 y/o SMAD4. Los ejemplos espedficos de inhibidores de la interaccion de SMAD2/3 y SMAD4 incluyen, aunque no de forma limitativa, Trx-SARA, Trx-xFoxH1b y Trx-Lefl. (Veanse, por ejemplo, Cui et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006).)
Los activadores/agonistas de SMAD6 y SMAD7 incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos, variantes negativas dominantes, y acidos nucleicos de sentido contrario que se dirigen a SMAD 6 o SMAD 7. Los ejemplos espedficos de inhibidores incluyen, aunque no de forma limitativa, oligonucleotidos PTO como smad7. Vease, por ejemplo, Miyazono et al., documento US6534476, y Steinbrecher et al., US2005119203.
VI. Inhibidores de MEK
Los inhibidores de MEK pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes, y ARNip y acidos nucleicos de sentido contrario que suprimen la expresion de MEK. Los ejemplos espedficos de los inhibidores MEK incluyen, aunque no de forma limitativa, PD0325901, (vease, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible, por ejemplo, de Cell Signaling Technology), U0126 (disponible, por ejemplo, de Cell Signaling Technology), SL 327 (disponible, por ejemplo, de Sigma-Aldrich), ARRY-162 (disponible, por ejemplo, de Array Biopharma), pD184161 (vease, por ejemplo, Klein et al., Neoplasia 8:1-8 (2006)), PD184352 (CI-1040) (vease, por ejemplo, Mattingly et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (vease, por ejemplo, Voss et al., US2008004287), sorafenib (vease, Voss supra), Vandetanib (vease, Voss supra), pazopanib (vease, por ejemplo, Voss supra), Axitinib (vease, Voss supra) y PTK787 (vease, Voss supra).
Actualmente, algunos inhibidores de MEK estan sometidos a evaluacion en ensayos clmicos. CI-1040 se ha evaluado en ensayos clmicos en Fase I y Fase II para el cancer (vease, por ejemplo, Rinehart et al., Journal of Clinical Oncology 22(22):4456-4462 (2004)). Otros inhibidores de MEK que estan sometidos a evaluacion en ensayos clmicos incluyen PD184352 (vease, por ejemplo, English et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1):40-45 (2002)), BAY 43-9006 (vease, por ejemplo, Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001)), PD-325901 (tambien PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD6244 (tambien ARRY- 142886 o ARRY-886), RO5126766, XL518 y AZD8330 (tambien ARRY-704). Vease, por ejemplo, la informacion de los National Institutes of Health localizada en la World Wide Web en clinicaltrials.gov, asf como la informacion procedente del National Cancer Institute localizada en la World Wide Web en cancer.gov/clinical trials.
VII. Reprogramacion
Hasta la fecha, se ha establecido un gran numero de metodos y protocolos diferentes para inducir celulas de marnffero no pluripotentes en citoblastos pluripotentes inducidos (iPSC). Los iPSC tienen una morfologfa, proliferacion, y pluripotencia, similar a ESC, juzgado por la formacion del teratoma y la contribucion de la quimera. Se cree que los activadores de PDK1 o los compuestos que promueven el metabolismo glucolftico (por ejemplo, los activadores de PDK1), opcionalmente, en combinacion con un inhibidor de HDAC, y opcionalmente un inhibidor de ALK5 y opcionalmente un inhibidor de Mek, mejoraran esencialmente cualquier protocolo de reprogramacion para generar iPSC. Se cree que los protocolos de reprogramacion que se pueden mejorar incluyen aquellos que implican la introduccion de uno o mas factores de transcripcion de la reprogramacion seleccionados entre un polipeptido Oct (incluyendo, aunque no de forma limitativa Oct 3/4), un polipeptido Sox (incluyendo, aunque no de forma limitativa Sox2), un polipeptido Klf (incluyendo, aunque no de forma limitativa Klf4) y/o un polipeptido Myc (incluyendo, aunque no de forma limitativa c-Myc). Por lo tanto, en algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente comprenden condiciones en las que uno o mas factores de transcripcion de la reprogramacion se seleccionan entre un polipeptido Oct (incluyendo, aunque no de forma limitativa Oct 3/4), un polipeptido Sox (incluyendo, aunque no de forma limitativa Sox2), un polipeptido Klf (incluyendo, aunque no de forma limitativa Klf4) y/o un polipeptido Myc (incluyendo, aunque no de forma limitativa c-Myc) se introducen en la celula. Como se senala en los Ejemplos, se ha demostrado que los activadores de PDK1 mejoran la reprogramacion incluso con un unico factor de transcripcion de la reprogramacion (por ejemplo, Oct4 solo). Por lo tanto, en algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir a una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente
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comprenden condiciones en las que un factor de transcripcion de la reprogramacion (por ejemplo, Oct4 solo) se introduce en la celula.
En algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir a una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente comprenden introducir factores de reprogramacion en las celulas, por ejemplo, mediante la expresion de un casete de expresion recombinante que se ha introducido en la celula diana, o incubando las celulas en presencia de polipeptidos de factores de transcripcion de la reprogramacion exogenos de tal manera que los polipeptidos penetren en la celula.
Los estudios han mostrado que la transduccion retrovmca de los fibroblastos de raton con cuatro factores de transcripcion que estan muy expresados en ESC (Oct 3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc) generan citoblastos pluripotentes inducidos (iPSC). Vease, Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al. Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Cell Stem Cell 1,55-70 (2007); Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Nature Biotechnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al. Cell 131,861-872 (2007); Yu, J. et al. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell. 2, 1012 (2008). Los estudios han demostrado tambien la reprogramacion de celulas somaticas humanas con factores de transcripcion que estan muy expresados en ESC: Hockemeyer et al. Cell Stem Cell. 11;3(3):346-53 (2008); Lowry et al. Proc Natl Acad Sci USA. 105(8):2883-8 (2008); Park et al. Nature. 10;451(7175):141-6 (2008); Nakagawa et al. Nat Biotechnol. Ene; 26(1):101-6 (2008); Takahashi et al. Cell. 131(5):861-72 (2007); y Yu et al. Science. 318(5858):1917-20 (2007). Se cree que dichos metodos mejoraran con la inclusion de un activador de PDK1 o uno de mas compuestos que promueven el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1) y, opcionalmente, otros agentes como se describe en el presente documento.
Para hacer frente a los problemas de seguridad que surgen de los genomas de las celulas diana que hospedan secuencias exogenas integradas, se han desarrollado adicionalmente numerosos protocolos geneticos modificados que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgacion. Estos protocolos producen celulas iPSC con riesgos potencialmente reducidos, e incluyen adenovirus no integrantes para administrar los genes de reprogramacion (Stadtfeld, M., et al. (2008) Science 322, 945-949), transfeccion transitoria de plasmidos de reprogramacion (Okita, K., et al. (2008) Science 322, 949-953), sistemas de transposicion piggyBac (Woltjen, K., et al. (2009). Nature 458, 766-770, Yusa et al. (2009) Nat. Methods 6:363-369, Kaji, K., et al. (2009) Nature 458, 771-775), Virus rescindibles (Soldner, F., et al. (2009) Cell 136, 964-977), y sistema de expresion episomica basado en oriP/EBNA1-(Yu, J., et al. (2009) Science DOI: 10,1126). Por lo tanto, en algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir a una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente comprenden condiciones en la que los factores de reprogramacion se administran por adenovirus no integrantes, transfeccion transitoria de plasmidos de reprogramacion, sistemas de transposicion piggyBac, virus rescindibles (Soldner, F., et al. (2009) Cell 136, 964-977), y/o sistemas de expresion episomica basados en oriP/EBNA1-, de acuerdo con cualquiera de los protocolos descritos anteriormente. En algunos aspectos, un activador de PDK1 o uno de mas compuestos que promueven el metabolismo glucolftico (por ejemplo, un activador de PDK1) y opcionalmente otros agentes que se describen en el presente documento se incuban con las celulas en cualquiera de los protocolos descritos anteriormente.
Tal como se ha senalado anteriormente, la reprogramacion puede implicar cultivar celulas diana en presencia de una o mas protemas en condiciones que permitan la introduccion de las protemas en la celula. Vease, por ejemplo, Zhou H et al., Cell Stem Cell. 8 de mayo de 2009; 4(5):381-4; documento WO/2009/117439. Se puede introducir un polipeptido exogeno (es decir, una protema proporcionada desde el exterior de la celula y/o que no esta producida por la celula) a la celula mediante numerosos metodos diferentes que no implican la introduccion de un polinucleotido que codifica el polipeptido. En algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir a una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente comprenden introducir en la celula una o mas protemas exogenas, comprendiendo cada protema exogena un polipeptido del factor de transcripcion de interes unido (por ejemplo, unido como una protema de fusion o unido de otra manera de forma covalente o no covalente) a un polinucleotido que potencia la capacidad del factor de transcripcion de penetrar en la celula (y en algunos aspectos, el nucleo de la celula).
Los ejemplos de secuencias de polipeptidos que potencian el transporte a traves de las membranas incluyen, aunque no de forma limitativa, la protema de transcripcion de la homeoprotema de Drosophila antennapedia (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34,1991; Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8,1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4, 1993), la protema VP22 estructural del virus del herpes simple (Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-33, 1997); la protema TAT del activador de la transcripcion de VIH-1 (Green y Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel y Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988); Secuencia senal FGF de Kaposi (kFGF); el dominio 4 de transduccion de la protema (PTD4); Penetratin, M918, Transportan-10; una secuencia de localizacion nuclear, un peptido PEP-I; un peptido anfipatico (por ejemplo, un peptido MPG); los transportadores potenciadores de la administracion tales como los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 6.730.293 (que incluyen, aunque no de forma limitativa, una secuencia peptfdica que comprende al menos 5-25 o mas argininas contiguas o 5-25 o mas argininas en un conjunto contiguo de 30, 40 o 50 aminoacidos; incluyendo, aunque no de forma limitativa un peptido que tiene suficientes, por ejemplo, al menos 5, restos guanidino o amidino); y el peptido Penetratin™ 1 comercialmente disponible, y los vectores peptfdicos Diatos ("DPV") de la plataforma Vectocell®, disponibles de
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Daitos S.A. de Pans, Francia. Veanse tambien los documentos WO/2005/084158 y WO/2007/123667 y los transportadores adicionales descritos en los anteriores. No solo estas protemas pueden pasar a traves de la membrana plasmatica sino que la union de otras protemas, tales como los factores de transcripcion descritos en el presente documento, es suficiente para estimular la captacion celular de estos complejos. Se han descrito anteriormente numerosos polipeptidos capaces de mediar en la introduccion de moleculas asociadas en una celula y se pueden adaptar a la presente invencion. Vease, por ejemplo, Langel (2002) Cell Penetrating Peptides CRC Press, Pharmacology and Toxicology Series.
