ES2628351T3 - Método para recubrir nanopartículas - Google Patents

Abstract

Método para recubrir nanopartículas coloidales con una única capa de un agente de unión, en el que el método comprende las etapas de: - determinar mediante la valoración de la concentración, antes del recubrimiento de dichas nanopartículas, la cantidad mínima de agentes de unión requerida para obtener una suspensión coloidal estable de nanopartículas recubiertas con una única capa de agentes de unión, en el que dicha determinación de la cantidad mínima de agentes de unión se realiza en presencia de un detergente no iónico, catiónico y/o zwitteriónico; y - mezclar una disolución que comprende las nanopartículas con una disolución que comprende dichos agentes de unión, en el que dicha disolución que comprende las nanopartículas y/o dicha disolución que comprende el agente de unión comprenden un detergente no iónico, catiónico y/o zwitteriónico en el que la concentración de dicho detergente no iónico, catiónico y/o zwitteriónico oscila entre el 0,0001 y el 1% volumen/volumen.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para recubrir nanopartmulas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para recubrir nanopartmulas con una pareja de union, mediante lo cual se requiere una cantidad reducida de pareja de union. En realizaciones espedficas, la invencion proporciona metodos para recubrir nanopartmulas con una unica capa de una pareja de union tal como una protema. En particular, la invencion se refiere a un metodo para recubrir nanopartmulas con una unica capa de protema, en el que solo se requieren bajas cantidades de protema.

Antecedentes de la invencion

Las nanopartmulas se usan ampliamente hoy en dfa en muchas aplicaciones en las ciencias medicas y biomedicas tales como para administracion de farmacos, para terapia y para diagnostico. Para muchas de estas aplicaciones, se recubren nanopartmulas con protemas. Las nanopartmulas recubiertas con protemas tales como anticuerpos contra celulas cancerosas pueden usarse, por ejemplo, para localizar celulas cancerosas en el cuerpo. De manera similar, para la deteccion de analitos in vitro, se unen sondas tales como anticuerpos a nanopartmulas, mediante lo cual se detecta la union del analito al anticuerpo en la nanopartmula.

Mas en particular, pueden usarse nanopartmulas de metal recubiertas con protemas para transducir acontecimientos de union mediante cambios en su absorcion al menos en el espectro de luz visible. Este fenomeno de resonancia de plasmones de superficie localizados (RPSL) permite el examen de interacciones de biomoleculas. Por tanto, pueden usarse nanopartmulas de metal recubiertas con protemas en la deteccion de interacciones anticuerpo-ligando, interacciones receptor-ligando, union enzima-ligando y cinetica de asociacion-disociacion anticuerpo-antigeno.

Se han descrito en la tecnica nanopartmulas recubiertas con parejas de union tales como protemas, asf como metodos para recubrir nanopartmulas. Por ejemplo, el documento US 2010/0029902 describe un metodo para recubrir nanopartmulas que comprende mezclar las nanopartmulas y uno o mas tipos de protema con una disolucion dispersada, en el que las protemas se adsorben en superficies completas de las nanopartmulas con el fin de controlar e impedir la agregacion de las nanopartmulas. El documento WO0189820 da a conocer composiciones y metodos para recubrir un sustrato, que proporcionan un buen contacto de adhesion entre un sustrato y una capa de recubrimiento dura, en los que el sustrato recubierto incluye un sustrato, una primera capa que comprende partmulas de relleno inorganicas dispersas en al menos un silano hidrolizable, y una segunda capa que comprende al menos un agente de compatibilizacion. El documento WO0188540 da a conocer nanopartmulas recubiertas con sflice y un procedimiento para producir tales nanopartmulas recubiertas con sflice. Tambien se dan a conocer metodos para funcionalizar nanopartmulas recubiertas con sflice. El documento WO2010002479 da a conocer nanosensores o transductores magneticos que permiten la medicion de un parametro ffsico en un analito mediante mediciones de resonancia magnetica, en particular de ensayos sin aglomeracion. Mas particularmente, el documento WO2010002479 da a conocer disenos de reactivos de nanopartmula y nanopartmulas magneticas recubiertas con polfmero sensible. El documento WO2010007857 da a conocer un metodo para mantener la reactividad de micropartmulas que tienen una sustancia reactiva unida a las mismas en una dispersion de las micropartmulas durante un largo periodo mediante la estabilizacion de las micropartmulas en la dispersion de las micropartmulas. Espedficamente se da a conocer un metodo para estabilizar micropartmulas que tienen una sustancia reactiva unida a las mismas, que implica una etapa de permitir que coexista un aminoacido que contiene azufre o un derivado del mismo en una dispersion de las micropartmulas. El metodo del documento WO2010007857 es particularmente adecuado cuando se pretende que coexista una sustancia de inhibicion de la precipitacion tal como un polianion o dextrano en la dispersion. El documento WO2010052665 da a conocer una nanopartmula de oro recubierta con desde dos hasta cinco capas de una combinacion de un polielectrolito que tiene funcionalidad amino y un polielectrolito que tiene funcionalidad de tipo sulfonico, o con una unica capa de dicho polielectrolito que tiene funcionalidad amino, en la que dicha nanopartmula comprende una capa exterior de albumina. El documento W02010006201 da a conocer un metodo de reduccion de las interacciones no espedficas de especies interferentes presentes en una muestra en ensayos basados en nanopartmulas metalicas, aumentando de ese modo la sensibilidad de estos ensayos. En particular, los metodos del documento W02010006201 conllevan neutralizar la reactividad qrnmica de grupos funcionales presentes en especies interferentes mediante la adicion de un agente de neutralizacion, tal como un agente de alquilacion o ion de metal pesado.

Una desventaja de los metodos de la tecnica anterior es el requisito de altas cantidades de la pareja de union para recubrir por completo las nanopartfculas. A menudo, solo se dispone de bajas cantidades de la pareja de union de interes.

Ademas, como algunos de estos metodos de la tecnica anterior dan como resultado nanopartfculas recubiertas con multiples capas de la pareja de union, la interaccion de la protema unida con otro compuesto se produce a una distancia aumentada desde la superficie de la nanopartfcula, lo que afecta a la intensidad de la senal en metodos de deteccion.

Sigue habiendo la necesidad en la tecnica de proporcionar metodos para recubrir nanopartfculas con parejas de

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union tales como protemas en los que solo se requieran bajas cantidades de la pareja de union y, para realizaciones particulares, en los que puede lograrse el recubrimiento con una unica capa de la pareja de union.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores han hallado un metodo para recubrir nanopartmulas que implica el uso de una cantidad limitada de pareja de union. Ademas, los inventores han hallado metodos que permite, cuando resulta de interes, el recubrimiento con una unica capa de la pareja de union. Por tanto, los metodos de la superan uno o mas de los problemas mencionados anteriormente de la tecnica anterior.

En un primer aspecto, la invencion se refiere a metodos para recubrir nanopartmulas coloidales con una pareja de union, en los que los metodos comprenden concentrar la pareja de union sobre la superficie de la nanopartmula. En realizaciones particulares, el metodo implica garantizar una concentracion del agente de union cerca de la nanopartmula. En realizaciones particulares de la invencion, los metodos implican garantizar una interaccion electrostatica entre la nanopartmula y el agente de union.

La invencion se refiere a metodos para recubrir nanopartmulas con una pareja de union, en los que los metodos comprenden poner en contacto dichas nanopartmulas con un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de o tras poner en contacto las nanopartmulas con una disolucion de dicha pareja de union.

