ES2624905T3 - Uso de fosfatasa alcalina para la desintoxicación de LPS - Google Patents

Abstract

El uso de fosfatasa alcalina para la fabricación de un medicamento para administrar a una capa mucosal del tracto gastrointestinal para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal, en donde la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, enterocolitis y enterocolitis necrotizante.

Description

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DESCRIPCION

Uso de fosfatasa alcalina para la desintoxicacion de LPS Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la medicina y en particular al uso de enzimas desintoxicantes y neutralizantes de LPS. La presente invencion se refiere ademas al campo de la farmacia y en particular al uso farmaceutico de enzimas de fosfatasa alcalina como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invencion

Los lipopolisacaridos (LPS, denominados ademas endotoxinas) estan presentes en las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas. Cuando el LPS se presenta en un organismo vertebrado estimula las respuestas inmunitarias innata y celular en una amplia variedad de tipos celulares. La produccion de citocinas y quimiocinas (tales como TNF, diversas interleucinas, interferones y otros) atraera y activara las celulas del sistema inmunitario, lo que puede culminar en ultima instancia en un slndrome de respuesta inflamatoria sistemica inducida por LPS (SIRS) en determinadas condiciones.

Los LPS o endotoxinas son toxicos para la mayorla de los mamlferos e independientemente de la fuente bacteriana, todas las endotoxinas producen la misma variedad de efectos biologicos en el huesped animal. La inyeccion de celulas Gram-negativas vivas o muertas, o LPS purificado, en animales experimentales produce un amplio espectro de reacciones fisiopatologicas no especlficas, tales como: fiebre, taquicardia, taquipnea, hiper o hipotermia, cambios en el conteo de globulos blancos, coagulacion intravascular diseminada, hipotension, disfuncion de organos, y puede resultar incluso en shock y muerte.

La inyeccion de pequenas dosis de endotoxina da como resultado una respuesta proinflamatoria en la mayorla de los mamlferos, pero el intervalo de respuesta a la dosis y su gradiente varlan significativamente con las especies e incluso dentro de las especies pueden diferir significativamente en dependencia, por ejemplo, de la tolerancia al LPS. La secuencia de eventos proinflamatorios sigue un patron regular (cascada inflamatoria): (1) perlodo latente; (2) malestar fisiologico (diarrea, postracion, shock); y en caso de choque septico grave y fallo multiorganico puede resultar en (3) la muerte. El tiempo en que ocurre la muerte varla segun la dosis de la endotoxina, la via de administracion y la especie del animal.

Los efectos fisiologicos de la endotoxina estan mediados principalmente por el motivo denominado llpido A de LPS. Dado que el llpido A esta embebido en la membrana externa de las celulas bacterianas, solo ejerce sus efectos toxicos cuando se libera de las celulas multiplicadoras en forma soluble, o cuando las bacterias se lisan como resultado de la autolisis, el complemento y el complejo de ataque a la membrana (MAC), la ingestion y la muerte por fagocitos, o la muerte con determinados tipos de antibioticos. El LPS liberado al torrente sangulneo puede ser neutralizado por muchos componentes de la sangre en un determinado grado, entre ellos varios llpidos y protelnas plasmaticas, entre ellos protelnas de union a LPS. El complejo de protelna de union a LPS interactua con CD14 y receptores de tipo Toll en monocitos y macrofagos y a traves de otros receptores en las celulas endoteliales. En los monocitos y macrofagos se desencadenan tres tipos de eventos durante su interaccion con el LPS:

En primer lugar, la produccion de citocinas, que incluyen IL-1, IL-6, IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) y factor activador de plaquetas. Estas a su vez estimulan la produccion de prostaglandinas y leucotrienos. Estos son mediadores poderosos de la inflamacion y el choque septico que acompana a la toxemia por endotoxina. El LPS activa los macrofagos para aumentar la fagocitosis y la citotoxicidad. Los macrofagos se estimulan para producir y liberar enzimas lisosomicas, IL-1 ("pirogeno endogeno") y factor de necrosis tumoral (TNF alfa), as! como otras citocinas y mediadores.

En segundo lugar, la activacion de la cascada del complemento. C3a y C5a provocan la liberacion de histamina (que conduce a vasodilatacion) y el efecto de quimiotaxis y acumulacion de neutrofilos. El resultado es la inflamacion.

Finalmente, activacion de la cascada de coagulacion. La activacion inicial del factor de Hageman (Factor de coagulacion XII) puede activar varios sistemas humorales que dan lugar a la coagulacion: una cascada de coagulacion sangulnea que conduce a coagulacion, trombosis, coagulacion intravascular diseminada aguda, que agota las plaquetas y diversos factores de coagulacion lo que resulta en sangramiento interno y ademas activacion de la via alternativa del complemento (como se explico anteriormente, que conduce a la inflamacion). Se activa la plasmina, lo que conduce a fibrinolisis y hemorragia, y la activacion de quinina libera bradicininas y otros peptidos vasoactivos que provocan hipotension. El efecto neto es la induccion de inflamacion, coagulacion intravascular, hemorragia y shock.

El LPS actua ademas como un mitogeno de celulas B al estimular la diferenciacion policlonal y multiplication de las celulas B y la secretion de inmunoglobulinas, especialmente IgG e IgM.

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Las actividades fisiologicas del LPS estan mediadas principalmente por el componente denominado Llpido A del LPS. El llpido A es un potente modificador de la respuesta biologica que puede estimular el sistema inmunitario de mamlferos. Durante una enfermedad infecciosa provocada por bacterias Gram-negativas, las endotoxinas liberadas de las celulas multiplicadoras, o parte de estas, tienen efectos similares en los animales y contribuyen significativamente a los slntomas y la patologla de la enfermedad encontrada. Se ha dilucidado la estructura primaria del llpido A y se ha sintetizado qulmicamente el llpido A. Su actividad biologica parece depender de una conformacion peculiar determinada por el disacarido de glucosamina, los grupos PO4, las cadenas acilo y ademas el nucleo interno que contiene KDO de la molecula de LPS.

La fosfatasa alcalina (AP), se ha descrito anteriormente como una enzima clave en la desfosforilacion del LPS (endotoxina) en condiciones fisiologicas tanto in vitro como in vivo como una respuesta natural para desintoxicar y neutralizar el LPS (patente de Estados Unidos 6,290,952, Poelstra y otros, Am J Pathol., 1997 Oct; l5l (4): 1163-9).

Los informes sobre la actividad enzimatica de AP implican su pH extremadamente alto optimo para los sustratos exogenos usuales y su localizacion como ectoenzima. Las endotoxinas son moleculas que contienen varios grupos fosfato y usualmente estan presentes en el espacio extracelular. La AP es capaz de desfosforilar este producto bacteriano a niveles de pH fisiologicos, mediante la eliminacion de grupos fosfato de, entre otros, el motivo toxico que es el llpido A del LPS. Como los residuos de fosfato en el motivo del llpido A determinan la toxicidad de la molecula, el efecto del inhibidor de AP levamisol in vivo mediante el uso de un modelo de septicemia en la rata confirmo la especificidad de la AP para el LPS que contiene grupos fosfato (Poelstra y otros, 1997). Los resultados demostraron que la inhibicion de la AP endogena por el levamisol reduce significativamente la supervivencia de ratas inyectadas por via intraperitoneal con bacterias E. coli, a la vez que este farmaco no influye en la supervivencia de ratas que reciben una dosis subletal de la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aureus, lo que demuestra un papel crucial para esta enzima en la defensa del huesped. Los efectos del levamisol durante las infecciones de bacterias Gram-negativas y la localizacion de la AP como ectoenzima en la mayorla de los organos, as! como la induccion de la actividad enzimatica durante las reacciones inflamatorias y la colestasis, estan de acuerdo con este papel protector.

La fuente principal de exposicion al LPS en el cuerpo humano son los microorganismos Gram negativos que viven dentro del tracto digestivo o gastrointestinal humano (GI). Hay muchas mas bacterias en el sistema digestivo que las presentes en la piel u otras partes del cuerpo, por lo que el tracto GI y la mucosa GI son la principal via de entrada de LPS a la circulacion. Un adulto promedio porta aproximadamente 100 billones de bacterias en los intestinos, la mayorla de las cuales se localizan en el colon, contribuyendo a 1-1,5 kg de su peso corporal. Existen mas de 400 especies de bacterias que se encuentran en el sistema digestivo. Estas incluyen tanto especies beneficiosas (comensales) como potencialmente daninas (patogenas), que compiten continuamente para mantener una flora intestinal bien equilibrada.

Las superficies mucosas, y en particular (pero sin limitaciones) la mucosa intestinal, estan expuestas a esta amplia variedad de bacterias comensales y potencialmente patogenas, entre las cuales estan muchas bacterias Gram- negativas productoras de endotoxina/LPS, tales como E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus, Helicobacter, Chlamydia y otros patogenos principales. El epitelio intestinal es de particular importancia ya que forma una barrera dinamica que regula la absorcion de nutrientes y agua y al mismo tiempo restringe la entrada de microbios y otros materiales nocivos como el LPS desde el lumen intestinal.