Las secuencias polipeptfdicas ilustrativas que potencian el transporte a traves de las membranas incluyen:
VP22. GSPPTAPTRSK.TPAQGLARKLHFSTAPPNPDAPWTPRVA GFNKRVFRFSPQTARRATTTRI; kFGF: AGSGGAAVALLPAVLL ALLAPGGEFA; PTD4. AGSGGYARAAARQARAGGEFA; PENETRATIN: RQIKIWFQGRRMKWKK; TAT Y GRKKRRQRRR;
M918: MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV; TRAXSPORTiX-10 AGYLLG KIGLKALAALAKKIL.
En algunos aspectos, el polipeptido que potencia el transporte a traves de las membranas es una secuencia peptfdica que comprende al menos 5 o mas argininas contiguas o no contiguas (por ejemplo, un peptido de 8 argininas). En algunos aspectos, el polipeptido que potencia el transporte a traves de las membranas es una secuencia peptfdica que comprende al menos 7 o mas argininas contiguas o no contiguas. Por ejemplo, el polipeptido que potencia el transporte a traves de las membranas es una secuencia peptfdica que comprende 11 argininas contiguas, por ejemplo, ESGGGGSPGRRRRRRRRRRR. Tal como se ha senalado anteriormente, las argininas en la secuencia potenciadora del transporte no tienen que ser contiguas. En algunos aspectos, la region de la poliarginina (por ejemplo, la contigua o no contigua) tiene al menos 5, 8, 10, 12, 15, 20 o mas aminoacidos contiguos largos y tiene al menos, por ejemplo, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas argininas.
En algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir a una celula a convertirse en un citoblasto pluripotente comprenden condiciones en las que uno o mas polipeptidos exogenos, por ejemplo, un polipeptido Oct (incluyendo, aunque no de forma limitativa Oct 3/4), un polipeptido Sox (incluyendo, aunque no de forma limitativa Sox2), un polipeptido Klf (incluyendo, aunque no de forma limitativa Klf4) y/o un polipeptido Myc (incluyendo, aunque no de forma limitativa c-Myc), se introduce en las celulas mediante metodos tradicionales tales como lipofeccion, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, bombardeo de partmulas y/o microinyeccion, o se puede introducir en las celulas mediante un agente de administracion de protemas. Por ejemplo, se puede introducir el polipeptido exogeno en las celulas mediante lfpidos unidos de forma covalente o no covalente, por ejemplo, mediante un grupo miristoMo unido de forma covalente. Los lfpidos utilizados para la lipofeccion estan excluidos opcionalmente de los modulos de administracion celular en algunos aspectos. En algunos aspectos, los polipeptidos del factor de transcripcion descritos en el presente documento se introducen exogenamente como parte de un liposoma, o un coctel de lfpidos (tal como Fugene6 y Lipofectamina comercialmente disponibles). En otra alternativa, las protemas del factor de transcripcion pueden microinyectarse o introducirse directamente de otra forma en la celula diana. En algunos aspectos, los polipeptidos del factor de transcripcion se administran a las celulas utilizando reactivos de administracion de protemas Profect, por ejemplo, Profect-P1 y Profect-P2 (Targeting Systems, El Cajon, CA), o utilizar reactivos de transfeccion Pro-Ject® (Pierce, Rockford IL, EE.UU.). En algunos aspectos, los polipeptidos del factor de transcripcion se administran a las celulas utilizando nanotubos de una sola pared (SWNT).
Como se describe en los Ejemplos del documento WO/2009/117439, la incubacion de las celulas con los polipeptidos del factor de transcripcion utilizados de acuerdo con la invencion durante periodos prolongados puede ser toxica para las celulas. Por lo tanto, en algunos aspectos, las condiciones suficientes para inducir que una celula de mairnfero no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente comprenden incubar un activador de PDK1 o uno de mas compuestos que promueven el metabolismo glucolrtico (por ejemplo, un activador de PDK1) y opcionalmente un inhibidor de hDaC, un inhibidor de ALK5 y/o un inhibidor de Mek, e incubar de forma intermitente la celula de mamffero no pluripotente con uno o mas de un polipeptido Oct (incluyendo, aunque no de forma limitativa Oct 3/4), un polipeptido Sox (incluyendo, aunque no de forma limitativa Sox2), un polipeptido Klf (incluyendo, aunque no de forma limitativa Klf4) y/o un polipeptido Myc (incluyendo, aunque no de forma limitativa c- Myc) con periodos intervinientes en la incubacion de la celula en ausencia de uno o mas polipeptidos. En algunos aspectos, el ciclo de incubacion con y sin los polipeptidos puede repetirse durante 2, 3, 4, 5, 6, o mas veces y llevarse a cabo durante lapsos de tiempo suficientes (es decir, las incubaciones con y sin protemas) para conseguir el desarrollo de celulas pluripotentes.
Los diversos agentes (por ejemplo, activadores de PDK1 o compuestos que promueven el metabolismo glucolftico,
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inhibidores de HDAC, receptores de TGFp/inhibidores de ALK5, inhibidores de la ruta MEK/ERK, y/o inhibidores de Rho GTPasa/ROCK, etc.) se pueden poner en contacto con celulas no pluripotentes tanto antes como, simultaneamente o despues de la administracion de, los factores de transcripcion de la programacion (por ejemplo, administrados como casetes de expresion o como protemas). Por conveniencia, el dfa que se administran los factores de reprogramacion se designa "dfa 1". En algunos aspectos, los inhibidores se ponen en contacto con las celulas en un agregado (es decir, como un coctel) en aproximadamente 3-7 dfas y se continua durante 7-14 dfas. Como alternativa, en algunos aspectos, el coctel se pone en contacto con las celulas en el dfa 0 (es decir, un dfa antes de los factores de preprogramacion) y se incuba durante aproximadamente 14-30 dfas.
La celula en la que una protema de interes se introduce puede ser una celula de mairnfero. Las celulas pueden ser humanas o no humanas (por ejemplo, primate, rata, raton, conejo, bovino, perro, gato, cerdo, etc.). La celula puede estar, por ejemplo, en cultivo o en un tejido, fluido, etc., y/o proceder o estar en un organismo. Las celulas que se pueden inducir a pluripotencia incluyen, aunque no de forma limitativa, queratinocitos, celulas de folmulos pilosos, HUVEC (Celulas endoteliales de vena umbilical humana), celulas sangumeas de cordon umbilical, celulas progenitoras neurales y fibroblastos.
En algunos aspectos, las moleculas pequenas pueden mejorar la eficacia de un proceso para generar celulas pluripotentes (por ejemplo, celulas iPSC). Por ejemplo, se puede manifestar una eficacia mejorada acelerando el tiempo para generar dichas celulas pluripotentes (por ejemplo, acortando el tiempo de desarrollo de las celulas pluripotentes en al menos un dfa en comparacion con un proceso similar o igual sin la molecula pequena). De forma alternativa, o en combinacion, una molecula pequena puede aumentar las celulas pluripotentes generadas por un proceso concreto (por ejemplo, aumentar el numero en un periodo de tiempo dado en al menos 10%, 30%, 50%, 100%, 200%, 500%, etc., en comparacion con un proceso similar o igual sin la molecula pequena).
Opcionalmente, o ademas, las moleculas pequenas pueden "complementar" o sustituir lo que generalmente se entiende de otra forma como una expresion necesaria de una de estas protemas para dar como resultado celulas pluripotentes. Poniendo en contacto una celula con un agente que sustituye funcionalmente uno de los factores de transcripcion, es posible generar celulas pluripotentes con todos los factores de transcripcion anteriormente relacionados excepto por el factor de transcripcion sustituido o complementado por el agente.
VIM. Transformacion
La presente invencion emplea tecnicas rutinarias en el campo de la genetica recombinante. Los textos basicos que divulgan los metodos generales de uso en la presente invencion incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). En algunos aspectos, se introducen en una celula casetes de expresion para la expresion de uno o mas factores de transcripcion de la reprogramacion.
En algunos aspectos, las especies de celulas y protemas que se van a expresar son iguales. Por ejemplo, si se usa una celula de raton, se introduce un ortologo de raton en la celula. Si se utiliza una celula humana, se introduce un ortologo humano en la celula.
Se apreciara que cuando se van a expresar dos o mas protemas en una celula, se pueden usar uno o multiples casetes de expresion. Por ejemplo, cuando un casete de expresion expresa multiples polipeptidos, se puede usar un casete de expresion policistronico.
Se puede usar cualquier tipo de vector para introducir un casete de expresion de la invencion en una celula. Los vectores ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, plasmidos y vectores vmcos. Los vectores vmcos ilustrativos incluyen, por ejemplo, vectores adenovmcos, vectores VAA, y vectores retrovmcos (por ejemplo, vectores lentivmcos).
Los metodos adecuados para la administracion de acidos nucleicos para la transformacion de una celula, un tejido o un organismo para uso con la invencion actual se cree que incluyen virtualmente cualquier metodo por el cual un acido nucleico (por ejemplo, ADN) se puede introducir en una celula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o conocena una persona normalmente experta en la materia (por ejemplo, Stadtfeld y Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 de abril de 2009). Dichos metodos incluyen, aunque no de forma limitativa, la administracion directa de ADN tal como mediante transfeccion ex vivo (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel y Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugene6 (Roche) o Lipofectamina (Invitrogen), mediante inyeccion (patentes de Estados Unidos con numeros 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyeccion (Harland y Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; patente de Estados Unidos n.° 5.789.215); mediante electroporacion (patente de Estados Unidos n.° 5.384.253; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); mediante precipitacion con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); utilizando DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); mediante carga
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sonica directa (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); mediante transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., JBiol. Chem., 266:3361-3364, 1991) y transfeccion mediada por receptores (Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); y cualquier combinacion de dichos metodos, cada una de las cuales se incorpora al presente documento por referencia.
