ES2627954T3 - Sistema de expresión en CHO - Google Patents

Abstract

Una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que comprende un vector de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN), y en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40) , que incluye el potenciador de SV40 y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en la que dicha GS comprende una secuencia al menos el 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de expresion en CHO CAMPO DE LA INVENClON

La presente invencion esta dentro del campo de la produccion industrial de protemas. Los inventores han disenado y construido un nuevo sistema de expresion que comprende un vector de expresion que codifica una glutamina sintetasa de origen humano o de perro, y una lmea de celulas CHO. Mas espedficamente, la invencion se refiere a una combinacion de (i) un vector de ADN adecuado para la produccion de una protema recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa, y (ii) una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO), en la que dicha GS comprende una secuencia al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

Cuando se producen protemas recombinantes a escala industrial, deben aislarse clones que producen altas cantidades de protemas recombinantes.

La introduccion de genes heterologos en celulas huesped de animal y el cribado para la expresion de los genes anadidos es un proceso largo y complicado. El proceso implica la transfeccion y la seleccion de clones con expresion a largo plazo estable, y el cribado de altas velocidades de expresion de la protema recombinante.

Cuando se generan clones que expresan una protema recombinante a partir de vectores de expresion, normalmente se transfectan celulas huesped con un vector de ADN que codifica tanto la protema de interes como el marcador de seleccion en el mismo vector. Un vector de expresion tal comprende asf un marcador de seleccion que permite la seleccion de clones en el que el vector de expresion esta presente. Un marcador de seleccion tal puede tambien conducir a una co-amplificacion que tiene lugar, permitiendo asf el aislamiento de clones altamente productores.

Se conocen en la tecnica varios de tales marcadores de seleccion, que incluyen, por ejemplo, G418, higromicina, puromicina, zeomicina, dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa (GS) e hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT). En particular, la GS se usa ampliamente como marcador de seleccion en el campo de la produccion industrial de protemas recombinantes en celulas eucariotas.

Mas espedficamente, el documento WO 87/04462 describe el uso de glutamina sintetasa (GS) como marcador de seleccion. Los ejemplos ensenan un vector de expresion que comprende, como marcador de seleccion, la secuencia que codifica una GS de origen de hamster chino. Se muestra ademas que un vector de expresion tal permite la produccion de una protema recombinante tras la transfeccion del vector de expresion en celulas CHO, siendo la protema recombinante tPA.

Aunque el sistema de expresion en CHO anterior basado en el uso de GS como marcador de seleccion se describio ya en los anos 80, todavfa hoy en dfa sigue siendo un estandar en la materia. En particular, no se ha publicado mejora significativa al marcador de seleccion de GS original.

De hecho, la patente coreana KR10-0267720 desvela el uso de GS humana como marcador de seleccion. Sin embargo, no se ha desvelado la secuencia exacta de la GS humana usada. Ademas, tambien se indica que el efecto tecnico (alto rendimiento) esta solo asociado a tanto la GS humana como al promotor de SV40 espedfico que se usa (es decir, un promotor de SV40 que carece de las posiciones 128 a 270).

Asf, hay una necesidad en la materia de sistemas de expresion adicionales y/o mejorados que permitan el aislamiento de un alto numero de clones que expresan la protema recombinante para la que se desea la produccion, presentando al menos algunos de estos clones altas velocidades de expresion de la protema recombinante.

SUMARIO DE LA INVENCION

Los inventores han descubierto sorprendentemente que cuando se producen protemas recombinantes en celulas CHO, el uso de una GS de origen humano o de perro da mejores resultados que el uso de una GS de origen CHO (veanse, por ejemplo, las Figuras 2 y 3).

En particular, se ha encontrado que el uso de una GS de origen humano es especialmente ventajoso, ya que permite el aislamiento de mas clones que expresan las protemas recombinantes que cuando se usa una GS de origen CHO, expresando algunos de ellos la protema recombinante a niveles mas altos que cuando se usa una GS de origen cHo (vease, por ejemplo, la Figura 3).

Una realizacion de la invencion proporciona una lmea celular de ovario de hamster chino (CHO) que comprende un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y en la que el vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mairnfero heterologa bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40 y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante, en la que la GS comprende una secuencia de protemas que es al menos el

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94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la invencion, la GS comprende una secuencia al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y a la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la invencion, la GS comprende una secuencia al menos el 97,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una realizacion particular de la invencion, la GS es una GS humana y comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la invencion, la GS es una GS de perro y tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2.

Los investigadores describen que la lmea de celulas CHO comprende un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mairnfero heterologa y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante, en la que los codones del triplete de dicha secuencia que codifica una GS han sido sesgados para la expresion en celulas CHO. Muestran que dicha secuencia que codifica una GS comprende una secuencia al menos el 80 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En particular, demuestran que la secuencia que codifica una GS comprende una secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En otra realizacion de la invencion, la secuencia que codifica GS humana se pone bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40) y la protema recombinante es un anticuerpo monoclonal.

Los investigadores describen que la lmea de celulas CHO comprende un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mai^ero heterologa y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante en la que los codones del triplete de dicha secuencia que codifica una GS han sido sesgados para la expresion en celulas CHO. En otra realizacion, el vector comprende un primer casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena ligera del anticuerpo, y un segundo casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena pesada del anticuerpo. Los investigadores tambien muestran que el primer y segundo casetes de expresion comprenden cada uno un promotor de CMV y la lmea de celulas CHO es capaz de ser cultivada en medio sin suero o medio libre de protema libre de suero y derivado de animal.

En una realizacion de la invencion, la lmea de celulas CHO es la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC o se deriva de la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC. En otra realizacion de la invencion, la lmea de celulas CHO permite obtener clones que producen al menos 1 mg/l de protema recombinante tras la transfeccion de dicho vector en la lmea de celulas CHO depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC.

En otra realizacion adicional de la invencion, la lmea de celulas CHO comprende un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia de nucleotidos de glutamina sintasa (GS) bajo el control de un promotor del virus (40) vacuolante de simio, que incluye el potenciador de SV40 (es decir, una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS)) y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante. Los investigadores describen que el vector no contiene un gen heterologo para la expresion de una protema recombinante. Muestran que el vector contiene al menos una secuencia que codifica una protema recombinante. Demuestran que el vector contiene un gen heterologo que codifica una protema recombinante que es un anticuerpo monoclonal. Los investigadores tambien describen que el vector contiene un gen heterologo que codifica una protema recombinante que es una protema inmunogenica para inducir una respuesta de anticuerpos. Muestran que el vector contiene un gen heterologo que codifica una protema recombinante que es una enzima para la terapia de reemplazo de enzima o para uso industrial.

Una realizacion de la invencion proporciona un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40 y un primer casete de expresion adecuado para la clonacion de una protema recombinante heterologa bajo el control de un promotor de CMV. En una realizacion particular de la invencion, la GS comprende una secuencia de protemas que es al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

El investigador tambien describe un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40) y un primer casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena ligera del anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV, y un segundo casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena pesada del anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV. En particular, muestran que la GS comprende una secuencia de protemas que es al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de al menos 100 aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Los investigadores tambien describen un vector como se define en la Figura 1.

Una realizacion de la invencion proporciona un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante que comprende las etapas de proporcionar una lmea de celulas CHO; cultivar la lmea de celulas CHO obtenida en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y aislar y/o purificar dicha protema recombinante. Otra realizacion proporciona otra etapa de formular la protema recombinante en una composicion farmaceutica.

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Una realizacion de la invencion se refiere a una combinacion de:

i) una lmea celular eucariota (por ejemplo, una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO)); y

ii) un vector de ADN adecuado para la produccion de una protema recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mairnfero heterologa bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40 (por ejemplo, una GS que comprende una secuencia al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2).

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un kit que comprende la combinacion anterior.

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere al vector de ADN como tal.

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere a una lmea de celulas CHO que comprende el vector de ADN.

En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante que comprende las etapas de:

a) proporcionar un vector como se define aqu anteriormente;

b) transfectar una lmea celular con dicho vector;

c) cultivar la lmea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y

d) aislar y/o purificar dicha protema recombinante.

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere al uso de una combinacion tal, o de un vector tal, o de tal lmea celular, para producir una protema recombinante in vitro.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra un esquema de los vectores usados en los ejemplos (pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3699, pBH3698, pBH3697 y pBH3623).

La Figura 2 muestra el numero de pocillos ocupados y productividades logradas con una lmea de celulas CHO transformada con los vectores pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3699, pBH3698, pBH3697 y pBH3623. La Figura 3 muestra las productividades logradas por los clones obtenidos durante el experimento mostrado en la Figura 2, para los vectores pBH3695, pBH3700 y pBH3623. Cada barra representa un clon.