Esta bien establecido que una fraccion importante del influjo de LPS desde el lumen del intestino a traves del revestimiento de la mucosa hacia la circulacion de un cuerpo vertebrado esta mediada a traves de quilomicrones (Harris y otros, 1998, 2000, 2002). De manera coincidente con la ingestion de llpidos y la introduction de quilomicrones en la circulacion, capaces de portar LPS, se informa de un aumento significativo en la AP linfatica derivada del tracto gastrointestinal (Nauli y otros, 2002). El influjo de LPS a traves de la barrera GI se incrementa normalmente con una dieta rica en grasa saturada. El LPS se inserta con su cadena acilo del llpido A en los fosfollpidos de lipoprotelnas. De esta manera, el LPS pasa la barrera intestinal mediante migration conjunta con quilomicrones, que se absorben predominantemente en el Ileon del intestino delgado (Harris y otros, 2002). Despues de una ingesta de alimentos ricos en grasas, en la linfa se detecta ademas un aumento significativo de la AP anclada al glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) formando complejos con lipoprotelnas (Nauli y otros, 2003).

Los roles fisiologicos y la interpretation de los niveles sericos de AP no estan claros, pero un papel en la desintoxicacion de LPS ha surgido de la investigation actual. La presencia conjunta tanto de AP como LPS en fracciones ricas en quilomicrones sugiere un papel de la AP en la desfosforilacion del LPS derivado del intestino ya en estrecha proximidad. La desintoxicacion puede tener lugar tanto en el lumen intestinal como en el camino hacia el hlgado, o tras la presentation en este, especlficamente en este contexto a las celulas de Kuppfer y los hepatocitos, que limpian los quilomicrones de la circulacion.

El aumento de los niveles sericos de AP se asocia con dano hepatico. Tras una agresion con endotoxina, la AP circulante se redirige a los hepatocitos, lo que reduce de esta manera los niveles de AP circulante inicialmente (Bentala y otros, 2002) a traves de la captation mediada por receptores (receptor de asialoglicoprotelna). Los hepatocitos tambien eliminan rapidamente los quilomicrones cargados con LPS de la circulacion (Harris y otros, 2002) con un tiempo de vida media de 5-10 minutos. Despues el LPS se elimina a traves de la excretion biliar, lo que impide de esta manera

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la activacion de las celulas de Kupffer, las cuales son un objetivo principal para el LPS circulante (Harris, 2002). Bentala y otros, 2002, mostraron que las celulas de Kupffer tambien acumulan AP en modelos animales retados con LPS. Esto puede implicar que en condiciones normales las celulas de Kuppfer no se activaran ya que el LPS (el motivo de llpido A), o su derivado MPLS (MPLA, derivado del Llpido A), se presenta principalmente a los hepatocitos a traves de un receptor de lipoprotelna y despues se elimina por secrecion biliar. Sin embargo, en condiciones con exceso de LPS, las celulas de Kupffer se activan a traves de un receptor TLR-4 (LPS).

Una amplia variedad de animales tienen AP y varias otras entidades presentes para contrarrestar una agresion (bacteriana), ya sea local o sistemica, las que se inducen o estan disponibles como funcion de vigilancia/defensa. Entre otros, los neutrofilos o macrofagos activados expresan una amplia variedad de mediadores inflamatorios destinados a neutralizar la agresion. Se ha descrito que motivos tales como, pero sin restricciones, la protelna de union a LPS (LBP), CD14, Apo-E, VLDL, HDL, albumina, inmunoglobulina y AP, todos realizan esta funcion. Sin embargo, cuando dicha agresion no se supera, por ejemplo, en el caso de una agresion grave de bacterias Gram negativas o positivas, los mediadores inflamatorios resultantes pueden iniciar un slndrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS).

Se postulo que la AP se agota como consecuencia de su accion catalltica hacia el LPS (Poelstra y otros, 1997). Esto implica que posteriormente los niveles normales deben restaurarse a traves de un mecanismo controlado. En pacientes que padecen de septicemia, se ha observado que el aumento de la AP serica puede estar precedido de reduction de los niveles sericos de Ap (Manintveld y Poelstra, solicitud de patente EP 989626940) y que la AP circulante se eliminarla de la circulation tras la interaction con LPS (Bentala y otros, 2002). Por lo tanto, el aumento en los niveles de AP posteriores puede ser un mecanismo de retroalimentacion en respuesta a esta reduccion de AP. Hasta la fecha no se ha descrito un mecanismo para tal capacidad de respuesta de LPS/Ap.

En los procesos inflamatorios se encuentran aumentos (temporales) en la AP serica. En el contexto de esta invention, tal aumento de AP se considera como una respuesta natural del sistema inmunitario innato a una agresion por LPS para hacer frente a estas agresiones y restablecer el equilibrio natural. El aumento de los niveles plasmaticos de AP es el resultado de la liberation masiva de AP desde los hepatocitos en respuesta a la agresion por LpS. Se ha observado que el LPS induce la actividad de la fosfolipasa-D (Locati y otros, 2001) que a su vez se ha informado que actua sobre las protelnas ancladas al GPI, entre las que se incluyen AP (Deng y otros, 1996) y, por ejemplo, CD14 lo que libera de esta manera las protelnas a la circulacion (Zhang F y otros, 2001, Locati M. y otros, 2001).

Por lo tanto, la AP plasmatica circulante -predominantemente la AP de tipo hepatica sin anclaje (Ahn y otros, 2001)- puede ya haber ejercido su actividad desintoxicante de LPS en la superficie de la membrana plasmatica y posteriormente se libera de la membrana de los hepatocitos a la circulacion antes de su elimination posterior de la circulacion mediante, por ejemplo, la ruta de asialo glicoprotelna.

La AP ejerce su actividad catalltica hacia el LPS principalmente en la vecindad de una membrana, posiblemente en las llamadas balsas lipldicas (drm o fraction de membrana resistente al detergente) donde se ha informado que se localiza. Varias publicaciones favorecen tal actividad catalltica de AP en la superficie de membranas, ya sea presentada a nivel de tejido o liberada a la circulacion como con fragmentos circulantes de membrana plasmatica hepatica (LPMF) (por ejemplo Deng y otros, 1996). El aumento de los niveles de AP observados en los pacientes inflamados cronicamente puede estar provocado por la desintoxicacion suboptima del influjo de LPS derivado del intestino, que frecuentemente aumenta en condiciones patologicas antes de la movilizacion de la AP hepatica.

El tratamiento de enfermedades inflamatorias representa un porcentaje sustancial del costo medico en bruto en los palses desarrollados y la incidencia de estas enfermedades inflamatorias esta en aumento continuo debido a factores clave como el envejecimiento de la poblacion y un numero creciente de pacientes con un sistema inmunitario deprimido como consecuencia de medicamentos y tratamiento de una amplia variedad de enfermedades como enfermedades cardlacas, trastornos de autoinmunidad y alergias, trasplantes de organos, quimioterapia o radioterapia contra el cancer y enfermedades infecciosas como el SIDA. Hasta cierta medida, estas enfermedades se relacionan con un influjo de LPS bacteriano. El influjo de LPS frecuentemente aumenta por la afeccion medica de un sujeto, que provoca un proceso inflamatorio por un sistema inmunitario innato defectuoso o no equilibrado, que constituye la primera llnea de defensa contra, por ejemplo, agresiones microbianas, en particular de bacterias productoras de LPS/endotoxinas.

La presente invencion tiene como objeto proporcionar composiciones para la desintoxicacion, neutralization o formation de complejos del LPS in situ en tejidos mucosos en cavidades corporales antes que el LPS pueda pasar a traves de la capa mucosal y entrar en la circulacion donde provocarla efectos toxicos y/o una respuesta inflamatoria.

Descripcion

Definiciones:

Las endotoxinas son parte de la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. Las endotoxinas se asocian invariablemente con bacterias Gram-negativas sean los organismos patogenos o no. Aunque el termino "endotoxina" se utiliza ocasionalmente para referirse a cualquier toxina bacteriana asociada a celulas, esta

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reservado adecuadamente para referirse al lipopolisacarido o complejo LPS asociado con la membrana externa de bacterias Gram-negativas tales como Escherichia (E. coli), Salmonella, Shigella, Pseudomonas (Ps. Aeruginosa), Neisseria (N. meningitidis), Haemophilus (H. influenzae), Chlamydia (Chl. Pneumoniae), Helicobacter (H. pylori) y otros patogenos principales.

Los lipopolisacaridos son moleculas anfifllicas complejas con un peso molecular monomerico de aproximadamente 10 kDa, que varlan ampliamente en la composicion qulmica tanto entre las especies bacterianas como dentro de ellas. El LPS consiste en tres componentes o regiones, Llpido A, un polisacarido R y un polisacarido O. El llpido A contiene la region hidrofoba de anclaje a membrana del LPS. El llpido A consiste en un dlmero fosforilado de N-acetilglucosamina (NAG) con 6 o 7 acidos grasos (FA) unidos. El antlgeno del nucleo (R) o polisacarido R se une a la posicion 6 de una NAG. El antlgeno R consiste en una cadena corta de azucares. Normalmente estan presentes dos azucares inusuales, la heptosa y el acido 2-ceto-3-desoxioctonoico (KDO), en el polisacarido nucleo. KDO es unico y esta presente invariablemente en el LPS y por lo tanto ha sido un indicador en los ensayos de LPS (endotoxina).