IX. Mezclas
Como se describe en el presente documento, la presente divulgacion proporciona celulas de mamftero en una mezcla con un activador de PDK1 o un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, y uno o mas de (a) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (b) un inhibidor de MEK; (c) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (d) un polipeptido exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de PDK1. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, PS48. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 2,6-bisfosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un sustrato de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un intermedio glucolftico o sus precursores metabolicos, por ejemplo, acido nicotmico, NADH, o fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del transportador de captacion de glucosa. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, el modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa, por ejemplo, 2,4-dinitrofenol, o acido 2- hidroxiglutarico. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del factor inducible por hipoxia, por ejemplo, N-oxaloilglicina, o quercetina.
En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5. Los receptores de TGFp/inhibidores de ALK5 incluyen, aunque no de forma limitativa A-83-01. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de MEK. Los inhibidores de MEK incluyen, aunque no de forma limitativa PD0325901. En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC). Los inhibidores de HDAC incluyen, aunque no de forma limitativa, butirato de sodio (NaB) y acido valproico (VPA). En algunos aspectos, la mezcla comprende ademas un factor de transcripcion exogeno, por ejemplo, un factor de transcripcion exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
En algunos aspectos, el compuesto (por ejemplo, el activador de PDK1 o el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico) esta presente en la mezcla a una concentracion suficiente para inducir o mejorar la eficacia de induccion hasta pluripotencia. Por ejemplo, en algunos aspectos, los compuestos estan en una concentracion de al menos 0,1 nM, por ejemplo, al menos 1, 10, 100, 1000, 10000, o 100000 nM, por ejemplo, entre 0,1 nM y 100000 nM, por ejemplo, entre 1 nM y 10000 nM, por ejemplo, entre 10 nM y 10000 nM. En algunos aspectos, las mezclas estan en un recipiente sintetico (por ejemplo, un tubo de ensayo, una placa Petri, etc.). Por lo tanto, en algunos aspectos, las celulas son celulas aisladas (no parte de un animal). En algunos aspectos, las celulas se afslan de un animal (humano o no humano), se introducen en un recipiente, se ponen en contacto con uno o mas compuestos como se describe en el presente documento. Las celulas se pueden cultivar posteriormente y opcionalmente, reintroducirse en el mismo animal o en otro diferente, opcionalmente despues que las celulas se hayan estimulado para convertirse en un tipo o linaje celular concreto. En algunos aspectos, la concentracion de los inhibidores es suficiente para mejorar en al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300% o mas, la eficacia de induccion de las celulas no pluripotentes en la mezcla a citoblastos pluripotentes inducidos cuando la mezcla se somete a condiciones suficientes para inducir la conversion de las celulas en citoblastos pluripotentes inducidos.
Como se explica en el presente documento, en algunos aspectos, las celulas comprenden un casete de expresion para la expresion heterologa de al menos uno o mas de un polipeptido Oct, un polipeptido Myc, un polipeptido Sox y un polipeptido Klf. En algunos aspectos, las celulas no incluyen un casete de expresion que expresa uno o mas (incluyendo en algunos aspectos, cualquiera) de los polipeptidos Oct, Myc, Sox, o Klf.
Las celulas utilizadas de acuerdo con la presente invencion pueden ser humanas o no humanas (por ejemplo, primate, rata, raton, conejo, bovino, perro, gato, cerdo, etc.). Los ejemplos de celulas no pluripotentes incluyen aquellas descritas en el presente documento, incluyendo, pero sin limitacion, las celulas procedentes de un tejido seleccionado entre medula osea, piel, musculo esqueletico, tejido graso y sangre periferica. Los tipos de celulas ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos, linfocitos T, queratinocitos, celulas de foftculos pilosos, celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), celulas sangumeas del cordon umbilical, y celulas progenitoras neurales. En algunos aspectos, al menos un 99% de las celulas en la mezcla son inicialmente celulas no pluripotentes. En algunos aspectos, esencialmente todas las celulas en la mezcla son inicialmente celulas no pluripotentes.
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X. Kits
La presente divulgacion proporciona un kit para inducir la pluripotencia en una celula de mairnfero no pluripotente que comprende un activador de PDK1 o un compuesto que promueve el metabolismo glucolftico, y uno o mas de (a) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; (b) un inhibidor de MEK; (c) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC); o (d) un polipeptido exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de PDK1. En algunos aspectos, el activador de PDK1 es un activador de PDK1 alosterico, por ejemplo, PS48. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 2,6-bisfosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un sustrato de la glucolisis, por ejemplo, fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un intermedio glucolftico o sus precursores metabolicos, por ejemplo, acido nicotmico, NADH, o fructosa 6-fosfato. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del transportador de captacion de glucosa. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un modulador de la respiracion mitocondrial. En algunos aspectos, el modulador de la respiracion mitocondrial es un inhibidor de la fosforilacion oxidativa, por ejemplo, 2,4-dinitrofenol, o acido 2- hidroxiglutarico. En algunos aspectos, el compuesto que promueve el metabolismo glucolftico es un activador del factor inducible por hipoxia, por ejemplo, N-oxaloilglicina, o quercetina.
En algunos aspectos, el kit comprende ademas un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, por ejemplo, A-83-01. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de MEK, por ejemplo, PD0325901. En algunos aspectos, el kit comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo, butirato de sodio (NaB), o acido valproico (VPA). En algunos aspectos, el kit comprende ademas un factor de transcripcion exogeno, por ejemplo, un factor de transcripcion exogeno seleccionado entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox. En algunos aspectos, el factor de transcripcion exogeno comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
En algunos aspectos, los kits comprenden ademas celulas no pluripotentes. Los ejemplos de celulas no pluripotentes incluyen aquellas descritas en el presente documento, incluyendo, pero sin limitacion, las celulas procedentes de un tejido seleccionado entre medula osea, piel, musculo esqueletico, tejido graso y sangre periferica. Los tipos de celulas ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos, linfocitos T, queratinocitos, celulas de foftculos pilosos, celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), celulas sangumeas del cordon umbilical, y celulas progenitoras neurales.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invencion reivindicada.
Ejemplo 1: Reprogramacion de celulas somaticas primarias humanas mediante OCT4 y compuestos quimicos
Los inventores informan aqrn de un novedoso coctel de moleculas pequenas que permite la reprogramacion de celulas somaticas primarias humanas a iPSC con la expresion exogena solamente de OCT4.
Resultados
Entre los diferentes tipos de celulas somaticas humanas primarias facilmente disponibles, los queratinocitos que se pueden aislar facilmente de piel humana o foftculos pilosos representas una fuente celular atractiva para la reprogramacion, debido a que expresan endogenamente KLF4 y cMYC, y se ha informado de que se reprogramaban mas eficazmente utilizando los cuatro TF o tres TF convencionales (sin MYC) (Aasen, T. et al., Nat Biotechnol 26:1276-1284 (2008); Maherali, N. et al., Cell Stem Cell 3, 340-345(2008)). Mas recientemente, los inventores informaron de que la doble inhibicion de las rutas de TGFp y MAPK/ERK utilizando moleculas pequenas (es decir, SB431542 y PD0325901, respectivamente) proporciona una condicion drasticamente potenciada para reprogramar los fibroblastos humanos con cuatro TF exogenos (es decir, Oct4, Sox2, Klf4, y c-Myc TF, o "OSKM") (Lin, T. et al., Nat Methods 6:805-808 (2009)). Ademas, los inventores han mostrado que dicha inhibicion de ruta doble podna potenciar tambien la reprogramacion de los queratinocitos humanos mediante dos TF exogenos (es decir, Oct4 y Klf4, u "OK") con dos moleculas pequenas, Parnato (un inhibidor de la desmetilasa 1 espedfica de lisina) y CHIR99021 (un inhibidor de GSK3) (Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). Sin embargo, dicho proceso de
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reprogramacion de 2-Tf era muy ineficaz y complejo (por ejemplo, implicando dos TF exogenos y cuatro sustancias qmmicas), y la reprogramacion con incluso un TF menos pareda desmoralizadora. En su camino hacia la reprogramacion usando solamente OCT4, los inventores desarrollaron una estrategia por etapas en el refinamiento de la condicion de reprogramacion e identificaron nuevas entidades qmmicas de reprogramacion.
Los inventores intentaron en primer lugar optimizar el proceso de reprogramacion con las cuatro o tres condiciones de TF (es decir, OSKM u oSk) en queratinocitos epidermicos humanos neonatales (NHEK) ensayando diversos inhibidores de las rutas de TGFp y MAPK a diferentes concentraciones utilizando metodos de caracterizacion de iPSC humanos informados anteriormente (Lin, T. et al., Nat Methods 6:805-808 (2009)). Los inventores encontraron que la combinacion de PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM (un inhibidor del receptor TGFp mas potente y selectivo) era mas eficaz para potenciar la reprogramacion de los queratinocitos humanos transducidos con OSKM u OSK (Figura 1a). De forma notable, cuando los inventores redujeron adicionalmente las transducciones vmcas a solo dos factores/OK, los inventores generaron ademas iPSC a partir de NHEK cuando se trataron con PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM, aunque con eficacia reducida. A continuacion los inventores comenzaron a seleccionar moleculas pequenas adicionales a partir de una coleccion de compuestos bioactivos conocidos a diversas concentraciones como se ha informado anteriormente. Entre docenas de compuestos analizados hasta este momento, los inventores descubrieron, de forma sorprendente que un activador de molecula pequena de PDK1 (quinasa dependiente de 3’-fosfoinosftido-1), PS48 (5 pM) que no se ha informado nunca en la reprogramacion, puede potenciar significativamente la eficacia de la reprogramacion aproximadamente quince veces. De manera interesante, los inventores encontraron tambien que 0,25 mM de butirato de sodio (NaB, un inhibidor de la histona desacetilasa) resulto ser mucho mas fiable y eficaz que los 0,5 mM de VPA anteriormente notificados para la generacion de iPSC bajo la condicion OK (Figura 1b). Los posteriores estudios de seguimiento demostraron que la combinacion de PS48 5 pM y NaB 0,25 mM potencianan adicionalmente la eficacia de reprogramacion alrededor de veinticinco veces (Figura 1b y Tabla 3).
