ES2625111T3

ES2625111T3 - Partículas nanolipídicas

Info

Publication number: ES2625111T3
Application number: ES06851496.7T
Authority: ES
Inventors: Michael W. Fountain
Original assignee: Nuvessl Inc
Current assignee: Nuvessl Inc
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: EP1973837A2; US8597678B2; US20170042826A1; US20140170226A1; EP3219307A1; WO2008005045A2; US9987234B2; EP1973837B1; US20140170227A1; US9480650B2; US8545874B2; US20120195940A1; WO2008005045A3; US8545875B2; US9399015B2; EP1973837A4; US20140072639A1; US20100239686A1; US20070154539A1; US9364434B2

Abstract

Un método para fabricar una población de conjunto de partículas nanolipídicas [PNL], que comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución precursora monofásica, formándose dicha solución precursora monofásica mediante: solubilización de un material anfipático que comprende fosfolípidos en una primera cantidad de disolvente no acuoso; adición de una cantidad de agua para formar una suspensión turbia; y adición de una segunda cantidad de disolvente no acuoso hasta que la suspensión turbia sea monofásica y tenga claridad óptica a temperatura ambiente; (b) mezclar una molécula pasajero seleccionada del grupo que consiste en moléculas pasajero lipófilas y anfipáticas con dicha solución precursora monofásica para formar una población de vehículos cargados; (c) diluir dicha población de vehículos cargados con una o más alícuotas de disolvente no acuoso para formar una población de partículas cargadas con PNL; (i) dicho disolvente no acuoso se añade de manera secuencial a la solución precursora después de la adición de una molécula pasajero, (ii) dicha población de vehículos cargados se combina con dicho disolvente no acuoso en una proporción que varía de aproximadamente 1 parte de la población de vehículo cargado a 20 partes de disolvente no acuoso, a una proporción de 1 parte de la población de vehículo cargado a 0,3 partes de disolvente no acuoso, (iii) donde dicha dilución de dicha población de vehículo cargado forma una población de partículas cargadas con PNL que tienen partículas nanolipídicas (PNL) de 1 nm a 20 nm de tamaño, determinándose dichos tamaños mediante dispersión de luz láser a temperatura ambiente y disminuyendo dicho tamaño de las PNL a medida que dicha concentración de disolvente no acuoso aumenta, y (d) mezclar una alícuota de dicha población de PNL cargadas con un disolvente acuoso para formar una población de conjunto de PNL que tiene un diámetro medio de partícula de 20 a 200 nm.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Partfculas nanolipfdicas Campo tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de incorporacion de moleculas pasajero en vesfculas lipfdicas. Antecedentes de la invencion

La incorporacion de moleculas pasajero, tales como principios activos farmaceuticas, en vesfculas lipfdicas, tales como liposomas, se ha notificado en la tecnica anterior. En la patente 5.269.979 se ha divulgado un portador anfipatico indicado como Microportador de dilucion en disolvente ("SDMC"). En general, la patente '979 describio la fabricacion de una pluralidad de vehfculos SDMC mediante la solubilizacion de un material anfipatico y una molecula pasajero en una primera cantidad de un disolvente no acuoso. Despues de esto, se anadio una primera cantidad de agua, que formo una suspension turbia. En una etapa posterior, se anadio una segunda cantidad de disolvente no acuoso para formar una solucion opticamente transparente. La ultima etapa de una realizacion preferente era organizar la solucion opticamente transparente en vehfculos SDMC mezclando con aire o una segunda cantidad de agua.

En la patente 5.879.703, se describio un metodo para preparar una solucion precursora estable en almacenamiento util para la encapsulacion remota de principios activos. En '703, la solucion precursora se preparo solubilizando un material anfipatico en un disolvente no acuoso. Se anadio a la primera mezcla una cantidad de agua para formar una solucion precursora caracterizada por claridad optica y que era monofasica a temperatura ambiente. La solucion precursora se podrfa almacenar durante un perfodo de tiempo prolongado y el principio activo deseado se anadio en un momento posterior, tal vez en una ubicacion remota, para formar una solucion precursora cargada. Los SDMC podrfan formarse, en realizaciones preferentes, a partir de la solucion precursora cargada mediante dilucion con agua o mezcla con aire. Los SDMC tenfan un tamano que oscilaba entre aproximadamente 230 y aproximadamente 412 nanometros de tamano.

Aunque los SDMC y la solucion precursora estable en el almacenamiento proporcionaron la fabricacion de vehfculos adecuados para liberar los principios activos en diversas aplicaciones, segufa existiendo la necesidad de vehfculos mejorados para la liberacion de moleculas pasajero.

Se ha descubierto ahora que la solucion precursora estable en almacenamiento, tal como la descrita en la patente '703, se puede usar como material de partida en un metodo novedoso que da como resultado vehfculos de un tamano mas pequeno que el descrito anteriormente. El material de partida se manipula mediante dilucion con un disolvente no acuoso, antes o despues de la carga con una molecula pasajero, para proporcionar una o mas poblaciones definidas de partfculas nanolipfdicas ("PNL") cuyo tamano varfa de aproximadamente 1 nanometro a aproximadamente 20 nanometros. Las PNL se forman a partir de las PNL cuyo tamano varfa de aproximadamente 30 nanometros a aproximadamente 200 nanometros. Ademas, se ha descubierto que las PNL pueden usarse en un metodo para fabricar preparaciones de vehfculo portador que son vehfculos portadores mas pequenos y mas grandes mezclados o que tienen un tamano medio mayor de aproximadamente 200-300 nanometros, pero mejor encapsulacion de moleculas pasajero.

