ES2628191T3 - Método para producir proteínas - Google Patents

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Abstract

Una célula huésped recombinante, en donde la célula se modifica para comprender una secuencia polinucleotídica exógena que codifica Ero1 que comprende la secuencia polipeptídica dada en la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que sustancialmente retiene la función de Ero1; y una secuencia polinucleotídica exógena que codifica XBP1 que comprende la secuencia polipeptídica dada en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que sustancialmente retiene la función de XBP1 y dicha célula huésped modificada tiene niveles de expresión aumentados de Ero1 y XBP1 con respecto a los niveles de expresión de Ero1 y XBP1 en una célula no modificada.

Description

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La secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés puede estar en el mismo vector que XBP1 y Ero1. Alternativamente o adicionalmente, la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés puede estar en el mismo vector que la secuencia polinucleotídica de Ero1. Alternativamente o adicionalmente, la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés puede estar en el mismo vector que la secuencia polinucleotídica de XBP1. Alternativamente o adicionalmente, la célula puede comprender además un vector separado que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés.
El vector para uso en la presente invención puede producirse insertando un casete de expresión como se ha definido anteriormente en un vector adecuado. Alternativamente, las secuencias de expresión reguladoras para dirigir la expresión de cada secuencia polinucleotídica que codifica una proteína, pueden estar contenidas en el vector y por lo tanto solamente se requerirá la región de codificación de uno o más polinucleótidos para completar el vector.
Los promotores empleados en la presente invención pueden estar ligados al polinucleótido relevante directamente o situados alternativamente en una posición apropiada, por ejemplo en un vector de tal manera que cuando el polipéptido relevante se inserta, el promotor relevante puede actuar sobre el mismo. Se puede emplear un promotor para todas las secuencias codificadas, pero generalmente se obtienen mayores niveles de expresión cuando cada polipéptido codificado tiene un promotor específico.
Por lo tanto, en una realización se emplean uno, dos, tres o más promotores.
En una realización, se localizan uno o más promotores en el polinucleótido empleado en la invención.
En una realización, el promotor se localiza antes del fragmento de codificación del polinucleótido en el que actúa, por ejemplo un promotor relevante antes de cada fragmento de codificación del polinucleótido. "Antes", como se usa en la presente memoria, pretende implicar que el promotor está situado en el extremo 5 prima con respecto al fragmento polinucleotídico que codifica.
Los promotores empleados en la presente invención pueden ser iguales o diferentes para cada polinucleótido. Los promotores pueden ser endógenos o exógenos a las células huésped. Los promotores adecuados incluyen CMV tal como hCMV (por ejemplo, adecuado como promotor cuando el polipéptido es un anticuerpo), promotores LTR víricos y el promotor SV40.
Uno o más de los promotores empleados pueden ser promotores inducibles.
En una realización, el polinucleótido empleado en la presente invención comprende una secuencia señal de poliadenilación, por ejemplo, asociada con cada secuencia polinucleotídica que codifica una proteína seleccionada de Ero1, XBP1 y de la proteína de interés según sea conveniente, tal como al final (por ejemplo en el extremo Cterminal (3 prima)) de cada polinucleótido codificador. Los vectores de expresión, en particular, pueden requerir secuencias señal que codifiquen una cola de poliadenilación. La secuencia señal de poliadenilación provoca que se añada una cola de poliadenilación al final del pre-ARNm transcrito, la cual puede proteger al ARNm de las exonucleasas, estabilizando así al ARNm y pudiendo terminar la transcripción.
Ejemplos de colas de poliadenilación incluyen SV40poli A, BgH poliA y cola de poliA sintética, en particular SV40 poli
A.
En una realización, el polinucleótido empleado en la presente invención comprende uno o más intrones. En una realización, la secuencia polinucleotídica comprende un intrón antes del codón de iniciación, es decir, en el extremo 5 prima. En una realización, la secuencia polinucleotídica comprende un intrón después del codón de parada, es decir, en el extremo 3 prima. En una realización, la secuencia polinucleotídica comprende 1, 2 o 3 intrones. En una realización, la secuencia polinucleotídica comprende un intrón antes del codón de iniciación y después del codón de parada. El intrón puede derivarse de cualquier gen, particularmente de un gen del que deriva la secuencia codificada.