La Figura 4 muestra los resultados de un experimento llevado a cabo en la lmea celular 9E4. Se muestran las productividades y el numero de clones obtenidos. El numero "0" en el eje horizontal indica que no se obtuvo ningun clon (que es el caso para los vectores pBH3700, pBH3694, pBH3697, pBH3698 y pBH3699).

La Figura 5 muestra un alineamiento de secuencias entre la GS humana de SEQ ID NO: 1, la GS de perro de SEQ ID NO: 2 y la GS de CHO de SEQ ID NO: 3, que se preparo usando el programa de “alineamiento de multiples secuencias" CLUSTAL 2.1". Los restos que son diferentes en GS humana y de perro, como en comparacion con GS de CHO, se indican con una flecha negra. Estos restos se corresponden con los restos 12, 16, 18, 19, 33, 49, 80, 82, 91, 116, 191, 269, 282, 350, 355 y 356 de SEQ ID NO: 1 y de SEQ ID NO: 2 (las variaciones de aminoacido correspondientes a 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91K, 116T, 191A, 269Y, 282Q, 350S, 355L y 356I, respectivamente). Los restos que son diferentes en GS humana, en comparacion con GS de perro y CHO, se indican con una flecha gris. Estos restos se corresponden con restos en la posicion 2, 68, 98, 107, 169, 213 de SEQ ID NO: 1 (las variaciones de aminoacido correspondientes a 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S, respectivamente).

La Figura 6 muestra la concentracion de anticuerpo obtenida despues de la transfeccion transitoria de celulas CHOS con vectores de control (Control 1 y Control 2), y con los vectores pBH3695 y pBH3772, respectivamente, que expresan los anticuerpos 13C3 y anti-CD38.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los investigadores describen una combinacion de:

i) una lmea celular eucariota; y

ii) un vector de ADN (acido desoxirribonucleico) adecuado para la produccion de una protema recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mai^ero heterologa.

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La lmea celular eucariota puede ser, por ejemplo, una lmea celular de levadura (por ejemplo, una lmea celular de Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica), una lmea celular fungica (por ejemplo, una lmea celular de Aspergillus niger), una lmea celular de insecto o una lmea celular de mairnfero (que incluye, pero no se limita a, lmeas de celulas CHO, lmeas celulares humanas tales como HEK293 o PERC.6, lmeas celulares de raton tales como NS0 y lmeas celulares de mono). En una realizacion espedfica, la lmea celular eucariota es una lmea de celulas CHO. La GS codificada por el vector de ADN procede de una especie de mamffero heterologo, y puede, por ejemplo, proceder de ser humano o perro.

En particular, muestran que dicha GS de mamffero heterologa comprende o consiste en una secuencia:

- al menos el 94,5 % identica a al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Una combinacion tal constituye un sistema de expresion.

Mas espedficamente, un aspecto de la invencion se refiere a una combinacion de:

i) un vector de ADN adecuado para la produccion de una protema recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control del promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40; y

ii) una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO); en la que dicha GS comprende una secuencia:

- al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

La combinacion segun la invencion puede proporcionarse, por ejemplo, bajo la forma de un kit, por ejemplo con un vial que comprende el vector de ADN, y otro vial que comprende la lmea celular.

Cuando el sistema de expresion se usa para producir una protema recombinante, el vector se introduce en la lmea celular (puede ser, por ejemplo, establemente o transitoriamente transfectado en la lmea celular).

Asf, la presente invencion engloba:

- una combinacion en la que el vector esta presente dentro de la lmea celular, por una parte, y

- una combinacion en la que el vector se afsla de la lmea celular, por otra parte.

1. Vector segun la invencion

El vector de ADN para su uso en la combinacion segun la invencion (denominado ademas "vector segun la invencion") es adecuado para la produccion de una protema recombinante, y comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40. Como se usa en el presente documento, el termino "glutamina sintetasa" o "GS" se refiere a un polipeptido capaz de catalizar la condensacion de glutamato y amoniaco para formar glutamina, como se representa por la siguiente reaccion bioqdmica:

ATP + L-glutamato + NH3 <=> ADP + fosfato + L-glutamina.

Un polipeptido tal se clasifica con el numero de la Comision de Enzimas (EC) 6.3.I.2. Polipeptidos capaces de catalizar la reaccion anterior presentan "actividad de GS".

La GS que se usa en el marco de la presente invencion (denominada ademas "GS segun la invencion") puede comprender o consistir en una secuencia al menos el 94,5 %, 95 %, 95,5 %, 96 %, 96,5 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % o el 100 % identica a al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. De hecho, se ha encontrado que una GS tal es ventajosa para su uso como un marcador de seleccion en celulas CHO (vease el Ejemplo 1). Tambien puede comprender o consistir en un fragmento de al menos 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, siempre que la protema retenga su actividad de GS.

En una realizacion espedfica, la GS segun la invencion comprende o consiste en una secuencia al menos el 94,5 %, 95 %, 95,5 %, 96 %, 96,5 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % o el 100 % identica tanto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 como a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En una realizacion espedfica, la GS segun la invencion comprende o consiste en una secuencia al menos el 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % o el 100 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1. Una GS tal es particularmente ventajosa para su uso como un marcador de seleccion en celulas CHO (vease el Ejemplo 1), en particular en la lmea de celulas CHO E94 (vease el Ejemplo 2).

En una realizacion espedfica, la GS segun la invencion es una GS humana, es decir, una GS de origen humano. Como se usa en el presente documento, el termino "GS humana" se refiere a una secuencia que comprende o que

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consiste en SEQ ID NO: 1, ademas de variantes de la misma que presentan actividad de GS. Tales variantes pueden corresponderse, por ejemplo, con variantes que se producen naturalmente en especies humanas (tales como variantes alelicas o variantes de corte y empalme). Alternativamente, tales variantes pueden corresponderse con variantes obtenidas por ingeniena genetica. Lo mas preferentemente, tales variantes solo se diferencian de la secuencia de SEQ ID NO: 1 por la presencia de como maximo 22, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoacido en comparacion con SEQ ID NO: 1 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y deleciones).

En otra realizacion espedfica, la GS segun la invencion es una GS de perro, es decir, una GS de origen de perro. Como se usa en el presente documento, el termino "GS de perro" se refiere a una secuencia que comprende o que consiste en SEQ iD NO: 2, ademas de variantes de la misma que presentan actividad de GS. Tales variantes pueden corresponderse, por ejemplo, con variantes que se producen naturalmente en especies de perro (tales como variantes alelicas o variantes de corte y empalme). Alternativamente, tales variantes pueden corresponderse con variantes obtenidas por ingeniena genetica. Lo mas preferentemente, tales variantes solo se diferencian de la secuencia de SEQ ID NO: 2 por la presencia de como maximo 22, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoacido en comparacion con SEQ ID NO: 2 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y deleciones).

En una realizacion espedfica, la GS segun la invencion comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 16, 20 o 22 de los siguientes aminoacidos: 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91 K, 116T, 191A, 269Y, 282Q, 350S, 355L, 356I, 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S, en la que el numero indica la posicion en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y la letra la naturaleza del aminoacido (usando el codigo genetico de una letra). En una realizacion mas espedfica, la GS segun la invencion comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los siguientes aminoacidos: 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S. En otra realizacion mas espedfica, la GS segun la invencion comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 o 16 de los siguientes aminoacidos: 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91 K, 116T, 191A, 269Y, 282Q, 350S, 355L y 356I. Los aminoacidos anteriores parecen ser espedficos para la GS humana y/o de perro, en comparacion con la GS de CHO (vease la Figura 5).

Por un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos al menos, por ejemplo, el 95 % "identica" a una secuencia de aminoacidos de busqueda de la presente invencion, se pretende que la secuencia de aminoacidos del polipeptido objeto sea identica a la secuencia de busqueda, excepto que la secuencia de polipeptidos objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacido por cada 100 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de busqueda. En otras palabras, para obtener un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos al menos el 95 % identica a una secuencia de aminoacidos de busqueda, hasta el 5 % (5 de 100) de los restos de aminoacidos en la secuencia objeto pueden insertarse, delecionarse, o sustituirse con otro aminoacido.

En el marco de la presente solicitud, el porcentaje de identidad se calcula usando un alineamiento global (es decir, se comparan las dos secuencias a lo largo de su longitud entera). Metodos de comparacion de la identidad y homologfa de dos o mas secuencias son muy conocidos en la tecnica. Puede usarse el programa « needle », que usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443453) para encontrar el alineamiento optimo (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera su longitud entera, por ejemplo, cuando se realiza un alineamiento global. Este programa needle esta disponible, por ejemplo, en el sitio de la malla mundial de ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad segun la invencion se calcula preferentemente usando el programa EMBOSS::needle (global) con un parametro de "Hueco abierto" igual a 10,0, un parametro de "Extension de hueco" igual a 0,5, y una matriz Blosum62.