Con dicha eficacia sin precedentes en la reprogramacion de las NHEK con solo dos TF, los inventores exploraron adicionalmente la posibilidad de generar iPSC con OCT4 solo refinando las combinaciones de aquellas moleculas pequenas durante ventanas de tratamiento diferentes. Las NHEK primarias se transdujeron con OCT4 y se trataron con sustancias qmmicas (Figura 1c). Entre diversas condiciones, las pequenas colonias de iPSC se asemejan a hESC (cuatro a seis colonias de 1.000.000 de celulas sembradas) aparecieron en NHEK infectadas con OCT4 que se trataron con NaB 0,25 mM, PS48 5 pM y A-83-01 0,5 pM durante las primeras cuatro semanas, seguido por el tratamiento con NaB 0,25 pM, PS48 5 mM, A-83-01 0,5 pM y PD0325901 0,5 pM durante otras cuatro semanas (Figura 1c). Dichas colonias de iPSC positivas para TRA-1-81 (Figura 1d) crecieron mas con el medio de cultivo hESC convencional y se pudo pasar en serie para dar como resultado clones de iPSC estables que se caracterizaron adicionalmente (Figura 1e y 2). Ademas, tambien se pudieron generar iPSC solamente con OCT4 a partir de queratinocitos adultos humanos mediante la adicion de Parnato 2 pM y CHIR99021 3 pM (que habfan mostrado mejorar la reprogramacion de NHEK bajo la condicion OK) a este coctel qmmico. Tras la reprogramacion fiable de los queratinocitos primarios a iPSC mediante OCT4 y moleculas pequenas, los inventores aplicaron adicionalmente las condiciones a otros tipos de celulas primarias humanas, incluyendo HUVEC (celulas mesodermicas diferenciadas) y AFDC (celulas derivadas de fluido amniotico). De un modo similar, colonias de iPSC positivas para TRA-1-81 aparecieron en HUVEC infectadas con OCT4 y AFDC que se trataron con sustancias qmmicas. De forma notable, parecio que la reprogramacion de HUVEC y AFDC fue mas eficaz y mas rapida que la reprogramacion de NHEK bajo condiciones de OCT4 y moleculas pequenas (Tabla 3). Dos clones de iPSC procedentes de cada tipo de celula se expandieron a largo plazo durante 20 pases en condiciones de cultivo de hESC convencionales y se caracterizaron adicionalmente (Tabla 4).
Estas celulas hiPSC-OK e hiPSC-O expandidas de forma estable son morfologicamente indistinguibles de hESC, y se pudieron cultivar en una superficie revestida con ECM en condiciones exentas de alimentador y definidas qmmicamente (Figura 1e y Figura 6). Se dieron un resultado positivo en la tincion para la fosfatasa alcalina (ALP) y expresaron marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-81 y SSEA4, detectado mediante inmunocitoqmmica/ICC (Figura 1e, 3b, Figuras 4-5). Ademas, el analisis de RT-PCR confirmo la expresion de los genes OCT4 humanos endogenos, SOX2, NANOG, REX1, UTF1, TDGF2, FGF4, y el silenciamiento de OCT4 y KLF4 exogenos (Figura 2a y 3c). Ademas, el analisis de secuenciacion con bisulfito desvelo que los promotores OCT4 y NANOG de las celulas hiPSC-OK e hiPSC-O se desmetilaron ampliamente (Figura 2b y 3d). Este resultado proporciona una evidencia adicional para la reactivacion del programa de transcripcion de la pluripotencia en las celulas hiPSC-OK e hiPSC-O. El analisis de expresion genica global de las celulas hiPSC-O, NHEK y hESC mostro que las celulas hiPSC-O son distintas de NHEK (valor de correlacion de Pearson: 0,87) y mas similares a las hESC (valor de correlacion de Pearson: 0,98) (Figura 2c). El analisis de genotipacion mostro que las celulas hiPSC-O conteman solo el transgen OCT4 sin la contaminacion del transgen KLF4 o SOX2 (Figura 8). El analisis de la transferencia Southern mostro que existfan multiples sitios de integracion diferentes del transgen OCT4 (Figura 9) entre diferentes clones. Ademas, el resultado de la cariotipacion demostro que hiPSC-O mantuvo el cariotipo normal durante la reprogramacion completa y el proceso de expansion (Figura 10). Ademas, el ensayo de la huella del ADN excluyo la posibilidad de que estos hiPSC aparecieran a partir de la contaminacion de las hESC en el laboratorio (Tabla 5).
Para examinar el potencial desarrollo de estas celulas hiPSC, se diferenciaron in vitro mediante el metodo de
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diferenciacion del cuerpo embrioideo normalizado (EB). Los analisis ICC demostraron que pudieron diferenciarse eficazmente en las celulas neuronales caractensticas pIII- tubulina+ (ectodermo), celulas mesodermicas SMA+, y celulas endodermicas AFP+ (Figura 2d y 3e). Los analisis mediante PCR cuantitativa confirmaron adicionalmente la expresion de los genes marcadores espedficos de estos linajes y de linajes adicionales, incluyendo celulas ectodermicas (pIII-tubulina y NESTIN), celulas mesodermicas (MSX1 y MLC2a), y celulas endodermicas (FOXA2 y AFP) (Figura 2e). Siguiendo el protocolo EB, estas celulas hiPSC-OK e hiPSC-O tambien pueden dar lugar a cardiomiocitos que laten ntmicamente. Para ensayar su pluripotencia in vivo, se trasplantaron a ratones SCID. De cuatro a seis semanas despues, estas celulas hiPSC-O generaron eficazmente teratomas tfpicos que conteman derivados de las tres capas germinales (Figura 2f y 3f). En conjunto, estas caracterizaciones in vitro e in vivo demostraron que un unico factor de transcripcion, OCT4, combinado con un coctel de moleculas pequenas definido es suficiente para reprogramar algunas celulas somaticas primarias humanas a iPSC que son morfologica, molecular y funcionalmente similares a hESC pluripotentes.
Discusion
Los estudios presentados anteriormente tienen numerosas implicaciones importantes: En primer lugar, aunque se mostro que los NSC fetales se reprogramaban a iPSC mediante la expresion ectopica solo de OCT4, ha habido un significativo escepticismo acerca de si un unico gen OCT4 exogeno sena suficiente para reprogramar otras celulas somaticas humanas mas practicas que no expresan endogenamente SOX2 (uno de los dos genes de pluripotencia maestros en la reprogramacion), estan en las ultimas etapas de desarrollo (por ejemplo, comparacion embrion temprano/feto frente a recien nacido/adulto) y se pueden obtener sin danos significativos para el individuo. Segun el conocimiento de los inventores, el estudio de los inventores es la primera demostracion de que los iPSC pueden derivarse practicamente de celulas somaticas humanas primarias facilmente disponibles (por ejemplo, queratinocitos) transducidos con un unico gen de reprogramacion exogeno, OCT4. En contraste con los neurocitoblastos procedentes del cerebro, los queratinocitos son mas accesibles y se pueden obtener facilmente a partir de individuos nacidos con menos procedimientos invasivos. Esto refuerza aun mas la estrategia de aprovechar diversas celulas somaticas humanas practicamente accesibles para la generacion de iPSC con soluciones mas seguras y/o mejores calidades. Por lo tanto, este nuevo metodo y su desarrollo adicional facilitana significativamente la produccion de citoblastos pluripotentes espedficos del paciente para diversas aplicaciones.
En segundo lugar, aunque se han identificado moleculas pequenas y sus combinaciones para sustituir solo una o dos reprogramaciones de los TF, resulta ser un desaffo exponencial para generar iPSC cuando se omiten conjuntamente mas reprogramaciones exogenas de los TF. La identificacion de este nuevo coctel de moleculas pequenas, que sustituye funcionalmente tres factores de transcripcion maestros conjuntamente (es decir, SOX2, KLF4 y MYC) permitiendo la generacion de iPSC solo con OCT4, representa otra etapa principal hacia la reprogramacion en ultima instancia solo con moleculas pequenas, y demostro y reforzo adicionalmente el enfoque qrnmico para los iPSC.
En tercer lugar, esto demostro que una unica condicion genica tiene tambien una implicacion significativa para la tecnologfa de citoblastos pluripotentes inducido por protemas (piPSC). Un desaffo practico para la tecnologfa de piPSC es una produccion fiable y a gran escala de las cuatro protemas de reprogramacion transducibles, cada una de las cuales se comporta de forma diferente en la fabricacion (por ejemplo, su expresion, plegado, estabilidad, etc.). Claramente, combinar este coctel de moleculas pequenas con una unica protema transducible significana simplificar significativamente la tecnologfa de piPSC y facilitana sus aplicaciones.