En una o más realizaciones, el polinucleótido empleado en la presente invención comprende una secuencia Kozak asociada con cada secuencia polinucleotídica que codifica una proteína seleccionada entre Ero1, XBP1 y la proteína de interés según sea conveniente. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que la secuencia de Kozak es un sitio de unión al ribosoma óptimo.
Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria descriptiva con referencia al polinucleótido se aplican igualmente a las realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo a los vectores, casetes de expresión y/o células huésped que comprenden los componentes utilizados en la misma, en tanto que el aspecto relevante se pueda aplicar a los mismos.
La presente invención también proporciona un método que comprende modificar una célula para aumentar la capacidad de la célula de aumentar los niveles de expresión de Ero1 y XBP1 en relación con los niveles de expresión de Ero1 y XBP1 en una célula no modificada en el que el método comprende transfectar la célula con uno
o mas polinucleótidos, como se define en el presente documento.
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Tabla 1:
mAb
Especie Isotipo Coeficiente de Extinción
146
Ratón IgG1
632
Ratón IgG2a
497
Humano IgG4
240
Humano IgG4
42
Ratón IgG1 1,6
61
Ratón IgG1 1,62
164
Ratón IgG1 1,6
Los niveles de expresión de los anticuerpos se determinaron mediante ELISA a menos que se indique lo contrario.
Se midió la densidad celular y la viabilidad celular utilizando el sistema de recuento de células automatizado CEDEX (Innovatis) basado en el método de exclusión Blue Trypan muy establecido para determinar la viabilidad celular. La manipulación de las muestras, la tinción, el recuento de células y el análisis gráfico de los resultados se realizan automáticamente mediante el sistema CEDEX.
Ejemplo 1 Transfección de células CHO con Ero1α y/o XBP1
Línea celular CHOSX
La forma empalmada de XBP1 humana [hXBP1(s)] se clonó en el vector pcDNA3.1(+), este vector también contenía el sistema de selección G418 que comprendía el gen de resistencia a la neomicina, que generó el vector pcDNA3.hXBP1(s). Las células CHOS se transfectaron con el vector pcDNA3.hXBP1(s) y se seleccionaron líneas celulares estables en presencia de geneticina (1 mg/ml) para producir una línea celular CHOSX que expresaba hXBP1(s).
Línea celular CHOK1E
Ero1α humana (hEro1α) se clonó en el vector pcDNA3.1(+) y las células CHOK1 se transfectaron con pcDNA3. HEro1α para producir una línea celular CHOK1E que expresa Ero1α humano. Las células CHOK1E se seleccionaron usando el sistema de selección G418.
Línea celular CHOSXE
Se clonó Ero1α humano (hEro1α) en el vector pcDNA3.1(+)(zeo) (Invitrogen) y la línea celular CHOSX se supertransfectó posteriormente con el vector pCDNA3(zeo).hEro1α para producir la línea celular CHOSXE que expresaba tanto hEro1α como hXBP1(s). Se uso tanto el sistema de selección G418 (gen de resistencia a la neomicina) como el sistema de selección de zeocina (gen de resistencia a la zeocina) para seleccionar células CHOSXE transfectadas con éxito. Las células se cultivaron en 100-300 μg/ml de zeocina y 1 mg/ml de geneticina.
Selección de clones de CHOSXE
Seleccion 1:
Dos semanas después de la transfección se realizó una primera selección de 177 clones de los cuales 85 clones eran positivos para la expresión de ARNm de los transgenes hEro1α y hXBP1(s) según se evaluó mediante RT-PCR y PCR en célula única.