Variantes de una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparacion con la secuencia de referencia. En caso de sustituciones, la sustitucion se corresponde preferentemente con una sustitucion conservativa como se indica en la tabla a continuacion.

Sustituciones conservativas

Tipo de aminoacido

Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp

Aminoacidos con cadenas laterales hidrofobas alifaticas

Ser, Tyr, Asn, Gln, Cys

Aminoacidos con cadenas laterales no cargadas, pero polares

Asp, Glu

Aminoacidos con cadenas laterales acidas

Lys, Arg, His

Aminoacidos con cadenas laterales basicas

Gly

Cadena lateral neutra

El vector de ADN segun la invencion comprende una secuencia que codifica una GS tal segun la invencion. La secuencia que codifica una GS tal segun la invencion puede ser la secuencia de nucleotidos que existe de forma natural. Alternativamente, los codones del triplete de la secuencia que codifica una GS tal pueden estar sesgados para la expresion en celulas CHO. Software y algoritmos para sesgar la secuencia con el fin de obtener una

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expresion optima se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst Synth Biol. 4:215-25). Este algoritmo no solo proporciona los mejores codones disponibles para la expresion, sino que tambien tiene en cuenta el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseados.

Por ejemplo, la secuencia que codifica la GS segun la invencion puede comprender o consistir en una secuencia al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 8 (es decir, una secuencia que codifica la GS humana de SEQ ID NO: 1, que ha sido disenada para la expresion optima en celulas CHO) y/o con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 9 (es decir, una secuencia que codifica una GS de perro de SEQ ID NO: 2, que ha sido disenada para la expresion optima en celulas CHO).

En una realizacion espedfica, la secuencia que codifica la GS segun la invencion comprende o consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

Por ejemplo, la secuencia que codifica la GS segun la invencion puede ponerse, por ejemplo, bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), por ejemplo, el promotor tardfo o temprano de SV40. Un promotor temprano del SV40 se describe, por ejemplo, en Benoist y Chambon (1981, Nature. 290:304-10) y en Moreau et al. (1981, Nucleic Acids Res. 9:6047-68). En particular, dicho promotor de SV40 es un promotor de longitud completa, que incluye el potenciador de SV40. Dicho promotor de SV40 puede tambien tener un origen de replicacion que contiene una repeticion de 72 pb.

En una realizacion espedfica, dicho promotor de SV40 no es un promotor de SV40 en el que las posiciones 128 a 270 han sido eliminadas, es decir, dicho promotor de SV40 no es el promotor de SV40 descrito en la patente coreana N.° 10-0267720 y que transforma el transformante de E. coli depositado en Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST el 17 de diciembre de 1997 con el Numero de deposito: KCTC 8860 P.

Vectores de ADN que son adecuados para la produccion de protemas recombinantes son conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales vectores de ADN normalmente se corresponden con vectores de expresion que comprenden un origen de replicacion y al menos un casete de expresion que permite la clonacion y la expresion de la protema recombinante para la que se desea la produccion. Un casete de expresion normalmente comprende una region no traducida 5' (que comprende o que consiste en un promotor, y opcionalmente una secuencia de potenciador), uno o mas sitios de restriccion que permiten la clonacion de una secuencia que codifica la protema recombinante, una region no traducida 3' (por ejemplo, una senal de poliA), y opcionalmente uno o mas intrones. La secuencia de promotor puede corresponderse con cualquier promotor fuerte muy conocido en la materia, tal como, por ejemplo, el promotor de CMV humano. El vector segun la invencion puede tener, por ejemplo, la estructura representada en la Figura 1, que se explica en mas detalles en el Ejemplo 1, a condicion de que la cadena pesada y la cadena ligera de 13C3 puedan sustituirse con otras dos secuencias codificantes (por ejemplo, secuencias que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de otro anticuerpo).

La protema recombinante puede corresponderse con cualquier protema que sea de interes para aquellos expertos en la materia. Como se usa en el presente documento, el termino "protema" pretende englobar peptidos (es decir, cadenas de aminoacidos de menos de 50 aminoacidos), polipeptidos (es decir, cadenas de aminoacidos de al menos 50 aminoacidos), protemas monomericas (es decir, protemas que consisten en una cadena de aminoacidos) y protemas multimericas (es decir, protemas que consisten en dos o mas cadenas de aminoacidos, tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

El vector segun la invencion normalmente comprende un numero de casetes de expresion que es identico al numero de cadenas de aminoacidos diferentes que constituyen la protema (por ejemplo, un casete de expresion en caso de una protema monomerica o protema homodimerica, dos en el caso de una protema heterodimerica o de un anticuerpo monoclonal, etc.).

Alternativamente, el vector de ADN segun la invencion puede comprender solo un casete de expresion, incluso cuando se desee la produccion de una protema heterodimerica o de un anticuerpo monoclonal. En un caso tal, la(s) secuencia(s) que codifica(n) la(s) otra(s) cadena(s) de aminoacidos de la protema esta(n) presente(s) en un vector de expresion separado, que se co-transfecta con el vector segun la invencion en la lmea de celulas CHO.

En una realizacion espedfica, el vector de ADN segun la invencion puede carecer de casete de expresion. En un caso tal, el (los) casete(s) de expresion adecuado(s) para la expresion de la protema recombinante esta(n) presente(s) en un vector separado, que se co-transfecta con el vector segun la invencion en la lmea de celulas CHO.

En toda la presente memoria descriptiva, el termino "protema recombinante" se refiere a cualquier protema recombinante para la que se desea la produccion. Puede corresponderse, por ejemplo, con una protema terapeutica y/o una profilactica, es decir, una protema prevista para su uso como un medicamento (incluyendo vacunas). En una realizacion espedfica, la protema recombinante para la que se desea la produccion no es una glutamina sintetasa (GS). En otra realizacion espedfica, la protema recombinante para la que se desea la produccion es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion espedfica adicional, la protema recombinante para la que se desea la produccion es una protema antigenica. En otra realizacion espedfica adicional, la protema recombinante para la que se desea la produccion no es eritropoyetina (EPO).

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El termino "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (incluyendo anticuerpos biespedficos), fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab')2), y protemas de fusion que comprenden un fragmento de anticuerpo. Un anticuerpo reactivo con un antigeno espedfico puede generarse por metodos recombinantes tales como seleccion de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares, o inmunizando un animal con el antigeno o un acido nucleico que codifica el antfgeno.

Un "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, es un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos que forman esta poblacion son esencialmente identicos, excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural que podnan estar presentes en cantidades menores. Estos anticuerpos se dirigen contra un unico epitope (o un unico grupo de epitopes en el caso de anticuerpos monoclonales multiespedficos) y, por tanto, son altamente espedficos.

Un anticuerpo monoclonal tfpico comprende dos cadenas pesadas identicas y dos cadena ligeras identicas que se unen por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una region constante y una region variable. Cada region variable contiene tres segmentos llamados "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de la union de un epitope de un antigeno. Normalmente se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, se numeran secuencialmente desde el extremo N (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991). Las porciones mas altamente conservadas de las regiones variables se llaman las "regiones estructurales".

El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo completamente humano.

Cuando la protema recombinante para la que se desea la produccion es un anticuerpo monoclonal, el vector segun la invencion puede comprender un primer casete de expresion adecuado para la clonacion de la cadena ligera del anticuerpo, y un segundo casete de expresion adecuado para la clonacion de la cadena pesada del anticuerpo.

En una realizacion espedfica, dicho primer y segundo casetes de expresion comprenden cada uno el promotor del citomegalovirus (CMV), por ejemplo un promotor de CMV de un CMV humano o murino. Mas espedficamente, dichos primer y segundo casetes de expresion pueden comprender:

- un promotor/potenciador inmediato/temprano del CMV (por ejemplo, aquel que tiene la secuencia descrita en Teschendorf et al., 2002, Anticancer Res. 22:3325-30); o

- una region de promotor/potenciador de IE2 de CMV de raton (por ejemplo, aquella que tiene la secuencia descrita en Chatellard et al., 2007, Biotechnol Bioeng. 96:106-17); o

- un elemento regulador de hCMV-MIE (por ejemplo, aquel que tiene la secuencia descrita en el documento WO 89/01036).

El termino "protema antigenica" se usa en el presente documento en el sentido mas amplio y cubre cualquier protema capaz de generar una respuesta inmunitaria, tanto sola como en combinacion con un adyuvante. Puede estar prevista para su uso tanto en una vacuna profilactica como en una vacuna terapeutica. En una realizacion espedfica, la protema antigenica es una protema vacunal, es decir, una protema prevista para su uso en una vacuna profilactica.