Los inventores han hallado que los metodos descritos en el presente documento permiten el recubrimiento de nanopartmulas con una cantidad limitada de la pareja de union y permiten obtener nanopartmulas estables en forma coloidal. Ademas, en realizaciones particulares los metodos pueden usarse para obtener una unica capa de un agente de union, tal como una protema usando bajas cantidades del agente de union. Por tanto, estos metodos son ventajosos porque a menudo por ejemplo solo se dispone de pequenas cantidades de la protema de interes. Ademas, en realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion permiten controlar el grosor de capa de protema sobre las nanopartmulas. Por ejemplo, los metodos permiten la produccion de nanopartmulas estables recubiertas con solo una capa de protema sobre la superficie de la nanopartmula. Esto es de particular interes, por ejemplo cuando se pretende un recubrimiento adicional de las nanopartmulas con otra molecula, ya que se reduce la distancia de esta molecula a la superficie de la nanopartmula. Ademas, si va a estudiarse la interaccion entre la protema recubierta y otro compuesto, se reduce la distancia de esta interaccion a la superficie de la nanopartmula, mejorando de ese modo la deteccion optica de la interaccion.

Ademas, en realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion son ventajosos cuando se requiere un recubrimiento a altos valores de pH. En ausencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, el ajuste a altos valores de pH podna conducir a aglutinacion de las nanopartmulas. Realizaciones particulares de los metodos descritos anteriormente tambien pueden ser ventajosas cuando es necesario tamponar la disolucion del agente de union. En ausencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, incluso pequenas concentraciones de sal en la disolucion podnan conducir a aglutinacion de las nanopartmulas, mas particularmente cuando el agente de union es una protema. Si las nanopartmulas se ponen en contacto con un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de (y opcionalmente durante) el recubrimiento, no se produce aglutinacion, ni siquiera en presencia de concentraciones de sal moderadas. Aun otra ventaja de realizaciones particulares de los metodos de la presente invencion es que puede garantizarse un recubrimiento homogeneo, incluso cuando la protema es una protema o un peptido pequeno en baja cantidad. Ademas, realizaciones particulares del metodo descrito anteriormente tambien pueden ser ventajosas cuando el agente de union es una protema que se agrega antes del recubrimiento. La incubacion de la protema con un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes del recubrimiento ayudara a estabilizar la protema en forma no agregada, mejorando de ese modo el resultado de recubrimiento.

La presente invencion se refiere a metodos que comprenden la etapa de mezclar una disolucion que comprende las nanopartmulas con una disolucion que comprende el agente de union, en los que dicha disolucion que comprende las nanopartmulas y/o dicha disolucion que comprende el agente de union comprenden dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, en los que la concentracion de dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico oscila entre el 0,0001 y el 1% volumen/volumen. Los metodos de la presente invencion comprenden ademas poner en contacto entre sf la disolucion que comprende las nanopartmulas con la disolucion que comprende el agente de union de modo que se garantice una interaccion entre dicho agente de union y dicha nanopartmula. En realizaciones particulares adicionales, los metodos segun la invencion comprenden ademas una etapa de garantizar la union de dicha nanopartmula con dichos agentes de union.

En realizaciones particulares, la etapa de poner en contacto la disolucion que comprende la nanopartmula con la disolucion que comprende el agente de union garantiza la union de dicha nanopartmula con dicho agente de union. En realizaciones particulares, el agente de union es una protema y dicho metodo implica poner en contacto dicha nanopartmula con dicha protema en presencia de una disolucion que comprende las nanopartmulas y/o dicha disolucion que comprende las protemas comprenden dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, permitiendo de ese modo que la protema forme una unica capa sobre la superficie de dichas nanopartmulas.

La presente invencion proporciona metodos que comprenden ademas, antes del recubrimiento de dichas

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nanopartmulas, la etapa de determinar la cantidad mmima de protema requerida para obtener nanopartmulas estables en forma coloidal, recubiertas con una unica capa de agentes de union, mediante la valoracion de la concentracion, en los que dicha determinacion de la cantidad minima de agentes de union se realiza en presencia de dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere a metodos tal como se describieron anteriormente, en los que dicho detergente no ionico se selecciona del grupo que comprende polisorbatos, etoxilatos de octilfenol, glucaminas, Lubrol, Brij®, Nonidet®, Pluronic®, Genapol® e Igepal®.

En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona metodos tal como se describieron anteriormente, en los que dicho detergente cationico se selecciona de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) o bromuro de trimetil(tetradecil)amonio (TTAB).

En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere a metodos tal como se describieron anteriormente, en los que dicho detergente zwitterionico se selecciona del grupo que comprende amidosulfobetamas, alquilbetamas y propanosulfonatos de amonio.

En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere a metodos tal como se describieron anteriormente, en los que la cantidad de protema usada en el recubrimiento es mayor que la cantidad minima de protema requerida para obtener nanopartmulas estables.

En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona metodos tal como se describieron anteriormente, en los que dichas nanopartmulas comprenden un coloide de polfmero conductor, un coloide de metal noble, un coloide de material compuesto de polfmero conductor, sflice o latex.

En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere a metodos tal como se describieron anteriormente, en los que dichas nanopartmulas comprenden un metal de transicion seleccionado del grupo que comprende Au, Ag, Cu, Ta, Pt, Pd y Rh y preferiblemente en los que dicho metal de transicion es oro, plata o cobre.

En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere a composiciones de nanopartmulas que comprenden nanopartmulas que pueden obtenerse mediante uno o mas de los metodos tal como se describieron anteriormente. En realizaciones particulares, la presente invencion se refiere al uso de kits para recubrir nanopartmulas con una unica capa de un agente de union para obtener nanopartmulas estables en forma coloidal, en el que dichos kits comprenden nanopartmulas e instrucciones para recubrir dichas nanopartmulas con cualquiera de los metodos tal como se describieron anteriormente.

En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona kits tal como se describieron anteriormente, que comprenden ademas un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico o una disolucion que comprende un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona metodos para la deteccion por resonancia de plasmones de superficie localizados de la interaccion de un compuesto con una protema unido a una nanopartmula, metodo que comprende recubrir dicha nanopartmula con un agente de union tal como, pero sin limitarse a, una protema con cualquiera de los metodos tal como se describieron anteriormente.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se describira a continuacion, entre otras cosas, con referencia a las figuras adjuntas, que se proporcionan a modo de ejemplo unicamente y no debe considerarse que limitan el alcance de la presente invencion.

Las figuras 1 y 2 demuestran el efecto del detergente no ionico Tween 20 sobre la cantidad de protema G requerida para estabilizar nanopartmulas de oro (GNP, gold nanoparticles), segun una realizacion particular de la invencion.

La figura 1 demuestra los resultados de la valoracion de la concentracion de protema G en ausencia de Tween 20. La flecha indica la menor cantidad de protema G que estabiliza la GNP. La figura 1A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 1B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 1C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP.

La figura 2 demuestra los resultados de la valoracion de la concentracion de protema G en presencia de Tween 20. La flecha indica la menor cantidad de protema G que estabiliza la GNP. La figura 2A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 2B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 2C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 2D representa un grafico del diametro hidrodinamico de la GNP frente a la cantidad de protema G por ml de GNP.

Las figuras 3 y 4 demuestran el efecto de Tween 20 sobre la cantidad de estreptavidina requerida para estabilizar

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nanopartmulas de oro (GNP), segun una realizacion particular de la invencion.

La figura 3 demuestra los resultados de la valoracion de la concentracion de estreptavidina en ausencia de Tween 20. La flecha indica la menor cantidad de estreptavidina que estabiliza la GNP. La figura 3A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP. La figura 3B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP. La figura 3C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP.

La figura 4 muestra los resultados de la valoracion de la concentracion de estreptavidina en presencia de Tween 20. La flecha indica la menor cantidad de estreptavidina que estabiliza la GNP en presencia de Tween 20. La figura 4A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP. La figura 4B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP. La figura 4C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP. La figura 4D representa un grafico del diametro hidrodinamico de la GNP frente a la cantidad de estreptavidina por ml de GNP.