Posteriormente se rellenaron placas de 6 pocillos con 24 de los 85 clones positivos. Se determinaron los niveles relativos de ARMm de hXBP1(s) y de hEro1α por Taqman. Los resultados de este análisis se muestran en las Figuras 3a y 3b donde los niveles relativos de ARNm de hXBP1(s) y de hEro1α en los clones CHOSXE se comparan con las células CHOS (las células CHOS no mostraron expresión pero se contaron como 1 para calcular las cantidades relativas de ARMm ). Utilizando los resultados mostrados en las Figuras 3a y 3b, se seleccionaron 3 clones (70, 77 y 103) que expresan hEro1α bajo, 3 clones (76, 88 y 173) que expresan hEro1α medio y 3 clones (86, 94 y 101) que expresan hEro1α alto para su análisis posterior.
Seleccion 2:
Otras dos semanas después de haberse realizado la selección 1 se seleccionaron 72 clones más, de los cuales 29
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tres anticuerpos utilizados se etiquetaron como mAbs 42, 61 y 164. Los recuentos celulares y las viabilidades celulares se midieron los días 1, 4, 7 y 10. Se tomaron muestras del sobrenadante del cultivo los días 4, 7 y 10 para determinar la productividad específica de las células.
Tabla 2:% de viabilidad celular y densidad de células viables (VCD) en el día 1 después de la transfección.
Anticuerpo
Línea Celular VDC células x105/ml (día 1) % viabilidad (día 1)
42
CHOS 42 22,7 96,7
42
CHOSX 42 23,85 96,8
42
CHOSXE 42 23,05 97,1
61
CHOS 61 23,4 96,8
61
CHOSX 61 20,14 96,9
61
CHOSXE 61 23,54 97,8
164
CHOS 164 20,92 97,5
164
CHOSX 164 22,04 96,5
164
CHOSXE 164 23,73 97,5
Se puede ver en la Tabla 2 que las líneas celulares CHOXE tenían igual o mayor viabilidad comparada con CHOS y CHOSX y que CHOSXE tenía densidades de células viables comparables en relación con CHOS y CHOSX.
La Figura 8 muestra el incremento relativo en la expresión de los mAb 42, 61 y 164 de CHOSXE y CHOSX en comparación con la expresión de los mAbs 42, 61 y 164 de las células CHOS. Está claro que la expresión de los tres anticuerpos fue mayor en CHOSXE en comparación bien con CHOSX o con CHOS.
También se calculó la tasa de productividad específica (SPR) de cada línea celular. La Figura 9 muestra la SPR de las líneas celulares CHOS, CHOSX y CHOSXE en μg/1x106 células/día entre el día 4 y el día 7. La tasa de productividad específica por célula fue claramente superior en CHOSXE en comparación con ambas líneas celulares CHOS o CHOSX.
Los niveles relativos de ARMm de las cadenas pesadas y ligeras kappa de los mAb 42, 61 y 164 también se midieron mediante PCR en tiempo real (Taqman). Los resultados se muestran en la Figura 10, se puede ver que CHOSXE produjo mayores niveles de ARMm de la cadena pesada y ligera en comparación con CHOS y CHOSX.
Ejemplo 6: Electroporación de anticuerpos en las líneas celulares CHOSXE, CHOSX, CHOS y CHOK1 y posterior purificación
Las células CHOS, CHOSX, CHOSXE y CHOK1 se transfectaron como se ha descrito en el ejemplo 5.
La cuantificación de MAb se realizó mediante cromatografía de afinidad líquida de alto rendimiento (HPLC) utilizando Proteína G como ligando. Se generó una curva estándar inyectando cantidades conocidas de IgG purificada y analizando los picos de elución. El eluato de mAb se monitorizó a 280 nm y se extrapoló a partir de la curva estándar para calcular las concentraciones de mAbs usando sus respectivos coeficientes de extinción (concentración= absorbancia/coeficiente de extinción) (Tabla 1)
Los mAbs se purificaron usando columnas MabSelect Sure. El ligando MabSelect Sure derivado de la proteína-A, deriva de E. coli y ha sido diseñado para crear un medio de afinidad con estabilidad alcalina mejorada y alta capacidad de unión para IgG. En este punto se realizó una HPLC de traza para determinar el porcentaje de agregado de las fracciones agrupadas purificadas por afinidad. El grado de agregación exhibido por los mAbs expresados en CHOSXE fue comparable al de CHOS, CHOSX y CHOKI (véase la figura 11). Después de MabSelect Sure, los anticuerpos se purificaron adicionalmente usando HPLC de exclusión por tamaño. Se determinó también el rendimiento del mAb total post-purificación leyendo la absorbancia del mAb a 280 nm y calculando la concentración como anteriormente.