Con pequenas variaciones, el polisacarido nucleo y el llpido A son comunes a todos los miembros de un genero bacteriano (por ejemplo Salmonella), pero son estructuralmente distintos en otros generos de bacterias Gram-negativas. Salmonella, Shigella y Escherichia tienen nucleos similares pero no identicos.

La actividad biologica de la endotoxina se asocia con el lipopolisacarido (LPS). La toxicidad se asocia con el componente lipldico (Llpido A) y la inmunogenicidad se asocia con los componentes polisacaridos. Los antlgenos de la pared celular (antlgenos O) de las bacterias Gram-negativas son componentes del LPS. El LPS induce una variedad de respuestas inflamatorias en un animal. Debido a que activa el complemento por la via alternativa (properdina), frecuentemente es parte de la patologla de las infecciones de bacterias Gram-negativas.

El ensayo de Limulus (LAL) es un bioensayo bien conocido en la tecnica para medir las concentraciones y la toxicidad del LPS. El ensayo se basa en un sistema de defensa primitivo exquisitamente sensible del antiguo cangrejo herradura, Limulus polyphemus. Un ensayo basado en este sistema puede medirse mediante un cambio de color despues de la escision de sustratos cromogenicos o fluorogenicos. LAL puede usarse para medir cantidades de sub-picogramos de estos productos microbianos muy rapidamente con un equipamiento mlnimo y puede detectar organismos vivos, muertos y no cultivables. Las celulas sangulneas de Limulus, o amebocitos, del cangrejo herradura constituyen una defensa inmunitaria "innata" primitiva, que se une a las estructuras de la pared celular externa de la celula microbiana y provoca una reaccion de coagulacion de la sangre. Se ha demostrado que el LPS soluble, as! como los componentes de la pared celular de otros microbios, tales como los beta glucanos en levaduras y hongos, provocan que la sangre del cangrejo herradura se coagule. Se sabe ahora que esta reaccion de coagulacion es una cascada enzimatica cuyos componentes estan presentes en granulos dentro del amebocito. Un lisado de los amebocitos se produce mediante la recoleccion de celulas sangulneas con un metodo esteril, sin endotoxina y que esta disponible como un producto comercial (LAL, Charles River Endosafe, Charleston, SC) utilizado actualmente como un ensayo para LPS y desintoxicacion de LPS mediante enzimas AP y composiciones que comprenden fuentes de AP.

Fosfatasa alcalina (AP): EC 3.1.3.1 de acuerdo con la Nomenclatura de Enzimas segun la IUBMB, el nombre comun es fosfatasa alcalina (AP), una enzima que cataliza la reaccion de un monoester de fosfato + H2O = un alcohol + fosfato. Otros nombres para la AP son fosfomonoesterasa alcalina; fosfomonoesterasa; glicerofosfatasa; fosfohidrolasa alcalina; fenil fosfatasa alcalina; fosfohidrolasa de monoester ortofosforico (alcalina optima). El nombre sistematico de la AP es fosfato-monoester fosfohidrolasa (alcalina optima).

La AP es una enzima de amplia especificidad, que ademas cataliza transfosforilaciones. En humanos y otros mamlferos, se conocen al menos cuatro fosfatasas alcalinas distintas pero relacionadas. Estas son fosfatasa alcalina intestinal, placentaria, similar al tipo placentario, y de hlgado/hueso/rinon (o sin especificidad tisular). Las tres primeras se encuentran juntas en el cromosoma 2, mientras que la forma no especlfica del tejido se encuentra en el cromosoma 1. Las funciones fisiologicas exactas de las AP no se conocen, pero la AP parece estar involucrada con un gran numero de procesos fisiologicos, entre los cuales esta la desintoxicacion de LPS a traves de la desfosforilacion del motivo de llpido A determinante de la toxicidad del LPS. Para la presente invencion, el termino fosfatasa alcalina puede comprender cualquier enzima que muestre desintoxicacion de LPS segun se determina por un ensayo de Limulus u otro bioensayo. La actividad de una enzima AP o composicion o preparacion que comprende AP puede determinarse por desintoxicacion de LPS disponible comercialmente (por ejemplo Lipopolisacarido (LPS) de Sigma, num. de catalogo L- 8274) in vitro, seguido por un ensayo de Limulus estandar (LAL) antes y despues del tratamiento con AP. Alternativamente, la reduccion de la toxicidad del LPS mediante la actividad de AP puede cuantificarse por un bioensayo como se describe por Beumer y otros, 2003.

La mucosa es una membrana secretora de moco que recubre todas las cavidades o pasajes del cuerpo que se comunican con el exterior. La mucosa es un tejido humedo que reune muchos organos (como los intestinos) y las cavidades corporales (como la nariz, la boca, los pulmones, la vagina, el conducto biliar, el esofago) y secreta moco (un fluido espeso). La mucosa, o membrana mucosa, es un tipo de tejido que protege las cavidades corporales de las condiciones ambientales, patogenos y sustancias toxicas y generalmente son tejidos humedos banados por secreciones (tales como las secreciones en el intestino, pulmon, nariz, boca y vagina).

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Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion esta dirigida a proporcionar composiciones para la desintoxicacion de LPS in situ en tejidos mucosos en cavidades corporales. Un primer objetivo de la desintoxicacion in situ del LPS en las superficies mucosas del cuerpo es prevenir o reducir la respuesta inflamatoria local en tales superficies. Ademas, el LPS que se desintoxica de esta manera ya no esta disponible para pasar a traves de las capas mucosas y por lo tanto no puede entrar en la circulacion donde ejercerla sus efectos toxicos y/o provocarla una respuesta inflamatoria local y/o sistemica adicional. La desintoxicacion puede comprender ademas la neutralizacion o la formacion de complejos del LPS por la AP, que por estrecha proximidad puede formar una composicion detoxificada. Los metodos comprenden el uso de fuentes de fosfatasa alcalina, conocidas por ser un medio potente para la desintoxicacion de LPS. Una fuente de AP puede ser cualquier enzima AP, o cualquier composicion que comprenda la enzima AP y cualquier medio que pueda producir una enzima AP funcional en el contexto de la presente invencion, tal como acidos nucleicos ADN o ArN que codifican una enzima AP. El acido nucleico que codifica una AP puede incorporarse en vectores adecuados tales como plasmidos, fagemidos, fagos, (retro)virus, transposones, vectores de terapia genica y otros vectores capaces de inducir o conferir produccion de AP. Tambien microorganismos nativos o recombinantes, tales como bacterias, hongos, protozoos y levaduras pueden aplicarse como una fuente de AP en el contexto de la presente invencion.

En una primera modalidad, la invencion proporciona composiciones para usar en el metodo para la prevencion o reduccion de la toxicidad del LPS en un revestimiento mucoso de una cavidad corporal de mamlfero que comprende la etapa de administrar una fuente de AP en la capa mucosa. La invencion se refiere ademas al uso de AP como se definio anteriormente, o al uso de una composicion que contiene una fuente de fosfatasa alcalina como se definio anteriormente. La fuente de AP se usa para la fabricacion de un medicamento para la administracion de AP en una capa mucosa para la prevencion o reduccion del influjo del LPS toxico a traves de un revestimiento mucoso de una cavidad corporal de mamlfero. En una modalidad adicional, la invencion proporciona un metodo para la prevencion o reduccion del influjo del LPS toxico a traves de un revestimiento mucoso de una cavidad corporal de mamlfero que comprende la etapa de administrar una fuente de AP en la capa mucosa.

En particular, el metodo antes mencionado de administrar una fuente de AP en las capas mucosas de cavidades corporales es adecuado para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades mediadas o exacerbadas por LPS, aunque el metodo tambien puede usarse ventajosamente en sujetos sanos como tratamiento profilactico dirigido a la prevencion de la toxicidad inducida por LPS y/o enfermedades inducidas o exacerbadas por LPS. Los efectos beneficiosos de la administracion de AP para reducir los niveles toxicos de LPS en las cavidades corporales y en las capas mucosas de acuerdo con la presente invencion generaran un efecto general promotor de la salud independientemente de la condition medica del sujeto tratado. El efecto promotor de la salud puede aumentarse aun mas por la disminucion posterior del influjo de LPS a traves de las capas mucosas. Una enfermedad mediada o inducida por LPS puede ser cualquier enfermedad, slntoma o grupo de slntomas provocados por la toxicidad del LPS. Una enfermedad exacerbada por LPS puede ser cualquier enfermedad o slntoma que no es causado directamente por el LPS o por la toxicidad del LPS, sino una enfermedad cuyos slntomas y caracterlsticas cllnicas pueden agravarse por el LPS y el estado cllnico del sujeto que padece tal enfermedad empeora por LPS y por la toxicidad del LPS.

En la presente se describe ademas una composicion para usar en un metodo destinado al tratamiento de enfermedades mediadas o exacerbadas por LPS seleccionadas del grupo que consiste en: sepsis/choque septico, slndrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), meningococcemia, trauma/choque hemorragico, lesiones por quemaduras, cirugla cardiovascular/derivacion cardiopulmonar, cirugla/trasplante hepatico, enfermedad hepatica, pancreatitis, enterocolitis (necrotizante), enfermedad periodontal, neumonla, fibrosis qulstica, asma, enfermedad coronaria, insuficiencia cardlaca congestiva, enfermedad renal, slndrome uremico hemolltico, dialisis renal, enfermedades autoinmunitarias, cancer, Alzheimer, artritis reumatoide, lupus, lupus eritematoso sistemico.