La presente invencion se refiere a un metodo para fabricar una poblacion de conjuntos de partfculas nanolipfdicas [PNL], que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una solucion precursora monofasica, formandose dicha solucion precursora monofasica mediante; solubilizacion de un material anfipatico que comprende fosfolfpidos en una primera cantidad de disolvente no acuoso; adicion de una cantidad de agua para formar una suspension turbia; y adicion de una segunda cantidad de disolvente no acuoso hasta que la suspension turbia sea monofasica y tenga claridad optica a temperatura ambiente;

(b) mezclar una molecula pasajero seleccionada del grupo que consiste en moleculas pasajero lipofilas y anfipaticas con dicha solucion precursora monofasica para formar una poblacion de vehfculos cargados;

(c) diluir dicha poblacion de vehfculos cargados con una o mas alfcuotas de disolvente no acuoso para formar una poblacion de partfculas cargadas con PNL;

(i) dicho disolvente no acuoso se anade de manera secuencial a la solucion precursora despues de la adicion de una molecula pasajero,

(ii) dicha poblacion de vehfculos cargados se combina con dicho disolvente no acuoso en una proporcion que varfa de aproximadamente 1 parte de la poblacion de vehfculo cargado a 20 partes de disolvente no acuoso, a una proporcion de 1 parte de la poblacion de vehfculo cargado a 0,3 partes de disolvente no acuoso,

(iii) donde dicha dilucion de dicha poblacion de vehfculo cargado forma una poblacion de partfculas cargadas con PNL que tienen partfculas nanolipfdicas (PNL) de 1 nm a 20 nm de tamano, disminuyendo dicho tamano de las PNL a medida que aumenta la concentracion de dicho disolvente no acuoso,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

y

(d) mezclar una alfcuota de dicha poblacion de PNL cargadas con un disolvente acuoso para formar una poblacion de conjuntos de PNL, que tienen un diametro medio de partfcula de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nm.

Descripcion detallada

Las partfculas nanolipfdicas ("PNL") de acuerdo con la presente invencion tienen un tamano en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nanometros, medido mediante una tecnica estandar de dispersion de luz laser, que se trata con detalle en el presente documento. Pueden prepararse varias subpoblaciones de PNL. Las distintas subpoblaciones preferentes de NLP tienen un tamano en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 nm, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 nm, de aproximadamente 7 a

aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 nm, de aproximadamente 14 a

aproximadamente 18 nm y de aproximadamente 18 a aproximadamente 20 nm. Una subpoblacion preferente

comprende PNL que tienen un tamano promedio de aproximadamente 9 a 10 nanometros.

Las PNL se hacen a partir de una solucion precursora como se describe en la patente de Estados Unidos 5.879.703, Como se indica en la patente '703, se puede preparar una solucion precursora solubilizando un material anfipatico en una primera cantidad de un disolvente no acuoso apropiado para solubilizar el material anfipatico para formar una primera mezcla. El material anfipatico comprende fosfolfpidos (FL). Un FL preferente comprende uno o mas de los siguientes fosfatidos: fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), acido fosfatfdico (PA) y fosfatidilinositol (PI). En una realizacion preferente, se combinan PC, PE, PA y PI. Una proporcion preferente de FL utiles en la invencion es PC:PE:PA:PI de 6,5:2,5:0,7:0,3 en etanol. Preferentemente, se solubiliza un gramo de FL en 5,0-7,5 ml de disolvente de etanol.

Tras la disolucion del material anfipatico, se anade una cantidad de agua para formar una suspension turbia. La cantidad de agua a anadir es de aproximadamente 9 kg a 31 kg de material anfipatico disuelto, pero se puede variar para dar lugar a la suspension turbia deseada. Se anade una segunda cantidad de disolvente no acuoso, tal como etanol, hasta que la suspension turbia es monofasica y tiene la claridad optica a temperatura ambiente. Este producto resultante es una solucion precursora que es estable en el almacenamiento a lo largo del tiempo.

En la patente '703, se divulgo que una solucion precursora preparada de acuerdo con el proceso divulgado en la misma era estable en el almacenamiento durante hasta al menos dos anos, y tal vez mas, siempre y cuando permanezca en estado monofasico. Recientemente se ha determinado que las soluciones precursoras hechas mediante este metodo son estables durante al menos ocho anos, con independencia de la fabricacion, la localizacion, la estacion, el ano y el lote.

Actualmente, se ha descubierto que la solucion precursora, tal como la divulgada en '703 se puede usar como material de partida para preparar partfculas nanolipfdicas (PNL) y conjuntos de PNL. En '703, se divulgo que la solucion precursora era util para preparar SDMC en un momento posterior y, tal vez, una ubicacion remota. Los SDMC tienen un diametro de aproximadamente 230 a aproximadamente 412 nm. Por el contrario, las PNL tienen un diametro medio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm y los conjuntos de PNL tienen un diametro medio de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 200 nm.

Pueden hacerse diversas poblaciones de conjuntos de PNL para diversas aplicaciones. Las poblaciones preferentes oscilan de aproximadamente 40-60 nm; aproximadamente 60-80 nm; aproximadamente 80-110 nm; aproximadamente 110-140 nm; y aproximadamente 150-200 nm. Las poblaciones del conjunto de PNL tienen, generalmente, un diametro un 20-30 % mas pequeno que los SDMC para la misma molecula pasajero.

Una poblacion ligeramente mayor o poblacion mixta de vehfculos portadores se denomina en el presente documento ECV o vehfculos portadores de encapsulacion. Aunque se superponen al diametro medio de los SDMC, el ECV se fabrica utilizando un metodo diferente que emplea pNl y el resultado es una poblacion de vehfculos portadores que se ha descubierto que exhiben una eficacia de encapsulacion mayor. Se describe que los ECV tienen un diametro medio de aproximadamente 200 nm a 300 nm.

Para fabricar portadores de moleculas pasajero de acuerdo con el metodo divulgado, tales como poblaciones de PNL, conjuntos de PNL o ECV, la solucion precursora como se ha descrito previamente en la patente '703 se diluye con un disolvente adecuado o un sistema disolvente mixto que es compatible con el sistema de disolvente utilizado en la solucion precursora. Esta dilucion se realiza antes o despues de la adicion de la molecula pasajero, como se describira con mas detalle a continuacion. El disolvente se selecciona para determinar la biocompatibilidad si el uso final de los portadores va a requerir esa caracterfstica. El disolvente o el sistema disolvente mixto utilizado para la dilucion debe ser miscible con los disolventes en la solucion precursora y deberfa ser eficaz para dispersar en lugar de disolver los portadores. Mas preferentemente, el disolvente utilizado para la dilucion es etanol, ya que posee las cualidades deseadas. La dilucion se lleva a cabo, preferentemente, de una manera secuencial o en serie. Por ejemplo, una primera dilucion de 1:10 proporciona una poblacion de portadores y una dilucion adicional en serie a aproximadamente 1:0,5 proporciona una serie de poblaciones de portadores. El tamano de los portadores en cada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

dilucion puede determinarse mediante dispersion de luz laser. Pueden crearse poblaciones mixtas de PNL y vesfculas mas grandes con diluciones mas bajas con el disolvente no acuoso. Un instrumento adecuado para este fin es el Zetasizer 1000, fabricado por Malvern Instruments, (Worcestershire, Reino Unido). Los diametros de las partfculas indicados en el presente documento fueron determinantes usando el Modo de Analisis Multimodal del Zetasizer 1000 para determinar el tamano de partfcula por intensidades maximas. Se pueden usar otras tecnicas para analizar el tamano de partfcula, cuyos resultados pueden correlacionarse con los valores numericos obtenidos con la tecnica de dispersion de luz descrita en el presente documento.