En el marco de la presente invencion, el vector de ADN podna tanto comprender al menos una secuencia que codifica la protema recombinante de interes (por ejemplo, una secuencia que codifica una protema monomerica, una secuencia que codifica una cadena de anticuerpo, o dos secuencias, que codifican una cadena ligera del anticuerpo y una cadena pesada del anticuerpo, respectivamente), o podna estar vado (es decir, que carece de una secuencia tal que codifica la protema recombinante de interes).

En un aspecto, la invencion se refiere al vector segun la invencion de por su Un vector tal esta preferentemente previsto para su uso en una lmea de celulas CHO. Sin embargo, tambien puede usarse para expresar protemas en otras lmeas celulares eucariotas tales como lmeas celulares de levadura, fungicas, de insecto o de mamffero (por ejemplo, humanas, de raton, mono, etc.).

2. Lmea celular segun la invencion

La lmea celular para su uso en la combinacion segun la invencion (denominada ademas "lmea celular segun la invencion") es una lmea celular eucariota, por ejemplo una lmea celular de mamffero tal como una lmea de celulas CHO. Las lmeas de celulas CHO se usan comunmente para produccion industrial de protemas, y muchas lmeas de celulas CHO son conocidas para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, tales lmeas de celulas CHO incluyen, por ejemplo, la lmea de celulas cHo-K1 (Numero ATCC: CCL-61), la lmea de celulas DP-12 de CHO (N.° aTcC

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CRL-12444 y 12445) y la lmea de celulas 1-15 de CHO (Numero ATCC CRL-9606). Estas cepas estan publicamente disponibles de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo.

En una realizacion espedfica, la lmea de celulas CHO segun la invencion es capaz de crecer en medio sin suero (por ejemplo, un medio qmmicamente definido) y/o en suspension. Una lmea celular tal puede obtenerse facilmente por aquellos expertos en la materia adaptando la lmea celular parental para crecer en medio sin suero y/o en suspension (por ejemplo, mediante clonacion de una sola celula, mediante adaptacion progresiva y/o mediante un proceso de "privacion y rescate").

La lmea de celulas CHO segun la invencion puede tanto ser una lmea celular deficiente en GS, como una lmea celular que comprende un gen GS endogeno que codifica un polipeptido GS endogeno.

En una realizacion espedfica, la lmea de celulas CHO es la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC. Como se usa en el presente documento, el termino 'lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC" engloba el clon parental depositado en realidad en la ATCC, por una parte, y los clones derivados del mismo, por ejemplo mediante clonacion de una sola celula, adaptacion progresiva y/o o mediante un proceso de "privacion y rescate", por otra parte. Mas espedficamente, la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC puede usarse para obtener clones capaces de crecer en medio sin suero y/o en suspension.

En una realizacion espedfica, la combinacion segun la invencion se caracteriza por que permite obtener clones que producen al menos 1, 2, 3, 4 o 5 mg/l de protema recombinante tras la transfeccion del vector en la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC.

En otro aspecto, la invencion se refiere a una lmea de celulas CHO que comprende un vector segun la invencion. Preferentemente, dicha lmea de celulas CHO se transfecta (establemente o se transfecta transitoriamente) con dicho vector. Lo mas preferentemente, dicha lmea de celulas CHO comprende dicho vector integrado en su genoma.

Mas espedficamente, la invencion se refiere a la lmea de celulas CHO que comprende un vector de ADN de expresion, y en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamffero heterologa y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante, en la que dicha GS comprende una secuencia de protemas:

a) al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o

b) que consiste en un fragmento de al menos 100 aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

3. Kits, metodos y usos segun la invencion

Un aspecto de la invencion se refiere a un kit que comprende o que consiste en una combinacion segun la invencion. En un kit tal, el vector esta preferentemente vado, ya que esto permite la clonacion de la protema de interes para aquellos expertos en la materia. Ademas, el vector de ADN se afsla preferentemente de la lmea celular en un kit tal. El kit puede comprender ademas medios adecuados para el cultivo de la lmea celular, medios adecuados para la transfeccion del vector en la lmea celular, y/o instrucciones para el uso del sistema de expresion.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la combinacion segun la invencion, o del vector segun la invencion, o de la lmea celular segun la invencion, para producir una protema recombinante in vitro.

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho metodo en las siguientes etapas:

a) proporcionar una combinacion segun la invencion;

b) transfectar dicha lmea celular con dicho vector de ADN;

c) cultivar la lmea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y

d) aislar y/o purificar dicha protema recombinante.

Como es inmediatamente evidente para aquellos expertos en la materia, el aspecto anterior se refiere a una combinacion segun la invencion en la que el vector de ADN se afsla de la lmea celular en la etapa (a).

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho metodo en las siguientes etapas:

a) proporcionar una combinacion segun la invencion;

b) cultivar la lmea celular transfectada en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y

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c) aislar y/o purificar dicha protema recombinante.

Como es inmediatamente evidente para aquellos expertos en la materia, el aspecto anterior se refiere a una combinacion segun la invencion en la que la lmea celular comprende el vector de ADN (por ejemplo, la lmea celular ha sido previamente transfectada con el vector de ADN) en la etapa (a).

Otro aspecto mas de la invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante, que comprende o que consiste en las siguientes etapas:

a) proporcionar un vector segun la invencion, en el que dicho vector comprende al menos una secuencia que codifica una protema recombinante;

b) transfectar una lmea celular segun la invencion con dicho vector;

c) cultivar la lmea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y

d) aislar y/o purificar dicha protema recombinante.

Condiciones adecuadas para la produccion de protemas recombinantes son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Pueden usarse, por ejemplo, los protocolos descritos en los ejemplos.

En una realizacion espedfica, se anade un inhibidor de GS, tal como metionina sulfoximina (msx) o fosfinotricina, cuando se cultiva la lmea celular segun la invencion. En una realizacion mas espedfica, se anaden concentraciones crecientes de un inhibidor de GS tal cuando se cultiva la lmea celular. Esto permite seleccionar clones en los que se ha amplificado el gen GS derivado de vector (y asf la secuencia que codifica la protema recombinante).

Los metodos anteriores pueden comprender ademas la etapa de formular la protema recombinante en una composicion farmaceutica.

Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo de co-amplificacion de una secuencia de ADN recombinante que codifica una protema recombinante, que comprende o que consiste en las siguientes etapas:

a) proporcionar un vector segun la invencion, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica dicha protema recombinante;

b) proporcionar una lmea celular segun la invencion;

c) transfectar dicha lmea celular con dicho vector; y

d) cultivar dicha lmea celular transfectada en condiciones que permiten seleccionar transformantes que contienen un numero amplificado de copias de una secuencia derivada de vector que codifica GS, en el que dichos transformantes tambien contienen un numero amplificado de copias de la secuencia que codifica la secuencia de aminoacidos completa de la protema recombinante.

La etapa (d) del metodo anterior puede comprender cultivar la lmea celular transfectada en medios que contienen un inhibidor de GS y seleccionar celulas transformantes que son resistentes al nivel progresivamente elevado del inhibidor de GS. Los medios que contienen el inhibidor de GS pueden contener ademas metionina, por lo que pueden reducirse las concentraciones de inhibidor de GS en los medios.

La invencion tambien se refiere a un metodo de uso de un vector de ADN como marcador de seleccion dominante en un proceso de co-transformacion, en el que dicho metodo comprende o consiste en las siguientes etapas:

a) proporcionar un vector segun la invencion, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica una protema recombinante;

b) proporcionar una lmea celular segun la invencion;

c) transfectar dicha lmea celular con dicho vector; y

d) seleccionar celulas transformantes que son resistentes a inhibidores de GS, por lo que se seleccionan las celulas transformantes, en el que una secuencia de ADN recombinante derivado de vector que codifica GS sirve de marcador de seleccion dominante y co-amplificable.

En una realizacion espedfica de los kits y metodos anteriores, la lmea celular es una lmea de celulas CHO.

En una realizacion espedfica, el uso de la combinacion segun la invencion o del vector segun la invencion, o de la lmea celular segun la invencion, permite (i) aumentar clones que expresan las protemas recombinantes, y/o (ii) aumentar la produccion de la protema recombinante, mas que cuando se usa una GS de origen CHO.

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Se citan varios documentos en todo el texto de esta memoria descriptiva. Sin embargo, no se admite que cualquier documento citado en el presente documento sea de hecho estado de la tecnica en relacion con la presente invencion.

La invencion se describira ademas con los siguientes dibujos y ejemplos, que son ilustrativos solo, y no pretenden limitar la presente invencion. De hecho, la invencion se define por las reivindicaciones, que deben interpretarse con la ayuda de la descripcion y los dibujos.

BREVE DESCRIPCION de LAS SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS de origen humano.

SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS de origen de perro.

SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS de origen de hamster chino.

SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS de origen de levadura (Saccharomyces cerevisiae).

SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS que procede de sapo (Xenopus laevis).

SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS que procede de plantas (Arabidopsis thaliana).

SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoacidos de una GS que procede de insectos (Drosophila melanogaster).

SEQ ID NO: 8 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS de origen humano.

SEQ ID NO: 9 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS de origen de perro.

SEQ ID NO: 10 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS de origen de hamster chino.

SEQ ID NO: 11 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS de origen de levadura (Saccharomyces cerevisiae).

SEQ ID NO: 12 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS que procede de sapo (Xenopus laevis).

SEQ ID NO: 13 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS que procede de plantas (Arabidopsis thaliana).

SEQ ID NO: 14 muestra una secuencia nucleotidica que codifica una GS que procede de insectos (Drosophila melanogaster).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Identificacion de una GS que da resultados mejorados

Los inventores pretendieron desarrollar nuevos vectores para la expresion y produccion de protemas recombinantes en lmeas de celulas de ovario de hamster chino (CHO). Se diseno un conjunto de siete vectores como se describe a continuacion.

Se usaron dos ADNc que codifican una version humanizada del anticuerpo 13C3 (un ADNc que codifica la cadena pesada de 13C3 y otro ADNc que codifica la cadena ligera de 13C3, respectivamente, formando la combinacion de dichas cadenas el anticuerpo 13C3 humanizado) como indicadores para evaluar la calidad del vector. El anticuerpo 13C3 murino es un anticuerpo que se une espedficamente a la forma protofibrilar de la protema de p-amiloide humana, como se describe en el documento WO 2009/065054. Como se usa ademas en el presente documento, el termino "13C3" se refiere a la version humanizada del anticuerpo 13C3 murino.

Los siete vectores se representan esquematicamente en la Figura 1. Estos ocho vectores comprenden todos:

- una secuencia que codifica una GS, puesta bajo el control del promotor de SV40 temprano;

- un primer casete de expresion, en el que la secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo 13C3 se pone bajo el control del promotor de CMV;

- un segundo casete de expresion, en el que la secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo 13C3 se pone bajo el control del promotor de CMV;

- un origen de replicacion procariota;

- un origen de replicacion eucariota; y

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- un marcador de seleccion para su uso en celulas procariotas, concretamente una secuencia que codifica una protema que confiere resistencia a ampicilina, puesto bajo el control de su promotor natural.

Mas espedficamente, la secuencia que codifica GS se pone bajo el control del promotor de SV40, que incluye el potenciador de SV40. Un promotor de SV40 temprano tal contiene los potenciadores de repeticiones en tandem de 72 pb de SV40 unidos a las repeticiones en tandem de 21 pb, y la secuencia de protemas conductora temprana de SV40 que excluye cualquier secuencia codificante. El uso de esta region como promotor fuerte se describio por Benoist y Chambon (1981, Nature. 290:304-10) y en Moreau et al. (1981, Nucleic Acids Res. 9:6047-68). Se usa clasicamente como promotor para la expresion de marcadores de seleccion en celulas de mairnfero. En los siete vectores pBH3694 a pBH3700, el sitio de restriccion HindIII natural que se rompio, y los sitios de restriccion unicos (Sall y Xmal) se anadieron en el extremo 5' y 3' de la region promotora, de tal forma que se permitiera un facil intercambio de los diferentes ADNc de GS.

Los siete vectores se diferencian entre sf por la secuencia que codifica la GS. De hecho, se clonaron secuencias que codificaban GS que teman diferentes ongenes en los vectores.

Mas espedficamente, se generaron siete ADNc que codificaban respectivamente una GS de hamster chino (Cricetulus griseus), humana (Homo sapiens), perro (Canis lupus), levadura (Saccharomyces cerevisiae), drosophila (Drosophila melanogaster), planta (Arabidopsis thaliana) y sapo (Xenopus laevis) usando las secuencias de aminoacidos que existen de forma natural que estan disponibles en bases de datos publicas. A partir de estas secuencias, las protemas se retro-tradujeron usando una matriz de los codones mas frecuentes usados en CHO. A partir de aqrn, los ADNc se modificaron para contener sitios de clonacion apropiados y se optimizaron las secuencias nucleotfdicas. Digno de mencion, mientras que las secuencias nucleotfdicas se optimizaron para la expresion de CHO, la secuencia de aminoacidos de protemas codificadas sigue identica a la de las protemas naturalmente codificadas.

Mas espedficamente, se seleccionaron las secuencias codificantes que existen de forma natural para las diferentes GS en diferentes genotecas de ADNc publicas. Por ejemplo, se uso el N.° de referencia de NCBI Nm_002065.5 para GS humana. Se uso el N.° de referencia de NCBI NM_001002965.1 para GS de perro. Se uso el N.° de referencia de NCBI NM_078568.2 para GS de drosophila. La secuencia que codifica GS de levadura se encontro en el sitio de la malla mundial disponible en yeastgenome punto org (N.° de referencia YPR035W). La secuencia de aminoacidos de GS de hamster chino se corresponde con aquella que se muestra en la secuencia de referencia de NCBI: XP_003502909.1 (REFSEQ: acceso XM_003502861.1). A partir de las secuencias de ADNc que se producen naturalmente, se sesgaron los codones del triplete de la secuencia que codifica una GS tal para la expresion en celulas CHO usando un software desarrollado por Wagner y colaboradores, que se basa en el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst Synth Biol. 4:215-25). Esta tecnica no solo proporciona los mejores codones disponibles para la expresion, sino que tambien tiene en cuenta el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseados.

Los ADNc obtenidos se clonaron en el esqueleto que lleva los casetes de expresion para el anticuerpo 13C3, dando asf los vectores representados en la Figura 1.

El nombre de estos vectores, ademas del origen y la secuencia de la GS codificada, se muestran en la tabla a continuacion.

Nombre

Origen de la GS Secuencia de aminoacidos de la GS Secuencia nucleotfdica de la GS

pBH3695

Humano SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 8

pBH3700

Perro SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9

pBH3623

CHO SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 10

pBH3694

Levadura SEQ ID NO: 4 SEO ID NO: 11

pBH3699

Sapo SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 12

pBH3698

Planta SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 13

pBH3697

Drosophila SEQ ID NO: 7 SEO ID NO: 14

Se nucleoporaron los vectores anteriores usando condiciones clasicas en una lmea de celulas CHO. 24 horas despues de la transfeccion, se sembraron aproximadamente 2000 celulas en 480 a 960 pocillos de placas de 96 pocillos, comprendiendo cada pocillo 200 pl de medio CD-CHO que contiene metionina sulfoximina (msx) a una concentracion de 25 pM.

Aproximadamente 20 dfas despues de la siembra, los medios de los pocillos se cambiaron a medio nuevo y selectivo (el mismo que se ha descrito anteriormente).

Cuatro d^as despues, se conto el numero de ocupados, es decir, se cuentan los numeros de pocillos que estan conteniendo clones en crecimiento. Se probo cada sobrenadante de pocillos ocupados para su productividad de anticuerpos 13C3 usando una tecnologfa de fluorescencia resuelta en el tiempo homogenea (HTRF) desarrollada por Cisbio Bioassays (Bagnols/Ceze, Francia).

5 Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3. Puede llegarse a la conclusion a partir de estas figuras que dos vectores, concretamente pBH3695 y PBH3700, dan mejores resultados que los otros vectores. Permiten obtener ambos mas clones, y una mejor productividad.

Se muestran los porcentajes de identidad entre las secuencias de diferentes GS que se probaron en las tres tablas a continuacion. Estos porcentajes de identidad se calcularon usando el programa EMBOSS Needle, usando los 10 siguientes parametros por defecto:

- Matriz: EBLOSUM62;

- Penalizacion_hueco: 10,0; y

- Penalizaci6n_extension: 0,5.

Vector

Secuencia Origen de GS Porcentaje de identidad con la GS humana de SEQ ID NO: 1

pBH3695

SEQ ID NO: 1 Humano 100 %

pBH3700

SEQ ID NO: 2 Perro 97,3 %

pBH3623

SEQ ID NO: 3 CHO 94,1 %

pBH3694

SEQ ID NO: 4 Levadura 52,4 %

pBH3699

SEQ ID NO: 5 Sapo 85,8 %

pBH3698

SEQ ID NO: 6 Planta 50,3 %

pBH3697

SEQ ID NO: 7 Drosophila 62,8 %

Vector

Secuencia Origen de GS Porcentaje de identidad con la GS de perro de SEQ ID NO: 2

pBH3695

SEQ ID NO: 1 Humano 97,3 %

pBH3700

SEQ ID NO: 2 Perro 100 %

pBH3623

SEQ ID NO: 3 CHO 94,4 %

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Vector

Secuencia Origen de GS Porcentaje de identidad con la GS de CHO de SEQ ID NO: 3

pBH3695

SEQ ID NO: 1 Humano 94,1 %

pBH3700

SEQ ID NO: 2 Perro 94,4 %

pBH3623

SEQ ID NO: 3 CHO 100 %

A partir de estas tablas, puede llegarse a la conclusion de que las dos secuencias que dan los mejores resultados, concretamente GS humana y de perro, se caracterizan por que su secuencia presenta al menos el 94,5 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1 y/o 2. Esta caractenstica no es cierta para las secuencias de las otras 20 GS que se probaron, que condujeron a resultados menos optimos.