La endotoxina circulante se ha detectado en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales, particularmente en pacientes diagnosticados con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Su presencia es la consecuencia del dano a la mucosa intestinal y aumento del influjo de LPS o translocation intestinal y provoca o exacerba la respuesta inflamatoria en los intestinos. La translocacion bacteriana intestinal y la translocacion intestinal de LPS tambien se observa en pancreatitis aguda y enfermedades hepaticas provocadas por cirrosis, abuso de alcohol, ictericia obstructiva y otras afecciones hepaticas. La endotoxina se ha implicado ademas en el desarrollo de la enfermedad periodontal, donde penetra en el epitelio gingival/mucosa, y provoca una respuesta inflamatoria local. En una modalidad preferida, el metodo comprende la administracion oral de una fuente de AP para reducir la toxicidad de LPS y/o el paso de LPS a traves de la mucosa.

El modo de administracion preferido comprende el uso de composiciones farmaceuticas que comprenden fuentes de AP, que pueden administrarse en un regimen de dosis diarias para reducir los niveles de LPS toxicos en el lumen del tracto GI durante un perlodo prolongado de tiempo. Preferentemente, las composiciones farmaceuticas comprenden un revestimiento enterico para proteger la AP de los efectos perjudiciales de los jugos gastricos (pH 1,0 a 2,5) y asegurar un suministro eficaz de AP en la mucosa del tracto intestinal. Con mayor preferencia, la composicion farmaceutica es una fuente de AP comprendida dentro de un revestimiento enterico.

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Los revestimientos entericos detienen la liberation del compuesto activo de las formas de dosificacion ingeribles oralmente. En dependencia de la composition y/o el espesor, los revestimientos entericos son resistentes al acido del estomago durante los perlodos de tiempo requeridos antes de que comiencen a desintegrarse y permitan la liberacion lenta de AP (farmaco) en el estomago inferior o en la parte superior del intestino delgado. Ejemplos de algunos revestimientos entericos se describen en la patente de Estados Unidos num. 5,225,202. Los ejemplos de revestimientos entericos comprenden cera de abejas y monoestearato de glicerilo; cera de abejas, goma laca y celulosa, opcionalmente con un copollmero neutro de esteres de acido polimetacrllico; copollmeros de acido metacrllico y metilesteres de acido metacrllico o copollmero neutro de esteres de acido polimetacrllico que contienen estearatos metalicos (para referencias de revestimientos entericos ver las patentes de Estados Unidos nums. 4,728,512, 4,794,001, 3,835,221, 2,809,918, 5,225,202, 5,026,560, 4,524,060, 5,536,507). La mayorla de los pollmeros de revestimiento enterico comienzan a volverse solubles a pH 5,5 y superiores, con unas velocidades de solubilidad maximas a pH por encima de 6,5. Los revestimientos entericos pueden comprender ademas etapas de subrevestimiento y revestimiento externo, por ejemplo para composiciones farmaceuticas destinadas a un suministro especlfico en el tracto GI inferior, es decir, en el colon (pH 6,4 a 7,0, Ileon pH 6,6), en oposicion a un pH en el intestino superior, en el duodeno del intestino delgado el pH varla de 7,7 a 8 (despues de los jugos pancreaticos y la adicion de la bilis). Las diferencias de pH en los intestinos pueden ser explotadas para dirigir la composicion de AP con revestimiento enterico a un area especlfica en el intestino. Permite ademas la selection de una enzima AP especlfica que sea mas activa a un pH particular en el intestino. Por ejemplo, la CIAP (AP intestinal de ternero) y la AP de placenta humana (HPLAP) son las mas activas a un pH alcalino de 8,2 en el duodeno, yeyuno e Ileon del intestino delgado, mientras que la AP derivada de la leche y la AP de hueso/hlgado/rinon o sin especificidad tisular (AP TSN) son mas activas a pH neutro y se adaptan mejor para el tratamiento del colon (pH 7,4).

Los tejidos mucosos de mayor preferencia para tratar de acuerdo con la presente invention son los tejidos mucosos que recubren las cavidades corporales del tracto intestinal. La AP administrada por via oral se suministra en los tejidos mucosos del tracto GI, que comprende esofago, estomago, intestino delgado (duodeno, yeyuno, Ileon) e intestino grueso o colon (ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide, recto y ano). Dentro del alcance de la presente invencion, ademas los tejidos mucosos que recubren la boca, los conductos biliares y el pancreas forman parte del tracto intestinal y pueden tratarse de acuerdo con el metodo de la presente invencion.

Las composiciones que comprenden una fuente de AP de acuerdo con la presente invencion son particularmente adecuadas para la administration oral para prevenir, tratar, reducir, tratar o aliviar enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal. Las enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal pueden inducirse y/o exacerbarse significativamente por el influjo de LPS. Una reduction en la cantidad de LPS toxico en el lumen de los intestinos mediante la administracion de fuentes de AP, a traves de la desintoxicacion del motivo de llpido A del LPS, da lugar a una disminucion correspondiente en el influjo sistemico de LPS toxico en la circulation de un sujeto. En una modalidad de mayor preferencia, la administracion oral de fuentes de AP es particularmente preferida para la profilaxis o el tratamiento de las siguientes enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal: enfermedad de Crohn, colitis, enterocolitis (necrotizante), colitis ulcerosa, enfermedad hepatobiliar, hepatitis B, hepatitis C, cirrosis hepatica, fibrosis hepatica, inflamacion de los conductos biliares, obstruction biliar, pancreatitis, pancreatitis aguda, peritonitis y enfermedad periodontal.

En otra modalidad de la invencion, una fuente de AP se administra oralmente a sujetos que padecen de un aumento de la permeabilidad mucosal del tracto gastrointestinal. El aumento de la permeabilidad mucosal del tracto GI es frecuentemente el resultado de una disminucion de la perfusion o isquemia de los intestinos. La isquemia, falta del suministro de oxlgeno por el torrente sangulneo, puede ser provocada por insuficiencia cardlaca, lesiones, trauma o cirugla. La isquemia de los intestinos da como resultado un mal funcionamiento de la mucosa y un consiguiente aumento del influjo o la translocation de LPS toxico desde el intestino, que da como resultado toxicidad local y sistemica e inflamacion. La toxicidad y la respuesta inflamatoria pueden incluso aumentar aun mas la permeabilidad de la mucosa, lo que da como resultado un clrculo vicioso. El aumento de la permeabilidad de la mucosa del tracto GI puede ser el resultado de enfermedades inflamatorias intestinales u otras condiciones patologicas del tracto GI. La administracion oral de fuentes de AP de acuerdo con la presente invencion reducira o suprimira significativamente este aumento del influjo de LPS toxico mediante desintoxicacion de LPS en el lumen de las cavidades intestinales. La administracion exogena de AP rompera el clrculo vicioso del influjo de LPS a traves de la mucosa, la inflamacion y el aumento de la permeabilidad de la mucosa que da lugar a un aumento del influjo de LPS. La disminucion de la perfusion o la isquemia de los intestinos y un aumento concomitante de LPS se observa en el siguiente grupo de enfermedades o afecciones: quemaduras, traumatismos y/o heridas que pueden ser el resultado de accidentes, heridas de bala o cuchillo, cirugla y en particular cirugla con derivation cardiopulmonar. Ademas el mal funcionamiento de la funcion cardlaca, tal como en cardiopatla congenita, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad coronaria y cardiopatla isquemica puede dar lugar a isquemia de los intestinos y un aumento del influjo de LPS. Una modalidad preferida de la presente invencion es el tratamiento de sujetos que padecen este grupo de enfermedades y afecciones con una administracion oral oportuna y regular de composiciones que comprenden una fuente de AP para prevenir o reducir el influjo de LPS a traves de la mucosa intestinal con una aumento de la permeabilidad para LPS.

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En otra modalidad, la presente invencion esta dirigida a proporcionar una fuente de AP en el revestimiento mucoso del tracto respiratorio. El tracto respiratorio es otra cavidad corporal con un revestimiento mucoso que se expone a los efectos toxicos del LPS. El LPS, libre o asociado a bacterias inhaladas, penetra en la mucosa bronquial y pulmonar del tracto respiratorio mediante la respiracion normal, por inhalacion por ejemplo de partlculas de polvo, o por infecciones de las vlas respiratorias y tejidos mucosos con bacterias gram negativas. Ademas, se sabe que el tabaco es una fuente rica en LPS y fumar, de manera pasiva o activa, tambien puede contribuir significativamente a la carga de LPS de la mucosa bronquial y pulmonar. En condiciones normales este LPS se desintoxica por el sistema de defensa inmunitario mucosal local en el tracto respiratorio. Por lo tanto, en otra modalidad preferida, la presente invencion se refiere a la administracion de una fuente de AP por inhalacion, a la mucosa bronquial y pulmonar para prevenir o reducir el influjo de LPS a traves de la mucosa del tracto respiratorio para las condiciones donde las respuestas de defensa normales al LPS no funcionan bien. La presente invencion proporciona ademas composiciones adecuadas para la administracion de AP en la mucosa bronquial y pulmonar. Estas composiciones se administran preferentemente para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio. En una modalidad de mayor preferencia, se aplica una administracion pulmonar de una fuente de AP de acuerdo con la presente invencion para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en neumonla, infecciones pulmonares, asma, CARA, fibrosis qulstica, bronquitis y enfisema. En la presente se describen ademas dispositivos de atomizacion cargados con una composicion que comprende una fuente de AP y opcionalmente diversos excipientes tales como propelentes, portadores, nebulizadores y/o difusores, adecuados para la administracion de AP en la mucosa pulmonar y bronquial. Los dispositivos de atomizacion, los inhaladores y los nebulizadores se conocen en la tecnica de las formulaciones farmaceuticas y seran evidentes para el experto en la tecnica, referencia Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA. 17ma ed. 1985.