La adicion de la molecula pasajero deseada se produce antes de la dilucion con el disolvente si la molecula pasajero es lipofila o anfipatica. La adicion se produce despues de que la dilucion de la molecula de pasajero sea soluble en agua.

Por lo tanto, en el caso de una molecula pasajero lipofila o anfipatica, las poblaciones cargadas de PNL se forman tras la dilucion con el disolvente. Las poblaciones de conjuntos de PNL o ECV se forman mediante la dilucion de la poblacion cargada de PNL en agua.

En el caso de una molecula pasajero soluble en agua, la solucion precursora se mezcla con una molecula pasajero disuelta en agua. Las poblaciones de conjuntos de PNL o ECV se forman tras la dilucion con el disolvente no acuoso. Si se utiliza una tecnica de dilucion en serie, se forman poblaciones distintas.

Basandose en las curvas observadas de diferentes clases de compuestos, pueden establecerse intervalos para la poblacion de conjuntos de PNL terminada para cada poblacion de PNL usada para formar la poblacion final de conjuntos de PNL. Cuanto mas disolvente no acuoso se utilice para diluir las PNL, mas pequenas seran las poblaciones de conjuntos de PNL.

Varias poblaciones cargadas de PNL pueden mezclarse y adaptarse para proporcionar un producto de conjunto de PNL multifuncional. Como un solo ejemplo, en un producto para el cuidado de la piel, puede ser deseable proporcionar topicamente vitamina E y un antibiotico en una sola preparacion. Las diferentes poblaciones cargadas de PNL dentro del conjunto de PNL podrfan proporcionar una preparacion que permita que un principio activo sea absorbido, preferentemente, en lugar del otro, lo que permite un control de las velocidades de penetracion de diferentes ingredientes en una sola preparacion. Como alternativa, una unica poblacion de PNL podrfa cargarse con mas de una molecula pasajero para proporcionar la multifuncionalidad.

Un producto de conjunto de PNL multifuncional inyectable tambien podrfa proporcionar ventajas: Debido a la capacidad novedosa de LA PRESENTE invencion para producir poblaciones bien definidas de poblaciones extremadamente pequenas (menores que 150 nm), pueden producirse productos de PNL que tienen semividas en suero considerablemente aumentadas. Tales partfculas pueden ser capaces de evadir la captacion inicial por el sistema inmunologico del cuerpo y, posiblemente, ayudar en la liberacion de cargas de farmacos a celulas y tejidos que no son facilmente accesibles por mecanismos de liberacion vascular normales; es decir, la liberacion a traves de la barrera hematoencefalica y la liberacion extravascular de cargas de farmacos a organos y tejidos seleccionados o dirigidos.

La capacidad para seleccionar una poblacion de PNL de un tamano preferente para una aplicacion dada proporciona ventajas tambien al proceso de fabricacion. Se requerira menos material para formar el producto final si se selecciona una solucion precursora de PNL para una necesidad de tamano concreta. La eficiencia de la carga tambien aumenta. El numero de partfculas de PNL aumenta a medida que disminuye el tamano de las poblaciones de PNL en funcion del diametro decreciente del producto de PNL esfericas (asumiendo que la cantidad de lfpido en la molecula pasajero permanece constante). Esto puede proporcionar una mayor concentracion de molecula pasajero por unidad de volumen.

Otra ventaja de la tecnologfa PNL es que se puede preparar una solucion opticamente transparente que contiene PNLP cargadas con moleculas pasajero mediante la seleccion de condiciones en las que las PNL tienen un tamano inferior a aproximadamente 150 nm. Muchas veces es importante que un producto aparezca opticamente transparente o no lograra la aceptacion del consumidor. Por ejemplo, las PNL cargadas en una solucion opticamente transparente tienen aplicacion en la industria de bebidas y en la industria farmaceutica para productos lfquidos. Como ejemplo, se puede preparar un colutorio que contenga PNL que encapsulen un ingrediente para la liberacion en el tiempo en la boca. Un consumidor prefiere comprar un colutorio opticamente transparente en lugar de uno turbio.

Las moleculas pasajero adecuadas para su uso en la formacion de una poblacion cargada de PNL son numerosas. En una realizacion, En una realizacion, se pueden seleccionar moleculas pasajeras que exhiben solubilidad lipfdica o son anfipaticas. Estas moleculas tienen perfiles de solubilidad adecuados idealmente para cargar en pNl. Las moleculas solubles en agua se pueden incorporar en las PNL mediante solubilizacion en la solucion acuosa usada para formar el producto de PNL acabado. Usando estos dos enfoques, practicamente cualquier molecula puede incorporarse como una molecula pasajero en productos de PNL de tamanos definidos. Se puede utilizar un uso innovador de ambos enfoques para incorporar compuestos solubles tanto en lfpidos como en agua en un producto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de conjunto de PNL incorporando primero compuestos liposolubles en las PNL antes de la dilucion con etanol y, en segundo lugar, incorporando una o mas moleculas solubles en agua en la solucion acuosa usada para formar el producto de PNL acabado de tamano definido.

Se han incorporado numerosas moleculas pasajero en las PNL. Por ejemplo, se pueden usar vitaminas liposolubles como molecula pasajero. Se ha descubierto que las vitaminas D, E y K son adecuadas para las PNL.

Las vitaminas solubles en agua, tal como vitamina B y C, tambien se pueden utilizar como moleculas pasajero. Tanto las vitaminas hidrosolubles como las liposolubles se pueden combinar en un conjunto de PNLP, si se desea administrar ambas usando la tecnica tratada anteriormente.

Tambien pueden usarse moleculas pasajero de modo que sean utiles en protectores solares. La benzofenona (absorbente de UVB y UVA), por ejemplo, por ejemplo, puede usarse apropiadamente como una molecula pasajero de PNL.