En cuarto lugar, los inventores identificaron una nueva molecula pequena, PS48, con un nuevo mecanismo/diana para potenciar la reprogramacion. PS48 es un activador alosterico de molecula pequena de PDK1 (H indie, V. et al., Nat Chem Biol 4:758-764 (2009)). Un mecanismo mediante el cual PS48 potencia la reprogramacion parece ser facilitar la reprogramacion metabolica de la oxidacion mitocondrial utilizada principalmente por celulas somaticas adultas para la glucolisis utilizada principalmente por ESC (que se conoce tambien como el efecto Warbur) (Manning, B. D. y Cantley, Cell 129:1261-1274 (2007); Kondoh, H. et al., Antioxid Redox Signal 9:293-299 (2007); Heiden, M. G. V. et al., Science 324:1029-1033 (2009)). Dicho uso diferencial del metabolismo glucolttico sobre la respiracion mitocondrial por los citoblastos pluripotentes favorecena la pluripotencia promoviendo la proliferacion/transicion del ciclo celular con menos estres oxidativo. Para las celulas muy proliferantes, la fosforilacion oxidativa no sena capaz de cumplir la demanda de proporcionar precursores macromoleculares para la replicacion celular, sino que genera tambien una cantidad significativa de especies de oxfgeno reactivas en las mitocondrias que podnan inducir danos oxidativos excesivos. Por otra parte, el metabolismo glucolttico generana mas eficazmente precursores macromoleculares, tales como intermedios glucoltticos para aminoacidos no esenciales y acetil-CoA para acidos grasos, a la vez que proporciona suficientes energfas para satisfacer las necesidades de las celulas proliferantes (Kondoh, H. et al., Antioxid Redox Signal 9:293-299 (2007); Heiden, M. G. V. et al., Science 324:1029-1033 (2009)). De manera interesante, la condicion hipoxica y la activacion de su efector HIF-1a no solo se han vinculado estrechamente con el estfmulo del metabolismo glucolfticos, sino que tambien mostro potenciar la reprogramacion de ratones y seres humanos (Yoshida, Y. et al., Cell Stem Cell 5:237-241 (2009)). Desde el punto de vista mecanicista, las rutas de senalizacion del factor de crecimiento, la condicion hipoxica/HIF-1a y la reprogramacion del factor Myc parecen regular los aspectos complementarios del metabolismo celular, incluyendo la regulacion en exceso de los transportadores de glucosa y las enzimas metabolicas de la
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glucolisis, tales como GLUT1, HK2 y PFK1 (Gordan, J. D. et al., Cancer Cell 12:108-113 (2007); DeBerardinis, R. J. et al., Cell Metabolism 7:11-20 (2008)). Esos estudios sugieren que un mecanismo potencial conservado de Myc, la condicion hipoxica/HIF-1a, y la activacion de la ruta de los factores de crecimiento/Akt en la potenciacion de la reprogramacion convergen en sus papeles esenciales en la regulacion del metabolismo glucolftico. Respaldando esta nocion, los inventores descubrieron que el tratamiento con PS48 activo posteriormente Akt/PKB (Figura 11a), y regulo en exceso la expresion de algunos genes glucolfticos clave (Figura 11d), facilitando el cambio metabolico hacia la glucolisis (Figura 11c). A la inversa, los inventores descubrieron que la inactivacion de la actividad de PDK1 mediante UCN-01 (un inhibidor de PDK1) o la inhibicion de la glucolisis mediante la 2-desoxi-D-glucosa (un inhibidor de la glucolisis) no solo atenuo la glucolisis (Figura 11c) sino que tambien bloqueo el proceso de la reprogramacion (Figura 11b). Ademas, algunas moleculas pequenas conocidas que se han usado ampliamente para modular la respiracion mitocondrial (2,4-dinitrofenol), el metabolismo glucolftico (fructosa 2,6-bisfosfato y oxalato) o, mas espedficamente, la activacion de la ruta HIF (N-oxaloilglicina y Quercetina) mostraron tambien efectos consistentes correspondientes sobre la reprogramacion: es dear, los compuestos que facilitan el metabolismo glucolftico potencian la reprogramacion (tales como 2,4-dinitrofenol y N-oxaloilglicina), aunque los compuestos que bloquean el metabolismo glucolftico inhiben la reprogramacion (tales como oxalato) (Figura 11e) (Hewitson, K. S. y Schofield, C. J., Drug Discov Today 9:704-711 (2004); Pelicano, H. et al., Oncogene 25:4633-4646 (2006)). En conclusion, estos resultados indicaron que un cambio metabolico a una glucolisis anaerobia es crftica y facilita la reprogramacion de las celulas somaticas a citoblastos pluripotentes.
Finalmente, este nuevo y poderoso coctel de moleculas pequenas para la reprogramacion valido la optimizacion qmmica por etapas y la estrategia de seleccion presentada aqm como enfoque productivo hacia los citoblastos pluripotentes inducidos por sustancias puramente qmmicas en ultima instancia. Ademas, los inventores descubrieron que diferentes moleculas pequenas modulando el mismo mecanismo diana podnan tener diferentes efectos significativos sobre la reprogramacion en un contexto diferente, ilustrado por una mejora en las actividades de reprogramacion de A-83-01 y NaB en queratinocitos humanos, lo que sugiere la importancia de la optimizacion y el tratamiento "individualizados" con diferentes regfmenes para un contexto de reprogramacion espedfica.
Metodos
Cultivo celular
Queratinocitos epidermicos humanos normales (Lonza) se mantuvieron en medio de cultivo de queratinocitos (KCM, Lonza). celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Millipore) se mantuvieron en medio completo EndoGRO-VEGF (HCM, CHEMICON). Los ESC e hiPSC humanos se cultivaron en celulas alimentadoras MEF en medio de cultivo ESC humano convencional (hESCM: DMEM/F12, sustitucion del 15% de suero desactivado, 1% de Glutamax, 1% de aminoacidos no esenciales, 1% de penicilina/estreptomicina, p-mercaptoetanol 0,1 mM y 10 ng/ml de bFGF). Todos los productos de cultivos celulares eran de Invitrogen/Gibco BRL a excepcion de cuando se mencionan.
Produccion de lentivirus
Se produjeron sobrenadantes de lentivirus y se recogieron como se ha descrito anteriormente (Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007)). Los plasmidos utilizados para la produccion de lentivirus incluyen pSin-EF2-Puro-hOCT4, pSin2-EF2-Puro- hSOX2, pLove-mKlf4, pLove-mMyc, el plasmido psPAX2 empaquetado y el plasmido pMD2.G de codificacion de la envoltura (Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) and Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
Reprogramacion de los NHEK
Se cultivaron los NHEK en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y se transdujeron 3 veces (3-4 horas de cada transduccion) con sobrenadantes de lentivirus producidos recientemente. Se sembraron 1.000.00 de NHEK transducidos sobre las celulas alimentadoras CF1 MEF inactivadas irradiadas con rayos x en una placa de 100 mm y se cultivaron en KCM y se trataron con PS48 5 |jM, NaB 0,25 mM (Stemgent) y A-83-01 0,5 |jM (Stemgent) durante 2 semanas, seguido por el cambio de la mitad del volumen del medio para los hESCM y suplementacion con PS48 5 jM, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 jM durante otras 2 semanas. A continuacion, los medios de cultivo celular se cambiaron para los hESCM y se suplementaron con PS48 5 jM, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 jM y PD0325901 0,5 jM (Stemgent) durante cuatro semanas adicionales. Los mismos queratinocitos infectados con OCT4 cultivados en medio sin sustancias qmmicas se usaron como control. El cultivo se dividio mediante Accutase (Millipore) y se trato con Tiazovivina1 jM (Stemgent) en el primer dfa tras la division. Las colonias de iPSC que dieron un resultado positivo en la tincion con el anticuerpo de raton dirigido contra TRA-1-81 humano conjugado con Alexa Fluor 555 (BD Pharmingen) se repicaron para la expansion en celulas alimentadores en hESCM y se cultivaron de forma rutinaria.
Reprogramacion de HUVEC
Se cultivaron las HUVEC en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y se transdujeron 2 veces (4-6 horas cada transduccion) con sobrenadantes de lentivirus producidos de forma reciente. 200.000 HUVEC transducidas se
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sembraron sobre una placa de 100 mm revestida con gelatina, se cultivaron en HCM, y se trataron con PS48 5 jM, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 jM durante 2 semanas, seguido por el cambio de la mitad del volumen del medio para los hESCM y suplementacion con PS48 5 jM, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 jM durante otras 2 semanas. A continuacion, los medios de cultivo celular se cambiaron para los hESCM y se suplementaron con PS48 5 jM, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 jM y PD0325901 0,5 jM durante 1-2 semanas mas. Las colonias de iPSC que dieron un resultado positivo en la tincion con el anticuerpo de raton dirigido contra TRA-1-81 humano conjugado con Alexa Fluor 555 se repicaron para la expansion en celulas alimentadores en hESCM y se cultivaron de forma rutinaria. El cultivo se dividio mediante Accutase y se trato con Tiazovivina 1 jM en el primer dfa tras la division.
Reprogramacion de HUVEC utilizando diversos compuestos moduladores del metabolismo
Se cultivaron HUVEC en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y se transdujeron 2 veces (4-6 horas cada transduccion) con sobrenadantes de lentivirus producidos de forma reciente que conteman cuatro factores de reprogramacion (Klf, Sox, Myc, y Oct). Aproximadamente 20.000 HUVEC transducidas se sembraron sobre una placa de 6 pocillos revestida con gelatina, se cultivaron en HCM y se trataron con un compuesto modulador del metabolismo durante 2 semanas. A continuacion, los medios de cultivo celulares se cambiaron para hESCM y se suplementaron con un compuesto modulador del metabolismo durante 1-2 semanas mas. Se contaron el numero de colonias de iPSC con un resultado positivo para la tincion mediante anticuerpo de raton dirigido contra TRA-1-81 humano conjugado con Alexa Fluor 555. Se sometieron a ensayo diversos compuestos moduladores del metabolismo, incluyendo Fructosa 2,6-bisfosfato (F2,6P) 10 mM, Fructosa 6-fosfato (F6P) 10 mM, 6- aminonicotinamida (6-AN) 10 mM, oxalato (OA) 10 mM, 2,4-dinitrofenol (DNP) 1 jM, N-oxaloilglicina (NOG) 1 jM, Quercetina (QC) 1 jM, acido 2-hidroxiglutarico (2-HA) 10 jM, o acido nicotmico (nA) 10 jM.
Diferenciacion in vitro
La diferenciacion in vitro de hiPSC se llevo a cabo mediante el metodo del cuerpo embrioideo normalizado (EB). En resumen, los hiPSC se disociaron mediante Accutase (Millipore), se cultivaron en una placa de 6 pocillos de union ultrabaja durante ocho dfas y a continuacion se transfirieron a una placa de 6 pocillos revestida con Matrigel en medio de diferenciacion. Se fijaron las celulas para el analisis inmunocitoqmmico o se recogieron para los ensayos de RT-PCR ocho dfas despues. Medio de diferenciacion: DMEM/F12, 10% de FBS, 1% de Glutamax, 1% de aminoacidos no esenciales, 1% de penicilina/estreptomicina, p-mercaptoetanol 0,1 mM.