Ejemplo 2: Confirmacion de las ventajosas propiedades del uso de vector que codifica una GS humana en una segunda lrnea de celulas CHO.

Se ha repetido el experimento anterior con la lrnea de celulas CHO denominada "9E4", que es adecuada para la produccion industrial de protemas recombinantes.

25 La lrnea celular 9E4 se establecio a partir de un clon de la lrnea celular CHO-K1 mediante un proceso de clonacion de una sola celula. La lrnea celular CHO-K1 se obtuvo por Puck en 1957 y se ha depositado en la ATCC con numero

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CCL-61. Parece que la lmea celular 9E4 de CHO expresa una protema GS endogena y funcional, ya que esta lmea celular puede crecer en ausencia de glutamina. As^ debe usarse preferentemente metionina sulfoximina (msx) para la seleccion de clones transfectados.

El vector se introdujo en la lmea celular 9E4 mediante nucleoporacion. Se realizo un primer experimento usando los seis vectores construidos en el Ejemplo 1 (concretamente pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3697, pBH3698 y pBH3699). Las condiciones de seleccion fueron identicas a las condiciones descritas en el Ejemplo 1 (se anadio msx a una concentracion de 25 jM). Se midieron el numero de pocillos ocupados y la concentracion de anticuerpo 13C3 como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 4.

En la lmea celular 9E4, pBH3695 es el unico vector capaz de generar clones que producen anticuerpos 13C3. Este plasmido es el unico que lleva el ADNc que codifica GS humana, donde los codones del triplete se sesgaron para la expresion en celulas CHO. Asf, el uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es particularmente ventajoso para producir protemas recombinantes en lmeas de celulas CHO.

Ejemplo 3: Expresion transitoria de X14 en HEK 293 usando el vector pBH basado en GS humana y promotor de CMV humano.

En este experimento, se ha usado un vector que contiene la GS humana de secuencia SEQ ID NO: 1 puesta bajo el control del promotor de SV40, y un unico casete de expresion que contiene un ADNc que codifica el receptor de X14 humano o de raton (tambien llamado la familia 14 del dominio de lectina de tipo C, miembro A (CLEC14A), y que tiene respectivamente el numero de referencia de NCBI NP_778230.1 y NP_080085.3) bajo el control del promotor de CMV humano y un sitio de poliadenilacion. El vector que contiene el ADNc que codifica el receptor de X14 humano en lo sucesivo vector pBH4590, y el vector que contiene el ADNc que codifica el receptor de X14 de raton se denomina en lo sucesivo vector pBH4589.

Se introdujeron el vector pBH4590, vector pBH4589 o un vector de control (es decir, un vector plasirndico no relacionado) por transfeccion con Jet PEI en celulas HEK 293-FS como se describe por el fabricante Poly Plus transfection.

Las celulas se analizaron 24 h despues de la transfeccion por inmunofluorescencia, citometna de flujo o inmunocitoqmmica despues del marcado apropiado para la deteccion de X14 humano o de raton.

Deteccion por inmunofluorescencia

Para la deteccion por inmunofluorescencia, se centrifugaron las celulas transfectadas y se desecharon sus sobrenadantes. Se resuspendieron los sedimentos de celulas en tampon PBS que contema 1 % de albumina de suero bovino (PESO/VOLUMEN) y 0,1 % de Tween (V/V) (PBS T BsA) y se saturaron durante 10 minutos en este tampon. Las celulas se lavaron dos veces con el mismo tampon y se incubaron con suero 1 primario (es decir, suero obtenido justo antes de la inmunizacion del animal, llamados sueros pre-inmunosuero que representan el control negativo) o suero 2 (es decir, suero que es el inmunosuero no purificado obtenido despues de la inmunizacion del animal) con dominio extracelular humano de X14 purificado como se describe mas adelante a dilucion 1/5000 en el tampon (PBS T BSA) durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Despues de lavar el anticuerpo primario no unido, se anade un anticuerpo anti-conejo de cabra secundario unido a un fluoroforo Alexa (Alexa 488nm Ref A11034 de Invitrogen). La inmunofluorescencia se realizo usando un microscopio de fluorescencia de Leica establecido para detectar Alexa 488 nm.

No puede observarse fluorescencia de Alexa 488 de ruido fondo tanto con el plasmido de control y el suero 1 como el plasmido de control y el suero 2, respectivamente. Esto indica la ausencia de fluorescencia no espedfica de ruido de fondo. Por el contrario, aparece una fuerte fluorescencia de Alexa 488 en la membrana plasmatica de celulas transfectadas con vectores pBH4590 y pBH4589. Asf, el uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es particularmente ventajoso para promover la expresion transitoria de protemas unidas a membrana.

Deteccion por citometna de flujo.

Para la deteccion por citometna de flujo, se logro el marcado de X14 humano por dos incubaciones en serie con tres preparaciones de anticuerpo diferentes y un anticuerpo secundario anti-resto Fc de IgG de conejo. Se analizaron las dos lmeas celulares transfectadas con tres diluciones diferentes del suero anti-X14 (1/5000, 1/1000, 1/500):

• Suero 1, obtener justo antes de la inmunizacion del animal, llamados sueros pre-inmunosuero que representan el control negativo,

• Suero 2 que es el inmunosuero no purificado y obtener despues de la inmunizacion del animal con dominio extracelular humano de X14 purificado,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

• Suero 3 que se corresponde con la fraccion de inmunoglobulina del Suero 2, dirigido contra lectina humana de X14.

Despues de lavar el anticuerpo primario no unido, se ha anadido un anticuerpo anti-conejo de cabra secundario unido a un fluoroforo Alexa (Alexa 488nm, Numero de catalogo A-11034, de Life Technologies). Las celulas transfectadas se analizaron usando citometna de flujo establecida para detectar Alexa 488 con tres diluciones diferentes de Suero 1, 2 y 3 respectivamente.

Merece la pena mencionar que todos los histogramas presentan un unico pico de fluorescencia, que indica una poblacion de celulas homogenea. La intensidad de fluorescencia media de este pico esta entre 102 y 103 unidades de fluorescencia. Sin embargo, las celulas incubadas con suero 2, diluido a 1/500e, presentan una intensidad de fluorescencia media de aproximadamente 1000 unidades de fluorescencia. Esta intensidad de ruido de fondo minima es adecuada para estudiar la deteccion en la membrana plasmatica. El citometro de flujo se calibro de tal forma que la fluorescencia observada con vector de control y suero 1 diluido a 1/5000e se tomara como la fluorescencia de referencia del ruido de fondo.

Entonces se analizaron las celulas transfectadas con el vector pBH4590. La intensidad de fluorescencia de la celula transfectada con X14 humano con el suero 1, para cada dilucion, es similar a las senales de las celulas de control. Por el contrario, las senales de fluorescencia fueron marcadamente mas intensas para el suero 2 y los anticuerpos policlonales purificados (Suero 3) que para el pre-inmunosuero (Suero 1). En realidad, la intensidad de fluorescencia media para el inmunosuero (Suero 2) y el anticuerpo purificado (Suero 3) en celulas transfectadas con X14 humano es 104 unidades de fluorescencia. Aumenta un factor de 10-20 a las tres concentraciones de antisueros espedficos probados.

Estos resultados demuestran que en celulas HEK 293-FS transfectadas con el vector pBH4590, X14 humano se produce a un nivel claramente detectable como se observa por microscopfa fluorescente y citometna de flujo. Ademas, X14 humano esta siendo accesible a la deteccion extracelular, que indica que se expresa en la membrana plasmatica.

Ejemplo 4: Expresion de receptores de X14 humano y murino en celulas CHO

El objetivo de este experimento era probar si el mismo vector que se uso para la expresion transitoria de X14 humano o de raton podna usarse para la expresion en celulas CHO como clones estables de tanto receptor de X14 de raton como humano. Para hacer esto, se transfecto el vector pBH4590 o el vector pBH4589 que lleva ADNc de GS humana en la lmea celular CHO-9E4, usando el protocolo desarrollado por el dispositivo de nucleoporacion de Lonza/Amaxa. Se electroporaron dos millones de celulas CHO-9E4 con 10 pg de vector pBH4590 o vector pBH4589 descritos aqrn anteriormente. Poco despues del choque electrico, las celulas se diluyeron en 2 ml de medio fresco CD-CHO y 24 horas despues las celulas se diluyeron otra vez en medio CD-CHO fresco que contema metilsulfoximida (msx) 25 pM a una concentracion de 10.000 celulas por ml. Se sembraron aproximadamente diez placas de 96 pocillos a 2000 celulas por pocillo.