Otras moleculas pasajero preferentes son antibioticos, tales como aminoglucosidos (gentamicina), beta-lactamidos (penicilina G) y macrolidos (eritromicina). Los anestesicos, como la lidocafna, se han incorporado de forma eficaz en las PNL, al igual que los esteroides y los antifungicos (griseofulvina).

Las PNL tambien pueden utilizarse en la industria de alimentos y bebidas. Por ejemplo, Las PNL que incorporan cafefna se pueden utilizar en suplementos dieteticos para la supresion del apetito. Se ha descubierto que la encapsulacion en PNL es eficaz para enmascarar el sabor de la molecula pasajero si se desea evitar saborear la misma tras la ingestion.

Otra aplicacion en la industria de alimentos y bebidas es la incorporacion de sustancias en las PNL que se van a probar, en lugar de enmascarar. Los aromatizantes, tales como aceite de menta y otros aceites, se incorporan adecuadamente en las PNL. La encapsulacion de sustancias que contienen aceite puede conducir a una mayor vida util durante el almacenamiento, ya que la sustancia encapsulada esta protegida contra la oxidacion. Ademas, la encapsulacion de sustancias permitirfa opciones adicionales para los fabricantes y los consumidores. Como un solo ejemplo, un fabricante de una bebida podrfa preparar y embotellar un sabor base. A continuacion, el consumidor tendrfa la opcion de anadir paquetes de PNL a la bebida para satisfacer las preferencias de sabor del consumidor o para enriquecerla con vitaminas. Un consumidor que prefiere un fuerte aroma de menta en una bebida de chocolate podrfa anadir a su bebida PNL que contengan aceite de menta. Las sustancias que van a saborearse tambien se pueden asociar de forma laxa con el exterior de la PNL proporcionando tales sustancias en la fase acuosa del procedimiento. Por ejemplo, una PNL que contiene una vitamina que, preferentemente, no debe saborearse, puede tener un sabor agradable en el exterior de la misma. Si se desea que las PNL permanezcan en la boca para que su contenido pueda saborearse, puede unirse un carbohidrato natural o azucar a la PNL simplemente proporcionandolo en la solucion acuosa. Este se adherira al interior de la boca durante un perfodo de tiempo y la qufmica normal de la boca y la masticacion liberaran el contenido de las PNL para proporcionar el efecto deseado. Las PNL tambien pueden someterse a agitacion y cizalladura, tal como en un mezclador o equipo industrial pesado en un sitio de fabricacion para proporcionar aromatizantes a alimentos y bebidas.

Las PNL tambien pueden usarse para la incorporacion de peptidos. En las PNL se han incorporado con eficacia tripeptidos, tetrapeptidos, hexapeptidos y nonapeptidos.

Las PNL tambien pueden ser utiles en industrias que requieren colorantes como ingrediente. Se pueden usar colorantes solubles en agua y solubles en lfpidos.

Las PNL pueden utilizarse para incorporar aceites de diversos tipos, tales como aceites esenciales y aceites perfumados, en los productos. Ejemplos de tales productos son lociones, emulsiones, cremas, cosmeticos, cosmeceuticos y perfumes. Las pNl pueden cargarse con los aceites y proporcionar al producto una funcion de liberacion en el tiempo, lo que permite que el ingrediente deseado se libere durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, la esencia de un perfume podrfa incorporarse en una o mas poblaciones de tamanos de PNL y liberar la esencia durante un perfodo de tiempo mas largo que la esencia no incorporada en las PNL.

Si la molecula pasajero deseada es soluble en agua, la molecula pasajero debe, en primer lugar, disolverse en agua. La etapa de incorporacion, o carga de la molecula pasajero en la PNL, se logra cuando el producto de PNL se forma mediante la adicion de la molecula pasajero disuelta a la solucion precursora.

Ejemplo preparatorio 1: Uso de una solucion precursora estable durante el almacenamiento como ingrediente de partida para las particulas nanolipfdicas

Se uso la solucion precursora estable durante el almacenamiento (lote de fabricacion 0013-040010) para preparar PNL de diversas poblaciones de tamano definido. Utilizando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern (Zetasizer 1000), se midio que las poblaciones nacientes de PNL eran de 9 nm. Para preparar poblaciones de conjuntos de PNL de tamanos definidos, se siguio el siguiente procedimiento: se introdujeron alfcuotas de 1 ml de la

5

10

15

20

25

30

solucion precursora de reserva (lote 0013-040010) en tubos de ensayo de 10 ml. Para preparar poblaciones definidas del producto de PNL, se anadieron varias cantidades de etanol a cada una de las preparaciones de la muestra. Despues de la formacion de las preparaciones de PNL, se anadieron alfcuotas de 1 ml de cada muestra a 20 ml de agua destilada usando una pipeta de 2 ml. Cada preparacion se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos y, despues, se extrajeron alfcuotas de 2 ml, se sometieron a agitacion en vortex durante 20 segundos y, a continuacion, se sometieron a analisis de tamano usando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern. En la Tabla 1 se muestran los resultados.