La figura 5 muestra los resultados de la valoracion con protema G de la concentracion de GNP recubiertas con Tween 20, segun una realizacion particular de la invencion. La flecha indica la menor cantidad de protema G que estabiliza GNP recubiertas con Tween 20. La figura 5A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 5B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP. La figura 5C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de protema G por ml de GNP.

La figura 6 muestra los resultados de la valoracion con protema A de la concentracion de GNP recubiertas con Tween 20, segun una realizacion particular de la invencion. La flecha indica la menor cantidad de protema A que estabiliza GNP recubiertas con Tween 20. La figura 6A representa un grafico de Xmax frente a la cantidad de protema A por ml de GNP. La figura 6B representa un grafico de DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema A por ml de GNP. La figura 6C representa un grafico de DO(Xmax) frente a la cantidad de protema A por ml de GNP.

Descripcion detallada de la invencion

En los siguientes parrafos, se describen diferentes aspectos de la invencion con mas detalle. Cada aspecto asf descrito puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier caractenstica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra caractenstica o caractensticas indicadas como preferidas o ventajosas.

En el contexto de la presente invencion, los terminos usados han de interpretarse segun las siguientes definiciones, a menos que el contexto dicte otra cosa.

Tal como se usa en el presente documento, las formas en singular “un(o)”, “una” y “el/la” incluyen referentes tanto en singular como en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Los terminos “que comprende”, “comprende” y “se compone de” tal como se usan en el presente documento son sinonimos de “que incluye”, “incluye” o “que contiene”, “contiene”, y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o etapas de metodo adicionales, no citados. Cuando se hace referencia a que las realizaciones “comprenden” caractensticas, elementos o etapas particulares, esto pretende incluir espedficamente realizaciones que consisten en las caractensticas, elementos o etapas enumerados.

La indicacion de intervalos numericos mediante sus extremos incluye todos los numeros y fracciones incluidos dentro de los intervalos respectivos, asf como los extremos citados.

El termino “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como un parametro, una cantidad, una duracion temporal, y similares, pretende englobar variaciones de +/-10% o menos, preferiblemente +/-5% o menos, mas preferiblemente +/-1% o menos, y todavfa mas preferiblemente +/- 0,1% o menos de y desde el valor especificado, en la medida en que tales variaciones sean apropiadas de realizar en la invencion dada a conocer. Se entiende que el valor al que se refiere el modificador “aproximadamente” se da a conocer a su vez tambien espedficamente, y de manera preferible.

La presente invencion se refiere a metodos para recubrir nanopartmulas con un agente de union en los que se requiere una cantidad reducida de agentes de union. Mas particularmente, la invencion proporciona metodos en los que se garantiza una interaccion entre la nanopartfcula y el agente de union antes de o durante la etapa de recubrimiento. En realizaciones particulares, la interaccion garantiza un recubrimiento eficaz de la nanopartfcula. En realizaciones adicionales, los metodos pueden implicar la union covalente del agente de union a la nanopartfcula despues de la concentracion del agente de union en la superficie de la nanopartfcula.

El termino agente de union tal como se usa en el presente documento se refiere a una molecula de interes que va a recubrirse sobre una nanopartroula y que puede garantizar a su vez la union a otra entidad. Normalmente, la pareja de union es un miembro de un par de union espedfico conocido o previsto tal como antfgeno-anticuerpo, receptor- ligando, enzima-ligando, azucar-lectina, receptor-agente de union a receptor, protema-oligonucleotido, etc. En realizaciones particulares, la pareja de union es una protema o un peptido. En realizaciones particulares adicionales,

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la pareja de union contiene al menos 5 aminoacidos, mas particularmente al menos 10 aminoacidos, al menos 20, al menos 50 o mas.

En un aspecto, la invencion proporciona metodos para recubrir nanopartmulas, en los que solo se requieren bajas cantidades de protema, y a nanopartmulas de una unica capa obtenidas mediante estos metodos.

Segun este aspecto, la invencion se refiere a metodos para recubrir nanopartmulas con una protema, en los que los metodos comprenden poner en contacto dichas nanopartmulas con un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de o tras poner en contacto las nanopartmulas con una disolucion de dicha protema.

El termino “detergente no ionico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un detergente que no tiene ningun grupo ionico. En realizaciones de los metodos de la invencion, el detergente no ionico se selecciona del grupo que comprende polisorbatos, etoxilatos de octilfenol, glucaminas, Lubrol, Brij®, Nonidet®, Pluronic®, Genapol® e Igepal®. En realizaciones particulares, el polisorbato se elige del grupo que comprende polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80 y polisorbato 85. En realizaciones particulares, el etoxilato de octilfenol se selecciona del grupo que comprende TRITON® X-15, TRITON® X-35, TRITON® X-45, TRITON® X-100, TRITON® X-102, TRITON® X-114, TRITON X-165 (70%), TRITON® X-305 (70%), TRITON ® X- 405 (70%) y TRITON® X-705 (70%). En realizaciones particulares, la glucamina se selecciona del grupo que comprende de N-octanoil-N-metilglucamina (MEGA-8), N-nonanoil-N-metilglucamina (MEGA-9) y N-decanoil-N- metilglucamina (MEGA-10).

El termino “detergente cationico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un detergente con una carga ionica positiva. En realizaciones de los metodos de la invencion, el detergente cationico se selecciona de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) o bromuro de trimetil(tetradecil)amonio (TTAB).

El termino “detergente zwitterionico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un detergente que tiene grupos ionicos, pero sin carga neta. En realizaciones de los metodos de la invencion, el detergente zwitterionico se selecciona del grupo que comprende amidosulfobetamas, alquilbetamas y propanosulfonatos de amonio. En realizaciones preferidas, el detergente zwitterionico se selecciona del grupo que comprende amidosulfobetama-14, amidosulfobetama-16, 1-propanosulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio] (CHAPS), 2-hidroxi-1- propanosulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio] (CHAPSO), propanosulfonato de 3-(4-heptil)fenil-3- hidroxipropil)dimetilamonio (C7BzO), EMPIGEN® BB, sal interna de propanosulfonato de 3-(N,N-dimetiloctilamonio), sal interna de propanosulfonato de 3-(decildimetilamonio), sal interna de propanosulfonato de 3- (dodecildimetilamonio), sal interna de propanosulfonato de 3-(N,N-dimetilmiristilamonio), sal interna de propanosulfonato de 3-(N,N-dimetilpalmitilamonio), sal interna de propanosulfonato de 3-(N,N- dimetiloctadecilamonio).

El experto entendera que la referencia en el presente documento al uso de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico incluye el uso de combinaciones de diferentes detergentes no ionicos, cationicos y/o zwitterionicos.

En realizaciones particulares de los metodos de la invencion, el detergente es un detergente no ionico.

Los metodos de la presente invencion se caracterizan por que las nanopartmulas se ponen en contacto con el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de o durante el recubrimiento con la protema de interes. En efecto, se han usado detergentes no ionicos, cationicos y/o zwitterionicos en la tecnica anterior en tampones con la manipulacion de nanopartmulas recubiertas. Sin embargo, segun los metodos de la presente invencion, las nanopartmulas se ponen en contacto con un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de o durante el procedimiento de recubrimiento, tal como para mejorar el procedimiento de recubrimiento.

