ES2625977T3 - Reducción de la genotoxicidad in vitro de extractos de polen mediante la eliminación de flavonoides - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de reducción de la genotoxicidad in vitro de un extracto de polen que comprende la etapa consistente en reducir la cantidad de un flavonoide en el extracto de polen por ultrafiltración del extracto de polen con una membrana de 1-10 kDa y al menos 5 volúmenes de una disolución de bicarbonato de amonio, y una etapa de filtración estéril a través de un filtro de 0,22 μm.
Description
- masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) tras mineralización
- especies dactilo, espiguilla, raigrás, grama de olor o hierba timotea de tres proveedores todos los lotes analizados 250 veces) de la dosis límite calculada (125 ppm)
- Níquel (Ni) y cromo (Cr): espectrometría de absorción atómica en horno de grafito (GFAAS)
- Dos lotes (de dos proveedores diferentes) de polen de cada una de las especies dactilo, espiguilla, raigrás, grama de olor o hierba timotea = un total de 10 lotes Ni y Cr fueron <10 ppm y <2 ppm, respectivamente en los lotes analizados Ni y Cr están muy por debajo (más de 10 veces y 60 veces, respectivamente) de la dosis límite calculada (125 ppm)
- Micotoxinas (aflatoxinas B1 y 2, G1 y 2; DON* / vomitoxin; fumonisinas B1 y 2; ocratoxina A; zearalenona)
- HPLC Dos lotes (de dos proveedores, excepto para una especie) de polen de cada una de las especies dactilo, espiguilla, raigrás, grama de olor o hierba timotea = un total de 10 lotes Indetectables o justo por encima del límite de detección (aflatoxina B1 en un lote) en todos los lotes analizados Todas las micotoxinas están muy por debajo (1.250 veces o más) de las dosis límite calculadas (dependientes de la aflatoxina considerada)
- Dos lotes (de dos
- Benzo[a]pireno
- Cromatografía de gases con dilución isotópica seguida de espectrometría de masas (GC-MS) proveedores diferentes) de polen de cada una de las especies dactilo, espiguilla, raigrás, grama de olor o hierba timotea = un Indetectable o justo por encima del límite de detección (en un lote) en todos los lotes analizados El benzo[a]pireno está muy por debajo (al menos 1,6 x 105 veces) de la dosis límite calculada (125 ppm)
- total de 10 lotes
- * Desoxinivalenol
[0084] Las cuatro categorías de contaminantes que podrían ocasionar un potencial genotóxico in vitro resultaron indetectables y/o muy por debajo de las dosis límite calculadas según las directrices apropiadas (es decir, de sanidad alimentaria) en al menos 10 lotes de la materia prima usada para preparar los comprimidos de polen de
5 gramíneas.
[0085] Por lo tanto, el perfil genotóxico de la materia prima del polen de gramíneas y de sus extractos solamente puede explicarse por una sustancia o sustancias intrínsecas del polen de gramíneas.
[0086] Cuatro sustancias o grupos de sustancias que podrían ser las sustancias intrínsecas del polen de gramíneas que explicaran el potencial genotóxico in vitro observado se seleccionaron para un análisis más detallado:
15 -ácidos clorogénico y cafeico (Fung V. A., Cameron T. P., Hughes T. J., Kirby P. E., Dunkel V. C., Mutat. Res. 1988,
204: 219-228), -cumarina (Kevekordes S., Spielberger J., Burghaus C. M., Birkenkamp P., Zietz B., Paufler P., Diez M., Bolten C., Dunkelberg H., Anticancer Res. 2001, 21: 461-469; Möller M., Stopper H., Haring M., Schleger Y., Epe B., Adam W.,
20 Saha-Moller C. R., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 216: 693-701), -alcaloides (Liu S. X., Cao J., Yuan J., Huang P., Shua P. Q., Honma M., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2003, 28: 957-961), y -flavonoides (Caria H., Chaveca T., Laires A., Rueff J., Mutat. Res. 1995, 343: 85-94; Müller L. y Kasper P., Mutat. Res. 2000, 464: 19-34 (revisión); Antognoni F., Ovidi E., Taddei A. R., Gambellini G., Speranza A., Altern. Lab. Anim.