TABLA 1

Solucion precursora de reserva: Etanol Sin pasajero Tamano

1 ml: 0 ml [Control] 278 nm

1 ml: 0,2 ml [Poblacion mixta] 242 nm

1 ml: 0,5 ml [Conjunto de PNL] 186 nm

1 ml: 0,8ml [Conjunto de PNL] 160 nm

1 ml: 1,0ml [Conjunto de PNL] 138 nm

1 ml: 2,0ml [Conjunto de PNL] 110 nm

1 ml: 3,0ml [Conjunto de PNL] 98 nm

1 ml: 5,0ml [Conjunto de PNL] 61 nm

1 ml: 10 ml [Conjunto de PNL] 34 nm

Ejemplo 2: Partfculas nanolipfdicas con moleculas pasajero solubles en lipidos

Se uso la solucion precursora estable durante el almacenamiento (lote de fabricacion 0013-040010) para preparar PNL de diversas poblaciones de tamano definido. Utilizando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern (Zetasizer 1000) se midio que las poblaciones nacientes de PNL eran de 9 nm. Para preparar poblaciones de PNL con vitamina K1 de tamanos definidos se siguio el siguiente procedimiento: A 10 ml de la solucion de reserva estable durante el almacenamiento (lote 0013-040010) se anadieron 10 mg de vitamina K1. El material se solubilizo mediante agitacion en vortex, dando una preparacion de PNL cargada con una concentracion eficaz de 1 mg/ml de Vitamina K1. Se introdujeron alfcuotas de 1 ml de las PNL cargadas con vitamina K1 en tubos de ensayo de 10 ml. Para preparar poblaciones definidas del producto de PNL, se anadieron varias cantidades de etanol a cada una de las preparaciones de la muestra. Despues de la formacion de las preparaciones de PNL, se anadieron alfcuotas de 1 ml de cada muestra a 20 ml de agua destilada usando una pipeta de 2 ml. Cada preparacion se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos y, despues, se extrajeron alfcuotas de 2 ml, se sometieron a agitacion en vortex durante 20 segundos y, a continuacion, se sometieron a analisis de tamano usando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern. Las preparaciones de vitamina K1 resultantes se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Solucion precursora de reserva: Etanol Vitamina K1 Tamano

1 ml: 0ml [Control] 271 nm

1 ml: 0,5ml [Poblacion mixta] 229 nm

1 ml: 1,0 [Conjunto de PNL] 76 nm

1 ml: 2,0 [Conjunto de PNL] 51 nm

1 ml: 5,0 [Conjunto de PNL] 40 nm

1 ml: 10,0 [Conjunto de PNL] 30 nm

Ejemplo comparativo 3: PNL con moleculas pasajero solubles en agua

Se uso la solucion precursora estable durante el almacenamiento (lote de fabricacion 0013-040010) para preparar PNL de diversas poblaciones de tamano definido. Utilizando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern (Zetasizer 1000) se midio que las poblaciones nacientes de PNL eran de 9 nm. Para preparar poblaciones de PNL

5

10

15

20

25

30

35

con eritromicina de tamanos definidos se siguio el siguiente procedimiento: Se preparo una solucion de reserva (150 ml) de eritromicina 1 mg/ml mediante la adicion de eritromicina a 150 ml de agua destilada. La solucion se solubilizo mediante agitacion a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se introdujeron alfcuotas de 1 ml de los materiales de partida de las PNL en tubos de ensayo de 10 ml. Para preparar poblaciones definidas del producto de PNL con eritromicina incorporada se anadieron varias cantidades de etanol a cada una de las preparaciones de la muestra. Despues de la formacion de las preparaciones de PNL, se anadieron alfcuotas de 1 ml de cada muestra a 20 ml de la solucion de reserva de eritromicina en agua 1 mg/ml usando una pipeta de 2 ml. Cada preparacion se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos y, despues, se extrajeron alfcuotas de 2 ml, se sometieron a agitacion en vortex durante 20 segundos y, a continuacion, se sometieron a analisis de tamano usando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern. En la Tabla 3 se muestran los resultados.

TABLA 3

Solucion precursora de reserva: Etanol Eritromicina Tamano

1 ml: 0ml [Control] 289 nm

1 ml: 0,5ml [Conjunto de PNL] 162 nm

1 ml: 1,0ml [Conjunto de PNL] 141 nm

1 ml: 2,0ml [Conjunto de PNL] 105 nm

1 ml: 5,0ml [Conjunto de PNL] 66 nm

1 ml: 10,0ml [Conjunto de PNL] 52 nm

Ejemplo 4: PNL con moleculas pasajero tanto solubles en lipidos como en agua

Se uso la solucion precursora estable durante el almacenamiento (lote de fabricacion 0013-040010) para preparar PNL de diversas poblaciones de tamano definido. Utilizando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern se midio que las poblaciones nacientes de PNL eran de 9 nm. Para preparar poblaciones de PNL con vitamina B12 (soluble en agua) y vitamina K1 (liposoluble) de tamanos definidos se siguio el siguiente procedimiento: se preparo una solucion de reserva (70ml) de vitamina B12 1 mg/ml mediante la adicion de 70 mg de vitamina B12 a 70ml de agua destilada. La solucion se solubilizo mediante agitacion a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se preparo una preparacion de PNL cargadas con vitamina K1 mediante solubilizacion de 10 mg de vitamina K1 en 10 ml del lote de fabricacion (0013-040010 de la solucion precursora estable durante el almacenamiento. Se introdujeron alfcuotas de 1 ml de las PLN cargadas con vitamina K1 en tubos de ensayo de 10 ml. Para preparar poblaciones definidas del producto de PNL con vitamina K1 y vitamina B12 incorporadas se anadieron varias cantidades de etanol a cada una de las preparaciones de la muestra. Despues de la formacion de las preparaciones de PNL, se anadieron alfcuotas de 0,5 ml de cada muestra a 10 ml de la solucion de reserva preparada de vitamina B12 en agua 1 mg/ml usando una pipeta de 2 ml. Cada preparacion se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos y, despues, se extrajeron alfcuotas de 2 ml, se sometieron a agitacion en vortex durante 20 segundos y, a continuacion, se sometieron a analisis de tamano usando el instrumento de dispersion de luz laser de Malvern. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

Solucion precursora de reserva: Etanol Vitaminas K1 y B12 Tamano

1 ml: 0ml [Control] 217 nm

1 ml: 0,5 [Conjunto de PNL] 122 nm

1 ml: 1,0 [Conjunto de PNL] 94 nm

1 ml: 2,0 [Conjunto de PNL] 71 nm

1 ml: 5,0 [Conjunto de PNL] 68 nm

1 ml: 10,0 [Conjunto de PNL] 57 nm

Ejemplo 5: Preparacion de poblaciones definidas - Efecto del disolvente

Se uso la solucion precursora estable durante el almacenamiento (numero de lote 0013-040100) como material de partida para la produccion de conjuntos de PNL

5

10

15

20

25

30

35

40

Se anadieron varias cantidades y tipos de disolvente al material de partida para preparar soluciones de reserva diluidas con disolvente. Los conjuntos de PNL se prepararon convirtiendo las soluciones de reserva diluidas con disolvente mediante la adicion de 1 ml de la misma en 20 ml de agua destilada con agitacion, usando una placa mezcladora y una barra de agitacion a temperature ambiente. La mezcla se agito durante 5 minutos, se sometio a agitacion en vortex suavemente durante 20 segundos y se coloco en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion del conjunto de PNL resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal.