Aun en otra modalidad, la presente invencion esta dirigida a la administracion topica de una fuente de AP a una capa mucosa que reviste una cavidad corporal. En una modalidad preferida, la cavidad corporal es la cavidad nasal, cavidad oral, vagina o recto. La administracion topica de una fuente de AP a un tejido mucoso que reviste una cavidad corporal se aplica preferentemente para tratar enfermedades inflamatorias locales o sistemicas y se prefiere particularmente para el tratamiento o la profilaxis de infecciones de las cavidades nasal, vaginal, oral o rectal, enfermedades e infecciones de transmision sexual, infecciones del tracto urinario, infecciones de la vejiga y enfermedad periodontal.

La presente invencion proporciona ademas composiciones que comprenden una fuente de AP, entre las que se encuentran composiciones farmaceuticas y nutraceuticas que comprenden una fuente de AP. Las composiciones pueden comprender opcionalmente excipientes, estabilizadores, activadores, portadores, permeadores, propelentes, desinfectantes, diluyentes y conservantes farmaceuticamente aceptables. Los excipientes adecuados se conocen comunmente en la tecnica de las formulaciones farmaceuticas y pueden encontrarse y aplicarse facilmente por el experto en la tecnica, referencias, por ejemplo, Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia PA, 17ma ed. 1985. En una modalidad preferida, las composiciones que comprenden una fuente de AP son adecuadas para la administracion oral y comprenden un revestimiento enterico para proteger la AP de los efectos adversos de los jugos gastricos y el pH bajo. Las formulaciones de revestimiento enterico y de liberacion controlada se conocen bien en la tecnica (referencias como las descritas anteriormente). Las composiciones de revestimiento enterico en la tecnica pueden comprender una solucion de un pollmero de revestimiento enterico soluble en agua mezclado con el o los ingredientes activos tales como AP y otros excipientes, los cuales se dispersan en una solucion acuosa y posteriormente pueden secarse y/o comprimirse. El revestimiento enterico formado ofrece resistencia al ataque a la AP por la humedad atmosferica y el oxlgeno durante el almacenamiento y por los fluidos gastricos y el pH bajo despues de la ingestion, a la vez que se descompone facilmente en las condiciones alcalinas que existen en el tracto intestinal inferior.

Las composiciones que contienen AP para el suministro de AP a los tejidos mucosos para la desintoxicacion de LPS de acuerdo con la presente invencion comprenden preferentemente una Ap eucariotica, con mayor preferencia una AP de mamlfero, que puede ser de los tipos de AP sin especificidad tisular, tal como del tipo de hlgado-hueso o rinon, o con especificidad tisular, tal como la AP placentaria y AP intestinal. Con mayor preferencia, la AP de mamlfero es una AP humana o una AP de bovino.

En una modalidad preferida de la presente invencion, la fuente de AP es AP que se produce o se alsla preferentemente a partir de la leche, preferentemente leche bovina. La leche puede obtenerse de animales que se han cruzado o modificado geneticamente para producir niveles elevados de Ap en su leche en comparacion con animales de tipo silvestre. La preparacion de fracciones enriquecidas en AP a partir de la leche se conoce en la tecnica. Por ejemplo, la fraccion enriquecida o derivada de la membrana de los globulos de la leche es la fraccion de leche enriquecida en AP preferida y puede obtenerse rutinariamente mediante el desnatado convencional de la leche cruda. La AP aislada de la leche puede formularse en composiciones farmaceuticas y en composiciones alimenticias o en nutraceuticos.

En una modalidad preferida, la composicion que contiene AP para la administracion oral de AP a la mucosa del tracto gastrointestinal de acuerdo con la presente invencion es un producto alimenticio o nutraceutico enriquecido en AP. En una modalidad, el producto alimenticio puede ser una planta, fruto o verdura, opcionalmente modificados geneticamente para contener un mayor nivel de AP. En otra modalidad, el producto alimenticio o nutraceutico que contiene AP es un producto lacteo. En particular, las preparaciones y composiciones que contienen leche no pasteurizada o sus fracciones,

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preferentemente leche bovina, contienen altos niveles de AP y son particularmente adecuadas para la administracion oral como una fuente de AP de acuerdo con la presente invencion.

En la presente se describe ademas un metodo para la preparacion de un producto lacteo enriquecido en AP, preferentemente leche, una fraccion de leche o producto lacteo. El metodo comprende el fraccionamiento de leche cruda, preferentemente leche bovina, la pasteurizacion de las fracciones que no contienen o no son ricas en AP y reformular dichas fracciones con las fracciones ricas en AP, no pasteurizadas, para obtener un producto lacteo menos perecedero y enriquecido en AP. Las fracciones ricas en AP no pasteurizadas pueden esterilizarse mediante otros medios, tales como, pero sin limitaciones, irradiacion con rayos UV, X o gamma, filtracion, presion, presion osmotica, productos qulmicos o antibioticos, asegurando que la enzima AP permanezca sustancialmente activa y que la fraccion de leche se vuelva sustancialmente esteril. Este producto lacteo puede usarse en composiciones o administrarse directamente a sujetos que padecen o estan en riesgo de desarrollar una enfermedad y/o inflamacion mediadas o exacerbadas por LPS. Sin embargo, el producto lacteo enriquecido en AP puede ofrecerse ademas a sujetos sanos como un producto farmaceutico o nutraceutico para la reduction de LPS toxico en el tracto gastrointestinal y para la reduction del influjo de LPS a traves de la mucosa gastrointestinal.

Ejemplos

Ejemplo 1

La presente invencion, y en particular la eficacia de las enzimas AP, preparaciones y composiciones, y diferentes modos de administracion de AP, pueden ensayarse en diversos modelos animales para enfermedades inflamatorias intestinales que se conocen en la tecnica. Los modelos animales que imitan la EII humana comprenden colitis inducida por antlgeno y colitis inducida por microbios; otras formas inducibles de colitis, modelos de colitis por qulmicos (por ejemplo, acido trinitrobenceno sulfonico (TNBS) en Montfrans y otros, 2002), inmunologica, flsica y genetica (modelos transgenicos y por desactivacion, ver por ejemplo ratones SCID, Davis y otros, 2003, ratones KO para IL-10, Rennick y otros, 2000, raton SAMP1/Yit, Kosiewicz, y otros, 2001 y Strober y otros, 2001); modelos de transferencia adoptiva y modelos de colitis espontanea (Kosiewicz, M.M. y otros, 2001).

El modelo de colitis por dextran sulfato sodico (DSS) inducido qulmicamente se describio originalmente por Okayasu y otros; Gastroenterology, 1990: 98, 694-702, y es un modelo para la colitis ulcerosa humana. El modelo comprende colitis ulcerosa aguda y cronica en ratones causada por la administracion de DSS al 3-10 % en su agua potable. Los cambios morfologicos y los cambios en la microflora intestinal son similares a los observados en casos cllnicos de colitis ulcerosa. El dano en el colon se desarrolla debido a un efecto toxico del DSS en las celulas epiteliales y a la fagocitosis por celulas de la lamina propia, lo que da como resultado la production de TNF-alfa e IFN-gamma.

Diseno experimental para la colitis aguda por DSS:

El DSS (PM 40 000 obtenido de ICN chemicals) se disuelve en agua potable acidificada en una concentration del 5 % (p/v) y se administra ad libitum a ratones hembras Balb/c (Harlan). La solution se cambia todos los dlas. Despues de 7 dlas de tratamiento, los ratones tratados y control pueden sacrificarse y se analizan los intestinos. Se diseca todo el colon (desde el ciego hasta el recto) y se registra su longitud. Aproximadamente la mitad del colon se congela en nitrogeno llquido y se obtienen criosecciones para el estudio de la morfologla (tincion con HE). Las pequenas partes del bazo y el hlgado tambien se congelan instantaneamente en nitrogeno llquido con fines inmunohistoqulmicos. Una pequena parte del colon se utiliza para preparar homogenados de tejido para las mediciones de citocinas. Se cultivan pequenas tiras de colon en RPMI/FCS al 10 % durante 24 h en ausencia o presencia de LPS. La secretion de citocinas (TNF alfa, IL-1 beta, IFN gamma) en el sobrenadante se mide mediante el uso de ensayos ELISA especlficos. El bazo y los ganglios linfaticos mesentericos se disecan y se trituran para preparar suspensiones de celulas individuales. Se disecan 4 placas de Peyer cerca del colon y se obtienen suspensiones de celulas individuales mediante el uso de colagenasa. Las celulas se caracterizan mediante tecnicas de citometrla de flujo. Las celulas del bazo se cultivan durante 24 h en RPMI/FCS al 10 % en ausencia o presencia de LPS o Con A. Se mide la secrecion de citocinas (TNF alfa, IL1 beta, IFN gamma) en el sobrenadante mediante el uso de ensayos ELISA especlficos. Se recolectan heces y se cultivan en placas de agar McConkey para determinar el contenido de enterobacterias. Para el contenido total de bacterias aerobias, las heces se cultivan en placas de agar sangre.