Se cribaron semiclones de CHO, obtenidos despues de la transfeccion de celulas CHO con el vector pBH4590 o el vector pBH4589, usando el marcador de seleccion GS. Tambien se realizo una transfeccion con el control de referencia que expresa el anticuerpo 13C3. Dicho control se uso como control para el analisis por citometro de flujo. Se obtuvieron treinta semiclones de X14 humano, cuarenta y un semiclones de X14 de raton y veintinueve semiclones para el vector de control.

Despues del pase de los semiclones en placas de 24 pocillos, que es al principio del proceso de amplificacion, se ha realizado la deteccion de la presencia o ausencia de antfgeno de X14 humano o de raton usando las herramientas descritas previamente.

Se ha observado que, por ejemplo, el semiclon humano N.° 12 tiene intensidad de fluorescencia mas baja que el semiclon murino N.° 30. En realidad, con semiclones murinos, se observo la presencia de fluorescencia de un solo pico que tiene una intensidad de fluorescencia maxima de 103 unidades de fluorescencia, mientras que en el caso de semiclon humano, el pico esta extendido y la intensidad de fluorescencia media no supera 500 unidades de fluorescencia. Se realizo la amplificacion de semiclones que se analizaron como positivos por citometna de flujo, permitiendo asf generar finalmente 10 semiclones de lmeas de CHO que expresan establemente lectina murina de X14 y 4 semiclones de lmeas de CHO que expresan establemente lectina humana de X14.

Asf, es particularmente ventajoso el uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana para generar lmeas de CHO que expresan establemente protemas recombinantes.

Ejemplo 5: Transfeccion transitoria en CHO-S de diferente plasmido de ADN que codifica diferentes dos anticuerpos diferentes

Con el fin de estudiar la factibilidad de uso del vector de los presentes inventores que lleva los ADNc de GS humana para la transfeccion transitoria en CHO-S, se construyo un segundo vector, llamado, derivado de pBH3695, reemplazando los dos ADNc correspondientes a la cadena ligera y pesada del anticuerpo 13C3 por la cadena ligera

y pesada de los ADNc anti-CD38 usando tecnolog^as de clonacion clasicas y cuatro sitios de restriccion unicos diferentes. Por consiguiente, el vector pBH3772 comprende:

- una secuencia que codifica una GS, puesta bajo el control del promotor de SV40 temprano;

- un primer casete de expresion, en el que la secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-CD38 se

5 pone bajo el control del promotor de CMV;

- un segundo casete de expresion, en el que la secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti- CD38 se pone bajo el control del promotor de CMV;

- un origen de replicacion procariota;

- un origen de replicacion eucariota; y

10 - un marcador de seleccion para su uso en celulas procariotas, concretamente una secuencia que codifica una

protema que confiere resistencia a ampicilina, puesta bajo el control de su promotor natural.

Entonces se transfectaron CHO-S usando el aparato Maxcyte® con (i) dos vectores de control clasicamente usados para la transfeccion transitoria y que contienen el ADNc de cadena ligera y pesada de dos anticuerpos diferentes (es decir, llamados Control 1 y Control 2), y (ii) los vectores pBH3695 y pBH3772 en las condiciones descritas por 15 Maxcyte® Corporation. Se cultivaron celulas CHO-S en CD-CHO que contema glutamina 8 mM en condiciones de cultivo de CHO-S clasicas (pase cada 2-3 dfas a 0,3 106 celulas /ml). El dfa antes de la transfeccion, las celulas se separaron a 1,2 106 celulas/ml y se transfectaron 24 horas despues. Se hicieron desplazamiento de temperatura y alimentacion de medio segun el protocolo Maxcyte®. Se tomaron muestras de cultivo en el dfa 3, 6, 7, 8 y 9, y se midieron por SEC-HPLC usando anticuerpo purificado como curva de referencia estandar.

20 Los resultados de un experimento tal se muestran en la Figura 6.

Puede llegarse a la conclusion a partir de esta figura que los vectores pBH3695 y pBH3772 son capaces de producir anticuerpos al nivel que son equivalentes o mejores que los dos vectores de control clasicamente usados para la transfeccion transitoria.

En conclusion, los dos vectores pBH3695 y pBH3772 basados en glutamina sintasa humana son capaces de 25 producir un nivel sorprendente de anticuerpos por encima de 100 mg/l.

El uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es asf particularmente ventajoso para expresar establemente o transitoriamente la protema unida a membrana o anticuerpos.

Ejemplo 6: Expresion de eritropoyetina (EPO) humana en celulas CHO

Con el fin de realizar la expresion de EPO humana, se digirio el vector pBH4590 con enzimas de restriccion Nhel y 30 EcoRl y dos ADNc de EPO humana, es decir, ADNc1 o ADNc2 limitados con sitios Nhel y EcoRl, se insertaron en dicho vector usando tecnicas clasicas de biologfa molecular.

Esto permite obtener el vector pBH4614 que lleva el ADNc1 de EPO humana, y el vector pBH4615 que lleva el ADNc2 de EPO humana.

Los dos vectores se prepararon al nivel de maxi-preparacion usando un kit desarrollado por Qiagen Corporation.

35 Se usaron vectores pBH4614 y pBH4615 para transfectar las tres lmeas celulares CHO-S, CHO-9E4 y CHO 30D12 usando las tecnicas de electroporacion de Lonza, respectivamente. Para hacer esto, las celulas se separaron el dfa antes de la transfeccion para lograr una densidad celular de 1X106 celulas/ml. Se centrifugaron dos millones de celulas y se suspendieron en 100 pl de disolucion V en presencia de 10 pg de ADN, respectivamente, para cada ADN y lmea celular. Las celulas se electroporaron usando el programa X05. Rapidamente despues de la 40 electroporacion, las celulas se diluyeron en 2 ml de medio CD-CHO que contema glutamina 6 mM (Life Technologies) y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y 5 % de CO2. Despues de esta incubacion, las celulas se diluyen en 200 ml del mismo medio sin glutamina y en presencia de msx 25 pM y se distribuyen en placas de 96 pocillos usando 200 pl por pocillo. Despues de 15 (ChO-S) a 25 dfas (CHO-9E4, CHO 30D12), se cambio medio fresco en pocillos que conteman celulas supervivientes. Cuatro a 5 dfas despues, las celulas supervivientes se 45 transfirieron a 1 ml de CD-CHO que contema msx 25 pM sin agitacion, respectivamente, para cada pocillo. Para CHO-S, se amplificaron 24 semi-clones, mientras tanto se amplificaron 12 semi-clones para las otras dos lmeas celulares, respectivamente para los dos ADNc de EPO. En general, se amplificaron 96 semi-clones, se cultivaron y se verificaron para su capacidad para producir eritropoyetina humana. Para hacer esto, despues de 3-4 dfas de incubacion, se diluyo 1 ml en 4 ml del medio CD-CHO que contema msx 25 pM y se puso en agitacion a 37 °C y 5 % 50 de CO2. Despues de 3-4 dfas, los cultivos se diluyeron otra vez con 5 ml de medio fresco. Despues de 3-4 dfas, se midio la densidad celular y celulas se diluyeron a 3X105 celulas/ml y se cultivaron durante 3-4 dfas para un primer tiempo. Se midio la densidad celular y las celulas se sembraron a 3X105 celulas/ml en medio CD-CHO que contema msx 25 pM y 30 % de Feed B (Life Technologies).

Las celulas se cultivaron en 10 ml del medio anterior (37 °C, 5 % de CO2) durante 10 dfas. Se midieron la densidad celular y viabilidad despues de 8 y 10 dfas. Se tomaron igualmente muestras de 0,6 ml para evaluar la concentracion de EPO humana. Se cribaron primero los sobrenadantes de cultivo (0,6 ml) usando la tecnologfa microflmdica de Caliper que evalua la presencia de protema al peso molecular aparente de EPO humana.

5 Se sometieron dieciseis sobrenadantes de los mejores clones, que tienen, por ejemplo, la senal de EPO mas intensa, a un ELISA espedfico para la deteccion de EPO humana usando el kit desarrollado por R&D System® para el diagnostico in vitro (Human Erythropoietin Quantikine® IVD ELISA Kit For In Vitro Diagnostic Use, referencia de catalogo DEP00). Se mostro que siete clones teman interesantes productividades como se mide en el dfa 8 y dfa 10 (siguiente tabla).