Ademas, el tamano de las PNL nativas presentes en el precursor tambien se determino examinando el precursor solo usando el Malvern 1000 con los parametros como ya se han descrito.

Los datos de la Tabla 5 demuestran que se pueden usar varios disolventes para formar conjuntos de PNL o PNL. Aunque es probable que se seleccione etanol para muchas aplicaciones debido a sus propiedades relativamente no toxicas, puede ser deseable usar otros disolventes para las caracterfsticas concretas de las PNL.

TABLA 5

Solucion precursora de reserva ( ml): Cantidad B de disolvente anadido a A (ml) Cantidad De agua anadida a 1 ml de A+B (ml) Tamano del disolvente etanol (nm) Tamano del disolvente metanol (nm) Tamano del disolvente 1- propanol (nm) Tamano del disolvente 2- propanol (nm)

1*: 0* 0* 14* 14* 14* 14*

1*: 0* * O CM 240* 240* 240* 240*

1: 0,5 20 133 191 112 95

1
1: 20 ND ND ND 46

1: 2 20 108 97 66 13*

1: 5 20 49 60 23 ND

1: 10 20 25 43 ND ND

Comparativo

Ejemplo 6: Uso de calentamiento para controlar el tamano

Los conjuntos de NLP y los ECV que se han preparado mediante adicion secundaria de disolvente a la solucion precursora, tal como en el ejemplo 5, pueden calentarse para reducir aun mas (de manera controlada) el tamano promedio de los mismos. Los conjuntos de PNL y ECV se produjeron usando la solucion precursora de reserva (lote numero 0013-040010) que contenfa PNL nativas de tamano de aproximadamente 10 nanometres (medidos usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer con medicion del tamano para poblaciones de partfculas configurada a los parametros multimodales). Se realizaron diluciones con etanol de las porciones de control y de ensayo, como se indica en la Tabla 6, para formar soluciones de reserva diluidas con disolvente. Los conjuntos de PNL y los ECV se prepararon convirtiendo las soluciones de reserva diluidas con disolvente mediante la adicion de 1 ml de las mismas a 20 ml de agua destilada con agitacion, usando una placa mezcladora y una barra de agitacion a temperatura ambiente, como se describe en el ejemplo 5. Se retuvo una porcion como control y se retiro una porcion para analizar la determinacion del efecto del calentamiento sobre la poblacion del conjunto de NLP o la poblacion de ECV.

El calentamiento de la porcion de ensayo se llevo a cabo colocando muestras de cinco ml en un tubo de ensayo, que despues se bajo en agua hirviendo rapidamente durante 3 minutos. Los tubos que contenfan las muestras calentadas de este modo se retiraron del agua hirviendo y se dejaron enfriar a temperatura ambiente, despues se agitaron en vortex durante 20 segundos. El control se trato de la misma manera con la excepcion de que no se calento.

Una alfcuota de cada porcion (control y calentada) se transfirio a una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion del conjunto de PNL resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

TABLA 6

Solucion precursora de reserva ( ml): Etanol B (ml) Agua (anadida a 1 ml de A+B ) (ml) Tamano (nm) Sin calentamiento Tamano (nm) Con calentamiento % Reduccion con calentamiento

1: 0* 0* 10* 10* 0*

1: 0 20 252 158 37,3

1: 0,5 20 188 125 33,5

1: 2 20 138 96 30,4

1: 5 20 57 35 38,6

1: 10 20 36 26 31

*Comparativo

Los resultados de estas evaluaciones demuestran que el calentamiento de los conjuntos de PNL o ECV redujo el tamano de los vehnculos portadores resultantes de una manera controlada con una reduccion promedio del 34 %. Debido a que estos resisten el calor, es posible no solo reducir el tamano de las PNL sino usar tecnicas de calentamiento y esterilizacion, tal como la pasteurizacion instantanea, lo que es deseable en la industria de alimentos y bebidas para controlar la carga bacteriana. Esto se puede llevar a cabo a temperatures de hasta 220 grados Fahrenheit con el intervalo habitual de aproximadamente 180 a 220 grados Fahrenheit.

Ejemplo comparativo 7: Enmascaramiento del sabor de las moleculas mediante encapsulacion en preparaciones de PNL

Los portadores de encapsulacion se prepararon usando una solucion precursora estable durante el almacenamiento (numero de lote 0013-050015) como una solucion de reserva. Se determino que el tamano de las PNL nativas en la reserva era de 8 nm usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. Se realizaron tres preparaciones. La preparacion A se realizo sin NaCl como molecula pasajero; se realizo la preparacion B en la que se encapsulo NaCl como una molecula pasajero usando una solucion de 0,9 g de NaCl por 100 ml de agua; y la preparacion C se realizo usando una preparacion de PNL precargada.

Preparacion A: Se prepararon partfculas sin NaCl mediante la adicion de 1 ml de solucion de reserva en 100 ml de agua destilada, mientras se agitaba usando una placa mezcladora y una barra de agitacion a temperatura ambiente. La mezcla se agito durante 5 minutos y se sometio a agitacion suave en vortex durante 20 segundos y coloco en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal. El tamano de partfcula obtenido fue 274 nm.

Preparacion B: Se prepararon partfculas con NaCl mediante la adicion de 1 ml de solucion de reserva en 100 ml de agua destilada que contema 0,9 g de NaCl, mientras se agitaba usando una placa mezcladora y una barra de agitacion a temperatura ambiente. La mezcla se agito durante 5 minutos, despues se sometio a agitacion suave en vortex durante 20 segundos y coloco en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion de vehnculo portador resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ ajustado para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal. El tamano de partfcula obtenido fue 275 nm.

Preparacion C: Las PNL precargadas se prepararon mediante la adicion de 1 ml de solucion de reserva en 10 ml de una solucion que contema 0,9 g de NaCl y agua destilada, mientras se agitaba a temperatura ambiente. La preparacion entera de 10 ml de PNL precargadas se anadio en 90 ml de agua destilada, mientras se agitaba a temperatura ambiente. Esto se agito durante 5 minutos y se sometio a agitacion suave en vortex durante 20 segundos y coloco en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal. El tamano de partfcula obtenido fue 238 nm.