Resultados

Los ensayos descritos anteriormente se usan para determinar la eficacia de composiciones que comprenden AP in vivo. Se observan reducciones en la secrecion de citocinas; se miden disminuciones en los niveles de TNF alfa, IL-1 beta e IFN gamma en los intestinos inflamados tras la administracion oral de la fraccion de membrana de globulos de la leche rica en fosfatasa alcalina de leche bovina.

Ejemplo 2: Los ratones tratados con AP desarrollan colitis menos grave despues del tratamiento con TNBS o DSS Materiales y metodos:

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Diseno experimental:

Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Para el primer experimento con DSS se obtuvieron 42 ratones C57BL/6 de tipo silvestre de ocho semanas de edad y para el experimento con TNBS se obtuvieron 20 ratones BALB/c de tipo silvestre de ocho semanas de edad de Charles River y Harlan Nederland (Horst, Palses Bajos), respectivamente. Para un segundo experimento con DSS, se obtuvieron 72 ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad de Charles River Nederland. Durante los experimentos, los ratones se alojaron en condiciones estandar y se les permitio libre acceso al agua y los alimentos.

En el primer experimento con ratones C57BL/6, la colitis se indujo por administracion de dextran sulfato sodico (DSS) al 1,5 % (n = 18) o 2,5 % (n = 20) en el agua potable de los ratones durante una semana.

En los ratones BALB/c, la colitis se indujo por administracion rectal en el dla cero y siete de 1 mg de acido 2,4,6- trinitrobenceno sulfonico (TNBS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos) disuelto en etanol al 40 % en PBS mediante el uso de un cateter de vinilo que se coloco a tres centlmetros del ano. Antes de la instilacion, los ratones se anestesiaron mediante el uso de isoflurano (1-cloro-2,2,2,-trifluoroetil-isofluranodifluorometileter) (Abbott Laboratories Ltd., Queen-borough, Kent, Reino Unido) y despues de la instilacion los ratones se mantuvieron verticalmente durante 30 segundos. Despues de 48 horas de la segunda administracion de TNBS, los ratones se sacrificaron.

Durante la induccion de la colitis, diez ratones BALB/c y veinte C57BL/6 recibieron oralmente 100 unidades de fosfatasa alcalina disueltas en 100 pl de Tris 100 mM (pH 7,8) una vez al dla; los otros ratones recibieron exclusivamente 100 pl de Tris 100 mM (pH 7,8). Cuatro ratones C57BL/6 se utilizaron como un control de referencia: no se indujo colitis ni recibieron ningun tratamiento.

Para un segundo experimento con DSS, se indujo colitis en ratones C57BL/6 (n = 48) por administracion de DSS al 2 % en el agua potable durante 5 dlas. Veinticuatro de estos ratones recibieron 100 unidades de fosfatasa alcalina en 250 pl de Tris 100 mM (pH 7,8) una vez al dla a partir del dla 5 hasta el dla 14, mientras que los otros 24 ratones recibieron vehlculo solo. Un grupo de 24 ratones que recibieron agua potable normal y vehlculo solo, sirvio como control de referencia. Esta configuration se utilizo para investigar el uso de AP como un medicamento de rescate, una vez que se establece la colitis.

En todos los experimentos, el peso y la temperatura de los ratones se registraron diariamente. Despues de sacrificar los ratones, se extrajeron el nodulo linfatico caudal (CLN) y el colon de los ratones. A traves de una incision en la llnea media, el colon se retiro y se abrio longitudinalmente. Despues de retirar el material fecal, se midio el peso del colon y se utilizo como indicador del engrosamiento intestinal relacionado con la enfermedad. El colon se dividio en dos partes, una de las cuales se utilizo para el analisis histologico y la otra para la detection de citocinas.

Analisis histologico:

El colon dividido longitudinalmente se fijo en formaldehldo al 4 %, se embebio en parafina para una histologla de rutina. Tres cortes transversales (5 pm), tomados de cada muestra de colon, se tineron con hematoxilina-eosina y se examinaron mediante microscopla optica. La inflamacion del colon se evaluo a ciegas mediante la estimation de 1) el porcentaje de area afectada, 2) la cantidad de follculos, 3) edema, 4) fibrosis, 5) erosion/ulceracion, 6) perdida de criptas y 7) infiltration de granulocitos y 8) monocitos con una puntuacion maxima de 26.

El porcentaje de area afectada y la perdida de criptas se clasificacion mediante una escala que esta en el intervalo de 0 a 4 de la siguiente manera: 0, normal; 1, menos del 10 %; 2, 10 %; 3, 10 a 50 %; 4, mas del 50 %. Los agregados foliculares se contaron y se clasificaron de la siguiente manera: 0 punto, 0-1 follculos; 1 punto, 2-3 follculos; 2 puntos, 45 follculos; 3 puntos, mas de 6 follculos. Las erosiones se definieron como 0 si el epitelio estaba intacto, 1 para la ulceration que involucraba la lamina propia, 2 ulceraciones que involucraban la submucosa, y 3 cuando las ulceraciones eran transmurales. La gravedad de los otros parametros se clasifico en una escala de 0 a 3 de la siguiente manera: 0, ausente; 1, debil; 2, moderada; 3, grave.

Cultivo de celulas:

Las celulas del nodulo linfatico caudal de ratones con TNBS se aislaron al pasar el ganglio linfatico a traves de filtros de celulas de 40 pm (Becton/Dickson Labware, New Jersey, Estados Unidos). Los linfocitos aislados se suspendieron en 4 ml de medio RPMI 1640, que incluye L-glutamina, 10 % de suero fetal de ternero (FCS) y antibioticos (penicilina G sodica 10000 U/ml, sulfato de estreptomicina 25 pg/ml, anfotericina B 25 pg/ml; Gibco/BRL, Paisley, Escocia). Las celulas se contaron y se anadieron a placas de 96 pocillos de fondo plano a 2 x 105 celulas por pocillo en un volumen total de 200 pl del mismo medio. Las celulas se cultivaron en presencia de a-CD3 inmovilizado (concentration 1:30, clon 145.2C11) y a-CD28 soluble (concentracion 1:1000, PharMingen) durante 48 horas a 37 °C. El sobrenadante se recogio y se utilizo para un ensayo de perlas para citocinas (CBA).

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Homogeneizacion y determinacion enzimatica

Las laminas suizas de las muestras de colon que se tomaron 6 cm desde el ano se congelaron en el nitrogeno. Los homogenados se obtuvieron con un homogeneizador de tejidos en 9 volumenes de tampon de lisis Greenberger (NaCl a 300 mmol/l, Tris a 15 mmol/l, MgCl2 a 2 mmol/l, Triton X-100 a 2 mmol/l (Sigma, St. Louis, MO) Pepstatina A, Leupeptina, Aprotinina (Roche, Mannheim, Alemania), todas a 20 ng/ml, pH 7,4). El tejido se liso durante una hora sobre hielo y se centrifugo durante 7 minutos a 3000 rpm y durante 10 minutos a 14 000 rpm. El sobrenadante se recogio y se almaceno congelado hasta el dla de la determinacion enzimatica y el analisis de matriz de cuentas para citocinas de BD.

Las heces de los ratones se recogieron durante el perlodo de colitis. El peso de las heces se registro y se suspendieron en 0,6 ml de tampon de glicina 50 mM con MgCl2 0,5 mM (pH = 9,6 a 25 °C). Despues de la centrifugacion (10', 13 000 rpm), el sobrenadante se almaceno congelado hasta el dla de la determinacion de la actividad de la fosfatasa alcalina.

La actividad de la fosfatasa alcalina en el colon y las heces se midio mediante espectrofotometrla, con el uso de fosfato de p-nitrofenilo como sustrato en tampon de glicina 50 mM con MgCl2 0,5 mM (pH = 9,6 a 25 °C). La actividad enzimatica se expreso en mU/ml para los homogenados de colon y en mU/mg para las heces.