La concentracion de detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico usada no es cntica, pero normalmente oscila entre el 0,0001 y el 1% volumen/volumen. Particularmente, el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico puede usarse en una concentracion que oscila entre el 0,005 y el 0,5% volumen/volumen. Preferiblemente, el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico puede usarse en una concentracion que oscila entre el 0,001 y el 0,1% volumen/volumen. Mas preferiblemente, la concentracion del detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico puede ser del 0,001, el 0,002, el 0,005, el 0,01, el 0,02, el 0,03, el 0,04, el 0,05, el 0,06, el 0,07, el 0,08, el 0,09 o el 0,1% volumen/volumen, o un valor en el intervalo entre dos cualesquiera de los valores mencionados anteriormente.

En realizaciones particulares, el agente de union es una protema y la invencion proporciona metodos que permiten el recubrimiento de una nanopartmula con una unica capa de protema y las nanopartmulas estables en forma coloidal que pueden obtenerse mediante estos metodos. En particular, en estas realizaciones, la invencion proporciona metodos para recubrir nanopartmulas con una unica capa de protema. En estas realizaciones, los metodos comprenden la etapa de mezclar una disolucion que comprende nanopartmulas con una disolucion que comprende protemas, permitiendo de ese modo que las protemas formen una unica capa sobre la superficie de dichas nanopartmulas, en los que dicha disolucion que comprende nanopartmulas y/o dicha disolucion que comprende protemas comprenden dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

En los metodos de la presente invencion, se preve que las nanopartmulas puedan ponerse en contacto con el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de poner en contacto las nanopartmulas con la protema, o

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simultaneamente. Por consiguiente, en una realizacion, la invencion proporciona metodos en los que la disolucion que comprende la protema comprende el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. En realizaciones particulares, esto puede tener la ventaja de que se estabilizan las protemas. Despues de eso, las nanopartmulas se ponen en contacto con la disolucion o suspension que comprende las protemas y el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

En otras realizaciones, los metodos de la invencion comprenden preparar una disolucion que comprende las nanopartmulas y anadir un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico a la misma. En estas realizaciones, las nanopartmulas se ponen en contacto con el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico antes de ponerlas en contacto con la disolucion de protema. Los metodos comprenden entonces mezclar la disolucion que comprende las protemas con la disolucion que comprende las nanopartmulas y el detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

Se preven estas realizaciones de los metodos de la presente invencion para mejorar generalmente el recubrimiento de nanopartmulas con protemas. La naturaleza de la protema no es cntica para este aspecto de la invencion y, por tanto, puede tener cualquier tamano e incluye, pero no se limita a, anticuerpos o fragmentos de la misma, antigenos, enzimas o sustratos, receptores o ligandos, etc. El termino protemas incluye por tanto peptidos.

Los inventores han hallado que en este aspecto de la invencion, los metodos son de particular interes para el recubrimiento de nanopartmulas con protemas que son susceptibles de interacciones hidrofobas y/o protemas que se agregaran facilmente con baja fuerza ionica. Mas particularmente, los metodos de la presente invencion son ventajosos para el recubrimiento de protemas que son susceptibles de interacciones hidrofobas a concentraciones de sal menores de 10 mM o para el recubrimiento de protemas que no soportan una fuerza ionica tan baja y deben conjugarse a mayor fuerza ionica para mantener su actividad y/o conformacion. Normalmente, las protemas susceptibles de interacciones hidrofobas comprenden grupos apolares que repelen mutuamente el agua y otros grupos polares, dando como resultado una atraccion neta de los grupos apolares entre sf. Se sabe que las protemas que comprenden grupos alquilo hidrocarbonados en Ala, Val, Leu e Ile y/o anillos de benceno (aromaticos) en Phe y Tyr son a menudo susceptibles de interacciones hidrofobas. Ejemplos de tales protemas son protemas asociadas con la membrana celular y protemas implicadas en funciones de transporte. La invencion se ilustra en el presente documento con estreptavidina, protema G y protema A. Por consiguiente, en realizaciones particulares, las protemas tal como se usan en los metodos de la presente invencion son protemas susceptibles de interacciones hidrofobas a bajas concentraciones de sal. Por consiguiente, realizaciones particulares de los metodos para recubrir nanopartmulas con una protema comprenden una etapa de recubrimiento realizada en presencia de mayor concentracion de sal. Aunque el termino mayor concentraciones de sal depende normalmente de la protema de interes, esto implica normalmente concentraciones de sal mayores de 10 mM, mas particularmente mayores de 50 mM, lo mas particularmente mayores de 100mM. En realizaciones particulares adicionales, los metodos de la presente invencion implican el recubrimiento de protemas que tienen un pi de 9 o mas, preferiblemente de 10 o mas. El termino “pi” se refiere en este caso al punto isoelectrico de la protema, que es el pH al que la protema o su superficie no porta una carga electrica neta.

En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion comprenden la etapa de determinar la hidrofobicidad de la protema antes de mezclar la disolucion que comprende las nanopartmulas con la disolucion que comprende las protemas. La hidrofobicidad de una protema puede determinarse calculando un grafico de hidropaticidad en funcion de la secuencia de aminoacidos de la protema o mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba o cromatograffa de fase inversa.

En realizaciones alternativas, los metodos de la presente invencion incluyen la etapa de poner en contacto el agente de union con la nanopartmula en presencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, de modo que se garantice una concentracion del agente de union en la superficie de la nanopartmula y una etapa de garantizar la union del agente de union a la superficie de la nanopartmula. En realizaciones particulares adicionales, la etapa de garantizar la union del agente de union a la superficie de la nanopartmula se realiza mediante la activacion de grupos funcionales (por ejemplo, grupos carboxilo) en las nanopartmulas, haciendo de ese modo que sean reactivos frente a la pareja de union (por ejemplo, aminas). En realizaciones particulares, el ligando es una molecula que contiene amina tal como una protema o un peptido y la union a la nanopartmula se garantiza mediante la activacion de un grupo carboxilo en la nanopartmula.

Se preve que los metodos de la presente invencion son de particular interes cuando el agente de union es una protema. Esto se ilustrara a continuacion en el presente documento.

Se preve que realizaciones particulares de los metodos de la presente invencion son de interes cuando se requiere el recubrimiento de la protema a altos valores de pH. En ausencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, el ajuste a altos valores de pH podna conducir a aglutinacion de las nanopartmulas. Segun realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion comprenden recubrir la protema en detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico a alto pH, y ajustar el pH despues del recubrimiento.

Se preve ademas que realizaciones particulares de los metodos de la presente invencion son de particular interes cuando es necesario tamponar la disolucion de protema, pero es susceptible de aglutinacion incluso a bajas concentraciones de sal. Segun realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion comprenden poner

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en contacto las nanopartmulas con la disolucion de protema en presencia de concentraciones de sal moderadas y un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico.

Con el fin de garantizar un recubrimiento optimo en los metodos de la presente invencion puede ser de interes poner en contacto las nanopartmulas con cantidades espedficas de la protema de interes. Tal como se indico anteriormente, los metodos de la presente invencion son particularmente ventajosos porque permiten el recubrimiento con una cantidad minima de protema. No obstante, en realizaciones particulares se prove que ha de determinarse la cantidad de protema requerida para recubrir las superficies de las nanopartmulas.

Por consiguiente, en realizaciones particulares, la invencion proporciona metodos para recubrir nanopartmulas, en los que el metodo comprende ademas, antes del recubrimiento de dichas nanopartmulas, la etapa de determinar la cantidad minima de protema requerida para obtener nanopartroulas estables en forma coloidal en presencia de dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. La etapa de determinar la cantidad optima de protema para recubrir la superficie de las nanopartroulas se realiza normalmente mediante una valoracion de la concentracion. Las nanopartroulas se mezclan con diferentes cantidades de protema y se registran los espectros de absorcion. Por ejemplo, en realizaciones particulares, se mezclan nanopartroulas con cantidades crecientes de protema normalmente en el intervalo desde 0 hasta 1000 |ig de protema por ml de nanopartroulas.