10
flavonoides, ya que no pudieron detectarse agluconas de flavonoides. Esto es consistente con los datos publicados, ya que los flavonoides más comunes aislados de polen son glucósidos de flavonoides, mientras que las agluconas no se presentan en el polen de forma natural (Mo Y., Nagel C., Taylor L. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89: 7213-7217; Campos M. G., Webby R. F., Markham K. R., Z. Naturforsch. [C]. 2002, 57: 944-946).
5
10 [0092] A la vista de los resultados anteriores, se concluyó que el potencial genotóxico de los extractos de polen de gramíneas debía estar asociado con flavonoides intrínsecos. Sin embargo, no se ha descrito una toxicidad in vitro para los glucósidos de flavonoides contenidos en los extractos de polen, mientras que se sabe que las agluconas de flavonoides, que no son detectables en los extractos, presentan potencial genotóxico in vitro
15 (Antognoni F., Ovidi E., Taddei A. R., Gambellini G., Speranza A., Altern. Lab. Anim. 2004, 32: 79-90 ; Nagao M., Morita N., Yahagi T., Shimizu M., Kuroyanagi M., Fukuoka M., Yoshihira K., Natori S., Fujino T., Sugimura T., Environ. Mutagen. 1981, 3: 401-419; Brown J. P., Mutat. Res. 1980, 75: 243-277).
[0093] Dado que se ha descrito una enzima capaz de desglucosilar un glucósido de flavonoide para dar su
20 aglucona correspondiente en un modelo de polen (Taylor L. P., Strenge D., Miller K. D. The role of glycosylation in flavonol-induced pollen germination, Adv. Exp. Med. Biol. 1998, 439: 35-44), se planteó la hipótesis de que el potencial genotóxico in vitro observado en los extractos de polen de gramíneas sería debido a la desglucosilación de los glucósidos de flavonoides no genotóxicos para dar agluconas de flavonoides genotóxicas in vitro mediante una enzima o enzimas específicas, siendo tanto los glucósidos de flavonoides como la enzima o enzimas extraíbles de
25 los pólenes.
[0094] Para demostrar esta hipótesis de trabajo, se investigó si:
-los flavonoides del polen de gramíneas pueden identificarse como glucósidos de flavonoides solamente presentes
30 en cantidades cuantificables, -estos glucósidos de flavonoides se desglucosilan para dar agluconas de flavonoides en las condiciones del protocolo de larga duración de 24 h, pero no en los protocolos de corta duración de 3 h de la prueba MLA/TK, -las cantidades de agluconas de flavonoides liberadas en tales condiciones son consistentes con los resultados de la prueba MLA/TK obtenidos con los extractos liofilizados de polen de gramíneas.
35
[0095] Los flavonoides del polen de gramíneas se identificaron primeramente por HPLC en fase inversa, en
40 función de su hidrofobicidad. El análisis de HPLC en fase inversa se realizó en una columna Atlantis dC18, 4,6 x 250 mm, 5 µm, de Waters, Milford, MA, EE. UU.; con elución en gradiente: de ácido fórmico al 0,1 % en agua a ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo en 30 min; tasa de flujo: 1 ml/min; tiempo de ejecución: 45 min; longitud de onda de detección: 354 o 254 nm; volumen de inyección: 50 µl. De manera importante, los extractos de polen de gramíneas se diluyeron cinco veces en metanol antes del análisis con el fin de solubilizar tanto los glucósidos de flavonoides
45 como las agluconas de flavonoides, siendo estas últimas difícilmente solubles en agua.