Ensayo de perlas para citocinas (CBA)

Se realizo un ensayo de perlas para citocinas para determinar simultaneamente la produccion de TNF-a, IFN-y, IL-2, IL- 4 e IL-5 en los homogenados de colon y el sobrenadante del cultivo de celulas CLN de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de Becton Dickinson (BD) y como se describe en otra parte (37, ver la figura 2.2). Brevemente, las partlculas (perlas de poliestireno) se tineron para cinco intensidades de fluorescencia. El colorante patentado tenia una longitud de onda de emision de ~ 650 nm (FL-3). Cada partlcula se acoplo a traves de un enlace covalente basado en la qulmica de tiol-maleimida con un anticuerpo contra una de las cinco citocinas y represento una poblacion discreta, unica en su intensidad de FL-3. Las partlculas con Ac sirvieron como captura para una citocina dada en el panel de inmunoensayo y pudieron detectarse simultaneamente en una mezcla. Las citocinas capturadas se detectaron por medio de inmunoensayo directo mediante el uso de cinco anticuerpos diferentes acoplados a ficoeritrina (PE), que emitio a ~ 585 nm (FL-2). Los patrones que estan en el intervalo de 0 a 2000 pg/ml eran mezclas de las cinco citocinas, de manera que se obtuvieron cinco curvas patron. Para cada muestra y mezcla patron de citocinas, 10 pl del reactivo Ac-perla de captura, de las muestras o del reactivo Ac-PE de deteccion se incubaron durante tres horas y se lavaron para eliminar el reactivo Ac-PE de deteccion no unido antes de la adquisicion de datos mediante el uso de citometria de flujo. El analisis por citometria de flujo de dos colores se realizo mediante el uso de un citometro de flujo FACScan® (Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS), San Jose, CA). Los datos se adquirieron y analizaron mediante el uso del programa informatico Cytometric Bead Array (CBA) de Becton Dickinson.

Analisis Estadistico

Todos los datos se expresaron como la media ± la desviacion estandar. Donde se indica, se utilizo una prueba t de Student para calcular la significacion estadistica para la diferencia en una medicion particular entre los diferentes grupos. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadisticamente significativos (* p < 0,05).

Resultados

Para investigar si la AP oral tiene potencial terapeutico en la Ell, se utilizaron como modelos la colitis inducida por TNBS y DSS en ratones. Tal como se predijo, la instilacion intrarrectal de TNBS y la administracion oral de DSS dieron como resultado diarrea y emaciacion. En el dia dos, murieron dos de los diez ratones en cada uno de los dos grupos de tratamiento (ver las figuras 2 y 3) lo que indico que la AP no previene la mortalidad debido a la respuesta inflamatoria temprana. Dos o tres dias despues de la administracion intrarrectal inicial de TNBS se activa una reaccion reactiva hipersensible retardada de tipo 4 y provoca la mayor parte de la inflamacion, lo que conduce a una mortalidad adicional. Aunque el tratamiento con AP no pudo evitar la muerte de los ratones durante esta primera reaccion, evito muertes adicionales debido a la respuesta inflamatoria secundaria.

En los grupos que recibieron DSS al 2 % en su agua potable durante 5 dias con posterior administracion de AP por sonda gastrica hasta 14 dias, el 33 % de los ratones murieron entre el dla 8 y 10 en el grupo tratado con AP. Despues de eso ningun raton murio en este grupo. Sin embargo, en el grupo tratado con placebo, en total 60 % de los ratones murieron a partir del dla 8 hasta el dia 14. Similar al modelo con TNBS, la AP es capaz de reducir la mortalidad en la etapa posterior de colitis por DSS, pero no en la fase de induccion.

Despues de la primera administracion de TNBS, el peso de los ratones habia disminuido en el primer dia tanto en los ratones tratados con AP como en los ratones control (ver la figura 4). Sin embargo, el peso de los ratones control se redujo hasta el 92 % de su peso inicial en el dla cuatro, mientras que el peso de los ratones tratados con AP se incremento hasta mas del 98 % de su peso inicial y se estabilizo. En el sexto dla, los ratones control tambien alcanzaron su peso inicial. Por lo tanto los efectos sobre el peso estan casi sincronizados con los beneficios descritos para la supervivencia.

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En los estudios con DSS, solo el segundo grupo que recibio DSS al 2 % y se siguio hasta los 14 dlas mostro diferencias estadlsticamente significativas en los dlas 10, 11 y 12 (figura 5). Los otros dos grupos se siguieron solo hasta el dla 7 y mostraron, como el primer grupo, que no hay diferencia entre los grupos tratados AP y no tratados hasta ese dla (datos no mostrados).

Ejemplo 3, La produccion de citocinas y la actividad de AP disminuyeron en el colon de ratones tratados con AP

Los homogenados de colon de ratones con TNBS y DSS se analizaron para la produccion de citocinas mediante un ensayo de perlas para citocinas para investigar la magnitud de la respuesta Th1. En contraste con el aumento de la produccion de citocinas en el CLN de ratones tratados con AP, la produccion de TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4 e IL-5 disminuyo en los homogenados de colon de estos ratones en comparacion con los ratones control, pero no significativamente (ver la tabla 1). Los ratones con colitis inducida por DSS al 2,5 % confirman resultados similares, aunque estos resultados tampoco alcanzaron significacion estadlstica. (Datos no mostrados).

Tabla 1, Concentraciones de citocinas en homogenados de colon medidas mediante CBA

Ratones con TNBS control Ratones con TNBS tratados con AP

TNF-a

19,7 ± 12,4 10,8 ± 10,8

IFN-y

8,2 ± 5,5 4,0 ± 4,6

IL-2

4,4 ± 2,9 2,7 ± 2,6

IL-4

15,0 ± 7,0 8,9 ± 7,5

IL-5

5,9 ± 4,0 2,9 ± 3,8

Ratones con DSS al 1,5 Ratones con DSS al 1,5 % % control tratados con AP

TNF-a IFN-y

15,6 ± 5,1 100,5 ± 82,3 13,1 ± 5,4 28,4 ± 19,8

Ratones con DSS al 2,5 % control Ratones con DSS al 2,5 % tratados con AP

TNF-a

89,3 ± 122,3 60,7 ± 40,8

IFN-y

130,0 ± 85,5 83,2 ± 90,0

IL-2

13,2 ± 25,8 7,2 ± 6,0

IL-4

23,4 ± 42,5 24,7 ± 19,2

La produccion de IL-2, -4 y -5 en los ratones con DSS al 1,5 % fueron casi indetectables (datos no mostrados). La produccion de TNF-a se redujo en los ratones tratados con AP en comparacion con los ratones control con DSS, aunque no significativamente (ver la figura 7). En el caso de la produccion de IFN-y, las diferencias fueron significativas (p <0,05): la produccion de IFN-y disminuyo de 100,5 ± 82,3 pg/ml en ratones control con DSS a 31,6 ± 21,3 pg/ml en ratones tratados con AP.

Ejemplo 4, Ensayo farmacocinetico de dosis oral unica de BIAP en ratones Materiales y Metodos

El objeto de la investigacion fue la biodisponibilidad local y sistemica despues de una aplicacion unica de una dosis alta de BIAP (fosfatasa alcalina intestinal bovina) por via oral. El material de prueba se suministro como una solucion y se almaceno a 4 °C hasta su uso. Las diluciones de dosificacion en agua potable esterilizada en autoclave se prepararon el mismo dla del tratamiento. Se utilizo agua potable esterilizada en autoclave como solucion de control.

El raton negro/6 es una especie de roedor adecuada para la colitis inducida por DSS y es aceptable para las autoridades reguladoras para las pruebas de seguridad. La via de administracion oral corresponde al uso terapeutico que se pretende en seres humanos.

La sala de estudio y las jaulas se limpiaron y desinfectaron. Durante el estudio, la sala y las jaulas se limpiaron a intervalos regulares. La temperatura ambiente se ajusto a 22 ± 3 °C y la humedad relativa se mantuvo entre 30 % y 70 %. Estos parametros se controlaron diariamente. La luz artificial se ajusto a un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad con luz a las 6:00 a.m. El aire se cambio aproximadamente 8 veces por hora en la sala de los animales y se filtro adecuadamente. Los animales se alimentaron ad libitum con granulados con SDS D3, analizados por el proveedor para nutrientes y contaminantes. El agua potable esterilizada en autoclave estaba disponible continuamente ad libitum a traves de botellas para beber. El consumo se controla visualmente de manera diaria.

Tabla 2. Los grupos experimentales y el pretratamiento con DSS se asignaron de acuerdo con la siguiente tabla:

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Grupo

Tratamiento Num.de animales Etiquetado de tarjeta Conc. en agua potable Volumen [ml/kg de peso corporal]

Rojo

DSS 29 A - E (rojo) 2 % Ver la Tabla 3

verde

- 29 A - E (verde) - Ver la Tabla 3

Tabla 3. Los grupos experimentales y el tratamiento con BIAP se asignaron de acuerdo con la siguiente tabla:

Grupo

De la jaula Tratamiento Num. de animales Conc. en agua potable Volumen [ml/kg de peso corporal] Sacr. Tiempo (min)

Control A

A verde Placebo 5 - 12.5 150

Control B

B verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 10

Control C

B verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 30

Control D

C verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 60

Control E

C verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 90

Control F

D verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 120

Control G

D verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 180

Control H

E verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 240

Control I

E verde BIAP 3 6000 U/ml 12.5 360

DSS A

A rojo Placebo 5 - 12.5 150

DSS B

B rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 10

DSS C

B rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 30

DSS D

C rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 60

DSS E

C rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 90

DSS F

D rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 120

DSSG

D rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 180

DSS H

E rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 240

DSS I

E rojo BIAP 3 6000 U/ml 12.5 360

De acuerdo con la Tabla 3, todos los ratones excepto aquellos en los grupos placebo en ambos grupos control y tratados con DSS recibieron una dosis oral unica de 75 000 U/kg de BIAP por sonda gastrica oral (en 250 pl de agua potable esterilizada en autoclave). Los grupos placebo (n = 5) recibieron solo 250 pl de agua potable esterilizada en autoclave. Todos los animales se trataron una sola vez. Antes del tratamiento con BIAP, algunos de los animales se trataron con DSS de acuerdo la Tabla 2.