En realizaciones particulares, la etapa de determinar la valoracion de la concentracion engloba que despues de un tiempo de incubacion de 10 min normalmente, se anade una sal (por ejemplo NaCl, 1 M) y despues de 10 min mas, se registran los espectros de absorcion de estas muestras entre 350 y 900 nm. La cantidad minima de protema necesaria para estabilizar las nanopartroulas puede determinarse usando graficos de Xmax, DO(Xmax) y/o la razon DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema por ml de nanopartroulas. La menor cantidad de protema, donde todos los graficos muestran la mayor similitud con el blanco, es la cantidad de protema necesaria para estabilizar las partroulas. En realizaciones alternativas, la etapa de valoracion de la concentracion engloba anadir la protema a las nanopartroulas en diferentes concentraciones directamente (sin adicion de sal) mediante lo cual se lee el espectro, por ejemplo, despues de 30 min.

En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion pueden comprender la etapa de determinar la cantidad optima de protema para el recubrimiento de las nanopartroulas. En general, la cantidad optima de protema (habitualmente expresada como concentracion de protema, por ejemplo |ig/ml) para el recubrimiento de las nanopartroulas dependera de la estructura y del peso molecular de la protema. Para protemas mas grandes, disminuira el peso relativo de protema frente a las partroulas. En realizaciones particulares, la cantidad de protemas usada es mayor que dicha cantidad minima de protema requerida para obtener nanopartroulas estables. En una realizacion adicional, la cantidad de protemas usada es mayor que la cantidad de protema que puede adsorberse en las superficies completas de las nanopartroulas.

Los metodos de la presente invencion permiten ademas controlar el recubrimiento mediante una cantidad discreta de protema de interes (es decir, la protema destinada para el recubrimiento y usada en aplicaciones adicionales, por ejemplo para la interaccion con otro compuesto, vease a continuacion). Esto puede lograrse, entre otros, realizando los metodos de la presente invencion y usando o bien composiciones que comprenden solo la protema de interes o bien composiciones de la protema combinadas con una protema que no es reactiva para los fines pretendidos (en la aplicacion adicional de la nanopartroula recubierta).

En la presente solicitud, la referencia a “protema” o “protemas” pretende referirse generalmente a la protema de interes. Sin embargo, en realizaciones particulares esto se refiere a una combinacion de protema de interes y protema no reactiva, mas particularmente en proporciones bien definidas. En estas realizaciones, es posible reducir adicionalmente y control la cantidad de protema de interes recubierta sobre la nanopartroula.

En realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas una etapa de controlar la adsorcion y/o la union de las protemas a las nanopartroulas. Esto puede realizarse mediante diferentes metodos de deteccion, incluyendo pero sin limitarse a metodos opticos de deteccion. En realizaciones particulares, la union de la protema a la nanopartroula se verifica detectando un desplazamiento en la longitud de onda de la resonancia de plasmones de superficie localizados (RPSL). Tal como se usa en el presente documento, el termino “resonancia de plasmones de superficie localizados” o “RPSL” se refiere a metodos que detectan cambios opticos en la superficie de nanopartroulas compuesta por metales nobles. Cuando las superficies de metal de las nanopartroulas se excitan mediante radiacion electromagnetica, presentan oscilaciones colectivas de sus electrones de conduccion, conocidas como plasmones de superficie localizados (PSL). Cuando se excitan de este modo, las nanopartroulas actuan como antenas a nanoescala, que concentran el campo electromagnetico en volumenes muy pequenos adyacentes a las nanopartroulas. Puede obtenerse una potenciacion excepcionalmente grande de la intensidad electromagnetica de este modo. Las nanopartroulas usadas en la RPSL permiten la aparicion de las oscilaciones de resonancia. El termino “absorbancia” se refiere al grado en que una muestra absorbe luz. En RPSL, pueden medirse cambios en la absorbancia proporcionando una indicacion de cambios a traves de monitorizacion en el mdice de refraccion. Puede detectarse la intensidad y longitud de onda de la absorbancia maxima para la banda de extincion de RPSL.

Los metodos de la presente invencion son aplicables generalmente al recubrimiento de nanopartroulas coloidales,

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que pueden ser de cualquier material o forma adecuados, tal como por ejemplo, pero sin limitarse a, nanopartfculas, nanoperlas, nanoesferas, nanopiramides, nanohilos, nanoprismas, nanocubos, nanovarillas, malla, etc. Un experto en la tecnica apreciara que otras nanoestructuras tambien pueden ser utiles en la presente invencion. En realizaciones particulares, las nanopartfculas son nanoestructuras redondas. En realizaciones particulares adicionales, las nanopartfculas tienen un diametro que oscila entre 1 y 1000 nm, particularmente entre 25 y 750 nm, mas particularmente entre 50 y 500 nm. El diametro de las nanopartfculas puede ser, por ejemplo, de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nm, o cualquier valor en el intervalo entre dos cualesquiera de los valores mencionados anteriormente. En realizaciones particulares, las nanopartfculas son nanovarillas. En realizaciones adicionales, las nanovarillas tienen una relacion de aspecto (es decir, longitud dividida entre anchura) que oscila entre 1,1 y 10, mas particularmente entre 1,5 y 5. En determinadas realizaciones, las nanovarillas tienen una anchura o un diametro de entre 2 y 10 nm. En realizaciones particulares, las nanovarillas tienen una longitud de entre 4 y 45 nm.

El metodo de presente invencion puede realizarse con cualquier tipo de partfculas coloidales que pueden recubrirse mediante interacciones electrostaticas. En realizaciones particulares, las nanopartfculas usadas en el contexto de la presente invencion comprenden un metal, un coloide de polfmero conductor, un coloide de metal noble, un coloide de material compuesto de polfmero conductor, sflice o latex.

El termino “coloide”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composicion fluida de nanopartfculas microscopicas en suspension en un medio lfquido. El termino “polfmero conductor” se refiere a un material polimerico electricamente conductor. En una realizacion, polfmeros conductores son polfmeros organicos, o polfmeros organicos conjugados con PI. Por ejemplo, los polfmeros conductores pueden ser polipirroles tales como polipirrol, poli(pirrol N-sustituido), poli(pirrol 3-sustituido) y poli(pirrol 3,4-disustituido); politiofenos tales como politiofeno, poli(tiofeno 3-sustituido), poli(tiofeno 3,4-disustituido) y polibenzotiofeno; poliisotianaftenos tales como poliisotianafteno; politienilenvinilenos tales como politienilenvinileno; poli(p-fenilenvinilenos) tales como poli(p- fenilenvinileno); polianilinas tales como polianilina, poli(anilina N-sustituida), poli(anilina 3-sustituida) y poli(anilina 2,3-sustituida); poliacetilenos tales como poliacetileno; polidiacetilenos tales como polidiacetileno; poliazulenos tales como poliazuleno; polipirenos tales como polipireno; policarbazoles tales como policarbazol y poli(carbazol N- sustituido), poliselenofenos tales como poliselenofeno; polifuranos tales como polifurano y polibenzofurano; poli(p- fenilenos) tales como poli(p-fenileno); poliindoles tales como poliindol; polipiridazinas tales como polipiridazina; poliacenos tales como naftaceno, pentaceno, hexaceno, heptaceno, dibenzopentaceno, tetrabenzopentaceno, pireno, dibenzopireno, criseno, perileno, coroneno, terileno, ovaleno, cuarterileno y circumantraceno; derivados (tales como trifenodioxazina, trifenoditiazina, hexaceno-6,15-quinona) que se preparan sustituyendo algunos de los atomos de carbono de poliacenos por atomos tales como N, S y O, o un grupo funcional tal como un grupo carbonilo; polfmeros tales como polivinilcarbazoles, poli(sulfuro de fenileno) y poli(sulfuro de vinileno). En una realizacion particular, polfmeros conductores son polipirrol, politiofeno, polianilina o sus derivados.