La Tabla 3 muestra los incrementos de la concentración del anticuerpo en relación con las células CHOS después de HPLC de prot G y purificación de proteínas.
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Tabla 3:
Incremento de plegamiento
HPLC Prot G
Producción después de purificación
Ab42
CHOS 1,00 1,00
CHOSX
1,09 0,83
CHOSXE
6,28 7,22
CHOK1
1,65 2,70
Ab61
CHOS 1,00 1,00
CHOSX
2,39 3,30
CHOSXE
5,36 5,24
CHOK1
1,58 2,35
Ab164
CHOS 1,00 1,00
CHOSX
2,68 2,44
CHOSXE
5,94 6,14
CHOK1
1,94 2,80
Puede verse en la Tabla 3 que las células CHOSXE produjeron una cantidad significativamente mayor de anticuerpos en comparación con las células CHOS, CHOSX y CHOK1.
Ejemplo 7: Análisis de calidad de los anticuerpos
Los mAbs purificados de las células CHOSXE se analizaron en cuanto a calidad y actividad como se describe a continuación.
Electroforesis en gel de polialquilamida con dodecilsulfato sódico (SDS PAGE)
Los MAbs 42, 61 y 164 se analizaron mediante SDS PAGE para determinar si el anticuerpo expresado era del tamaño esperado. El análisis de SDS PAGE se llevo a cabo mediante la aplicación de 5 μg de proteína reducida y no reducida en un gel de gradiente Bis-Tris 4-12% pre-envasado (Invitrogen) 50mA durante 45 minutos. Las Figuras 12a, b y c muestran los resultados de la SDS PAGE, puede observarse que los anticuerpos expresados a partir de CHOS, CHOSX, CHOSXE o CHOK1 eran del mismo tamaño.
Ensayo de Thermofluor
Se analizó la termoestabilidad de los MAbs 42, 61 y 164 en un ensayo de Thermofluor. Este ensayo permite determinar a qué temperatura se despliega la estructura de la proteína. Se utilizó un colorante fluorescente sensible al medio ambiente para monitorizar el proceso de despliegue térmico de las proteínas. El colorante se une a las regiones hidrofóbas que se exponen al desplegarse y cambian su espectro de emisión. Se colocaron en un pocillo de una placa de PCR de 384 pocillos ópticos 1 μl de muestra a 1 mg/ml, 1 μl de colorante 30x y 8 μl de tampón (las muestras se realizaron en cuadruplicado). El sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT contiene un dispositivo de calentamiento para el control preciso de la temperatura fijado de 20º C a 99º C, un dispositivo CCD controla simultáneamente los cambios de fluorescencia en los pocillos. Las desviaciones estándar fueron inferiores a 0,5º C, en los datos del ensayo de Thermofluor presentados. Los resultados del ensayo de Thermofluor se muestran en la Figura 13 donde se puede ver que no había diferencias significativas en las propiedades de estabilidad térmica de los mAbs que se expresan a partir de CHOS o de CHOSXE.
Enfoque iso-eléctrico
Se analizaron los MAb 42, 61 y 164 por enfoque isoeléctrico para determinar si los anticuerpos expresados tenían la misma carga neta. Se aplicó un alto voltaje a través del capilar usando ánodos y cátodos, que fueron sumergidos en pequeños depósitos que contenían catolito (OH) y anolito (H). Las muestras se prepararon con anfólitos transportadores y con la aplicación de alto voltaje las moléculas de proteína migraron y se enfocaron de acuerdo con sus respectivos pI. El sistema utilizado fue el iCE 280 de Convergent biosciences (Isogen en Europa), que es un instrumento de isoelectroforesis capilar capturada para determinar los pI de varias muestras de proteínas y sus
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