Despues de la extraccion de sangre, los intestinos del animal se prepararon y se recolectaron heces de cada tercera parte del intestino delgado y del colon por separado. Cada muestra se disolvio mediante agitacion vigorosa en 1 ml de tampon de glicina (25 mM, pH = 9,6)

Estas muestras se analizaron para determinar el contenido de fosfatasa alcalina mediante el uso de un ensayo para la determinacion de la actividad de la fosfatasa alcalina. El fosfato de paranitrofenilo, que es incoloro, se hidroliza por la fosfatasa alcalina a pH 9,6 y 25 °C para formar paranitrofenol libre, que es de color amarillo. La reaccion puede seguirse espectrofotometricamente. El cambio en la densidad optica a 405 nm por unidad de tiempo es una medida de la actividad de la fosfatasa alcalina. La cantidad de enzima que provoca la hidrolisis de un micromol de fosfato de paranitrofenilo por minuto a pH 9,6 y 25 °C se define como una unidad. La cantidad de unidades presentes en una muestra puede calcularse o calibrarse contra una curva de muestras de AP con una concentracion de Ap conocida.

Resultados

Durante la fase de pretratamiento con DSS, los ratones se pesaron diariamente como una indication para el desarrollo de colitis. La perdida de peso de aproximadamente 10 % en comparacion con los ratones control se usa para identificar la colitis inducida por DSS. En el dla 6, los ratones que se trataron durante 5 dlas con DSS hablan perdido alrededor del 10 % de peso corporal (figura 8) y se usaron en el experimento farmacocinetico para identificar la biodisponibilidad local y sistemica de la BlAP administrada durante la colitis. Un dla despues, se usaron ratones control de la misma manera.

Para analizar la captation de DSS, las botellas de beber se pesaron diariamente antes y despues del rellenado de las botellas. Los primeros tres dlas, los animales tratados con DSS consumieron aproximadamente la misma cantidad de agua que los animales control. Posteriormente, los ratones con DSS bebieron menos, probablemente como resultado de

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la disminucion del bienestar. Sin embargo, la ingesta diaria de DSS fue de aproximadamente 40 mg/raton, que demostro ser suficiente para la induccion de colitis en otros experimentos (ver la figura 9).

El objetivo de este estudio fue analizar la biodisponibilidad local en el tracto intestinal. Para este proposito, los ratones se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo y se aislo el tracto intestinal desde el duodeno hasta el colon. El intestino delgado (incluido el duodeno) se dividio en dos tres partes iguales. Se extrajeron heces de cada parte y del colon y se midio la actividad de la fosfatasa alcalina. En la figura 10, se muestra la actividad de la fosfatasa alcalina en las diferentes partes del intestino en diferentes puntos de tiempo. No se pudo medir la fosfatasa alcalina en ningun punto de tiempo en el duodeno y en la parte proximal del yeyuno. Esto se debio probablemente al hecho de que el paso a traves de esta parte tiene lugar en cuestion de 10 minutos, el primer punto de muestreo. A los 10 minutos tanto los animales control como con DSS tienen niveles maximos de fosfatasa alcalina en la parte distal del yeyuno y la parte proximal del Ileon. Entre media hora y una hora, se producen valores maximos de AP en la parte distal del Ileon. En el colon, la fosfatasa alcalina se incrementa una hora y media despues de la sonda gastrica y despues de seis horas, la mayor parte de la fosfatasa alcalina se excreto o se descompuso.

Considerando que se administro un total de 1350 U por raton, se estima una biodisponibilidad local en la parte distal del Ileon y el colon a 200/1350 = 15 % y 80/1350 = 6 %, respectivamente. Sin embargo, estos valores son probablemente una subestimacion, ya que se basan en valores maximos medios de 3 ratones individuales cada uno (ver el analisis).

El objetivo de este estudio fue estimar la biodisponibilidad local de BIAP despues de la administracion de una dosis alta oral. La biodisponibilidad local se estimo en 15 % en la parte distal del Ileon y 6 % en el colon. Estos valores estan probablemente subestimados, debido a que los valores son de ratones individuales en un punto de tiempo dado y no representan la actividad de la fosfatasa alcalina a traves del tracto de un raton seguido en el tiempo. Como consecuencia, pueden faltar valores maximos en ratones individuales en una parte dada del intestino en un punto de tiempo dado. Sin embargo, los resultados como se muestra en la figura 10 demuestran claramente la biodisponibilidad local de AP tras la administracion oral. Estos resultados ponen de relieve la viabilidad del metodo de la presente invencion para administrar a un sujeto una fuente de fosfatasa alcalina para prevenir o reducir el influjo de LPS (toxico) a traves de un revestimiento mucosal de una cavidad corporal de mamlfero.

Figuras

La Figura 1 explica el modelo de la presente invencion en tres etapas, 1. Mucosa en una condition sana, con histoqulmica de AP normal y desintoxicacion de LPS. 2. Condicion patologica, tincion de AP deficiente, insuficiente desintoxicacion de LPS por AP, influjo/translocacion de LPS toxico desde el intestino hacia la circulation, lo que conduce a una respuesta inflamatoria 3. Restauracion de los niveles de AP de la mucosa y desintoxicacion de LPS al proporcionar una fuente exogena de AP.

Figura 2, Tasa de letalidad en ratones con colitis inducida por TNBS Figura 3, Tasa de letalidad en ratones con colitis inducida por DSS

Figura 4, Perdida de peso en ratones tratados con AP y no tratados, con colitis inducida por TNBS.

Figura 5, Perdida de peso en animales tratados con AP y no tratados, con colitis inducida por DSS

Figura 6, Production de citocinas en el colon de ratones con colitis por TNBS.

a. La respuesta TH1 en el colon

b. La respuesta TH2 en el colon

Figura 7, La concentration de a. TNF-a y b. IFN-y en homogenados de colon. Los ratones control tienen valores normales de ratones no enfermos y no tratados.

Figura 8, el tratamiento con DSS disminuye el peso corporal. Los ratones se trataron con agua potable normal o con agua potable que contenla DSS al 2 % durante 5 dlas. En el dla seis, los animales tratados con DSS hablan perdido alrededor del 10 % de peso corporal en comparacion con los animales control y se definieron como "collticos". Se muestran las medias con las desviaciones estandar de 29 animales por grupo.

Figura 9, los ratones tratados con DSS consumen entre 40-80 mg de DSS por dla. Los ratones se trataron con agua potable o agua potable que contenla DSS al 2 %.

Las botellas de bebida se pesaron antes y despues de rellenar. Los valores muestran la ingesta media de agua en g/raton/dla.

Figura 10, Niveles de fosfatasa alcalina en diferentes partes del tracto intestinal en diferentes puntos de tiempo despues de la sonda gastrica. En diferentes puntos de tiempo despues de la sonda gastrica, los ratones se sacrificaron y los intestinos se extrajeron. Se recogieron heces de diferentes partes del tracto y se midio el contenido de fosfatasa alcalina. Se muestran valores de las medias de tres ratones por punto de tiempo.

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Referencias:

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   Reivindicaciones

   1. El uso de fosfatasa alcalina para la fabricacion de un medicamento para administrar a una capa mucosal del tracto gastrointestinal para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal, en donde la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, enterocolitis y enterocolitis necrotizante.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la fosfatasa alcalina es para administracion oral.
3. 3. El uso de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde la permeabilidad de la mucosa del tracto gastrointestinal para el LPS aumenta debido a una disminucion de la perfusion o isquemia de los intestinos.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la fosfatasa alcalina es para administracion topica en una capa mucosa del tracto gastrointestinal.
5. 5. Una composicion que comprende fosfatasa alcalina, en donde la fosfatasa alcalina tiene un revestimiento enterico para la administracion oral y el suministro a la mucosa intestinal.
6. 6. La composicion de conformidad con la reivindicacion 5, en donde la fosfatasa alcalina es una fosfatasa alcalina intestinal de mamlfero, fosfatasa alcalina sin especificidad tisular, fosfatasa alcalina placentaria o fosfatasa alcalina hepatica.
7. 7. La composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde la fosfatasa alcalina es recombinante, humana o bovina.
8. 8. La composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la composicion es un producto alimenticio o nutraceutico enriquecido con fosfatasa alcalina, adecuado para la ingestion oral y el suministro de fosfatasa alcalina al revestimiento mucosal del tracto gastrointestinal.
9. 9. La composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el producto alimenticio es un producto lacteo que comprende fosfatasa alcalina.
10. 10. La composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el producto lacteo es una fraccion de leche o una leche no pasteurizada o parcialmente pasteurizada.
11. 11. La composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la fraccion de leche es la fraccion de membrana de globulos de la leche.