Las preparaciones B y C se compararon mediante el gusto. B sabfa como el agua de mar y C no tema sabor salado. Cuando C se sometio a sonicacion extensa para liberar las moleculas pasajero de NaCl, el sabor salado estaba presente. Utilizando el metodo para preparar la preparacion C, con PNL precargadas, se proporciono una poblacion de vehnculos portadores que efectivamente enmascaro el sabor de la molecula pasajero.

Ejemplo 8: Enmascaramiento del sabor de la lidocafna clorhidrato

Las partfculas de encapsulacion se prepararon usando una reserva precursora estable durante el almacenamiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(numero de lote 0013-050015). Se determino que el tamano de las PNL nativas en esta reserva precursora era de 8,1 nm usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. A 5 ml de la reserva se anadieron 50 mg de clorhidrato de lidocafna. La mezcla se sometio a agitacion en vortex e hasta que el clorhidrato de lidocafna se disolvio en la reserva, formando PNL precargadas. Se anadio etanol a las PNL precargadas, como se indica a continuacion para formar una reserva de PNL diluidas con disolvente. Se diluyo adicionalmente 1 ml de la reserva de PNL diluidas en disolvente mediante adicion a 20 ml de agua destilada, mientras se agitaba usando una placa mezcladora y una barra de agitacion a temperatura ambiente. Los vehfculos portadores resultantes se agitaron durante 5 minutos y se sometieron a agitacion suave en vortex durante 20 segundos y coloco en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal.

TABLA 8

Reserva de PNL A (ml): Etanol B (ml) Agua (anadida a 1 ml de A+B ) (ml) Precargada con clorhidrato de lidocafna Tamano (nm)

1*: 0* 0* No* 8,1*

1*: 0* * O CM No* 262*

1*: 0* * O CM Si* 276*

1: 0,5 20 Si 91

1
1: 20 Si 88

1: 2 20 Si 68

1: 5 20 Si 46

* comparativo

El tamano de las PNL nativas presentes en el precursor de reserva tambien se determino examinando el precursor solo usando el Malvern 1000 con los parametros como ya se han descrito.

Las preparaciones de vehfculos portadores formados usando las PNL precargadas con clorhidrato de lidocafna enmascararon el sabor del clorhidrato de lidocafna.

Ejemplo 9: Cafefna como molecula pasajero

Las preparaciones de vehfculos portadores se realizaron utilizando cafefna como molecula pasajero. Se evaluaron dos concentraciones para determinar la capacidad de enmascarar el sabor y la estabilidad en el tiempo, tanto en tamano como en capacidad de enmascarar el sabor.

Se preparo una preparacion de reserva de PNL precargadas. Primeramente, se disolvieron 5 g de cafefna en 100 ml de agua destilada. Por separado, se diluyeron 10 ml de solucion precursora estable durante el almacenamiento (numero de lote 0013-010007), que contenfa PNL nativas medidas a 12 nm utilizando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer con modo de analisis ajustado a una configuracion de poblacional multimodal, con 10 ml de etanol como disolvente secundario (dilucion volumen/volumen 1:1). Esto formo una reserva de PNL diluida con disolvente. La reserva de PNL diluida con disolvente stock se anadio a la solucion de 100 ml que contenfa 5 gramos de cafefna, mientras que la solucion se agitaba a temperatura ambiente. La totalidad de la preparacion de 120 ml preparada de este modo se anadio en 880 ml de agua destilada mientras se agitaba a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se retiro una muestra de 3 ml para analisis y se agito en vortex durante 20 segundos. Los vehfculos portadores cargados con cafefna como molecula pasajero se introdujeron en una cubeta de muestra que se uso para determinar el tamano de la poblacion de vehfculo portador resultante con un instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer™ ajustado para evaluar el tamano de partfcula usando analisis multimodal. Se determino que los vehfculos portadores eran de 121 nm.

Cuando se evaluo la muestra para el enmascaramiento del sabor, se enmascaro el sabor amargo de la cafefna. Ademas, la preparacion final de los vehfculos portadores cargados con cafefna era opticamente transparente.

Se llego a la conclusion de que este procedimiento podia utilizarse para aplicaciones de productos opticamente transparentes adecuados para el consumo oral, como bebidas o preparaciones medicinales. Las moleculas pasajero amargas o con alguna otra objecion encapsuladas de este modo en vehfculos portadores podrfan consumirse sin que el consumidor tenga que probar la molecula pasajero. Ademas de la cafefna, se contempla que los electrolitos (NaCl y KCl) y las vitaminas, entre otras moleculas pasajero, serfan candidatos apropiados para la formulacion como se describe en el ejemplo 8.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo comparativo 10: Produccion de preparaciones de PNL precargadas que contienen cafefna

Las PNL precargadas se prepararon a partir de una reserva precursora estable durante el almacenamiento (numero de lote 0013-050015). Se determino que el tamano de las PNL nacientes era de 8 nm usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. La preparacion que contenfa cafefna se preparo como sigue:

1. Se disolvio cafefna anhidra (2,5 g) en 50 ml de agua destilada a temperatura ambiente

2. A 20 ml de la reserva precursora se anadieron 10 ml de etanol.

3. El material de la etapa 2 se anadio a la solucion de cafefna de la etapa 1 mientras se agitaba a temperatura ambiente. La mezcla se agito durante 5 minutos. Esto dio como resultado la produccion de PNL precargadas que contenfan cafefna a 31,3 mg/ml.

4. El producto acabado que contenfa cafefna a 0,5 mg/ml se produjo mezclando la preparacion de la etapa 3 en un volumen apropiado de agua destilada (1:62,5 volumen/volumen).

5. El tamano de la preparacion acabada se determino usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. Se determino que el tamano de la preparacion acabada era de 147 nm. La preparacion acabada que contenfa 0,5 mg/ml de cafefna era opticamente transparente.

6. La preparacion acabada de la etapa 5 se evaluo segun su capacidad para enmascarar el sabor de la cafefna introduciendo 1 ml de preparacion en la boca. Se encontro que la preparacion enmascaraba eficazmente el sabor de la cafefna.

Ejemplo comparativo 11: Produccion de preparaciones de PNL precargadas que contienen vitaminas liposolubles como medio para producir productos acabados de tamano pequeno y capacidad para enmascarar el gusto adverso de las vitaminas liposolubles.