Tincion de fosfatasa alcalina y ensayo de inmunocitoqmmica
Se llevo a cabo la tincion con fosfatasa alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el Kit de deteccion de la fosfatasa alcalina (Stemgent). Se llevo a cabo el ensayo de inmunocitoqmmica normalizado como se ha informado anteriormente (Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). En la Tabla 2 se pueden encontrar los anticuerpos primarios utilizados. Los anticuerpos secundarios fueron IgG de mono dirigida contra IgG de raton o IgG de mono dirigida contra IgG de conejo conjugadas con Alexa Fluor 488 (1:1000) (Invitrogen). Se visualizaron los nucleos mediante tincion DAPI (Sigma-Aldrich). Se capturaron las imagenes utilizando un microscopio Eclipse TE2000-U de Nikon.
Analisis de la expresion genica mediante RT-PCR y qRT-PCR
Para el analisis mediante RT-PCR y qRT-PCR, se extrajo el ARN total de los iPSC humanos utilizando el RNeasy Plus Mini Kit junto con QIAshredder (Qiagen). Se llevo a cabo la transcripcion inversa de la primera hebra con 2 jg de ARN utilizando el Kit de smtesis del ADNc iScript™ (BioRad). Se analizo la expresion de los marcadores de pluripotencia mediante RT-PCR utilizando Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). Se analizo la expresion de los marcadores espedficos de linaje tras la diferenciacion mediante qRT-PCR utilizando iQ SYBR Green Supermix (BioRad). En la Tabla 1 se pueden encontrar los cebadores.
Analisis de micromatriz
Se utilizo el Ref-8_v3 expression Beadchip humano (Illumina, CA, EE.UU.) para las hibridaciones de la micromatriz para examinar la expresion genica global de las celulas NHEK, hiPSC y hES. Se sintetizo el ARNc marcado con Biotina-16-UTP a partir de 500 ng de ARN total con el kit de amplificacion del ARN TotalPrep de Illumina (Ambion AMIL1791, Foster City, CA, EE.UU.). La mezcla de hibridacion que contema 750 ng de ARNc amplificado marcado se preparo de acuerdo con el manual del sistema Illumina BeadStation 500x (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) utilizando los reactivos suministrados y la solucion de tincion Streptavidin-Cy3 de GE Healthcare. La hibridacion con el Illumina Human Ref-8_v3 expression Beadchip se realizo durante 18 h a 55 °C en un BeadChip Hyb Wheel. La matriz se escaneo utilizando el Illumina BeadArray Reader. Todas las muestras se prepararon en dos replicas biologicas. El procesamiento y el analisis de los datos de la micromatriz se llevaron a cabo con el programa informatico Illumina BeadStudio. El valor del fondo se resto de los datos, que se normalizaron usando la opcion de rango invariante.
Secuenciacion genomica con bisulfato
Se aislaron ADN genomicos utilizando el Kit de aislamiento del ADN no organico (Millipore) y a continuacion se trataron con el Kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corp., Orange, CA). Los ADN tratados se usaron a continuacion como moldes para amplificar las secuencias de interes. En la Tabla 1 se indican los cebadores utilizados para la amplificacion de los fragmentos promotores OCTA4 y NANOG. Los fragmentos resultantes se 5 clonaron utilizando el Kit de clonacion TOPO TA para secuenciacion (Invitrogen) y se secuenciaron.
Genotipacion de hiPSC
Se llevo a cabo la genotipacion de lmeas hiPSC utilizando la RT-PCR del ADN genomico con cebadores espedficos 10 (Tabla 1; Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) and Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
Formacion del teratoma
Se recogieron las lmeas de hiPSC utilizando Tripsina-EDTA al 0,05%. Se inyectaron cinco millones de celulas bajo la 15 capsula renal de ratones SCID (n=3). Despues de 4-6 semanas, se recogieron los teratomas bien desarrollados, se fijaron y, a continuacion, se analizaron histologicamente en una instalacion de nucleos histologicos TSRI.
Tabla 1. Cebadores utilizados
Gen
Directo Inverso
Para RT-PCR
Endo-OCT4
AGTTTGTGCCAGGGTTTTTG ACTTCACCTTCCCTCCAACC
Endo-SOX2
CAAAAATGGCCATGCAGGTT AGTTGGGATCGAACAAAAGCTATT
Endo-NANOG
TTTGGAAGCTGCTGGGGAAG GATGGGAGGAGGGGAGAGGA
Endo-KLF4
ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC GATTGTAGTGCTTTCTGGCTGGGCTCC
Endo-cMYC
GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG
REX1
CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA
UTF1
CCGTCGCTGAACACCGCCCTGCTG CGCGCTGCCCAGAATGAAGCCCAC
TDGF2
CTGCTGCCTGAATGGGGGAACCTGC GCCACGAGGTGCTCATCCATCACAAGG
FGF4
CTACAACGCCTACGAGTCCTACA GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG
Exo-OCT4
TGTCTCCGTCACCACTCTGG ATGCATGCGGATCCTTCG
PAX6
TG TC CAAC G GATGTGAGT TTTCCCAAG CAAAGAT G GAC
TUBULINA pil
CAACAGCACGGCCATCCAGG CTTGGGGCCCTGGGCCTCCGA
FOXF1
AAAGGAGCCACGAAGCAAGC AGGCTGAAGCGAAGGAAGAGG
HAND1
TCCCTTTTCCGCTTGCTCTC CATCGCCTACCTGATGGACG
AFP
AGCAGCTTGGTGGTGGATGA CCTGAGCTTGGCACAGATCCT
GATA6
TG TG C GTTC ATG G AG AAG ATC A TTTG ATAAG AGACCTCATG AAC C G ACT
GAPDH
GTGGACCTGACCTGCCGTCT GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT
Para la secuenciacion con bisulfato
OCT4-1
TTAG G AAAATGG GTAGTAG GG ATTT T AC C C AA AA AAC A AATA AATTATAAAACCT
OCT4-2
G GATGTTATTAAG ATG AAG ATAGTTG G C CT AA AC TCCCCTTC AA AATCT ATT
NANOG
G AG TT AA AG AGTTTTGTTTTT A AAA ATT AT TC C C A AAT CTAATAATTTATCATATC TTT C
Para la genotipacion
OCT4-Int
CAGTGCCCGAAACCCACAC AGAGG AACT GCTTCCTTCACG ACA
SOX2-Int
TACCTCTTCCTCCCACTCCA AGAGGAACTGCTTCCTTCACGACA
KLF4-Int
CACCTTGCCTTACACATGAAGAGG CGT AG AATCGAGACCGAGG AGA
Tabla 2. Anticuerpos primarios aplicados
Anticuerpo
Especie Dilucion Proveedor
Anti-OCT4 (1)
Raton 1:500 Santa Cruz Biotechnology
Anti-OCT4 (2)
Conejo 1:500 Stemgent
Anti-SOX2
Conejo 1:1000 Chemicon
Anti-NANOG
Conejo 1:500 Abcam
Anti-SSEA4
Raton 1:500 Stemgent
Anti-TRA-1-81
Raton 1:500 Stemgent
TUJ1 (anti-TUBULINA pill)
Raton 1:3000 Covance Research Products
Anti-SMA
Raton 1:500 Sigma
Anti-AFP
Raton 1:500 Sigma
Tabla 3. Sumario de los experimentos de reprogramacion
Celulas donantes
Factores de induccion Sustancias qufmicas Experimento s Colonias positivas para TRA-1-81
n.° 1 17
DMSO n.° 2 20
OCT4+KLF4+SOX2+MYC n.° 3 23
n.° 1 72
A83+PD n.° 2 104
n.° 3 91
NHEK (numero de lote: 0000087940)
n.° 1 2
DMSO n.° 2 3
OCT4+KLF4+SOX2 n.° 3 8
n.° 1 26
A83+PD n.° 2 35
n.° 3 44
n.° 1 1
A83+PD n.° 2 2
n.° 3 0
n.° 1 15
A83+PS48+PD n.° 2 18
n.° 3 5
OCT4+KLF4 n.° 1 6
A83+VPA+PD n.° 2 0
n.° 3 3
n.° 1 20
A83+NaB+PD n.° 2 17
n.° 3 18
A83+PS48+NaB+PD n.° 1 21
Celulas donantes
Factores de induccion Sustancias qufmicas Experimento s Colonias positivas para TRA-1-81
n.° 2 30
n.° 3
27
OCT4
A83+PS48+NaB+PD n.° 1 4
n.° 2
0
n.° 3
3
NHEK (numero de lote: 2F0661)
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 1 2
n.° 2
3
n.° 3
0
AHEK
OCT4 A83+PS48+NaB+PD +Par+CHIR n.° 1 3
n.° 2
2
HUVEC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 1 4
n.° 2
7
n.° 3
4
HUVEC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD +Par+CHIR n.° 1 23
n.° 2
17
AFDC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD +Par+CHIR n.° 1 5
n.° 2
11
NHEK, Queratinocitos epidermicos humanos neonatales; HUVEC, Celulas endoteliales de la vena umbilical humana; AHEK, Queratinocitos epidermicos humanos adultos; AFDC, Celulas derivadas de fluido amniotico. Concentracion qmmica utilizada: PD, PD0325901 0,5 jM; A83, A-83-01 0,5 |jM; PS48, PS48 5 |jM; VPA, Acido valproico 0,5 mM;
5 NaB, Butirato de sodio 0,25 mM; Par, Parnato 2 jM; CHIR, CHIR99021 3 jM. Para la reprogramacion inducida por cuatro factores o tres factores, se sembraron NHEk a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas cuatro semanas despues; Para la reprogramacion inducida por dos factores, se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas seis semanas despues; y para la reprogramacion inducida por un factor, se sembraron NHEK y AHEK a 10 una densidad de 1.000.000 de celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas ocho semanas despues. Se sembraron HUVEC y AFDC a una densidad de 200.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas seis semanas despues.