Semi clones

Celulas viables /ml (x10A6) Dfa8 Celulas viables /ml (x10A6) Dfa 10 Concentracion de EPO (g/l) Dfa 8 Concentracion de EPO (g/l) Dfa 10

CHO-S ADNc1/ clon 17

3,9 0,4 0,9 1,5

CHO-S ADNc1/ clon 18

9,8 5,8 0,5 1,0

CHO-S ADNc1/ clon 21

2,4 2,6 0,5 0,9

CHO-S ADNc1/ clon 24

1,4 1,5 0,5 0,9

CHO-S ADNc2/ clon 30

4,6 1,5 0,4 0,6

CHO-30D12 ADNc2/ clon 90

8,4 0,8 1,1 2,0

CHO-30D12 ADNc2/ clon 92

19,4 20,3 0,4 0,7

CHO-30D12 ADNc2/ clon 93

23,1 26,7 0,3 0,7

CHO-30D12 ADNc2/ clon 94

18,8 17,8 1,3 1,4

10

Las productividades de los clones estuvieron oscilando de 0,3 a 2,0 g/l. El semiclon 90 fue el mejor clon productor con una productividad de 1,1 a 2,0 g/l en el dfa 8 y dfa 10, respectivamente.

La viabilidad de este clon en el dfa 10 fue de aproximadamente el 70 % con menos de un millon de celulas por ml (0,8 millones de celulas/ml), haciendo imposible calcular la productividad espedfica a medida que el numero de 15 celulas disminrna entre el dfa 8 y el dfa 10. No hace posible el calculo de una actividad espedfica (tabla a continuacion). Este fenomeno se observa para la mayona de los semiclones, excepto para los semiclones 21, 24, 92 y 93. En ese caso, la productividad espedfica expresada en jg/106 celulas/dfa puede llegar hasta 441 y 854 (tabla a continuacion).

Semiclones

Velocidad de crecimiento diaria Productividad pg/celula en 2 dfas Productividad espedfica (pg/celula/dfa)

CHO-S ADNc1/ clon 17

NA NA NA

CHO-S ADNc1/ clon 18

NA NA NA

CHO-S ADNc1/ clon 21

0,29 1542 441

CHO-S ADNc1/ clon 24

0,17 5125 854

CHO-S ADNc2/ clon 30

NA NA NA

CHO-30D12 ADNc2/ clon 90

NA NA NA

CHO-30D12 ADNc2/ clon 92

0,12 296 36

CHO-30D12 ADNc2/ clon 93

0,43 117 51

CHO-30D12 ADNc2/ clon 94

NA 117 NA

20 Estos resultados muestran asf que, tanto en terminos de volumen como productividad espedfica, el uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana permite tener productividad por encima de 300 |jg de protema por millon de celulas.

10

15

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> SANOFI

<120> SISTEMA DE EXPRESION EN CHO <130> FR2012-007 <160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211>373 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO) que comprende un vector de expresion de acido desoxirribonucleico (ADN), y en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mairnfero heterologa bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40), que incluye el potenciador de SV40 y al menos un casete de expresion para expresar una protema recombinante, en la que dicha GS comprende una secuencia al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.
2. 2. La lmea de celulas CHO segun la reivindicacion 1, en la que dicha GS es una GS humana.
3. 3. La lmea de celulas CHO segun la reivindicacion 2, en la que dicha GS comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1.
4. 4. La lmea de celulas CHO segun la reivindicacion 1, en la que dicha GS es una GS de perro.
5. 5. La lmea de celulas CHO segun la reivindicacion 4, en la que dicha GS de perro comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2.
6. 6. La lmea de celulas CHO segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha protema recombinante es un anticuerpo monoclonal.
7. 7. La lmea de celulas CHO segun la reivindicacion 6, en la que dicho vector comprende un primer casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena ligera del anticuerpo, y un segundo casete de expresion adecuado para la clonacion de una cadena pesada del anticuerpo.
8. 8. La lmea de celulas CHO segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha lmea de celulas CHO es la lmea celular depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC.
9. 9. La lmea de celulas CHO segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que permite obtener clones que producen al menos 1 mg/l de protema recombinante tras la transfeccion de dicho vector en la lmea de celulas ChO depositada con el N.° CCL-61 en la ATCC.
10. 10. Una combinacion de:

    i) una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO); y

    ii) un vector de ADN (acido desoxirribonucleico) adecuado para la produccion de una protema recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamnfero heterologa bajo el control de un promotor del virus 40 vacuolante de simio (SV40) que incluye el potenciador de SV40, en la que dicha GS comprende una secuencia al menos el 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.
11. 11. Un kit que comprende la combinacion segun la reivindicacion 10.
12. 12. Un metodo in vitro de produccion de una protema recombinante que comprende las etapas de:

    a) proporcionar una lmea de celulas CHO segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

    b) cultivar dicha lmea de celulas CHO obtenida en condiciones adecuadas para la produccion de la protema recombinante; y

    c) aislar y/o purificar dicha protema recombinante.
13. 13. El metodo segun la reivindicacion 12, que comprende ademas la etapa de formular dicha protema recombinante en una composicion farmaceutica.
14. 14. Uso de la lmea de celulas CHO segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o de la combinacion segun la reivindicacion 10, para producir una protema recombinante in vitro.

    Promotor

    procariota

    Amp

    imagen1

    Origen procariota de replicacion

    Promotor de SV40

    Origen procariota de replicacion

    N

    Secuencia que codifica una GS

    Serial de poli A

    Secuencia que codifica la cadena pesada de 13C3

    imagen2

    Promotor de CMV

    Intron

    Intron

    Secuencia que codifica la cadena ligera de 13C3 Promoter de CMV Serial de poli A

    Fiqura 1

    co

    CD

    -o c

    o o « V

    n

    z in

    Numero de pocillos ocupados

    imagen3

    ■

    pBH3695 GS humana

    pBH3700 GS de perro

    ■

    pBH3694 GS de levadura

    ■

    pBH3697 GS de Drosophila

    ■

    pBH3698 GS de planta

    m

    pBH3699 GS de sapo

    m

    pBH3623 GS de CHO

    72

    I

    44 1

    26

    10 J-° 0 0 ^__________

    fc 0 o o o

    5-50

    Productividad de 13C3 (mg/l)

    Fiqura 2

    o

    £

    05

    co

    O

    co

    <u

    ■o

    ■D

    ns

    ■a

    u

    3

    ~o

    o
15. 35.0
16. 
    30.0 -
17. 
    25.0 -
18. 
    20.0 -
19. 
    15.0 -
20. 
    10.0 -

    5,0 -

    0,0

    pBH3700 pBH3695 /(GS humana)

    pBH3623 (GS de CHO)\

    /

    V

    Transfectantes estables en placas de 96 pocillos

    Fiqura 3

    (A

    <D

    C

    o

    o

    E

    <u

    (A

    <U

    73

    imagen4

    E

    35

    30

    25

    20

    15

    10

    5

    ■

    pBH3695 GS humana

    pBH3700 GS de perro

    ■

    pBH3694 GS de levadura

    m

    pBH3697 GS de Drosophila

    M

    pBH3698 GS de planta

    bb

    pBH3699 GS de sapo

    10

    0 0 0 0 0

    0 0 0 0 0

    0 0 0 0 0

    <1

    1-5

    > 5

    Productividad de 13C3 (mg/l)

    Figure 4

    SEQ ID NO:1 Human SEQ ID NO:2 Dog SEQ ID NO:3 CHO

    SEQ ID NO:1 Human SEQ ID NO:2 Dog SEQ ID NO:3 CHO

    SEQ ID NO:l Humana SEQ ID NO:2 Perro SEQ ID NO:3 CHO

    -tv

    N>

    SEQ ID NO:l Humana SEQ ID NO:2 Perro SEQ ID NO:3 CHO

    SEQ ID NO:1 Humana SEQ ID NO:2 Perro SEQ ID NO:3 CHO

    SEQ ID NO:l Humana SEQ ID NO:2 Perro SEQ ID NO:3 CHO

    SEQ ID NO:l Humana SEQ ID NO:2 Perro SEQ ID NO:3 CHO

    T T TT T T

    MTTSASSHLNKGIKQVYMSLPQGEKVQAMYIWIDGTGEGLRCKTRTLDSEPKCVEELPEW MATSASSHLNKGIKQVYMSLPQGEKVQAMYIWIDGTGEGLRCKTRTLDSEPKGVEELPEW MATSASSHLNKNIKQMYLCLPQGEKVQAMYIWVDGTGEGLRCKTRTLDCEPKCVEELPEW

    k-kkkkkkkkk k k k • k • kkkkkkkkkkkkk-kkkkkkkkkkkkkkk k k k k k k k k k k

    ▼ ▼ ▼ .. y

    NFDGSSTLQSEGSNSDMYLVPAAMFRDPFRKDPNKLVLCEVFKYNRRPAETNLRHTCKRI

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    NFDGSSTFQSEGSNSDMYLSPVAMFRDPFRRDPNKLVFCEVFKYNRKPAETNLRHSCKRI

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