Tal como se conoce en la tecnica, el polfmero conductor puede doparse incorporando en el polfmero, materiales que tienen un grupo funcional tal como un grupo dimetilamino, un grupo ciano, un grupo carboxilo y un grupo nitro, materiales tales como derivados de benzoquinona y tetracianoetileno asf como tetracianoquinodimetano, y derivados del mismo, que actuan como aceptor que acepta electrones, o, por ejemplo, materiales que tienen un grupo funcional tal como un grupo amino, un grupo alquilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo y un grupo fenilo; aminas sustituidas tales como fenilendiamina; antraceno, benzoantraceno, benzoantracenos sustituidos, pireno, pireno sustituido, carbazol y derivados del mismo y tetratiafulvaleno y derivados de mismo, que actuan como donador que es un donador de electrones. El termino “dopado”, tal como se usa en el presente documento, significa que se incorporan moleculas que aceptan electrones (aceptores) o moleculas que donan electrones (donadores) en la cadena del polfmero. Cuando el agente de dopado es un grupo sustituyente para el monomero usado para sintetizar el polfmero, el se usa termino polfmero de autodopado. En otros casos, el agente de dopado es externo y se incluye despues de la smtesis en la cadena del polfmero (habitualmente como pelfcula), tal como vapor de yodo. En la presente invencion, pueden emplearse tanto aceptores como donadores como agentes de dopado.

El termino “coloide de metal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un coloide en el que las nanopartfculas microscopicas en suspension son nanopartfculas de metal. El termino “metal noble” se refiere a metales del grupo VIII de la tabla periodica incluyendo, pero sin limitarse a: platino, iridio, paladio y similares, asf como oro, plata, etc.

El termino “coloide de material compuesto de polfmero conductor/metal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un coloide que se compone de nanopartfculas de metal que tienen un polfmero conductor presente en una superficie de las mismas. En realizaciones particulares, las nanopartfculas usadas en el contexto de la presente invencion comprenden uno o mas metales seleccionados de Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, La, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au y/o Ac. Un experto en la tecnica apreciara que los metales de transicion descritos anteriormente pueden adoptar cada uno diferentes estados de oxidacion, todos los cuales son utiles en la presente invencion. En algunos casos, se forma el estado de oxidacion mas estable, pero otros estados de oxidacion son utiles en la presente invencion. Ademas, los metales de transicion de la presente invencion pueden ser oxidos de metal. En una realizacion, la invencion se refiere a un metodo, en el que dichas nanopartfculas comprenden un metal de transicion seleccionado del grupo que comprende Au, Ag, Cu, Ta, Pt, Pd y Rh y preferiblemente en el que dicho metal de transicion es oro, plata o cobre.

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Tal como se detallo anteriormente en realizaciones particulares, los metodos de recubrimiento segun la invencion se basan en interacciones electrostaticas entre los agentes de union, mas particularmente las moleculas de protema, y las nanopartmulas. Sin embargo, para determinadas aplicaciones pueden requerirse conjugados de protema- nanopartmula mas estables. Tales conjugados estables pueden obtenerse mediante acoplamiento covalente entre moleculas de protema y las nanopartmulas. Con el fin de garantizar tal acoplamiento covalente, la superficie de las nanopartmulas se dota habitualmente de grupos funcionales, tales como por ejemplo grupos carboxilo o amina o peptidos, o azidas o alquenos, etc. En un protocolo tfpico para la union covalente segun la tecnica anterior, una primera etapa en el acoplamiento covalente es la activacion de los grupos funcionales, por ejemplo grupos carboxilo, en las nanopartmulas, haciendo de ese modo que sean reactivas frente a la pareja de union, por ejemplo una protema. Entonces se anade la pareja de union. Normalmente, es necesario un exceso de la pareja de union para lograr la cobertura completa del nanomaterial con la pareja de union. Despues de completarse la reaccion de acoplamiento, se retira el exceso de pareja de union mediante purificacion.

Sin embargo, segun realizaciones particulares de la presente invencion se proporcionan metodos de recubrimiento optimizados que implican la union covalente de protemas a nanopartmulas. En efecto, en realizaciones particulares, el metodo de recubrimiento segun la presente invencion garantiza la formacion de una monocapa de protema alrededor de las nanopartmulas, proporcionando de ese modo un estrecho contacto entre la protema y cualquier grupo funcional (activado) en las nanopartmulas, concentrando por tanto la protema en la superficie de la nanopartmula y acelerando la formacion del enlace covalente. A diferencia de los metodos para la union covalente conocidos en la tecnica esta el hecho de que con el metodo segun la presente invencion, se requiere un pequeno exceso o ninguno de la protema.

Por consiguiente, en realizaciones particulares, la superficie de las nanopartmulas se funcionaliza con uno o mas grupos funcionales. El experto conoce bien metodos para la funcionalizacion de nanopartmulas, y pueden implicar por ejemplo la union de ligandos a la superficie de la nanopartmula, en los que dichos ligandos comprenden al menos un agente enlazante que tienen una primera parte enlazada a la nanopartmula y una segunda parte que es un grupo funcional que puede enlazarse a una molecula de afinidad, por ejemplo una protema. En realizaciones particulares, la superficie de las nanopartmulas se funcionaliza con uno o mas grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en un carboxilo, una amina, polietilenglicol, un peptido, ADN y ARN. Los grupos carboxilo son especialmente utiles para la union a protemas, porque el grupo carboxilo puede reaccionar con un resto de amina de una protema, formandose de ese modo un enlace amida. Por consiguiente, en realizaciones espedficas, los grupos funcionales comprenden grupos carboxilo. En realizaciones particulares, los grupos funcionales se activan antes de o tras poner en contacto las nanopartmulas con una disolucion que comprende la protema. El experto conoce bien la activacion de grupos funcionales. Si el grupo funcional es un carboxilo, el carboxilo puede activarse usando uno o mas grupos de activacion de carboxilo. Los ejemplos de grupos de activacion de carboxilo utiles incluyen, pero no se limitan a, reactivos de carbodiimida, reactivos de fosfonio tales como hexafluorofosfato de benzotriazoliloxi-tris- (dimetilamino)fosfonio (BOP) y similares, reactivos de uronio o carbonio tales como hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), N-hidroxi-succinimida (NHS), hexafluorofosfato de benzotriazol- 1-il-oxitripirrolidinofosfonio (Py-BOP) y similares; 1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ); yoduro de 1- metil-2-cloropiridinio (reactivo de Mukaiyama) y similares.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion de nanopartmulas que comprende nanopartmulas que pueden obtenerse mediante uno o mas de los metodos de la presente invencion.