Tabla 4. Caracterizacion de las lineas de celulas iPSC humanas establecidas
clon hiPSC
Factores de induccion Fuente celular Expresion del marcador Ensayo RT- PCR Diferenciacion de EB Ensayo del teratoma
hiPSC-OK#1
OCT4+KLF4 NHEK V V V V
hiPSC-OK#3
V V V
hiPSC-O#1
V V V V
hiPSC-O#3
V V V
hiPSC-O#4
OCT4 NHEK V
hiPSC-O#5
V
2 lrneas mas
hiPSC-O#21
V V V V
hiPSC-O#22
V
hiPSC-O#26
OCT4 HUVEC V V V
clon hiPSC
Factores de induccion Fuente celular Expresion del marcador Ensayo RT- PCR Diferenciacion de EB Ensayo del teratoma
hiPSC-O#31
V V V V
7 lmeas mas
hiPSC-O#52
OCT4 AHEK V V
hiPSC-O#57
V
hiPSC-O#63
OCT4 AFDC V V
hiPSC-O#65
V
Aquellas lmeas de celulas caracterizadas se expandieron a largo plazo durante 20 pases en condiciones de cultivo de hESC convencionales y se caracterizaron adicionalmente para determinar la expresion del marcador y la pluripotencia; mientras que otras lmeas de celulas establecidas se almacenaron en el pase 5 o 6. Las entradas en 5 blanco indican "no determinado".
Tabla 5. Analisis de la huella de ADN sobre iPSC inducidas por OCt4 y lmeas parentales celulares
Loci genomicos
NHEK (combinados) hiPSC-O#1 HUVEC hiPSC-O#21
Amelogenina
X, S X, S X X
vWA
11, 15, 17, 18, 19 15, 18 15; 16 15; 16
D8S1179
10, 13, 16 13, 10; 13 10; 13
TPOX
8,9,11,12 8 8 8
FGA
19,22,23,24 19,22 24; 27 24; 27
D3S1358
13,14,15,17 17 14; 16 14; 16
THO1
6, 7, 9, 9,3 7, 9 6 6
D21S11
24.2, 29, 30.2, 35 24,2, 29 28; 30,2 28; 30,2
D18S51
13, 14, 16, 17, 18, 19 13, 17 13;18 13; 18
Penta E
5,8,13,14,19 13, 19 12 12
D5S818
8,11,12,13 11, 13 12; 13 12; 13
D13S317
8,9,11,12,13 9, 12 11; 14 11; 14
D7S820
8,9,10,11 9, 10 11 11
D16S539
9, 10, 11, 12, 13 9, 13 9; 11 9; 11
CSF1PO
10,11,12 11, 12 11; 12 11; 12
Penta D
2,2, 10, 12 10 12; 13 12; 13
Se investigaron los loci de ADN de 15 repeticiones en tandem corto polimorficas (STR) y el marcador de 10 cromosomas sexuales de la amelogenina.
Ejemplo 2: Reprogramacion de celulas endoteliales de la vena umbilical humana
Los inventores probaron los efectos de la combinacion de un inhibidor de HDAC, un activador de PDK1, un inhibidor 15 del receptor de TGFp, y un inhibidor de MEK en HUVEC que se transdujeron lentivmcamente solo con Oct4 para determinar sus efectos sobre la cinetica y la eficacia de la reprogramacion.
Metodos
20 Celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Millipore) se mantuvieron en medio completo EndoGRO- VEGF (HCM, CHEMICON). Se cultivaron HUVEC en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y se transdujeron 2 veces (4-6 horas/tiempo) con sobrenadantes de lentivirus producidos de forma reciente. A continuacion se sembraron 200.000 HUVEC transducidas sobre una placa de 100 mm revestida de gelatina y se cultivaron en HCM y se trataron con el activador de PDK1 PS48 (5 jM), el inhibidor de HDAC NaB (0,25 mM) y el inhibidor del receptor
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de TGFp A-83-01(0,5 |jM) durante 2 semanas, seguido por el cambio de la mitad del volumen de los medios para hESCM y la suplementacion con el activador de PDK1 PS48 (5 jM), el inhibidor de HDAC NaB (0,25 mM) y el inhibidor del receptor de TGFp A-83-01(0,5 jM) durante otras 2 semanas. A continuacion, los medios de cultivo celular se cambiaron para los hESCM y se suplementaron con el activador de PDK1, PS48 (5 jM), el inhibidor de HDAC, NaB (0,25 mM), y el inhibidor del receptor de TGFp, A-83-01(0,5 jM) y el inhibidor de MEK, PD0325901 (0,5 jM) durante 2 semanas mas. Las colonias de iPSC con un resultado positivo en la tincion con anticuerpo de raton dirigido contra TRA-1-81 humano conjugado con Alexa Fluor 555 (BD Pharmingen). hESCM: DMEM/F12, sustitucion del 15% de suero desactivado, 1% de Glutamax, 1% de aminoacidos no esenciales, 1% de penicilina/estreptomicina, p-mercaptoetanol 0,1 mM y 10 ng/ml de bFGF.
Resultados
Para las HUVEC transducidas solo con Oct4, los inventores probaron los efectos de la combinacion de un inhibidor de HDAC, un activador de PDK1, un inhibidor del receptor de TGFp, un inhibidor de MEK sobre la eficacia de la reprogramacion. Los inventores descubrieron que el tratamiento con la combinacion de PS48 5 jM, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 jM y PD0325901 0,5 jM dio como resultado una eficacia de reprogramacion de D0,0015%.
Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invencion pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invencion seran facilmente evidentes para una persona normalmente experta en la materia y estan abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Zhu, Saiyong Ding, Sheng The Scripps Research Institute
<120> Celulas en reprogramacion
<130> 14740-40-1PC
<140> WO PCT/US11/30598 <141> 30/03/2011
<150> US 61/319.494 <151> 31/03/2010
<150> US 61/393.724 <151> 15/10/2010
<150> US 61/406.392 <151> 26/10/2010
<160> 57
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia peptidica del transportador que potencia la administracion sintetica de 5-25 argininas contiguas <220>
<221> VARIANTE <222> (6)...(25)
<223> Arg puede estar presente o ausente <400> 1
imagen2
10
15
20
25
30
35
40
<210>2 <211> 61 <212> PRT
<213> Virus del herpes simple <220>
<223> Secuencia del polipeptido VP22 de la protema estructural que potencia el transporte a traves de las membranas
<400> 2
Gly
Ser Pro Pro Thr Ala Pro Thr Arg Ser Lys Thr Pro Ala Gin
Gly
1
5 10 15
Leu
Ala Arg Lys Leu His Phe Ser Thr Ala Pro Pro Asn Pro Asp Ala
20 25 30
Pro
Trp Thr Pro Arg Val Ala Gly Phe Asn Lys Arg Val Phe Arg Phe
35 40 45
Ser
Pro Gin Thr Ala Arg Arg Ala Thr Thr Thr Arg lie
50
55
60
<210>3 <211> 26 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del polipeptido senal sintetico FGF (kFGF) de Kaposi que potencia el transporte a traves de las membranas
<400> 3
Ala 1
Gly Ser Gly Gly 5 Ala Ala Val Ala
Ala
Leu Leu Ala 20 Pro Gly Gly Glu Phe 25
Leu Leu Pro A.la Val Leu Leu 10 15
Ala
<210>4 <211> 21 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del polipeptido del dominio 4 (PTD4) de transduccion de la protema sintetica que potencia el transporte a traves de las membranas
<400> 4
Ala Gly Ser Gly Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gin Ala Arg Ala 15 10 15
Gly Gly Glu Phe Ala 20
<210>5 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del polipeptido sintetico penetratina que potencia el transporte a traves de las membranas <400> 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Gly Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15
<210>6 <211> 11 <212> PRT
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana 1 <220>
<223> Secuencia del polipeptido TAT de la protema activadora de la transcripcion de VIH-1 que potencia el transporte a traves de membranas
<400> 6
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10
<210>7 <211> 22 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del polipeptido sintetico M918 que potencia el transporte a traves de membranas <400> 7
Met Val Thr Val 1
Pro Pro Arg Val 20
<210> 8 <211>21 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> secuencia del polipeptido sintetico transportan 10 que potencia el transporte a traves de las membranas <400> 8
Leu Phe Arg Arg Leu Arg lie Arg Arg Ala Cys Gly 5 10 15
Arg Val
Ala Gly Tyr Leu 1
Ala Lys Lys lie 20
<210> 9 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del peptido sintetico 8-arginina que potencia el transporte a traves de membranas <400> 9
Leu Gly Lys lie Gly Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 5 10 15
Leu
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 10 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Secuencia del peptido sintetico con 11 argininas contiguas que potencia el transporte a traves de membranas
<400> 10
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 15 10
<210> 11 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia del peptido sintetico que comprende 11 argininas contiguas que potencian el transporte a traves de membranas
<400> 11
Glu 1
Arg
<210> 12 <211> 20 <212>ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico Endo-OCT4 <400> 12
agtttgtgcc agggtttttg 20
<210> 13 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico Endo-OCT4 <400> 13
acttcacctt ccctccaacc 20
<210> 14 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico Endo-SOX2 <400> 14
caaaaatggc catgcaggtt 20
<210> 15 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 5 10 15
Arg Arg Arg 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico Endo-SOX2 <400> 15
agttgggatc gaacaaaagc tatt 24
<210> 16 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador directo de la RTPCR sintetico Endo-NANOG <400> 16
tttggaagct gctggggaag 20
<210> 17 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RTPCR sintetico Endo-NANOG <400> 17
gatgggagga ggggagagga 20
<210> 18 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico Endo-KLF4 <400> 18
acgatcgtgg ccccggaaaa ggacc 25
<210> 19 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico Endo-KLF4 <400> 19
gattgtagtg ctttctggct gggctcc 27
<210> 20 <211> 26 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico Endo-cMYC <400> 20
gcgtcctggg aagggagatc cggagc 26
<210> 21 <211> 26 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico Endo-cMYC <400> 21
ttgaggggca tcgtcgcggg aggctg 26
<210> 22 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico REX1 <400> 22
cagatcctaa acagctcgca gaat 24
<210> 23 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico REX1 <400> 23
gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23
<210> 24 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico UTF1 <400> 24
ccgtcgctga acaccgccct gctg 24
<210> 25 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico UTF1 <400> 25
cgcgctgccc agaatgaagc ccac 24
<210> 26 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico TDGF2 <400> 26
ctgctgcctg aatgggggaa cctgc 25
<210> 27 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico TDGF2 <400> 27
gccacgaggt gctcatccat cacaagg 27
<210> 28 <211> 23 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico FGF4 <400> 28
ctacaacgcc tacgagtcct aca 23
<210> 29 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico FGF4 <400> 29
gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24
<210> 30 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico Exo-OCT4 <400> 30
tgtctccgtc accactctgg 20
<210> 31 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico Exo-OCT4 <400> 31
tgcatgcgg atccttcg 18
<210> 32 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico PAX6 <400> 32
tgtccaacgg atgtgagt 18