[0096] También se usó la hidrólisis con HCl antes del análisis de HPLC en fase inversa porque la hidrólisis de los glucósidos de flavonoides conduce a la desglucosilación. El análisis de HPLC de las moléculas desglucosiladas permite entonces la identificación de sus fracciones áglucónicas. Para la hidrólisis con HCl, los flavonoides de un
50 extracto crudo de polen de gramíneas se purificaron primeramente en Amberlite XAD-2, una resina usada actualmente para el aislamiento de flavonoides (Gil M. I., Ferreres F., Tomás-Barberán F. A., J. Agric. Food Chem. 1998, 46: 2007-2012; D’Arcy B. R. Antioxidants in Australian floral honeys: Identification of health-enhancing nutrient components: a report for the Rural Industries Research and Development Corporation. D’Arcy B. R., Barton, A. C. T.: Rural Industries, Research and Development Corporation, 2005, 84 p). Los estándares de agluconas de flavonoides
55 y glucósidos de flavonoides se adquirieron de Extrasynthese (Genay, Francia).
[0097] El análisis de HPLC en fase inversa indicó que un extracto de polen de cinco gramíneas contiene: 1. una mayor parte de flavonoides de alta polaridad, que aparecen como los picos n.° 1 y n.° 2; 2. pequeñas cantidades de flavonoides de polaridad moderada, que aparecen como los picos n.° 3, n.° 4 y n.° 5; 3. no contiene agluconas de
60 flavonoides detectables. Los tiempos de retención (RT) fueron los siguientes: pico n.° 1: 14,975; pico n.° 2: 15,151;
12
Tabla 2. Concentración de isorramnetina, quercetina y canferol en tres lotes de extractos tamizados de polen de cinco gramíneas, según medición por HPLC-DAD trashidrólisis con HCl y concentración deducida de los diclucósidos correspondientes respectivos (en µg/mg)
Concentración de agluconas de flavonoides Concentración deducida de diglucósidos de flavonoides
Agluconas deDiclucósido deDiclucósido deDiclucósido deDiglucósidos de
de lote N.° IsorramnetinaQuercetinaCanferol
flavonoidesisorramnetinaquercetinacanferolflavonoides
(316 Da) (302 Da) (286 Da)
totales (640 Da) (626 Da) (610 Da) totales
50299 1,70 0,34 0,10 2,14 3,44 0,70 0,21 4,36 50300 1,00 0,26 0,08 1,34 2,03 0,54 0,17 2,73 50311 1,30 0,35 0,09 1,74 2,63 0,73 0,19 3,55
Media1,33 0,32 0,09 1,74 2,70 0,66 0,19 3,55 % 77 18 5100 76 19 5100
Tabla 3. Concentración de isorramnetina, quercetina y canferol en tres lotes de extracto liofilizado tamizado de polen de cinco gramíneas (sustancia activa) obtenidosusando la etapa de ultrafiltración optimizada, según medición por HPLC-DAD tras hidrólisis con HCl, concentración deducida de los correspondientes diglucósidosrespectivos y concentración deducida de todos los diglucósidos de flavonoides en un comprimido de 300 IR correspondiente
Concentracióndeducida dediglucósidos
Concentración deducida de diglucósidos de flavonoides (en % ode flavonoides
Concentración de agluconas de flavonoides (en % o g/100 g) g/100 g)* en un
de lote N.° comprimido
de 300 IR (enµg)**
Agluconas deDiglucósidoDiglucósidosDiglucósidos
DiglucósidoDiglucósido
Isorramnetina Quercetina Canferol flavonoidesdede flavonoidesde flavonoides
de quercetina de canferol
totales isorramnetina totales totales 60099 <0,001 <0,001 <0,001 <0,003 <0,002 <0,002 <0,002 <0,006 <0,15 60106 <0,001 <0,001 <0,001 <0,003 <0,002 <0,002 <0,002 <0,006 <0,15 60113 <0,001 <0,001 <0,001 <0,003 <0,002 <0,002 <0,002 <0,006 <0,15
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