En efecto, en realizaciones particulares, los metodos de la presente invencion proporcionan un modo unico de obtener nanopartmulas que se recubren con una unica capa de protema. El grosor de capa de protema puede determinarse midiendo el diametro hidrodinamico de las partmulas a traves de mediciones de dispersion dinamica de luz (DLS). Un aumento del diametro hidrodinamico es equivalente a un aumento del grosor de capa de protema. Nanopartmulas recubiertas con una unica capa de protema proporcionan varias ventajas. Se mejora el recubrimiento de nanopartmulas de protema recubiertas con otro compuesto, porque se reduce la distancia de este compuesto a la superficie de la nanopartmula. Ademas, si va a estudiarse la interaccion entre la protema recubierta y otro compuesto, se reduce la distancia a la superficie de la nanopartmula, mejorando de ese modo la deteccion optica de las interacciones proteicas mediante RPSL. Segun realizaciones particulares, la invencion proporciona composiciones de nanopartmulas que comprenden nanopartmulas recubiertas con una o mas protemas, en las que la una o mas protemas se recubren como una unica capa sobre la nanopartmula.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona kits que comprenden nanopartmulas y el uso de los mismos, comprendiendo ademas dichos kits componentes y/o instrucciones para el recubrimiento de las nanopartmulas con protema segun uno o mas de los metodos de la presente invencion. En realizaciones particulares, los kits segun la presente invencion comprenden nanopartmulas en disolucion, en los que dicha disolucion comprende un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. Adicional o alternativamente, los kits segun la presente invencion comprenden nanopartmulas y un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico independiente o una disolucion independiente que comprende un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. En realizaciones particulares, los kits comprenden instrucciones para recubrirlas nanopartmulas segun los metodos de la presente invencion.

Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere al uso de las nanopartmulas recubiertas obtenidas segun la presente invencion en diferentes aplicaciones. En efecto, las nanopartmulas obtenidas mediante los metodos de

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recubrimiento de la presente invencion pueden usarse en todas las aplicaciones de la tecnica anterior conocidas que implican nanopartmulas recubiertas con protema, incluyendo, pero sin limitarse a la administracion de farmacos, terapia, diagnostico, metodos de deteccion de analitos, metodos de direccionamiento, etc.

Ademas se ha hallado que las nanopartmulas obtenidas mediante realizaciones particulares de los metodos de la presente invencion tienen ventajas particulares en aplicaciones espedficas. En efecto se observa que para la deteccion optica de interacciones de una primera protema con un segundo compuesto (incluyendo una segunda protema) usando nanopartmulas, es de interes que la interaccion se produzca lo mas cerca posible de la superficie de la nanopartmula. Por tanto, el recubrimiento de la primera protema en una unica capa sobre la superficie de la nanopartmula garantiza una deteccion optima de la interaccion de dicha protema con otro compuesto o protema. En realizaciones particulares, las nanopartmulas recubiertas de la presente invencion se usan en metodos de deteccion de analitos. En realizaciones particulares, los metodos de recubrimiento son metodos opticos de deteccion, mas particularmente metodos que implican la deteccion de la dispersion de luz por la nanopartmula. En realizaciones particulares adicionales, las nanopartmulas que pueden obtenerse u obtenidas mediante los metodos de la presente invencion se usan en metodos de deteccion por RPSL.

Los metodos de deteccion por RPSL se usan normalmente en el contexto de la medicion de interacciones entre un primer y un segundo compuestos, en el contexto de la determinacion de propiedades espedficas de uno o los dos compuestos o propiedades espedficas de la interaccion entre ambos compuestos. En los metodos de la presente invencion, el primer compuesto, que se une a la nanopartmula es una protema. En realizaciones particulares, los compuesto primero y segundo son un miembro de un par de union espedfico conocido o previsto. Por tanto, el segundo compuesto (o posible ligando relacionado) se refiere a un compuesto que puede interaccionar posiblemente con el primer compuesto acoplado a la nanopartmula. Normalmente, los compuestos primero y segundo son ambos restos de deteccion que son miembros del par de union tal como antigeno-anticuerpo, receptor- ligando, enzima-ligando, azucar-lectina, receptor-agente de union al receptor, y otros. En estas realizaciones, los metodos de deteccion por RPSL pueden servir para detectar la interaccion entre los dos miembros del par de union.

La presente invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Puesta en contacto de nanopartmulas con un detergente no ionico tras el recubrimiento de las nanopartmulas con protema G

En primer lugar, va a determinarse la cantidad de protema G necesaria para estabilizar un determinado volumen de nanopartmulas de oro (GNP) en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico mediante una valoracion de la concentracion. Una disolucion preparada de GNP de 30 nm de diametro con una DO de 4 a la longitud de onda maxima contiene 6 x 1011 GNP/ml. Se mezclan las GNP con diferentes cantidades de protema en un intervalo tfpico de 0 a 100 |ig de protema por ml de GNP. Despues de un tiempo de incubacion de 10 min, se anade NaCl (1 M en H2O) y despues de 10 min mas, se registran los espectros de absorcion de estas muestras entre 350 y 900 nm. Para identificar la menor cantidad de protema necesaria para estabilizar las nanopartmulas, se realizan tres graficos; se representan graficamente Xmax, DO(Xmax) y la razon DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema por ml de GNP. La menor concentracion de protema, donde los tres graficos muestran la mayor similitud con el blanco es la cantidad minima de protema necesaria para estabilizar las nanopartmulas. Particularmente, la razon DO(600)/DO(Xmax) debe ser lo mas pequena posible. Puede esperarse un pequeno desplazamiento de Xmax a mayores longitudes de onda y, de ese modo, un pequeno aumento de DO(600)/DO(Xmax) despues del recubrimiento con protema. Principalmente, la DO(Xmax) tambien aumenta o disminuye un poco. Mediante la valoracion de la concentracion, se determino que una cantidad de protema de 25 |ig de protema G por ml de GNP era la menor cantidad que estabiliza las nanopartmulas (figura 1).

Despues de determinar la cantidad minima de protema necesaria para estabilizar las nanopartmulas en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, se realiza una valoracion de la concentracion en presencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. En los presentes ejemplos, se usa el detergente no ionico Tween 20 a una concentracion final del 0,05%. La mayor cantidad de protema sometida a prueba en la valoracion con Tween 20 es la menor cantidad de protema que estabiliza las nanopartmulas en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. Se realiza la valoracion de manera similar a la valoracion de la concentracion en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico excepto en que se mezcla la protema con una cantidad fija de Tween 20 antes de la adicion de GNP. Se registran los espectros de absorcion de estas muestras y de nuevo se realizan los siguientes tres graficos; se representan graficamente Xmax, DO(Xmax) y la razon DO(600)/DO(Xmax) frente a la cantidad de protema por ml de GNP.

Debido a Tween 20, todas las muestras son estables despues de la adicion de NaCl (1 M en H2O). Puede monitorizarse la union de la protema en la superficie de la nanopartmula mediante el desarrollo de Xmax con una cantidad creciente de protema por ml de GNP. Cuanta mas protema se une a la superficie de las nanopartmulas, mas se desplaza Xmax a mayores longitudes de onda. Este desarrollo tambien tiene un efecto sobre el grafico de DO(600)/DO(Xmax). Con Xmax creciente, la razon DO(600)/DO(Xmax) tambien aumenta ligeramente.

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En la figura 2, se muestran los resultados de la valoracion de la concentracion en presencia de Tween 20. Ademas de los espectros de absorcion (figuras 2A, 2B, 2C), se realizaron mediciones de dispersion dinamica de luz (DLS) para cada muestra (figura 2D). Una cantidad de 12,5 a 15 |ig de protema G por ml de GNP es suficiente para cubrir las nanopartmulas con aproximadamente una capa de protema G (figura 2, indicado mediante las flechas). Pueden identificarse claramente dos mesetas correspondientes respectivamente a una primera y una segunda capas de protema sobre las nanopartmulas (figura 2D). El uso de 12,5 |ig de protema G por ml de GNP, que es necesario para estabilizar las nanopartmulas en presencia de Tween 20, da como resultado nanopartmulas con un grosor de capa de protema de 5 nm. El uso de 25 |ig de protema G por ml de GNP, que es necesario para obtener nanopartmulas estables en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, da como resultado nanopartmulas con un grosor de capa de 12,5 nm, que es mas del doble de grande (figura 2D). El uso de Tween 20 en el procedimiento de recubrimiento permite por tanto producir GNP recubiertas con protema G estables con solo una capa de protema sobre la superficie de la nanopartmula. De ese modo, se divide a la mitad la cantidad necesaria de protema G por ml de GNP y si se pretende un recubrimiento adicional de las nanopartmulas con otra molecula, se reduce la distancia de esta molecula a la superficie de la nanopartmula.