<210> 33 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico PAX6 <400> 33
tttcccaagc aaagatggac 20
<210> 34 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador directo de la RT-PCR sintetico betaIII TUBULIN <400> 34
caacagcacg gccatccagg 20
<210> 35 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico de la TUBILINA betaIII <400> 35
cttggggccc tgggcctccg a 21
<210> 36 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico FOXF1 <400> 36
aaaggagcca cgaagcaagc 20
<210> 37 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico FOXF1 <400> 37
aggctgaagc gaaggaagag g 21
<210> 38 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico HAND1 <400> 38
tcccttttcc gcttgctctc 20
<210> 39 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico HAND1 <400> 39
catcgcctac ctgatggacg 20
<210> 40 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico AFP <400> 40
agcagcttgg tggtggatga 20
<210> 41 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico AFP <400> 41
cctgagcttg gcacagatcc t 21
<210> 42 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico GATA6 <400> 42
tgtgcgttca tggagaagat ca 22
<210> 43 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico GATA6 <400> 43
tttgataaga gacctcatga accgact 27
<210> 44 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de la RT-PCR sintetico GAPDH <400> 44
gtggacctga cctgccgtct 20
<210> 45 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador inverso de la RT-PCR sintetico GAPDH <400> 45
ggaggagtgg gtgtcgctgt 20
<210> 46 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador directo de secuenciacion con bisulfito sintetico OCT4-1 <400> 46
ttaggaaaat gggtagtagg gattt 25
<210> 47 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador inverso de secuenciacion con bisulfito sintetico OCT4-1 <400> 47
tacccaaaaa acaaataaat tataaaacct 30
<210> 48 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador directo de secuenciacion con bisulfito sintetico OCT4-2 <400> 48
ggatgttatt aagatgaaga tagttgg 27
<210> 49 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador inverso de secuenciacion con bisulfito sintetico OCT4-2 <400> 49
cctaaactcc ccttcaaaat ctatt 25
<210> 50 <211> 30 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de secuenciacion con bisulfito sintetico NANOG <400> 50
gagttaaaga gttttgtttt taaaaattat 30
<210> 51 <211> 30 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> Cebador inverso de secuenciacion con bisulfito sintetico NANOG <400> 51
tcccaaatct aataatttat catatctttc 30
<210> 52 <211> 19 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de genotipacion sintetico OCT4 Int <400> 52
cagtgcccga aacccacac 19
<210> 53 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de genotipacion sintetico OCT4 Int <400> 53
agaggaactg cttccttcac gaca 24
<210> 54 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de genotipacion sintetico SOX2 Int <400> 54
tacctcttcc tcccactcca 20
<210> 55 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador inverso de genotipacion sintetico SOX2 Int <400> 55
agaggaactg cttccttcac gaca 24
<210> 56 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador directo de genotipacion sintetico KLF4 Int <400> 56
caccttgcct tacacatgaa gagg 24
<210> 57 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso de genotipacion sintetico KLF4 Int
5 <400> 57
cgtagaatcg agaccgagga ga 22

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo in vitro para inducir una celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido, comprendiendo el metodo:
    (I)
    (a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Oct4 o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4; y
    (b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con una receptor de TGFp /inhibidor de ALK5 de molecula pequena, un inhibidor de MEK de molecula pequena, un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) de molecula pequena, y un activador alosterico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) de molecula pequena en condiciones suficientes para inducir que la celula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente inducido; o
    (II)
    (a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Oct4 y un polipeptido Klf4 o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 y un polinucleotido que codifica un polipeptido Klf4; y
    (b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con una receptor de TGFp /inhibidor de ALK5 de molecula pequena, un inhibidor de MEK de molecula pequena, y un activador alosterico de quinasa dependiente de 3'-fosfoinosftido 1 (PDK1) de molecula pequena en condiciones suficientes para inducir que la celula humana no pluripotente se convierta en un citoblasto pluripotente, induciendo de esta forma la celula humana no pluripotente en un citoblasto pluripotente.
  2. 2. El metodo de reivindicacion 1, en el que el activador alosterico de PDK1 de molecula pequena es: acido (Z)-5-(4- clorofeni)-3-fenilpent-2-enoico ("PS48"), acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3-fenilpent-2-enoico ("PS08"), acido 2-(3- (4-clorofenil)-3-oxo-1-fenilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3-fenilpent-2-enoico ("12Z"), o acido (Z)-5-(1H- Indol-3-il)-3-fenilpent-2-enoico ("13z").
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 (II), que comprende ademas poner en contacto la celula no pluripotente con un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) de molecula pequena.
  4. 4. El metodo de reivindicacion 1, en el que:
    a) el receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena es SB431542 o A-83-01;
    b) el inhibidor de MEK de molecula pequena es PD0325901; o
    c) el inhibidor de HDAC de molecula pequena es acido valproico (VPA) o butirato de sodio (NaB).
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1(I), que comprende ademas uno o mas de:
    (a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Klf o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Klf;
    (b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Sox o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Sox; o
    (c) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Myc o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Myc.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 (II), que comprende ademas uno o mas de:
    (a) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Sox o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Sox; o
    (b) poner en contacto la celula humana no pluripotente con un polipeptido Myc o introducir en la celula humana no pluripotente un polinucleotido que codifica un polipeptido Myc.
  7. 7. El metodo de reivindicacion 1, en el que el polipeptido Oct4 puesto en contacto con la celula humana no pluripotente comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
  8. 8. El metodo de reivindicacion 5 o la reivindicacion 6, en el que uno o mas del polipeptido Oct4, el polipeptido Klf, el polipeptido Sox, o el polipeptido Myc puesto en contacto con la celula humana no pluripotente comprende una secuencia de aminoacidos que potencia el transporte a traves de las membranas celulares.
  9. 9. Una mezcla que comprende:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    (I) (a) celulas de mai^ero, que comprenden un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 exogeno; (b) un activador de PDK1 de molecula pequena; (c) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; (d) un inhibidor de MEK de molecula pequena; y (e) un inhibidor de hDaC de molecula pequena; o
    (II) (a) celulas de mairnfero; (b) un polipeptido Oct4 exogeno; (c) un activador de PDK1 de molecula pequena alosterico; (d) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; (e) un inhibidor de MEK de molecula pequena; y (f) un inhibidor de HDAc de molecula pequena; o
    (III) (a) celulas de mamffero, que comprenden un polinucleotido que codifica un polipeptido Oct4 exogeno y un polinucleotido que codifica un polipeptido Klf4 exogeno; (b) un activador de PDK1 de molecula pequena; (c) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; y (d ) un inhibidor de MEK de molecula pequena; o
    (IV) (a) celulas de mai^ero; (b) un polipeptido Oct4 exogeno y un polipeptido Klf4 exogeno; (c) un activador de PDK1 de molecula pequena alosterico; (d) un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena; y (e) un inhibidor de MEK de molecula pequena.
  10. 10. La mezcla de la reivindicacion 9(III) o la reivindicacion 9(IV), en la que la mezcla comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) de molecula pequena.
  11. 11. La mezcla de la reivindicacion 9(III) o la reivindicacion 9(IV) o la reivindicacion 10, en la que:
    a) el receptor de TGFp/inhibidor de ALK5 de molecula pequena es SB431542 o A-83-01;
    b) el inhibidor de MEK de molecula pequena es PD0325901; o
    c) el inhibidor de HDAC de molecula pequena es acido valproico (VPA) o butirato de sodio (NaB).
  12. 12. La mezcla de la reivindicacion 9(I) o la reivindicacion 9(II), en la que la mezcla comprende ademas al menos un polipeptido exogeno seleccionado entre el grupo que consiste en: un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox; o en la que las celulas de mamffero en la mezcla comprenden ademas al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido exogeno seleccionado entre el grupo que consiste en: un polipeptido Klf, un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox.
  13. 13. La mezcla de la reivindicacion 9(III) o la reivindicacion 9(IV), en la que la mezcla comprende ademas al menos
    un polipeptido exogeno seleccionado entre el grupo que consiste en: un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox; o en la que las celulas de mamnfero en la mezcla comprenden ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido exogeno seleccionado entre el grupo que consiste en: un polipeptido Myc, y un polipeptido Sox.
  14. 14. La mezcla de la reivindicacion 9, en la que al menos un 99% de las celulas son celulas no pluripotentes.
  15. 15. La mezcla de la reivindicacion 9, en la que las celulas son celulas humanas.
  16. 16. La mezcla de la reivindicacion 9, en la que el activador de PDK1 de molecula pequena alosterico es: acido (Z)-5-
    (4-clorofeni)-3-fenilpent-2-enoico ("PS48"), acido (Z)-5-(4-bromo-2-fluorofenil)-3-fenilpent-2-enoico ("PS08"), acido 2- (3-(4-clorofenil)-3-oxo-1-fenilpropiltio)acetico, acido (Z)-5-(naftalen-2-il)-3-fenilpent-2-enoico ("12Z"), o acido (Z)-5- (1H-Indol-3-il)-3-fenilpent-2-enoico ("13Z").
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