Las PNL precargadas se prepararon a partir de una reserva precursora estable durante el almacenamiento (numero de lote 0013-050015). Se determino que el tamano de las PNL nacientes era de 8 nm usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. La preparacion que contenfa vitaminas liposolubles se preparo como sigue:

1. Se preparo la reserva precursora diluida en disolvente anadiendo 20 ml de etanol a 40 ml de la reserva precursora estable durante el almacenamiento.

2. 250 mg de vitamina D3 DSM Chemicals), 500 mg de vitamina E (DSM Chemicals) y 4 mg de vitamina K (DSM Chemicals) se disolvieron en la preparacion resultante de la etapa uno. Esto se agito a temperatura ambiente y dio como resultado una poblacion de NLP precargada.

3. La preparacion de PNL precargada de la etapa 2 se diluyo de 1 a 50 en agua destilada para producir un producto acabado adecuado para consumo oral que contenfa la dosis diaria recomendada ("DDR") de las 3 vitaminas liposolubles.

4. El tamano de la preparacion acabada se determino usando el instrumento de dispersion de luz laser Malvern 1000 Zetasizer para analizar poblaciones de tamanos usando el modo de analisis multimodal. Se determino que el tamano de la preparacion acabada era de 168 nm.

5. La preparacion acabada de la etapa 5 se evaluo segun su capacidad para enmascarar el sabor del sabor desagradable de las tres vitaminas liposolubles introduciendo 1 ml en la boca. Se encontro que la preparacion enmascaraba eficazmente el sabor delas tres vitaminas liposolubles; vitamina D3, E y K.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Un metodo para fabricar una poblacion de conjunto de partfculas nanolipfdicas [PNL], que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una solucion precursora monofasica, formandose dicha solucion precursora monofasica mediante:

solubilizacion de un material anfipatico que comprende fosfolfpidos en una primera cantidad de disolvente no acuoso; adicion de una cantidad de agua para formar una suspension turbia; y adicion de una segunda cantidad de disolvente no acuoso hasta que la suspension turbia sea monofasica y tenga claridad optica a temperatura ambiente;

(b) mezclar una molecula pasajero seleccionada del grupo que consiste en moleculas pasajero lipofilas y anfipaticas con dicha solucion precursora monofasica para formar una poblacion de vehfculos cargados;

(c) diluir dicha poblacion de vehfculos cargados con una o mas alfcuotas de disolvente no acuoso para formar una poblacion de partfculas cargadas con PNL;

(i) dicho disolvente no acuoso se anade de manera secuencial a la solucion precursora despues de la adicion de una molecula pasajero,

(ii) dicha poblacion de vehfculos cargados se combina con dicho disolvente no acuoso en una proporcion que varfa de aproximadamente 1 parte de la poblacion de vehfculo cargado a 20 partes de disolvente no acuoso, a una proporcion de 1 parte de la poblacion de vehfculo cargado a 0,3 partes de disolvente no acuoso,

(iii) donde dicha dilucion de dicha poblacion de vehfculo cargado forma una poblacion de partfculas cargadas con PNL que tienen partfculas nanolipfdicas (PNL) de 1 nm a 20 nm de tamano, determinandose dichos tamanos mediante dispersion de luz laser a temperatura ambiente y disminuyendo dicho tamano de las PNL a medida que dicha concentracion de disolvente no acuoso aumenta,

y

(d) mezclar una alfcuota de dicha poblacion de PNL cargadas con un disolvente acuoso para formar una poblacion de conjunto de PNL que tiene un diametro medio de partfcula de 20 a 200 nm.
2. El metodo de reivindicacion 1, donde dos o mas moleculas pasajero diferentes se anaden a dicha solucion precursora monofasica, anadiendose una o mas moleculas pasajero a dicha solucion precursora monofasica antes de diluir con dicho disolvente no acuoso, y anadiendose una o mas moleculas pasajero a dicha disolucion precursora monofasica despues de la adicion de dicho disolvente no acuoso.
3. El metodo de reivindicacion 1, donde dicho disolvente acuoso anadido en la etapa (d) comprende ademas una molecula pasajero soluble en agua, ademas de anadir la molecula pasajero en la etapa (c).
4. El metodo de la reivindicacion 3, donde dichas moleculas pasajero solubles en agua se asocian con el exterior de dichas PNL.
5. El metodo de reivindicacion 1, donde dicha poblacion de conjunto de PNL tiene un diametro medio de partfcula de 30 nm a 200 nm.
6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas la etapa de calentar dicha poblacion del conjunto de PNL cargadas con la molecula pasajero a una temperatura de hasta 104,4 grados Celsius (220 grados Fahrenheit), reduciendo dicho calentamiento el diametro medio de dicha poblacion del conjunto de PNL.
7. El metodo de reivindicacion 1, donde dicha solucion precursora comprende fosfolfpidos seleccionados del grupo que consiste en fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), acido fosfatfdico (PA) y fosfatidilinositol (PI) y mezclas de los mismos.
8. El metodo de reivindicacion 1, donde dicho disolvente no acuoso usado en la etapa (c) para diluir el precursor es etanol.
9. Una poblacion de conjunto de partfculas nanolipfdicas (PNL) formada de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde cada una de dicha PNL tiene un diametro medio de partfcula de 1 nm a 20 nm, determinandose dichos tamanos mediante dispersion de luz laser a temperatura ambiente y formandose dichas poblaciones de conjunto de PNL cuando dichas PNL se diluyen con un disolvente acuoso.
10. La poblacion de conjunto de PNL de la reivindicacion 9, donde el diametro medio de la poblacion de conjunto de PNL medio es de 30 nm a 200 nm, determinandose dichos tamanos por dispersion de luz laser a temperatura ambiente.
11. La poblacion de conjunto de PNL de la reivindicacion 9, donde el diametro medio de la poblacion de conjunto es de 80 nm a 110 nm, determinandose dichos tamanos por dispersion de luz laser a temperatura ambiente.
12. La poblacion de conjunto de PNL de la reivindicacion 9, donde dicha poblacion comprende una preparacion para 5 consumo oral.
13. La poblacion de conjunto de PNL de la reivindicacion 12, donde las PNLP cargadas de moleculas pasajero contienen moleculas pasajero cuyo sabor se enmascarara tras la ingestion oral por parte de un usuario.

10 14. La poblacion de conjunto de PNL de la reivindicacion 12, donde dicha preparacion comprende PNL a las que se

ha asociado un agente con dicha NLP exterior para proporcionar una propiedad deseada a dicha PNL.