La comparacion del desarrollo de Xmax (figura 2A) y el diametro hidrodinamico (figura 2D) de las nanopartmulas con una cantidad creciente de protema muestra que el desarrollo del grosor de capa de protema con una cantidad creciente de protema tambien puede deducirse a partir del grafico de Xmax frente a la cantidad de protema por ml de GNP. Un aumento del diametro hidrodinamico, que es equivalente a un aumento del grosor de capa de protema, da como resultado un ligero desplazamiento al rojo de Xmax. Dado que las mediciones de DLS llevan mucho tiempo, la oportunidad de usar solo los espectros de absorcion para obtener informacion sobre el grosor de capa de protema reduce significativamente el tiempo necesario para determinar la cantidad optima de protema para el recubrimiento.

Ejemplo 2: Poner en contacto nanopartmulas con un detergente no ionico tras el recubrimiento de las nanopartmulas con estreptavidina

Mediante la valoracion de la concentracion, se determino que una cantidad de protema de 25 |ig de estreptavidina por ml de GNP era la menor cantidad que todavfa estabiliza las nanopartmulas en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico (figura 3). En la figura 4, se muestran los resultados de la valoracion de la concentracion adyacente de estreptavidina en presencia de Tween 20. Es necesaria una cantidad de 12,5 |ig de estreptavidina por ml de GNP para cubrir las nanopartmulas con aproximadamente una capa de estreptavidina (figura 4). El uso de 25 |ig de estreptavidina por ml de GNP, que es necesario para obtener nanopartmulas estables en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, da como resultado nanopartmulas con un grosor de capa que es el doble de grande (figura 4D). Las mediciones de DLS presentadas en la figura 4D muestran claramente el desarrollo de dos capas de protema posteriores que confirman los datos espectroscopicos presentados en las figuras 4A, 4B y 4C. Por tanto, el metodo de la presente invencion divide a la mitad la cantidad necesaria de estreptavidina por ml de GNP.

Ejemplo 3: Puesta en contacto de nanopartmulas con un detergente no ionico antes del recubrimiento de las nanopartmulas con protema G

El ejemplo 3 es similar al ejemplo 1 excepto en que se anade Tween 20 a las nanopartmulas antes de anadirse la protema.

En primer lugar, va a determinarse la cantidad minima de protema que es necesaria para recubrir un determinado volumen de GNP en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico. Tal como se ha descrito ya en el ejemplo 1, se determino que una cantidad de protema de 25 |ig de protema G por ml de GNP era la menor cantidad que todavfa estabiliza las nanopartmulas en ausencia de Tween 20 (figura 1).

Luego se realiza una valoracion de la concentracion con GNP recubiertas con Tween 20. La mayor cantidad de protema sometida en esta valoracion es de nuevo la menor cantidad de protema que estabiliza las nanopartmulas en ausencia de Tween 20. A diferencia del ejemplo 1, se recubren las GNP con Tween 20 antes de iniciarse la valoracion. Se realiza la valoracion de manera similar a la valoracion de la concentracion en ausencia de cualquier detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico excepto en que se usan nanopartmulas estabilizadas con Tween 20 en lugar de GNP recubiertas con citrato. El uso de nanopartmulas estabilizadas con Tween 20 permite el reemplazo progresivo del detergente no ionico por la protema. Esto es ventajoso cuando la protema que va a recubrirse es un peptido pequeno o esta tamponada. Se registraron los espectros de absorcion de estas muestras y, en la figura 5, se muestran los resultados de la valoracion de la concentracion con GNP recubiertas con Tween 20. Es necesaria una cantidad de 7,5 a 15 |ig de protema G por ml de GNP para cubrir las nanopartmulas con aproximadamente una capa de protema G (figura 5). En comparacion con los 25 |ig de protema G por ml de GNP que son necesarios para sintetizar GNP recubiertas con protema G estables en ausencia de Tween 20, esto es de nuevo una reduccion significativa de la cantidad de protema por nanopartmula. Este resultado es comparable al resultado obtenido en el ejemplo 1, considerando que se uso otro lote de coloide para esta valoracion.

Ejemplo 4: Puesta en contacto nanopartmulas con un detergente no ionico antes del recubrimiento de las nanopartmulas con protema A

En la figura 6, se muestran los resultados de una valoracion con protema A de la concentracion de GNP recubiertas con Tween 20. Es necesaria una cantidad de 5 a 7,5 |ig de protema A por ml de GNP para cubrir las nanopartmulas con aproximadamente una capa de protema A.

Claims (10)

1. 10
2. 2.

   15
3. 3.
4. 4.

   20
5. 5.
6. 6.

   25
7. 7.
8. 8.

   30 9.
9. 10.

   35
10. 11.

    40

    REIVINDICACIONES

    Metodo para recubrir nanopartfculas coloidales con una unica capa de un agente de union, en el que el metodo comprende las etapas de:

    - determinar mediante la valoracion de la concentracion, antes del recubrimiento de dichas nanopartfculas, la cantidad minima de agentes de union requerida para obtener una suspension coloidal estable de nanopartfculas recubiertas con una unica capa de agentes de union, en el que dicha determinacion de la cantidad minima de agentes de union se realiza en presencia de un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico; y

    - mezclar una disolucion que comprende las nanopartfculas con una disolucion que comprende dichos agentes de union, en el que dicha disolucion que comprende las nanopartfculas y/o dicha disolucion que comprende el agente de union comprenden un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico en el que la concentracion de dicho detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico oscila entre el 0,0001 y el 1% volumen/volumen.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho detergente no ionico se selecciona del grupo que comprende polisorbatos, etoxilatos de octilfenol, glucaminas, Lubrol, Brij®, Nonidet®, Pluronic®, Genapol® e Igepal®.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho detergente cationico se selecciona de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) o bromuro de trimetil(tetradecil)amonio (TTAB).

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho detergente zwitterionico se selecciona del grupo que comprende amidosulfobetamas, alquilbetamas y propanosulfonatos de amonio.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas nanopartfculas comprenden un coloide de polfmero conductor, un coloide de metal noble o un coloide de material compuesto de polfmero conductor/metal.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas nanopartfculas comprenden un metal de transicion seleccionado del grupo que comprende Au, Ag, Cu, Ta, Pt, Pd y Rh.

    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que dicho metal de transicion es oro, plata o cobre.

    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas activar un grupo funcional sobre la superficie de dicha nanopartfcula, de modo que se garantice la union covalente de dichos agentes de union en dicha superficie.

    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos agentes de union son una protema.

    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho metodo es un metodo para la deteccion por resonancia de plasmones de superficie localizados (RPSL) de la interaccion de un compuesto con un agente de union unido a dicha nanopartfcula, que comprende ademas la etapa de medir la interaccion entre dicho agente de union y dicho compuesto mediante un metodo de deteccion por RPSL.

    Uso de un kit en un metodo para recubrir nanopartfculas con una unica capa de un agente de union para obtener nanopartfculas estables en forma coloidal, en el que dicho kit comprende:

    - nanopartfculas no recubiertas;

    - un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico, o una disolucion que comprende un detergente no ionico, cationico y/o zwitterionico; e

    - instrucciones para recubrir dichas nanopartfculas con un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

    Uso segun la reivindicacion 11, en el que dichas nanopartfculas comprenden un metal de transicion seleccionado del grupo que comprende Au, Ag, Cu, Ta, Pt, Pd y Rh.